DK149285B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af gamma-endorfin-analoge un-, do- eller tridecapeptider eller funktionelle derivater deraf - Google Patents

Description

149285

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte psyko-farmakologisk aktive un-, do- eller tridecapeptider eller funktionelle derivater deraf afledt af et bestemt fragment af hormonet Ø-lipotropin (Ø-LPH).

5 ø-lipotropin er et polypeptid bestående af 91 aminosyrer. Det dannes i hypofysens baglap og viser fedtmobiliserende virkning.

Der kendes allerede og er i litteraturen beskrevet nogle få β-LPH-fragmenter. Det er f.eks. kendt, at fragmentet γ-ϋρο-10 tropin (β-LPH(1-58)) ligesom β-LPH selv har fedtmobiliserende egenskaber. Fragmentet β-LPH-(41-58), benævnt β-melanotropin, er i stand til at indvirke på hudens pigmentering ved at stimulere melanocytterne. Det er yderligere kendt, at sekvensen af β-LPH-(61-91)(β-endorfin) har en analgetisk virkning, der kan 15 antagoniseres ved hjælp af naloxon ligesom i tilfældet med morfin, således at undertrykkelsen af både morfin og β-endorfin, der påvirker den samme receptor, er indlysende.

Imellemtiden er det også kendt,at små peptidfragmenter af 20 β-endorfin har en affinitet til den opiate receptor, f.eks. β-LPH-(61-76)(benævnt α-endorfin), fragmentet β-LPH-(61-69) og fragmentet β-LPH-(61-65))(benævnt Met-enkephalin). Se Nature 258, 577 (1975).

25 En affinitet til den opiate receptor er også blevet beskrevet

C C

for det endogene peptid Leu-enkephalin, [Leu]β-LPH-(61-65), 2 62 og for det syntetiske D-Ala -Met-enkephalin, [D-Ala ]β-LPH-(61-65). Se f.eks. Science 194, 330 (1976). 1 2 3 4 5 6

Det er desuden allerede blevet konstateret, at β-endorfin 2 (β-LPH-(61-91)) har visse psyko-farmakologiske egenskaber.

3

Dette peptid hæmmer f.eks. ekstinktionen af rotters (aktive) 4 flugtadfærd i den velkendte stangspringstest (adfærd for at 5 undgå at udføre stangspring).

6

Denne egenskab af β-endorfin kan ikke modvirkes af kendte morfinantagonister, såsom naloxon eller naltrexon, således at den konklusion, at β-endorfins psyko-farmologiske virk- . 2 149285 ning opfattes som fuldstændig uafhængig af de opiate recep-torsteder i hjernen, er fuidkommet berettiget.

Bortset fra β-endorfin har det vist sig, at også de mindre 5 peptidfragmenter α-endorfin, fragmentet β-LPH-(61-69) og

Met-enkephalin afledt deraf inhiberer ekstiifctionen af afværgeadfærden på en lignende måde.

Ligeledes peptidet γ-endorfin (β-LPH-(61-77), L-Tyr-L-Gly-L- 10 Gly-L-Phe-L-Met-L-Thr-L-Ser-L-Glu-L-Lys-L-Ser-L-Gln-L-Thr-L-

Pro-L-Leu-L-Val-L-Thr-L-Leu-OH, som kun er forskellige fra ct-endorfin ved nærværelsen af kun én yderligere aminosyre (leu-cin) på C-terminalsiden, viste sig at have psyko-farmakologisk virkning, det være sig af en fuldstændig anden karakter end 15 af a- og β-endorfinet. Medens a-endorfin forsinkede ekstink tionen af afværgeadfærden, viste det sig i modsætning hertil, at γ-endorfin accelererede ekstinktionen af afværgeadfærden.

Det er bemærkelsesværdigt, at tilføjelsen af én aminosyrerest til α-endorfins C-endedel giver anledning til et så dramatisk 20 omslag af adfærdsaktiviteten.

Hollandsk patentansøgning nr. 78.02289 (ikke forpubliseret), jf. dansk patentansøgning nr. 875/79 angiver, at peptider med en aminosyresekvens β-LPH-(62-77) eller nært beslægtede analoge af-25 ledt deraf accelererer ekstinktionen af afværgeadfærden i større udstrækning, end det er tilfælde med γ-endorfin. I modsætning til γ-endorfin har desuden nævnte peptider ikke længere en kraftig affinitet til de opiate receptorer.

Det viste sig overraskende, at hele peptidsekvensen 62-77 af β-LPH ikke var nødvendig for at opretholde nævnte afværgeadfærd (accelerering af ekstinktionen).

Den foreliggende opfindelse angår derfor en analogifremgangsmåde

O C

til fremstilling af peptider eller funktionelle derivater deraf, som indeholder fra 11 til 13 aminosyrerester, og som derfor er betydeligt kortere end de i nævnte hollandske patentansøgning omhandlede peptider.

