DK149331B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af piperidinderivater afdi-0-(n-alkyl- eller n-alkenyl)-propandiol eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

1A 9 3 31

Opfindelsen angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte piperidinderivater af di-O-(n-alkyl- eller n-alkenyl)-propandiol med formlen ✓-\ /CH2NH2

h^OsL

2 149331 eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, hvor R^ og R hver er udvalgt fra gruppen bestående af normale alkylgrupper med fra 12-20 carbonatomer og normale alkylengrupper, hvor dobbeltbindingen ikke er i 1-stillingen, med fra 12-20 carbonatomer, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 1's kendetegnende del anførte. De omhandlede forbindelser er nyttige til bekæmpelse af virale infektioner i pattedyr.

Virusinfektioner, som angriber pattedyr, herunder mennesker, er normalt smitsomme sygdomme, som kan forårsage stor menneskelig lidelse og økonomisk tab. Uheldigvis er opdagelsen af antivirale forbindelser meget mere kompliceret og besværlig end opdagelsen af antibakterielle og antifungale midler. Dette skyldes delvis den tætte strukturelle lighed mellem vira og strukturen af visse essentielle cellulære forbindelser, såsom ribonucleinsyre og desoxyribo-nucleinsyre. Imidlertid er beskrevet adskillige ikke-virale "antivirale forbindelser", dvs. forbindelser "som kan danne enten en beskyttende eller terapeutisk virkning til en klar påviselig fordel for den virusangrebne vært, eller et materiale, som væsentligt kan forøge antistofdannelsen, forbedre antistofaktiviteten, forbedre ikke-specifik modstand, bevirke hurtigere helbredelse eller hæmme symptomer", [Herrman et al., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 103, 625, (I960)]. Listen af angivne antivirale midler omfatter, for at nævne et fåtal, interferon og syntetiske materialer, såsom amantadinhydro-chlorid, pyrimidiner, biguanider, guanidin, pteridiner og methisa-zon. På grund af det temmelig snævre område af virale infektioner, der kan behandles med hver af de i handelen tilgængelige antivirale midler på nuværende tidspunkt, er nye syntetiske antivirale midler altid velkomne som potentiel værdifuld forøgelse af den medicinske teknologis udstyr.

Pattedyrs celler producerer som svar på virale infektioner et stof, der muliggør, at cellerne kan modstå formering af et antal vira. De virushæmmende eller virusinterfererende stoffer kaldes "interferoner". Interferonerne er glycoproteiner, der kan adskille sig i deres fysisk-kemiske egenskaber, men som alle udøver samme biologiske egenskaber, nemlig hæmning af et stort antal ikke-be-slægtede vira, ikke har toksisk eller anden skadelig effekt på cellerne og er artsspecifikke (Lockart, Frontiers of Biology, Vol. 2, "Interferons", udgivet af Finter, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1966, side 19-20).

3 149331

Ingen praktisk, økonomisk fremgangsmåde er endnu blevet udviklet til fremstilling af exogene interferoner til klinisk rutinebrug overfor virale infektioner. Et alternativ til fremstilling af interferoner har derfor været forsøgt, hvilket omfatter administrering til det dyr, som skal beskyttes eller behandles, af et ikke-viralt stof, der stimulerer eller inducerer frembringelse af interferon i cellerne. Interferon fremstillet på denne måde betegnes "endogen" interferon.

US Patentskrift nr. 2.738.351 beskriver, at forbindelser med den almene formel R^X-CH, I 2

CH-Z-ALK-B

2 ) R -Y-CH2 1 2 hvor R og R kan være alkyl, aralkyl, aryl, cycloalkyl, nitrosubstitueret aryl, halogen-substitueret aryl, alkyl-substitueret aryl eller alkoxy-substitueret aryl, X, Y og Z kan være oxygen, svovl eller sulfonyl, ALK betyder en ligekædet eller forgrenet alkylengrup-pe med fra 1-6 carbonatomer, og B kan være di(lavere)-alkylamino, piperidino, morpholino, pyrrolidino, (lavere alkyl)-pyrrolidino, N'-alkylpiperazino eller pipecolino, er lokalt anæstetiske midler. Yderligere beskrives ved diskussionen af alternative syntetiske veje (se spalte 1, 11. 57-70 i nævnte patentskrift) mellemprodukter med den i det foregående nævnte formel, hvor B er amino- og (lavere alkyl)-aminogrupper. Imidlertid indeholder ingen af de i det nævn- 1 2 te patentskrift specielt angivne forbindelser en R eller R alkyl-gruppe, som er større end n-pentyl. Yderligere er der ingen forbin-delser, hvor både R og R er alkylgrupper, og både X og Y er oxygenatomer.

