DK157019B

DK157019B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 2-amino-4-hydroxyquinazolinderivater

Info

Publication number: DK157019B
Application number: DK540080AA
Authority: DK
Inventors: Terence Richard Jones; Kenneth Reginald Harrap; Alan Hilary Calvert
Original assignee: Nat Res Dev
Priority date: 1979-12-19
Filing date: 1980-12-18
Publication date: 1989-10-30
Also published as: GB2065653B; HU193505B; US4447608A; EP0031237B1; NO803868L; ES508454A0; PT72232B; IE51188B1; NZ195876A; ES508453A0; GR72847B; DE3069468D1; YU321180A; NO154919C; IL61756A; GB2065653A; NO154919B; FI76791C; AU543237B2; ES8307762A1

Description

DK 157019B

ο

Den foreliggende opfindelse angâr en analogifrem-gangsmâde til fremstilling af hidtil ukendte quinazolinderi-vater, der er kraftige anti-tumor-(anti-cancer)-midler.

St0rstedelen af de præparater, der har været an-5 vendt til behandling af tumorer, har enten direkte eller in-direkte grebet ind i reproduktionen af nucleinsyrer i cellerne, der hurtigt deler sig. Mange midler, der kaldes anti-metabo-liter, er beregnet til at dræbe tumoren ved at udmatte dens væsentlige vækstelementer i konkurrence med og ved fortræng-10 ning af substrater for særlige enzymer, der indgâr i DNA-syn-tese. Antimetaboliter kan klassificeres efter deres særlige inhiberende virkning, og eksempler herpâ omfatter analoge af puriner og pyrimidiner og folinsyreantagonister sâsom ami-nopterin og amethopterin (methotrexat).

15 Af de antimetaboliter, der er folinsyre-antagoni- ster, anvendes methotrexat i stor udstrækning til behandling af maligne sygdomme hos mennesker, især til behandling af choriocarcinom og osteosarcom og til vedligeholdelsesbehand-ling af akut lymfatisk leukæmi. Stoffets inhibering af enzy-20 met dihydrofolatreduktase (DHFR, EC 1.5.1.4) fremkalder en reduktion af tetrahydrofolatreserverne med ët carbonatom, hvilket resulterer i inhibering af de novo-syntese sâvel af thymidin- som purinnucleotider, der er n0dvendige for DNA-syn-tese. Selv om den "purinl0se" tilstand, der fremkaldes af 25 methotrexat, har vist sig at fremkalde toksicitet i mave-tarm-kanalen hos mus, bidrager den ikke til methotrexats cytotok-siske virkning over for visse dyrkede tumorcelleslægter og kan modvirke den hos andre. Methotrexat kræver ikke metabo-lisk aktivering og undergâr ingen signifikant metabolisk ned-30 brydning i st0restedelen af celletyper. Kendte ârsager til resistens over for methotrexat omfatter reduceret membran-transport og for0get cellulær DHFR. I sidstnævnte tilfælde kan det effektive mal for methotrexat blive thymidylat-syn-thetase (TS, EC 2.1.1.45), idet enzymet katalyserer sluttrin-35 net i de novo-syntesen af thymidylat, der udelukkende er n0d-vendig for DNA-syntesen. Direkte inhibering af TS kan op-nâs ved hjælp af en aktiv metabolit af 5-fluoruracil, 5-fluor-

O

DK 157019 B

2 deoxyuridin-monophosphat. Imidlertid ledsages 5-fluoruracil-resistens ofte af en reduktion af de egnede aktiverende enzy-mer, og præparatet kan ogsâ hâve toksiske virkninger, der tilskrives dets inkorporering i RNA.

5 Der eksisterer derfor et behov for et middel, der konkurrerer med TS's tetrahydrofolat-cosubstrat frem for med pyrimidinsubstratet, idet det ma forventes, at en sâdan for-bindelse har en aktivitet, der er lig med eller st0rre end methotrexats, ikke blot i methotrexat-f0lsomme tumorer, men 10 ogsâ i sâdanne, der er resistente pâ grund af fremdyrket cel-û lulær DHFR. Det skal ogsâ være mindre toksisk for værtsorga- nismen, eftersom purinsyntesen ikke pâvirkes. Endvidere skal folatanaloge være mere effektive end pyrimidiner, idet de ikke kræver metabolisk aktivering.

15 Adskillige klassi.ske quinazolin-antifolater har vist sig at være inhibitorer af TS, f.eks. 2-amino-4-hydroxy-og 2,4-diaminoderivater, idet dog de sidstnævnte, selv om de har vist sig at være rimeligt effektive inhibitorer af TS, ogsâ bindes yderst stærkt til DHFR.

20 USA-patentskrift nr. 3.472.851 angâr sâledes anti-tumor-forbindelser, der er lavere homologe til forbindelseme if0lge opfindelsen. Disse lavere homologe er forbindelser, der er usubstituerede eller methylsubstituerede pâ det ali- 25 phatiske nitrogenatom (dvs. at R i den her angivne almene formel I er hydrogen eller methyl). Denne type antitumor-forbindelsers virkning kan, som beskrevet mere indgâende nedenfor, bestemmes ved deres evne til at inhibere enzymet thymidylat-syntetase og udtrykkes som deres virkning pâ museleukæmi-cellelinien L1210. Bed0mt efter disse kriterier 30 udviser forbindelseme ifolge opfindelsen overlegne egen-skaber i forhold til de lavere homologe, fra det ovennævnte USA-patentskrift kendte forbindelser.

35

O

3

DK 157019 B

Opfindelsen angâr sâledes en fremgangsmâde til frem-stilling af 2-amino-4-hydroxyquinaz olinderivater med den almene formel

5 O

t1j]^ch2- ^}-co-y ^2 (χ)η ίο ^ n hvor R betyder 15 1) en llgekædet eller forgrenet umættet carbonhydrid- gruppe med 2-6 carbonatomer eller 2) en llgekædet eller forgrenet mættet eller umættet carbonhydridgruppe med indtil 6 carbonatomer, der er sub-stitueret med mindst én substituent, der er CN, COOH eller 20 et sait eller en ester deraf, OH, =0, halogen, NH2, C0NH2, CO-C6H5, oxiranyl eller 5-uracilyl, idet carbonhydridgruppen R indeholder mindst 2 carbonatomer, nâr substituenten er =0, n betyder 0 eller et helt tal pâ 1-4, X betyder halogen, C^C^alkyl, phenyl, phenyl-C]^- 25 -C4-alkyl, C^^-alkoxy eller N02, og Y betyder en gruppe med formlen a) -NH-CH-COOH (L-aspartat), i ch2-cooh 30 b) -NH-CH-COOH (L-glutamat) eller i ch2-ch2-cooh

c) -NH-CH-COOH

35 CH2-CH2-CH- -NH-CH-COOH

i __ CH2-CH2-CO- -oh m

O

DK 157019 B

4 hvor m er et helt tal fra 1 til 9 (poly-L-glutamater), eller er et pharmaceutisk acceptabelt sait eller en ester med en aliphatisk C1-C2o~alicoilol deraf.

Forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmâden 5 if0lge opfindelsen, er nyttige anti-cancer-midler, der enten er aktive i sig selv eller er egnede til pro-præparater, der in vivo kan omdannes til aktive forbindelser.

Fremgangsmâden if0lge opfindelsen er ejendommelig ved, at 10 (A) beskyttelsen fjernes helt eller delvis, sâledes at der fâs en forbindelse med formlen I, fra en forbindelse med formlen 15 0 R2 CH- N / \—CO-Y' Ia -Λτ x 25 o hvor X og n har de ovenfor anf0rte betydninger, R* er æk- vivalent med R som defineret ovenfor eller er en gruppe R i beskyttet form, R1 er hydrogen eller en amino-beskyttende gruppe, og Y' er en gruppe med formlen a), b) eller c) som defineret ovenfor for Y eller et sait af disse grupper eller 30 disse grupper i delvis eller fuldstændig beskyttet form, idet den beskyttende gruppe i Y’ er en estergruppe eller en anden beskyttende gruppe, forudsat at forbindelsen med formlen la indeholder mindst én beskyttende gruppe, og at, hvis fjernelsen af beskyttelse udf0res for at fjerne mere end én beskyttende gruppe, denne beskyttelsesfjernelse kan ud0res samtidigt eller i en hvilken som helst rækkef0lge, eller 35

O

5

DK 157019 B

(B) en forbindelse med formlen

O

Il CH X»

5 z III

10 hvor R1 er sont defineret under A), og X" er en agâende grup-pe, kobles med en forbindelse med formlen 15 r2 l /=\ NH / \ CO-Y * (X) n 20 hvor R2, X, n og Y' er som defineret under A) ovenfor, til dannelse af en forbindelse med formlen la som defineret under A), ovenfor, som ikke n0dvendigvis indeholder beskyt-25 tende grupper, og om n0dvendigt beskyttelsen fjernes fra forbindelsen med formlen la som defineret under A).

R-substituenter som defineret under 1) er sâdanne, der indeholder 2-6, f.eks. 4 og fortrinsvis 3 carbonatomer, og fortrinsvis sâdanne der har umættethed i mindst 2- eller 30 i ω-stillingen. Eksempler pâ sâdanne grupper er alkenyl, alkadienyl-, alkynyl- og alkadiynylgrupper, og særlige eksempler er allyl, propargyl, but-2-ynyl, but-3-ynyl og 1-methylprop-2-ynyl.

Grupperne R som defineret under 2) indeholder indtil 35 6 carbonatomer i carbonhydridkæden, fortrinsvis indtil ialt 4 carbonatomer i R-gruppen. Foretrukne heteroatom-substi-

O

« DK 157019 B

tuenter er halogen, f.eks. Cl, Br og F, og nâr det drejer sig om C2- eller h0jere carbonhydridgruppe, =0, der fortrins-vis er knyttet til et carbonatom, der ikke er a-carbonatomet. Eksempler pâ sâdanne R-grupper er 2-oxopropyl, f ormylmethyl, 5 2,2,2-trifluorethyl og 2-chlor-, 2-brom- eller 2-fluorethyl.

Foretrukne carbocycliske, substituentgrupper indehol-der 3-6 ringcarbonatomer, især 3-5, men maksimalt 6 car-bonatomer ialt. Et eksempel pâ en sâdan R-gruppe er cyclo-10 propylmethyl. Den carbocycliske ring kan selv hâve mindst én C1-C3-alkylsubstituent, fortrinsvis methyl, hvoraf der fortrinsvis er 1-3, især 1.

De substituentgrupper, der er omtalt i definitionen 2) af R, indeholder fortrinsvis 1-6, især 1-4, heteroatomer 15 valgt blandt halogen, 0 eller N. Særlige eksempler pâ sâdanne grupper er OH, NH2, C0NH2, COOH og salte og estere deraf, og CN. Sâledes kan R-grupper defineret under 2) f.eks. være 2-hydroxyethyl, 3-hydroxypropyl, carboxymethyl eller ethoxy-carbonylmethyl.

