FI67366B - Foerfarande foer framstaellning av nya psykofarmakologiskt verkande peptider - Google Patents

Description

I- ^™T1 r_, M4V KUULUTUSJULKAISU /Π7 / / J$tST& ® ^ UTLÄGCNINGSSKRIFT 673 6 6 ^ ’ (51) K*.ik!/totCL3 C 07 C 103/52 SUOMI —FINLAND pi) Pm«ttftikM-PK«(iMMnl*| 772156 (22) HriwmtapiW-AMBtalntwhe 11.07.77 (23) Attcuptivt—GUttgtMOdaf 11.07.77 (41) ΤαΝκ tufldMksJ — U«k a(Mtl| j j g ^ jg pantti· j» rekisteri hallitut /44) NlMMMpanoft )· kuuLHkU*» pvm. — r*t*at· och registerrtyrelten AmNum utkagd odt uti^knftMt pubttcerad 30.11.q4 (32)(33)(31) ·ωο*·*» -8·**π) prior** 12.07.76

Hoilanti-Holland(NL) 76O768A

(71) Akzo N.V., Ussellaan 82, Arnhem, Hoilanti-Hoi 1and(NL) (72) Hendrik Marie Greven, Heesch, David de Wied, Bilthoven,

Hoilanti-Hoiland(NL) (7*0 Oy Kolster Ab (5*0 Menetelmä uusien psykofarmakologisesti vaikuttavien peptidien valmistamiseksi - Förfarande för framstäl1 ning av nya psyko-farmakologiskt verkande peptider

Keksintö koskee menetelmää uusien psykofarmakologisesti vaikutta-vien peptidien valmistamiseksi. Näillä peptideillä on arvokkaita psykofarmakologisia ominaisuuksia. Erityisesti ne estävät välillisen ajatus-reaktion häviämisen, minkä seurauksena ne ovat erityisen sopivia hoidettaessa tiettyjä mielenterveydellisiä sairauksia, joissa aivotoiminnan stimulointi on toivottavaa, kuten vanhuuden oireita hoidettaessa.

Julkaisusta Ear . J . Pharmacol .2_, lU (1967) tunnetaan, että luonnollisten adrenokortikotrooppisten hormonien (ACTH) tietyt peptidi-fragmentit hidastavat välillisen ajatusreaktion heikkenemistä. Erityisesti Peptidi, joka koostuu ACTK:n aminohapposarjasta 1+-10, on osoittautunut P^-enimmäksi peptidiosaseksi , joka on tässä suhteessa vaikuttava.

Mainittujen psykofarmakologisten ominaisuuksien lisäksi on pepti- 2 67366 dillä, jossa on ACTH:n aminohapposarja 1-10, lievä MSH-vaikutus, kuten tämän tyyppisille ACTH-osasille on tavallista. Vaikkakaan peptidin, jolla on MSH-vaikutusta, pienen annoksen vaikutusta ei vielä täysin tunneta, on siitä huolimatta tutkittu peptidejä, joilla on ainakin sama psykofarmakologinen vaikutus, mutta ei lainkaan tai suuresti vähentynyt MSH-vaikutus.

US-patenttijulkaisussa 3 853 836 esitetään, että aminohappo-sarja 1-10 ACTH ei ole oleellinen psykofarmakologisen vaikutuksen kannalta, ja että tämä vaikutus on katsottava aiheutuvaksi paljon lyhyemmästä peptidistä, nimittäin 1-6 ACTH. Lisäksi käy ilmi, että N-terminaalinen aminohappo L-Met voidaan aktiivisuuden vähentymättä korvata ryhmillä D-Met , L- tai D-Met(-^ 0) , L- tai D-Met (—£-0 ) , desa-mino-Met , desamino-Met (t=s-0 ) tai desamino-Met (0^ ) , tai ryhmällä H N-B-C-, jossa B on haarautunut tai suoraketjuinen alkeeniryhmä,

M

0 jossa on 1-6 hiiliatomia.

US-patenttijulkaisussa 3 856 770 esitetään edelleen, että C-terminaalisen peptiditähteen -L-Trp-Gly-OK korvaamisesta alkuperäisessä 1-10 ACTH-peptidissä yhdellä tai useammilla ryhmistä -L-Phe OH, L-Phe-Gly-OH , fenyylialkyyliaminoryhmällä tai (3-indolyyli)alkyy1i-aminoryhmällä on seurauksena psykofarmakologisen vaikutuksen lisääntyminen .

US-patenttijulkaisussa 3 812 0 61 on lisäksi esitetty, että saadaan psykofarmakologisen vakutuksen huomattava lisäys korvaamalla L-arginiini alkuperäisessä 1-10 ACTH-peptidissä tai jossakin modifioiduista peptideistä, joita on kuvattu edellä mainituissa julkaisuissa, D-lysiiniliä.

Tässä jälkimmäisessä julkaisussa on kuvattu kaikkein aktiivisimmat peptidit, nimittäin peptidit, jotka vastaavat yleistä kaavaa: A-L-Glu-L-His-L-Phe-D-Lys-L-Phe-(Gly)-OH, jossa A tarkoittaa samaa kuin edellä. Näiden peptidien aktiivisuuden on todettu olevan n. 1 000 kertaa voimakkaampi kuin alkuperäisen 1-10 ACTH:n.

Yllättäen on nyt havaittu, että aminohappotähteet Glu ja His, joita tähän asti on pidetty oleellisina aktiivisuudelle, voidaan korvata ilman aktiivisuushäviötä alemmilla aiifaattis il1a aminohappotähteillä, kuten ryhmillä Ala, Leu, Vai ja Ile, joita voidaan käyttää hyväksi paljon yksinkertaisemmin ja halvemmin kuin tähteitä Glu ja His peptidisynteesissä.

67366

On myös varmistettu, että aminohappo L-Phe alkuperäisen U-10 ACTH:n 7-asemassa voitaisiin korvata muilla vasemmalle kiertävillä aminohapoilla, kuten edellä nimetyillä alemmilla alifaattisilla aminohapoilla .

Keksinnön kohteena on täten menetelmä uusien psykofarmakologisesti aktiivisten peptidijohdannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava A-NH-CH-CO-NH-CH-CO-L-Q-D-Lys-Z (I)

I I

R1 R2 jossa A on H-L-Met- H-L-Met (->0 ) , H-L-Met (0 ) , de s amino-Met , de samino-Met-(->0), desamino-Met (-^5 ) tai ryhmä H^N-B-CO, B on haaroittunut tai suoraketjuinen 1-6 hiiliatomia sisältävä al-kyleeni tai 1-6 hiiliatomia sisältävä alkylideeni, Q on aminohappotähde -NH-CHR-CO, jossa R merkitsee 1-U hiiliatomia sisältävää alkyyliä, p-hydrok s ifenyylimetyyliä, 3-indolyylimetyyliä tai f enyyl imetyyl iä, R^ ja R^ merkitsevät vetyä tai 1-1+ hiiliatomia sisältävää alkyyliä, ja Z on N(fenyylietyyli)amino, N-(p -indolyylietyyli)amino, L-Trp-OH, L-Phe-OH, L-Trp-Gly-OH tai L-Phe-Gly-OH, tai niiden toiminnallisten johdannaisten valmistamiseksi, joita ovat farmaseuttisesti hyväksyttävät happoadditiosuolat , aiifaattise sti C g-karboksyylihaposta johdetut asyylijohdannaiset, substituoimat-tomat tai alemmalla alkyylillä (1-6 C) substituoidut amidit, 1-8 hiiliatomia sisältävistä alifaattisista alkoholeista johdetut esterit, sekä metallikompleksit, jotka on saatu saattamalla peptidi kosketukseen koboltin, nikkelin, kuparin, raudan tai edullisesti/sinkin niukkaliukoisen suolan, hydroksidin tai oksidin kanssa.

Z:n määritelmässä N(fenyylietyyli)-amino ja N( β -indolyylietyy-li)anino poikkeavat samanasukuisista aminohappotähteistä siinä, että niissä ei ole karboksyyyliryhmää.

