DK148354B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af aminderivater af di-o-(n-alkyl)-glyceroler eller syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

148354

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte aminderivater af di-O-(n-højere alkyl )-glyceroler eller deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte, hvilke forbindelser er nyttige til bekæmpelse af virale infektioner i pattedyr. Af særlig interesse er 1,3-di-0-(n-hexadecyl)-2-0-(3-aminopropyl)- glycerol og dens farmaceutisk acceptable syreadditionssalte.

Virusinfektioner, som angriber pattedyr, herunder mennesker, er normalt smitsomme sygdomme, som kan forårsage stor menneskelig lidelse og økonomisk tab. Uheldigvis er opdagelsen af antivirale forbindelser meget mere kompliceret og besværlig end opdagelsen af 148354 2 antibakterielle og antifungale midler. Dette skyldes delvis den tætte strukturelle lighed mellem vira og strukturen af visse essentielle cellulære forbindelser, såsom ribonucleinsyre og desoxyribo-nucleinsyre. Imidlertid er beskrevet adskillige ikke-virale "antivirale forbindelser", dvs.forbindelser "som kan danne enten en beskyttende eller terapeutisk virkning til en klar påviselig fordel for den virusangrebne vært, eller et materiale, som væsentligt kan forøge antistof dannel.sen, forbedre antistof aktiviteten, forbedre ikke-speci-fik modstand, bevirke hurtigere helbredelse eller hæmme symptomer"t [Herrman et.al., Proc. Soc. Exptl. Biol. Med., 103, 625, (I960)]. Listen af angivne antivirale midler omfatter for at nævnte et fåtal, interferon og syntetiske materialer, såsom amantadinhydrochlorid, pyrimidiner, biguanider, guanidin, pteridiner og methisazon. På grund af det temmelig snævre område af virale infektioner, der kan behandles med hver af de i handelen tilgængelige antivirale midler på nuværende tidspunkt, er nye syntetiske antivirale midler altid velkomne som potentiel værdifuld forøgelse af den medicinske teknologis hjælpemidler.

Pattedyrs celler producerer som svar på virale infektioner et stof, der muliggør, at cellerne kan modstå formering af et antal vira. De virushæmmende eller virusinterfererende stoffer kaldes "interferoner". Interferonerne er glycoproteiner, der kan adskille sig i deres fysisk-kemiske egenskaber, men som alle udøver samme biologiske egenskaber, nemlig hæmning af et stort antal ikke-beslægtede vira, ikke har toksisk eller anden skadelig effekt på cellerne og er artsspecifikke (Lockart, Frontiers of Biology, Vol. 2, "Interferons", udgivet af Finter, W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1966, side 19-20).

Ingen praktisk, økonomisk fremgangsmåde er endnu blevet udviklet til fremstilling af exogene interferoner til klinisk rutinebrug overfor virale infektioner. Et alternativ til fremstilling af interferoner har derfor været forsøgt, hvilket omfatter administrering tildet dyr, som skal beskyttes eller behandles, af et ikké-viralt stof, der stimulerer eller inducerer frembringelse af interferon i cellerne. Interferon fremstillet på denne måde betegnes "endogen" interferon.

U.S. patentskrift nr. 2.738.351 beskriver, at forbindelser med den almene formel 148354 3 R1-X-Ch2

CH-Z-ALK-B

2 I

R -Y-CH2 1 2 hvor R og R kan være alkyl, aralkyl, aryl, cycloalkyl, nitro- substitueret aryl, halogen-substitueret aryl, alkyl-substitueret aryl eller alkoxy-substitueret aryl, X, Y og Z kan være oxygen, svovl eller sulfonyl, ALK betyder en ligekædet eller forgrenet alkylengruppe med fra 1-6 carbonatomer, og B kan være di(lavere)- alkylamino, piperidino, morpholino, pyrrolidino, (lavere alkyl)- pyrrolidino, N'-alkylpiperazino eller pipecolino, er lokalt anæste- tiske midler. Yderligere beskrives ved diskussionen af alternative syntetiske veje (se spalte 1, 11. 57-70 i nævnte patentskrift) mellemprodukter med den i det foregående nævnte formel, hvor B er amino- og (lavere alkyl)-aminogrupper. Imidlertid indeholder ingen af de i det nævnte patentskrift specielt angivne forbindelser en 12 R eller R alkylgruppe, som er større end n-pentyl. Yderligere er 1 2 der ingen forbindelser, hvor både R og R er alkylgrupper, og både X og Y er oxygenatomer.