20 Særlige eksempler pâ substituentgrupper med hetero atomer, der indeholder ringe, er phenacyl, carbocycliske grupper substitueret med OH, NH2, COOH, keto, formyl, oxira-nylmethyl og 5-uracilylmethyl, dvs. en thyminylgruppe.

Særlige kraftige anti-cancer-midler, der fremstil-25 les ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen, er sâdanne, hvor R er propargyl, n=0 og Y er en glutaminsyregruppe eller et sait eller en ester deraf. Desuden viser de tilsvarende forbindel-ser, hvor n = 1, og X er chlor eller methyl i 2-stillingen, h0j aktivitet.

30 Som anf0rt ovenfor fremstilles der ved fremgangsmâ den if0lge opfindelsen ogsâ quinazolinderivater i form af frie syrer og ligeledes i form af pharmaceutisk acceptable salte eller estere af disse syrer, der kan være delvis salte og estere. Nâr det sâledes drejer sig om forbindelserne, der in-35 deholder glutaminsyre- og asparaginsyregrupper, monoester-, monosyre-og diesterdérivater og de tilsvarende saltformer, kan disse ligeledes fremstilles ved fremgangsiaâden if0lge opfindel- .

O

DK 157019 B

7 sen. Desuden kan R-grupper med COOH-grupper eksempelvis være i sait- eller ester-form, f.eks. ethylesteren. Saltene kan være salte, der er dannet med fysiologisk acceptable uorganiske eller organiske syrer og baser og er fortrinsvis natriumsalte, 5 f.eks. dinatriumsalte. Esterne er fortrinsvis lipophile estere, i hvilken form forbindelser som et pro-præparat kan overf0res til enzymstedet, idet det nedbrydes til den til-svarende syreform. Eksempler pâ foretrukne estere er sâdan-ne med C^_2q aliphatiske grupper, f.eks. alkylestere, for-10 trinsvis med 1-4 carbonatomer, især diethylestere.

Forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmâden if0lge opfindelsenjkan fremstilles ved en fremgangsmâde, - der er en delvis eller fuldstændig fjernelse af beskyttelse udf0rt pâ en forbindelse med formlen 15 20 25 30 35

O

DK 157019 B

8 Q r2 / —y 5 Jl ^ CH0-N-/ /)-CO-Y* /ry “ 2 10 hvor X og n har de ovenfor anf0rte betydninger, R svarer til R eller er en gruppe R i beskvttet form, R^ er hydrogen eller en amino-beskyttende gruppe, og Y' er en gruppe med formlen a) , b) eller c) sorti defineret ovenfor for Y eller et sait af sâdanne grupper eller sâdanne grupper i delvis el-15 1er fuldstændig beskyttet form, idet den beskyttende gruppe i Y' er en estergruppe eller en anden beskyttende gruppe, og forbindelsen med formlen la indeholder mindst én beskyttende gruppe. Hvis fjernelse af beskyttelsen udf0res for at fjerne mere end ên beskyttende gruppe, kan fjernelserne 20 af beskyttelserne udf0res samtidig eller i en hvilken som helst rækkef0lge.

Sâledes kan f.eks. svrerne og saltene, der frem- stilles ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen, fremstilles ved fuldstændig fjernelse af beskyttelsen fra en forbindelse 25 med formlen la, de delvise estere kan fremstilles ved f jer- 2 nelse af beskyttelsen af 2-aminogruppen, og R -gruppen efter behov, nâr Y' enten allerede er i delvis esterform eller er i fuldstændig esterificeret form, hvorfra beskyttelsen der-efter delvis fjernes, og de fuldstændige estere kan fremstil- 30 les ved fjernelse af beskyttelsen for 2-amino- og R2-gruppen efter behov, idet Y'-gruppen er i fuldstændig esterificeret form.

35

DK 157019B

Ο 9

Fjernelse af beskyttelsen for gruppen Y' i ester-form til dannelse af en syre kan f.eks. udf0res ved mild hydrolyse under anvendelse af en base sâsom NaOH. Den derved fremkomne syre kan om 0nsket derefter underkastes omsætning 5 med en syre eller base til dannelse af et pharmaceutisk ac-ceptabelt sait. Særlig foretrukket fâr syren lov at reagere med NaOH til dannelse af det tilsvarende dinatriumsalt. Alternat! vt kan syreproduktet esterificeres, et saltprodukt kan omdannes til en syre eller ester, eller et esterprodukt 10 kan transesterificeres. Det kan være 0nskeligt at danne et sait direkte fra en ester ved en beskyttelsesfjernende frem-gangsmâde; nâr forbindelsen med formlen I er i form af en diester, kan dinatriumsaltet af forbindelsen med formlen I dan-nes ved at hydrolysere diesteren med 3 mol vandig NaOH pr.

15 mol diester, og nâr denne reaktion er afsluttet, tilsættes 1 mol vandig HCl pr. mol diester og det fremstillede sait fryset0rres derefter fortrinsvis. Salte kan ogsâ dannes, f. eks. ved aminogruppe, med en syre sâsom HCl eller HBr.

Den særlige beskyttende gruppe R1 vil i reglen væ-20 re valgt under hensyntagen til arten af R- og Y'-grupperne og det 0nskede produkt, dvs. sâledes at de betingelser, der er n0dvendige for àt fjerne R^-gruppen, ikke negativt pâvir-ker den ubeskyttede R-gruppe og ikke fjerner beskyttende e-stergrupper i Y', nâr disse er pâkrævet i slutproduktet. Et 25 ekseinpel pâ en R^-gruppe er en pivaloylgruppe, der kan fjer-nes i et hydrolyseringstrin under anvendelse af f.eks. NaOH

for at fjerne estergrupper fra Y'.

2 R er som anf0rt enten ækvivalent med R eller er 2 en 0nsket R-gruppe i beskyttet form. Sâledes kan R i sidst- 30 nævnte ti'lfælde f.eks. indeholde gruppen COOH i esterform eller gruppen OH beskyttet med en syregruppe. Eksempler pâ 2 sâdanne R -grupper er ethoxycarbonylmethyl og 3-acetoxypro-2 pyl. Disse R -grupper kan imidlertid selv være eksempler pâ R. Et andet eksempel pâ en beskyttet form af R forekommer, 35

DK 157019 B

10 0 2 nâr substituenten R ikke blot indeholder en ekstra gruppe, men nâr den foreligger i en form, der er forskellig fra R- -gruppen og undergâr omdannelse som det beskyttelsesfjernen- 2 de trin. Et eksempel herpâ er anf0rt senere, hvor en R -5 -gruppe 2-hydroxy-3-brompropyl undergâr en cycliseringsreak-tion under hydrolyseringsbetingerne til fjernelse af ester-grupper fra Y1 og danner en oxiranylmethylgruppe R.

Den beskyttede forbindelse med formlen la kan selv fremstilles ved en koblingsreaktion pâ fçôlgende mâde

10 O

jùy ‘ * 15 (X) n t

III II

1 2 hvor R , R , X, n og Y! har den for forbindelse la anf0rte 20 betydning, og X" er en afgâende gruppe, fortrinsvis halogen, f.eks. chlor eller brom, p-toluensulphonat, methylsulphonat eller trifluormethylsulphonat. Denne konjugering udf0res 1 reglen 1 nærværelse af en syreacceptor, f.eks. calciumcar-bonat, kallumcarbonat, 2,6-dimethylpyridin eller triethyl-25 amin og i et opl0sningsmiddel, f.eks. N,N-dimethulacetamid eller "Cellosolve".

Aminerne med formlen II ovenfor kan fremstilles 2 ved direkte reaktion af en forbindelse med formlen R X, hvor 2 R har den ovenfor anf0rte betydning, og X' er en afgâende 30 gruppe, fortrinsvis halogen, f.eks. chlor eller brom, p-toluensulphonat, methylsulphonat eller trifluormethylsulphonat, med N-(4-aminobenzoyl)-L-glutamat, -L-aspartat eller -poly--L-glutamat i beskyttet form.

En anden metode til dannelse af aminen med formlen 35 II er den af Santi i J. Heterocyclic Chem. 4 475 beskrevne der som udgangsmateriale anvender en 4-(((4-methylphenyl)--sulphonyl)-amino)-benzoatester, f0eks0 ethylesteren, der fâr

O

11

DK 157019 B

2 2 lov at reagere med en forbindelse R X' (hvor R og X' har 2 de ovenfor anf0rte betydninger) til indf0relse af R -grup- pen pâ aminonitrogenet. Derefter kan esteren hydrolyseres til den fri syre, omdannes til syrechloridet og derefter 5 kobles med en Y'-gruppe i beskyttet, f.eks. diester-, form.

Produktet er aminen med formlen II, der bærer den beskytten- de gruppe CH2-0-SO2 pâ aminogruppen, soin derefter kan fjernes.

Nâr man 0nsker af fremstille forbindelser, der in- deholder substituenter X, foretrækkes det f0rst at fremstil- ]_0 le det tilsvarende N- (4-nitrobenzoyl) -L-glutamat, -L-aspar- tat eller poly-L-glutamat i beskyttende form med en passende X^substituent og at omdanne den ved hydrogenering eller ved reduktion til det tilsvarende 4-aminoderivat, som derefter 2 omsættes med R X' til dannelse af en amin med formlen II.

]_5 Reaktanterne med formlen III ovenfor, hvor R^" = H

og Hal er brom eller chlor, kan fremstilles af den tilsvarende 6-brommethyl-2-trimethylacetamido(pivaloyl) forbindelse ved omsætning i tetrahydrofuran med henholdsvis vandig HBr og vandig-methanolisk HCl. Der kan anvendes N-bromsuccinimid 20 til bromering af 6-methyl-2-trimethylacetamido-quinazolinet.

En anden fremgangsmâde til dannelse af de beskyt-tede forbindelser med formlen la omfatter reaktion af den N10-usubstituerede konjugerede forbindelse i 2-amino-beskyt- 2 2 tet form og Y' i beskyttet form med R X', hvor R og X' har 25 de ovenfor anf0rte betydninger, i overensstemmelse med neden-stâende reaktionsskema:

Hflf^-ch2-nh-/ \-co-Y' (Ib)

30 R1 T

<X>n î r2 Îr=\ 9 - CH0-N-(. /)-C0-Y' .

35 R2X' \ Il | 2 // . (Ia)

T

R -NH (X)^

O

12

DK 157019 B

Forbindelsen med formlen Ib kan selv fremstilles ved f0lgende reaktion 0 JL ch2x"

! --O— *, XXX

'-j—' R-NH

<X>n 10 111 hvor X" har den ovenfor anf0rte betydning. Ved denne reaktion er det muligt i stedet for 6-CH2-X"-forbindelsen med formlen III at anvende de tilsvarende 6-formyl- eller 6-cy-anoforbindelser, eftersom forbindelsen med formlen lia ikke 15 har nogen R-gruppe pâ aminogruppen pâ dette reaktionstrin.

Forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen, kan anvendes i pharmaceutiske præparater, der omfatter en terapeutïsk effektiv mængde af et anti-can-cermiddel som defineret ovenfor og et pharmaceutisk accepta-20 belt bærestof eller fortyndingsmiddel. Eksperimenter fore-taget med mus med kunstigt implanterede tumorer har vist, at intraperitoenal injektion af anti-cancermidler, der fremstilles ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen, kan fremkalde en stigning i musenes gennemsnitlige overlevelsestid, der er af-25 haengig af den givne dosis. Endvidere lider disse dyr intet bemærkelsesværdigt vægttab eller udviser andre tegn pâ toksi-citet, medens de bliver behandlet med præparatet.

Præparaterne kan f.eks. foreligge i en.-forai, der er egnet til parentéral (f.eks. intraven0s, intramuskulær el-30 1er intracavitær), oral, topisk eller rectal indgivelse. Sær-lige præparatformer kan f.eks. være opl0sninger, suspensioner, emulsioner, cremer, tabletter, kapsler, liposomer eller mikro-reservoirer, især præparater i steril injicerbar form. For-bindèlserne, der fremstilles ved fremgangsmâden if0lge opfin-35 delsen, kan anvendes til behandling af cancer hos dyr og men-nesker ved indgivelse af et sâdant anti-cancer-middel. Tera-peutisk effective doser til mermesker menes at ligge i inter- 0 13

DK 157019 B

vallet 50-500 mg/kg legemsvægt.

Forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmâden if01ge opfindelsen, forventes at udvise en bredspektret anti-tumor-aktivitet mod leukæmiformer, maligne lymphoide lidelser 5 og en række faste tumorer, især carcinomer og sarcomer. Forbindelserne kan sâledes udover til anvendelse som enkelte mid-ler indgives samrnen med eller indeholdt i et blandet præparat, f.eks. med mitotiske inhibitorer (f.eks. "Vincristine", "Vinblastine"), alkyleringsmidler (f.eks. cyclophosphamid, "Melpha-10 lan", "Myleran", "Chlorambucil", "Mustine"), antimetaboliter (f.eks. 5-fluoruracilf 6-mercaptopurin, thioguanin, cytosin arabinosid, hydroxyurinstof), intercalarantibiotika (f.eks. "Adriamycin", "Bleomycin") eller enzymer (f.eks. asparaginase).

Forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmâden 15 if0lge opfindelsen, kan ogsâ anvendes som en del af en kombi-neret behandling, der f.eks. omfatter radioterapi og/eller ki-rurgi.

Den foreliggende opfindelse belyses i det f0lgende nærmere ved hjælp af eksempler.

20

Eksempel 1

Diethyl-N-(4-(prop-2-enylamino)benzoyl)-L-glutamat og diethyl-N-(4-(prop-2-ynylamino)-benzoyl)-L-glutamat alky-leres hver med 2-amino-6-chlormethyl-4-hydroxyquinazolin.

25 En omr0rt blanding af chlormethylquinazolin-hydro- chloridet og aminen (1 mol ækv.) i 2-ethoxyethanol (2,5 ml pr. mmol) opvarmes til 80°C. 2 molækv. triethylamin tilsættes derefter, sâ at der fâs en klar opl0sning, der opvarmes, ind-til tyndtlagschromatografi (10% Et0H-CHCl3/Si02) viser maksi-30 mal (men ikke fuldstændig) omdannelse. (Reaktionstid og -tem-peratur er hhv. 5 timer ved 100°C og 6 timer ved 105°C.) Op-10sningsmidlet fjernes i vakuum, og remanensen opl0ses i CHC13, og opl0sningen vaskes med vand. Ekstrakten t0rres (MgSO^) og inddampes, hvilket giver det râ produkt. Dette renses pâ si-35 licagel (180 g) ved HPLC, idet der elueres med 5% EtOH-CHCl^.

Produkterne er diethyl-N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy--6-quinazolinyl) methyl) prop-2-e;nylamino) benzoyl) -L-glutamat

O

14

DK 157019 B

(ester af CB 3716) og diethyl-N- (4- (N- ( (2-amino-4-hydroxy-6--quinazolinyl)-methyl)-prop-2-ynylamino)-benzoyl)-L-glutamat (CB 3721) i form af ikke-krystallinske gummiagtige faste stof-fer, hvis struktur bekræftes ved grundstofanalyse og NMR (op-5 I0sning i DMSO-Dg), og udbytterne og smeltepunkterne er: ester af CB 3716ï 21,5%, 107-112°C; CB 3721: 27,5%, 143-147°C.

Eksempel 2

Diethyl-N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-quinazolinyl)-]_0 -methyl)-prop-2-ynylamino)-benzoyl)-L-glutamat, et produkt i- f0lge eksempel 1, fremstilles ogsâ ved f0lgende fremgangsmâde: En opl0sning af 15,1 g 2-amino-6-brommethyl-4-hy-droxyquinazolin-hydrobromid og 16,2 g diethyl-N-(4-(prop-2--ynylamino)-benzoyl)-L-glutamat i 300 ml N,N-dimethylaceta-15 mid omr0res over 13,5 g calciumcarbonat i 65 timer ved 25°C. Calciumcarbonatet fjernes ved centrifugering ved 2000 om/min. i 15 minutter (det kan ogsâ fjernes ved filtrering gennem "Ce-lite"). Opl0sningsmidlet fjernes derefter ved 40°C/0,2 mm.

Det sâledes fremstillede râ produkt opl0ses i 5% volumen/vo-2o lumen éthanol i chloroform undtagen en lille rest og chroma-tograferes pâ silicagel (Merck. Art 15111), idet der elueres med 5% EtOH-CHCl^. Produktet, diethyl-N-(4-(N-((2-amino-4--hydroxy-6-quinazolinyl)-methyl)-prop-2-ynylamino)-benzoyl)--L-glutamat (CB3721) er et hvidligt fast stof, smeltepunkt 25 146-148°C (ukorrigeret), udbytte 69%. Strukturen bekræftes af grundstofanalyse.

Analyse: Beregnet for ^gH^NgOg : c 63,03, H 5,86, N 13,13.

Fundet: C 62,54, H 5,65, N 13,07.

Udgangsmaterialerne til anvendelse i eksemplerne 1 30 og 2 ovenfor kan fremstilles pâ f0lgende mâde:

Diethyl-N-(4-(prop-2-enylamino)-benzoyl)-L-gluta-mat fremstilles ved at behandle 5,00 g diethyl-N-(4-aminobenz-oyl)-L-glutamat i 100 ml ethanolisk opl0sning i 8 timer ved 60°C med 5,4 ml allylbromid i nærværelse af 2,14 g kaliumcar-35 bonat. Efter at opl0sningsmidlet er fjernet i vakuum, opl0-ses remanensen i chloroform, og opl0sningen vaskes med vand. Ekstrakten t0rres (MgSO^) og inddampes, hvilket giver det râ 0 15

DK 157019 B

produkt. Dette renses ved HPLC under anvendelse af 5,0:50 chloroform:petroleumether som elueringsmiddel.

Til fremstilling af diethyl-N-(4-(prop-2-ynylami-no)-benzoyl)-L-glutamat gentages processen med undtagelse af, 5 at reaktionen udf0res i 4 tinter ved 70°C under anvendelse af 10 ml af en 80%'s opl0sning af propargylbromid i toluen i stedet for allvlbromidet.

Strukturerne bekræftes ved grundstofanalyse og NMR-spektroskopi, og udbytterne og smeltepunkterne er: hhv. 76,5%, 10 60-61°C og 55,5%, 98-99°C.

Eksempel 3 N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-quinazolinyl)-methyl)-prop-2-enylamino)-benzoyl)-L-glutaminsyré (CB 3716) og N-(4-(N-2^5 - ( (2-amino-4-hydroxy-6-quinazolinyl)-methyl)-prop-2-ynylamino)- -benzoyl)-L-glutaminsyre (CB 3717) fâs af de tilsvarende diethyl-estere, der kan fremstilles som beskrevet i eksempel 1 eller 2 ved suspension i 25%'s vandig EtOH (20 ml pr. mmol) og behand-ling med IN vandig NaOH (4 mol ækv.). Kraftig rystning giver 20 i 10bet af 5 minutter en opl0sning. Efter en times forl0b klares opl0sningen ved filtrering gennem "Hyflo", og pH-vær-dien indstilles til 4,1 med IN vandig HCl. Herved fâs et ge-latin0st bundfald bestâende af produktet. Dette befries for uorganiske ioner ved hjælp af tre cycler med suspension, cen-25 trifugering og dekantering. Det amorfe, hvidlige, hygrosko-piske faste stof t0rres derefter ved 100°C i vakuum. Dette er homogent ved tyndtlagschromatografi i to systemer: (i) n--butanol:eddikesyre:vand (5:2:3), (ii) chloroform: methanol: eddikesyre (75:20:5).

3q Strukturerne bekræftes ved grundstofanalyse og ultraviolet spektroskopi (spektrene bestemmes i 0,1N vandig NaOH). üdbytte, smeltepunkt og UV-data er som f0lger: CB 3716: udbytte 46%, smeltepunkt 207-209°C, ÜV A-(nm) (£,) maksi-ma: 311,5 (29.100), 276 (17.600), 228,5 (49.300); minima: 35 282 (16.900), 252 (9.060). CB 3717: udbytte 81%, smeltepunkt 232-235°C, UVÎt(nm)(8) maksima: 301,5 (26.600), 279 (23.900), 229 (50.700); minima: 284 (23.700), 251,5 (9.800). Til brug 16

DK 157 019 B

Ο fremstilles CB 3717 som en koncentration pâ 10 mg/ml som di-natriumsaltet ved pH 8,5-9,0 i en opl0sning af fysiologisk saltvand (0,9% vægt/volumen NaCl).

I eksemplerne 1 og 3 bestemmes smeltepunkterne pâ 5 en Kofler-blok og korrigeres, og grundstofanalyser af de folat analoge fâs ved anvendelse af bâde et katalytisk addi-tiv og en oxygendonor. Hver forbindelse har en tilfredsstil-lende {- 0,4%). mikroanalyse for C, H og N. NMR-spektre be-stemmes pâ et Perkin-Elmer R12B 60 MHz spektrometer med und-tagelse af dem for produkterne i eksempel 1, der bestemmes ved 50°C pâ et Bruker HFX 90 MHz Fourier transform-instrument. Præparativ HPLC udf0res pâ Jobin-Yvon Chromatospac Prep 10 under anvendelse af silicagel (Merck Art 11695), idet elue-ringsmidlet ledes gennem en Cecil 212A ultraviolet monitor med variabel b0lgelængde. TLC foretages pâ Polygram PG 23 præ-overtrukne silicaplader (Macherey-Nagel & Co.). Cen-trifugering sker ved 20.000 g.

