DK148355B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af terapeutisk anvendelige n-epsilon-trimethyl-l-lysinsalte - Google Patents

Description

o 1 148355

Den foreliggende opfindelse angår en analogifrem-gangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte, terapeutisk anvendelige salte af N- £-trimethyl-L-lysin med et eller to molekyler asparaginsyre eller glutaminsyre.

5 N- E-trimethyl-L-lysin er en kendt forbindelse, der er blevet påvist i talrige mikroorganismer og dyrearter, herunder Actinomyceter og pattedyr, samt i en mængde forskellige planter, enten i bundet eller i fri form. Den nøjagtige biologiske rolle, som denne forbindelse, der hører til de ba-10 siske aminosyrer af betaintypen, samt de dermed nært beslægtede forbindelser spiller, er hidtil ikke blevet klarlagt éntydigtog er først nyligt beskrevet nogenlunde klart (Tyihak m.fl., Life Science, 20 (1977) 385). N-E-trimethyl-L-lysin er i øvrigt for nylig blevet isoleret fra menneskeplacenta 15 (T. Tomita og K. Nakamura, Z. Physiol. Chem. 358 (1977) 413), og dette kan tyde på, at forbindelsen spiller en fysiologisk eller biokemisk rolle i de voksende organismer.

Den frie N- £-trimethyl-L-lysinbase er skadelig for cellerne, men kan i form af et salt knyttes til en receptor, 20 den er dog inaktiv i in vitro-prøver. Af denne grund er N- £ --trimethyl-L-lysin altid blevet isoleret og anvendt til forskellige undersøgelser i form af salte deraf. Det salt, der er blevet mest undersøgt, er dioxalatet (T. Takemoto m.fl., Yakugaku Zasshi 84 (1964) 1176 , japanske patentskrifter 25 nr. 24.790 (1965), 09.529 (1968) og 28.092 (1968), fransk patentskrift nr. 1.442.318 og M. Takehara m.fl. Nippon kagaku Zasshi 101 (1969)), der er stabilt, men på grund af oxalsyrens velkendte høje toksicitet naturligvis ikke kan anvendes til farmakologiske formål. Andre grundigt undersøgte salte er de 30 tilsvarende mono- og dihydrochlorider (engelsk patentskrift nr. 865.157, fransk patentskrift nr. 1.442.318, J. Puskås og E. Tyihak, Periodics Polytechnica 13 (1969) 261, J.H.

Seely og N.L. Benoiton, Cand. J. Biochem. 48 (1970) 1122, R.A. Cos og C.L. Hoppel, Biochem. J., 136 (1973) 1083).

35 Disse salte er imidlertid meget hygroskopiske, hvilket er meget uheldigt med hensyn til opbevaring og dosering. Andre o 2 148355 kendte salte af N- £-trimethyl-L-lysin, f.eks. hydrobromidet (fransk patentskrift nr. 1.442.318),citratet (H. Ozawa m.fl., Yakugaku Sasshi 87 (1967) 935), di-p-hydroxyazobenzen-p1-sul-phonatet (R.T. Markiw, Biochem. Med. 13 (1975) 23, Y. Kakio-5 moto og S. Akazawa, J. Biol. Chem. 245 (1970) 5751/ T. Tomita og K. Nakamura, Z. Physiol. Chem. 358 (1977) 413), nikotina-tet (fransk patentskrift nr. 1.442.318) og N-acetyl-L-amino-succinatet (fransk patentskrift nr. 1.442.318) er også blevet undersøgt fysisk og fysiologisk. Disse salte er ikke 10 opbevaringsstabile, er stærkt cytotoksiske og er især kendt for at virke fremmende på tumorvækst.

Den foreliggende opfindelse bygger på den ny,overraskende erkendelse, at N- £-trimethyl-L-lysinsalte af aspara-ginsyre eller glutaminsyre, alene eller i kombination med 15 kendte cytostatika, imod det, man fra ovennævnte kendte salte skulle forvente, har vist sig at have en i høj grad ønskelig og gunstig indvirkning in vivo ved bekæmpelse af tumorceller ved bl.a. at reducere anæmi forårsaget af væksten af NK/Ly-tu-morceller og afgifte det cytostatiske middel og herved spe-20 cielt er egnede til intraperitoneal indgift, jvf. tabel I.

Denne virkning forefindes ikke hos alle N-£-trimethyl-L-ly-sinsalte, jfr. tabel II, hvoraf det fremgår, at såvel dihy-drochloridsaltet som citratsaltet (begge kendte) på langt nær udviser den samme virkning som glutamatsaltet (fremstillet 25 ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen), men tværtimod ligger nærmest på linie med den ubehandlede kontrol.

