DK149591B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 2,5-diketopiperazinderivater eller syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

149591

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte immunregulatoriske 2,5-diketopiperazin-derivater og farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

DK patentansøgning nr. 1092/80 angår en gruppe peptider med 05 ubiquitin-lignende aktivitet, hvilke peptider indeholder et GLN-LYS-fragment alene eller i kombination med forskellige antal sarcosinamino-syrerester. Det fremgår af ansøgningen, at disse peptider har samme aktivitet som det langkædede polypeptid ubiquitin, der er omhandlet i US patentskrift nr. 4.002.602.

10 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer diketopiperaziner (cykliske dipeptider), som også besidder kraftig ubiquitin-lignende aktivitet. Da ubiquitin selv og de peptider, der er anført i den nævnte patentansøgning, alle er lineære, er det højst overraskende, at de omhandlede diketopiperaziner, som er cykliske, besidder den 15 samme anvendelighed.

Det er derfor et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe hidtil ukendte immunregulatoriske diketopiperaziner, som er i høj grad anvendelige i menneskers og dyrs immun sy stemer.

Opfindelsen angår således en analogifremgangsmåde til fremstil-20 ling af hidtil ukendte 2,5-diketopiperazinforbindelser med formlen:

H

H2N-C-(CH2)m>^^ <3 25 0 (CH2)n-NH2 H (I) hvori m er 1 eller 2, og n er 3 eller 4 eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved 30 det i krav 1's kendetegnende del angivne.

Det vil fremgå af en undersøgelse af ovenstående formel, at de omhandlede forbindelser indeholder to asymmetiske centre og derfor kan eksistere i flere forskellige optisk aktive former. Det vil sige, at de optisk aktive centre begge kan være dextro (D), begge levo 35 (L), eller det ene kan være dextro og det andet levo. Alle disse mulige kombinationer af optiske isomere anses for omfattet af den foreliggende opfindelse.

149591 2

Ligeledes omfattet af opfindelsen er de farmaceutisk acceptable salte af disse forbindelser. Som syrer, der er i stand til at danne salte med forbindelserne, kan nævnes uorganiske syrer, sisom saltsyre, hydrobromidsyre, perchlorsyre, salpetersyre, thiocyansyre, 05 svovlsyre, phosphorsyre, etc., og organiske syrer, såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, glycolsyre, mælkesyre, pyrodruesyre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, anthranilsyre, kanelsyre, naphthalensulfonsyre og sulfanilsyre, f.eks.

De omhandlede substituerede diketopiperaziner forener struk-10 turel enkelhed, fremstillingslethed og kraftig immunregulatorisk aktivitet, og tilvejebringer således signifikante fordele.

Det vil forstås, at de omhandlede diketopiperaziner kan betragtes som cykliske dipeptider, der som den ene aminosyrekomponent kan omfatte enten D- eller L-glutamin eller D- eller L-asparagin; og 15 som den anden aminosyrekomponent enten D- eller L-lysin eller D-elier L-ornithin.

I den foreliggende beskrivelse benyttes følgende forkortelser for de pågældende aminosyrer: 20 Aminosyre Forkortelse

L-glutamin GLN

L-asparagin ASN

L-iysin LYS

L-ornithin ORN

25 D-glutamin D-GLN

D-asparagin D-ASN

D-!ysin D-LYS

D-ornithin D-ORN

30 De omhandlede forbindelser fremstilles ifølge opfindelsen på den i krav 1 angivne måde ved at følge almindeligt kendte principper.

Syntese af cykliske peptider er f.eks. beskrevet i M. Bodanszky, et al., "Peptide Synthesis", 2. udgave, 1976, og K.D. Koppie, "Synthesis of Cyclic Peptides", J. Pharm. Sci., 61, (9), 1345 (sep-35 tember 1972).

I det almindelige fremstillingsskema beskyttes a-aminogruppen af en af aminosyrekomponenterne på dens ct-aminogruppe ved at til- 3 149591 lade, at den reagerer med et reagens, som vil indføre en beskyttende gruppe, som yderligere omtalt nedenfor. Denne beskyttede ami-nosyrekomponent aktiveres derpå med hensyn til nucleofilt angreb af en amin ved dens carboxygruppe til dannelse af en carboxy-akt?-05 veret beskyttet aminosyrekomponent, som yderligere beskrevet nedenfor. Det foretrækkes, at den således behandlede aminosyrekomponent er glutamin- eller asparaginaminosyrekomponenten.

