DK156977B - Ph-analysator og fremgangsmaade til kvantitativ bestemmelse af et stof i en proeveoploesning - Google Patents

Description

DK 156977 B

Opfindelsen angâr en pH-analysator til bestemmelse af karakteristika af en oplosning, baseret pâ ændring i pH, og omfattende i et hus et par glas-pH-elektroder anbragt i en temperatur-stabiliseret understcttende blok, en fælles, 5 elektrisk ledende og jordforbunden tilforselsledning til de to elektroder, et differentialanalogforstærkerkredslcb for-bundet til den elektriske udgang for elektroderne til til-vejebringelse af et elektrisk signal, der viser en forskel i pH i de to elektroder, samt organer til tilforsel af op-10 l0sning til de to elektroder, og opfindelsen angâr tillige en fremgangsxnâde til kvantitativ bestemmelse af en stof i en pr0veopl0sning i en sâdan analysator.

I den analytiske og kliniske kemi og i biokemien har elektrometriske metoder under anvendelse af en pH-elektrode 15 og en referendeelektrode, f.eks. en calomel- eller en s0lv/-sclvchlorid-elektrode, tidligere været anvendt i udstrakt grad til bestemmelse af pH i opl0sning.

Mange stoffer, især de, der findes i biologiske flui-da, kan bringes til at reagere med passende reagenser ved 20 st0kiometriske kemiske reaktioner, der frembringer produkter, som er optisk aktive. Der er blevet udviklet mange metoder til kvantitativ bestemmelse af sâdanne stoffer som f.eks. glucose, urinstof, totalt carbondioxid og chlorid, idet man drager fordel af de nævnte reaktioner. Typisk vil ét eller 25 flere produkter fra sâdanne reaktioner tilvejebringe en ændring i lystransmissionen gennem opl0sningen, og spektro-fotometre er blevet anvendt til at bestemme variationen i det transmitterede lys og til herudfra pâ basis af kendte molære absorptionskoefficienter at beregne koncentrationen 30 af det stof, der har interesse. Alternativt kan reaktions-produkterne omsættes med et farvedannende middel, og der kan udf0res en kolorimetrisk analyse til tilvejebringelse af en kvantitativ indikation for stoffet i den oprindelige oplosning. Alternativt kan der ved reaktionen dannes vanne, 35 eller reaktionsproduktet kanlede den elektriske strcm. I disse sidstnævnte tilfælde er kalorimetriske eller konduk- 2

DK 156977 B

trimetriske metoder blevet anvendt til bestemmelse af kon-centrationen af én eller flere af de kemiske forbindelser, der deltager i den kemiske reaktion.

Mange reaktioner giver pâ den anden side anledning 5 til dannelse af en syre eller en base, hvis ionisering i bestemte pH-omrâder forer til frigorelse af eller optagelse af hydrogenioner.

Eksempelvis kan glucose i oplosning ved hjælp af enzymet glucoseoxidase (GOD) omdannes til gluconsyre i over-10 ensstemmelse med reaktionen:

GOD

Glucose -^ Gluconsyre + H+ (1) 15 Eftersom reaktionen (1) kan bringes til at foregâ i et medium med en kendt pH-værdi, kan bestemmelsen af A[H+], dvs. af antallet af hydrogenioner frigjort ved reaktionen, anvendes til stokiometrisk bestemmelse af koncentrationen af glucose, eller i princippet ethvert andet stof, der danner 20 eller absorberer hydrogenioner i oplosning. Til udforelse af sâdanne reaktioner er det imidlertid nodvendigt at pH--værdien i mediet ikke ændres til under eller over bestemte grænser. Dette sikres ved anvendelse af pufferoplosninger, der er en gruppe stof fer, som er i stand til at engagere 25 sig i ioniseringsreaktioner. De teoretiske principper, der ligger bag det ovenfor anforte, er velkendte og behandlet udforlige i aile læreboger omhandlende den fysiske kemi af elektrolytiske oplosninger.

Til bestemmelse af A[H+] dannet ved reaktionen (1) 30 kan der gores brug af ligningen: dpH = )5x d[H+] (2) hvor dpH og d[H+] er infinitésimale ændringer i pH-værdien 35 af oplosningen forârsaget af en infinitésimal mængde hydrogenioner, og β er oplosningens sâkaldte "pufferværdi".

β er igen en funktion af koncentrationen af puffere i oplosninger, af deres respektive ioniseringskonstanter og af oplosningens pH-værdi, svarende til ligningen: 3

DK 156977 B

5 v—,i=n β = 2,3 x ) C(i) x ai x (l-αχ) (3) L—1=1 hvor antallet af pufferarter, der er til stede i opl0sning, 10 hvis individuelle koncentration er C(i), varierer mellem l og n. ai er ioniseringsfraktionen af hver art, givet ved formlen: ai « 1/(1 + ΐθΡκ(ϊ)~ΡΗ) (4) 15 hvor pK for hver art svarer til -logK^ij, hvor K^ij er ioniser ingskonstanten for pufferkomponenten i.

Intégration af ligning (2) over et bestemt pH-omrâde giver ligningen (5): 20 Δ[Η+] - a(pH(l) - pH(o) ) = 0ApH (5)

Ved denne intégration antages det, at titreringskurven for oplosningen er en ret linie over det pH-omrâde, der 25 unders0ges. A[H+] er antallet af hydrogenioner i mol pr. liter, soin kræves til ændring af opl0sningens pH-værdi mellem pH(o) og pH(l). Typiske værdier af β for biologiske opl0s-ninger ved pH = 7,4er/3 = 7,5x 10"3 mol pr. liter pr. pH-enhed (plasma eller sérum) og β = 30 x ÎO”3 mol pr. liter 30 pr. pH-enhed (helblod). Den mængde hydrogenioner, der kræves til ændring af pH i plasma eller blod med én pH-enhed er sâledes henholdsvis 7,5 x 10-3 mol pr. liter for plasma og 30 x 10"3 mol pr. liter for blod.

