DK154892B - Knogleerstatningsmateriale med forbedret biologisk stabilitet paa basis af modificeret collagen - Google Patents

Description

i

DK 154892 B

Opfindelsen angår et knogleerstatningsmateriale med forbedret biologisk stabilitet på basis af modificeret collagen.

I kirurgien er det gang på gang nødvendigt at forsyne knogledefekter med et fyldmateriale. Dette er frem for alt nødven-5 digt efter ulykker med kvæstelser, som har ført til knoglebrud med knoglematerialetab eller knogledeformation. Der findes dog talrige yderligere anvendelser som f.eks. defektfyldning efter fjernelse af knogletumorer eller tømning af knoglecyster. Yderligere bliver et knoglefyldmateriale nødvendigt i de til-10 fælde, hvor kirurgen i forbindelse med korrekturforanstaltninger på knogler må udfylde et allerede tilstedeværende eller af kirurgen selv tilvejebragt hulrum.

Ifølge det nuværende stade af den kirurgiske teknik er det bedst egnede materiale autologe spongiosa eller en autolog 15 kortiko spongiøs spån (Litteratur: Unfallheilkunge, 81, 565 -567 (1978)). I dette tilfælde er modtageren tillige knogledonoren.

Overføringen af humane knogler fra en person til en anden, den homologe transplantation, er ligeledes almindelig. Her-20 til er der enkelte steder oprettet knoglebanker, som holder egnet materiale parat. Desuden er overføringen af dyreknog-ler, som blev underkastet en egnet tilberedningsbehandling som f.eks. indlejring i cialitopløsning eller ifølge den i DE-PS 961.654 angivne fremgangsmåde, kendt og almin-25 delig.

De bedste kirurgiske egenskaber på implantationsområdet er hidtil uden tvivl blevet opnået, når man også har udtaget knoglerne fra den samme patient , som skal have dette materiale (autolog transplantation).

30 Herved findes to forskellige ulemper: 2

DK 154892 B

1. Knogleerstatningsmaterialet skal her udvindes ved en yderligere operation. Det yderligere operative indgreb fører til en forlængelse af den samlede opera tionstid, hvilket for patienten kan være meget uheldigt^ i nogle tilfælde endog livs- 5 truende. Dette rammer specielt hårdt kvæstede gamle mennesker eller af andre almene sygdomme, der er uafhængige af det nødvendige kirurgiske indgreb, forbelastede mennesker. Den yderligere operation fører desuden til større blodtab og er ubehagelig for de ramte mennesker på grund af smerterne, som op-10 står. Desuden giver hvert operative indgreb en risiko for komplikationer, som yderligere i enkelte tilfælde ikke altid forudseeligt kan bevirke yderligere skader.

2. Den til rådighed værende mængde autologe knogler er begrænset. Den eksisterende reserve udgøres af bækkenkammene i 15 begge sider, ribbenene, skinnebenshovedet og de til legemet ikke fæstnede dele af spolebenet. Selv den fuldstændige udnyttelse af disse kilder, som så nødvendiggør flere operative indgreb, giver ikke i alle tilfælde en tilstrækkelig mængde knogleerstatningsmateriale. Såfremt behovet er større, er lægen, som foretager 20 det operative indgreb, tvunget til enten ikke.‘at· .anvende tilstrækkelige mængder knogleerstatningsmateriale eller at gribe til anvendelsen af mindre velegnede knogler fra andre mennesker eller fra dyr.

Ved den homologe knogletransplantation fra et menneske til et 25 andet bliver transplantatet ofte ikke optaget acceptabelt af modtageren. Ansvarlig herfor er frem for alt dannelsen af modstoffer mod fremmedæggehvide. Egnet materiale kan desuden kun vanskeligt tilvejebringes. I reglen må man gribe til anvendelsen af fra lig udtagne knogler, som allerede har kraftigt re-30 duceret værdi. Overføringen af infektioner til modtageren er ikke udelukket.