Insecticide og miticide forbindelser med formelen R1-CH0 I 2

CH-(CH2)q-A

R -ch2 1 2 hvor R og R hver bl.a. kan være lavere alkylthiogrupper, q betyder 0-5, og A bl.a. kan være en 1-piperidino eller di(lavere alkyl)aminogruppe er beskrevet i japansk patentskrift nr. J7-6042-177.

Det har nu vist sig, at visse hidtil ukendte amin-derivater af di-0-(n-C12_20 alkyl)-glyceroler kan bekæmpe virale infektioner i pattedyr. De hidtil ukendte forbindelser fremstillet ved fremgangsmåden ifølge denne opfindelse har formlen r1-o-ch2

CH-0-Y-NHR3 I

2 * R -0-CH2 eller CH^-O-Y-NHR 1 '

R -0-ρϊ II

r2-o-ch2 4 148354 1 2 hvor R og R hver er udvalgt fra gruppen bestående af normale alkylgrupper med fra 12-20 carbonatomer, Y er udvalgt fra gruppen bestående af alkylengrupper med fra 2-4 carbonatomer, idet de to valenser findes ved forskellige carbonato— mer 3 R er udvalgt fra gruppen bestående af et hydrogenatom eller en alkylgruppe med fra 2-4 carbonatomer, samt farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf.

Forbindelserne franstillet ifølge opfindelsen udviser anti-viral virkning overfor en stor mængde vira in vivo i pattedyr og in vitro i cellekulturer fra pattedyr. I det mindste en væsentlig mængde af denne virkning resulterer fra de nævnte forbindelsers evne til at inducere interferonproduktion i cellerne, d.v.s. endogen interferon.

Med "farmaceutisk acceptable" syreadditionssalte menes de salte, som er ikke-toksiske" ved de indgivne doser. De farmaceutisk acceptable syreadditionssalte, der kan anvendes, omfatter sådanne vandopløselige og vanduopløselige salte, såsom hydrochlorider, hydrobromider, fosfater, nitrater, sulfater, acetater, hexafluor-fosfater, citrater, gluconater, benzoater, propionater, butyrater, sulfosalicylater, maleater, laurater, malater, fumarater, succina-ter, oxalater, tartrater, amsonater (4,4'-diamino- stilben-2,2'-di-sulfonater), pamoater (1,1'-methylen-bis-2-hydroxy-3-naphthoater), stearater, 3-hydroxy-2-naphthoater, p-toluen-sulfonater, methansul-fonater, lactater og suraminsalte.

En foretrukket gruppe af forbindelserne med formlerne I eller II består af hydrochloridsaltene af baserne med formlerne I eller II

En anden foretrukken gruppe af forbindelserne med formlerne I

1 2 eller II af de forbindelser, hvor R og R hver er normale alkylgrupper med fra 14-18 carbonatomer.

En anden foretrukken gruppe af forbindelserne med formlerne i eller II består af de forbindelser, hvor. R og R hver er normale alkylgrupper med fra 14-18 carbonatomer og indeholder samme antal carbonatomer.

En anden foretrukken gruppe af forbindelser med formlerne I

1 2 eller Π består af de forbindelser, hvor R og R hver er n-hexadecyl-grupper.

En anden foretrukken gruppe af forbindelserne med formlerne 3 I eller II består af forbindelser, hvor R er et hydrogenatom.

148354 5

En anden foretrukken gruppe af forbindelser med formlerne I

3 eller II består af de forbindelser, hvor R er et hydrogenatom, og Y er ligekædet.

Særlig værdifulde er følgende forbindelser og deres farmaceutisk acceptable syreadditionssalte.

l,3-di-0-(n-hexadecyl)-2-0-(3-aminopropyl)-glycerol, smp. for hydrochlorid 69-70°C, l,2-di-0-(n-hexadecyl)-3-0-(3-aminopropyl)-glycerol, smp. for hydrochlorid med 3/4 H20 76-78°C.

