DK147579B - Fremgangsmaade til kontinuerlig isomerisation af glucose til fruktose - Google Patents

Description

i 147579

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til kontinuerlig isomerisation af glucose til fruktose ved hjælp af et fast leje af en immobiliseret isomerase stammende fra en organisme af arten Bacillus coagulans, hvilken isomerase har forøget isomerisationshastighed fra glucose til fruktose når glucoseisomerisationsreaktionen udføres (i) i nærværelse af Co++ ioner og (ii) ved en temperatur over 60°C.

Fruktose vundet ved enzymatisk isomerisation af dextrose (glucose) til fruktose anvendes udstrakt som sakkaroseerstatning i fødevareindustrien, slikvareindustrien og ved fremstilling af alkoholfri drikke såsom søde vande, juicer og såkaldt sodavand.

Den fruktose der er fremstillet ved den foreliggende fremgangsmåde kan således anvendes ved fremstilling af slikvarer såsom bolsjer, syrlige bolsjer, konfektblandinger, marcipan, nougat, lakridskonfekt og andre slags lakrids, lakridspastiller og andre pastiller, halspastiller, søde skumprodukter, saltpastiller og salmiakpastiller, flødekarameller, kager og småkager og lignende såvel som syltede frugtprodukter såsom syltetøj, gelé og marmelade. En vigtig anvendelse af fruktose fremstillet ved den foreliggende fremgangsmåde er i søde vande såsom squash, juice og sodavand, coladrikke, tonicvand, grape tonic, lemon squash og lignende drikkevarer. Desuden kan fruktose fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen også bruges som sødemiddel i tobak og i andre sødemidler, og i søde overtræk for medicinske tabletter og piller, såvel håndkøbsvarer som receptbundne medicinske produkter. Denne fruktose kan også bruges til egentlig sødning af medikamenter og håndkøbsmedicin i form af saft eller sirup. Den kan.bruges i dyrefoder inclusive husdyrfoder og kæledyrfoder, og den kan også bruges til industrielle formål i pesticider, som kemisk mellemprodukt og i klæbestoffer.

Væsentlige produktionsomkostninger ved fremstilling af fruktose opstår på grund af nødvendigheden af hyppigt at udskifte brugte eller deaktiverede glucoseisomeraser. Forbedret produktivitet med hensyn til fruktose af glucoseisomerase er et ønskeligt mål. Der har været udfoldet omfattende forskningsbestræbelser på at opnå maximal fruktoseproduktivitet med den la- 2 t47579 vest muligt mængde glucoseisomerase. Mange forskere har ment at løsningen på dette punkt blev at det simpelt hen ville være et spørgsmål om at opdage en stabil glucoseisomerase. Til dette formål har man sigtet sig frem til, muteret og fremstillet en mængde forskellige glucoseisomerasepræparater. Ved afprøvningen af effektiviteten og følsomheden af disse glucoseisomeraser for deaktivering er forskere på området kommet til det resultat at isomeraser stammende fra forskellige mikroorganismer har forskellige enzymatiske egenskaber. Optimale isomerisationsbetingelser såsom pH og temperatur, isomeraseaktivatorer (fx metalionaktivatorer såsom Co++, mangan etc.) og andre procesvariable vil afhænge af den særlige glucoseisomerasetype. Generelt optræder der større ulighed med hensyn til isomerisationsbetingelser mellem isomeraser stammende fra forskellige slægter.

Immobiliserede eller ubevægeliggjorte isomeraser er mere stabile end isomeraser i vandopløselig eller ubundet form. I almindelighed egner immobiliserede glucoseisomeraser sig bedst til kommerciel eller industriel drift fordi de kan bruges kontinuerligt i batch-processer eller kontinuerlig drift indtil de er opbrugt. Når de er opbrugt eller udpint, erstattes disse isomeraser med frisk immobiliseret isomerase. De fleste isomerisations-reaktioner udføres ved temperaturer og pH-værdier som optimerer den hastighed, hvormed isomerase omdanner glucose til fruktose. I lighed med andre enzymer er isomeraser sædvanligvis mest stabile mod inaktivering (herunder varmeinaktivering) og har højest enzymatisk aktivitet når de bruges ved deres optimale isomerisations-pH. Glucoseisomeraser der for tiden anvendes ved kommerciel fremstilling af fruktoseholdige sirupper udviser karakteristisk forbedret stabilitet og aktivitet når isomerisationsprocessen udfø-res i nærværelse af Co ioner. Kobol tosalte sættes undertiden til fødesiruppen til dette formål. Det ville være ønskeligt at opnå højere produktivitet uden at behøve at bruge koboltoioner.

En modifikation ved glucoseisomerisationsprocesser, der har været foreslået, består i at forøge isomerisations-reaktions-temperaturen efterhånden som isomeraseaktiviteten går ned. En forøgelse i reaktortemperaturen vil accelerere hastigheden af fruktoseproduktionen såvel som den hastighed hvormed isomerasen deaktiveres. Nettoeffekten er at nedsætte det samlede fruktose- 147579 3 udbytte, der produceres af isomerasen.

Isomeraser der er rapporteret frembragt af organismer hørende til slægten Bacillus omfatter isomeraser stammende fra Bacillus stearothermophilus ATCC 31265, NRRL B-3680, NRRL B-3681 og NRRL B-3682; Bacillus sp. NRRL B-5350 og NRRL B-5351; Bacillus megaterium ATCC 15450; Bacillus fructosus ATCC 15451, 35c (se fx USA-patentskrifterne nr. 3.826.714 og 3.306.752, tysk offentliggørelsesskrift 2.164.342, samt Danno et al i Agri. Biol. Chem., Vol. 31, nr. 3, side 284-292, 1967). Varme- eller kemisk behandling af levedygtige celler indeholdende intracellulær iso-merase, indkapsling, komplexering med naturlige og syntetiske polymerer, ubevægeliggørelse i en bindermatrix og talrige andre midler til ubevægeliggørelse af isomeraserne har været foreslået. Eksempler på fremgangsmåder til immobilisering af isomeraser og forbedring af den enzymatiske stabilitet er angivet bl.a. af Kent et al. i J. Appl. Chem. Biotechnol. 1974, 24, side 663-676; og S. Yoshimura et al. i Agri. Biol. Chem., bind 30, nr. 10, side 1015-1023 (se også hollandsk offentliggjort patentansøgning nr. 73.12525 af 11. september 1973, britisk patentskrift nr. 1.274.158, USA-patentskrifterne nr. 3.821.082, 3.779.869, 3.694.314 og 3.788.945 samt britisk patentskrift nr. 1.356.283).