3 149285

De ifølge opfindelsen fremstillede, hidtil ukendte peptider har den almene formel I: A-R-L-Ser-R^-L-Thr-L-Pro-L-Leu-L-Val-L-Thr-B, 5 hvori R betegner aminosyreresten L-Lys eller L-Arg, betegner aminosyreresten L-Glu eller L-Gln, 10 b betegner L-Leu-OH eller a-methyl-L-Leu-OH, og A betegner H-L-Ser-L-Glu- eller H-Z-L-Ser-L-Glu eller H-Q-L-Thr-L-Ser-L-Glu-, 15 hvori Z betegner L-Thr, D-Thr, eller HN-ALK-CO, Q betegner L-Met, L-Met(O), L-Met(02) eller HN-ALK-CO, og ALK betegner en alkylen- eller alkylidengruppe med 1-6 car-20 bonatomer, eller er funktionelle derivater deraf i form af syreadditionssalte, metalsalte, metalkomplekser, estere afledt af alifatiske alkoholer med 1-18 carbonatomer, amider eller mono- eller 25 di-alkylsubstituerede amider, hvor alkylgruppen eller -grup perne har 1-6 carbonatomer, N-acylderivater afledt af en alifatisk carboxylsyre med 1-6 carbonatomer, N-alkyl-^ eller Ν,Ν-dialkylderivater, hvori alkylgruppen eller -grupperne har 1-6 carbonatomer.

30

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del angivne. De til fremstillingen af forbindelserne hyppigst anvendte metoder kan sammenfattes som 35 angivet i det følgende i tre alternative processer: 4 149285 (a) Kondensation i nærværelse af ét kondensationsmiddel af (1) en aminosyre eller et peptid indeholdende en fri carboxyl-gruppe (og hvori andre reaktive grupper er blevet beskyttet) med (2) en forbindelse (aminosyre, peptid eller amin) inde- 5 holdende en fri aminogruppe (og hvori andre reaktive grupper ligeledes er blevet beskyttet), eller (b) kondensation af (1) en aminosyre eller et peptid indeholdende en aktiveret carboxylgruppe, og hvori andre reakti- 10 ve grupper eventuelt er blevet beskyttet, med (2) en forbindelse (aminosyre, peptid eller amin) indeholdende en fri -gruppe, og hvori andre reaktive grupper eventuelt er blevet beskyttet, eller 15 (c) kondensation af (1) en aminosyre eller et peptid indehol dende en fri carboxylgruppe (og hvori andre reaktive grupper er blevet beskyttet) med (2) en forbindelse (aminosyre, peptid eller amin). indeholdende en aktiveret aminogruppe (og hvori andre reaktive grupper eventuelt er blevet beskyttet), hvor-20 efter beskyttelsesgrupperne om ønsket fjernes.

Fremgangsmåder til aktivering af carboxylgruppen kendes af fagfolk på dette område og omfatter omdannelse heraf til et syrehalogenid, et azid, anhydrid, imidazolid eller en akti-25 veret ester, såsom N-hydroxysuccinimidesteren af p-nitrophenyl-esteren.

Aminogruppen kan aktiveres ved hjælp af i teknikken kendte metoder inklusive omdannelse af aminogruppen til et phosphit-30 amid eller ved anvendelse af "phosphor-azo"-metoden. Vedrørende begge aktiveringsmetoder se: Houben-Weyl, Methoden der Orga-nischen Chemie, 4. udgave, bind XV/2 (Georg Thieme Verlag).

De mest almindelige metoder til de ovennævnte kondensations-35 reaktioner er: carbodi-imid-metoden, azid-metoden, den blandede anhydrid-metode og den aktiverede ester-metode som beskrevet i E. Schroder og.K. Lubke, "The Peptides", bind I, 1965 5 149285 (Academic Pressi. Den såkaldte "fastfase"-metode ifølge Merrifield beskrevet i 85 J. Amer. Chem. Soc 2149 (1963) kan yderligere også anvendes· 5 ...

De reaktive grupper, som ikke deltager i kondensationsreaktionen,beskyttes effektivt ved hjælp af egnede såkaldte beskyttelsesgrupper eller beskyttende grupper, som igen senere let fjernes ved hydrolyse eller reduktion. En carboxylgruppe 10 kan således effektivt beskyttes ved hjælp af kendte metoder, f.eks, forestring med mindst en støkiometrisk,effektiv, mængde methanol, ethanol, tertiær butanol, benzylalkohol eller p-nitrobenzylalkohol,eller alternativt ved omdannelse ved hjælp af kendte midler til et amid, som f.eks. beskrevet i Houben-15 Weyl, Methoden der Organischen Chemie, 4, udgave, bind 15/1, side 315 seq. Denne sidste beskyttelsesgruppe fjernes imidlertid meget vanskeligt, således at det kan anbefales, at denne gruppe kun anvendes til at beskytte carboxylgruppen af C-terminalaminosyren i det endelige peptid eller Y~carb= .