Eksempel 4 20 a) 6,436 g diethyl-N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-

-quinazolinyl)-methyl)-prop-2-ynylamino)-benzoyl-L-glutamat suspenderes i 130 ml vand og behandles med 0,1N vandig NaOH (36,19 ml, 3,00 mol.ækv.). Blandingen rystes yderst kraftigt i 45 minutter, hvorefter der fâs en opl0sning. Lidt tilbage-25 holdt materiale fjernes ved filtrering gennem sintermasse fin-hed 3. 6 timer efter den indledende tilsætning af NaOH

tilsættes 13,00 ml 0,1N vandig HCl, til opnâelse af pH 8,45. Opl0sningen, der indeholder nogle fâ gran udfældet materiale, fryset0rres, hvilket giver en blanding af dinatriumsaltet af N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-quinazolinyl)-methyl)-prop-2--ynylamino)-benzoyl-L-glutaminsyre (CB 3717) og natriumchlorid som et cremefarvet flaget amorft pulver. HPLC-analyse viser, at N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-quinazolinyl)-methyl)-prop--2-ynylamino)benzoyl-L-glutaminsyre (CB 3717) udg0r 99% af det 25 organiske materiale.

b) Ved en anden fremstilling omr0res 14,0 g diethyl-ester med 400 ml vand, 68 ml éthanol og 78,7 ml 0,IN vandig

O

17

DK 157019 B

NaOH. Efter en times forl0b klares opl0sningen ved filtre-ring og neutraliseres til pH 8,35 med 0,1N vandig HCl. Blan-dingen fryset0rres, hvilket giver 15,5 g af et cremefarvet fast stof. Eftersom blandingen er yderst hygroskopisk fâr 5 den lov at komme i ligevægt med atmosfæren, f0r der fors0ges mikroanalyse.

Analyse: Beregnet for C24H2iN5°6Na2 + (NaCD + 0,51 (HCl) +2,5 (H2QX(= C24H26,51N5°8,5Na3,31Cll,82^: C 43,56, H 4,03, N 10,58, Cl 9,75, Na 11,50, 10 H20 6,81.

Fundet: C 43,41, H 4,03, N 10,91, Cl 8,68, Na 11,53, H20 7,69.

Mere n0jagtige tal for Cl og H20 fâs fra en særskilt analyseret pr0ve, der fâs ved at bringe det t0rre materiale 15 i ligevægt med atmosfæren i 24 timer:

Fundet: Cl 9,48, H20 7,12.

HPLC-analyse af denne portion viser, at CB 3717 udg0r 98% af det organiske materiale.

20 Eksempel 5

En blanding af 1 molækv. 2-amino-6+brommethyl-4--hydroxyquinazolin-hydrobromid, 1 molækv. calciumcarbonat og 1 molækv. diethyl-N- (4-(phenacylamino)-benzoyl)-L-gluta-mat i 5 ml pr. mmol Ν,Ν-dimethylacetamid omr0res ved stue-25 temperatur i 60 timer. Blandingen filtreres, og opl0snings-midlet fjernes i vakuum. Den fremkomne olie renses ved chroma tografi pâ silicagel, idet der elueres med 5% methanol-me-thylenchlorid. Produktet, diethyl-N-(4-(N-((2-amino-4-hy-droxy-6-quinazolinyl) -methyl) -phenazylamino) ’-'benzoyl) -L-glu-30 tamat (CB 3744) har et smeltepunkt 148~150°C og bekræftes ved grundstofanalyse og NMR. En anden reaktion ved anvendel-se af 2 molækv. 2,6-dimethylpyridin i stedet for calciumcar-bonatet giver et identisk produkt.

Pâ lignende mâde fremstilles de f0lgende forbin-35 delser ved hjælp af calciumcarbonat som base ved alkylering af en passende amin:

“ DK 157019 B

° I 'Vf (K!»; °Η2Ν—? V- COKH.CH.COOC2H5

lG

h2n / 5

Forb. i r2 X m sm.p. ( °C)Fodnote CB No.

10 3745 -CH2COOC2H5 - 2 96-100° 1 -CH2CONH2 - 2 160°(dec) 2 3746 -CH2CH2Br - -2 139-142° 1,3 3748 -CH 20ξ0Η - '1 157-159° 1,3 15 3750 -CH2C=CH Cl 2 138-141° 1 3749 -CH2C=CH CH3 2 162-165° 1 3747 -CH2CH(OH)CH2Br - 2 137-139° 2,4 20 1) Elueret med 10% methanol-methylenchlorid 2) Elueret med 15% methanol-methylenchlorid 3) Reaktionen omr0res i 100 timer ved stuetemperatur 25 4) Fremstillet ved alkylering af diethyl-4-{3-hydroxy-l- -azetidinyl)-benzoyl-L-glutamat.

Aminudgangsmaterialer til anvendelse i eksempel 5 kan fremstilles pâ f0lgende mâde: A) 30 ÇHoC00CoHc J 2 2 5 Ilb R2 CH, I _ | 2 hn—r y— conh.ch.cooc2h5 35 o

19 DK 157019B

En blanding af 1 molækv. diethyl-N-(4-aminobenzo- yl)-L-glutamat, 1 molækv. 2,6-dimethylpyridin og 1 molækv.

ethylbromacetat i 2,5 ml pr. mmol Ν,Ν-dimethylacetamid om- r0res ved 90°C i 5 timer. Blandingen hældes i vand, ekstra- 5 heres med ethylacetat, og den organiske fase vaskes f0rst med vand, derefter IN svovlsyre og endelig saltvandsopl0sning.

Efter t0rring over vandfrit natriumsulphat fjernes opl0snings- mildet i vakuum, hvilket giver en brun olie, der krystallise- rer ved triturering med cyclohexan. Produktet, diethyl-N-(4- 2 j_q - (ethoxycarbonylmethylamino) -benzoyl) -L-glutamat (IXb: R = -CË^CCXX^H^) , har et smeltepunkt pâ 84-85°C og bekræftes ved grundstofanalyse og NMR. Pâ lignende mâde fremstilles de f0l-gende forbindelser ved virkning af et passende alkylerings-middel pâ aminen: 15 - -- R2 sm.p. (°C) Fodnote -CH2CONH2 167-169° 1,2,4 20 · -CH2C0-O 135-137° 1,3,4 1) Vandfrit kaliumcarbonat (0,5 molækv.) kan erstatte 2,6- 25 -dimethylpyridinet ved reaktionen.

2) Omr0rt ved 110°C i 4 timer.

3) Omr0rt ved stuetemperatur i 16 timer.

4) omkrystalliseret ud fra éthanol.

30 B) C00CoHc I ^ ** I I Ile HN-^ y-CONHCHCOOC2H5 ,

20 DK 157019B

ο

En blanding af 1 molækv. diethyl-N- ( 4-amino-2-me-thylbenzoyl)-L-glutamat, 1,1 molækv. 2,6-dimethylpyridin og 1,1 molækv. propargylbromid i 2 ml pr. mmol af aminen N,N-di-methylacetamid omr0res ved stuetemperatur i 16 timer. Blan-5 dingen hældes i vand, ekstraheres med ethylacetat, og den or-ganiske fase vaskes med vand, t0rres over vandfrit magnesium-sulphat, og opl0sningsmidlet fjernes i vakuum. Den fremkomne olie renses ved chromatografi pâ silicagel, idet der elueres med 30%!s ethylacetat-methylenchlorîd. Produktet, diethyl-10 -N-(4-(prop-2-ynylamino)-2-methylbenzoyl)-L-glutamat (Ile: R = -CH2C-CH, X -- -CH-j, m = 2) har smeltepunkt 85-87°C og bekræftes ved grundstofanalyse og NMR. Pâ lignende mâde fremstilles f0lgende forbindelser ved at lade et passende al-kyleringsmiddel indvirke pâ den pâgældende amin: 15 _ _____ r2 X m sm.p. (°c) Fodnote -CH^CSCH Cl 2 oil 1 20 -ch2cs:h — i oil -CH2CH2Br — 2 67-69° (dek. 2,3 1) Elueret med 20%'s ethylacetat-methylchlorid.

25 2) Der anvendes 5 molækv. alky1eringsmiddel, 3 molækv. vand frit calciumcarbonat i stedet for 2,6-dimethylpyridin og omr0res ved 90°C i 16 timer.

3) Den vandige oparbejdning udelades, og efter fjernelse af reaktionsopl0sningsmidlet i vakuum renses den râ olie pâ 3q silicagel, idet der elueres med et trinvis stigende for- hold mellem 25%'s ethylacetat-hexan og 50% ethylacetat-hex-an.

C) ch2cooc2h5 /CH2 \ fH2 35 HO-/ N-/^-CONH.CH.COOC2H5 ixd o

21 DK 157019 B

En blanding af 1 molækv. diethyl-N-(4-aminobenzo-yl)-L-glutamat, 2,5 molækv. calciumcarbonat og 5 molækv. epi-bromhydrin og Ν,Ν-dimethylacetamid i en mængde af 2 ml pr. mmol amln omr0res ved 90°C i 40 timer. Blandingen filtreres, 5 og opl0sningsmîdlet fjernes i vakuum. Den fremkomne olie renses ved chromatografi pâ silicagel, idet der elueres med 25% ethylacetat-hexan. Produktet, diethyl-4-(3-hydroxy-l--azetidinyl)-benzoyl-L-glutamat har smeltepunkt 87-90°C og bekræftes ved grundstofanalyse og NMR.

10 °)

Til en omr0rt opl0sning af diethyl-N-(2-chlor-4--nitrobenzoyl)-L-glutamat i 55% ethanol-vand (20 ml pr. mmol) ved stuetemperatur sættes 6 molækv. natriumhydrogencarbonat efterfulgt af protionsvis tilsætning af 3 molækv. natriumdi-15 thionit i 10bet af 20 minutter. Efter omr0ring i yderligere en time fjernes ethanolen i vakuum, og remanensen fortyndes med saltvandsopl0sning. Forbindelsen ekstraheres i ethylacet-at og renses ved tilbageekstrahering i 2N saltsyre, neutrali-sering med natriumbicarbonat og genekstrahering i ether. E-20 therekstrakten t0rres over vandfrit magnesiumsulphat, og op-I0sningsmidlet fjernes i vakuum, hvilket giver en olie, der krystalliserer ved henstand. Produktet, diethyl-N-(2-chlor- 4-aminobenzoyl).^L-glutamat, har smeltepunkt 73-75°C og bekræftes ved grundstofanalyse og NMR.

25 E)

Diethyl-N-(2-methyl-4-nitrobenzoyl)-L-glutamat i ethanolisk opl0sning (8 ml pr. mmol). hydrogeneres under an-vendelse af 10% palladium-trækul, indtil den teoretiske mængde hydrogen er blevet brugt. Reaktionsopl0snïngen filtreres, 30 °9 opl0sningsmidlet fjernes i vakuum, hvilket giver en olie, der krystalliserer ved henstand. Produktet, diethyl-N-(2-me-thyl-4-aminobenozyl)-L-glutamat, har smeltepunkt 98-100°C og bekræftes ved grundstofanalyse og NMR.