En nylig artikel i die Starke 27, årgang 1975 nr. 7,side 236-241 med titlen "Sweetzyme - A New Immobilised Glucose Isomerase" beskriver immobiliserede isomeraser stammende fra Bacillus coagulans. Denne artikel definerer produktiviteten af glucoseisamerase som den kombinerede effekt af aktivitet og stabilitet. Ved forholdsvis neutrale pH-værdier anses kobolt for essentielt for fruktoseproduktivitet. For at opnå optimal fruktosesirup-produktivitet i fravær af koboltioner slutter forfatterne at det er nødvendigt at gennemføre den kontinuerlige isomerisationsreaktion ved forholdsvis høj alkalisk pH-værdi. Til kontinuerlig drift (fx kolonneisomerisa- tion) med kort kontakttid og reaktionstid mellem isomerase og ++ sirup angives det at optimal produktivitet i frævær af Co opnås ved en pH-værdi over 8,0 (fx 8,1 til 8,5) ved en faststofkoncentration på 40-45% og 65°C.

Det er opfindelsens formål at forlænge den nyttige levetid og fruktose-produktiviteten af immobiliserede glucoseisomera-ser stammende fra en organisme af arten Bacillus coagulans.

147579 4 Særlig sigtes der til at forbedre proces'effektiviteten ved isomerisation af glucose til fruktose i reaktorer af kolonnetypen. Ved opfindelsen muliggøres det kontinuerligt at isomerisere en dextrosesirup til en fruktosesirup under procesbetingelser som mindsker dannelse af uønskede biprodukter.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav 11 s kendetegnende del anførte.

Det dannede fruktosesirup kan bruges som sådan eller fruktose kan isoleres derfra.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse bruges der en raffineret glucosesirup med højt indhold af mono- ++ sakkarid-faststof og i det væsentlige fri for Co ioner. Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udnyttes i en proces ved hvilken en reaktor frembringer det ønskede fruktosesirup-produkt ved en enkelt passage eller ved recirkulation af siruppen gennem en reaktor med højere strømningshastighed til den ønskede omdannelse er opnået, eller med et antal reaktorer forbundet i serie, i hvilke fruktoseindholdet forøges progressivt efterhånden som siruppen strømmer gennem hver af reaktorerne i serien.

Produktiviteten af isomerisationsprocessen forhøjes almindeligvis ved at der bruges fødesirup med højt monosakkaridindhold. Omdanneisessirupper med højt glucoseindhold, indeholdende over 90% glucose (på tørvægtsbasis) eller 95% glucose eller endnu mere (navnlig omkring 97-99%) er særlig nyttige fødesirupper (se fx USA-patentskrifterne nr. 3.783.100 og 3.897.305). Man anvender særlig fordelagtigt ifølge opfindelsen en fødesirup som defineret i krav 3.

Kvaliteten af den isomeriserede sirup og produktiviteten af glucoseisomeraselejet påvirkes i ugunstig retning af uorganiske og organiske ikke-sakkarid-forureninger fra siruppen.Visse metalioner i spormængder såsom aluminium, kobber, tin, zink, kviksølv, kalcium og andre samt anioner der inaktiverer isomerasen og/eller reagerer til dannelse af uopløselige stoffer kan nedsætte enzymlejets produktivitet. Sådanne forureninger kan fjernes fra glu-cosefødesiruppen Ved konventionel kation- og anion-harpiksbehand- 5 14757¾ ling. Ufuldstændig ionbytterbehandling kan også føre til udvikling af uopløselige flokkuleringer eller bundfald i isomerisationssy-stemet, som bevirker trykfald i isomerisationskolonnereaktoren, hvilketnedsætter lejets produktivitet. Disse ioniske urenheder kan hensigtsmæssigt fjernes fra den højt glucoseholdige fødesi-rup ved enkelt eller dobbelt kation- og anionbytterbehandling, fx stærk kation - svag anion - stærk kation - svag anion.

Organiske stoffer der typisk er til stede i stærkglucoseholdige omdannelsessirupper såsom proteinholdige materialer, farveforure-ninger (fx HMF) og aromaforureninger etc. har skadelig virkning på enzymlejets produktivitet og fruktosesiruppens kvalitet. Konventionel ionbytterbehandling kan ikke fjerne alle disse uønskede organiske stoffer fra fødesiruppen. Sådanne organiske stoffer kan hensigtsmæssigt fjernes fra siruppen ved hjælp af konventionelle midler såsom granuleret kulstof, behandling med aktiveret kulstof (fx i mængder på fra ca. 0,5 til ca. 2,0 vægtdele aktiveret kul for hver 100 vægtdele sirup-tørstof). Det er også ønskeligt at fjerne uopløselige organiske og uorganiske stoffer på konventionel måde fra fødesiruppen før isomerisationsreaktionen. Raffinering af siruppen ved at man i nævnte rækkefølge fjerner de uopløselige stoffer, behandler med kul og foretager ionbytterbehandling er i almindelighed tilfredsstillende.

Den foreliggende isomerisationsreaktion udføres ved temperaturer, pH-værdier og andre driftsbetingelser som begunstiger mikrobevækst. Uden tilstrækkelige forholdsregler mod mikrobevækst kan isomerisationsreaktorerne blive inficeret ved langvarig brug. Dette vil påvirke isomerase-produktiviteten og siruppens kvalitet i ugunstig retning. Ved regulering af fødesiruppen til et tørstofindhold på over 45 vægt% og fortrinsvis mindst 50 vægt% kan mikrobeinfektionsproblemet lettere kontrolleres end ellers. Føde-sirupper der indeholder over 60% tørstof er i almindelighed for viskose til effektiv passage gennem isomerisationsreaktoren. En fødesirup reguleret til et tørstofindhold fra ca. 50 til ca. 55 vægt% vil i almindelighed give tilstrækkelige strømningshastigheder gennem reaktoren og samtidig nedbringe mikrobeinfektion til et minimum. Periodisk eller kontinuerlig behandling af føde-siruppen med konventionelle baktericider kan bruges som hjælp under driften til at nedsætte mikrobeinfektion.

Ved den foreliggende fremgangsmåde isomeriseres glucose 6 147579 til fruktose ved at man fører en glucosesiruppen gennem et immobili-seret leje indeholdende en isomerase stammende fra en organisme af arten Bacillus coagulans. Egnede iiimobiliserede lejer til gennemførelse af isomerisationsreaktionen omfatter konventionel teknik og apparatur til at holde den immobiliserede isomerase inden for en isomerisations-reaktionszone samtidig med at det muliggøres for siruppen at passere gennem lejet. Reaktorsysterner af kolonnetypen der drives ved en enkelt passage eller ved recirkulation, eller med et antal reaktorer forbundet i serie kan bruges til omdannelse af siruppen til det ønskede fruktoseholdige sirupsprodukt (fx med et vægtforhold mellem fruktose og dextrose på fra ca. 2:3 til ca. 1:1). Fortrinsvis udføres isomerisationsprocessen ved at man kontinuerligt lader en dextrosesirup flyde gennem en kolonnereaktor indeholdende immobiliseret glucoseisomerase, idet mængden af glucoseisomerase og strømningshastigheden for siruppen gennem kolonnen er tilstrækkelig til at forøge siruppens fruktoseindhold til et niveau på fra ca. 44 til ca. 47% (monosakkarid-vægtbasis).