Ifolge teknikkens nuværende stade kan der ved pH-35 mâlinger pâ helblod eller plasma med en kombination af glas-og reference-elektrode og under anvendelse af kommercielt tilgængelige elektrometre ikke opnâs bedre opl0sning end 4

DK 156977 B

±0,001 pH-enheder, og dette endog kun under ideale labora-toriebetingelser. Anvendelse af ligning (5) viser straks, at det ifelge teknikkens stade i dette tilfælde ved simple pH-mâlinger er muligt at bestemme hydrogenionoptagelsen 5 eller -frigerelsen med en felsomhed pâ 7,5 x 10“3 x 10"3 = 7,5 x 10-6 mol pr. Hier û. ufortyndet plasma og med en fel-somhed pâ 3 x 10-5 mol pr. liter i helblod. Eftersom kon-centrationen af mange metaboliter af klinisk interesse i biologiske fluida ligger i koncentrationsomrâdet fra 5 til 10 0, 1 x 10"3 mol pr. liter, viser de ovenstâende overvejelser, i det mindste i princippet, anvendeligheden af benyttelsen af elektrokemiske metoder baseret pâ pH-mâlinger til bestem-melse af koncentrationen af mange kemiske forbindelser af fysiologisk interesse, f.eks. urinstof, glucose og urinsyre.

15 Det ber tilfejes, at bestemmelsen af den mængde hydrogenio-ner, der frigeres eller absorberes ved en kemisk reaktion, ved pH-elektrodemâlinger kan opnâs uanset prevens optiske kvalitet, der alvorligt begrænser anvendelsen af spektrofo-tometriske metoder til studiet af helblod eller andre turbide 20 oplesninger.

En nærmere analyse af de analyseinstrumenter, der hidtil er blevet fremstillet kommercielt, viser imidlertid, at der endnu ikke er blevet tilvejebragt nogen instrumenter med praktisk anvendelighed egnede til bestemmelse af sub-25 strater eller enzymer i oplesning under anvendelse af pH--mâlingsmetoderne. Dette er ikke overraskende, fordi en mere detaljeret analyse af problemet faktisk afslerer flere praktiske vanskeligheder. Disse kan sammenfattes som felger: (a) Pufferevnen af prever sâsom blod eller plasma 30 fra forskellige individer er ikke konstant. Bedemmelsen eller bestemmelsen af A[H+] dannet ved en kemisk reaktion ud fra mâlingen af pH-værdien kræver sâledes en nejagtig bestemmelse af provens pufferevne, eller alternativt, at provens pufferevne gérés negligérbar sammenlignet med puf-35 ferevnen for det medium, hvori reaktionen bringes til at forlebe.

5

DK 156977 B

(b) De fleste kommercielle analysatorer, der f.eks. er baseret pâ lysabsorptionsmâlinger, kraever kun nogle fâ mikroliter proveoplosning, som bekvemt fortyndes til et storre rumfang (0,5 til 3,0 ml) reagensoplosning. Anvendelsen 5 af et lignende fortyndingstrin ville ogsâ være n0dvendig forud for pH-mâling, men ville uheldigvis proportionalt formindske koncentrationen af det stof, der skal bestemmes, og storrelsen af ApH-mâlingen. Fortynding af en blodprove indeholdende 5,0 x 10”3 mol glucose pr. liter til et forhold 10 pâ 1:100 ville sâledes nedsætte koncentrationen af glucose til 5 x 10”5 mol pr. liter. Tilsætning af glucoseoxidase i henhold til reaktion (1) ville derpâ bevirke frigorelse af en maksimal mængde hydrogenioner pâ 5 x 10“5 mol pr. liter.

I et medium med en puffer svarende til 5 x 10”3 mol pr.

15 liter pr. pH-enhed, som er den minimale værdi, sâfremt der skal udfores n0jagtige pH-mâlinger, ville dette forârsage en ændring i pH pâ 5 x 10"5/5 x 10"3 = 0,01 pH-enheder, en st0rrelse, der er ait for lille til at kunne mâles nojagtigt med en fejl pâ nogle fâ procent ved anvendelse af tilgængelig 2 o teknik.

(c) pH-mâlinger til ±0,0001 pH-enheder, der kræves til opnâelse af koncentrationen af glucose, vil ogsâ n0dven-digg0re en h0j stabilitet af temperaturen for mâleelektro-derne og for opl0sningerne, hvorved pH-mâlingssystemet kom- 25 pliceres yderligere.

I USA-patentskrift nr. 4.149.949 er der beskrevet et elektrokemisk mâleapparat til bestemmelse af C02-koncentrationen i sérum. Apparatet omfatter et mâlekammer, i hvilket en pr0ve, der skal analyseres, indsprojtes og reagerer med 30 et surt reagens. En enkelt pH-glaselektrode er i kontakt med en elektrolyt i et kammer, som igen er i semipermeabel forbindelse med mâlekammeret gennem en membran.

Der er her taie om et typisk apparat til mâling af forholdsvis h0je pH-vaerdier sâsom de, der svarer til C02-35 koncentrationen i blod eller sérum. Apparatet vil ikke kunne anvendes til mâling af pH-værdier med den nojagtighed, der 6

DK 156977 B

0nskes til bestemmelse af de fleste kemiske forbindelser, der har fysiologisk interesse.

Der er af Luzzana et al. i Anal. Biochem., 43, 556-563 (1971), blevet beskrevet en elektrometrisk metode til 5 mâling af smâ pH-ændringer ned til ±5 x 10”5 pH-enheder i biologiske oplosninger. Denne teknik er baseret pâ anvendel-sen af to glaselektroder, hvoraf den ene anvendes soin refe-renceelektrode. Metoden har den fordel, at man eliminerer (a) falske pH-afvigelser pâ grund af sidereaktioner, der 10 ofte findes ved biologiske priver, og (b) variationer i forbindelsespotentialer, der vides at forekomme ved den traditionelle pH-mâling under anvendelse af en pH-glaselek-trode og en calomel-referenceelektrode, ved forbindelsen mellem mættede KCl-oplosninger ved reference-elektroden og 15 den oplosning, pâ hvilken der mâles.

Omend det princip, der er beskrevet af Luzzana et al., har fundet flere intéressante anvendelser inden for det specialiserede biokemiske omrâde, er der hidtil ikke blevet beskrevet nogen praktisk, kommerciel anvendelse af 20 dette princip. Dette var ogsâ at forvente, fordi aile be-skrevne anvendelser af denne teknik - inden fremkomsten af den foreliggende opfindelse - langtfra har været enkle nok til at kunne anvendes af ikke-specialuddannet personale. Hovedvanskelighederne i den kendte teknik kan fores tilbage 25 til folgende punkter: (a) de to glaselektroder i apparatet beskrevet i Luzzana et al. befinder sig i særskilte rum, der mâ termostatindstilles nojagtigt til opnâelse af den pâkrævede stabilitet ved aflæsning, (b) fornyelsen med friske proveoplosninger i kontakt med de to elektroder kan ikke 30 udfores automatisk og kræver mindst nogle fâ minutters manuelle operationer, (c) rumfanget, der kræves til reaktio-nerne til hver enkelt mâling, er mindst 10 ml, hvorved an-vendelsen af mikroprover af oplosningen, der skal testes, hindres, (d) forbindelsesoplosningen mellem de to testop-35 losninger kan ikke fornyes automatisk, og (e) aile bereg-ninger, der kræves til fastlæggelse af koncentrationen af

DK 156977 B

7 et givet substrat under afprovning ud fra de mâlte pH-værdier mâ udfores ved manuel udregning. Med den foreliggende opfin-delse overvindes sâdanne vanskeligheder, hvilket muliggor udviklingen af et helt nyt apparat, der automatisk kan be-5 stemme koncentrationen af mange stoffer af interesse inden . for klinisk kemi, biokemi og analytisk kemi.