De ifølge opfindelsen fremstillede hidtil ukendte, farmaceutisk anvendelige N-£ -trimethyl-L-lysinsalte har yderligere visse tekniske fordele, idet specielt glutamaterne er 30 stabile, dvs. ikke er hygroskopiske, har god lagerstabilitet, er lette at bringe i doseringsform, da de bevarer en bestemt sammensætning og i vandig opløsning har en pH-værdi, der næsten er identisk med fysiologisk natriumchloridopløsnings.

N-£ -trimethyl-L-lysinmonoglutamatet (der herefter vil blive 35 betegnet som TML.Glu) har vist sig at være særlig fordelag-* tigt i denne henseende.

o 3 148355

Ifølge opfindelsen fremstilles de ovennævnte salte ved, at N- £-trimethyl-L-lysin omsættes med asparaginsyre eller glutaminsyre, fortrinsvis i vandig opløsning, idet der pr. mol lysinforbindelse anvendes 1 eller 2 mol af de nævnte 5 syrer.

Ifølge en foretrukket udførelsesform for fremgangsmåden kombineres vandige opløsninger af udgangsmaterialerne, og når reaktionen er afsluttet, inddampes den fremkomne reaktionsblanding, og inddampningsremanensen tørres, eventuelt 10 efter omkrystallisation.

Den mængde asparaginsyre eller glutaminsyre, der anvendes som udgangsmateriale, afhænger af det produkt, der skal fremstilles, dvs. af, om det salt, der skal fremstilles, dannes med et eller to molekyler af en tilsvarende syre.

15 De farmakologiske egenskaber hos forbindelserne frem stillet ifølge opfindelsen belyses ved følgende prøver.

TML.Glu's indvirkning på mus, hvori der er transplanteret Nk/Ly-tumorceller, undersøges. Prøverne udføres på følgende måde: I 50 8-uger gamle CFLP O-mus, der vejer 20-22 g 20 hver, transplanteres ascites tumorceller intraperitonealt i 5 en dosis på 5 x 10 celler/dyr. 25 dyr anvendes som kontrol, og de øvrige 25 dyr får indgivet 100 mg/kg intraperitoneale doser TML.Glu på 2., 5., 9., 11., 13. og 19. dagen efter transplantationen af tumorceller. På 19. dagen får kun de 25 5 mus, der endnu er i live, ovennævnte behandling. Virknin gen af behandlingen på dyrenes blodtælling er anført i nedenstående tabel I· 4 148355

O Tabel I

Dagen for blodtælling Røde blodlegemer Hvide blodlegemer efter transplantation (millioner/mm3) (tusinder/mnw)

Behandlet Kontrol Behandlet Kontrol 2. 8,66 7,06 6,466 7,800 5 5. 7,2 6,95 8,732 8,466 8. 8,2 7,8 7,200 7,733 10. 7,2 6,4 8,520 8,900 12. 7,5 5,7 10,800 6,500 13. 6,6 4,9 8,260 6,700 10 14. 5,5 4,5 9,000 7,700 20. 5,0 2,1 7,133 5,100

Ovennævnte data viser utvetydigt, at den alvorlige 15 anæmi på grund af væksten af NK/Ly-tumor reduceres betydeligt, når dyrene behandles med TML.Glu.

LDj.q intraperitonealt hos mus = mere end 1500 mg/kg.

Der udføres prøver for at undersøge fordelingen af 3 thymidin ( H TdR) i thymuskirtel, benmarv, milt og ileus-20 slimhinde hos sunde 12-uger gamle DBA/2 hunmus og i ascites-tumorceller, der formerer sig in vivo. Prøverne udføres på grupper bestående af 5 dyr og gentages fire gange efter hinanden .

Der indgives TML.Glu i en intraperitoneal dosis 3 25 på 100 mg/kg. Det har vist sig, at inkorporeringen af H TdR i thymuskirtlen øges med 85-7%, i milten med 75 - 8% og i NK/Ly-tumorceller med 94 - 11% i den 24. time efter behandling med ovennævnte dosis af TML.Glu. I benmarvceller øges inkorporeringen af H TdR i den 10. time med 57 - 4% og i 30 den 48. time med 72 - 5%. Når det drejer sig om NK/Ly- · -tumorceller, øges inkorporeringen yderligere endog i den 48. time, hvor den stiger til 124 - 14%. Når TML.Glu indgives intraperitonealt, øges inkorporeringen i ileus-slimhinden ikke, men ved oral indgivelse iagttages en forøgelse på 35 50 - 9% i den 23. time efter behandlingen. Forøgelsen af inkorporeringen af % TdR viser, at cellerne er begyndt syn- o 148355 tetisering af desoxyribonucleinsyre (DNS), dvs. de er blevet aktive.