F) 35 Til en omr0rt suspension af 1 molækv. diethyl-L- -glutamat-hydrochlorid i 0,5 ml pr. mmol toluen afk01et til 0°C sættes 2,5 molækv. pyridin efterfulgt af drâbevis tilsæt- 0 22

DK 157019 B

ning af en opl0sning af 1,5 molækv. 2-methyl-4-nitrobenzoyl-chlorid opl0st i toluen i en mængde pâ 0,7 ml pr. mmol i 10-bet af 20 minutter. Omr0ringen fortsættes i yderligere 30 minutter ved 0°C og derefter i en time ved stuetemperatur.

5 Efter fortynding med toluen ekstraheres blandingen med vand, 2N saltsyre, 5%'s natriumhydrogencarbonatopl0snxng og vand.

Den organiske fase t0rres over vandfrit matnesiumsulphat, og opl0sningsmidlet fjernes i vakuum. Den herved fremkomne olie renses ved chromatografi pâ silicagel, idet der elueres med 10 ethylacetat-60-80°C petroleumether (1:1). Produktet, diethyl--N-(4-amino-2-methylbenzoyl)-L-glutamat, har smeltepunkt 67-68°C og bekræftes ved grundstofanalyse og NMR.

Eksempel 6

15 COOH

I iri (ïH2)m y~~ conhchcooh Id

H2N

1 molækv. diethyl-N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6--quinazolinyl)-methyl)-phenacylamino)-benzoyl)-L-glutamat suspenderes i 33%'s ethanol-vand (40 ml pr. mmol) og behand-25 les med 3 molækv. IN vandig natriumhydroxidopl0sning, og blandingen omr0res ved stuetemperatur i 18 timer. Tilsætning af 3 molækv. 0,1N vandig saltsyre giver et gelatin0st bund-fald, der renses ved seks cycler bestâende af centrifugering, dekantering og gensuspendering i destilleret vand. Den ende-30 lige vandige suspension fryset0rres, hvilket giver et amorft hvidt fast stof. Produktet, N-(4-(N-{(2-amino-4-hydroxy-6--quinazolinyl)-methyl)-phenacylamino)-benzoyl)—L-glutaminsyre (Id: R = -CT^-CO-^ ingen X-gruppe, m = 2, CB 3733) be- 35 kræftes ved grundstofanalyse og proton-NMR (opl0sning i DMSO--d6), S 2,0 (2H, m), 2,3 (2H, m), 4,4 (1H, m), 4,7 (2H, s), 5,2 (2H, s), 6,6 (2H, d), 6,5-7,0 (2H, b), 7,2 (1H, d, J 7 Hz), 7,4-7,8 (6H, mj, 7,85 (1H, d, J 8 Ho), 5.75 i2K, m), 8,15 (1H, o

23 DK 157019 B

Hydrolysereaktionen i ovenstâende eksempel sker fra en diester via en monosyre, monoester, der ikke isoleres, men hydrolyseres in situ til disyren. Pâ lignende mâde fréinstallés f0lgende forbindelser ved hydrolyse af de passende 5 estere: ' Forb. R X xn Fodnote ' CB No.

3728 -CHoC00H - 2 1,2,7 10 2 3734 -CH2CONH2 2 8 3735 -CH2CH2Br - 2 3,9 3737 -CH2C=CH - 1 4,10 15 3739 -CH2C^CH Cl 2 4,11 3738 · -CH2C=CH CH3 2 4, 12 3736 /°\ - 2 5,6,13 -CH2CH-CH2 20 1) Der anvendes 4 ækvivalenter natriumhydroxid og saltsyre.

2) Udgangsmaterialet er N"^ ethoxycarbonylmethylderivatet.

3) Reaktionstiden er 6 timer ved stuetemperatur.

25 4) Der anvendes ethanol-vand (1:1).

5) Der anvendes 4 ækvivalenter natriumhydroxid.

6) Udgangsmaterialet er N^-2-hydroxy-3-brompropylderivatet.

7) NMR i DMSO-dg : §2,0 (2H, m) , 2,3 (2H, m) , 4,2 (2H, s), 4,4 (1H, m), 4,7 (2H, s), 6,65 (2H, d), 7,1 (1H, d, J 7 Hz), 30 7,5 (1H, dd, J 7,3 Hz), 7,7 (2H, d), 7,8 (1H, d, J 3 Hz), 7,9 (1H, d).

8) NMR i DMSO-dg : 6 2,05 (2H, m) , 2,4 (2H, m)', 4,1 (2H, s), 4,4 (1H, m), 4,7 (2H, s), 6,3 (2H, b), 6,7 (2H, d), 7,15 (1H, d, J 7 Hz), 7,0-7,4 (2H, b), 7,5 (1H, dd, J 7,3 Hz), 35 7,7 (2H, d), 7,75 (1H, d, J 3 Hz), 8,1 (1H, d).

9) NMR i DMSO-dg : £l,9 (2H, m) , 2,2 (2H, m) , 3,6-4,0 (4H, m), 4,25 (1H, m), 4,6 (2H, s), 6,3 (2H, b), 6,7 (2H, d), 7,1 o

DK 157019 B

O A

(1H, d, J 7 Hz), 7,3 (1H, bd), 7,6 (3H, m), 8,1 (1H, d).

10) NMR i DMSO-dg: 6 2,7 (2H, m), 3,1 (1H, t, J 1,5 Hz), 4.3 (2H, d, J 1,5 Hz), 4,7 (3H, m), 6,4 (2H, b), 6,85 (2H, d), 7,2 (1H, d, J 7 Hz), 7,5 (1H, dd, J 7,3 Hz), 5 7,7 (2H, d), 7,8 (1H, d, J 3 Hz), 8,2 (1H, d)„.

11) NMR i DMSO-dg*. <$ 1,95 (2H, m) , 2,3 (2H, m) , 3,2 (1H, s), 4.3 (3H, m), 4,65 (2H, s), 6,5 (2H, b), 6,7-6,9 (2H, m) , 7,15 (1H, d, J 7 Hz), 7,25 (1H, d, J 7 Hz), 7,5 (1H, dd, J 7,3 Hz), 7,8 (1H, d, J 3 Hz), 8,35 (1H, d).

10 12) NMR i DMSO-dgï à 2,0 (2H, m), 2,3 (2H, m), 2,4 (3H, s), 3,1 (1H, t, J 1,4 Hz), 4,2 (2H, bs), 4,3 (1H, m), 4,6 (2H, s), 6,1-6,6 (2H, b), 6,6-6,8 (2H, m), 7,15 (1H, d, J 7 Hz), 7,25 (1H, d, J 7 Hz), 7,5 (1H, dd, J 7,3 Hz), 7,8 (1H, d, J 3 Hz), 8,1 (1H, d).

15 13) NMR i DMSO-dg: 6 1,9 (2H, m), 2,2 (2H, m), 2,5 (1H, dd, J 5,2 Hz), 2,65 (1H, t, J 5 Hz), 3,1 (1H, m), 3,3-4,0 (2H, m), 4,3 (1H, m), 4,6 (2H, s), 6,3 (2H, b), 6,7 (2H, d), 7,1 (1H, d, J 7 Hz), 7,35 (1H, bd, J 7 Hz), 7,6 (3H, m), 8,1 (1H, d).

20

Eksempel 7

En opl0sning af 7,5 mmol 6-brommethyl-4-hydroxy-2--trimethylacetamidoquinazolin i 25 ml N,N-dimethylacetamid indeholdende 15 mmol calciumcarbonat suspenderet deri frem-25 stilles ved 60°C. En opl0sning af 7,5 mmol diethyl-N-(4-(3--acetoxypropylamino)-benzoyl)-L- glutamat i 10 ml N,N-dime-thylacetamid sættes til den omr0rte reaktionsblanding i 10-bet af 90 minutter. Efter omr0ring i yderligere 12 timer ved 6Q°C filtreres reaktionsblandingen, og filtratet ekstra-30 heres med ethylacetat efter tilsætning af 10 volumendele vand. Den organiske fase vaskes med vand, og opl0sningsmid-let fjernes i vakuum, hvilket giver en olie.

Olien chromatograferes pâ silicagel (Merck 60) un-der anvendelse af blandinger af methylenchlorid og ethylace-35 tat som elueringsmiddel. Passende fraktioner inddampes til t0rhed under formindsket tryk, hvilket giver en olie. Nâr dette produkt t0rres under vakuum, £âs et skumlignende fast stof, diethyi-lï- (4- (N- ( (4-hyâiO3îy-iyiacetcüXiid-S-qui- 25

DK 15 7 019 B

Ο nazolinyl)-methyl)-3-acetoxypropylamino)-benzoyl)-L-glutamat, smeltepunkt 61-64°C.

Amin-udgangsmaterialet, der anvendes i eksempel 7 ovenfor, kan fremstilles pâ f0lgende mâde: 5 0,002 mol diethyl-N-(4-aminobenzoyl)-L-glutamat og 0,02 mol 3-acetoxypropylbromid kondenseres i 20 ml N,N-dime-thylacetamid i 12 timer ved 100°C i nærværelse af 0,02 mol ka-liumcarbonat. Produktet isoleres som i eksempel 5 B), og den herved fremkomne olie chromatograferes pâ silicagel (Merci 10 60) under anvendelse af en blanding (2:1) af methylenchlorid og ethylacetat som elueringsmiddel, hvilket giver en olie, der krystalliserer ved henstand, smeltepunkt 59-62°C.

Eksempel 8 15 0,74 mmol diethyl-N-(4-(N-((4-hydroxy-2~trimethyl- acetamido-6-guinazolinyl)-methyl)-3-acetoxypropylamino)-benzoyl) -L-glutamat hydrolyseres under anvendelse af 5 ækviva-lenter vandig natriumhydroxidopl0sning (0,2N, 18,4 ml) i 75 ml éthanol ved 50°C natten over. Produktet isoleres ved til-20 sætning af 0,2 vandig saltsyre til pH 4 og derefter som i eksempel 6, hvilket giver N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-quina-zolinyl)-methyl)-3-hydroxypropylamino)-benzoyl)-L-glutaminsyre (CB 3729) , smeltepunkt 220°C (s0nderdeling).

NMR (90 MHz i DMSO-dg): 6 1,7-2,5, en multiplet (6H), 25 3,6, en multiplet (4H), 4,4, en multiplet (1H), 4,7, en sin- glet (2H), 6,5, en bred singlet (2H), 6,7, en dublet J = 8,5 Hz (2H), 7,2, en dublet, J = 8 Hz (1H), 7,5, en dublet af du-bletter, J = 1,5, 8 Hz (1H), 7,7, en singlet og dublet (3H), 8,1, en dublet, J = 7 Hz (1H).