If0lge opfindelsen opnâs det ovennævnte med en pH-analysator af den allerede angivne art, hvilken analysator er ejendommelig ved en kuvette med en hulhed til modtagelse 10 af et nejagtigt rumfang opl0sning, idet kuvettehulheden er forbundet til elektroderne via en ledning og yderligere er forbundet til tilf0rselspumper til tilf0rsel af opl0sning og reagenser til hulheden, hvorhos elektroderne er glaska-pillar-pH-elektroder, gennem hvis kapillarpassage oplosningen 15 ledes, og organerne til tilf0rsel af opl0sning til elektroderne omfatter to pumper til transport af opl0sning fra hulheden gennem passagerne i elektroderne.

Fremgangsmâden ifolge opfindelsen til bestemmelse af et stof i en preveoplosning i den her omhandlede pH-analy-20 sator er ejendommelig ved, at man bestemmer en kalibrerings-faktor FCAL for pH-elektroderne, blander proveoplosningen med et reagens, der kan reagere med stoffet og ændre hydro-genionkoncentrationen i oplosningen som et résultat af reak-tionen, 25 bestemmer en ApH0-værdi mellem elektroderne som en funktion af st0jniveau og afdrift og det ureagerede reagens og pro-veoplosning, bestemmer en ApHb-værdi mellem elektroderne som en funktion af tilsætningen af en reaktions-initierende forbindelse, 30 bestemmer en ApHc-værdi mellem elektroderne som en funktion af ændringen i hydrogenionkoncentration resulterende fra reaktionen, og bestemmer koncentrationen af stoffet i oplosningen i over-ensstemmelse med formlen 35 [stof] = FCAL x (ApHc - ApHb - ApH0).

DK 156977B

8

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer sâledes en række fordele i forhold til konventionelle analysemetoder sâsom de, ved hvilken man benytter sig af kolorimetriske 5 metoder. Eksempelvis anvendes der ifelge opfindelsen meget stabile og holdbare sensorer, dvs. de to pH-elektroder. og man er ikke afhængig af optiske mâlinger. Fremgangsmâden og analysatoren ifolge opfindelsen kan sâledes anvendes til bestemmelse af kemiske forbindelser i turbide oplesninger 10 eller i oplesninger med hej optisk absorbans, f.eks. fortyn-det plasma, blod, sirupper, drikkevareprodukter eller pro-dukter fra næringsmiddelindustrien eller den kosmetiske industri. Fremgangsmâden og analysatoren ifolge opfindelsen er særdeles felsom, eftersom en ændring pâ ±0,0001 pH-enheder 15 let kan mâles, hvilket forer til bestemmelsen af stoffer, der er til stede i opleisning i særdeles lave koncentrationer (10“5 mol pr. liter eller mindre).

I analysatoren og ved fremgangsmâden ifolge opfindelsen gores der ogsâ brug af et forholdsvis ringe antal aner-20 kendte elektroniske og mekaniske komponenter, og under kon-trol af et mikrodatamatprogram udferes automatisk aile de analytiske trin, der kræves til analysen, og de endelige resultater for koncentrationen af det stof, der har interesse, gives pâ digital form. Endvidere er analyse ifelge 25 opfindelsen reproducerbar til ca. 2%, og der anvendes mi-krorumfang af den oplosning, der skal analyseres (10 mi-kroliter eller mindre). Den fuldstændige analyse kan gen-nemfores i lobet af ca. 40 sekunder fra analysens begyndelse og til det endelige résultat.

30 Fremgangsmâden ifelge opfindelsen involverer som nævnt anvendelse af formlen: [stof] = FCAL X (ApHc - ApHb - ApHQ) 35 hvor [stof] repræsenterer koncentrationen af den forbindelse, der er taie om, FCAL repræsenterer en kalibreringsfaktor, 9

DK 156977 B

der er en kombination af β og en fortyndingsfaktor, ApHc repræsenterer ΔρΗ-værdien af oplosningen efter reaktion,

ApHjj repræsenterer ΔρΗ-værdien af oplosningen af reagenseme, men uden proven, og ApH0 repræsenterer ApH-værdien, der 5 indikerer niveauet af stoj og bevægelse af maskinkomponen-terne.

De ovennævnte samt andre fordele ved opfindelsen vil fremgâ af det folgende sammen med tegningen, pâ hvilken fig. l viser et perspektivbillede af analysatoren 10 ifolge opfindelsen, fig. 2 viser et frontbillede af analysatoren i fig.

1, hvor frontpladen er fjernet, fig. 3 viser et planbillede set ovenfra af analysatoren ifolge opfindelsen med frontpladen fjernet, 15 fig. 4 viser et billede af den i analysatoren ifolge opfindelsen anvendte kuvette i adskilt tilstand, fig. 5 viser elektrodecellen anvendt i analysatoren ifolge opfindelsen i adskilt tilstand, og fig. 6 viser et skematisk billede af det elektroniske 20 kredslob, der anvendes i forbindelse med analysatoren ifolge opfindelsen.

I fig. 1 ses analysatoren ifolge opfindelsen, der generelt betegnes 10, og som omfatter et hus 12 og er udsty-ret med et proveindtag 14, gennem hvilket den prove, der 25 skal analyseres, indfores. En digital-displayplade 16 anvendes til visning af resultaterne af analysen, især værdien af koncentrationen af det stof, der undersdges, pâ digital-form. En lampe 18 er indrettet til at give signal fra mi-krocomputeren, nâr instrumentet er klar til at modtage en 30 prdve. En knap 20 anvendes til at initiere en cyklus af mâlinger, der forer til kalibrering af apparatet, og en knap 22 anvendes til at initiere en cyklus af mâlinger, der forer til mâlingen af koncentrationen af et givet stof, der er under undersogelse.