20 oxylgruppen af glutaminsyren. I dette tilfælde fører peptidsyntesen direkte til amidet af peptidet ifølge den almene formel (I).

Grupper,som effektivt kan beskytte en aminogruppe,er alminde-25 ligvis egnede syregrupper, f.eks. en syregruppe afledt af egnede alifatiske, aromatiske, aralifatiske eller heterocykliske carboxylsyrer (såsom eddikesyre, benzoesyre, pyridin-carboxyl-syre) eller en syregruppe afledt af carbonsyre (såsom ethoxy= carbonyl, benzyloxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl eller p-meth= 30 oxybenzyloxycarbonyl) eller en syregruppe afledt af en sulfon-syre (såsom benzensulfonyl eller p-toluensulfonyl). Andre grupper kan også anvendes, såsom substituerede eller usubstitue-rede aryl- eller aralkylgrupper, f.eks. benzyl og triphenyl= methyl,eller grupper, såsom o-nitrophenylsulphenyl eller 2-35 benzoyl-l-methylvinyl. (Se Houben-Wéyl, bind XI/1, side 46 seq).

Det foretrækkes også at beskytte lysins ε-aminogruppe og 6 U9285 eventuelt serins og threonins hydroxylgrupper. Denne sidste beskyttelse er imidlertid ikke altid nødvendig. De sædvanlige beskyttelsesgrupper i denne forbindelse er en tertiær-butyloxy-carbonyl eller en tosyldel til lysins ε-aminogruppe og en 5 t-butyl eller benzyldel til serins og threonins hydroxylgruppe.

Beskyttelsesgrupperne kan afspaltes ved hjælp af forskellige sædvanlige metoder afhængig af den pågældende gruppe, f.eks. ved hjælp af trifluoreddikesyre eller ved mild reduktion f.eks.

10 med hydrogen og en katalysator, såsom palladium eller med HBr i iseddikesyre.

Peptider fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse med aminosyreres-ten L-Met(01 kan fremstilles ud fra det tilsvarende Met-hol-15 dige peptid ved mild oxidation under anvendelse af i teknikken kendte metoder, f.eks. med fortyndet hydrogenperoxid eller en persyre. En sådan oxidation resulterer i en blanding af S- og R-sulfoxidet, som kan spaltes til de særskilte di= astereoisomere ved hjælp af kendte metoder, f.eks. ved selek-20 tiv krystallisation. De særskilte diastereoisomere kan også opnås direkte ved anvendelse af L-methionin-S (eller R)-sulf= oxid i peptidsyntesen.

Sulfonpeptiderne fremstillet ifølge den foreliggende opfindelse med amino-25 syreresten Met«!^) kan opnås ved .oxidation af det tilsvarende Met-peptid I eller ved anvendelse af methioninsulfon i peptidsyntesen .

Udtrykket egnede funktionelle derivater af peptiderne med 30 den almene formel (I) omfatter: (a) syreadditionssaltene og metalsaltene, 35 (b) estere afledt af alifatiske alkoholer med 1 til 18 car- bonatomer, specielt fra alkoholer med 1 til 6 carbonatomer, 7 149285 såsom methanol, ethanol, propanol, isopropanol, hutanol, sec.-butylalkcjhol, amyl alkohol, isoamylalkohol og hexylalkohol, 5 (c) amider eller mono- eller di-alkylsubstituerede amider, hvor alkylgruppen eller alkylgrupperne besidder 1 til 6 carbonatomer, fortrinsvis methyl eller ethyl, (d) N-acylderivater afledt af en alifatisk carboxylsyre med 10 1 til 6 carbonatomer, (e) N-alkyl eller Ν,Ν-dialkyIderivater, hvori alkylgruppen har 1-6 og fortrinsvis 1-4 carbonatomer, og 15 (f) metalkomplekser dannet ved at bringe peptiderne i kontakt med et tungt'opløseligt salt, hydroxid eller oxid af et metal, fortrinsvis zink.