Den anden aminosyrekomponent esterificeres derpå på dens carboxy-terminal med f.eks. en C1-C6 lavere alkanol, og beskyttes 10 (hvis passende) på dens Δ- eller ε-aminogruppe ved at tillade, at den reagerer med et reagens, som vil indføre en beskyttende gruppe i den position. Det foretrækkes, at denne aminosyrekomponent er lysin eller onithin.

Ca. ækvimolære mængder af hver af disse materialer får lov at 15 reagere til dannelse af det resulterende lineære beskyttede dipeptid, som ringsluttes efter fjernelse af den a-amino-terminal beskyttende gruppe. Denne ringslutning kan opnås ved forskellige metoder, herunder aktiv ester- og azid-metoderne og andre velkendte metoder.

Den direkte metode, som anvender et carbodiimid (f.eks. et Ν,Ν1-20 dialkylcarbodiimid, Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimid eller N-ethyl-N1- (3-dimethylaminopropyl)carbodiimid, som foretrækkes, er imidlertid illustreret nedenfor og anvendes i eksemplerne.

Endelig fjernes den Δ- eller ε-amino-beskyttende gruppe, hvilket giver det ønskede cykliske dipeptid som enten en fri base eller 25 et syreadditionssalt.

Dette reaktionsskema kan illustreres som følger, hvori m og n er som ovenfor defineret, X og Y betegner amino-beskyttende grupper, R betegner lavere al kyl, og A betegner en carboxy-aktiverende gruppe: 30 35 149591 4 H2N-C-(CH2)m-CH - C-OA + H2N-CH-COOR -> 0 NHX O «V) | Z Π (ID NHY (III) H2N"fr"(CH2)m-fH ' C-NH-CH-COOR -> O NHX 0 (CH-,) 2) ringslutning i 2 n NHY (iv) 10 2 II 2 m N Λ Ίυ ο Ύ ^γΟ

- g (CH2)n-NHY

8 (V) 15

De amino-beskyttende grupper X og Y kan være ens eller forskellige og bør være stabile over for fjernelse ved de trin, der anvendes for sammenføjning af de to aminosyrer, medens X bør kunne fjernes under betingelser, som ikke vil fjerne Y, og Y bør kunne 20 fjernes under betingelser, som ikke vil ødelægge den resulterende diketopiperazinforbindelse.

Ifølge opfindelsen udvælges X og Y hver især fra gruppen bestående af:

25 O

1 // i a) R -OC-, hvori R betegner phenyl, tolyl, xylyl, adamantyl, allyl, β-cyanoethyi, fluorenylmethyl, benzyl, benzyl, hvori phenyl-ringen er substitueret med fra 1 til 3 substituenter udvalgt fra gruppen bestående af halogen, nitro, lavere alkyl og lavere alkoxy, 30 diisopropylmethyl, diphenylmethyl, cyclohexyl, cyclopentyl, vinyl, t-butyl, t-amyl, dimethyltrifluormethylmethyl eller dimethylbiphenyl-methyl;

O

2 U 2 35 b) R C-, hvori R betegner lavere al kyl med 2 til 4 carbonato- mer, såsom ethyl, isopropyl, t-butyl, og lignende, eller lavere alkyl med 1 til 4 carbonatomer substitueret med fra 1 til 5 halogengrupper, såsom trifluormethyl, chlormethyl, pentachlorethyl, og lignende;

V

5 149591 o il 3 4 c) R O-F-, hvori V er S eller O, og R og R hver betegner ben- 1 4

OR

zyl eller lavere alkyl; 05 d) ,'fr

ICH

10 \Nf° ' 'r6 5 6 5 6

hvori R og R hver for sig betegner lavere al kyl, eller R og R

tilsammen betegner 15 -CH„-C-CH9-

R7 V

7 8 20 hvori R og R hver betegner hydrogen eller lavere alkyl; "ti"1 25 ^ Sv.

g hvori R betegner hydrogen eller nitro; og f)

p O

30 κ10 II

oc

II

o 10 35 hvori R betegner hydrogen, methyl, halogen eller nitro.