De isomeraser der bruges ved den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved at udvise optimal isomeraseaktivitet ved pH 8,0 til 8,5 bestemt under standardprøvebetingelser med et prøvesubstrat af 60 g vand, 40 g vandfri glucose, 0,02M magniumsulfat, 0,0035 M koboltklorid ved 65°C i 1 time. Under disse prøvebetingelser vil isomerasen danne mere fruktose mellem pH

8,0 og 8,5 end der vil blive dannet uden for dette område. Hvis ovennævnte standardprøvetemperatur nedsættes (fx til 60°C eller derunder) frembringer disse isomeraser (under disse prøvebetingelser) mindre fruktose end de vil ved 65°C eller derover. En anden karakteristik for isomerasen er at når koboltklorid udelukkes fra standardprøvesubstratet og prøven udføres ved pH 7,5 og ' 60°C i 1 time, så vil fruktoseproduktionen blive mindre end den der fremkommer når der indgår 0,0035 M koboltklorid som prøveingrediens .

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er særlig tilpasset til brug med isomeraser vundet fra stammer af arten Bacillus coagulans (fx NRRL B-5305 eller NRRL B-5351) og immobiliseret i overensstemmelse med hvad der står i den offentliggjorte hol- 147579 7 landske patentansøgning nr. 73.12525 af 11. september 1973. Disse isomeraser er mere stabile mod inaktivering når de bruges i en isomerisationsproces med en stabiliserende mængde Co ion (fx fra 0,0015 til 0,004 M), de har pH-optimum ved ca. 8,5 og optimal isomerisationstemperatur godt over 60°C.

Ved udøvelse af den foreliggende fremgangsmåde kan en reaktor af kolonnetypen hensigtsmæssigt tilberedes med en iso-merase der typisk har en aktivitet (målt under de ovennævnte standardprøvetetingelser) på over ca. 400 IGIU/g enzym. Lejet indeholder med fordel over ca. 106 x 10^ IGIU og fortrinsvis over 212 x 10 IGIU pr. m lejerumfang. Når det ønskes at producere ca. 45%'s fruktose (monosakkaridbasis) i en enkelt passage, er en ladning af kolonnen, der tillader en oprindelig sirup-strømningshastighed gennem et frisk leje på omkring 0,19 til omkring 0,76 liter pr. minut (sædvanligvis ca. 0,38 1/min.) for hver 28,3 liter lejevolumen i almindelighed passende (dvs. ca. 6,7 til 26,8 liter/minut/m ). Strømningshastigheden nedsættes proportionalt for at kompensere for deaktivering af lejet efterhånden som isomerisationsprocessen skrider frem.

Den enzymatiske isomerisation gennemføres i det væsentlige ved pK 7,0-7,5 . Hvis pH falder under 7,0 bliver isomerasen (uden tilstedeværelse af en stabiliserende mængde Co ) udsat for permanent deaktivering. Ved en pH-værdi på over 7,5 vil den samlede fruktose-produktivitet af lejet ligeledes gå ned på grund af isomerase-deaktivering. En sekundær fordel ved at gennemføre isomerisationsprocessen i dette mere neutrale pH-område er at det forhindrer dannelse af uønskede lugt- og farvestoffer. I sammenligning med en proces gennemført ved pH 8,5 og 65°C forøges fruktose-produktiviteten ved den foreliggende fremgangsmåde med omkring det 5- til 10-dobbelte. Denne forøgede fruktose-produktivitet nedsætter væsentligt den samlede mængde isomerase der behøves til at frembringe en given mængde fruktose og gør det muligt at anvende reaktoren i en længere tidsperiode uden at afbryde driften for at genopfylde med frisk enzym. På lignende måde som andre enzymer er isomeraser typisk mere følsomme for deaktivering når de bruges ved en pH væsentligt under deres optimale pH. I modsætning til hvad der kunne ventes øges den samlede fruktose-produktivitet af lejet væsentligt ved at man gennemfører isomerisationsreaktionen uden en stabiliserende mængde kobolt » · '< 8 147579 (dvs. over 0,0OlM) ved et pH-niveau som ligger godt uden for dets optimale pH-område for isomerisationen.

Under isomerisationsprocessen vandrer den glucoserige sirup ind i de immobiliserede isomerasepartikler. Inden i partiklerne isomeriseres glucosen til en fruktoserig sirup. Denne fruktoserige sirup vandrer fra partiklerne og partiklerne genopfyldes med frisk glucose. På lignende måde som ved udskiftning af væsker i levende organismer eksisterer der således heterogenitet mellem den ydre sirupsfase og den indre partikelfase. Visse tørre immobiliserede isomerasepræparater, som fx dem der fremstilles i overensstemmelse med den offentliggjorte hollandske patentansøgning nr. 73.12525 har vist sig at indeholde latente sure substanser (fx immobiliserede isomeraser af den tværbundne type med glutar-aldehyd). Disse sure substanser holdes åbenbart oprindeligt inde i strukturen for den tørre immobiliserede partikel. Når de bruges ved en isomerisationsproces indespærres disse syrer i partiklerne. De fangede syrer kan skabe en alt for lav, stærkt lokaliseret pH-værdi og bevirke inaktivering af isomerasen.

Der skal tages passende forholdsregler for at forhindre disse syrer i at deaktivere isomerasen. Dette problem kan hensigtsmæssigt løses ved at man hydratiserer og neutraliserer de syreholdige tørrede immobiliserede partikler med en ikke-deakti-verende base (fx natriumhydroxyd, bikarbonat og natriumkarbonat) før isomerisationsreaktionen begynder (fx straks efter ladningen), eller ved at man tilsætter en isomerase-forenelig,vandopløselig base eller puffer til fødesiruppen i tilstrækkelig mængde til at sikre at pH holdes i området 7,0 til 7,5.

pH-Værdien ved isomerisationen kan holdes inden for området 7,0 til 7,5 ved at man til fødesiruppen eller reaktoren sætter en ikke-deaktiverende base (fx natriumhydroxyd, bikarbonat eller karbonat) eller konventionelle puffere som ikke deaktive-rer isomerasen (fx natriumsulfit, natriumbisulfiter eller karbonater) . Ikke-nedbrydende reduktionsmidler der konventionelt tilsættes på majssirup-fabriken for at forhindre oxydation og dannelse af farvestoffer kan inkorporeres i fødesiruppen, fx na-triumbisulfit.