Syreadditionssaltene kan opnås direkte ved at isolere peptidet 20 fra det ønskede sure miljø, eller det opnåede peptid kan senere omdannes til et syreadditionssalt ved reaktion af peptidet med en syre, såsom HC1, HBr, phosphorsyre, svovlsyre, eddikesyre, maleinsyre, vinsyre, citronsyre, polyglu-taminsyre eller carboxymethylcellulose .· 25

Metalsaltene,specielt alkalimetalsaltene, opnås ved reaktion af peptidet med den ønskede metalbase, såsom NaOH, ^200^,

NaHC03. 1 2 3 4 5 6 N-acylderivater og fortrinsvis N-terminal-acyIderivaterne kan 2 fremstilles ved, at der i peptidsyntesen anvendes en amino 3 syre, som allerede har den pågældende acylgruppe. Denne acyl- 4 gruppe fungerer så også som en beskyttelsesgruppe i peptid 5 syntesen, På denne måde fremstilles de ønskede acylderivater 6 direkte. Det er imidlertid også muligt at indføre den ønskede acylgruppe senere ved at acylere peptidet på sædvanlig måde, som kendes af fagfolk på dette område.

8 149285 N-acylgruppen, som foretrækkes særligt, er acetylgruppen.

Estere og amider fremstilles også fortrinsvis ved, at der i peptidsyntesen anvendes en aminosyre, som allerede har den 5 ønskede ester- eller amidgruppe. De kan imidlertid også fremstilles senere ved forestring af peptidet opnået på den for fagfolk på dette område kendte sædvanlige måde, eller ved at omdanne samme til et amid.

10 Amider,som særligt foretrækkes, er de usubstituerede amider og monomethyl- eller dimethylamideme og monoethyl- eller diethyl-amiderne.

N-alkyl og N,N-dialkyIderivaterne, såsom N-monomethyl- eller 15 Ν,Ν-dimethyIderivaterne,fremstilles ved i peptidsyntesen at anvende den relevante allerede N-mono- eller alt efter det foreliggende tilfælde N,N-dialkylerede aminosyre.

Metalkomplekserne kan opnås ved at bringe peptidet i kontakt 20 med tungtopløselige metalsalte, metalhydroxider eller metal oxider. Metalphosphaterne, metalpyrophosphaterne og metal-polyphosphaterne anvendes almindeligvis som tungtopløselige metalsalte. Metallerne, der kan anvendes ved denne proces, er metallerne, som hører til undergrupperne "b" i det perio-25 diske system, f.eks. kobolt, nikkel, kobber, jern og fortrinsvis zink, såvel som metaller fra hovedgrupperne i det periodiske system, som er i stand til at danne komplekser, såsom magnesium og aluminium. Fremstillingen af disse metalkomplekser finder sted på sædvanlig måde. Et metalkompleks kan f.eks.

30 opnås ved at sætte peptidet og tungtopløseligt metalsalt, metalhydroxid eller metaloxid til et vandigt medium. Metalkomplekset kan også opnås ved at sætte et alkalisk medium til en vandig opløsning af peptidet og et opløseligt metalsalt, således at det uopløselige peptid-metalhydroxidkompleks dan-35 nes. Metalkomplekset kan yderligere opnås ved at sætte peptidet, et opløseligt metalsalt og et yderligere opløseligt salt til et vandigt, fortrinsvis alkalisk medium, således at der in situ dannes et uopløseligt peptid-metalsalt-kompleks.

149285 9

Metalkomplekserne kan direkte uden yderligere behandling anvendes som suspensioner, eller de kan f.eks. frysetørres og senere resuspenderes.

5 Peptiderne ifølge den almene formel I og de funktionelle derivater som beskrevet ovenfor accelerer ekstinktionen af afværgereaktionen hos rotter i den såkaldte "stang-spring"-test på samme måde og ved omtrent det samme niveau som peptider, der er beskrevet i hollansk patentansøgning 78.02289. De 10 foreliggende peptider er imidlertid ikke blot kortere og kan således fremstilles mere økonomisk, men risikoen for bivirkninger på grund af peptidfragmenter dannet ved metabolisk nedbrydning er væsentligt reduceret.

15 I det følgende er anført farmakologiske data vedrørende accelerationen af ekstinktionen af rotters flugtopførsel ved. "stang-spring"-testen (afværgereaktion med hensyn til spring fra.stang) efter subkutan injektion af ifølge opfindelsen fremstillede peptider sammenlignet med referenceforbindelsen γ-endorfin. I 20 spalterne 2, 3 og 4 er angivet resultaterne henholdsvis ved injektionen og to og fire timer efter injektionen.