Insecticide og miticide forbindelser med formlen R1-CH- I 2 CH-(CH-) -A 2 I 2 5 .

R -CH2 2 hvor R og R hver bl.a. kan være lavere alkylthiogrupper, q betyder 0-5, og A bl.a.kan være en 1-piperidino eller di(lavere alkyUamino-gruppe er beskrevet i japansk patentskrift nr. J7-6042-177.

4 149331

Det har nu vist sig, at de hidtil ukendte forbindelser med formlen I og de farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, som fremstilles ved analogifremgangsmåden ifølge opfindelsen, udviser anti-viral virkning overfor en stor mængde vira in vivo i pattedyr og in vitro i cellekulturer fra pattedyr. I det mindste en væsentlig mængde af denne virkning resulterer fra de nævnte forbindelsers evne til at inducere interferonproduktion i cellerne, dvs. endogen interferon.

r Med"farmaceutisk acceptable" syreadditionssalte menes de salte, som er "ikke-toksiske" ved de indgivne doser. De farmaceutisk acceptable syreadditionssalte, der kan anvendes, omfatter sådanne vandopløselige og vanduopløselige salte, såsom hydrochlori-der, hydrobromider, fosfater, nitrater, sulfater, acetater, hexa-fluorfosfater, citrater, gluconater, benzoater, propionater, buty-rater, sulfosalicylater, maleater, laurater, malater, fumarater, succinater, ocalater, tartrater, amsonater (4,4'-diamino- stilben-2,2'-disulfonater), pamoater (1,1'methylen-bis-2-hydroxy-3-naphtho-ater), stearater, 3-hydroxy-2-naphthoater, p-toluen-sulfonater, methansulfonater, lactater og suraminsalte.

En foretrukken gruppe af forbindelserne, som fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, består af hydrochloridsaltene af baserne med formlen I.

En anden foretrukken gruppe af forbindelserne med formlen I består af de forbindelser, hvor R og R hver er normale alkyl-grupper med fra 14-18 carbonatomer.

En anden foretrukken gruppe af forbindelserne med formlen 1 2 I består af de forbindelser, hvor R og R hver er normale alkyl-grupper med fra 14-18 carbonatomer og indeholder samme antal carbonatomer .

Én anden foretrukken gruppe af forbindelser med formlen I

1 2 består af de forbindelser, hvor R og R hver er n-hexadecylgrup-per.

Særlig værdifulde er følgende forbindelser og deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte.

1-[2,3-di(n-octadecyloxy) propyl]-4-aminomethyl-4-phenyl-piperidin, 1—[2,3-di(n-hexadecyloxy)propyl]-4-aminomethyl-4-phenyl-piperidin og 1-[2,3-di(n-tetradecyloxy) propyl]-4-aminomethyl-4-phenyl-piperidin.

Syreadditionssalte af baserne med formlen I kan fremstilles 5 149331 ved konventionelle fremgangsmåder, såsom ved blanding af aminfor-bindelsen i et passende opløsningsmiddel med den ønskede syre og udvinding af saltet ved fordampning eller udfældning efter tilsætning af et opløsningsmiddel, hvori saltet er uopløseligt. Hydro-chloridsalte kan let fremstilles ved gennemledning af hydrogen-chlorid gennem en opløsning af aminforbindelsen i et organisk opløsningsmiddel. Som det kan ses af de følgende eksempler har mange af de isolerede hydrochlorid- eller dihydrochloridsalte af baserne med formlen I tendens til at indeholde en betydelig mængde vand.

Det vides ikke, hvorvidt dette observerede "fangne" vand er vilkårligt indesluttet under krystallisation eller svarer til dannelse af virkelige molekylære hydrater eller stammer fra tilstedeværelsen af et andet fænomen. I hvert tilfælde kan saltene, indeholdende "fanget" vand, let præpareres og administreres uden forudgående dehy-dratisering.

Udgangsmaterialerne 1,2-di-0-(n-højere alkyl)-glyceroler kan fremstilles ved den af Kates, M. et al., Biochemistry, 2, 394 (1963) angivne metode. Udgangsmaterialerne 1,2- di-0-(n- højere alkenyl)-glyceroler kan fremstilles ved den af Bauman, W.J. og Mangold, Η. K., J. Org. Chem., 31, 498 (1966) angivne metode.