Selv om fremgangsmåden udføres i fravær af varmestabilise-rende mængder koboltioner, udføres isomerisationsreaktionen i nærværelse af en co-metalion-isomeraseaktivator.

147579 9

Der opnås forbedret produktivitet når iscmerisationsmediet indeholder mindst ca. 0,002M magniumioner. Over niveauet 0,01M er isomerasens behov for magniumioner dækket og yderligere mængder deraf vil kun vise sig som forøgede procesomkostninger (fx omkostninger ved magniumsalte og yderligere besvær i raffineringssystemer for at fjerne ionerne). Et magniumionindhold mellem ca. 0,003M og ca. 0,010M har vist sig at være særlig effektivt til at forøge den samlede isomerase-produktivitet.

Lejet bruges indtil lejets aktivitet går ned til under 20% og fortrinsvis under 15% af den maximale driftsaktivitet. Typisk vil frisk immobiliseret isomerase have en prøveaktivitet (ved de standardprøvebetingelser der er nævnt foran) på mindst 400 International Glucose Isomerase Units (IGIU) pr. g og vil typisk blive anvendt i den kontinuerlige proces indtil der er en aktivitet på under 80 IGIU/g. De mest passende sirup-strømningshastigheder gennem kolonnen eller lejet vil afhænge af den ønskede \ grad af fruktoseomdannelse, lejets isomeraseaktivitet og trykfaldet ved strømningen gennem lejet. For at opretholdet et konstant fruktoseudbytte (fx ca. 45% fruktose og 55% dextrose) reguleres fødesiruppens strømningshastighed proportionalt så at den stemmer med lejets isomeraseaktivitet. Fx vil et leje ladet med 13,6 kg isomerase pr. 28,3 liter og med en isomeraseaktivitet på 500 enheder pr. g (dvs. 240.393 IGIU/1) og et ønsket udbytte på ca. 45% fruktose typisk fra starten blive drevet med en strømningshastighed på ca. 0,38 liter pr. minut/28,3 liter leje (dvs. 13,4 liter/minut/m ). Hvis imidlertid isomeraseaktiviteten går ned til ca. 50 IGIU/g (dvs. 24.039 IGIU/1) behøves en lavere sirup-strømningshastighed på 0,038 liter pr. minut pr. 28,3 liter (dvs. 1,34 liter/minut/m ) for at give et ækvivalent fruktoseudbytte. Typiske sluthastigheder for sirupstrømmen er over 0,019 liter pr. minut pr. 28,3 liter (dvs. 0,67 liter/minut/m^) 3 og sædvanligvis over ca. 1,34 liter/minut/m . Det er ønskeligt at bruge de højest mulige strømningshastigheder. Den samlede aktivitet af lejet begrænser imidlertid den hastighed hvormed siruppen kan føres gennem kolonnen for at give den ønskede fruktosekoncentration. Under niveauet 40 IGIU/g er strømningshastighederne så lave at processen bliver uøkonomisk. Til de fleste kolonne- t47579 ίο operationer vil siruppens strømningshastighed være imellem ca.

3 3 1,34 liter/minut/m og ca. 26,8 liter/minut/m .

De immobiliserede isomeraser under de isomerisationsbetin-gelser der hersker ved den foreliggende opfindelse har typisk en oprindelig lav aktivitet (under 200 IGIU/g) og frembringer en forholdsvis lav mængde fruktose under de første 10-15 timer.

I modsætning hertil har et leje der drives ved pH 8,5 karakteristisk en væsentlig højere aktivitet og giver mere fruktose. Derimod er det atypisk at den immobiliserede isomerase under de foreliggende procesbetingelser udviser væsentlig aktivitetsforøgelse efter omkring 200-400 timers brug (fx 235 IGIU/g eller mere), mens en isomerase der bruges ved højere pH og højere temperatur progressivt vil gå ned i aktivitet. Efter ca. 400 timer går den immobiliserede isomerase gradvis ned i aktivitet indtil lejet er opbrugt (typisk mere end 3.500 timer og fortrinsvis efter mindst 4.000 timers kontinuerlig brug) , i modsætning til den hurtige nedgang som man får med immobiliserede lejer der drives ved pH-vær-dier over dette niveau. Den samlede riettoeffekt af de procesbetingelser der bruges ved den foreliggénde opfindelse er at opretholde et langt højere niveau for fruktoseproduktiviteten over et længere tidsrum.

Den grad af permanent isomerase-deaktivering der opstår ved driftsbetingelser på kolonnen som ligger uden for det foreskrevne pH-område 7,0 til 7,5 står i direkte relation til den grad hvori pH-værdien afviger derfra og til den periode hvor , den udsættes derfor. Regnet på ækvivalent tidsbasis bevirker drift af kolonnen ved en pH over 8,5 eller under 6,0 en mere omfattende permanent deaktivering og nedsat produktivitet end en drift der udføres inden for pH-området 7,8 til 8,0 eller 6,5 til 7,0. Drift ved et pH på enten ca. 6,0 eller 8,5 i kort tid (fx 24 timer) fører i almindelig til mindre grad inaktivering end længere tids drift (fx 300 timers) til pH-værdier på ca. 6,5 eller 8,0.

På grund af okkluderede eller fast bundne sure substanser der indeholdes i den immobiliserede isomerase (fx glutaraldehyd, tværbundet immobiliseret isomerase) er det vanskeligt straks at opnå den ønskede effluent-pH på 7,0 til 7,5. Hydratisering og neutralisation af isomeraselejet (før man begynder isomerisations- 147579 11 processen som nævnt foran) accelererer den hastighed hvormed lejet vil stabilisere sig på pH 7,0 til 7,5 (fx typisk i løbet af 1 dag). I modsætning hertil vil de ubehandlede lejer sædvanligvis fordre mindst dobbelt så lang tid for effluentstrømmen til at stabilisere sig på pH 7,0 til 7,5. Der kan også bruges puffere som proceshjælp for at holde pH inden for det foreskrevne pH-om-råde 7,0 til 7,5. Såfremt der hverken bruges puffere eller en forbehandlét isomerase og isomeraselejet indeholder en relativ høj mængde okkluderet syre, kan man imidlertid regulere den indgående strøms pH til en svagt højere pH-værdi (fx 7,5 til 8,0 og ved højere strømningshastigheder) for at kompensere for de sure substanser i lejet og for at opnå den ønskede pH på 7,0 til 7.5 i effluentstrømmen.

Det er betydningsfuldt at man under de første 2.000 timers drift af kolonnen holder isomeraselejet, som det kan konstateres ved effluentstrømmens pH-værdi, på en pH på mindst 7,0 og højst 7,5. Forøget isomerase-produktivitet opnås ved at man lader kolonnen arbejde inden for dette område mindst 90% af drifttiden og fortrinsvis i over 95% af drifttiden ved pH 7,0 til 7,5.