N(fenyylietyyli)amino- ja N( fi>-indolyylietyyli)aminoryhmi11ä ymmärretään ryhmiä _/T7\V 3 NK c \ ) ja vastaavasti -NH-C H,--^ '""n

\ 2 1+jj II

N ^

H

* 67366 jossa R on vety, halogeeni, hydroksi, alkyyl iryhmä, jossa on 1-1+ hiiliatomia, tai alkoksiryhmä, jossa on 1-ä hiiliatomia.

Yleisen kaavan I mukaisia peptidejä ja peptidijohdannaisia valmistetaan tällaisille yhdisteille tavallisilla tavoilla. Tavallisimmin käytetyt menetelmät näiden peptidien valmistamiseksi voidaan pääkohdittain esittää seuraavasti: a) kondens oimalla kondens oimis aine en läsnäollessa yhdiste (aminohappo, peptidi), joka sisältää vapaan karboksyyliryhmän ja jossa muut reaktiiviset ryhmät on suojattu, yhdisteen kanssa (aminohappo, peptidi tai amiini), joka sisältää vapaan aminoryhmän ja jossa muut reaktiiviset ryhmät samoin on suojattu, b) kondens oimalla yhdiste, (aminohappo, peptidi), joka sisältää aktivoidun karboksyyliryhmän ja jossa muut reaktiiviset ryhmät on valinnaisesti suojattu, yhdisteen (aminohappo, peptidi, amiini) kanssa, joka sisältää vapaan aminoryhmän ja jossa muut reaktiiviset ryhmät on suojattu; minkä jälkeen suojaryhmät, jos niin halutaan, voidaan poistaa.

Menetelmät karboksyyliryhmän aktivoimiseksi käsittävät tämän ryhmän muuttamisen happchalogenidiksi , -atsidiksi, -anhydridiksi , -imidiät soiidiksi tai aktivoiduksi esteriksi, kuten N-hydroksi-sukkii-ni-imidie steriksi tai p-nitrofenyylie steriksi . Aminoryhmä voidaan aktivoida muuttamalla tämä ryhmä fo s fiittiamidiksi tai käyttämällä "fos-foratso"-menetelmää.

Tavallisimmat menetelmät edellä mainittuja kondensaatioreakti-oita varten ovat: karbodi-imidi -menetelmä, at sidi-menetelmä , seka-anhydridi -menetelmä ja aktivoitu esterimenetelmä, kuten on kuvattu teoksessa "The Peptides", osa I, 1965 (Academic Press), E. Schröder ja K. Lubke. Ns. Merrifieldin "jähmeäfaasi"-menetelmää , joka on kuvattu julkaisussa J. Am. Chem. Soc . 8_5, 2lU9 (1963) voidaan lisäksi käyttää keksinnön mukaisten peptidien tai peptidi-johdannaisten valmistamiseksi.

Reaktiiviset ryhmät, joiden osaanotto kondensaatioreaktioon täytyy estää, suojataan tehokkaasti, ns. suojaryhmi11ä , jotka voidaan helposti jälleen poistaa, esimerkiksi hydrolyysillä tai pelkistämällä. Esimerkiksi karboksyyliryhmä voidaan tehokkaasti suojata esteröimällä .^etanolilla , etanolilla, t e rt i äär i s ellä butanolilla, b ent sy y 1 i alkoho -lilla tai p-nitrobentsyy1ialkoholilla , tai muuttamalla amidiksi. Tämä jälkimmäinen suojaryhmä on kuitenkin hyvin vaikea poistaa, niin että on suositeltavaa, että tätä ryhmää käytetään vain C-terminaalis en aminohapon karboksyyliryhmän suojaamiseen lopullisessa peptidissä.

Il 5 67366 Tässä tapauksessa peptidisynteesi johtaa suoraan kaavan I mukaisen peptidin amidiin. Ryhmiä, jotka voivat tehokkaasti suojata aminohapporyhmän, ovat tavallisesti happoryhmät, esimerkiksi happo-ryhmä, joka on johdettu aiifaattise sta , aromaattisesta, aralifaatti-sesta tai heterosyklisestä karbonihaposta, kuten asetyyli-, bentsoyy-li- tai pyridiini-karboksyyliryhmä, tai happoryhmä, joka on johdettu karboksyylihaposta, kuten etoksikarbonyyli-, bentsyy1ioksikarbonyy1i-, t-butyylioksikarbonyyli- tai p-metoksibentsyyli-oks ikarbonyyliryhmä, tai ryhmä, joka on johdettu sulfonihaposta, kuten bents eeni-sulfonyy-li- tai p-1olueeni-sulfonyy1iryhmä , mutta voidaan käyttää myös muita ryhmiä, kuten substituoituja tai substituoimattomia aryyli- tai aral-kyyliryhmiä, esimerkiksi bentsyyli- ja trifenyylimetyy1iryhmiä, tai sellaisia ryhmiä kuin o-nitrofenyylisulfenyyli- ja 2-bentsoyy1i-1-me-tyyl i vinyyliryhmät . Usein on suositeltavaa, että lysiinin £-aminoryh-mä ja valinnaisesti tyrosiinin fenolihydroksyyliryhmä myös suojataan. Tämä jälkimmäinen suojaus ei kuitenkaan aina ole olennainen. Tavallisia suojaryhmiä tässä yhteydessä ovat tertiäärinen butyylioksikarbo-nyyli tai tosyyiiryhmä lysiinin 6.-aminoryhmälle ja bent syyl i ryhmä tyrosiinin fenolihydroksyyliryhmälle.

Suojaryhmät voidaan lohkaista erilaisin tavallisin menetelmin, riippuen kysessä olevan ryhmän luonteesta, esimerkiksi trifluorietik-kahapon avulla tai lievästi pelkistämällä, esimerkiksi vedyllä ja katalyytillä, kuten palladiumilla, tai HBr:lla jääetikassa.

Keksinnön mukaisia peptidejä, joissa on (L tai D)Met(—^O) tai de samino-Met ( 0) N-terminaalisena tähteenä, voidaan valmistaa vas taavasta Met- tai desamino-Met-peptidistä lievästi hapettaen tunnetulla tavalla, esimerkiksi laimealla vetyperoksidilla tai jollakin per-hapolla. Tällaisen hapettamisen seurauksena saadaan S- ja R-sulfoksi-dien seos, joka voidaan hajottaa antamaan erilliset diastereo-isoinee-rit sinänsä tunnetulla tavalla, esimerkiksi selektiivisesti kiteyttämällä. Erilliset di astereo-isomeerit saadaan myös suoraan yhdistämällä (L tai D)-metioniini-S(tai R-)-sulfonsidi tai sen vastaava desami-no-johdannainen peptidi-osasen tähteen kanssa.

Tämän keksinnön mukaisia peptidejä, joissa on (L tai D)-Met ( > 0 g ) tai desamino-Met ( >02) N-t er mi n aal i sena osana, voidaan saada hapettamalla (de s amino ) Met-peptidi I tai yhdistämällä (desamino) Met -sulfoni peptidi-osasen tähteen kanssa.

Yleisen kaavan I peptidien toiminnallisilla johdannaisilla ymmärretään : 6 67366 1. Happoadditiosuoloja tai raetallisuoloja , edullisesti alkalime-tallisuoloja , kuten natriumsuoloja; 2. Yleisen kaavan I peptidejä, joissa yksi tai useampi vapaista aminoryhmistä on substituoitu asyyliryhmällä, joka on johdettu alifaat-tisesta karbonihaposta, jossa on 1-6 hiiliatomia, esim. asetyylillä, propionyylillä , butyryylillä jne., 3. Näiden peptidien amideja, valinnaisesti alkyy1i-substituoi-tuja, kuten sub stituoimattornia amideja tai mono- tai di-alkyyli(1-6C) amideja, esim. mono- tai dimetyyliamideja, ä. Näiden peptidien estereitä, jotka on johdettu aiifaattisista tai aralifaattisista alkoholeista, joissa on 1-18 C-atomia, 5. Metallikomplekseja, jotka on muodostettu saattamalla tässä tarkoitettuja peptidejä kosketukseen metallin, edullisesti sinkin, niukasti liukenevan suolan, hydroksidin tai oksidin kanssa.

Happoadditiosuolat saadaan saattamalla tässä tarkoitetut peptidit reagoimaan farmaseuttisesti hyväksyttävän hapon, kuten halogeeni-vedyn, fosforihapon, etikkahapon, maleiinihapon , viinihapon tai sitruunahapon kanssa.