Den anti-virale virkning af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen blev bestemt ved anvendelse af to uafhængige fremgangsmåder. Ved den første blev prøveforbindelsen administreret til mus ad intraperitoneal vej 18 til 24 timer før indgift af en letal dosis af encephalomyocarditis (EMC) virus. Overlevelsesdata er opført 10 dage efter indgift af virus og sammenlignet med data fra ubeskyttede dyr. Fremgangsmåden, ved hvilken medikamentet indgives 18 til 24 timer før og på et væsentligt adskilt sted fra virusinjektionen, er beregnet på at eliminere lokale effekter mellem medikament og virus og identificere udelukkende de forbindelser, som giver et systemisk anti-viralt svar.

Ved den anden fremgangsmåde behandles monolag af humane nasale polypceller, dyrket på mikrotiterplader, med prøveforbindelsen ca. 18 timer før behandling med en letal dosis af vesikular stoma-titis-virus (VSV). Prøveforbindelsen vaskes bort fra monolaget før virusbehandling. Kulturvæske ekstraheres fra pladerne efter en inkubationsperiode og titreres for mængden af infektiøs virus tilstedeværende i mikrotiterplader af L-929 muse-fibroblaster. Sammenligning gøres med virusdata fra kulturvæske ekstraheret fra ubeskytte- 6 149331 de polyceller.

Yderligere blev mange af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen afprøvet med hensyn til deres evne til at forøge den kendte antivirale virkning af polyinosin:polycytidylinsyre. Endelig blev visse af forbindelserne afprøvet med hensyn til deres evne til _at inducere cirkulerende interferon i mus efter parenteral ad-.. ministrering ved anvendelse af den af Hoffman, W.W., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 3, 498-501 (1973) beskrevne fremgangsmåde.

Parenteral, topisk eller intranasal administrering af de omhandlede aminer til pattedyr før udsættelse af pattedyret for en infektiøs virus giver hurtig modstand mod viruset. Fortrinsvis bør administreringen finde sted fra ca. 2 til ca. 1 dag før udsættelse for virus, men dette vil variere noget med den specielle dyreart og med den specielle infektiøse virus.

Ved indgift af de omhandlede’ forbindelser anvendes de lettest og mest økonomisk i dispergeret form i en acceptabel bærer.

Når det siges, at dette materiale er dispergeret, betyder det, at partiklerne kan være af molekular størrelse og holdes i sand opløsning i et passende opløsningsmiddel, eller at partiklerne kan være af colloidal størrelse og dispergeret i en væskefase i form af en suspension eller en emulsion. Betegnelsen "dispergeret" betyder også, at partiklerne kan være blandet med og spredt i en fast bærer, således at blandingen er i form af et pulver eller støv. Denne betegnelse omfatter også blandinger, der egner sig til anvendelse som sprøjtemidler, omfattende opløsninger, suspensioner eller emulsioner af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen.

Administreret parenteralt (subcutant, intramuskulært, intra-peritonealt) anvendes de omhandlede forbindelser i en mængde på fra ca. 1 mg/kg legemsvægt til ca. 200 mg/kg legemsvægt. Det foretrukne område er fra ca. 5 mg/kg til ca. 100 mg/kg legemsvægt, og det mest foretrukne område fra ca. 5 mg til ca. 50 mg/kg legemsvægt.

Dosis afhænger naturligvis af det pattedyr, som skal behandles, og den specielle aminforbindelse, som er anvendt, og bestemmes af den person, som er ansvarlig for administreringen. Sædvanligvis administreres små doser i begyndelsen med gradvis forøgelse af dosis, indtil det optimale dosisniveau er bestemt for det specielle subjekt, som er under behandling.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af følgende eksempler.

7 149331

Eksempel 1 1-[2,3-Di (n-hexadecyloxy)propyl]-4-aminomethyl-4-phenylpiperidin-dihydrochlorid.

A. 1-[2,3-Di(n-hexadecyloxy) propyl]-4-cyano-4-phenylpiperidin.

En blanding af 1,2-di-O-(n-hexadecyl)-3-0-(p-tosyl)-glycerol (6,96 g, 10 mmol), 4-cyano-4-phenylpiperidin-hydrochlorid (2,23 g, 10 mmol), triethylamin (2 ml) og Ν,Ν-dimethylformamid (40 ml) blev omrørt i 16 timer til 95-100°C. Reaktionsblandingen blev så afkølet, fortyndet med vand (200 ml) og ekstraheret med ethylacetat (3 x 150 ml). Den samlede ethylacetatekstrakt blev tørret over MgSO^, filtreret og inddampet i vakuum til en olie (6 g), som blev . renset ved søjlekromatografi (eluering med benzen:ethylacetat) (olie, ir (CHClg) 2220 cm 1).