Som almen regel gælder det at isomeraselejet under de her omtalte procesbetingelser typisk vil bevare over 40% (og ofte 50% eller mere) af dets oprindelige døgnakvititet efter 2.000 timers kontinuerlig brug. Under isomeraselejets sidste levetid (fx efter 3.000 timers drift) vil opretholdelse af pH i området 7,0 til 7.5 forøge produktiviteten i mindre grad. Dette områdes effekt på produktiviteten er nedsat på grund af det væsentligt nedsatte niveau af lejets potens og aktivitet. pH holdes altså i området 7.0 til 7,5 i mindst 90% af dets arbejdsdygtige levetid og ifølge opfindelsen således at der i ikke over 5% af den samlede drifttid holdes en pH over 8,0 eller under 6,5. Væsentlig og permanent isomerase-inaktivering optræder når fremgangsmåden gennemføres i 100 timer eller derover ved en pH over 8,0 eller under 6,5. Hvis pH afviger fra området 7,0 til 7,5 er isomeraseaktiviteten delvis genoprettelig ved genregulering af pH til området 7,0 til 7,5. Dette retter imidlertid ikke op på den permanente isomerase-nedbrydning og det produktivitetstab som er bevirket ved at man har arbejdet uden for området 7,0 til 7,5.

Temperaturforholdet har en lignende virkning på fruktose- 12 147579 produktiviteten. Forhøjede temperaturer forøger midlertidigt lejets aktivitet, men nedsætter den totale produktivitet. Ligningen lng Y = 14,484 - (0,10247) (X), hvor Y er fruktose-produktiviteten og X isomerisationstemperaturen i C°, approximerer nøje virkningen af temperaturen på produktiviteten ved den foreliggende fremgangsmåde. Kort midlertidig højere temperatur kan forekomme, men undgås så vidt muligt. I sammenligning med en proces ved 65°C bevirker en drifttemperatur på 60°C eller derunder i begyndelsen lavere produktion af fruktose. Ækvivalent fruktoseproduktion (dvs. samlet udbytte af fruktose) ved en isomeri-sationstemperatur på 60°C opnås typisk ikke før efter 1400 timers kontinuerlig drift, på hvilket tidspunkt fruktose-produktiviteten ved 60°C nærmer sig til eller begynder at overstige produktiviteten ved 65°C. Isomeraselejet forbliver driftmæssigt levedygtigt ved 60°C i længere tid end ved drift ved 65°C (fx 4.050 timer mod 1.680 timer). Forbedret produktivitet opnås ved at man holder kolonnereaktoren under 61°C i mindst 90% af drifttiden og fortrinsvis på ca. 60°c eller derunder i mindst 95% af driftperioden. Om ønsket kan kolonnereaktorens temperatur forøges til 65°C eller derover når lejet nærmer sig den tilstand at være opbrugt. Drifttemperaturer under 55°C påvirker ikke isomeraselej-ets produktivitet i ugunstig retning, men reaktionshastigheden bliver væsentligt lavere. Når drifttemperaturen går under 55°C bliver den sirup med højt tørstofindhold, der bruges som udgangsmateriale, mere viskost og mindre bevægeligt. Det er også vanskeligt at forhindre mikrobiel infektion af lejet ved de lavere drifttemperaturer. Under hensyn til samtlige forhold er det derfor fordelagtigt at gennemføre isomerisationsreaktionen i temperaturområdet 57°C til 61°C og særlig hensigtsmæssigt går man ifølge opfindelsen frem som angivet i krav 2.

Ved kontinuerlig fremstilling af konversionssirup med højt fruktoseindhold er konventionelle portionsvis prøvemetoder og konventionel teknik der anvendes til at bedømme de optimale driftbetingelser vildledende og hyppigt uanvendelige i forbindelse med de samlede betingelser der behøves for at opnå maximal produktivitet. De konventionelle prøvemetoder (fx iGIU-prøvemetoder) er nyttige til at bestemme den oprindelige isomerasepotens eller aktivitet og dens egnethed til anvendelse ved kontinuerlig drift 147579 13 til fremstilling af en sirup med højt fruktoseindhold. Derefter er den mest meningsfyldte vejledning den samlede mængde fruktose, der faktisk produceres af en given mængde enzym. Ved en kontinuerlig proces til fremstilling af sirup med højt fruktoseindhold kan man let bestemme den mængde fruktose der er frembragt af iso-meraselejet på et hvilket som helst tidspunkt under driften (såvel som den samlede mængde fruktose der er blevet fremstillet) ved at man overvåger effluentstrømmen. Periodisk overvågning af effluentstrømmen gør det muligt at bedømme når isomerasen har nået sit maximale produktionsniveau. Derefter kan lejets effektivitet på et hvilket som helst trin af processen bestemmes ved at man sammenligner det ved overvågningen konstaterede niveau for fruktoseproduktionen med det maximale niveau for fruktoseproduktion. Ved den foreliggende fremgangsmåde anvendes lejet fordelagtigt indtil den mængde fruktose, der frembringes af lejet, går ned til en værdi på under 15% af det maximale fruktoseudbytte (dvs. den højeste konstaterede fruktoseproduktion eller det højeste konstaterede aktivitetsniveau). Fortrinsvis genopfyldes reaktorlejet eller udskiftes med frisk isomerase når lejets aktivitet er gået ned til 10-15% af det maximale udbytteniveau.

I almindelighed kan de ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse anvendte isomerisationsbetingelser forlænge den nyttige og produktive levetid for en immobiliseret isomerase med mindst 2.000 timer. Ved at man holder pH i området 7,0 til 7,5 og temperaturen under 61°C gør den foreliggende fremgangsmåde det typisk muligt for fruktosesirup-fabrikanten at bruge kolonnereaktoren kontinuerligt og opnå tilstrækkelig omdannelse til fruktose i over 3.000 timer og mest typisk over 4.000 timer. Den nyttige levetid der kan forventes for et sådant leje ved en proces der gennemføres ved pH 8,5 og 65°C er under 1.000 timer. Ved den foreliggende fremgangsmåde frembringes der desuden fruktosesirup af højere kvalitet. Sirupforringelse stammende fra isomeri-sationsprocessen er minimal, med minimal udvikling af forkert aroma og misfarvning. De ved fremgangsmåden fremstillede sirupper kan bringes i brugbar form uden at man behøver omfattende behandling med kul eller ionbytning.