Tämän keksinnön peptidejä ja edellä määriteltyjä johdannaisia voidaan antaa sekä suun kautta että ruoansulatuskanavan ulkopuolisesti. Peptidejä käytetään edullisesti ruiskeena annettavina valmisteina, jota tarkoitusta varten ne liuotetaan, suspendoidaan tai emulgoidaan sopivaan nesteväliaineeseen. Sekoitettuna sopivien kantajien tai täyteaineiden kanssa, ne voidaan saattaa myös muotoon, joka on sopiva suun kautta annettavaksi, kuten pillerit, tabletit tai rakeet. Tässä tarkoitettuja peptidejä voidaan antaa myös peräpuikon tai suihkeen muodossa.

Keksinnön muka i siä peptidejä tai peptidi-johdannaisia käytetään edullisesti ruoansulatuskanavan ulkopuolisesta päivittäisen annoksen ollessa väliltä 0,31 pg - 1 mg ja suun kautta päivittäisenä annoksena väliltä 0,1 mg - 53 mg/kg kehon painoa, riippuen peptidin vaikutustasosta.

Erityisen arvokkaita valmisteina saadaan, kun nämä peptidit käsitellään muotoon, jossa vaikutusaikaa on pidennetty. Tässä yhteydessä tarkoitetaan erityisesti peptidien metallikomplekseja. Näitä metalli-komplekseja voidaan saada saattamalla peptidit kosketukseen niukkaiiu-koisten metallisuolojen, metallihydroksidien tai metallioksidien kanssa. Metallifosfaatteja , metallipyrofosfaatteja metai1ipolyfosfaatteja käytetään yleensä niukkaliuokoisina metaliisuoloina.

Metalleja, joita voidaan käyttää tässä käsittelyssä, ovat metallit, jotka kuuluvat siirtymäalkuaineisiin, esimerkiksi koboltti, nikkeli, kupari, rauta ja edullisesti sinkki sekä myös metallit, jotka

II

τ 67366 kuuluvat jaksottaisen järjestelmän pääryhmiin ja jotka pystyvät muodostamaan komplekseja, kuten magnesium ja alumiini. Näiden metallikomplek-sien valmistus tapahtuu tavalliseen tapaan.

Metallikompleksi voidaan esimerkiksi saada 1isäämällä peptidiä ja niukkaliukoista metallisuolaa , metai1ihyroksidia tai netallioksidia vesipitoiseen väliaineeseen. Metallikompleksi saadaan myös lisäämällä alkalinen väliaine peptidin ja liukoisen metallisuolan vesipitoiseen liuokseen, minkä tuloksena muodostuu liukenematon peptidi-metallihyd-roksidikompleksi.

Metallikompleksi voidaan lisäksi saada lisäämällä peptidi, liukoinen metallisuola ja muu liukoinen suola vesipitoiseen, edullisesti alkaliseen väliaineeseen, jolloin muodostuu in situ liukenematon peptidi-metalli suolakompiek s i.

Metallikompleks it voidaan välittömästi käyttää suspensioina, tai voidaan esimerkiksi kuivata jäädyttäen tai myöhemmin suspendoida uudestaan.

A:n määritelmä käsittää tähteet Met, de samino-Met, tähteiden Met ja desamino-Met vastaavan sulfoksidin ja sulfonin sekä myös aminohappotähteen H^N-B-CO, jossa B on haarautunut tai haarautumaton aikeeni- tai alkylideeni-osa , jossa on 1-6 hiiliatomia, ja edullisesti 1-5 hiiliatomia. Jälkimmäinen aminohappotähde käsittää edullisesti luonnolliset Ck-aminohappotähteet Gly, Ala, Vai, Leu ja Ile, sekä myös muita tähteitä, kuten p~Ala tai (os-Me)Ala.

Aminohappotähteet HN-CHR^-CO ja HN-CHR^-CO tämän keksinnön mukaisissa peptideissä edustavat samoja tai eri alifaattisia G^-aminohap-pätähteitä. Edullisia aminohappotähteitä tässä yhteydessä ovat ne, joissa R^ ja R0 ovat vety tai alkyyli (l-U C) ja erityisesti luonnon aminohappotähteet Gly, Vai, Leu, Ile ja erityisesti Ala.

Ok-aminotähde Q, joka on määritelty HN-CHR-CO:ksi , keksinnön peptideissä, käsittää luonnolliset aminohapot Ala, Vai, Leu, Ile, Tyr, Trp ja Phe. Aminohappotähteet Phe , Leu ja ne tähteet, joissa R on alempi alkyyliryhmä (l-U C), erityisesti Ala (R = CH^) ovat edullisia.

Keksinnön peptidien esterit johdetaan edullisesti alkanoleista, joissa on 1-8 hiiliatomia, ja erityisesti l-U hiiliatomia, kuten metano-lista, etanolista, propanolista ja butanolista ja niitä voidaan valmistaa esteröimällä lopullinen peptidi tai esteröimällä kyseessä oleva 1ähtöaminohappo , jolloin esteriosa voi toimia suojaryhmänä peptidisyn-teesin aikana. Amideja valmistetaan samalla tavalla joko lopullisen esterin aminolyysillä tai aloittamalla peptidisynte e si kyseessä olevan aminohapon amidista.

E

67366'

Yleisen kaavan I peptideistä ovat edullisia ne peptidit, joissa R^ ja Rj edustavat samanlaisia ryhmiä, esimerkiksi metyyliä (joka antaa aminohappotähteen Ala), isopropyyliä (joka antaa aminohappotähteen Vai) tai 2-metyylipropyyliä (joka antaa aminohappotähteen Leu).

Yleisessä kaavassa I on "A" edullisesti L-Met tai desamino-Met, tai näistä kahdesta happotähteestä johdettuja sulfoksideja tai sulfoneja.

Symboli "Q" yleisessä kaavassa I edustaa edullisesti jompaakumpaa aminohappotähteistä L-Phe tai L-Ala.

Symboli "Z" yleisessä kaavassa I on edullisesti aminohappotähde L-Phe-OH tai valinnaisesti peptiditähde L-Phe-Gly-OH, vaikkakin tämä jälkimmäinen vapaa valinta edustaa lisäystä ketjun pituudessa ilman muuta aktiivisuuden lisääntymistä.

Tässä mainituista keksinnön peptideistä ovat erityisen edullisia seuraavat: H-L-Met-L-Ala-L-Ala-L-Phe-D-Lys-L-Phe-OH, H-L-Met(0)-L-Ala-L-Ala-L-Phe-D-Lys-L-Phe-OH, H-L-Met(02)-L-Ala-L-Ala-L-Phe-D-Lys-L-Phe-OH, H-Met-L-Ala-L-Ala-L-Ala-D-Lys-L-Phe-Gly-OH, H-L-Met(0)-L-Ala-L-Ala-L-Ala-D-Lys-L-Phe-Gly-OH, H-L-Met(02)-L-Ala-L-Ala-L-Ala-D-Lys-L-Phe-OH, desamino-Met-L-Ala-L-Ala-L-Phe-D-Lys-L-Phe-OH, desamino-Met(Og)- L-Ala-L-Ala-L-Phe-D-Lys-L-Phe-OH, desamino-Met(0)-Ala-L-Ala-L-Phe-D-Lys-L-Phe-Gly-OH.

Seuraavat huomautukset on tehty myöhemmin seuraavia esimerkkejä varten.

I. Jos optista muotoa ei ole annettu, tarkoitetaan L-muotoa.

II. Seuraavat lyhennykset on annettu käytetyille suoja- ja aktivoi-misryhmille s

Boc * tertiäärinen butyylioksikarbonyyli t3U = tertiäärinen butyyli = metyyli ONp = p-nitrofenyylioksi

Bzl = hentsyyli

Onb = nitrobentsyylioksi

Qgu = sukkiiniamidi-N-oksi 1 = bentsyylioksikarbonyyli.