B. Titelforbindelsen.

En opløsning af 1-[2,3-di-(n-hexadecyloxy)propyl]-4-cyano- 4-phenylpiperidin (2,5 g, 3,6 mmol) i ether (100 ml) blev behandlet med lithiumaluminiumhydrid (0,4 g, 10,5 mmol), og den resulterende blanding blev omrørt i 4 timer ved -stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev behqndlet forsigtigt med vand (100 ml) og ekstraheret med ether (3 x 100 ml). Den samlede etherekstrakt blev tørret over MgSO^, filtreret og inddampet i vakuum til en olie, som blev renset ved kromatografi på silicagel (eluering med benzen:ethanol) og derpå opløst. Opløsningen blev behandlet med hydrogenchloridgas og derpå inddampet i vakuum til dannelse af et fast stof, som blev omkrystalliseret med ethylacetat (1,1 g fast stof indeholdende ca.

3/4 mol H2O pr. mol produkt, 40%'s udbytte, smp. 132-134°C, elementæranalyse beregnet: 70,60% C, 11,53% H, 3,50% N, fundet: 70,74% C, 11,34% H, 3,40% N) .

Eksempel 2-4 På lignende måde som beskrevet i eksempel 1 blev følgende forbindelser fremstillet fra passende 1,2-di-O-(n-alkyl eller alkenyl) -3-0-(p-tosyl)-glyceroler.

r-o-ch2 R72t^~\/cs^ 8 149331 ιΓ: cc σ\ η ο η η & ^ © σ\

C r-i CO

4J www

0 S3 (—i rH O Ό i-l r—I rH C

s fn m id

f ID O

Ul * - - D\ H ri VD i' h 0 m

rH

r-ι in en in (C ^ N N

c Zl - - * < ^ co to co

OP

in o m U N ID N ø s] - * - C I—I i—I i—I 0Ί rH rH rH 0 tø G) \D Ifl Γ*

® 5 C\ H

al - - -

Cn rH i—i id r- r-cn r~ o

N< rH CN

• ‘—' rH i—i I—i au I I I EO o in cd tn 'r' t-H i—i rH i—! i—i

i—i r—i rH

u u u s s s cn cn cn Ih · · ·

ftj CN CN CN

rH Z Z Z

>irH CN CN CN

x ø o o o

0 E O CO CN

rH S oo cn σι oos s s

S Ή CO rH rH

Η· in in u u u

rH

>1

C

0

rH I

>1 rH <T\ o >i i ø o o •C 0 0

•cd Ό Ό K Sh (0 cd -M +J -P

0 O O U O O

1 I I

c c c I Sh

E C

0 __ - _ CN CO τ .Λ '"l ic Z4 9 149331

Eksempel 5

In vivo aktivitet overfor EMC-virus.

Fremstilling af en emulsion skete ved smeltning .og blanding af lige dele af den angivne forbindelse, polysorbat 80 og glycerin og påfølgende dispergering af blandingen i varmt vand under voldsom omrøring. Præparatet blev så indstillet til.en endelig koncentration på 0,14M natriumchlorid og 0,01M natriumfosfat, pH 7.Yderligere fortyndinger blev gjort med 0,14M natriumchlorid, 0,01M natriumfosfat, pH 7, pufferopløsning.

3 Grupper af 10 hun-albinomus (20-25 g legemsvægt) blev givet 0,5 ml intraperitoneale injektioner indeholdende mængder på 1,5, 5, og 15 mg af den angivne forbindelse/kg legemsvægt. En fjerde kontrolgruppe på 10 mus fik ingen injektion. 18-24 Timer senere fik alle 4 grupper 0,2 ml subcutan injektion indeholdende 20 gange LD^g dosis, som forårsager 50% dødelighed i ubeskyttede mus i 10 dage, af encephalomyocarditis (EMC) virus. Overlevelsesdata blev opsamlet over de næste 10 dage, og den relative overlevelse (Sr) beregnet.

Antiviral virkning udtrykkes som den relative overlevelse (Sr) i eksperimentelle grupper sammenlignet med kontrollen 10 dage efter smitte. Sr defineres ved hjælp af formelen ζ" + > ----x-i - > e±

Sr = X i=l til 10 i=l. tili10 X 100 100 + .100 -5 ef - i=l til 10 hvor Sr = den relative overlevelse

Sx = procentisk overlevelse efter 10 dage i den eksperimentelle gruppe = antallet af overlevende pr dag i i den eksperimentelle gruppe e^ = antallet af overlevende pr dag i i kontrolgruppen.