3 5 Fig. 2 og 3 viser det generelle udseende af det indre af huset 12, der omfatter fem peristaltiske pumper 24, 26, 10

DK 156977 B

28, 30 og 32, der, nâr de aktiveres i den rette rækkefolge af mikrocomputeren, i programmerede trin bevæger oplosnin-gerne indeholdt i et opl0sningsreservoir 34 og i et réservoir 36, f.eks. for enzym, gennem en kuvette 38 og en celle 40 5 til en spildbeholder 41. Et ror 44 udgdr en flydende forbin-delse mellem de to elektroder, jfr. tegningen, og bor derfor være af et ledende materiale, fortrinsvis rustfrit stâl, og bor befinde sig pâ maskinejordpotential. Det bor bemærkes, at kun nâr jordforbindelsespunktet er fikseret fer eller 10 ved den flydende forbindelse mellem de to elektroder, og oplosningen efter dette punkt er isoleret fra jord, er det muligt at undgâ falske elektrokemiske signaler og opnâ ApH-mâlinger, der er reproducerbare til ±0,0001 pH-enheder. Det andet ror, der anvendes til at forbinde reservoirerne 34 og 15 36, pumperne 24-32, kuvetten 38 og cellen 40, kan være et- hvert egnet ror, f.eks. et egnet indifferent plast- eller metalror.

I fig. 4 pâ tegningen ses kuvetten 38 at omfatte en jævnstromsmotor 46, der holder en lille cylindrisk magnet 48.

20 Motoren er normalt indfort i en cirkulær hulhed 50 i en blok 52 og holdes pâ plads ved hjælp af en skrue indsat i en boring 54. I blokken 52 findes der en cirkulær hulhed 56, og denne kan ved hjælp af den peristaltiske pumpe 26 fyldes med den oplosning, der findes i reservoiret 34. Et lille 25 borehul 58 er boret ind i blokken 52 til at forbinde hulheden 56 med glaselektroderne i cellen 40. Der findes ligeledes en lille boring 60, gennem hvilken et rumfang oplosning indeholdt i reservoiret 34 ved hjælp af den peristaltiske pumpe 26 kan pumpes ind i hulheden 56. En cirkulær magnetomrorer 30 62 hviler normalt ved bunden af hulheden 56 og er koblet magnetisk til motoren 46 gennem magneten 48. Omroreren anvendes til at blande indholdet i hulheden 56.

Proveindtaget 14 ses at omfatte en blok 64 og er ud-styret med en indlobspassage 65, og en boring 66 er forbundet 35 via pumpen 28 til spildbeholderen 42. En egnet forsegling, 11

DK 156977 B

sâsom en O-ring 68, forsegler blokken 64 inden i blokken 52, eftersom under driftsbetingelserne blokken 64 er fuldstændigt indsat i hulheden 56 i blokken 52 og derved definerer et rum med et bestemt rumfang, hvori en kemisk reaktion kan 5 finde sted. Den lille passage 65 har fortrinsvis en dia-meter pâ ca. 1,5 mm. En pr0ve indeholdt i en mikrosprojte eller mikropipette kan indferes i hulheden 56 gennem passagen 65. En anden boring 72 findes i blokken 52 og er forbundet med reservoiret 36 ved hjælp af den peristaltiske pumpe 24 10 til indfering af reagenset, der er indeholdt i reservoiret 36.

I fig. 5 er der vist cellen 40, der indeholder de to kapillarglas-pH-elektroder. Cellen 40 omfatter en blok 74 af plastmateriale af egnet sammensætning, gennem hvilken 15 passende passager er boret som vist. En indtagsforbindelse 76 er anbragt mellem kuvetten 38 og de to kapillar-pH-elek-troder. Cellen 40 er dannet af to rustfri stâlblokke 78 og 80 med elektrodekammerhalvparter 82, 84, 86 og 88, der er fremkommet ved maskinel bearbejdning. Skont blokkene 78 og 20 80 fortrinsvis er tildannet af rustfrit stâl, kan de fréin stallés af ethvert egnet materiale, der har en hoj tempera-turoverforselskoefficient og kan isolere og afskærroe de to pH-elektroder bâde magnetisk og termisk. Herved sikres tem-peraturensartethed mellem de to elektroder.

25 Elektroderne 90, hvoraf kun én er vist i fig. 5, er af identisk konstruktion og er kommercielt tilgængelige elektroder og omfatter en monteringsbosning 92, der tjener til at underst0tte elektroderne inden i cellen 40 og til at forsegle den ene ende af elektrodekamrene. Oplosningen pas-3 0 serer gennem en kapillarpassage 91 i elektroden 90. Oplosning kan tilfores elektrodepassagen og dermed gennem elektroderne fra indtagspassagen 76 gennem passager 94 og 96. Oplesningen aspireres ved hjælp af de peristaltiske pumper 30 og 32 fra reaktionskammeret eller kuvetten 38 ind i cellen 40 og strom-35 mer gennem de to pH-sensitive glaskapillarelektroder 90 og via en passende rorlængde, der er forbundet ved en ende 98 12

DK 156977 B

af elektroden, til spildbeholderen 42. Forbindelsen mellem kuvetten 38 og celleindtaget 76 udgeres af en længde kapil-lart rustfrit stâlr0r, der har maskinejordpotential.

I fig. 6 er der vist en skematisk illustration af 5 det elektroniske kredsl0bssystem, der anvendes til regulering af funktionerne af det viste apparat. Systemet er baseret pâ en Z80A-(Zilog)-mikrodatamat 100, der arbejder efter et passende program for dataoptagelse og -bearbejdning, instru-mentkontrol og præsentation af resultaterne pâ en kendt 10 mâde. En taktgenerator 102 frembringer en 4 MHz firkantb0lge, som sendes til klokindgangen af Z80A-centralbehandlingsen-heden (CPU) 100. Adresse- og datalinier, der kommer fra CPU 100, sendes til en adressedatabus 104. Dette tillader ind-byrdes forbindelse mellem CPU 100 og et ROM-lager 106, et 15 RAM-lager 108, en parallelindgangs-udgangsenhed 110 og en analog-digital-omsætter 112. ROM-lageret 106 omfatter to 2716 EPROM med en total kapacitet pâ 4 R oktetter, hvoraf ca. 2 K er n0dvendige til den matematiske "pakke". Temporære data oplagres i RAM 108, hvis st0rrelse er 500 oktetter.