Forbindelserne med formlen I eller II i det foregående fremstilles ifølge opfindelsen ved,.at en forbindelse med formlen R1-0-CH2

CH-O-Y'-CHO XV

2 1 r^-o-ch2 eller ch2-o-y*-cho

XVI

R -0-CH

hvor Y' er udvalgt fra gruppen bestående af alkylengrup-per med fra 1-3 carbonatomer, 1 o og hvor R og R har de ovenfor angivne betydninger, omsættes 3 3 med en forbindelse med formlen NH2R , hvor R har den ovenfor anførte betydning, under reducerende betingelser, hvorefter manf om ønsket,omdanner en dannet forbindelse med formlen I eller il til et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf

Syreadditions salte af baserne med formlerne I eller II kan fremstilles ved konventionelle fremgangsmåder, såsom ved blanding af aminforbindelsen i et passende opløsningsmiddel med den ønskede syre og udvinding af saltet ved fordampning eller udfældning efter tilsætning af et opløsningsmiddel, hvori saltet er uopløseligt. Hydrochloridsalte kan let fremstilles ved genindvinding af hydrogenchlorid gennem en opløsning af aminforbin-delsen i et organisk opløsningsmiddel. Som det kan ses af de følgende eksempler har mange af de isolerede hydrochlorid- eller di-hydrochloridsalte af baserne med formlerne I eller II tendens til at indeholde en betydelig mængde vand. Det vides ikke, hvorvidt dette observerede "fangne" vand er vilkårligt indesluttet under krystallisationen eller svarer til dannelse af virkelige molekylære hydra- 6 148354 ter eller stammer fra tilstedeværelsen af et andet fænomen. I hvert tilfælde kan saltene indeholdende "fanget" vand let præpareres og administreres uden forudgående dehydratisering.

Udgangsmaterialerne l,2-di-0-(n-højere alkyl)-glyceroler kan fremstilles ved den af Kates, M. et al., Biochemistry, 2, 394 (1963) angivne metode. Udgangsmaterialerne l,3-di-0-(n-højere alkyl)-glyceroler kan fremstilles ved den af Damico, R., et al. J. Lipid Res., 63 (1967) angivne metode.

Den anti-virale virkning af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen blev bestemt ved anvendelse af to uafhængige fremgangsmåder. Ved den første blev prøveforbindelsen administreret til mus ad intra-peritoneal vej 18 til 24 timer før indgift af en letal dosis af encephalomyocarditis (EMC) virus. Overlevelsesdata er opført lo dage efter indgift af virus og sammenlignet med data fra ubeskyttede dyr. Fremgangsmåden, ved hvilken medikamentet indgives 18 til 24 timer før og på et væsentligt adskilt sted fra virusinjektionen, er beregnet på at eliminere lokale effekter mellem medikament og virus og identificere udelukkende de forbindelser, som giver et systemisk anti-viralt svar.

Ved den anden fremgangsmåde behandles monolag af humane nasale polypceller, dyrket på mikrotiterplader med prøveforbindelsen ca.

18 timer før behandling med en letal dosis af vesikular stomatitis-virus (VSV). Prøveforbindelsen vaskes bort fra monolaget før virusbehandling. Kulturvæske ekstraheres fra pladerne efter en inkubationsperiode, titreres for mængden af infectiøs virus tilstedeværende i mikrotiterplader af L-929 muse-fibroblaster. Sammenligning gøres med virusdata fra kulturvæske ekstraheret fra ubeskyttede polypceller.

Yderligere blev mange af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen afprøvet med hensyn til deres evne til at forøge den kendte anti-virale virkning af polyinosin:polycytidylinsyre. Endelig blev visse af forbindelserne afprøvet med hensyn til deres evne til at inducere cirkulerende interferon i mus efter parenteral administrering ved anvendelse af den af Hoffman, W.W., et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 3, 498-501 (1973),beskrevne fremgangsmåde.

148354 7

Parenteral, topisk eller intranasal administrering af de i det foregående nævnte beskrevne aminer til pattedyr før udsættelse af pattedyret for en infectiøs virus giver hurtig modstand mod virusen. Fortrinsvis bør administreringen finde sted fra.ca. 2 til ca. 1 dag før udsættelse for virus, men dette vil variere noget med den specielle dyreart og med den specielle infec-tiøse virus.