6 149591

Som udtrykket "halogen" anvendes i den foreliggende beskrivelse, indbefatter det fluor, chlor, brom og iod, men chlor og brom foretrækkes. Udtrykkene "lavere alkyl" og "lavere alkoxy" indbefatter henholdsvis mættede alifatiske carbonhydrider med 1 til 6 car-05 bonatomer, sisom methyl, ethyl, isopropyl, t-butyl, n-hexyl, og lignende, og de tilsvarende alkoxy'er, såsom methoxy, ethoxy, iso-propoxy, t-butoxy, n-hexoxy, og lignende. Methyl er den foretrukne lavere alkyl, og methoxy er den foretrukne lavere alkoxy.

De reagenser, der anvendes for at indføre disse beskyttende 10 grupper (sædvanligvis de tilsvarende syrechlorider, skønt andre derivater kan anvendes), omtales undertiden i den foreliggende beskrivelse som "beskyttende gruppe reagenser".

Det foretrækkes, at X betegner t-butyloxycarbonyl (BOC), og Y betegner benzyloxycarbonyl (CBZ).

15 . En forskellighed af reagenser kan anvendes for at fremstille den carboxy-aktiverede beskyttede aminosyre ved indføring af A-gruppen.

Én type carboxy-aktiveret beskyttet aminosyrerest er en reaktiv ester. Eksempler pi midler, der anvendes til fremtilling af de 20 egnede aktive estere, er phenol; og phenol, hvori phenyl ringen er substitueret med 1 til 3 substituenter udvalgt fra gruppen bestående af halogen (f.eks. chlor eller fluor), nitro, C^_3 lavere alkyl og C^_3 lavere alkoxy.

De omhandlede forbindelser udviser immunregulatorisk aktivitet 25 som påvist i en in vitro cytotoxisk lymfocyt prækursor enheds- (CLP-U) prøve, hvor virkningen af in vitro inkubation af en af de omhandlede forbindelser med muse-miltceller på genereringen af CLP-U vurderedes. Denne prøve korrelerer direkte med immunreaktion i varmblodede dyr, herunder mennesker. Det vil sige, at hvis 30 en afprøvet forbindelse stimulerer eller inhiberer CLP-U genereret i prøven ved en vis koncentration, antyder disse resultater den afprøvede forbindelses immunregulatoriske virkning. Denne prøve er også blevet udført, f.eks. for det kendte immunregulatoriske peptid TP5, hvilket har bekræftet denne korrelation. For en mere detaljeret 35 beskrivelse af denne prøve og dens anvendelse ved måling af immunregulering henvises til C.Y. Lau og G. Goldstein, J. Immunology: 124 (4), 1861-1865 (april 1980).

7 149591 På grund af de omhandlede forbindelsers karakteristika er de terapeutisk nyttige ved behandling af mennesker og dyr, da de besidder evnen til at korrigere immunmangler i individer, der har behov for sådan korrektion. Som et resultat anses forbindelserne frem-05 stiliet ifølge opfindelsen for at besidde multiple terapeutiske anvendelser. På grund af deres biologiske karakteristika, som er yderst aktive ved lave koncentrationer, anses de for at være nyttige ved at hjælpe kroppens kollektive immunitet, idet forbindelserne vil forøge eller hjælpe til ved terapeutisk stimulering af cellulær immunitet 10 og derved blive nyttige ved behandlingen af sygdomme, der medfører kronisk infektion in vivo, såsom fungal- eller mycoplasmainfek-tioner, tuberkulose, spedalskhed, akutte og kroniske virale infektioner, og lignende. Yderligere anses forbindelserne for at være nyttige pi et hvilket som helst område, hvor cellulær immunitet er 15 af vigtighed, og især hvor der er mangler i immuniteten, såsom ved DiGeorge syndromet (medfødt fravær af thymus). Ligeledes kan forbindelserne, hvor der er et overskud af antistofproduktion, korrigere denne tilstand ved at regulere T-celle produktionen. De kan således være terapeutisk nyttige ved visse autoimmune sygdomme, hvor 20 skadelige antistoffer er til stede, f.eks. systemisk lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, og lignende. Yderligere er forbindelserne på grund af deres karakteristika anvendelige in vitro ved at forårsage udvikling af T-cellers overfladeantigener, ved at forårsage udvikling af den funktionelle evne til at opnå reaktion på mitogener 25 og antigener og cellesamarbejde ved at fremme B-cellers evne til at producere antistoffer. Ydermere er forbindelserne nyttige ved behandling af tilstande, såsom neoplasia, hvor immunreaktionen er subnormal.· Indgivelse af en effektiv immunregulatorisk mængde af de omhandlede forbindelser vil hjælpe til ved behandlingen af sådanne 30 tilstande (og især neoplasia) enten alene eller sammen med andre former for behandling, såsom kirurgisk fjernelse.

Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen kan anvendes til regulering af immunsystemet i et individ, menneske eller dyr, som har behov for sådan immunregulering ved indgivelse til det nævnte 35 individ af en effektiv immunregulatorisk mængde af en af de omhandlede forbindelser, fortrinsvis i blanding med et farmaceutisk bæremiddel. Som det anvendes i den foreliggende beskrivelse, betyder 149591 δ udtrykket "regulere", at de omhandlede forbindelser forårsager, at immunsystemet fra en unormal sygelig tilstand vender tilbage til en normal afbalanceret tilstand.

Det er en yderligere egenskab ved forbindelserne fremstillet 05 ifølge opfindelsen, at de er stærkt aktive i meget lave koncentrationer i området fra 0,1 pg/ml. Bæremidlet kan være et hvilket som helst af de til dette formål velkendte bæremidler, indbefattet normale saltvandsopløsninger, fortrinsvis med et proteinfortyndingsmiddel, såsom okseserumalbumin (BSA) til forhindring af adsorptive tab til 10 glasartikler ved disse lave koncentrationer. Forbindelserne ifølge opfindelsen er aktive parenteralt ved ca. 1 ng/kg legemsvægt. Til behandling af rheumatoid arthritis kan de i almindelighed indgives i en mængde pi fra ca. 0,1 til 100 ng/kg legemsvægt. I almindelighed kan det samme dosismængdeinterval anvendes ved behandling af de 15 andre nævnte tilstande eller sygdomme.

Til fremstilling af farmaceutiske præparater ud fra forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen kombineres en forbindelse med formel (!) eller et syreadditionssalt deraf som den aktive bestanddel i intim blanding med et farmaceutisk bæremiddel i overensstemmelse 20 med konventionelle farmaceutiske præparationsteknikker, hvilket bæremiddel kan have mange forskellige former afhængig af den præparatform, der ønskes til indgivelse, f.eks; sublingual, rektal, nasal, oral eller parenteral. Ved fremstilling af præparaterne på oral dosisform kan et hvilket som helst sædvanligt farmaceutisk medium anven-25 des, såsom f.eks. vand, glycoler, olier, alkoholer, smagsstoffer, konserveringsmidler, farvestoffer, og lignende, hvor det drejer sig om orale flydende præparater, såsom f.eks. suspensioner eliksirer og opløsninger; eller bæremidler, såsom stivelser, sukker, fortyndingsmidler, granuleringsmidler, smøremidler, bindemidler, disinte-30 greringsmidler, og lignende, hvor det drejer sig om orale faste præparater, såsom f.eks. pulvere, kapsler og tabletter. På grund af den lethed, hvormed de indgives, repræsenterer tabletter og kapsler den mest fordelagtige orale dosisenhedsform, i hvilket tilfælde der naturligvis anvendes faste farmaceutiske bæremidler. Hvis det 35 ønskes, kan tabletter overtrækkes med sukker eller et enterisk overtræk ved standardteknikker. Til parenterale midler vil bæremidlet sædvanligvis omfatte sterilt vand, skønt andre ingredienser, f.eks.

9 149591 for at lette opløselighed eller til konserveringsformål, kan anvendes. Injicerbare suspensioner kan ligeledes fremstilles, i hvilket tilfælde egnede flydende bæremidler, suspenderingsmidler, og lignende, kan anvendes. De parenterale farmaceutiske præparater bør formuleres 05 således, at de omhandlede forbindelser indgives i en mængde på fra ca. 0,1 til ca. 100 ng/kg legemsvægt. De orale præparater bør indgives i mængder på fra ca. 100 til 1000 gange dosen til parenteral indgivelse - dvs. fra ca. 10 ng/kg til ca. 100 pg/kg legemsvægt. I overensstemmelse hermed bør de parenterale præparater pr. dosisen-10 hed indeholde fra ca. 5 ng til ca. 5 pg, medens de orale præparater pr. dosisenhed bør indeholde fra ca. 500 ng til ca. 5 mg af den omhandlede forbindelse.