20 Indgangslinierne anvendes til at fâ kommandoer eller logiske signaler som f0lger: "pr0ve udtages", tryk pâ knappen 22; "kalibrering", tryk pâ knappen 20. En liniefrekvenstaktgene-rator 114 anvendes til at synkronisere funktioner sâsom start og stop af motorer, til start af omsætningen i ana-25 log-digital-omsætteren 112 etc. Udgangslinierne anvendes til tilvejebringelse af logiske niveauer til forskellige organer sâsom (1) en motordrivenhed 116, der driver én eller flere af synkronmotorerne i de peristaltiske pumper 24-32, idet motoren startes, nâr den korresponderende Unie, 30 der kommer fra 110, ligger pâ et logisk niveau 1, og motoren standses, nâr det logiske niveau er 0, (2) en jævnstr0ms-drivenhed 118, der tænder for "READy-lyset 18 eller omr0-rermotoren 46, og (3) display 16, der giver et digitalud-gangssignal med tre tegn. Dette display eller denne indikator 35 kan i overensstemmelse med den logiske konfiguration ved dens indgang vise tal eller bogstaverne A til F til kodning 13

DK 156977 B

af diagnostiske informationer fra mikrodatamaten 100, f.eks.

"E" for "Error". De fem synkronmotorer 120, 122, 124, 126 og 128 er forbundet med de respektive peristaltiske pumper 24, 26, 28, 30 og 32.

5 Den spændingsforskel, der frembringes mellem de to kapillar-pH-elektroder, der er indeholdt i cellen 40, for-stærkes af differentialforstærkeren 130. Indgangssignalerne fra de to elektroder, der er vist ved klemmer E^ og E2, fores til to felteffekttransistorer 132 og 133 med lav forspæn-10 dingsstrom, lille afdrift og hoj indgangsimpedans. Til op-retholdelse af termisk stabilitet er disse transistorer fortrinsvis indeholdt i en enkelt "chip". Udgangssignalet fra de to felteffekttransistorer tilfores to operationsfor-stærkere 134 og 135, der er forbundet i en differensforstær-15 kerkredslobsopstilling. Deres indgangssignal tilfores gennem to 5000 Ohm modstande 136 og 138 til henholdsvis de négative og positive indgange pâ en operationsforstærker 140. Udgangssignalet fra differentialforstærkeren 130 tilfores derpâ til analog-digital-omsætteren 112, der er en 12-bit analog-20 -digital-omsætter af type AD 574 (fra Analog Devices) med en tre tilstandes udgangsbufferkreds til direkte sammenkob-ling med adressedatabussen 104. Der kan naturligvis ogsâ anvendes andre lignende analog-digital-omsættere.

Til démonstration af beskrivelsen af den analytiske 25 kapacitet af den her omhandlede instrumentering skal der henvises til den faktiske mâling af et kemisk stof af særlig klinisk interesse, nemlig mâling af koncentrationen af glucose i plasma. Til dette formâl fyldes reservoiret 34 med en oplosning indeholdende 25 x 10"3 mol phosphatpuffer pr.

30 liter (pH = 7,4), 2 x 10-3 mol adenosintriphosphat (ATP) pr. liter og 1 x 10”1 mol KC1 pr. liter. Reservoiret 36 fyldes med en oplosning indeholdende 0,5 enheder af enzymet hexokinase pr. mikroliter.

Nâr instrumentet bringes i anvendelse, initieres der 35 en sekvens af operationer under kontrol af mikrodatamaten 100. Pumpen 24 startes i et passende interval til fyldning 14

DK 156977 B

af roret fra enzymreservoiret 36 til kuvetten 38 med frisk oplosning. Pumperne 30 og 32 tourner kuvetten 38 gennem cellen 40. Pumpen 26 fylder kuvetten 38 med et overskud af reagens, som fuldstændigt opfylder rumfanget af den cirkulære hulhed 5 56. Overskuddet af reagens vil flyde over fra hulheden 56 ind \ roret 66, og overskuddet af oplosning fjernes derpâ med pumpen 28 fra kapillarroret 66. Pâ denne mâde fikseres rumfanget af den oplosning, der er indeholdt i hulheden 56, pâ en defineret, forudbestemt værdi. Efter tre sâdanne cykler 10 med fyldning og tomning af kuvetten er instrumentet klar, og lampen 18 tændes automatisk, og apparatet er rede til at modtage to instruktioner fra anvenderen, dvs. kalibrering eller mâling pâ en prove. Sâdanne instruktioner initieres ved at trykke pâ enten kalibreringsknappen 20 eller prove-15 knappen 22.

Operatoren indforer derefter 10 mikroliter af en standardoplosning indeholdende en kendt mængde glucose. En typisk sâdan standard-glucoseoplosning vil indeholde 11 mM pr. liter. Oplosningen indfores ved anvendelse af en mi-20 kropipette gennem proveindtaget 14 i det kendte rumfang af reagens, der er indeholdt i hulheden 56. Efter indforing af standarden trykker operatoren pâ kalibreringsknappen 20 til start af kalibreringscyklen. Standardoplosningen blandes med den oplosning, der er indeholdt i hulheden 56, ved hjælp 25 af den magnetomrorer 62, der drives magnetisk af magneten 48 og jævnstromsmotoren 46. Halvdelen af oplosningsrumfanget aspireres derpâ ind i de to kapillarelektroder, der er indeholdt i cellen 40, ved indvirkning af de peristaltiske pumper 30 og 32. Elektrodernes udgangsspænding forstærkes 30 ved hjælp af differentialforstærkeren 130, omsættes af ana-log-digital-omsætteren 112 og læses flere gange af mikroda-tamaten gennem databussen 104 og analyseres til detektering af stoj- og afdriftsniveauet. Stojniveauet kan f.eks. pâvir-kes af beskadigede elektroder, eller af elektroder, der er 35 blevet torret ud i lange perioder med ikke-brug. De opnâede datas standardafvigelse beregnes, og sâfremt stoj- og af- 15

DK 156977 B

driftsniveauerne ligger inden for forudbestemte værdier, sendes der ingen fejlmelding til digitalindikatoren 16.

Hvis de forudbestemte værdier overskrides, f.eks. i tilfælde af en svært beskadiget elektrode, sendes der en fejlmelding 5 til digitalindikatoren 16 sâledes, at operateren kan tage passende korrigerende forholdsregler inden mâling pâ prove-oplesningen. Hvis signalkvaliteten viser sig at ligge inden for en forudbestemt værdi, tages der et stort antal aflæs-ninger af spændingsforskellen mellem de to elektroder, for-10 tringvis ca. 100 aflæsninger, gennemsnittet beregnes, omdan-nes til pH-enheder og oplagres i mikrodatamaten RAM 108 som en nulaflæsning (ApH0).