9 67366 III. Seuraavat lyhennykset on annettu käytetyille liuottimille tai reagensseille:

Bz = bentseeni

To = tolueeni

EtOH = etanoli

Bu = butanoli

Py = pyridiini

Ac = etikkahappo

EtOAc = etyyliasetaatti

Fo = muurahaishappo

Am = amyylialkoholi iPro = isopropanoli DMF = dimetyyliformamidi THF = tetrahydrofuraani DCCI * disykloheksyylikarbodi-imidi DCHU = disykloheksyyliurea TAA = trietyyliamiini TFA = trifluori-etikkahappo

Wa = vesi NEM * N-etyylimorfoliini HOBt = N-hydroksibentstriatsoli IV. Seuraavia lyhennyksiä on käytetty aminohapporyhmille:

Met = metionyyli

Met(->>,0) = metionyylin sulfoksidi

Met(—>0^) = metionyylin sulfoni

Phe = fenyylialanyyli

Tyr = tyrosyyli

Lys = lysyyli

Trp = tryptofyyli

Gly = glysyyli

Vai » valyyli

Leu = leusyyli

Ala = alanyyli

Ile = isoleusyyli β-Ala- = β-alanyyli (a-Me)Ala = a-metyylialanyyli.

Γ 10 6 7 3 6 6 V. Seuraavia lyhennyksiä on käytetty ryhmistä, jotka ovat sukua aminohappotähteille: PPA = N-(3-fenyylipropyyli)amino PEA = N-(2-fenyylietyyli)amino HPEA = N-(p-hydroksifenyylietyyli)amino

Amf = N-(2-fenyyli-isopropyyli)amino, johdettu amfetamiinista

Tra = N-(p-indolyylietyyli)amino, johdettu trypt- amiinieta desamino-Met = desamino-metionyyli desamino-Met(—> 0) = desamino-metionyylin sulfoksidi (tai 4-metyylisulfinyylibutyryyli) desamino-Met(—>02) = desamino-metionyylin sulfoni (tai 4-metyylisulfonyylibutyryyli).

Lähtöaineiden valmistus I. N-terminaalinenosa 1. Boc-Met-Ala-Ala-NgH^ a) . Boc-Ala-Ala-OMe: 20,79 S Boc-Ala-OH liuotetaan 150 ml:aan DMP. Jäähdyttämisen jälkeen -10°C:seen, lisätään 15,84 ml TAA, mitä seuraa 10,45 ml etyyliklooriformiaattia. Seosta sekoitetaan 10 minuuttia -10°C: ssa, minkä jälkeen lisätään liuos, jossa on 13*9 g H-Ala-OMe.HCl 150 ml:ssa DMF ja 14*4 ml:ssa TAA, reaktioseokseen ja seosta sekoitetaan vielä 15 minuuttia -10°Gsssa, kaksi tuntia 0°C:ssa ja lopuksi kahdeksan tuntia huoneen lämpötilassa. Jäähdyttämisen jälkeen -10°C:seen, TAA.HC1 suodatetaan erilleen ja suodos haihdutetaan kuiviin. Jäännös liuotetaan 250 ml:aan metyyliasetaattia ja pestään peräkkäin vedellä, HCl:llä (0,05N), K^CO^-liuoksella (3 i°) ja NaCl-liuoksella (30 $). Kuivaamisen jälkeen NagSO^llä suodos haihdutetaan ja jäännös kiteytetään eetteri/petrolieetteristä.

Saalis 19,3 8i sulamispiste 108/ll0°C.

Rf To:EtOH:ssa (8:2) = 0,50 Si02:lla, b) . H-Ala-Ala-OMe.HCl: 18,75 8 Boc-Ala-Ala-OMe ((a):sta) liuotetaan 150 ml:aan meteenikloridia ja HC1 johdetaan liuokseen 45 minuuttia jatkuvasti jäävedessä jäähdyttäen.

Suojaamattoman tuotteen saanto lU,3 g.

Rf To:EtOH: ssa (8:2) = 0,01 SiO^lla.

6 7 3 6 6 c). Boc-Met-Ala-Ala-OMe: 15»S g Boc-Met-N^H^, liuotettuna 150 ml:aan DMF, aktivoidaan -20°C:ssa 28,0 ml:lla 4»2N HC1 THF:ssa ja 8,10 ml:lla isoamyylinitriittiä. 20 minuutin aktivoinnin jälkeen -15°C:ssa liuos neutraloidaan 14,5 ml:11a NEM, minkä jälkeen lisätään liuos, jossa on 14,3 g H-Ala-Ala-OMe.HCl ((b):sta) 75 ml:ssa DMF, ja leq. NEM. Sen jälkeen, kun pH on säädetty 7,2:een NEMilla reaktioseosta pidetään 48 tuntia noin 4°C:ssa. 48 tunnin kuluttua NEM.HC1 suodatetaan erilleen ja suodos haihdutetaan, Jäännös liuotetaan 300 ml:aan etyyliasetaattia, minkä jälkeen se pestään vedellä, 0,005N HCl:llä, 5-prosenttisella NaHC0^:lla ja jälleen vedellä.

Kuivaamisen jälkeen Na2S0^:llä suodos haihdutetaan kuiviin ja jäännös kiteytetään etyyliasetaatti/petrolieetteristä (l:l).

Saanto.16,2 g; sulamispiste 128-129°C.

Rf To:EtOH; ssa (8:2) = 0,46 SiO^lla.

d}. Boc-Met-Ala-Ala-N„H„: 15,9 g Boc-Met-Ala-Ala-OMe (kohdasta c) ' - ά—$ liuotetaan ΙβΟ ml:aan metanolia ja lisätään 16,0 ml hydratsiinihydraattia.

3,5 tunnin sekoittamisen jälkeen lisätään 200 ml kuivaa eetteriä. Jäähdyttämisen jälkeen 0°C:seen suodatetaan jähmeä aine erilleen.

Saanto 12,6 g; sulamispiste 207-208°C.

Rf Am:iPro:Va: ssa (10:4*5) 0,41 SiO^lla.

Seuraavat peptidit valmistetaan samalla tavalla kuin I.l:ssa esitettiin : 2. Boo-Ala-Ala-Ala-NgH^;

Rf Am:iPro:Wa:ssa (10:4*5) * 0,44 3. Boc-Val-Ala-Ala-NgH^;

Rf Am:iPro:Wa:ssa (10:4*5) =0,40 4. Boc-Ala-Leu-Leu-N2H^{

Rf Am:iPro:Wa:ssa (10:4*5) * 0,38 5. Boc-Met-Ala-Leu-N^H^;

Rf Am:iPro:Wa:ssa (10:4*5) =0,39 6. Boc-Met-Val-Val-^H^»

Rf Am:iPro:Wa:ssa (10:4*5) = 0,38 7. Boc-Met(02)-Ala-Ala-N2H^;

Rf Am:iPro:Wa:ssa (10:4*5) = 0,30 8. Desamino-Met-Ala-Ala-NgH^j

Rf Am*iPro:Wa:ssa (10:4*5) = 0,34 67366 12 9. Desamino-Met(02 ^Ala-Ala-N^H^;

Rf Am:iPro:Wasssa (10:4s 5) =0,23 II. C-terminaalinenosa 1. H-Phe-D-Lvs(Boc)-Phe-OtBu:n synteesi 1) Z-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu 10,03 g Z-D-Lys(Boc)-ONP liuotetaan 50 ml:aan DMF ja liuos lisätään jäähdyttämisen jälkeen -20°C:seen liuokseen, jossa on 4,1 g H-Phe-OtBu 75 ml:ssa DMF. Yhden tunnin sekoittamisen jälkeen 0°C:ssa ja vielä 20 tunnin sekoittamisen jälkeen 20°C:ssa reaktioseos haihdutetaan. Keltainen jäännös liuotetaan etyyliasetaatti/veteen ja pestään 5-prosenttisella kaliumkarbonaatilla, vedellä, 5-prosenttisella sitruunahapolla ja jälleen vedellä. Orgaaninen faasi kuivataan ja haihdutetaan. Jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja lisätään petrolieetteriä (40-60) kunnes liuos samenee. Syntynyt saostuma suodatetaan sen jälkeen erilleen.

Rf To:EtOH:ssa (9sl) = 0,63 (Si02).

2) H-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu 3 g dipeptidiä liuotetaan 60 ml:aan metanolia. Sen jälkeen, kun on lisätty 10-prosenttista palladium/hiiltä johdetaan vetyä, kunnes COgJn kehittyminen lakkaa (kaksi tuntia). Suodattamisen jälkeen hyflolla suodos haihdutetaan, jolloin saadaan vaahto.