Ved indgift af de pågældende forbindelser anvendes de lettest og mest økonomisk i dispergeret form i en acceptabel bærer. Når det siges, at forbindelserne er dispergeret, betyder det, at partiklerne kan være af molekulær størrelse og holdes i sand opløsning i et passende opløsningsmiddel, eller at partiklerne kan være af colloidal størrelse og dispergeret i en væskefase i form af en suspension eller en emulsion. Betegnelsen "dispergeret" betyder også, at partiklerne kan være blandet med og spredt i en fast bærer, således at. blandingen er i form af et pulver eller støv.

Denne betegnelse omfatter også blandinger, der egner sig til anvendelse som sprøjtemidler, omfattende opløsninger, suspensioner eller emulsioner af forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen.

Administreret parenteralt (subcutant, intramuskulært, intra-peritonealt) anvendes de pågældende forbindelser i en mængde på fra ca. 1 mg/kg legemsævgt til ca. 200 mg/kg legemsvægt. Det foretrukne område er fra ca. 5 mg/kg til ca. 100 mg/kg legemsvægt, og det mest foretrukne område fra ca. 5 mg til ca. 50 mg/kg legemsvægt. Dosis afhænger naturligvis af det pattedyr, som skal behandles, og den specielle aminforbindelse, som er anvendt, og bestemmes af den person, som er ansvarlig for administreringen. Sædvanligvis administreres små doser i begyndelsen med gradvis forøgelse af dosis, indtil det optimale dosisniveau er bestemt for det specielle subjekt, som er under behandling.

Ved anvendelse af den intranasale administrationsvej kan anvendes en hvilken som helst praktisk fremgangsmåde til kontakt mellem det anti-virale middel og dyrets åndedrætsve, je. Effektive fremgangsmåder omfatter administrering af midlet ved hjælp af intranasale eller nasapharyngeale dråber og ved inhalation ved hjælp af en nebulizer eller en aerosol. Sådanne administreringsfremgangsmåder er af praktisk betydning, fordi de tilvejebringer en let, sikker og effektiv indgivningsmåde, Til 8 148354 intranasal administrering, sædvanligvis i en acceptabel bærer, er en koncentration mellem 0,1 mg/ml og 100 mg/ml tilfredsstillende. Koncentrationer i området på fra ca.

30 til 50 mg/ml muliggør administrering af et passende volumen*

Til topisk anvendelse benyttes de anti-virale midler hensigtsmæssigt i en passende bærer for at muliggøre let og sikker anvendelse og bedre adsorption. Også her er koncentrationer i området fra ca. 1,0 mg/ml til ca. 250 mg/ml tilfredsstillende. Generelt vil man ved de to foregående metoder anvende en dosis i området fra ca. 1,0 mg/kg til ca. 250 mg/kg legemsvægt og fortrinsvis fra ca.

5,0 mg /kg til ca. 50 mg/kg.

Opfindelsen forklares nærmere ved hjælp af følgende eksempel.

Eksempel i,2-Di-0-(n-hexadecyl)-3-0-(2-isopropylaminoethvl)-glycerol— hydrochlo-rid.

A. l,2-Di-0-(n-hexadecyl)-3-0-allyl-glycerol.

Natriumhydrid (1,78 g 50%'s dispersion i mineralolie, 37 mmol) blev ved 60°C sat til en opløsning af l,2-di-0-(n-hexadecvl-glyce-rol (10 g, 18,5 mmol) i Ν,Ν-dimethylformamid (100 ml), og den resulterende opløsning omrørt i 20 min. ved 60°C. Allylbromid (4,47 g, 37 mmol) blev så dråbevis tilsat, og den resulterende blanding omrørt i 3 timer ved 90°C, afkølet, forsigtigt fortyndet med vand (200 ml) til afslutning af reaktionen og ekstraheret med ether (3 x 150 ml). Den samlede etherekstrakt blev vasket med mættet vandig natriumchloridopløsning, tørret over MgS04, filtreret og inddampet i vakuum til en olie, som blev renset med silicagel chro-matografi (eluering med benzen) [10 g, 93%'s udbytte, olie, nmr. (CDC13) δ 5,66-6,16 (m, 1, -0CH2CH=CH2), 5,25 (d for dubletter, 2, -OCH2CH=CH2) og 4,03 (d, 2, -OCH2CH=CH2)].