30

Eksempel 9

En opl0sning af 1,00 g 2-amino-6-brommethyl-4-hy-droxyquinazolin-hydrobromid og 1,00 g diethyl-N-(4-(((5-ura-cilyl)-methyl)-amino)-benzoyl)-L-glutamat i 20 ml Ν,Ν-dime-35 thylacetamid omr0res over 0,67 g calciumcarbonat i 140 timer ved stuetemperatur (23°C)» Calciumcarbonatet fjernes ved filtrering gennem "Celite", og derefter fjernes opl0snings-

O

DK 157019 B

midlet ved 45°C/0,05 mm. Det râ produkt, der derved fâs, op~ l0ses i 20% volumen/volumen éthanol i chloroform med undtagel-se af en lille rest og chromatograferes pâ silicagel (Merck,

Art 15111), idet der elueres med 20% EtOH-CHCl^. De passende 5 fraktioner forenes og inddampes, og slutopl0sningsmidlet er éthanol ved gentagne inddampninger af tilsat éthanol. Volu-minet reduceres til 50 ml, og de fremkomne hvide krystaller, der fâs ved centrifugering, vaskes ved gensuspendering i éthanol, centrifugering og dekantering. T0rring (p2°5^ giver det 10 urene produkt (32,7%) som et hvidligt fast stof, smeltepunkt !> 350°C med en smule s0nderdeling op mod denne temperatur. NMR-spektroskopi viser, at materialet indeholder quinazolin, uracil og benzoyl-glutam-molekyldelene i det rigtige 1:1:1--forhold til at være produktet diethyl-N-(4-(N-((2-amino-4-15 -hydroxy-6-quinazolinyl)-methyl-N-(5-uracilyl)-methylamino)--benzoyl)-L-glutamat.

Amin-udgangsmaterialet, der anvendes i eksempel 9 ovenfor, kan fremstilles pâ f0lgende mâde: 3,22 g diethyl-N-(4-aminobenozyl)-L-glutamat behand-20 les i 60 ml N,N-dimethylacetamidopl0sning i 70 timer ved 23°C med 1,93 g 5-chlormethyluracil i nærværelse af 3,00 g calci-umcarbonat. Calciumcarbonatet fjernes ved filtrering gennem "Celite", og det râ produkt fâs ved fjernelse af opl0snings-midlet ved 40°C/0,2 mm. Et fors0g pâ rensning ved at dele 25 olien mellem chloroform og vand f0rer til dannelse af et emulsionslignende bundfald i det organiske lag. Det vandige lag dekanteres, og den 0vrige suspension filtreres, idet det tilbageblevne hvide’ faste stof vaskes med varm éthanol. Det forenede filtrat og vaskevæskerne inddampes til t0rhed. Det 30 fremkomne faste stof ekstraheres f0rst med varm chloroform og derefter med varm dichlormethan for at fjerne noget af udgangsaminen. Det 0vrige hvide faste stof omkrystalliseres til slut ud fra éthanol, hvilket giver produktet som hvide mikronâle, smeltepunkt 183-200°C. Strukturen bekræftes- ved 35 grundstofanalyse og NMR-spektroskopi.

o

27 DK 157019 B

Eksempel 10 0,327 g diethyl-N-(4-(N”2-amino-4-hydroxy-6=qui‘-nazolinyl)-methyl-N-(5-uracilyl)-methyl-amino)-benzoyl)-L--glutamat suspenderes i en blanding af 7 ml vand og 2 ml 5 éthanol og behandles med 6 molækv. IN NaOH. Kraftig ryst-ning giver en opl0sning i I0bet af 30 minutter. Efter yder-ligere 1,5 timer klares opl0sningen ved filtrering, og pH bringes pâ 4,0 ved anvendelse af IN vandig saltsyre. Her-ved fremkomer et findelt bundfald af produkt. Dette befries 1q for uorganiske ioner ved tre cycler omfattende suspension, centrifugering og dekantering. Det amorfe hvide faste stof t0rres ved 40°C i vakuum, hvilket giver den rene divalente syre, N- (4- (N- (2-amino-4-hydroxy~6-quinazolinyl) -methyl-N--(5-uracilyl)-methyl-amino)-benzoyl)-L-glutaminsyre (CB 3743) 15 som dihydratet (68%), smeltepunkt 250-255°C. Strukturen bekræftes af grundstofanalyse (C, H, N) og af UV-spektrosko= pi (spektrum bestemt i vandig 0,1N NaOH). /L (nm)(E)maksima? 310 (29.200), 276,5 (22.000), 230 (50.700); minima: 282,5 (21,500), 251,5 (11.600).

20

Eksempel 11

En opl0sning af 0,420 g 2-amino-6-brommethyl-4--hydroxyquinazolin-hydrobromid og 0,370 g diethyl-N-(4-(2--fluorethylamino)-benzoyl)-L-glutamat i 8 ml dimethylaceta-25 mid omr0res og 0,417 g calciumcarbonat i 45 timer ved stue-temperatur (23°C). Calciumcarbonatet fjernes ved filtrering gennem "Celite", og derefter fjernes opl0sningsmidlet ved 40-55°C/0,02 mm. Det sâledes opnâede râ produkt opl0ses i 5% volumen/volumen éthanol i chloroform med undtagelse af en 30 lille rest og chromatograferes pâ silicagel (Merck, Art 15111, 250 g), idet der elueres med 5% EtOH-CHClg. Produktet, die-thyl-N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy~6-quinazolinyl)-methyl)-2--fluorethylamino)benzoyl)-L-glutamat, er et hvidt fast stof, smeltepunkt 115-120°C (46,3%). Strukturen bekræftes ved 35 grundstofanalyse (C, H, N og F) og af NMR-spektroskopi.

Amin-udgangsmaterialet, der anvendes i eksempel 11 ovenfor, fremstilles pâ f0lgende mâdes

O

28 DK 157019 B

3,22 g diethyl-N-(4-aminobenozyl)-L-glutamat behand-les i 40 ml DMF-opl0sning i 17 timer ved 135°C med 4,36 g 2--fluorethyl-p-toluensylphonat (W.F.Edgell og L. Parts, J. Am. Chem. Soc., 77, 4899 (1955)) i nærværelse af 3,00 g calcium-5 carbonat. Det er n0dvendigt at tilsætte yderligere reaktant (4,36 g) efter 2 timer og 45 minutter. Calciumcarbonatet fjernes ved filtrering gennem "Celite", og efter fjernelse af opl0sningsmidlet i vakuum opl0ses remanensen i chloroform, og opl0sningen vaskes med vand. Ekstrakten t0rres (MgSO^) 10 og inddampes, hvilket giver det râ produkt. Dette renses ved HPLC pâ silicagel (Merck, Art 15111) under anvendelse af 50:50 chloroform:petroleumether som elueringsmiddel. Der fâs hvide krystaller (11,3%), smeltepunkt 105,5-106,5°C. Strukturen bekræftes ved grundstofanalyse (C, H, N og F) og 15 ved NMR-spektroskopi.

Eksempel 12 0,206 g N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-quinazolinyl)-methyl)-2-fluorethylamino)-benzoyl)-L-glutamat suspenderes i 2o en blanding af 4,5 ml vand og 1 ml éthanol og behandles med 5 molækv. IN vandig NaOH. Kraftig rystning giver en opl0s-ning i 10bet af 5 minutter. Efter 2 timers forl0b klares op-l0sningen ved filtrering, og pH bringes pâ 4,0 ved anvendelse af IN vandig saltsyre. Herved fâs et gelatin0st bundfald 25 af produkt. Det befries for uorganiske ioner ved tre cycler hver bestâende af suspendering, centrifugering og dekantering. Det amorfe hvide faste stof t0rres ved 70°C i vakuum (smeltepunkt 1>350°C med en vis m0rkfarvning og langsom s0nderdeling fra 245°C), hvilket giver N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-qui-30 nazolinyl)-methyl)-2-fluorethylamino)-benzoyl)-L-glutaminsyre (CB 3731) i et udbytte pâ 60,1%. Strukturen bekræftes ved grundstofanalyse (C, H, N og F) og ved UV spektroskopi (spek-trum bestemt i vandig 0,1N NaOH) . UV 9t(nm) (£..) maksima: 307 (29.200), 275 (19.500), 227,5 (49.700)? minima: 279 (19.200), 35 250 (9.100).

o

29 DK 157019 B

Eksempel 13

Til en opl0sning af 2,111 g diethyl-N-(4-(N-((2--amino-4-hydroxy-6-quinazolinyl)-methyl)-amino)-benzoyl)-L--glutamat (S.P.Acharya og J.B. Hynes, J. Heterocyclic Chem.

5 12, 1283 (1975)) i 21 ml iseddike sættes 0,384 g paraformal- dehyd (3 molækv.), 0,832 g kaliumcyanid (3 molækv.) og 2,119 g vandifrit zinkchlorid (3,65 molækv.). Den fremkomne opslæm-ning deles, efter at være blevet omr0rt med udelukkelse af fugt i 16,5 timer, mellem chloroform og vand.

10 Den organiske fase fjernes, vaskes med vand og t0r- res (MgSO^). Afdampning af opl0sningsmidlet efterlader det râ produkt som et gult fast stof. Dette chromatograferes to gange pâ silicagel (Merck, Art. 11695), idet det pâf0res ko-lonnen hver gang i 6%'s éthanol i chloroform, og der elueres 15 med samme opl0sningsmiddel. Produktet renses yderligere ved at f0re det ned gennem en tredje silica-kolonne (Merck, Art 15111), idet det denne gang pâf0res som overtræk pâ silica (Merck, Art 7734), der fâs ved inddampning af en DMF-opl0s-ning ved 70°C. (Spor af DMF fjernes ved t0rring (^2^5^ ^ va” 20 kuum i 48 timer). Elueringen sker med 6%'s éthanol i chloroform. Produktet, diethyl-N-(4-(N-((2“amino-4-hydroxy-6-qui-nazolinyl)-methyl)-cyanomethylamino)-benzoyl)-L-glutamat, er et hvidligt fast stof, smeltepunkt 145-160°C. Udbytte 44%. Strukturen bekræftes ved grundstofanalyse og ved NMR-spektro-25 skopi.

Analyse: Beregnet for C27H30N6^6: C 60,66, H 5,66, N 15,72.

Fundet: C 60,53, H 5,85, N 15,86.

At -CH9-CN-molekyldelen ( (5 4,73 s, 2H) er knyttet 10 Δ til N , bekræftes ved iagttagelse af, at signalet (d, 2H) 30 fra 3'- og 51-protonerne er flyttet fraô6,62 til fS 6,95, hvilket tyder pâ elektronfjernelse af molekylets broomrâde.