Pumpen 24 startes nu til injektion af tre til fire mikroliter af den enzymoplesning, der er indeholdt i reser-15 voiret 36, i hulheden 56, atter efterfulgt af aktivering af motoren 46 til blanding af enzymoplosningen med opl0sningen indeholdende glucose, der er forblevet i reservoiret 56. Den f0lgende reaktion pâbegyndes herefter: 20 ATP + glucose —> ADP + glucose-6-phosphat + H+ (7)

Koncentrationerne af ATP og hexokinase er sâdanne, at reaktionen (7) pâ fâ sekunder drives fuldstændigt mod hojre under dannelse af en bestemt mængde hydrogenioner, 25 hvilken mængde er proportional med koncentrationen af glucose i opldsning. De hydrogenioner, der frig0res ved reaktionen, vil forârsage en ændring af pH-værdien i opl0sningen i over-ensstemmelse med ligning (2). Pumpen 32 aktiveres derpâ til aspirering af et rumfang af den omsatte opl0sning ind i den 30 anden kapillarelektrode. Spændingsforskellen mellem de to pH-glaselektroder indeholdende henholdsvis (1) glucoseopl0s-ningen og (2) den samme oplosning plus hexokinase aflæses som beskrevet for nulaflæsningen. Der foretages igen 100 mâlin-ger, gennemsnittet beregnes, og det omdannes til pH-enhe-35 der til opnâelse af en anden aflæsning (ApHc).

16

DK 156977 B

En cyklus, i hvilken aile de foregâende operationer automatisk udferes af instrumentet, men under udeladelse af indforingen af standardoplosningen af glucose, og irikluderen-de tilsætning af enzymet, gennemfores derefter, og der opnâs 5 en tredie pH-aflæsning, ApH^, og denne oplagres i RAM 108.

Ved slutningen af kalibreringscyklen beordrer mikrodatamaten 100 en sérié pâ tre vaskecykler. Til de forste to af disse cykler fyldes reservoiret 56 med en passende mængde frisk reagensoplesning fra reservoiret 34, hulheden 56 tommes, og 10 de to kapillarelektroder vaskes via de peristaltiske pumper 30 og 32. Den sidste cyklus bestâr i fyldning af hulheden 56 ved hjælp af den peristaltiske pumpe 26 og f jernelse af overskuddet af reagens med den peristaltiske pumpe 28. ,,READY"-lampen 18 tændes derpâ for at vise operatoren, at in-15 strumentet er klar til at modtage en prove.

Eftersom i ligningen: [standard glucose] = FCAL x (ApHc -ApHjj - ApH0) (8) 20 aile andre udtryk er kendt, beregnes kalibreringsfaktoren FCAL automatisk og lagres i RAM 108.

Efter kalibrering indferer operatoren i frisk reagens indeholdt i hulheden 56 10 mikroliter af en oplesning in-deholdende en ukendt mængde glucose. Oplesningen kan være 25 ufortyn det plasma, helblod, urin eller ethvert andet bio-logisk fluidum, der indeholder eller mistænkes for at in-deholde glucose.

Operatoren trykker dernæst pâ proveknappen 22, og cyklen af operationer og mâlinger som beskrevet under "kali-30 breringscyklus" gentages, idet man mâler ApH£ og ApH^ som i kalibreringstrinnet. ApHj-, antages at være den samme, efter tilnærmelse af forste orden, som den værdi, der fâs ved kalibreringstrinnene. Eftersom det kan vises, at under de beskrevne eksperimentelle betingelser aile de pâ hojre side 35 af ligningen (9) anforte udtryk er blevet bestemt: 17

DK 156977 B

[prove af glucose] *= FCAL x (ApH^. - ApH^ - ApH^,) (9) kan koncentrationen af glucose i proven beregnes og præsente-res pâ digitalform pâ indikator- eller displaypanelet 16.

5 Tabel I viser bestemmelser af glucosekoncentrationen i humant plasma under anvendelea af den foreliggende opfin-delse samt ved en af U.S. Food and Drug Administration fore-slâet manuel metode til bestemmelse under anvendelse af en spektrofotometrisk procedure, jfr. Fédéral Register, vol.

10 39, nr. 126, June 28, 1974. Lignende resultater opnâs ved pr0ver af helblod fra normale og patologiske individer.

18

DK 156977 B

Tabel I

Bestemmelse af glucoseindhold ved anvendelse 5 af analysatoren og fremgangsmâden ifolge opfin- delsen: (a) i sérum fra et normalt individ (20 gentagelser) og (b) i sérum fra en diabetespa-tient (18 gentagelser).

10 (a) (a) (b) (b)

Prove nr. Mâlt værdi Pr0ve nr. Mâlt værdi (mg%) (mg%) I 113% 1 245% 15 2 112 2 242 3 110 3 242 4 112 4 241 5 109 5 242 6 109 6 244 20 7 112 7 242 8 116 8 241 9 112 9 243 10 111 10 242 II 109 11 244 25 12 111 12 241 13 112 13 245 14 112 14 242 15 110 15 243 16 112 16 244 30 17 112 17 246 18 112 18 243 19 114 20 111 n - 20 genmsn. 111,6 ± 1,70 n = 18 genmsn. 242,9 35 ± 1,49 (S.E. = 1,5%) (S.E. = 0,61%) 19

DK 156977 B

Værdier opnâet ved hjælp af den af FDA foreslâede hexokinase-glucose-6-phosphat-dehydrogenase manuelle test (ved spektrofotometri) er 110 mg% for prove (a) og 240 mg% for prdve (b). Det skal tilfdjes, at i denne sérié fors0g 5 svarer ApH pâ 0,0001 pH-enheder til den ændring i pH, der fremkaldes af ca. 1 mg% glucose.

Til pâvisning af lineariteten af den her omhandlede analysator udf0res der ogsâ bestemmelser af glucosekoncen-trationen i vandige standardopldsninger indeholdende en 10 kendt nominel glucosekoncentration pâ 50, 100, 200, 500 og 1000 mg% Nâr instrumentet kalibreres med standardoplosningen indeholdende 200 mg% glucose, giver det folgende anslâede koncentrationer af de andre opl0sninger: 15 Opln. 50 Opln. 100 Opln. 200 Opln. 500 Opln. 1000 mg% 48,6 98,1 198,7 511,9 1018,0 51,0 100,9 200,3 504,8 1008,0 I en anden sérié pâ 25 bestemmelser af de sanme stan-20 dardopl0sninger passer aile punkter til en linie givet ved ligningen y = Ι,ΟΟχ - 0,57. Den fundne regressionskoefficient er r = 0,99.

Yderligere mâlinger er blevet udfdrt i overensstemmel-se med opfindelsen sâledes, som det fremgâr af de folgende 25 resultater: 1. Glucose.