Rf To:EtOH:ssa (9:l) = 0,21 (SiOg).

3) Z-Phe-C-Lys(Boc)-Phe-OtBu 2,18 g Z-Phe-ONP liuotetaan 15 ml:aan DMF. Sen jälkeen, kun on lisätty liuos, jossa on 2,24 g H-D-Lys(Boc)-Phe-0tBu (kohdassa 2) 30 ml:ssa DMF, seosta sekoitetaan 15 minuuttia 20°C:ssa.

Keltaisen liuoksen kuiviin haihduttamisen jälkeen jäännös liuotetaan 15 ml:aan etyyliasetaattia, minkä jälkeen lisätään 50 ml petrolieetteriä. Seoksen annetaan tämän jälkeen seistä kahdeksan tuntia 0°C:ssa, minkä jälkeen muodostunut saostuma suodatetaan erilleen. Sulamispiste 135-138°C.

4) H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu 2,5 S kohdassa 3) saatua tripeptidiä hydrataan kohdassa 2) kuvatulla tavalla.

Rf To:EtOH: ssa (8:2) = 0,38 (SK>2).

Il 15 67366 2. H-Leu-D-Lys(Boc)-Phe-QtBu 1) Z-Leu-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu Z-Leu-ONP (3,2 g) liuotetaan 40 ml:aan DMF. 3,6 g H-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu lisätään sitten liuokseen, minkä jälkeen seosta sekoitetaan 20 tuntia huoneen lämpötilassa. Reaktioseoksen haihduttamisen jälkeen jäännös liuotetaan 100 ml:aan etyyliasetaattia ja saatu liuos pestään 10-prosent-tieella ^CO^-liuoksella, 30-prosenttisella NaCl-liuoksella, sitruunahap-poliuoksella ja jälleen 30-prosenttisella NaCl-liuoksella. Etyyliasetaat-tiliuos kuivataan sitten ja haihdutetaan pienempään tilavuuteen, minkä jälkeen väkevöitteeseen lisätään petrolieetteriä. Muodostunut saostuma suodatetaan erilleen. Sulamispiste 102-105°C.

Saanto k ,Q g.

2) H-Leu-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu

Kohdassa l) saatu tripeptidi hydrataan Pd/C (10 $) katalyyttinä kohdalla II.1.2. kuvatulla tavalla.

Rf To:EtOH:ssa (8:2) *= 0,41 SiOgSlla.

3. H-Ala-D-Lvs(Boc)-Phe-OtBu 2,8 g Z-Ala-ONP liitetään 3,6 g:aan H-D-Lys(Boc)-Phe-OtBu samalla tavalla kuin kohdassa 2 kuvattiin ja saatu suojattu tripeptidi hydrataan.

Rf To:EtOH:ssa (8:2) = 0,37 SiO^lla.

4. H-Leu-D-Lys(Boc)-Tra 1. Z-Leu-D-Lys(Boc)-Tra Z-Leu-D-Lys(Boc)-Tra saadaan II.1.3:ssa kuvatulla tavalla lähtien 3,1 g:sta Z-Leu-ONP ja 3 g:sta H-D-Lys(Boc)-Tra (valmistettu Z-D-Lys(Boc)-Tra:sta).

Saanto 6 5 %.

Rf To:EtOH:ssa (8:2) = 0,72 SiO^lla.

2. H-Leu-D-Lys(Boc)-Tra 2 g peptidiä (kohdasta l) liuotetaan 25 ml:aan metanolia ja hydrataan 10-prosenttisen palladium/hiilen läsnäollessa II.1.2:ssa kuvatulla tavalla. Kuiviin haihduttaminen antaa vaahdon.

Saanto 9 3 %.

Rf To:EtOH:ssa (8:2) = 0,47 (Si02).

67366 14 5. H-Phe-D-Lys(Boc)-Tra

Samoin kuin 4*ssä.

Hf To:EtOH:ssa (θ:2) - 0,33· 6. H-Ala-D-Lys(Boc)-Tra

Samoin kuin 4*esät

Rf To:EtOH:ssa (8:2) = 0,35.

7. H-Tyr-D-Lys(Boo)-Tra

Samoin kuin 4*ssä.

Rf TosEtOHsssa (8:2) = 0,24·

8. H-Leu-D-Lys(Boc)-Trp-OMe; H-Leu-D-Lys(Boc)-Trp-OH

1. Z-Leu-D-Lys(Boc)-Trp-OMe 5,57 g Z-Leu-OH liuotetaan 50 ml:aan DMF ja liuoksen jäähdyttämisen jälkeen 0°Csseen lisätään 3»0 ml TAA ja 2,0 ml etyyliklooriformiaattia. Reaktioseosta sekoitetaan 15 minuuttia, minkä jälkeen lisätään 8,64 g H-D-Lys(Boc)-Trp-OMe 50 ml:ssa DMF -10°C:ssa ja seosta sekoitetaan tässä lämpötilassa 30 minuuttia. Vielä kaksituntisen sekoittamisen jälkeen 0°C:ssa ja sen jälkeen noin viiden tunnin sekoittamisen jälkeen huoneen lämpötilassa seos suodatetaan ja suodos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan sitten etyyliasetaattiin ja saatu liuos pestään peräkkäin vedellä, 5-prosentti-sella NaHCO^-liuoksella, vedellä, C,1N HCl:llä ja 30-prosenttisella NaCl-liuoksella.

Liuos kuivataan sitten ja haihdutetaan (öljy).

Saanto 10,5 g.

Rf To:EtOH: ssa (9:l) - 0,41 Sioilla.

2. Z-Leu-D-Lys(Boc)-Trp-OH

Tripeptidiesteri kohdasta 1 (5 g) liuotetaan 100 ml:aan dioksaa-nia, minkä jälkeen lisätään 15*5 nil 0,94N NaOH. Reaktioseosta sekoitetaan kaksi tuntia huoneen lämpötilassa ja pH säädetään 7: ään 2N HCl:llä. Dioksaani poistetaan sen jälkeen haihduttamalla ja jäännökseen lisätään etyyliasetaatti/vettä. Seos (vesipitoinen kerros) tehdään sitten happamek-si (pH 2) erottamatta kerroksia. Orgaaninen faasi pestään 10-prosentti-sella NaCl-liuoksella ja kuivataan sitten. Poistamalla liuotin tislaamalla saadaan vaahto.

Saanto 3,6 g.

Rf To:EtOH: ssa (8:2) = 0,38 SiO^lla.

Il 67366 15

3· H-Leu-D-Lys(Boc)-Trp-OH

5,15 g kohdassa 2 saatua tripeptldiä liuotetaan 50 ml:aan DMF ja 1,67 ml:aan 4N HC1. Sitten liuokseen lisätään 50 mg Pd/C (lO °Jo) ja sen läpi johdetaan vetyä neljä tuntia. Katalyytti suodatetaan sitten eroon ja suodos haihdutetaan (öljy).

Rf TorEtOH:ssa (9:1) * 0,10 Si02:lla.

4. H-Leu-D-Lys(Boc)-Trp-0Me

Peptidiesteri kohdasta 1 hydrataan kohdassa 3 kuvatulla tavalla, jolloin saadaan öljy.

Rf Am:Py:Va:ssa (5:3:2) = 0,29 Sioilla.

9. H-Leu-D-LysCBotO-fenyylialkyyllamidien valmistus

1. Z-D-Lys(Boc)-PPA

10,33 β (20,6 mmoolia) Z-B-Lys(Boc)-ONP liuotetaan 80 ml:aan me-teenikloridia n. 0°C:ssa. Sitten lisätään 2,7 g 3-fenyylipropyyliamiinia tähän liuokseen, minkä jälkeen seosta sekoitetaan 1,5 tuntia 0°C:ssa ja vielä 18 tuntia huoneen lämpötilassa. Liuotin poistetaan haihduttamalla ja jäännös liuotetaan 200 ml:aan etyyliasetaattia. Etyyliasetaattiliuos pestään nyt peräkkäin natriumkarbonaattiliuoksella (10 $), NaCl-liuoksel-la (30 io), 0,1N HCl:llä ja 30-prosenttisella NaCl-liuoksella, minkä jälkeen etyyliasetaattikerros kuivataan ja haihdutetaan n. 80 ml:n tilavuuteen. Sitten lisätään riittävästi eetteriä aikaansaamaan samentuminen ja seos pannaan jääkaappiin. Muodostunut sakka suodatetaan pois kahden tunnin kuluttua.