B. 1,2-Di-O-(n-hexadecyl)-3-0-formylmethyl-glycerol.

Osmiumtetroxid (90 mg, 0,354 mmol) blev sat til en opløsning af l,2-di-0-(n-hexadecyl)-3-0-allyl-glycerol (4,5 g, 7,75 mmol) i tetrahydrofuran:vand (3:1, 120 ml), og den resulterende opløsning omrørt i 5 min. ved stuetemperatur. Natriumperiodat (9 g, 42 mmol) blev så tilsat, og reaktionsblandingen omrørt i 16 timer ved stuetemperatur under nitrogen. Reaktionsopløsningen blev så fortyndet 148354 9 med vand (150 ml) og ekstraheret med ether (2 x 150 ml). Den samlede etherekstrakt blev vasket med vand (150 ml) , tørret over MgS04 og inddampet i vakuum til en olie, som blev renset ved silicagel chro-matografi (eluering med benzen:ethylacetat [2,6 g, 57%'s udbytte, voksagtigt fast stof , ir (CHC13) 1735 cm-1, nmr (CDClj) 6 9,38 (t, J = 1 Hz, 1, -OCH2CHO) og 4,07 (d, J = 1 Hz, 2, -OCg2CHO)1.

C..Titelforbindelsen

Natriumcyanoborhydrid (0,1 g, 1,6 mmol) blev sat til en opløsning af l,2-di-0-(n-hexadecyl)-3-0-formylmethyl-glycerol (1,5 g, 2,6 mmol) og isopropylamin (0,89 g, 15 mmol) i methanolrtetrahydro-furan (1:1, 50 ml), og blandingen omrørt i 2 timer ved stuetemperatur. pH blev så indstillet på 6 med 5N methanolisk saltsyre, yderligere natriumcyanoborhydrid (0,1 g, 1,6 mmol) blev tilsat, og reaktionsblandingen omrørt yderligere 60 timer ved stuetemperatur, filtreret, behandlet med vandig 3N natriumhydroxid (10 ml) og derpå vandig natriumchloridopløsning (200 ml) og ekstraheret med ether (2 x 150 ml), Det samlede etherekstrakt blev tørret (MgSO^), fil-, treret og inddampet i vakuum til et olieagtigt fast stof, som blev renset ved silicagel chromatografi (eluering med benzen:ethanol) og opløst i methanol. Blandingen blev behandlet med hydrogenchlorid-gas og inddampet i vakuum til dannelse af et fast stof, som blev omkrystalliseret med ethylacetat (400 mg, fast stof indeholdende ca. 1/4 mol H20 per mol produkt, 23%'s udbytte, smp. 71-72°C, nmr.

(CDCl^) δ 1,42 (d, J = 6 Hz, 6, -NHCH[CHj]^), elementær analyse beregnet: 72,02% C, 12,76% H, 2,10% N, fundet: 71,89% C, 12,34% H, 2,09% N].

In vivo aktivitet af 1,3-di-O- (n-hexadecyl)^ 2-0- (3-aminopropyl) -glycerol-hydrochlorid overfor EMC-virus.

Fremstilling af en emulsion skete ved smeltning og blanding af lige dele af den angivne forbindelse, polysorbat 80 og glycerin og påfølgende dispergering af blandingen i varmt vand under voldsom omrøring. Præparatet blev så indstillet til en endelig koncentration på 0,14M natriumchlorid og 0,01M natriumfosfat, pH 7.Yderligere fortyndinger blev gjort med 0,14M natriumchlorid, 0,01M natrium-fosfat, pH 7, pufferopløsning.

3 Grupper af 10 hun-albinomus (20-25 g legemsvægt) blev givet 0,5 ml intraperitoneale injektioner indeholdende mængder på 1,5, 10 148354 5, og 15 mg af den angivne forbindelse/kg legemsvagt. En fjerde kontrolgruppe på 10 mus fik ingen injektion. 18-24 Timer senere fik alle 4 grupper 0,2 ml subcutan injektion indeholdende 20 gange LD5q dosis, som forårsager 50% dødelighed i ubeskyttede mus i 10 dage, af encephalomyocarditis (EMC) virus. Overlevelsesdata blev opsamlet over de næste 10 dage, og den relative overlevelse (Sr) beregnet:

Dosis af forbindelsen Sy (gennemsnit af syv forsøg) .15 mg/kg 61 5 45 3.,5 24

Antiviral virkning udtrykkes som den relative overlevelse (Sr) i eksperimentelle grupper sammenlignet med kontrollen 10 dage efter smitte. Sr defineres ved hjælp af formelen ζ" + ^ xi - EZei

Sr = A i=l til 10 i=l. til 10 X 100 100 + 100 -5 e± - i=l til 10 hvor Sr = den relative overlevelse δχ = procentisk overlevelse efter 10 dage i den eksperimentelle gruppé

Xj_ e antallet af overlevende på dag i i den eksperimentelle gruppe e^ = antallet af overlevende på dag i i kontrolgruppen.