25 1 35 10 149285 , i

Antal afværgereaktioner i 3 Behandlxng , ekstinktionsperioder_ i 0 time 1 2 timer . 4 timer •-*— -1---1- i γ-endorfin (5-17) ; ! idosis/rotte 0,1 i 9,5+0,6 j 6,3+0,9 i 4,5+1,0 ! 0,3 μg 9,5+0,4 j 4,5+0;4 i 2,3+0,9 ! 1,0 μg 9,3+0,5 4,3+1,4 2,0+0,7 j 0,5 ml saltvand 9,8+0,3 9,0+0,4 7,8+0,5 γ-endorfin (6-17) dosis/rotte 0,03 μg 8,8+0,5 7,1+1,1 5,8+1,2 0,1 Mg 8,5+0,4 1,7+0,5 1,7+0,4 0,5 ml saltvand 8,6+0,4 8,0+0,5 7,0+0,8 γ-endorfin (7-17) jdosis/rotte 0,03 ug 9,3+0,4 8,3+0,8 6,2+0,9 I 0,1 Mg 9,2+0,4 5,0+1,5 2,8+1,4 j 0,5 ml saltvand 9,6+0,4 7,6+1,5 7,4+1,4 [Ala^]-γ-endorfin (6-17) dosis/rotte 0,1 μg 9,3+0,5 7,3+1,1 5,3+1,2 0,3 μg 9,8+0,3 6,5+2,2 5,3+2,1 1 μg 8,3+0,3 6,3+1,3 . 3,3+1,3 ; 0,5 ml saltvand 9,5+0,3 8,0+1,1 6,0+1,4 ; i [N^ (Ac)]-γ-endorfin (6-17) I dosis/rotte 0,003 ug 9,2+0,4 6,6+1,0 5,2+1,5 . j 0,01 Mg 9,5+0,2 7,7+0,5 4,5+1,0 I 0,5 ml saltvand 9,2+0,4 8,2+0,4 7,2+0,9 i 0,03 Mg 8,8+0,3 5,6+0,5 j 2,8+0,7 i 0,5 ml saltvand 8,8+0,3 7,8+0,6 \ 7,7+0,5 ; 0,01 Mg 9,1+0,4 4,0+0,8 ! 1,8+0,5 ; 0,5 ml saltvand 8,8+0,3 7,6+0,3 i 7,0+0,3 i I ^ T 7 i [N -MeLeu /]-γ-endorfin I(6-17) idosis/rotte: 0,001 Mg 9,8+0,3 6,6+1,0 5,0+1,4 i 0,003 Mg 9,4+0,4 j 8,0+0,3 i 4,2+1,4 i 0,01 Mg 9,6+0,3' | 6,2+1,8 * 3,8+1,3 j 0,5 ml saltvand 9,2+0,4 ( 8,2+0,6 7,0+0,8 i i7 ! I [a-MeLeu ]-γ-endorfin | · . i (6-17) j i j dosis/rotte: 0,003 Mg 9,5+0,3 | 8,1+1,5 5,3+1,9 i 0,01 Mg 9,6+0,2 j 8,1+0,6 5,0+1,4 0,5 ml saltvand 9,5+0,4. 9,0+1,0 8,7+0,5 [D-Thr®]-γ-endorfin (6—17) dosis/rotte: 0,003 Mg 9,3+0,3 7,8+0,8 5,2+1,4 0,01 9,3+0,3 7,3+0,6 4,6+1,2 0,5 ml saltvand ‘9,2+0,4 8,2+0,4 7,2+0,9 i— -------------------------------------------------------;----- f · I γ-endorfin (reference) 1 dosis/rotte: 0,03 Mg 8,8+0,3 6,7+0,8 4,0+0,7 1 0,1 Mg 9,3+0,3 5,5+0,6 2,3+0,4 ! . 0,3 Mg 9,0+0,4 4,6+0,3 0,8+0,4 ! 0,5 ml saltvand I 9,4+0,4 8,0+0,5 j 7,8+0,7 ‘ ....... .. — ------- - — 11 149285

De foreliggende peptider er yderligere aktive i den såkalte "gribetest". De med peptiderne fremstillet ifølge opfindelsen behandlede rotter svævede over burets gulv med deres forpoter gribende om en blyant i væsentlig længere tid end rotter be-5 handlet med saltvand (placebo) eller a-endorfin.

Positive resultater ved gribetesten anses for at indicere en neuroleptisk virkning. Det velkendte neuroleptikum, Haloperidol, er virksom i denne test.

10

Ved den nedenfor beskrevne gribetest blev der opnået følgende resultater.

1--—-- 1 Γ2Ι ~ΤΓ)

Forbindelse_ Aktivitet i gribetest 15 γ-endorfin (5-17) +++ γ-endorfin (6-17) +++ γ-endorfin (7-17) ++ [3-Ala6]-^-endorfin (5-17) + [ε-Ahx5]-γ-endorfin (5-17) + 20 N-Ac-y-endorfin (6-17) + j 6 ! [D-Thr 3-γ-endorfin (6-17) ++ [Ala6]-γ-endorfin (6-17) +++ [Arg^]-γ-endorfin (6-17) ++ [Ne^-Ac]-y-endorfin (6-17) +++ 25 N-Ac[Ne^-Ac]-y-endorfin (6-17) +/++ [Giu**]-γ-endorfin (6-17) +++ [g-MeLeu^] -γ-endorfin (6-17) j_._++_' *) ε-Ahx = ε-aminohexansyre 1 (1) Protokol for gribetest.