Mangeårig anvendelse heterologt transplantationsmateriale, f.eks. det fra DE-patentskrift 96 .654 kendte Kieler Knochen-span har vist, at dette materiale af nogle patienter ikke 3

DK 154892 B

blev optaget tilfredsstillende. De af kirurgen indførte knoglestykker blev hyppigt ikke omdannet til levende knoglevæv, men blev liggende i vævet som dødt materiale.

5 Formålet med opfindelsen er derfor at tilvejebringe et hidtil ukendt knogleerstatningsmateriale, som står til rådighed i ønsket mængde, ikke danner antistoffer ved implantation i et menneskes eller dyrs legeme, har god vævsforligelighed og efter implantering i legemet bliver ombygget til knoglevæv.

10

Dette opnås med de i kravene definerede materialer.

Som udgangsmateriale for knogleerstatningsmaterialet ifølge opfindelsen tjener knogler og specielt bovint knoglemateriale, 15 f.eks. fra kalv. Der kan dog også anvendes andre udgangsmaterialer, såsom humane knogler eller lignende collagenholdigt materiale fra andre dyr. Nedenfor belyses fremgangsmåden til fremstillingen af knogleerstatningsmaterialet ifølge opfindelsen ved hjælp af kalveknogler som udgangsmateriale.

20

Fremgangsmåden udgør en kombination af forskellige trin, som skal gennemføres i den anførte rækkefølge for at opnå knogleerstatningsmaterialet ifølge opfindelsen med forbedret biologisk stabilitet.

25 I et første trin udvandes knoglerne i et vist tidsrum til fjernelse af blodfarvestoffet og andre vandopløselige proteiner. Dette tidsrum udgør fortrinsvis 2-3 dage. Ved denne udvanding bliver vaskevæsken hyppigt fornyet. Udvandingen kan også gen-30 nemføres som udvanding med strømmende vand. En særlig temperatur er ikke nødvendig, dog udvandes der hensigtsmæssigt ved omgivelsernes temperatur.

Et andet trin tjener til fjernelse af yderligere ikke vandop-35 løselige proteinmængder. Det er vigtigt, at fremmede proteiner uden for collagenet som f.eks. knogleceller bliver fjernet for at undgå modreaktioner på grund af antistofdannelse også af enzymatisk art. Fjernelsen af proteinandele i dette trin

DK 154892 B

4 - . - sker ved indlejring af knoglematerialet i en ^(^-opløsning. Denne E^C^-opløsning skal udvise en koncentration på over 10%. Behandlingens varighed udgør normalt 2-3 dage.

Også her må opløsningen fornyes flere gange for at sikre en 5 fuldstændig fjernelse af æggehvideandelene.

Det tredje fremstillingstrin består igen i et skylningstrin, i hvilket det i andet trin opnåede materiale bliver udvandet med koldt vand til udvaskning og bortførelse af de opløste bløddele. Det er her af fordel at anvende strømmende vand.

10 I det fjerde fremstillingstrin affedtes det således opnåede materiale. Affedtningen sker ved hjælp af organiske opløsningsmidler. Egnede opløsningsmidler er f.eks. acetone eller ether eller specielt en kombination af disse opløsningsmidler. Affedtningen kan gennemføres· i et vilkårligt dertil egnet appa-15 ratur. Et Soxhlet-apparatur er særligt egnet til denne affedtning.

I fremgangsmådens femte trin behandles det i fjerde trin opnåede materiale ved hjælp af kompleksdannere eller ionbyttere. Dette trin tjener det formål at eliminere knoglens mineralandel ved kompleksdannelse. Saltene af ethylendiamintetraeddikesyre 20 er egnede kompleksdannere.

Et til afkalkning egnet opløsningsmiddel kan fremstilles ifølge en i Remeis "Lehrbuch der mikroskopischen Technik" angivet fremgangsmåde. Derved behandles 250 g dinatriumethylendiamintetraeddikesyre med 200 ml destilleret vand, og der opvarmes. Under vedvarende 25 omrøring tilsættes 50 ml af en 40%ig natriumhydroxid, og det hele suppleres med destilleret vand til 800 ml. Ved tildryp-ning af 40%ig natriumhydroxid indstilles pH-værdien på 7,4, og det samlede volumen indstilles på 1000 ml med destilleret vand.