Fremstillingen og vurderingen af en som eksempel angivet forbindelse er anført nedenfor til illustration. Med mindre andet er an-15 ført, er alle dele vægtdele.

Eksempel 1 N -BOC-L-glutaminyl-N -benzyloxvcarbonyl-L-lysin-OMe BOC-GIn-ONp (3,67 g, 0,01 mol) og Ns-Z-Lys-OMe.HCI (3,64 20 g, 0,011 mol) opløstes i 30 ml DMF. Blandingen afkøledes på et isbad, og diisopropylethylamin (1,91 ml, 0,011 mol) tilsattes langsomt under omrøring. Reaktionen omrørtes i 3 dage ved omgivelsernes temperatur. Opløsningsmidlet fjernedes under reduceret tryk, og remanensen genopløstes i ethylacetat (200 ml) og vaskedes med 10% 25 natriumbicarbonatopløsning (6 x 50 ml), HgO (3 x 50 ml), 0,1N HCI (3 x 50 ml) og (3 x 50 ml). Det organiske lag tørredes over natriumsulfat, og efter filtrering fjernedes opløsningsmidlet under reduceret tryk. Det rå produkt (4,6 g) opnåedes ved tilsætning af ether til blandingen, fjernelse af faststoffet ved filtrering, udvask-30 ning med ether og tørring i vakuum/. Dette materiale suspenderedes i ethylacetat, filtreredes og vaskedes med den mindst mulige mængde ethylacetat. Produktet tørredes i vakuum til dannelse af et hvidt faststof (3,8 g, 73% udbytte), smp. 99-100°C; Rf 0,49 (CHCIg/MeOH/ HOAc = 85:10:5; silicagel GF 250 p); pmr (CD3OD)6, 1,42 [s, 9H, 35 (CH3)3C-j, 1,5-2,4 (Μ, 10H, methylen H), 3, 1 (t, 2H, CHg-NH-Z), 3,7 (s, 3H, -OCH3), 4-4,5 (m, 2H, o-CH-), 5,1 (s, 2H, -CHg-CgHg), 7,39 (s, 5H, -CgHg).

10 149591

Analyse beregnet for C25H38N4°8: C: 57,46, H: 7,33, N: 10,71,

Fundet: C: 57,23, H: 7,24, N: 10,52.

05 Eksempel 2

Cyclo-(L-glutaminyl-Ns-benzyloxycarbonyl-L-lysin) BOC-Gln-NS-CBZ-Lys-OMe (2,15 g, 4,11 mmol) behandledes med 10 ml 4N HCI/dioxan ϊ 1 time ved stuetemperatur. Opløsningsmidlet fjernedes under reduceret tryk, og remanensen opløstes i 25 10 ml Cl-^CIg. Opløsningen nedkøledes til 0°C, og diisopropylethylamin (0,96 ml, 4,11 mmol) ‘tilsattes langsomt under omrøring. Blandingen bragtes til tørhed, og det tilbageblevne materiale opløstes i 50 ml CHgOH og tilbagesvaledes forsigtigt i 24 timer. Blandingen anbragtes i et koldt rum, og bundfaldet opsamledes ved filtrering og va-15 skedes grundigt med vand. Produktet tørredes i vakuum til dannelse af et hvidt faststof (300 mg, 24% udbytte); smp. 235°C; der opnåedes et andet udbytte af materiale (400 mg, 26% udbytte); Rf 0,256 (n-butanol/HgO/HOAc = 3:1:1, silicagel GF, 250 μ); pmr (TFA)6, 1,4-2,8 (m, 12H, methylen H), 4,2-4,5 (m, 2H, a-CH), 20 5,2 (s, 2H, -CH2-CgH5), 7,32 (s, 5H, - CgHg).

Analyse beregnet for c-j9H26N4°5: C: 58,45, H: 6,71, N: 14,34.

Fundet: C: 58,31, H: 6,61, N: 14,30.