Rf Bz:Et0H:sea (9:1) = 0,50 SiO^lla.

2. H-D-Lys(Boc)-PPA

8,75 g kohdassa 1 saatua yhdistettä liuotetaan 120 ml:aan metano-lia, johon on lisätty 1,2 g 10-prosenttista palladium/hiiltä. Sitten johdetaan liuoksen läpi vetyä 3,5 tuntia sekoittaen, minkä jälkeen katalyytti suodatetaan pois, Suodoksen haihduttamisen jälkeen saadaan miltei väritön öljy, joka välittömästi käytetään jatkoreaktioita varten.

Rf Am:Fo:Wa:ssa (7:2:l) = 0,54 SiO^lla.

3. Z-Leu-D-Lys(Boc)-PPA

6,59 g kohdassa 2 saatua suojattua aminohappojohdannaista liuotetaan 68 ml:aan dimetyyliformamidia ja lisätään liuos, jossa on 7,0 g Z-Leu-ONP 20 ml:ssa dimetyyliformamidia. Seosta sekoitetaan huoneen lämpötilassa 16 67366 20 tuntia, minkä jälkeen liuotin poistetaan haihduttamalla tyhjössä. Jäännös liuotetaan 170 ml:aan etyyliasetaattia ja pestään peräkkäin 5-prosent-tisella kaliumkarbonaattiliuoksella, 30~prosenttisella NaCl-liuoksella, 0,1N HCl:llä ja 30-prosenttisella NaCl-liuoksella. Etyyliasetaattikerros kuivataan sitten NagSO^illä ja haihdutetaan.

Rf Bz :Et0H: ssa (8:2) = 0,64 SiO^lla.

4. H-Leu-D-Lys(Boc)-PPA

9,0 g kohdassa 3 saatua peptidi-johdannaista liuotetaan 300 ml:aan dimetyyliformamidia, johon on lisätty 4 ml 4N HC1 ja 1,5 g 10-prosenttis-ta palladium/hiiltä. Sitten johdetaan sekoittaen vetyä 3*5 tuntia, minkä jälkeen katalyytti suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan antamaan miltei väritön öljy.

Rf Bu:Ac:Wa:ssa (4*1:1) = 0,55 SiO^illa.

5« Seuraavat valmistetaan vastaavalla tavalla: 1. H-Leu-D-Ly3(Boc)-L-Amf;

Rf To:Et0H:ssa (8:2) = 0,50 Sioilla.

2. H-Leu-D-Lys(Boe)-PEA;

Rf To:EtOH: ssa (8:2) = 0,42 Sioilla.

3. H-Leu-D-Lys(Boc)-HPEA;

Rf 'To:EtOH: ssa (8:2) * 0,34 SiO^lla.

10. H-Fhe-D-Lys(Boo)-Phe-Gly-QH:n synteesi a) . Z-Phe-D-Lys(Boc)-OMe: 29,9 g Z-Phe-OH ja 14,8 g HOBt liuotetaan 200 ml:aan DMF, Jäähdyttämisen jälkeen -22°C:seen lisätään peräkkäin seuraavat: liuos, jossa on 3^,6 g H-D-Lys(Boc)-OMe.ECl 210 ml:ssa DMF ja leq. TAA:s3a, sekä liuos, jossa on 22,7 g DCCI 100 ml:ssa DMF. Seosta sekoitetaan 15 minuuttia -22°C:ssa, kaksi tuntia 0°C:ssa ja n. 16 tuntia huoneen lämpötilassa.

Jäähdyttämisen jälkeen muodostunut DCHTJ suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan etyyliasetaattiin ja pestään vedellä, 5-prosenttisella sitruunahapolla, 5-pr°senttisella natriumbikarbonaatilla ja jälleen vedellä, minkä jälkeen liuos haihdutetaan ja kiteytetään.

Saanto: 51*6 g| sulamispiste 122-123°C.

b) . Z-Phe-D-Lys(Boc)-0H: 13,7 g Z-Phe-D-Lys(Boc)-OMe kohdasta a), liuotetaan 180 ml:aan dioksaani/H^O (9*l) ja lisätään 15 ml 2N NaOH. Seosta sekoitetaan kaksi tuntia huoneen lämpötilassa, minkä jälkeen reak-

II

67366 17 tioseoksen pH asetetaan 78ään NHClsllä. Reaktioseoksen tilavuus pienennetään sen jälkeen n. 50 ml:ksi (dioksaani-vapaa) ja lisätään 250 ml etyyliasetaattia. Seos pestään vedellä ja kuivataan NaoS0.:llä. Na^SO. suoda-tetaan pois ja suodos haihdutetaan. Jäännös kiteytetään eetteri/petroli-eetteristä (1:5)-

Saanto: 11,5 8i sulamispiste 72-75°C.

Rf To:EtOH:ssa (8:2) * 0,12 SiOg^la, ja Am:Py:Wa:ssa (5 * 38 2) = 0,69 SiOgilla.

c) . Boc-Phe-Gly-OBz1: leq. NEM) jota seuraa liuos, jossa on 25,5 8 Boc-Phe-ONP 100 mlsssa DMF, lisätään liuokseen, jossa on 12,6 g H-Gly-OBzl.HCl 100 ml:ssa DMF. Sekoittamisen jälkeen yli yön huoneen lämpötilassa reaktioseos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan JOO ml saan etyyliase-taatti/vettä (5:l) ja pestään vedellä.

Kuivaamisen jälkeen Na2S0^:llä suodoksen tilavuus alennetaan haihduttamalla n. 100 mltksi, minkä jälkeen lisätään 50 ml petrolieetteriä ja 250 ml kuivaa eetteriä.

Saanto :16,7 Si sulamispiste 126-127°C.

Rf To:EtOH:ssa (8:2) * 0,56 SiO^lla.

d) . H-Phe-Gly-OBzl.HCl: 8,25 S Boc-Phe-Gly-OBzl liuotetaan 120 ml: aan meteenikloridia ja HCl-kaasua johdetaan liuokseen sekoittaen ja jäähdyttäen (jää/vesi) yksi tunti.

Tunnin kuluttua HCl:n johtaminen lopetetaan ja reaktioseos haihdutetaan.

Saanto: 6,99 8 vaahtomaista tuotetta.

Rf To:EtOH: ssa (8:2) = 0,35 SiO^lla.

e) . z-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OBzl: Menetelmä sama kuin kohdassa a), kuvattu menetelmä. Tarvittavat reagoivat aineet: 9,25 S Z-Phe-D-Lys(Boc)-OH (kohdasta b).)f 2.92 g HOBt 6,98 g H-Phe-Gly-OBzl.HCl ja 4,12 g DCCI. Kiteyttäminen etyyliasetaatti/petrolieetteristä.

Saanto :12,0 g{ sulamispiste 157-159°C.

Rf To:EtOH: ssa (8:2) - 0,39 SiO^lla.

f) . H-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH: 4,U 8 Z-Phe-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OBzl liuotetaan 75 mitään DMF. Pd/C:n lisäämisen jälkeen johdetaan vetyä kolme tuntia. Katalyytti suodatetaan pois hyflo/asbestilla ja suodos haihdutetaan.

67366 18

Saanto 2,9 g·

Rf Bu iPy: Ac:Wa: esa (4*0,75*0,25*1) “ 0,46 SiO^lla.

Seuraavat peptidit valmistetaan edellisissä esimerkeissä kuvatulla tavalla: 11. H-Trp-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;

Rf Bu:Py:Ac:Wa:ssa (4*0,75*0,25*1) = 0,52 SiO^slla.

12. H-Leu-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;

Rf Bu:Py:Ac:Wa:ssa (4*0,75*0,25*1) = 0,40 SiO^slla.

13. H-Val-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;

Rf Bu:Py:Ac:Wa:ssa (4*0,75*0,25*1) = 0,42 SiOgSlla.