Nogle eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1 14 147579

Dette eksempel belyser den forbedrede fructose-produktivitet ved anvendelse af en immobiliseret glucoseisomerase betegnet "Novo" SP-113E, der sælges af Novo Enzyme Corporation/ 1830 Mamoroneck Avenue, Manoroneck, New Jersey 10543, U.S.A. ("Novo" er et i Danmark indregistreret varemærke) i en kolonnereaktor af typen med enkelt passage og under isomerisationsbetingelser i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse. Enzymet stammede fra Bacillus coagulans og var immobiliseret ved glutaraldehyd-tværbinding i overensstemmelse med hollandsk offentliggjort patentansøgning nr. 73.12524.

Den tørrede immobiliserede isomerase blev hydratiseret og neutraliseret ved pH 7,5 og 50°C i 1 time ved opslæmning af 20 g isomerase i 150 ml raffineret 95-96%'s dextrosesirup (med 50% tørstofindhold) som indeholdt 0,005M MgSO^.7H20 og reguleredes til pH 7,5 (natriumhydroxyd). Den natriumhydroxyd-behandlede og stærkt kvældede isomeraseopslæmning blev derefter overført til en kolonnereaktor med vandkappe (højde 30 cm og diameter 2,5 cm).

I dette eksempel brugtes der en fødesirup med et indhold på 50% tørstof, 97,5% D.E., 96% glucose, 2,5% disakkarid, 0,5% trisakkarid og 1,5% polysakkarid (D.P. 4 eller derover). Siruppen blev raffineret ved behandling ved pH 4,0 til 4,5 med 0,5 til 1,0% pulveriseret aktiveret kul, fjernelse af uopløselige stoffer ved filtrering efterfulgt af ionbytning med en stærk kat-ionisk harpiks ("Amberlite"® 252), svagt basisk anionharpiks ("Duolite"® ES-561; fra Diamond Shamrock), stærk kationharpiks ("Amberlite" 252) og derpå en svagt basisk anionharpiks ("Duolite" ES-561) forbundet i serie. Den raffinerede sirup blev reguleret til pH 7,5 (natriumhydroxyd), og der tilsattes 0,005M MgS04.7H2P (som metalionaktivator) samt, udtrykt i g pr. liter sirup, 0,8 g metylparaben, 0,2 g propylparaben og 1,97 g natriumbenzoat (som preserveringsmidler). Den raffinerede glucosefødesirup førtes ved 60°C kontinuerligt til kolonnereaktoren med en strømningshastighed i området fra 0,6 til 2,4 ml fødesirup pr. minut.

pH-Værdien af influenten, altså glucosefødesirupstrømmen, holdtes på ca. 7,5 og effluentstrømmens pH overvågedes periodisk. Onder de indledende trin af isomerisationsreaktionen (ca. 24 timer) steg effluentstrømmens pH-værdi gradvis fra 6,0 til det ønskede 147579 15 område 7,0 til 7,5. Derefter holdt effluentstrømmens pH-værdi sig i det væsentlige inden for området 7,0 til 7,5, dog med den undtagelse at der konstateredes en pH-værdi på 6,9 ved 336 timer og 689 timer, en pH-værdi på 8,0 ved 2177 timer og på 8,5 ved 2201 timer. Tabel 1 viser illustrative konstaterede strømningshastigheder, procentdel af det samlede glucoseindhold . isomeriseret til fruktose, lejets isomeraseaktivitet, de samlede kumulative fruktoseudbytter eller produktivitet og pH-værdierne af effluen-ten (tilnærmelsesvis på 24 - 7 timers basis).

Af hensyn til sammenligning blev en kolonnereaktor derefter drevet under i det væsentlige samme betingelser, herunder 60°C og samme fødesirup med den forskel at der brugtes englucose-fødesirup med pH 8,5. Resultaterne af dette sammenligningsforsøg er vist i tabel 2.

i 147579 16 c m ia io in ιίΐ uiiiiifiininininininiiiuiininininininin CD β » * * o-*-»**·*'*''-''-'*'''** T3 5-1 Γ~ Γ'Γ^Ι^^Γ'Γ'Γ'Γ'Ι^Γ'Γ'Γ^Γ'Γ'Ι^Γ^Γ^Γ'

Bi-His ft ω & +i β 0) HaiC'icNimcNCNi'd'mcNicjif'orocM^inorotninLn β ' ^ ^ ^ ^ ^ * - * * ' ' - Η νΟ'ΛΓ-'Γ^Γ'Γ'Γ^Γ-'Γ'Γ^νΟΓ^Γ'Γ'Γ'Γ'Γ'-Ρ'Γ^Ρ'Ρ' m <m æ ft & •p 0) +)

•H

•H covovDinoomr'<Tiinin«3'roaiCMr-oHCNr'to 4J V "s X voooM^oooovoaiHcTiCMHoot-imcPii-ivoNin β Γ^ηΓ^ΗνοοΗιηιηΗ«3θΐη·^<πιχ>οιηΗΐηοο

τ) HHcafo^Lnvovor'r^cyiooc'iroinvDVD

0 r-l 1—I rH r-l rH r-l r-H

P

ft +> ε

<D >1 +1 N

•Η β mmhNinnif)HinH'iN(<iii)n\oN'f^mo H i> <u co H oirooi^cooiincomooroMomniaajio -Η ιηοοοοιησιοσι·^,Γοσ\Γ'ΗοσιΓ'ΐηη'Χ)'^<ΓθΓο i—I *P&1 1—I 1—I 1 I i I i I Cs] i 1 ΡΊ O*] [—I i—1 C-l (Ί| 1—I I—I 1—I I—! I—! I—I I—I 1—( <D X \

Λ i< H

tO tt

β i-)oc'ivoHococri'i'r''OOC'im«tfO<£>tninrocoH

M <D - - - - - - - - - ~ - - - ' - - - < » - -

4-ttn iiriNnintDniBNNNttitoniDiniooririN

O ncofnnforofofo-^^'ii'nnnn'a'cncnoocncc)

o\° -P

CO I (0(0--^00--^00-^-^0.511(000(000000(10000(0 •H *1—1 φ) K k. k> H k> >k k. ^ k. S W ^ +> <D β οο-^οασινο-ΐοο^'Γ'Γ'-ίΤ-^οιηίΝ'ςτιη'^'ηΓ^

ft Μ Ή Η H till r-l t—| t—1 i—I 1—I 1—I

0 Ό G I

1 (Mint>c>.'ci'ncri*s'ocMoooc^r''i'tnHoO'5i,fo<yt ,ΜΙ nrofO'i'r-'t-^rooioHHnfonHH(n->a,nnn (ϋ Ώ 1—1 r-I I—i Η O O rH 1—IrHrHi—li—! :—li—{1—!i—li—li—|(—!i—| ri Μ β (D IH O T3 G) *H C« rHr—IiHi—!rHr4iHr-ir-Hi—IpHi-Ir—IrHrHrHrHrHrHrHi—i

ft +> -H

β I Ή g g ocioononoo'3<cc>(o-ii'CMHHcocMr^inot^N(o -Q. tn\ mooincricocftoooor-iocor-'CftLntoHaitOLn-'a'