Reduktion af virusudbytte på humane polypceller in vitro med 1,3-di-O- (n-hexadecyl) -2-0- (3-aminopropyl) -glycerol-hydrochlorid.

Et dyrkningsmedium blev fremstillet ved til Eagle' s minimale essentielle medium (100 ml) at sætte 100X koncentreret antibiotisk-antimycotisk opløsning (2 ml) 200 mM glutaminopløsning (1 ml) 100X koncentreret opløsning af ikke-essentielle aminosyrer (1 ml) 100 mM natriumpyruvat opløsning (1 ml) og varme-inaktiveret kalvefos terserum (10%). Hver fordybning i mikrotiterplader med 96 fordyb-r ninger blev podet med ca. 50.000 menneskelige nasale polypceller suspenderet i 0,2 ml vækstmedium. Pladerne blev så inkuberet i 8-10 dage ved 37°C i en 5% CO2 atmosfære til dannelse af monolag af cellerne.

11 1A 8 3 5 Λ

Efter cellevækstDerioden på 8-10 dage blev sammenløbende monolag på pladerne vasket flere gange med fosfatforpufret saltvand og umiddelbart efter behandlet med 0,2 ml per fordybning af vedligeholdelsesmedium indeholdende 10, 5,0, 1,0, 0,5, 0,1 og 0 ug/ml af den angivne forbindelse. Vedligeholdelsesmediet var identisk med vækstmediet, som er beskrevet i det foregående, med den undtagelse, at mængden af kalve fosterserum er 5%. Pladerne blev inkuberet i yderligere 18 timer ved 37°C, og mono lagene blev derpå vasket flere gange med fosfatforpufret saltvand til fjernelse af den angivne forbindelse, smittet med et materiale indeholdende ca. 1000 gange TCID5Q, d.v.s. den dosis, som forårsager 50%'s infektion 1 ubeskyttede kulturer, af vesikular stomatitis-virus (VSV) i en 2 timers adsorptionsperiode ved 37°C, vasket 4 gange med fosfatfor-pufret saltvand til fjernelse af ikke-adsorberede viruspartikler og. forsynet med 0,2 ml per fordybning af vedligeholdelsesmediet. Pladerne blev så inkuberet i 7 timer ved 37°C, og dyrkningsvæsken fra 5-8 reproducerede celler taget fra hver plade, oplagret frosne i prøverør og derpå filtreret for mængden af tilstedeværende infek-tiøs virus i mikrotiterplader af L-929 musefibroblaster. L-929 muse-kulturerne blev talt mikroskopisk og analyseret ca. 3-4 dage senere med følgende fald i virusudbytte (med hensyn til kontrollen) bestemt for de 5 koncentrationer af den angivne prøveforbindelse:

Procentreduktion af virusudbytte

Koncentration (ug/ml) af den angivne forbindelse.

10 5_j_0 1^) 0^5 0^1 94% 90% 84% 75% <68% På lignende måde som beskrevet ovenfor blev formindskelsen af virusudbytte i humane polypceller in vitro bestemt for de i det følgende angivne forbindelser.

12 148354

i—I

u «

iH

ω u » æ h 4J o >i -5-1

A Η Η O H

•O— _ _ „ U 0 0 HO

ØHHDQQQDQ K 3 >ι H U ffi g*!SS!33 33 ΦΗΟΚ m \ o ·» o O' 33 «

3 O’ H >1 I * H

»3. Ο H » H 0

H^ U Η Η 0 H

> tn Λ „ Ο I >ι Ο Μ O

C' llQQQQ O ~ ,3 Μ Ο O

«Η Ool 3 3 3 3 >i H +) Ο O >i (OH i—I t>i GJ ϋ i—l +> O' & O >1 H O'