14. H-Ala-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;

Rf Bu:Py:Ac:Wa:ssa (4*0,75*0,25*1) = 0,37 SiO^^lla.

15· H-Tyr-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH;

Rf Bu:Py:Ac:Wa:ssa (4*0,75*0,25*1) * 0,48 SiO^slla.

Esimerkki I

H-Met-Ala-Ala-Ala-D-Lvs-Phe-Gly-OH

a) . Boc-Met-Ala-Ala-Ala-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH (i.l. + II.14) 1,62 g Boc-Met-Ala-Ala-N^H^ liuotetaan 20 ml:aan DMF. Jäähdyttämisen jälkeen -20°G:seen lisätään 1,68 ml 4,74N HCl/THF, mitä seuraa 0,60 ml isoamyylinitriittiä, ja seosta sekoitetaan 20 minuuttia —15 C:ssa, minkä jälkeen lisätään 0,6 ml NEM, mitä seuraa liuos, jossa on 2,3 g H-Ala-D-Lys(Boc)-Phe-Gly-OH 20 ml:ssa DMF ja 1,68 ml 4,74H HCl/THF. Reak-tioseoksen pH säädetään 7,2:een REM:11a, minkä jälkeen reaktioseosta pidetään kaksi päivää n. 4°C:ssa. NEM.HC1 suodatetaan sitten pois ja suo-dos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan 125 ml:aan sek.butanoli/CHCl^ (2:3) ja 25 ml:aan H^O ja saatu liuos pestään peräkkäin vedellä, 5-prosentti-sella sitruunaheppoliuoksella ja jälleen vedellä. Kuivaamisen jälkeen Ha_S0„:llä suodos haihdutetaan. Jäännös liuotetaan 40 ml:aan metanolia, 2 4 johon sitten lisätään 160 ml vettä, minkä jälkeen jähmeä aine suodatetaan erilleen ja kuivataan.

Saanto 2,6 g; sulamispiste 202-203°C (hajoaa).

Rf Bu:Py:Ac: Wa: ssa (4*0,75*0,25*1) = 0,62 SiOg^la.

b) . H-Met-AIa-Ala-Ala-D-Lys-Phe-OH-asetaatti 2,6 g kohdassa a), saatua peptidiä liuotetaan 25 ml:aan 90-prosent-

II

67366 19 tista TPA. 45-®inuuttisen sekoittamisen jälkeen huoneen lämpötilassa typ-piatmosfäärissä liuos lisätään tiputtaen 250 ml:aan kuivaa eetteriä. Syntynyt sakka suodatetaan erilleen ja kuivataan, minkä jälkeen kiinteä aine liuotetaan 40 ml:aan tert. butanoli/vettä (l:l) ja saatua liuosta sekoitetaan ioninvaihtohartsin kanssa asetaattimuodossa. JO minuutin sekoittamisen jälkeen ioninvaihtohartsi suodatetaan pois ja suodos haihdutetaan. Jäännös puhdistetaan sitten vastavirtaperiaatteella.

Saanto 76 %.

Rf Bu:Py:Ac:Wa:ssa (4*0,75*0,25:1) * 0,25 SiO^slla.

Esimerkki II

Seuraavat peptidit valmistetaan asetaattisuoloinaan tavalla, joka vastaa esimerkissä I kuvattua: 1. H-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH (i.l + II.10)

Rf = 0,24 2. H-Met-Ala-Ala-Trp-D-Lys-Phe-Gly-OH (I.l + II.11)

Rf = 0,27 3. H-Met-Ala-Ala-Leu-D-Lys-The-Gly-OH (i.l + 11.12)

Rf = 0,22 4. H-Met-Ala-Ala-Val-D-Lys-Phe-Gly-OH (I.l + II.13)

Rf = 0,18 5. H-Met-Ala-Ala-Tyr-D-Lys-Phe-Gly-OH (I.l + II.15)

Rf = 0,23 6. H-Ala-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH (1.2 + II.lO)

Rf = 0,21 7. H-Val-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH (1.3 + II.lO)

Rf = 0,26 8. H-Ala-Ala-Ala-Ala-D-Ly s-Phe-Gly-OH (l,2 + II.14)

Rf = 0,20 9. H-Ala-Leu-Leu-Leu-D-Lys-Phe-Gly-OH (1.4 + II.12)

Rf - 0,19 10. H-Met-Ala-Leu-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH (ΐ·5 + II.10)

Rf = 0,18 11. H-Met-Val-Val-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH (1.6 + II.10)

Rf - 0,22 12. H-Met(02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH (1.7 + II.lO)

Rf - 0,16 20 6 7 3 6 6 13. desamino-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH (1.8 + II.IO)

Rf = 0,36

14. desamino-Met(02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-0H

Rf = 0,28

Esimerkki III

Seuraavat peptidit valmistetaan asetaatti-suoloinaan tavalla, joka vastaa esimerkissä I kuvattua: 1. H-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-OH (i.l + II.l)

Rf = 0,27 2. H-Met-Ala-Ala-Leu-D-Lys-Phe-OH (i.l + II.2)

Rf = 0,28 3. H-Met(O2)-Ala-Ala-Ala-D-Lys-Phe-0H (1.7 + II.3)

Rf = 0,18 4. H-Met-(02)-Ala-Ala-Leu-D-Lys-Tra (1.7 + II.4)

Rf = 0,11 5. desamino-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Tra (1.8 + II.5)

Rf = 0,14 6. desamino-Met(02)-Ala-Ala-Ala-D-Lys-Tra (1*9 + 11*6)

Rf - 0,18 7. H-Met-Ala-Leu-Tyr-D-Lys-Tra (1.5 + II. 7)

Rf = 0,17 8. H-Met-Ala-Ala-Leu-D-Lys-Trp-OMe (1*1 + II.8)

Rf - 0,31 9. H-Met-Ala-Ala-Leu-D-Lys-Trp-OH (I.l + II.8.3)

Rf =0,18 10. H-Met-Ala-Ala-Leu-D-Lys-PPA (i.l + II.9.4)

Rf = 0,22 11. H-Net-Ala-Ala-Leu-D-Lys-L-Amf (1,1 + II.9.5.I)

Rf = 0,24 12. H-Met-Ala-Ala-Leu-D-Lye-PEA (i.l + 11.9.5.2)

Rf = 0,21 13. E-Ket-Ala-Ala-Leu-D-Lys-HPEA (i.l + II.9.5.3)

Rf = 0,26 14. H-Met(02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-OH (l.7 + II.l)

Rf = 0,19 I! 21 6 7 3 6 6 15. H-Ala-Leu-Leu-Phe-D-Lys-Phe-OH (1.4 + II.l)

Rf = 0,52 16. desamino-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-OH (1.8 + II.l)

Rf = 0,55

Ellei toisin ole osoitettu, ovat Rf:n arvot, jotka on annettu esimerkeissä II ja III, eluentille Bu:PysAc:Wa (4:0,75:0,25:1) Sioilla.

Esimerkki IV Sulfoksidit 0,06 mmoolia peptidiä liuotetaan 5 ml:aan etikkahappoa ja liuokseen lisätään 15 pl 50-Prosen'l:tista vetyperoksidia ja liuosta sekoitetaan tunti huoneen lämpötilassa. Sitten lisätään suspensio, jossa on 20 mg platinamustaa 2,5 ml:ssa jääetikkaa. Seosta sekoitetaan 50 minuuttia, minkä jälkeen se suodatetaan. Suodos haihdutetaan tyhjössä ja jäännös lisätään 10 ml:aan tert.butanoli/vettä. Seos lyofiloidaan sitten. Seuraavien peptidien asetaatit valmistetaan tällä tavalla.

1. H-Met(0)-Ala-Ala-Ala-D-Lys-Phe-Gly-OH

Rf - 0,12

2. H-Met(0)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH

Rf * 0,10

5. H-Met(0)-Ala-Leu-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH

Rf = 0,11

4. desamino-Met(O)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH

Rf = 0,26

5. H-Met(0)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-OH

Rf = 0,15 6. desamino-Met(o)-Ala-Ala-Phe-D-LyS“fra

Rf = 0,15

7. H-Met(0)-Ala-Ala-Leu-D-Lys-PPA

Rf = 0,08

8. desamino-Met(0)-Ala-Ala-Phe~D-Lys-Phe-0H

Rf = 0,19 9. K-Met(0)-Ala-Ala-Leu-D-Lys-Trp-OMe

Rf = 0,21

Rf-arvot on annettu Bu:Py:Ac:Wa:lie (4:0,75:0,25:1) SiOj^la.