Ved denne test blev der anvendt rotter, der vejer mellem .170 og 190 g hver. Først blev forpoterne på rotterne forsigtigt anbragt på en stang med en diameter på 9 mm, som var anbragt 35 vandret ca. 23 cm over burets gulv. Man målte den tid (i tiendedele sekunder) som dyrene holdt sig svævende over gulvet.

Denne test blev gennemført to gange i træk. Kun resultaterne ved det andet forsøg blev anvendt.

12 149285

Dyret blev først undersøgt uden behandling, og umiddelbart derefter fik de subkutant injiceret enten 10 eller 50 ug af den respektive forbindelse opløst i saltvand eller placebo. Afprøvningen blev foretaget igen 30 og 120 minutter efter injektionen.

5 Mellem afprøvningerne blev dyrene opbevaret med 5 dyr pr. bur i et lyddæmpet rum.

(2) Aktivitetskode: 10 + (mildt aktiv): forskel mellem peptid (dosis/rotte 50 pg) og placebo ^ 0,40 sek., men < 0,70 sek.

++ (aktiv): forskel > 0,70 sek.

+++ (hyperaktiv): signifikant forskel mellem placebo og peptid ved de to dosiskoncentrationer på 10 pg og 50 pg/rotte.

15

Denne farmakologiske profil gør de ifølge opfindelsen fremstillede peptider og peptidderivater særligt velegnede til anvendelse ved behandlingen af visse mentale forstyrrelser, hvori der ønskes en reduktion af cerebralfunktionen. De ifølge opfindelsen fremstillede peptider 20 har specielt neuroleptisk virkning og kan således være egnede ved behandlingen af f.eks. visse skizofrene syndromer.

Peptiderne anvendes i effektive mængder med kendte bærere og anvendes fortrinsvis i en dosis på 1 pg til 1 mg/kg legems-25 vægt pr. dag afhængig af den form, hvori de administreres.

Mennesker behandles fortrinsvis med en daglig dosis på 0,1 mg til ca. 10 mg,mere specielt mellem 0,5 og 2 mg.

De ifølge opfindelsen fremstillede peptider kan administreres ad enten 30 oral, rektal eller parenteral vej ved hjælp af en i teknikken kendt farmaceutisk effektiv bærer. Peptiderne anvendes fortrinsvis som injicerbare præparater. Til injektionsformål opløses, suspenderes eller emulgeres de i en egnet væske. Blandet med passende hjælpestoffer og fyldstoffer kan de ifølge op-35 findelsen fremstillede peptider yderligere gives en form, scm er velegnet til oral administration, såsom piller, tabletter, dragéer eller kapsler. De ifølge opfindelsen fremstillede peptider kan yderligere administreres i form af en stikpille eller et sprøjtepræparat.

13 149285 Særligt værdifulde præparater opnås, når de ifølge opfindelsen franstillede peptider tilvejebringes i en form, som giver forlænget virkning. Metalkomplekserne anvendes fortrinsvis. Disse metalkomplekser kan opnås ved at bringe peptiderne i kontakt med 5 tungtopløselige metalsalte, metalhydroxider eller -oxider, som kendes af fagfolk, på dette område. Metalphosphaterne, metalpyrophosphaterne og metalpolyphosphaterne anvendes generelt som tungtopløselige metalsalte. Peptider med den almene formel I, som foretrækkes, er de peptider, hvori R^ betegner 10 aminosyreradikalet L-Gin, R er aminosyreradikalet L-Lys, og B er gruppen L-Leu-OH.

Med hensyn til gruppen A i peptiderne fremstillet ifølge opfin-15 delsen foretrækkes specielt det peptid, hvori A betegner peptidradikalet: H-Z-Ir-Ser-L-Glu-, hvori 2 betegner L-Thr eller D-Thr, men også de lidt længere peptidradikaler A kan specielt anbefales, specielt de radikaler, hvori A betegner: 20 H-Q-L-Thr-L-Ser-L-Glu- hvori Q fortrinsvis er L-Met, L-Met(O) eller L-MettC^).

Radikalet I^N-ALK-CO, hvori ALK er en (1-6C) alkylen- eller 25 alkylidengruppe, omfatter blandt andet aminosyreresterne glycyl, alanyl, β-alanyl, valyl, leucyl, isoleucyl, e-amino= caproyl og α-methylleucyl.

Med hensyn til de efterfølgende eksempler gøres der følgende 30 betragtninger og fastsættes følgende regler.