O (0 , I O 3 H O' I

III MO O ^ h H O' I ^

H +1 -41111 II tfl H ft g I — H

0) 3 H| Η >i O (0 *-* H >i M(U 0) ft 3 Η H >i ft mo oh >1 >1 a o

Ό 3 m £ MEOi-POM

30 0 Ά E ft (0 O 3 3 ft

H«*+-H + +l + + 3 ® Ο H 3 Λ ft O

gin H A 3 >i ft 0 O 3

H g Μ η Λ O G 3 H

0 H® g +> m h h g ft Ο Λ (0 0) H g g (0 OI+Q + ++ Q *H 111(0(01 dP H| 2 3 <0 ro ro (N i I cm <X> J4 v^ww^lCM*--

oo X I I I 1 w I

io H O O O I I O

£ III tn Λ m ? ? ή

mg JL JL JL 2 x JL

4-1 Η Η Η Η Η H

““

O Q) UOOOOO

ID in 0)0)00)00) i—1 η Ό Ό Ό Ό Ό Ό mm (0(0(0(0(0(0

S S X K X X! X -P

mm oooooo

Id Ό .3 ,3 ,3 ϋ ,3 O

3 3 I I I I I I

o .¾ -H 333333

Η I μ I I I I I I

® Π5ΛΟΌΟΗ O O OOHOOO

ci w Η Η Η Η Η H

H dPdP Ό Ό Φ Ό Ό Ό A æra ......

3 NriiNnPiN

ft ^ ^ Η Η Η Η Η H

ni Ilf + * ίο a ο ·α ο «η 148364 13

Virkning af 1,3-Di-O-(n-hexadecyl)-2-0-(3-aminopropyl)-glycerol-hydroch'lorid til at inducere cirkulerende interferon.

En blanding af lige vægtmængder af den angivne forbindelse, polysorbat 80 og glycerol blev samlet og derpå homogeniseret i varm 0,14M natriumchlorid indeholdende 0,01M natriumfosfat, pH 7, (PBS).

Den resulterende olie-i-vand-emulsion blev let fortyndet med PBS til administrering.

Hunmus (med legemsvægt 20 til 25 g) blev injiceret intraperi-tonealt (0,5 ml) med en mængde af den i det foregående nævnte fortyndede emulsion indeholdende 25 mg af den angivne forbindelse per kg legemsvægt. 8, 12, 16 og 20 timer efter injektion blev prøver af plasma taget fra 4 mus og samlet. Seriefortyndinger i L-15 (Leibovitz) medium indeholdende 5% kalvefosterserum blev inkuberet i mikrotiterplader natten over ved 37°C på sammenløbne monolag af L-929 musefibroblaster. Monolagene blev så vasket med proteinfrit medium, smittet med 10 gange TCID^q, d.v.s. den dosis, som forårsager 50%'s infektion i ubeskyttede kulturer, af vesikular stomatitis-virus (VSV) i en adsorptionsperiode på 1 time ved 37°C, vasket, igen behandlet med L-15 medium indeholdende 5% kalvefosterserum og derpå inkuberet igen i 48 timer ved 37°C. L-929 kulturerne blev så talt mikroskopisk for viral cytopatologi og analyseret, og med plasma interferonniveauet blev den reciprokke af plasmafortyndingen, som forårsagede 50%'s beskyttelse af L-929 monolagene, bestemt.

Endnu et forsøg efter den i det foregående nævnte fremgangsmåde med undtagelse af, at musene fik 10 mg af den angivne forbindelse per kg legemsvægt, og prøver af peritoneal vask blev taget fra 4 mus og samlet 6, 9, 12, 15 og 18 timer efter injektion. Prøverne blev taget ved at frilægge peritonealmembranen, injicere 1 ml Hank's afbalancerede saltopløsning indeholdende 100 penicillinenheder/ml og 100 yg streptomycin/ml i peritonealhulen, kort massering af abdomen og påfølgende qpsugrång af peritonealvasken.

De følgende data blev opnået fra disse to forsøg

Interferonmængder (enhed/ml)

Interferon- Tid (timer) efter injektion kilde_ 6891215161820

Plasma - 34 - 67 - 52 - 40

Peritoneal vask <16 - 768 320 448 - 448 14 148354

Forøgelse af den med polyinosin-polycytidylinsyre fpoly-(I:CJ]-inducerede cellulære modstand mod virale infektioner af 1/3-di-O-(n-hexadecyl)-2-0- (3-aminopropyl) -glycerol—hydrochlorid.