149331 ro

Forbindelse fremstil- Sr ved dosis (mg/kg) let i eksempel nr. 15 5 1,5 1 77 58 26 2 76 85 42 3 52 42 32 4 79 72 28

Eksempel 6

Reduktion af virusudbytte på humane polypceller in vitro.

• Et dyrkningsmedium blev fremstillet ved til Eagle's minimale essentielle medium (100 ml) at sætte 100X koncentreret antibiotisk-antimycotisk opløsning (2 ml) 200 mM glutaminopløsning (1 ml) 100X koncentreret opløsning af ikke-essentielle aminosyrer (1 ml) 100 mM natriumpyruvat opløsning (1 ml) og varme-inaktiveret kalve-fosterserum (10%). Hver fordybning i mikrotiterplader med 96 fordybninger blev podet med ca. 50.000 menneskelige nasale polypceller suspenderet i 0,2 ml vækstmedium. Pladerne blev så inkuberet i 8-10 dage ved 37°C i en 5% C02- atmosfære til dannelse af monolag af cellerne.

Efter cellevækstoerioden på 8-10 dage blev sammenløbende monolag på pladerne vasket flere gange med fosfatforpufret saltvand og umiddelbart efter behandlet med 0,2 ml per fordybning af vedligeholdelsesmedium indeholdende 10, 5,0, 1,0, 0,5, 0,1 og 0 yg/ml af den angivne forbindelse. Vedligeholdelsesmediet var identisk med vækstmediet, som er beskrevet i det foregående^ med den undtagelse, at mængden af kalvefosterserum er 5%. Pladerne blev inkuberet i yderligere 18 timer ved 37°C, og monolagene blev derpå vasket flere gange med fosfatforpufret saltvand til fjernelse af den angivne forbindelse, smittet med et materiale indeholdende ca. 1000 gange TCID^g, d.v.s. den dosis, som forårsager 50%'s infektion 1 ubeskyttede kulturer, af vesikular stomatitis-virus (VSV) i en 2 timers adsorptionsperiode ved 37°C, vasket 4 gange med fosfatforpufret saltvand til fjernelse af ikke-adsorberede .viruspartikler og forsynet med 0,2 ml per fordybning af vedligeholdelsesmediet. Pladerne blev så inkuberet i 7 timer ved 37°C, og dyrkningsvæsken fra 5-8 reproducerede celler taget fra hver plade, oplagret frosne i prøverør og derpå filtreret for mængden af tilstedeværende infek- 11 149331 tiøs virus i mikrotiterplader af L-929 musefibroblaster. L-929 mu-sekulturerne blev talt mikroskopisk og analyseret ca. 3-4 dage senere med følgende fald i virusudbytte (med hensyn til kontrollen) bestemt for de 5 koncentrationer af de angivne prøveforbindelser:

Forbindelse fremstil- % Formindskelse af virusudbytte let i eksempel nr. _Koncentration μ?/ml_ 10 5,0 1,0 0,5 0,1

1 + ± - - ND

2 + + - - ND

3 + + - - ND

4 + - - - ND

(a) + a >68% Formindskelse, ±=^v68% formindskelse - =. <68% formindskelse, ND = ikke bestemt

Eksempel 7

Virkning af 1-[2,3-di(n-hexadecyloxy)propylJ-4-aminomethy1-4-phenyl-piperidin-dihydrochlorid til at inducere cirkulerende interferon.

En blanding af lige vægtmængder af den angivne forbindelse, polysorbat 80 og glycerol blev samlet og derpå homogeniseret i varm 0,14M natriumchlorid indeholdende Ο,ΌΙΜ natriumfosfat, pH 7, (PBS). Den resulterende olie-i-vand-emulsion blev let fortyndet med PBS til administrering.