Eksempel 14 0,108 g diethyl-N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-qui-35 nazolinyl)-methyl)-cyanomethylamino)-benzoyl)-L-glutamat sus-penderes i en blanding af 2,5 ml vand og 0,5 ml éthanol og behandles med 3 molækv. IN vandig NaOH. En kortvarig omr0r n

O

30 DK 157019 B

(10 minutter) giver en næsten fuldstændig opl0sning. Efter yderligere 1,25 timer fjernes en smule tilbageblevet mate-riale ved filtrering, og pH bringes pâ 4,1 med IN vandig salt-syre. Herved fâs et gelatin0st bundfald àf produkt. Dette 5 befries for uorganiske ioner ved hjælp af to cycler bestâende af suspension, centrifugering og dekantering. Det klare faste produkt, N-(4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6-quinazolinyl)-me-thyl-(cyanomethylamino)-benzoyl)-L-glutaminsyre (CB 3726) t0r-res over £*2^5' til ved 80°C i vakuum, smeltepunkt - in- 1q tet, det bliver til harpiks mellem 210 og 250°C. üdbytte 46%.

Analyse: Beregnet for C23H22N6°6: C 57/74, H 4,63, N 17,56.

Fundet: C 57,89, H 4,77, N 17,59.

15 Nedenstâende sammensætning tjener til belysning af de pharmaceutisk præparater, der kan fremstilles med de ak-tive forbindelser, der fremstilles ved fremgangsmâden if0lge opfindelsen: 20 Pr. tablet (vægt/væqt)

Aktiv forbindelse (mikroniseret) 83,3% "Avicel" (mikrokrystallinsk cellulose) 12,7%

Polyvinylpyrrolidon 1 % 25 Algininsyre 2 %

Magnesiumstearat 1 %

Den aktive forbindelse kan blandes med "Avicel" , og polyvinylpyrrolidon tilsættes opl0st i tilstrækkelig in-3q duestiel denatureret sprit 74° OP til opnâelse af en masse, der er egnet til granulering. Massen kan granuleres gennem en 20 mesh-sigte (britisk standardmesh), og det 'fremkomne granulat t0rres ved en temperatur, der ikke overstiger 50°C.

Det t0rrede granulat kan passeres gennem en 20 mesh-sigte, 35 og derefter tilsættes algininsyren og magnesiumstearatet og blandes med granulatet. Produktet kan slâs til tabletter.

31

DK 157019 B

0

Ved saimne metode kan f01gende sarnraensætning frem- stilles:

Pr. tablet (vægt/vægt) 5 Aktiv forbindelse 62,5% "Avicel" (mikrokrystallinsk cellulose) 33,5%

Polyvinylpyrrolidon 1 %

Algininsyre 2 % ]_q Magnes iumstearat 1 %

Desuden kan tabletter hâve f01gende sammensætnings

Pr. tablet (vægt/vagt) ]_5 Aktiv forbindelse (mikroniseret) 83,3%

Lactose (300 mesh) 6,3%

Majsstivelse 5 % Gélatine 3,3%

Magnesiumstearat 2 % 20

Disse tabletter kan fremstilles ved at blande den aktive forbindelse med lactose og halvdelen af den samlede mængde majsstivelse, der krasves, og til massen sætte en 5%"s vægt/volumen-opl0sning af gélatine i vand.

25 Produktet kan granuleres gennem en 16 mesh-sigte, og det fremkomne granulat t0rres til konstant vægt ved en temperatur, der ikke overstiger 60°C. Det t0rrede granulat kan passeres gennem en 20 mesh-sigte og blandes med magnésium-stearat og og den sidste del af majsstivelsen. Produktet kan 30 slâs til tabletter.

En injicerbar opl0sning kan fremstilles pâ f0lgende mâde: Nâr forbindelsen, der fremstilles ved fremgangsmâ-den if0lge opfindelsen, er i syreform, kan den (2 mmol) opl0-35 ses i 100 ml 0,9%'s vandig NaCl, der indeholder tilstrækkelig NaOH eller anden passende base til neutralisering.

ο

32 DK 157019B

Forbindelserne if0lge eksempel 2 bed0mmes in vitro som inhibitorer af TS og cellevækst og in vivo over for L1210-tumoren. Eftersom methotrexat (MTX)-resistens er et betydningsfuldt problem ved cancerterapi, unders0ges for-5 bindelserne, der fremstilles ved fremgangsmâden if0lge opfin-delsen, ogsâ ud fra dette synspunkt. Krydsresistensen hos den MTX-resistente cellelinie L1210/R71, der vides at hâve forh0jet DHFR-, men normal MTX-overf0rsel, mâles under dyrkning, og de aktive forbindelsers evne til at konkurrere 10 med mærket MTX eller folinsyre med henblik pâ overf0rsel ind i Ll210-celler bed0mmes ligeledes.

Enzymologi. Forbindelserne CB 3716 og CB 3717 op-10ses hver i N/10 NaOH og neutraliseres f0r anvendelse. Cyto-solen af "log phase" Ll210-celler h0stet fra dyrene renses 25 delsvis med henblik pâ TS *50“ og Ki-bestemmelse for fra prae-paratet at fjerne en phosphatase, der nedbryder dUMP til de-oxyuridin. (I^q defineres som den inhibitorkoncentration, der er n0dvendig for at reducere TS's reaktionshastighed med 50%). DHFR renses ved hjælp af affinitetschromatografi, og 20 Ki-bestemmelserne udf0res.

Resultaterne er vist i nedenstâende tabel Ifog der foretages en sammenligning med den 10-propylforbindelse, der svarer til CB 3716 og 3717.

25 Tabel I

Thvmidylat- Dihydrofolat-synthetase redu]<tase

Forbindelse R_;_I50 _Ki (nM)_

Sammenligning -CH2-CH2-CH3 170 20 30 CB3716 -CH2-CH=CH2 69 27 CB3717 -CH2-C=CH 5 14

Tilstedeværelsen af allyl- og propargylgrupper i 33 10-stillingen giver i sammenligning med propylgruppen TS-in-hiberingsværdier, der er for0get henholdsvis ca. 3 og 30 gange, medens DHFR-inhiberingen forbliver af samme st0rrel-sesorden. Forbindelse CB3717's TS-inhibering beskrives og

O

„ DK 157019 B

•J ·«_* 5 10 viser sig at være pâ h0jde med N ,N -methylentetrahydrofo-lat med en Ki-værdi pâ ca. Ι,ΙηΜ.

Cellekultur. L1210- og L1210:R71-celler dyrkes ved kontinuerlig suspensionsdyrkning i RPMI 1640-medium, der in-5 deholder 10% hesteserum (Flow Laboratories, Irvine, Scotland, 5 UK). Cellerne fortyndes til 10 /ml, og der foretages tilsæt-ninger (fortyndet i medium og steriliseret ved "Millipore"-filtrering), der er fremstillet, f0r hver inkubering pâbegyn- des. Der foretages celletællinger efter 24 og 48 timers for= 10 10b ved anvendelse af et forbedret Neubauer hæmocytometer.

IDgg defineres soin den præparatkoncentration, der er η0άνβη~ dig for at reducere 48-timers tællingen til 50% af kontrollen, IDgg-koncentrationerne i cellekultur fo.r L1210 og L1210:R71 (MTX-resistent) er vist i tabel II nedenfor. Tok=

15 siciteten af præparaterne over for begge cellelinier tiltog ikke blot ved progressiv umættethed af 10-substituenten, men ogsâ graden af krydsresistens for L1210.«R71 blev mindre udtalt. L1210:R71 er ca. 600 gange sâ résistent over for MTX

20 Tabel II

ID50-værdier (um) Krydsresistens

Forbindelse L1210 L1210;R71 (ID5Q L1210:R71/ID5Q L1210) Φ )

Sammenligning '33,0 315 10 25 CB 3716 8,8 100 11 CB 3717_5^0_14_3______ *) forbindelse svarende til CB 3716 og 3717, hvor R - propyl

Reversering af forbindelse CB 3717's toksicitet a 30 opnâs ved co-inkubering med thymidin (10 jamol) , men kun dei vis reversering opnâs med folinsyre i en hvilken som helst kon= centration op til 100 jimol. Disse resultater er illustreret i fig. 1 pâ den ledsagende tegning, der viser Ll210-cellernes beskyttelse med 20 jimol CB 3717 ved dyrkning.

35 · CB 3717 alene; o CB 3717 + folinsyre 5 jimol? □ CB 3713 + folinsyre 50 pmol? q CB 3717 + folin-syre 500 jimol? 0

34 DK 157019 B

CB 3717 + tdr ljamol; CB 3717 + tdr 10 jimol.

Disse résultater tyder pâ at CB 3717 virker pâ TS som hovedlocus, især fordi dets affinitet over for DHER er 10 gan~ ge mindre end overfor TS, og ogsâ fordi det er muligt at yde 5 praktisk tait fuldstændig beskyttelse til Ll210-celler ved tilsætning af thymidin til mediet, medens tilsætning af fo-linsyre ikke reverserer midlernes virkning, selv nâr der an-vendes h0je koncentrationer (100 jimol) .

Forbindelser, fremstillet i de 0vrige eksempler be-10 d0mmes pâ lignende mâde in vitro som inhibitorer af TS og cellevaskst med f0lgende resultater: (i disse eksperimenter er det anvendte TS renset^>-2,000 gange for L1210-celler ved affinitetschromatografi). (Selv nâr disse forbindelser ikke udviser særlig god TS-inhibering, har de potentiel interesse 15 som anti-cancermidler, idet de udviser toksicitet over for Ll210-celler i vævskultur).

20 25 30 35

DK 157019 B

0 ^____________ TS TS (Ij-q}x idcq T t JU Reversermg ±50 -*-50 (Ι,πλ (pM) (dM) (CB 50 ' L1210 med 3717 CB 3717 thymidin C 11 s * soin Krelativ /(vsvs- (i kül- 5 nr. nr, kontr. 1 styrke) 'kultur) tur) 3717 3Λ vari- - 1 6.5-8.5 ja ab^vari- 6-48 ation 1 , , ikke (se næ- \ .^ 10 ste ko- signif.

lonne) 3721 1,2)3,000 48 >62 52 | 3726 14 94 6. 15.6 5.4 3728 6 1,400 14 100 27 ja 15 3745 5 >100 3729 8 120 14 8.6 54 3731 12 95 14 6.8 16 20 3733 6 1,640 41 40 100 3744 5 >100 3734 6 >3,000 48 > 62.5 87 ja' 3735 6 1,100 48 23 52 25 3746 5 >100 3736 6 310 41 7.6 >300 3737 6 66 4l 1.6 >100 | 3748 5 100 [ 30 3738 6 47 41 1.1 24 3749 5 100 3739 6 30 14 2.1 17 35 3750 5 18 ! 3743 10 > 1,000 45 >22 4„7 j ja j 3747 5 >100

36 DK 157019 B

0

Transportunders0gelser

Der foretages transportunders0gelser med forbindel-se CB 3717 soin repræsentativ for forbindelserne, der fremstil-les ved fremgangsmâden if01ge opfindelsen, ved at celler in-5 kuberes i nærværelse af et mærket stof, fjernelse af alikvote mængder, fraskillelse og vask af cellerne ved centrifugering og tælling af pellet'en.

Virkningen af varierende koncentrationer af forbin-delse CB 3717 i mediet pâ transportent af tritieret methotrex-1Q at og tritieret folinsyre vises i fig. 2 pâ den ledsagende tegning.