Vasks tmedium blev fremstillet ved til Eagle’s minimum essentielle medium (100 ml) at sætte 100X koncentreret antibiotisk-antimycotisk opløsning (2 ml), 200 mM glutaminopløsning (1 ml) og varme-inaktiveret kalvefosterserum (5%) . Muse-L-929 fibroblaster blev suspenderet i vækstmedium og hver fordybning i mikrotiterplader med 96 fordybninger blev podet med 0,2 ml af suspensionen indeholdende 20.000 til 30.000 celler. Pladerne blev inkuberet i 2-4 dage ved 37°C i en 5%'s C02 atmosfære til dannelse af monolag af cellerne. Pladerne blev vasket 4 gange med fosfatforpufret saltvand umiddelbart før behandling.

Poly-(I:C) blev fremstillet i koncentrationer på 5,0, 1,0, 0,2 og 0,04 ug/ml i det i det foregående beskrevne medium minus kalveserum. 0,1 ml af hver fortynding blev samlet i et dambrædt-arrangement på L-929 cellemonolagene med 0,1 ml fortyndinger indeholdende 20,0, 4,0, 0,8, 0,16 og 0,032 yg af den angivne forbindelse per ml serumfrit medium. Kontrolfordybninger blev givet enten poly (I;C) eller forbindelsen alene. Pladerne blev inkuberet i 6 timer ved 37°C i en 5% C02 atmosfære, vasket 4 gange med fosfatforpufret saltvand og forsynet med 0,1 ml per fordybning af vækstmedium indeholdende 2% kalvefosterserum. Efter yderligere 18 timers inkubering blev pladerne vurderet for toksicitet og derpå smittet med 0,1 ml per fordybning af vesikular stomatitisvirus (VSV) suspension indeholdende 10-30 g TCIDj-q (vævskultur inficeret med dosis, som forårsager 50%'s infektion). Pladerne blev inkuberet i yderligere 3-4 dage og derpå vurderet mikroskopisk for cytopatogen effekt (CPE). Celler beskyttet for virusinfektion var frie for CPE. Den minimale beskyttende dosis (MPD) af poly—(I:C) alene blev noteret, og mængden af .forbedret eller forøget anti-viral virkning forårsaget ved kombination med den angivne forbindelse opført for hvert fortyndingsniveau og forbindelsen.

Forøgelse af poly—(I:C)-induceret cellulær modstand mod virale infektioner.

Koncentration (yg/ml) af forbindelsen_ 20,0 4,0 0,8 0,16 0,032

125X 125X 125X 5X <5X

Claims (2)

14835-4 Bemærk: kombination af poly—(I:C) med forbindelsen giver samme anti-virale virkning som forøget poly—(I:C) koncentration med det angivne antal gange. På lignende måde som beskrevet ovenfor blev forøgelsen af den cellulære modstand induceret med poly-(I:C) overfor virale infektioner bestemt med de i det følgende angivne forbindelser. Poly(I:C) Forøgelse Koncentration (yq/ml) Forbindelse_ |0 |7θ (TjT" a + + - b + + c + + + d + + - + Ξ >5X forsøgelse, += forøgelse -= <5X forsøgelse, a: 1,2-di-O-(n-hexadecyl)-3-0-(3-aminopropyl)-glycerol, HCl b: 1,2-di-O-(n-octadecyl)-3-0-(3-aminopropyl)-glycerol, HCl c: 1,2-di-O-(n-hexadecyl)-3-0-(2-aminopropyl)-glycerol, HCl d: 1,2-di-O-(n-octadecyl)-3-0-(2-aminopropyl)-glycerol, HCl

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af aminderivater af di-0-(n-alkyl)-glyceroler med formlen I R1-0-CH_ * 2 3 CH-O-Y-NHR I 2 1 R -0-CH2 eller II CH--0-Y-NHR3 1

* 2 R -O-CH II 2 * R -0-CH2 hvor R og R hver er udvalgt fra gruppen bestående af normale alkyl-grupper med fra 12-20 carbonatomer, Y er udvalgt fra gruppen bestående af alkylengrupper med fra 2-4