Omdannelsesvirkningen af de hidtil ukendte N-£-tri-methyl-L-lysinsalte på lymphocytceller afprøves ligeledes på 5 kulturer af menneskeceller. Fra perifert blod fra sunde donorer isoleres lymphocyter ved hjælp af Ficoll-Uromiro-gra-dienten. Lymphocyterne suspenderes i et Parker-199-medium, der indeholder en autolog serum, ved 20°C i en koncentration på 5 x 10^ celler/ml, og som inkuberes ved en temperatur på 10 37°C i 96 timer. Kulturerne opdeles derefter i tre grupper. Den første gruppe behandles med en dosis på lOOyUg/ml TML.2HC1, den anden med en dosis på 100 /ig/ml TML-citronsyre, den tredje med en dosis på 100 ug/ml TML.Glu, medens den fjerde gruppe tjener som kontrol. Gmdannelsesvirkningen angives ved 3 3 15 inkorporeringen af H TdR. H TdR indgives i en koncentration på 11 μα/ml tre timer før afbrydelsen af dyrkningen. Dyrkningen afbrydes 48, 72 og 96 timer efter påbegyndelsen.

Den aktivitet, der er bundet til DNS, bestemmes efter ekstraktion med varm perchlorsyre ved hjælp af væskescintillations-20 teknik. De opnåede resultater er anført i følgende tabel U.

Tabel II

3„ TdR-inkorporering Tid H

OE (timer) TML-2HC1 TML.citr. TML.Glu Kontrol 25 - - ---—— - - - — 48 146 - 594 123 756 167 - 413 72 295 166 3010 159 30 303 274 2427 254 182 1413 96 231 - 2825 271 330 - 2878 301 - 3659 35 ____ o 6 148355

Den antagelse, at cellerne bliver aktive, bevises bl.a. af den kendsgerning, at de begynder at formere sig. Dannelsen af det samlede antal tumorceller bestemmes derfor også.

5 I ca. 20 CFLP hunmus transplanteres Nk/Ly-tumorceller.

10 dyr får indgivet en daglig dosis på 100 mg/kg TML.Glu i 8 efter hinanden følgende dage begyndende 24 timer efter transplantationen af tumorcellerne. 10 mus anvendes til sammenligning. Musene aflives 9 dage efter behandlingen, og dyrenes 10 vægt og det samlede antal tumorceller bestemmes. Det viser sig, at behandlingen resulterer i en forøgelse på 35% af det samlede antal tumorceller i forhold til kontrollen. Forøgelsen af antallet af tumorceller illustrerer, at TML-saltet aktiverer proliferationen af tumorceller. Denne aktivering gør tu-15 morcellerne mere følsomme overfor cytostatiske midler, og dette er grunden til, at kombxnationen af cytostatiske midler med TML-saltet forøger de cytostatiske midlers virkning.

Endelig iagttages TML.Glu's indvirkning på den humora-= le og cellulære immunreaktion hos mus. Som sammenligning 20 anvendes L-6-phenyl-2,3,5,6-tetrahydroimidazol[2,l-b]thiazol ("Levamisol"). Der udføres prøver på grupper bestående af 10 2-uger gamle DBA/2 hunmus hver. Som antigen anvendes røde blodlegemer fra får, der indgives intraperitonealt. Som positiv kontrol indgives E. coli endotoxin og en enkelt dosis 25 på 2-5 mg/kg legemsvægt "Levamisol". TML.Glu indgives først over en periode på 2 uger fem gange i ens intraperitoneale doser på 100 mg/kg legemsvægt (som foreløbig behandling) og derpå i en dosis (også på 100 mg/kg legemsvægt), lige før antigenet indgives. Hæmagglutinintiteren bestemmes med en "Takåcsy"-30 microtitrator. Det viser sig, at en enkelt forbehandling med TML.Glu ikke har nogen observerbar virkning, men en gentagen forbehandling giver ca. samme forøgelse af titerværdien som "Levamisol". Men medens "Levamisol" har forskellige uønskede bivirkninger, f.eks. er det skadeligt for mave-tarmka-35 nalen, har TML.Glu ikke disse bivirkninger, fordi det er et salt af et naturligt stof, der er til stede i den levende organisme.

o 148355

Den cellulære immunreaktion undersøges på basis af den type eksperiment, der er beskrevet af Legrange m.fl.

"Effects of Bacterial Lipopolysaccharide on the Induction and Expression of Cell-mediated Immunity" i J. Immunol.