25 Eksempel 3

Cyclo-(L-glutaminyl-L-lysin),hydrochlorid

Cycio-(L-Gln-Ns-benzyloxycarbonyl-L-Lys) (140 mg, 0,48 mmol) suspenderedes i 10 ml eddikesyre og 10 ml IN HCI. Til suspensionen sattes langsomt 100 mg 10% palladium-på-trækul. Blandin-30 gen hydrogeneredes på en Parr-ryster ved 40 psi i 24 timer. Katalysatoren fjernedes ved filtrering, og filtratet bragtes til tørhed.

Til remanensen sattes 15 ml ethanol og nogle få dråber vand. Blan-. dingen anbragtes i et koldt rum natten over, og bundfaldet opsamledes ved filtrering og tørredes i vakuum. Udbyttet var 95% (57 mg, 35 I. udbytte og 40 mg, 2. udbytte); smp. 246-248°C. Rf 0,20 (n-bu-tanol/HOAc/HgO = 3:1:1, silicagel GF, 250 μ); M.S. (sonde): m/e 256 (M+); pmr (DgO) 6 1,3-2,4 (m, 10H, methylen H), 2,8-3,1 (m, 2H, -CH2-NH) 4,05 (t, 2H, a-CH-).

11 149591

Analyse beregnet for C11H20N4°3: C: 45,13, H: 7,23, N: 19,13,

Fundet: C: 45,42, H: 7,10, N: 18,41.

05 Til vurdering af den immunregulatoriske aktivitet af det cykli ske dipeptid fremstillet ifølge eksempel 3 udførtes følgende prøve.

Enkelt-celle suspensioner fremstilledes fra milte af normale C57BL/6 mus (hunkøn, 8 uger gamle, Jackson Laboratory, Bar Harbour, Maine), og cellerne vaskedes tre gange med PBS. Cellerne 10 resuspenderedes derpå i RPMI 1640 medium (Gibco), hvorpå de inkuberedes med forskellige koncentrationer af prøvepeptidet i 1 time ved 37°C. Efter inkubering vaskedes cellerne, og frekvensen af CLP-U bestemtes ved den begrænsende fortyndingsprøve i henhold til den af Teh, et al., J. Immunol. 218:1049(1977) og Lindahl og 15 Wilson, J. Exp. Med. 145:508(1977) beskrevne metode.

Begrænsende antal C57BL/6 miltceller (2 x 104 til 8 x 104) anbragtes i V-bundede Linbro bakker (Flo Laboratories) sammen med mitomycin-C-behandlede DBA miltceller (DBA/2J mus, Jackson Laboratory, Bar Harbour, Maine), idet 107 DBA celler var blevet be-20 handlet med 30 pg mitomycin-C i 30 minutter ved 37°C. Antallet af anvendte DBA celler varierede fra 1,2 x 105 til 6,5 x 105 pr. kultur. Tyve replikater sattes op til hver cel le koncentration.

De forenede kulturer inkuberedes derpå ved 37°C i seks dage, ved slutningen af denne periode fjernedes 100 pi af supernatantme-25 diet fra hver kilde, og celler blandedes så med 0,1 ml frisk medium indeholdende 2 x 104 P815 mastocytoma-celler mærket Cr som tidligere beskrevet af Teh, et. al. Efter en yderligere inkubationsperiode på 4 timer fjernedes 100 μΙ af supernatantfluidet i hver kilde, og radioaktiviteten deri bestemtes i et gamma-spektrometer. Bag-30 grunds-krom-frigørelsen fra kulturer indeholdende kun C57NL/6 celler eller kun DBA celler var altid mindre end 15%.

Frekvenserne af CLP-U beregnedes i overensstemmelse med Poisson's statistikker som følger. Først beregnedes middel-spontan-frigørelsen ved at beregne gennemsnittet for tællinger af tyve kil-35 der, som kun modtog C57BL/6 celler. Kilder taltes som positive, hvis deres tællinger var højere end 2,07 standardafvigelser over denne middel-spontan-frigørelsesværdi (P<0,05). I henhold til 12 149591

Poisson's fordeling kan prækursorernes frekvenser derpå beregnes 6N

ved ligningen P = E , hvor P er lig med sandsynligheden for respons, 6 er lig med frekvens, og N er lig med antallet af celler anbragt i kulturen.