Hunmus (med legemsvægt 20 til 25 g) blev injiceret intraperi-tonealt (0,5 ml) med en mængde af den i det foregående nævnte fortyndede emulsion indeholdende 25 mg af den angivne forbindelse per kg legemsvægt. 8, 12, 16 og 20 timer efter injektion blev prøver af plasma taget fra 4 mus og samlet. Seriefortyndinger i L-15 (Leibovitz) medium indeholdende 5% kalvefosterserum blev inkuberet i mikrotiterplader natten over ved 37°C på sammenløbne monolag af L-929 musefibroblaster. .Monolagene blev så vasket med proteinfrit medium, smittet med 10 gange TCID^q, dvs. den dosis, som forårsager 50%'s infektion i ubeskyttede kulturer, af vesikular stomatitis-virus (VSV) i en adsorptionsperiode på 1 time ved 37°C, vasket, igen behandlet med L-15 medium indeholdende 5% kalvefosterserum og derpå inkuberet igen i 48 timer ved 37°C. L-929 kulturerne blev så talt 143331 12 mikroskopisk for viral cytopatologi og analyseret, og med plasma interferonniveauet blev den reciprokke af plasmafortyndingen, som forårsagede 50%,s beskyttelse af L-929 monolagene, bestemt.

Endnu et forsøg efter den i det foregående nævnte fremgangsmåde med undtagelse af, at musene fik 10 mg af den angivne forbindelse pr. kr legemsvægt, og prøver af peritoneal vask blev taget fra 4 mus og samlet 6, 9, 12, 15 og 18 timer efter injektion. Prøverne blev taget ved at frilægge peritonealmembranen, injicere 1 ml Hank's afbalancerede saltopløsning indeholdende 100 penicillinenhe-der/ml og 100 μg streptomycin/ml i peritonealhulen, kort massering af abdomen og påfølgende opsugning af peritonealvasken.

De følgende data blev opnået fra disse to forsøgs

Interferon- Interferonmængder (enhed/ml) kilde Tid (timer) efter injektion_ 6 8 9 12 15 16 18

Plasma <20 70 70 100 120 - 100

Peritoneal vask <13 - 109 284 312 - 224

Eksempel 8

Forøgelse af den med polyinosin-polycytidylinsyre tpoly-(I:C)]-inducerede cellulære modstand mod virale infektioner.

Vækstmedium blev fremstillet ved til Eagle's minimum essentielle medium (100 ml) at sætte 100X koncentreret antibiotisk-anti-mycotisk opløsning (2 ml), 200 mM glutaminopløsning (1 ml) og varme- inaktiver et kalvefosterserum (5%). Muse-L-929 fibroblaster blev suspenderet i vækstmedium og hver fordybning i mikrotiterplader med 96 fordybninger blev podet med 0,2 ml af suspensionen indeholdende 20.000 til 30.000 celler. Pladerne blev inkuberet i 2-4 dage ved 37°C i en 5%'s C02 atmosfære til dannelse af monolag af cellerne. Pladerne blev vasket 4 gange med fosfatforpufret saltvand umiddelbart før behandling.

Poly-(I:C) blev fremstillet i koncentrationer på 5,0, 1,0, 0,2 og 0,04 μg/ml i det i det foregående beskrevne medium minus kalveserum. 0,1 ml af hver fortynding blev samlet i et dambrædt-arrangement på L-929 cellemonolagene med 0,1 ml fortyndinger inde- 13 14933 1 holdende 20,0, 4,0, 0,8, 0,16 og 0,032 ug af den angivne forbin delse pr. ml serumfrit medium. Kontrolfordybninger blev givet enten poly (I:C) eller forbindelsen alene. Pladerne blev inkuberet i 6 timer ved 37°C i en 5% C02 atmosfære, vasket 4 gange med fosfat-forpufret saltvand og forsynet med 0,1 ml pr. fordybning af vækstmedium indeholdende 2% kalvefosterserum. Efter yderligere 18 timers inkubering blev pladerne vurderet for toksicitet og derpå smittet med 0,1 ml pr. fordybning af vesikular stomatitisvirus (VSV) suspension indeholdende 10-30 g TCID^q (vævskultur inficeret med dosis, som forårsager 50%'s infektion). Pladerne blev inkuberet i yderligere 3-4 dage og derpå vurderet mikroskopisk for cytopatogen effekt (CPE). Celler beskyttet for virusinfektion var frie for CPE. Den minimale beskyttende dosis (MPD) af poly-(I:C) alene blev noteret, og mængden af forbedret eller forøget anti-viral virkning forårsaget ved kombination med den angivne forbindelse opført for hvert fortyndingsniveau af forbindelsen.

Forbindelse fremstil- Poly(I:C) Forøgelse3 let i eksempel nr. Koncentration (ug/ml) 20 4,0 0,8 1 + + + 2 + + 3 + + ± 4 + - - (a) += >5X forøgelse, 1 =^5X forøgelse -= <5X forøgelse, ND= ikke bestemt.