+1 Ή g r—I Ol CM r-l r-l i—1 r-l 1—li—li—li—|i—li—|i—li—lOi—I H H 1—Il—I

ω β υ

Μ - <D

Ό g t^^i*ror~Mroco(OHin(ocor'r^HinHr't^nr' -Η-H HCN>a<(ocnH(ooooonLni>r'Oii«4i'3'nininr' E-t+s r-iHcMMfororom-a'inin'or'OOoai 17 14(7579 co I ft 0)3 ininiflifiinuiininuiinininicitniniii TØL-WK Γ^Γ^Γ^Γ^Γ'Ι^Γ'Γ'Γ^Ι^Ρ'Γ-Γ'Γ'Γ'Ρ' &< (0 (¾ +> β 0) 3 in^in^^'fomiflnn^^nioin iw Γ^Γ^Γ^Γ^Γ'Γ^ΟΟΟΟΓ'Γ'Γ'Γ^Γ^Γ-Γ'Γ'.

Ή S M ft μ 0) μ Η > ri α)α>'3'ΝΗθΗσ>Ν«3'!-ισ*Γ'»νο·ςΐ'Γθ j ί X coortNffltomo'i^N'fVDinoio 3 οσ>Γοησισ\Η<ν)ΐηη<ώοοοο'!ΐ'Γ~Γθ irf toeiM'ihcoiKmoiOrtMin^'iiii ^ o HHCMCMracNCNcscsnnforonron

-P M

cO ft co •μ μ

O -MS

Ή 0)

—' +) N

-H G ncx3CNCTiVDfonntnooHcor^'i'Lnr~ H ><D aioon-"3icor--ioiot''QH,5ii'’3ico'^1->ai •H ΟΙΓΊΟΟΟΓ^νΟνΟ-'ΪΓ-'^ΟΙΟΙΟμ'-μ1-^

ιΗ *μ&> i—i i—l i—i i—c H

0) Ai \

Λ < W

(C.

t*l t

X

3 σι-ϊΐ'οοιονονο'ΦΓΟΝνοΓ-'ΗοιοοΌσ» i_j(D **»» ****.·***» min csooH(r)tocooacooo<TiocMiOfO'<31

o fOCNJOirMCMCMCVlrHHHHCSCMHHH

op μ

X Vi I

•μ ·η tys ίΟΝ'ΐΦβΌ'ίΝοιίΐΐΒίΟ'ί'ί'ί'ί >μ φ β **^*^*fc**%****·*·* ftM-H ocri'd'ojoooonocricoio-^'ofovo'a1 OOS l^¢MfOΓOlM(Nc^^ιocofonΓ^o^'¾,¾,¾, ^il •^ΓοησιοοιοΓοσιΟΓ'οονοοοοΗΟ njcox rH'iiionnM'^,fO'i,«airgHHfOHc>i

ΜβΟ) HHHHHHHHHHHHHHHH

mOT) -¾1¾1¾1^¾1^^^¾1¾1^¾1^¾1¾1¾1¾1 φ β K«fc**fc*,**%*»^«*K^***^

ft μ Ή HHHHHHHHHHHHHHHH

C

| rn VDlOOVOOllor'HHOOO'HlOHOfO

g g ncvioovDfocrivoiovorocMO'a'yj'sP

(fo i—lOCOCOJi—li—lOCNOOrHHHi—1 i—|t—li—I

P H g ω fi u μ fonoiOfOfor-'Hror'<T>iooo-^ioi

». Φ r'CNMCNnior^oojayoooocNcnH

Ό g OOJlOVOOHHCNCSCN'i'r'CnOOOl

Η H HHHHOI<N<MOICMCMOI01<\JfOMfO

^ +1 147579 18 m i a 0)3 ΐίΐιηι/ικιιηιηυιΐΛΐηιηΐίΐΐΛΐη

Qi-ri® cooooococococococooocococo fa to a

P

C

<D

IH r-cocococooooocooocooooooo m as h a -μ Q) •μ

•H

> •ri 4J MOinPlHUJhOlfflrO^iDP) 3 σιιΗίηΓ'-ονοοοΓΊσιΗΓ'Γονο rrj cviTfc^'^oovocMcTiomcriint^

0 HncNco^inminvovD

μ fa μ e 0) >i -μ n

•ri C

oi >0) rovocM'-a'iHoinocMvor'VD'^ •h nHCNivD'a,ncN)oonooLnin'^t' pH +>Cti Γ'-σινονονοιηιηοσίοοί'-σισι

QJ \ i—IrHrHi—IrHrHrHrH

Λ < fa (0 H Q) ^^fe*'»*****»*** (H CO (TiOt'^O'JC'-JOf'COi—lOO^'S’

O nncMnnncMH<Nojoj(MfM

di> +)

10 I

•rl’ntJI

Pf ^ >H H'X>OOrHiOCvjf*'H,^^V£>V£> 0 fQ β I HCMHHHCMCOfOCOfOCMCN] χ I hH{N(yiM^^Lonh^r>iin irjtox CMrom^Dr^cN^ocMCNiCNioo

r-fHHOOi—IHHHHHHH

iwOO

(D*HG ·*****·*.%.*►·**»*.·*·****►

p£ 4J ·Η HHHHHi—Ir—IHi—i i—I i—Ir—I H

c

1 -H

g g c^i-iHLn'>a,c\iinrofor^foinr-i

Q. tji\ NK)NCOCOCOHMO®«llOlD

Ih et*} ·>·*ν·»****.***.»*

+J -H g r-IC'JC'Ji—lt—li—IC'JC'Ji—li—li—li—Ir—I

tn c o μ »O) t^'S'roncocOrHinrot^t^-i-iin rQg Hc^^criHtDoooLnt^r^tN^ •H-ri HHCMnmn«^mm B +> 147579 19

Som vist i tabel 1 var isomeraseaktiviteten og udbytterne af fruktose oprindeligt lave ved isomerisationsreaktionen ved pH 7,0 til 7,5, men gradvis steg den til den optimale (konstaterede) isomeraseaktivitet på 2.491 enheder/g efter ca. 10 dages drift. Isomeraseaktiviteten for den til sammenligning gennemførte reaktion ved pH 8,5 var i begyndelsen signifikant højere og nåede optimal konstateret aktivitet på en dag. Selv om den oprindelige produktivitet for processen ved pH 7,0 til 7,5 var lavere end ved processen ved pH 8,5, oversteg den førstnævntes produktivitet sidstnævntes efter ca. 5 dages drift. Efter ca. 22,7 dages drift var den kumulative fruktoseproduktivitet for reaktionen ved pH

7.0 til 7,5 1.069,7 mod 676,2 for den ved pH 8,5 behandlede sirup (tabel 2).