• 4jamol MTX, ^ 4pmol folinsyre.

Transporten af begge disse forbindelser inhiberes af forbindelse CB 3717.

25 Med CB 3717 undgâs sâledes tilsyneladende problemerne v.ed at anvende methotrexat, overfor hvilket modstand kan op-bygges ved hjælp af et for0get cellulært DHPR-indhold og en reduktion af den cellemembrantransport, der er ansvarlig for overf0rsel af bâde methotrexat- og tetrahydrofolatderivater-20 ne. CB 3717's cytotoksiske locus er TS og ikke DHFR, og trans-portunders0gelserne viser, at denne forbindelge tilsyneladende kan transporteres ad den vej, der anvendes til metho-trexat, og ligeledes ad den, der anvendes til folinsyre, idet CB 3717 fremkalder en dosis-afhængig reduktion af transpor-25 ten af begge disse forbindelser.

Behandling af :Ll21Q-tumorfaærende dyr

Ll210-tumoren hibringes rutinemæssigt DBA2-mus.

Til brug ved eksperimenter implanteres 5 x 10^ celler intra-peritonealt i C57B1 x DBA2 Fl hybridhunmus 3 dage f0r behand-2Q ling, hvilket giver en konstateret tumor pâ ca. 2 x 10 celler pâ behandlingstidspunktet. Forbindelsen CB 3717 opl0ses i ION NaOH fortyndet til passende volumen og pH indstillet til 8,5 f0r intraperitoneal injektion.

Résultaterne er opgjort i tabel III nedenfor.

35 o

37 DK 157019 B

Tabel III

Terapeutiske resultater af CB 3717-behandllng af mus,. der bærer L1210-ascites-tumor 5 Forbindelse Dyr % for0gelse Langtids- CB 3717 dosis pr. af gen.sn. overlsv.

(mg/kg)_gruppe Protokol_overlev.tid (> 200 dage) 80) 5 enkelt dosis 14 0 160? 5 enkelt dosis 32 0 8) 5 5 x daglig 8 0 16) 5 5 x daglig 13 0 16) 5 5 x daglig 29 0 32; 5 5 x daglig 62 0 64; 5 5 x daglig 72 0 ^3 128! 5 5 x daglig Ü>1200 4 125) 10 5 x daglig >1200*} 9 200)_10 5 x daglig_>1200*}_9_______ *) se fig. 3.

Grupperne i parentes viser de enkelte eksperimenter 2q Fig. 3 viser overlevelsen for mus med L1210, der har fâet injiceret BC 3717.

£ ingen behandling (10 dyr)-MTX-kontrol □ ingen behandling (20 dyr)-CB 3717-kontrol (Dyrene fâr injektion med 20 mmol NaHC03~puffer 0,4 22 ml daglig i 5 dage).

• MTX 3 mg/kg 5 x daglig (10 dyr) A CB 3717 125 mg/kg 5 x daglig (10 dyr) /\ CB 3717 200 mg/kg 5 x daglig (10 dyr).

Forskellen i overlevelsen .for dyr behandlet med CB 3717 og MTX er yderst signifikant, sâledes soin pâvist ved p <^0,001 ur-

«J VJ

der anvendelse af en logaritmisk bed0mmelsespr0ve.

Enkelte doser af forbindelse CB 3717 op til 160 mg/kg er ikke toksiske og giver meget ringe terapeutisk virkning.

Et skema med 5 daglige doser giver for0gelse af den gennem- 23 snitlige overlevelsestid, der er afhængig af dosis (se tabel III)o Ved doser pâ 125 og 200 mg/kg ses 9 ud af 10 langtids-overlevende (>120 dage) (se fig. 3).

O

38 DK 157019 B

Præparattîlstedeværelse og -opl0selighed udelukker anvendelsen af st0rre doser. Eftersom injektionsopl0snin-gerne kun kan neutraliseres til pH 8,5 og alligevel beholde opl0selighed, injiceres de pâgældende kontroldyr med bicar-5 bonat ved pH 8,5. Ingen af kontrolgrupperne viser nogen for-0gelse af overlevelsestid. Med henblik pâ sammenligning be-handles yderligere grupper dyr raed forskellige doser metho-trexat givet efter sainme dosisskema. Den optimale dosis me-thotrexat, 3 mg/kg, giver en for0gelse i gennemsnitlig over-10 levelsestid pâ 71%, men kun 2/10 langtidsoverlevende.

Disse dyr taber ikke signifikant i vægt eller viser andre tegn pâ toksicitet under behandling med præparatet som vist i fig. 4 pâ den ledsagende tegning, der viser legems-vægtforandringer i grupper pâ 10 mus behandlet med 5 daglige 15 doser CB 3717 pâ 125 mg/kg/dag 200 mg/kg/dag ubehand-lede kontroldyr med tumor ·; ubehandlede kontroldyr uden tu-mor o.

Resultaterne af disse pr0ver med dyr med L1210-tu-mor viser en betydelig for0gelse i langtidsoverlevelsen i sam-20 menligning med dyr behandlet optimalt med methotrexat.

25 30 35

Claims

1. Analogifremgangsmâde til fremstilling af 2-amino- 4-hydroxyguinazolinderivater med den almene formel 5 10 (χ>η hvor R betyder 15 1) en Xigekædet eller forgrenet umættet carbonhydrid- gruppe med 2=6 carbonatomer eller 2. en ligekædet eller forgrenet mættet eller umættet carbonhydridgruppe med indtil 6 carbonatomer, der er sub-stitueret med mindst én substituent, der er CN, COOH eller 20 et sait eller en ester deraf, OH, =0, halogen, NH2, CONH2, CO-CgHs, oxiranyl eller 5-uracilyl, idet carbonhydridgruppen R indeholder mindst 2 carbonatomer, nâr substituenten er =0, n betyder 0 eller et helt tal pâ 1=4, X betyder halogen, C1-C4=alkyl, phenyl, phenyl-C!»

25 -C4-alkyl, C1-C4-alkoxy eller N02, og Y betyder en gruppe med formlen 30 35

40 DK 1570 19 B a) -NH-CH-COOH (L-aspartat), CH2“COOH b) -NH-CH-COOH (L-glutamat) eller 5 ' CH2-CH2-COOH C) -NH-CH-COOH i CH2-CH2-CH- -NH-CH-COOH Ί 10 ' CH2-CH2-CO- -OH ^ m hvor m er et helt tal fra 1 til 9 (poly-L-glutamater), 15 eller er et pharmaceutisk acceptabelt sait eller en ester med en aliphatisk Ci-C20-alkohol deraf, kendeteg-n e t ved, at (A) beskyttelsen fjernes helt eller delvis, sâledes at der fâs en forbindelse med formlen I, fra en forbindelse med 20 formlen O 2 * Il I /=\ Ia

25 TY^rCH2~N «n- 30 hvor X og n har de ovenfor anf0rte betydninger, R2 er æk-vivalent med R som defineret ovenfor eller er en gruppe R i beskyttet form, R1 er hydrogen eller en amino-beskyttende gruppe, og Y1 er en gruppe med formlen a), b) eller c) som 35 defineret ovenfor for Y eller et sait af disse grupper eller disse grupper i delvis eller fuldstændig beskyttet form,

41 DK 157019 B idet den beskyttende gruppe i Y' er en estergruppe eller en anden beskyttende gruppe, forudsat at forbindelsen med form-len la indeholder mindst én beskyttende gruppe, og at, hvis fjernelsen af beskyttelse udfores for at fjerne mere end én 5 beskyttende gruppe, denne beskyttelsesfjernelse kan udores samtidigt eller i en hvilken sont helst rækkefolge, eller (B) en forbindelse med formlen 10 0 h CH,X« 111 15 hvor R1 er som def ineret under A), og X" er en agâende gruppe, kobles med en forbindelse med formlen 20 R2 l /=\ NH / \ CO-Y1 25 “W~ <X>n 30 hvor R2, X, n og Y1 er som defineret under A) ovenfor, til dannelse af en forbindelse med formlen la som defineret under A), ovenfor, som ikke nodvendigvis indeholder beskyttende grupper, og om nodvendigt beskyttelsen fjernes fra forbindelsen med formlen la som defineret under A).

2. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendeteg- n e t ved, at R er en umættet carbonhydridgruppe, evenfcuelt

42 DK 157019 B substitueret som defineret under 2) i krav 1 med 3 eller 4 carbonatomer i carbonhydridkæden.

3. Fremgangsmâde ifolge krav 2, kendeteg-n e t ved, at R er allyl eller propargyl.

4. Fremgangsmâde ifolge krav 1, kendeteg- n e t ved, at R er en mættet carbonhydridgruppe substitueret som defineret under 2) i krav 1 med 1-3 carbonatomer i carbonhydridkæden .

5. Fremgangsmâde ifolge krav 1, 2 eller 4, k e n-10 detegnet ved, at R er cyanoalkyl, carboxyalkyl, alkoxycarbonylalkyl, hydroxyalkyl, halogenalkyl, carbamoyl-alkyl, benzoylalkyl eller oxiranylalkyl, hvor alkylgruppeme indeholder 1-6 carbonatomer.

6. Fremgangsmâde ifolge krav 1, 2 eller 4, k e n-15 detegnet ved, at R er cyanomethyl, carboxymethyl, ethoxycarbonylmethyl, 3-hydroxypropyl, 2-chlor-, 2-brom-eller 2-fluorethyl, carbamoylmethyl, phenacyl, oxiranylmethyl eller 5-uracilylmethyl.

7. Fremgangsmâde ifolge et hvilket som helst af de 20 foregâende krav, kendetegnet ved, at n er 1 eller 2, og X er halogen eller Ci-C4-alkyl.

8. Fremgangsmâde ifolge krav 7, kendetegnet ved, at n er 1, og X chlor eller methyl.

9. Fremgangsmâde ifolge et hvilket som helst af de 25 foregâende krav, kendetegnet ved, at Y er en L-glutaminsyrerest, idet den ene eller begge syregrupper eventuelt foreligger i sait- eller esterform.

10. Fremgangsmâde ifolge krav l, kendetegnet ved, at den fremstillede forbindelse er N-(4-(N-((2- 30 amino- 4 -hydroxy- 6 -qu inaz ol inyl ) methyl ) prop-2 -ynylamino) -benzoyl) -L-glutaminsyre, N-(2-methyl-4-(N-( (2-amino-4-hydroxy-6-quinazol inyl ) methyl ) prop-2 -ynylamino) benzoyl) -L-glutaminsyre eller N-(2-chlor-4-(N-((2-amino-4-hydroxy-6--quinazolinyl)methyl)prop-2-ynylamino)-benzoyl)-L-glutamin-35 syre eller et sait eller en ester af disse forbindelser.

11. Fremgangsmâde ifolge et hvilket som helst af de DK 157019 B foregâende krav, kendetegnet vsd, at produktet fremstilles i form af et dinatriumsalt eller en diethyleter.