I. Hvis der ikke er angivet nogen optisk konfiguration er L-formen eksemplificeret. 1 il· Følgende forkortelser er blevet anvendt for de anvendte beskyttende eller aktiverende grupper: 14 149285

Boc = tertiær butyloxycarbonyl tBu = tertiær butyl Me = methyl ONp = p-nitrophenyloxy 5 Z = benzyloxycarbonyl III. Følgende forkortelser er blevet anvendt for de anvendte opløsningsmidler eller reagenser: 10 To = toluen

EtOH = ethanol

Bu = butanol

Py = pyridin

Ac = eddikesyre eller acetyl 15 EtOAc = ethylacetat

Am = amylalkohol I.A.N. eller IAN = isoamylnitrit DMF = dimethylformamid THF = tetrahydrofuran 20 DCCI = dicyklohexylcarbodiimid DCHU = dicyklohexylurinstof TEA = triethylamin TFA = trifluoreddikesyre

Wa = vand 25 N.E.M. = N-ethylmorpholin HOBt = N-hydroxybenztriazol IV. Følgende forkortelser er blevet anvendt for aminosyre-grupperne: 30

Met = methionyl

Met(Ol = sulfoxid af methionyl

Met(02) = sulfon af methionyl

Phe = phenylalanyl 35 Pro = prolyl

Ser = seryl

Lys = lysyl

Arg = arginyl

Thr = threonyl

Glu = glutamyl 15 149285

Gin = glutaminyl

Gly = glycyl

Val = valyl

Leu = leucyl 5 Ala = alanyl

MeLeu = a-methylleucyl

Udgangsstoffer 10 A. Syntese af H-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OMe og analoge (1) H-Glu(OtBul-Lys(Boc)-OMe a} 35,3 Z-Glu(OtBul-OH og 27,0 g HOBt opløses i 150 ml DMF, 15 hvorefter blandingen afkøles til ca. -22°C. 29,7 g H-Lys(Boc)-OMe,HCl i 100 ml DMF og 1 ækvivalent NEM sættes derpå til den afkølede blanding. Blandingen pH-værdi indstilles på 6,4 med NEM, og 23 g DCCI tilsættes så. Efter omrøring i ca. 15 min. ved ca. -22°C og ca. 12 timer ved stuetemperatur frafiltre-20 res DCHU, og filtratet inddampes til tørhed.

Resten opløses i 400 ml EtOAc og vaskes derpå med 15% NaCl-opløsning, 5% KHS04-opløsning, 5% NaHCO^-opløsning og 15% . NaCl-opløsning. Efter tørring og filtrering, inddampes fil-25 tratet til tørhed. Resten krystalliseres fra ether/petroleums-ether (1:2). Udbytte 86,6%. Smp.: 54-56°C.

b) Det under A(l) opnåede peptid opløses i DMF, hvorefter Pd/C (10%) tilsættes, og H2 ledes igennem, indtil udviklingen af CO2 ophører. Efter filtrering inddampes filtratet til tørhed.

Rf i To:EtOH (8:2) = Q,24 på Si02· 35 (2) Z-Thr-Ser-N^H-, 38,05 g Z-Thr-Ser-OMe (se Recueil 83, 255, (1964) opløses i 12 ml ethanol, hvorefter 43 ml hydrazinhydrat tilsættes. Efter 16 1A 9 2 8 5 omrøring i ca. 2 timer fraskilles det faste stof ved filtrering, vaskes med ethanol/ether (1:1) og tørres.

Rf i CHC13 rCHgOHsWa (70:30:51 = 0,58 på SiC>2; 5 dekomponering 215-216°C.

(3a) Z-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OMe ' a) 1,22 g af det i A(2) opnåede hydrazid suspenderes i 15 ml .10 DMF, hvorefter der tilsættes 4,28 ml 2,42 N HC1/DMF. Den klare opløsning afkøles til ca. -20°C. 0,7 ml IAN tilsættes derpå, . og blandingen omrøres i ca. 30 min. ved ca. -20°C. 1,5 g af det i B(1) opnåede peptid i 10 ml DMF tilsættes derpå. Reaktionsblandingens pH-værdi indstilles såtil 7,2, og det hele 15 anbringes i et køleskab i ca. 6 dage. Opløsningsmidlet fjernes så ved fordampning, resten opløses i EtOAc, og den resulterende opløsning vaskes. Inddampning til tørhed giver et fast stof. Udbytte 61,9%. Smp,: 13G-132°C.

.20

EksempelΓ

H-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln—Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH

25 1. Z-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-N2H3 4,0 g Z-Thr-Ser-Glu (OtBu) -Lys (Boc). -OMe (B. 3.aJ opløses i 40 ml methanol. Dertil sættes 2,Q ml Κ^Ι^,Ε^Ο, hvorefter blandingen omrøres ved stuetemperatur i 18 timer. Det resulterende 30 faste stof filtreres fra og omrøres så med 100 ml H20. Det faste stof filtreres igen fra, vaskes med vand og tørres. Udbytte 3,5 g. Smp. 158°C - 159°C.