Til yderligere bed0mmelse af apparatets ydeevne har man anvendt den protokol, der er foreslâet af U.S. Food and 30 Drug Administration i publikationen: PROPOSED PERFORMANCE, a révision of the "PROPOSED ESTABLISHMENT OF PRODUCT CLASS STANDARD FOR DETECTION OR MEASUREMENT OF GLUCOSE (FR 39:24136-24147)".

Bestemmelserne er blevet udfdrt pâ 10 forskellige 35 dage. Hver dag undersdges 3 pools og 12 serumprdver in duplo.

Ved referencemetoden og ved testmetoden undersdges pools in 20

DK 156977 B

triplo (to serier mâlinger hver dag), og de 12 serumprover undersoges in duplo.

Ved slutningen af de 10 dage udfores der i ait 60 referencemetode-bestemmelser af poolen af prever. Der mâles 5 ogsâ pâ i ait 120 prover in duplo ved reference- og testme-toden.

Tabel II

10 Pool-resultater

Reference ApH-Metode Fotometer:

Middel Standard- Middel Standard- Nodvendig stan-afvigelse afvigelse dardafvigelse 15 --

Pool 1 72,3 1,9 70,7 1,8 5

Pool 2 142,6 2,3 139,2 3,4 7,1

Pool 3 246,4 5,4 241,5 3,1 12,3 20

Bedommelse af skævhed

ApH-Metode Krævet ydeevne

Pool 1 1,099 5,768 25 Pool 2 -1,781 8,396

Pool 3 -6,035 14,693

Der er ikke blevet fundet nogen preve med overdreven individuel skævhed.

21

DK 156977 B

Intereferens ΔρΗ-metode Krævet ydeevne

Bilirubin 0,4 5 5 Creatinin 0,16 5

Natriumfluorid 1,50 5

Natriumsalicylat 0,76 5

Urinsyre 0,23 5 10 André interfererende stoffer: fructose (pâ grund af ikke-specificitet af hexokinase-reaktionen).

Tabel III

15

Lactat

Ifalqe kommercielt tilaænqeliqe reaaenser L-Lactat + NAD" Pyruvat + NADH + H+ 20 Reaktionsblandina

Glutamat 10 mM/1 KC1 100 mM/1 NAD 3 mM/1

Sterox 1 g/1 25

Linearitet

Standard Mâlt værdi 2,5 2,2 30 5,0 5,0 10,0 10,4

Lactat-koncentration i blodpraver Metode iflg. opfindelsen Spektrofotometer (manuel) 35 10,1-9,9 10,4 22

DK 156977 B

Alternativ reaktion cytb2

Lactat + 2Fe(CN)6“3 - Pyruvat + 2H++2Fe(CN)6-4 5 Reaktionsblandinq

Phosphat 8 mM/1 K-ferricyanid 2 mM/1

Sterox 1 g/1

10 Tabel IV

Total CO2

Reaktion H+-HC03 H20 + C02 î pK = 6,1 15

Puffer

Succinat 10 mM/lî pH = 5,3 20 Fremqanqsmâde: 1) Bestemmelse af den absolutte pH-værdi for blandingen af sérum og succinat-puffer, efter at serumprdven er blevct tilsat.

2) Ækvilibrering af den fortyndede preve med luft.

25 3) Mâling af pH-værdien af den ækvilibrerede pr0ve.

Bereqninq; üd fra pK-værdien kan pH-værdien for reaktionsblan-dingen beregnes, og ud fra ændringen i pH pâ grund af C02-30 -fjernelse kan total C02 beregnes.

Reaktionstiden er ca. 90 sekunder for luftækvilibre- ring.

23

DK 156977 B

Tabel V

Urinstof

Reaktion 5 2H20 + urinstof -> C02 + 2 NH3 2 NH3 + 2 H20 2 NHj + 2 OH" (pK = 9,3)

Puffer

Phosphat 20 mM/1 10 KC1 100 mM/1

NaH3 lg/1

Sterox lg/1

Acetazolamid 0,1 g/1

Brig 33% 0,3 g/1 15 pH 7,5

Linearitets-check Standard Mâlt værdi 25 25,0 20 50 50,2 100 99,9 150 152,4 200 206,8 25 Korrelation med klinisk dominerende metode (IL 919) i forbindelse med serumprover:

Metoden ifolge opfindelsen IL 919 75.6- 75,1 75 31,8-31,8 34 30 50,5-50,5 52 20.6- 20,4 22

De angivne resultater illustrerer nojagtigheden og præcisionen af den her omhandlede fremgangsmâde. Det skal 35 bemærkes, at de fleste andre kommercielt tilgængelige instrumenter, der anvender andre analyseprincipper, ikke giver 24

DK 156977 B

meningsfulde resultater, nâr glucosekoncentrationen i den undersogte oplosning overstiger ca. 350 mg%. Den her om-handlede analysator er lineær i det mindste op til en glu-cosekoncentration pâ 1000 mg%, en værdi, der er 10 gange 5 storre end den, der findes hos normale individer.

Omend opfindelsen er blevet beskrevet i forbindelse med bestemmelsen af glucose, lactat, totalt C02 og urinstof, er opfindelsen ikke begrænset til disse bestemmelser, og der kan faktisk udfores tilsvarende sæt af operationer og mâlin-10 ger, der forer til bestemmelsen af ethvert andet stof af interesse. Generelt mâ der til bestemmelse af andre stoffer end de omtalte (1) vælges en reaktion, ved hvilken det stof, der har interesse, involveres i en kemisk reaktion, der forer til frigorelsen af hydrogenioner, (2) specificiteten 15 af reaktionen mâ sikres ved tilsætning af en passende reak-tant, og (3) reaktionen bor foregâ i et pufret medium, i hvilket pH-ændringer er lineære. En egnet reaktant kan være et enzym eller et kemisk middel, der er specifikt for det stof, der skal bestemmes. Som et yderligere eksempel kan et 20 enzym bestemmes ved anvendelse af en substrat-reaktant for et sâdant enzym.

Den her beskrevne fremgangsmâde og den her beskrevne analysator kan sâledes anvendes til bestemmelse af koncentra-tionen af kemiske stoffer sâsom urinsyre, proteolytiske 25 enzymer, mælkesyre, pyruvat og i almindelighed stoffer, der er involveret i en kæde af reaktioner, der omfatter ATP/ADP- eller NAD/NADH-coenzymer.

Fremgangsmâden og analysatoren ifolge opfindelsen til-lader ogsâ direkte beregning af mængden af stoffer sâsom 30 glucose, urinstof, alkohol og cholestérol i turbide oplosnin-ger sâsom helblod, hvorved man undgâr den langsommelige og besværlige procès omfattende fældning af rode blodlegemer eller centrifugering og de mange analysetrin, der kræves til opnâelse af en beregning af koncentrationen af sâdanne stof-35 fer.