05 Procenten af ikke-responderende kulturer for hver C57BL/6 koncentration beregnedes og plottedes på semi-logaritmisk skala som en funktion af cel lekoncentrationen. I henhold til den ovenfor anførte ligning er den omvendte af antallet af celler i kulturen, som vil give 37% ikke-responderende kultur, frekvensen af prækursorer i 10 den kultur. Den bedst egnede regressionslinie ved det mindste kvadrats metode udregnedes for hver linie, og frekvensen beregnedes dernæst.

Forøgelse af CLP-U efter suboptimal stimulering Jagttoges for det cykliske dipeptid ifølge eksempel 3 ved koncentrationer i områ-15 det fra 0,1 pg/ml til 10 ng/ml, skønt optimal forøgelse iagttoges fra 0,1 pg/ml til 0,01 ng/ml.

Claims (3)

149591

1 CH v s ^c=o % I 30 6 5 6 5 hvori R og R hver for sig betegner lavere alkyl, eller R og C R tilsammen betegner

35 -CH„-C-CH„- >v R7 V 149591 7 8 hvori R og R hver betegner hydrogen eller lavere alkyl; e) \x: g hvori R betegner hydrogen eller nitro; og 10 f) R O

10 M Oc; II o 10 hvori R betegner hydrogen, methyl, halogen eller nitro, og 20. betegner phenyl eller phenyl, hvori phenylgruppen er substitueret med fra 1 til 3 substituenter, hver udvalgt fra gruppen bestående af halogen, nitro, C1-C3 lavere alkyl, og C1-C3 lavere alk-oxy, hvorefter man om ønsket omdanner en fremstillet forbindelse med formlen (I) til et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt 25 deraf.

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af 2,5-diketopiperazin-derivater med formlen:

05 H2S-J-(CH2)m I 0 <CH2>n-SH2 (I) ft 10 hvori m er 1 eller 2, og n er 3 eller 4 eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, KENDETEGNET ved, at man a) omsætter ca. ækvimolære mængder af en forbindelse med formlen 15 H9N-C-(CH0)r-CH--C-OA (II) 2 li 2 m [ jl O NHX O og en forbindelse med formlen: 20 h2n-ch-coor (III) (CH2}n"NHY til dannelse af en forbindelse med formlen: 25 H0N-C-(CH„>--CH-C-NH-CH-COOR (IV) 2 j| 2 m f II i O NHX O (CH2)n-NHY b) fjerner den X-beskyttende gruppe fra forbindelse (IV) 30 c) ringslutter den resulterende forbindelse til dannelse af en forbindelse med formlen: 35 (V) 0 li (kuk <CH2)n-NHY °9 H 1Λ 9 5 91 d) fjerner den Y-beskyttende gruppe fra forbindelse (V) til dannelse af en forbindelse med formlen (I), hvorhos X og Y hver især er udvalgt fra gruppen bestående af 05 O 1. ii η a) R -OC-, hvori R betegner phenyl, tolyl, xylyl; adamantyl; allyl, β-cyanoethyl, fluorenylmethyl, benzyl, benzyl, hvori phenylringen er substitueret med fra 1 til 3 substi- 10 tuenter udvalgt fra gruppen bestående af halogen, nitro, lave re alkyl og lavere alkoxy, diisopropylmethyl; diphenylmethyl; cyclohexyl; cyclopentyl; vinyl; t-butyl; t-amyl; dimethyltriflu-ormethylmethyl eller dimethylbiphenylmethyl;

15 O

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man ud fra tilsvarende udgangsforbindelser fremstiller cyclo-(GLN-LYS), cyclo-(GLN-ORN), cyclo-(ASN-LYS), cyclo-(ASN-ORN), eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

2 U 2 b) R C-, hvor? R betegner lavere alkyl med 2 til 4 carbon-atomer eller lavere al kyl med 1 til 4 carbonatomer substitueret med fra 1 til 5 halogengrupper;

20 V 3 11 3 4 c) R O-P-, hvori V er S eller O, og R og R hver betegner • λ OR^ benzyl eller lavere al kyl; 25 d) „ R_ ✓ I5 ' ^C'°

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at man ud fra tilsvarende udgangsforbindelser fremstiller cyclo-(D-GLN-D--LYS), cyclo-(D-GLN-D-ORN), cyclo-(D-ASN-D-LYS), cyclo-(D--ASN-D-ORN), eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf. 35