Rf = CHCl3/MeOH (8:2) = 0,55 på Si02.

2. Z-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boel-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu.

35 17 149285 1,42 g Z-Thr-Ser-Glu(OtBu).-Lys (Boci-^H^ opløses i 10 ml DMF. Derpå afkøles opløsningen til 0°C, og så tilsættes 1,62 ml 2,3 N HC1/DMF, og efter afkøling til -20°C tilsættes 0,27 inn I.A.N. Blandingen omrøres ved -15°C til -20°C i 5 min.

5

Til denne blanding sættes så 0,45 ml N.E.M. og en opløsning af 1,57 g H-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu (F.l) i 10 ml DMF. Reaktionsblandingens pH-værdi indstilles til 7,0-7,2 og henstår ved ca. 0°C i 3 dage. Blandingen hældes så i 310 ml 10 H20· Det resulterende faste stof isoleres, vaskes med vand og tørres.

Udbytte 2,29 g. Smp. 185-187°C (dekcanponering).

15 Rf i CHCl3/MeOH (8:21 = 0,35 på Si02·

3. H-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH

2,26 g (1,37 mmoll Z-Thr-Ser-Glu(OtBul-Lys(Boc)-Ser-Gln-20 Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu opløses i 30 ml DMF, hvorefter

Pd/C (10%) tilsættes, og H2 tilledes, indtil der ikke længere ses C02-udvikling. Efter frafiltrering af Pd/C reduceres filtratet ved inddampning.

25' Det hydrogenerede peptid indføres i 30 ml 90% TFA,og nogle få dråber anisol tilsættes. Blandingen omrøres ved stuetemperatur i 1 timer og hældes så i ether. Stoffet renses ved modstrømsfordeling i et opløsningsmiddelsystem Bu:Ac:Wa (4:1:5).

30

De samlede fraktioner reduceres ved fordampning, opløses i 50 ml tertiær butanol/H20 (1:1), hvorefter en ionbytter i form af acetat tilsættes, og blandingen omrøres i 1/2 time. Ionbytteren filtreres så fra, og filtratet fryses 35 og frysetørres. Udbytte 1,0 g.

Rf i Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) = 0,17 på Si02· 18 149285

O

Eksempel II

På samme måde som beskrevet i eksempel I fremstilles følgende peptider: H-D-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-

Leu-OH

,0 Rf - °'19 H-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu- nhch3

Rf = 0,26 15 H-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu- OMe

Rf = 0,34 2o H-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Glu-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH Rf = 0,16 H-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-MeLeu-

25 OH

Rf = 0/23

Opløsningsmiddelsystem Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) på S1O2 30 Eksempel IV

H-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH.

På sædvanlig måde fremstilles den beskyttede titelforbindelse 35 ved kobling af Z-Ser-OH med H-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OtBu.

19 149285

Fjernelse af de beskyttende grupper gennemføres på den i eksempel I. 3 beskrevne måde.

Rf i Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) = 0,19 på Si02· 5

Eksempel IV.

H-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-OH

1. Boc-Met-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OH

10

Boc-Met-OH kobles på den i eksempel E.l beskrevne måde med H-Thr-Ser-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-OMe (B.3.b), hvorefter den resulterende peptidmethylester forsæbes på den i E.2. beskrevne måde.

15 2. Det under 1 opnåede peptid kobles med H-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Va1-Thr-Leu-OtBu (F.l), hvorefter det resulterende beskyttede peptid befries for de beskyttende grupper og renses.

20 Rj i Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) = 0,20 på Si02·

Eksempel V.

På tilsvarende måde fremstilles: 25 Ø-Ala-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-

Thr-Leu-OH

Rf » 0,16 30 6-aminohexanoyl-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-

Val-Thr-Leu-OH Rf = 0,18 H-Leu-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-Thr-

Leu-OH

35 Rf 0,22

Rf-værdier i Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1). på Si02.

Claims (3)

149285

0 Eksempel VI På sædvanlig måde fremstilles følgende peptider: Η-Met(O)-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val- Thr-Leu-OH 5 Rf = 0,23 Opløsningsmiddelsystem: Bu:Py.Ac:WA (2:3/4.1/4.1) på Si02·

10 Eksempel VII På sædvanlig måde fremstilles ligeledes: Η-Met(02)-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val-15 Thr-Leu-OH = 0,27 Opløsningsmiddelsystem: Bu:Py:Ac:Wa (2:3/4:1/4:1) på Si02· Patentkrav 20 ___________________