22 „ „ 6 7 3 6 6

Esimerkki V Sulfonit 0,2 mmoolia peptidiä liuotetaan seokseen, jossa on 0,5 ml vettä, 0. 1.ml 4N perkloorihappoa ja 0,02 ml 0,5M ammoniummolybdaattia, minkä jälkeen lisätään 0,06 ml 30-prosenttista vetyperoksidia tähän seokseen. Seosta sekoitetaan kaksi tuntia n. 10°C:n lämpötilassa, minkä jälkeen se laimennetaan 25 ml:11a tert.butanoli/vettä. Ioninvaihtohartsi (Dowex X-8 asetaattimuodossa) lisätään sitten seokseen, jota sekoitetaan 30 minuuttia. Seos suodatetaan sen jälkeen ja suodos lyofiloidaan. Tällä tavalla valmistetaan seuraavat asetaatit:

1. Η-Me t(02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-Gly-OH

Rf - 0,18

2. H-Met(02)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-OH

Rf = 0,20

3. desamino-MetiOg)-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-OH

Rf = 0,23

Annetut Rf-arvot ovat Bu:Py:Ac:Wa:lle (4:0,75*0,25:1) SiO^slla.

Esimerkki VI Sinkkikompleksit 1.5 ml sinkkikloridin liuosta, joka sisältää 50 mg sinkkiä/ml, lisätään liuokseen, jossa on 31,5 mg Na^HPO^^HgO 30 mltssa tislattua vettä. Näin muodostunut sinkkifosfaattisakka liuotetaan uudelleen lisäämällä 4R HC1, minkä jälkeen seokseen lisätään 175 mg NaCl ja 0,5 S bentsyylialko-holia. Tähän seokseen liuotetaan sitten 1,5 mg heksapeptidiä H-Met-Ala-Ala-Phe-D-Lys-Phe-OH (esimerkki III,l) ja sen jälkeen lisätään riittävästi N natriumhydroksidia seoksen pH:n säätämiseksi 8,5:een. Tilavuus täydennetään sitten 50 mlrksi tislatulla vedellä.

1 ml suspensiota sisältää: 30 ;jg heksapeptidiä 1.5 mg sinkkiä

0,63 mg Na^HPO^^H^O

3.5 mg NaCl 10 mg bentsyylialkoholia

II

Claims (1)

1. 23 67366 Patenttivaat imus Menetelmä uusien psykofarmakologisesti aktiivisten peptidijoh-dannaisten valmistamiseksi, joilla on kaava A-NH-CH-CO-NH-CH-CO-L-Q-D-Lys-Z (I) I I R1 R2 jossa A on H-L-Met, H-L-Met(—^0 ) , H-L-Met(->02), desamino-Met , desamino-Met-(^JO), de samino-Met (—) tai ryhmä H^N-B-CO, 3 on haaroittunut tai suoraketjuinen 1-6 hiiliatomia sisältävä alky-leeni tai 1-6 hiiliatomia sisältävä alkylideeni, Q on aminohappotähde -NH-CHR-CO, jossa R merkitsee 1-U hiiliatomia sisältävää alkyyliä p-hydroksifenyylimetyyliä , 3-indolyylimetyyliä tai fenyylimetyyliä, R ja R merkitsevät vetyä tai 1-^ hiiliatomia sisältävää alkyyliä, ja Z on N-(fenyylietyyli)amino , N-(/3-indolyylietyyli)amino, L-Trp-OH, L-Phe-OH, L-Trp-Gly-OH tai L-Phe-Gly-OH, tai niiden toiminnallisten johdannaisten valmistamiseksi, joita ovat farmaseuttisesti hyväksyttävät happoadditiosuolat , aiifaattis esta C g-karboksyylihaposta johdetut asyylijohdannaiset , substituoimat-tomat tai alemmalla alkyylillä (1 — 6 C) sub stituoidut amidit, 1-8 hiiliatomia sisältävistä aiifaattisista alkoholeista johdetut esterit, sekä metallikompleksit , jotka on saatu saattamalla peptidi kosketukseen koboltin, nikkelin, kuparin, raudan tai edullisesti sinkin niukkaliukoisen suolan, hydroksidin tai oksidin kanssa, tunnet-t u siitä, että tarvittavat aminohapot, karboksyylihapot , amiinit tai peptidifragmentit yhdistetään oikeassa järjestyksessä a) kondensoimalla kondensoimisaineen läsnäollessa yhdiste (aminohappo, peptidi), joka sisältää vapaan karboksyyliryhmän ja jossa muut reaktiiviset ryhmät on suojattu, yhdisteen kanssa (aminohappo, peptidi tai amiini), joka sisältää vapaan aminoryhmän ja jossa muut reaktiiviset ryhmät samoin on suojattu, tai b) kondensoimalla yhdiste (aminohappo, peptidi), joka sisältää aktivoidun karboksyyliryhmän ja jossa muut reaktiiviset ryhmät on valinnaisesti suojattu, yhdisteen (aminohappo, peptidi, amiini) 2l* 67366 kanssa, joka sisältää vapaan aminoryhmän ja jossa muut reaktiiviset ryhmät on suojattu; minkä jälkeen mahdollinen suojaryhmä (mahdolliset suojaryhmät) poistetaan, ja sen jälkeen näin saatu peptidi mahdollisesti muutetaan edellä määritellyksi toiminnalliseksi johdannaiseksi ja/tai saatu peptidi hapetetaan vastaavaksi peptidisulfoksidik-si tai peptidisulfoniksi, jälkimmäiseksi siinä tapauksessa, että N-terminaalinen ryhmä A on Met tai desamino-Met. li 25 67366 Förfarande för framställning av nya psykofarmakologiskt aktiva peptidderivat med formeln A-NH-CH-CO-NH-CH-CO-L-Q-D-Lys-Z (I) R1 R2 väri A är H-L-Met , H-L-Met(-½0) , H-L-Met(-½ 0^) , desaraino-Met, desamino-Met(—) , desamino-Met (-^0^ ) eller en grupp H^N-B-CO, B är en förgrenad eller rakkedjad alkylen innehällande 1-6 kolatomer, eller alkyliden innehällande 1-6 kclatomer, Q är en aminosyrarest -NH-CHR-CO, väri R betyder alkyl med 1-^ kolatomer, p-hydroxifenylmetyl , 3-indolylmetyl eller fenylmetyl, R^ och R0 betyder väte eller alkyl med 1-U kolatomer, och cl Z är N-(fenyletyl)amino , N-(y3-indolyletyl)amino, L-Trp-CH , L-Phe-OH, L-Trp-Gly-OH eller L-Phe-Gly-OH , eller deras funktionella derivat , vilka utgörs av farmaceutiskt god-tagbara syraadditionssalter, acylderivat härledda frän en alifatisk -karboxylsyra , osubstituerade eller med en lägre alkyl (l-6 C) sub stituerade amider, estrar härledda frän alifatiska alkohoier med 1-8 kclatomer, samt metallkomplex , vilka har erhaliits genom bringande av peptiden i kontakt med ett svärlösligt sait, hydroxid eller oxid av kobo.lt, nickel, koppar, järn eller f ör et räde s vi s zink, k ä n πει e c k n a t därav , att de erforderliga aminosyrorna , karboxylsyrorna , aminerna och peptidfragmenten förenas i riktig ordning a) genom att kondensera i närvaro av ett kondenseringsmedel en förening (aminosyra, peptid), vilken innehäller en fri karboxylgrupp och i vilken de andra reaktiva grupperna är skyddade, med en förening (aminosyra, peptid eller amin), vilken innehäller en fri aminogrupp och i vilken de andra reaktiva grupperna pä samma sätt är skyddade, eller b) genom att kondensera en förening (aminosyra, peptid), vilken innehäller en aktiverad karboxylgrupp och i vilken de andra reaktiva grupperna valfritt är skyddade, med en förening (aminosyra, peptid, amin), vilken innehäller en fri karboxylgrupp och i vilken