5 bd. 114, nr. 1, del 2, jan 1973. Denne type er baseret på den iagttagelse, at efter en gentagen tilsætning af røde blodlegemer (får) forøges mus’ potetykkelse. I store træk nedsætter de midler, der stimulerer den humorale immunreaktion, til at begynde med væksten - i sammenligning med kon-10 trollen - og frembringer derefter, efter flere dage, en forøget vækst i forhold til kontrollen, hos hvem væksten i mellemtiden er aftaget. Den samme tendens kan iagttages i ca. to uger, når mus forbehandles med fem doser på 100 mg/kg legemsvægt TML.Glu.

15 . På basis af de opnåede resultater ved de ovenfor beskrevne prøver ses, at de ifølge opfindelsen fremstillede TML-salte udviser følgende væsentlige fordele: 1. De ifølge opfindelsen fremstillede trimethyllysin-salte og herunder specielt trimethyllysinglutamat sensibili-20 serer forskellige typer lympheceller, f.eks. fra thymuskirtel, benmarv, milt og ileusslimhinde, hos flere forskellige pattedyr, herunder mennesker og mus, således at disse bedre tåler behandling med kendte cytostatika med henblik på bekæmpelsen af tumorlidelser ved kemoterapi.

25 2. De ifølge opfindelsen fremstillede forbindelser har proliferationsforøgende virkning på blodceller og celler fra ileusslimhinde og afgifter herved cytostatika til brug over længere tidsrum.

3. Ved indgift alene viser de ifølge opfindelsen frem-30 stillede lysinsalte gunstig virkning ved blodtællingen og kan med held anvendes til behandling af tumorøse anæmier af anden oprindelse.

4. Forbindelsernes immunstimulerende virkning i organismen kan endvidere med held udnyttes ved behandlingen af 35 tumorlidelser og lignende til at lindre eller modvirke nedgangen i humoral immunitet.

148355 o

O

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses yderligere af nedenstående eksempler. De forkortelser, der anvendes i eksemplerne og i hele beskrivelsen, er de almindelige anvendte i litteraturen (J. Biol. Chem. 247 (1972) 977). Den hyp-5 pigst anvendte forkortelse er TML = N- £-trimethyl-L-lysin.

Ved forbindelsernes fremstilling ifølge opfindelsen sker inddampning altid i en "Buehi Rotavapor". Smeltepunkter bestemmes i et "Tottoli" (Buehi) apparat. Tyndtlagschro-matografi udføres på et "Fixion"-lag. Som opløsningsmiddel-10 blanding anvendes en blanding af 50 g citronsyre, 50 g natriumhydroxid, 7 ml koncentreret saltsyre og 500 ml destilleret vand. Chromatogrammerne fremkaldes med en blanding af 80 ml methanol, 20 ml iseddike, 0,2 g ninhydrin og 0,1 g kuprisulphat.

15

Eksempel 1 N- S-trimethyl-L-lysinmonoglutamat 50,0 g (0,265 mol) chromatografisk ensartet N-£.-tri-methyl-L-lysin opløses i 500 ml destilleret vand. Blandingen 20 opvarmes til 50°C og kombineres med en opløsning af 39,0 (0,265 mol) L-glutaminsyre i 500 ml destilleret vand med samme temperatur. Opløsningen, der fremkommer, omrøres ved 50°C i 30 minutter, affarves derefter med 5 g "Norit"-trækul.

Efter flere minutters omrøring filtreres opløsningen og ind-25 dampes til tørhed under formindsket tryk. Man må sørge for, at opløsningens temperatur ikke overstiger 50°C. Den krystallinske inddampningsremanens tørres i vakuum i nærværelse af phosphorpentoxid indtil vægten er stabil.

Udbytte: 95-98 g N- £~trimethyl-L-lysinmonoglutamat, 30 smeltepunkt 104-107°C. [a]^ = +5,15° (c = 1, vand).

Aminosyreanalyse: Glu: 1,0 (1); TML: 1,13 (1).

Analyse: beregnet for C^H3gOgN3.2H20 Beregnet: C = 45,2%, N = 11,3%

Fundet: C = 45,6%, N = 11,2%.

35 o 9 148355

Eksempel 2 N- g. -trimethyl-L-lysindiaspartat 50,0 g (0,265 mol) chromatografisk ensartet N-€-tri-methyl-L-lysin opløses i 500 ml destilleret vand med en tem-5 peratur på 50°C. Den således fremstillede opløsning tilsættes til en opløsning af 70,1 g (0,53 mol) L-asparaginsyre i 500 ml destilleret vand, der har samme temperatur. Efter nogle minutters omrøring affarves opløsningen med 5 g "Norit" trækul, trækullet filtreres fra, og filtratet inddampes unto der formindsket tryk. Den tiloversblevne olieagtige substans behandles med tør ethanol, hvilket giver 60,0 g fast N-£-trimethyl-L-lysindiaspartat .

Smeltepunkt 142-153°C (stoffet er meget hygroskopisk).