Claims (15)

12. Fremgangsmâde til kvantitativ bestemmelse af et stof i en proveoplesning i en pH-analysator med pH-elek-troder ifolge krav 1, kendetegnet ved, at man 10 bestemmer en kalibreringsfaktor FCAL for pH-elektroderne, blander proveopldsningen med et reagens, der kan reagere med stoffet og ændre hydrogenionkoncentrationen i opl0sningen som et résultat af reaktionen, bestemmer en ApH0-værdi mellem elektroderne som en funktion 15 af stoj niveau og afdrift og det ureagerede reagens og prove-opl0sning, bestemmer en ApH^-værdi mellem elektroderne som en funktion af tilsætningen af en reaktions-initierende forbindelse, bestemmer en ApHc-værdi mellem elektroderne som en funktion 20 af ændringen i hydrogenionkoncentration resulterende fra reaktionen, og bestemmer koncentrationen af stoffet i opl0sningen i over~ ensstemmelse med formlen 25 [stof] = FCAL x (ApHc - ApHjj - ApH0) .

13. Fremgangsmâde if0lge krav 12, kendetegnet ved, at man bestemmer kalibreringsfaktoren ved hjælp af en standardoplosning med kendt koncentration af stoffet. 30 14.... Fremgangsmâde if0lge krav 13, kendetegnet ved, at man bestemmer ApH0-værdien mellem begge elektroderne i kontakt med en blanding af pr0veopl0sningen og reagenset. 35 DK 156977 B

15. Fremgangsmâde ifolge krav 13, kendeteg-n e t ved, at man bestemmer ApHjj-værdien mellem den forste elektrode i kontakt med reagenset og den anden elektrode i kontakt med en blanding af reagenset og forbindelsen. 5

16. Fremgangsnâde ifolge krav 12, 13, 14 eller 15, kendetegnet ved, at man bestemmer ApHc-værdien mellem den forste elektrode i kontakt med reagenset og den anden elektrode i kontakt med den omsatte blanding af pro- 10 ven, reagenset og forbindelsen.

17. Fremgangsmâde ifolge krav 12, kendetegnet ved, at stoffet er glucose.

18. Fremgangsmâde ifolge krav 12, kendeteg net ved, at man bringer den forste og anden elektrode i kontakt med en portion af proveblandingen og bestemmer ApH0-værdien mellem elektroderne, 20 fremstiller en blanding af reagenset og en forbindelse, der kan initiere reaktionen, bringer den forste elektrode i kontakt med reagenset, og bringer den anden elektrode i kontakt med reagens-forbindel-sesblandingen og bestemmer ApHjj-værdien mellem elektroderne, 25 blander proveoplosningen, reagenset og forbindelsen og tilla-der reaktionen at forlobe, bringer den forste elektrode i kontakt med en mængde af proveblandingen, og bringer den anden elektrode i kontakt med reagerede blanding og bestemmer ApHc-værdien mellem 3 0 elektroderne.

19. Fremgangsmâde ifolge krav 18, kendetegnet ved, at reagenset omfatter en puffer, der er i stand til at opretholde en pH-værdi i reaktionsblandingen inden 35 for et omrâde pâ ikke mere end 0,1 pH-enhed. DK 156977 B

20. Fremgangsmâde ifolge krav 12, kendeteg-n e t ved, at man blander en mængde af en standardoplosning med kendt koncentration af stoffet med en mængde af et reagens, der 5 kan reagere med stoffet og ændre hydrogenionkoncentrationen i blandingen ved et kendt fortyndingsforhold, bringer den forste og den anden elektrode i kontakt med en portion af standardblandingen og bestemmer ApH0-værdien mellem elektroderne, 10 fjerner blandingen fra kontakt med den anden elektrode, sætter til den resterende del af blandingen en forbindelse til initiering af reaktionen mellem stoffet og reagenset og tillader reaktionen at forlobe, bringer den anden elektrode i kontakt med den reagerede 15 blanding og bestemmer ApHc-værdien mellem elektroderne, bringer den forste elektrode i kontakt med reagenset, og den anden elektrode i kontakt med en blanding af reagenset og forbindelsen og bestemmer ApHb~værdien mellem elektroderne, bestemmer en kalibreringsfaktor FCAL i overensstem-20 melse med formlen [standardoplesning] FCAL = _ (ApHc - ApHb - A pH0) 25 blander en mængde af proveoplosningen med reagenset ved det kendte fortyndingsforhold, bringer en portion af proveoplosningsblandingen i kontakt med den f0rste og den anden elektrode og bestemmer en ApH^-3 0 -værdi, fjerner proveoplosningsblandingen fra kontakten med den anden elektrode, sætter forbindelsen til resten af proveoplosningsblandingen og tillader reaktionen at forlobe, 35 bringer den reagerede proveoplosningsblanding i kontakt med den anden elektrode og bestemmer en ApH^-værdi mellem elektroderne, og DK 156977 B bestemmer koncentrationen af stofferne i prdveoplosningen i overensstemmelse med formlen [prçsveopldsning] = FCAL x (ApH^ - ApHj-, - ApH£). 5

21. Fremgangsmâde ifolge krav 20, kendeteg-n e t ved, at reagenset omfatter en puffer.

22. Fremgangsmâde ifolge krav 21, kendeteg-10 net ved, at stoffet er et substrat, og at reagenset omfatter et enzym, der er i stand til at fremkalde reaktionen med stoffet.

23. Fremgangsmâde ifolge krav 22, kendeteg-15 net ved, at substratet er glucose, og at enzymet er he- xokinase.

24. Fremgangsmâde ifolge krav 21, kendeteg-n e t ved, at stoffet er et enzym, og at reagenset omfatter 20 et substrat for enzymet.

25. Fremgangsmâde ifolge krav 21, kendeteg-n e t ved, at pufferen er i stand til at holde pH-værdien i reaktionsblandingen inden for et omrâde pâ ikke over 1 25 pH-enhed.

26. Fremgangsmâde ifolge krav 21, kendeteg-n e t ved, at pufferen er i stand til at holde pH-værdien af reaktionsblandingerne inden for et omrâde pâ ikke over 30 0,1 pH-enhed.

27. Fremgangsmâde ifolge krav 20, kendeteg-n e t ved, at der foretages et stort antal af hver af be-stemmelserne af ApHc-, ApHj,- og ApH0-værdierne, og at der 35 anvendes et gennemsnit for hver af værdierne til bestem-melse af kalibreringsfaktoren.