30 Knoglematerialet anbringes i en sådan, opløsning og forbliver d&ri et lamgere tidsrum, f.eks. i flere uger, indtil der er dannet et kautsjukagtigt elastisk produkt.

5

DK 154892 B

Det således opnåede kautsjukagtige elastiske produkt vaskes i et sjette fremstillingstrin på ny for at fjerne de tilstedeværende saltrester. Vaskningen sker i strømmende vand i et tilstrækkeligt tidsrum som f.eks. 2-3 dage.

5 Det derved opnåede materiale underkastes så i et syvende fremstillingstrin eventuelt en frysetørring på sædvanlig måde.

Det opnåede materiale underkastes så i et ottende fremstillingstrin den sædvanlige sterilisation, specielt strålesterilisa-10 tionen. Strålesterilisationen kan ske med sædvanlige doser, f. eks. med en dosis på 2,5 megarad.

Ved den ovenfor beskrevne kombinationsmetode er trinene 1-4 og trin 5 i og for sig kendte. Ganske vist bliver der ifølge DE-patentskrift 961.654 efter arbejdstrin 3 indskudt et tørringstrin, som gen-15 nemføres ved højst 40°C i løbet af et tidsrum på 12-24 timer.

Ved den foreliggende fremgangsmåde skal dette tørringstrin ikke anvendes, da man ellers ikke kommer til det opfinderiske resultat. Det er altså væsentligt, at efter fremstillingstrin 3, d.v.s. udvandingen, gennemføres det i og for sig kendte 20 arbejdstrin 4 uden et tørringstrin, d.v.s. affedtningen med organiske opløsningsmidler.

Fremgangsmådetrinet 5 kendes som sådant, f.eks. fra den nævnte Lehrbuch der mikroskopischen Technik” af Romeis. Derimod kendes kombinationen af fremgangsmådetrinene 1-4 ifølge 25 den foreliggende ansøgning med fremgangsmådetrin 5 ifølge ansøgningen ikke.

Ved fremgangsmådetrinene 6-8 drejer det sig om sædvanlige i og for sig kendte fremgangsmådetrin. Dog kendes heller ikke disse trin i kombination med fremgangsmådetrinene 1-5 ifølge 30 den foreliggende ansøgning.

Ved den opfinderiske kombination af de hver for sig i og for sig kendte enkelt-fremgangsmådetrin er det blevet muligt at

6 DK 154892 B

opnå et knogleerstatningsmateriale af renset collagen og specielt kalvecollagen, som ved omhyggelig undgåelse af alle skadelige faktorer, son f.eks. syre ved afkalkningsprocessen, i vid udstrækning fås i dets molekylstruktur, idet der ikke sker nogen nedbrydning af collagen på grund af hydrolyse.

5 Det således opnåede grundmateriale viser ved implantationen i legemet som knogleerstatningsmateriale forbavsende gode egenskaber. F.eks. er resorptionstiden væsentligt højere end ved andre kendte materialer. Desuden har finvævsundersøgelser, som blev udtaget efter implantation i forsøgsdyr på forskellige 10 tidspunkter, vist en fremragende forligelighed uden udstødningsreaktioner af legemet. Allerede efter 14 dages forløb kunne der påvises en begyndende omdannelse i knoglevævet. Finvævsundersøgelser viste indlejringer af mineralstof, bindevævceller, indribbede blodkar og knogledannende celler.

15 Det på ovennævnte måde opnåede grundmateriale kan med hensyn til dets fremragende egenskaber som knogleerstatningsmateriale endnu forbedres væsentligt, når man blander dette materiale med en ringe mængde af hormonet calcitonin, også benævnt thyreo-calcitonin. Hertil egner sig f.eks. i handelen værende calci-20 toninopløsninger. Det væsentligt forbedrede resultat tillader den slutning, at det her drejer sig om en synergistisk virkning mellem knogleerstatningsgrundmaterialet og hormonet calcitonin. Knoglenydannelsestiden kan med et sådant med calcitonin behandlet knogleerstatningsmateriale forkortes væsentligt 25 mere..

Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af det efterfølgende udførelseseksempel .

Eksempel 1 kg kalveknogler (spongiosastykke) vaskes omhyggeligt og be-30 fries så for grove blodrester. Denne knoglemængde anbringes så i et egnet kar med til- og fraløbsmuligheder og gennemskylles . så i 72 timer ved hjælp af s tremmende ledningsvand (trin 1). Knogle- 7

DK 154892 B

mængden anbringes så i en H202~opløsning (15%) i 72 timer. Opløsningen udskiftes 3-4 gange (trin 2). Behandlingen med flydende ledningsvand gentages så i 24 timer (trin 3). Derpå foretages affedtningen i et Soxhlet-apparat med 60% acetone og 5 40% diethylether i løbet af ca. 12 timer (trin 4).

1250 g dinatriumethylendiamintetraeddikesyre behandles med 1000 ml destilleret H2O og opvarmes. Under vedvarende omrøring tilsættes 200 ml NaOH (40%) og derpå suppleres med destilleret 10 vand til 4000 ml. Ved dråbevis tilsætning af 40%ig NaOH indstilles pH-værdien på 7,4, og der suppleres til 5000 ml med destilleret vand.

I den således opnåede opløsning anbringes de som ovenfor be-15 skrevet behandlede knogler, indtil flere udtagne prøver viser sig at være mineralfri. Ved stuetemperatur kræves hertil alt efter enkeltstykkernes størrelser ca. 3-4 uger (trin 5).

Dernæst vaskes ved hjælp af strømmende vand for at fjerne 20 restsalte (trin 6). Derpå frysetørres (trin 7). Efter egnet folieemballering steriliseres derpå ved bestråling med 2,5 me-garad (trin 8).

I det følgende beskrives forsøg og resultaterne heraf, i hvil-25 ke forsøg der er blevet implanteret knogleerstatningsmateriale ifølge opfindelsen.

Knogleerstatningsmaterialet ifølge eksemplet blevfpå rotter og kaniner afprøvet med hensyn til dets egenskaber.

30

Collagenmatrixen blev implanteret under huden xrg i dyrenes rygmuskulatur. Ved forskellige grupper blev implamtaterne udtaget og undersøgt histologisk efter 1,2,4,8 og '1*2 ugers foi— løb.

35

Efter 1 uges forløb kunne der allerede konstateres indvoksning af de fineste blodkar og celler.

Claims (2)

1. Knogleerstatningsmateriale med forbedret biologisk stabilitet på basis af modificeret collagen, hvis molekylstruktur i stor udstrækning svarer til naturligt collagens molekylstruktur, og hvor det modificerede collagen er blevet fremstillet 15 ud fra dyriske eller menneskelige knogler ved hjælp af følgende fremgangsmåde: 1. fjernelse af blodfarvestof og vandopløselige proteiner fra naturligt collagenholdigt materiale i form af knogler ved be- 20 handling med vand, 2. fjernelse af ikke-vandopløselige proteiner ved behandling med H202-opløsning, 25 3) skylning i koldt vand, 4. affedtning med organiske opløsningsmidler, kendetegnet ved, at affedtningen i trin 4 er foretaget umiddelbart efter skylningen i koldt vand i trin 3, og at frem- 30 gangsmådens følgende trin er 5. fjernelse af collagenmaterialets mineralandele ved hjælp af kompleksdannere eller ionbyttere, 35 6) restsaltfjernelse ved hjælp af strømmende væske, 7. eventuelt frysetørring på sædvanlig måde, og DK 154892 B 8. sterilisation på sædvanlig måde, specielt strålingssterilisation, idet dette collagen eventuelt er iblandet en ringe mængde af hormonet calcitonin.

2. Knogleerstatningsmateriale ifølge krav 1, kende tegnet ved, at der som dyriske knogler er anvendt bovin-knoglemateriale, f.eks. knogler fra kalv. 10 15 20 25 30 35