Som det ses af de i tabel 1 viste data gik isomeraseaktiviteten og fruktose-produktiviteten ned da effluentstrømmen kom under pH 7,0 niveauet, men steg ved den påfølgende tilbagevending til området pH 7,0 til 7,5 (sammenlign fx de data der er vist for 305, 336 og 353 timer). De i tabel 1 viste data viser også at en effluent-pH på 8,0 til 8,5 signifikant vil nedsætte både isomeraseaktiviteten og fruktoseudbytterne, men således at de højere fruktoseproduktionsniveauer optræder ved tilbagevenden til området pH 7,0 til 7,5 (se fx de viste data for 2153 og 2223 timer). Disse for høje pH-værdier er uønskelige selv om de indtrådte senere i den kontinuerlige proces, og de kan påvirke den samlede fruktoseproduktivitet af lejet i ugunstig retning.

Tilbageværende eller residual isomeraseaktivitet (beregnet på at aktiviteten efter 17 timer er sat til 100%) for kolonnereaktoren drevet kontinuerligt med en pH 7,5 fødesirup var efter 3.000 timer over 30% og efter 3.200 timers kontinuerlig drift over 28%. På basis af den maximale konstaterede aktivitet af isomerase-lejet (236 timer) forekom 25% aktivitetsniveauet (dvs. 75% deaktivering) først efter ca. 2.500 timer. Der behøvedes ca. 2.978 timers drift før lejet var gået ned til en aktivitet på 20%, mens de beregnede aktivitetsniveauer på 15%, 12,5% og 10% indtrådte ved 3.555 timer, 3.920 timer og 4.368 timer. Til sammenligning vil den reaktor der drives med en fødesirup med pH 8,5 give et beregnet 20%'s aktivitetsniveau efter ca. 990 timer, 15% aktivitet ved 1.175 timer, 12,5% ved 1.292 timer og 10% aktivitet efter 1.436 timers drift. Den samlede beregnede produktivitet ned til 147579 20 en aktivitet på 10% (regnet på basis af den maximale aktivitet af kolonnen) for fødematerialet med pH 7,5 er 3.873, mens den er 1.017 for pH 8,5 processen. Den gennemsnitlige halveringstid for isomerasen i tabel 1 var 1.389,64 timer mod 445,33 timer for iso-merasen der i henhold til tabel 2 blev drevet ved pH 8,5.

Den fruktoserige effluentstrøm i forsøg i henhold til tabel 1 var klarere og indeholdt mindre mængder forureninger og behøver mindre raffinering for at komme i kommercielt acceptabel form end effluentstrømmen frembragt under de i tabel 2 angivne betingelser.

I tabellerne 1 og 2 viser kolonnerne, regnet fra venstre til højre, først drifttiden, angivet som tiden i timer. Derefter 3 vises strømningshastigheden i cm pr. minut. Den kolonne hvis hoved hedder refraktionsindex angiver effluentsiruppens refraktive index ved 45°C. Kolonnen optisk drejning viser den optiske rotation af effluent-fruktosesiruppen (ved 20 cm cellevej og 25°C). Aktiviteten i E/g enzym (enheder/g enzym) er den beregnede akti- i vitet for isomerasen i enheder pr. g isomerase. Produktivitetskolonnen angiver den samlede kumulative mængde sirup-tørstof som er frembragt af kolonnen, og regnet på basis af isomerisation til en 42%'s fruktosesirup (tørstofbasis). Effluent-pH viser effluent-strømmens pH-værdi, og fødestrømmens pH-værdi er angivet i kolonnen yderst til højre.

De rapporterede procentuelle fruktoseværdier for effluentstrømmen bestemtes ud fra værdierne for refraktionsindex og optisk drejning ved følgende drejninger: Vægt% tørstof eller "% ts" = (487,74) (refraktionsindex) -639,72.

Specifik rotation eller -SR" = <|°°> drejning) % fruktose = 38,7 - (0,63) (SR)

Kolonnen "aktivitet, E/g enzym" repræsenterer lejets isomerase-aktivitet (udtrykt ved fruktoseaktiviteten i enheder pr. g isomerase) for de angivne tidspunkter, og værdierne blev beregnet på følgende måde: t47$?t 21

Isomeraseligevægtskonstant eller "ILK" = (0,513) (% monosakkarid-tørstof i fødesirup) 100

Aktivitet, E/g enzym =

(% ts) (60) (cm3/min.) (10) (1,2) (ILK) r ILK

g enzym x -*-ηβ lILK - %F/100J

hvor F betegner fruktose, ln betegner den naturlige logaritme, 3 e 3 60 (cm /min.) angiver fødesiruppens strømningshastighed i cm pr.

time og g enzym angiver det samlede antal g isomerase i kolonnen. Desuden betegner "% monosakkarid-tørstof i fødesiruppen" den samlede procentandel af fruktose og dextrose (beregnet som tørstof på tørstofindholdet) i fødesiruppen; tallet var 96%.

Før ladningen af kolonnen var den oprindelige aktivitetsværdi for den immobiliserede isomerase, "Sweetzyme"® E, der anvendtes i nærværende eksempel målt ved den foran nævnte standardbestemmelsesmetode, 600 glucoseisomeraseenheder pr. g isomerase (udtrykt i mikromol/min. i forhold til aktiviteten i enheder pr. g enzym i mg/time).

Ved drift af større kolonner er opretholdelse af pH-værdien i området 7,0 til 7,5 lettere (fx ved hjælp af indre pH-følere) end ved drift i mindre målestok. Tilsvarende kan man ved stor kolonnedrift lettere opretholde et konstant procent fruktoseindhold i siruppen ved hjælp af et fruktose-analyseapparat i effluent-strømmen, således at det bliver muligt at foretage manuel eller mekanisk regulering af fødesiruppens strømningshastighed for at give konstant fruktosekoncentration i effluent-fruktosestrømmen.

Den tørre immobiliserede glucoseisomerase, der er anvendt i dette eksempel, kan forbehandles i 30 minutter ved stuetemperatur (fx 23°C) og pH 7,5 med dextrosefødemateriale som indeholder koboltioner (fx 0,001M kobaltonitrat) og 0,02M magniumsulfit med henblik på at hydratisere og sikre at isomerasen indeholder den fulde mængde koboltoioner før begyndelsen af isomerisationsprocessen.

Dette eksempel belyser høj fruktoseproduktivitet uden tilsætning af nogen koboltoioner til fødesiruppen.

Eksempel 2 22 147579

Under anvendelse af samme raffinerede glucosesirup og ko-lonnereaktorsystem som i eksempel 1 førtes to forskellige føde-sirupper kontinuerligt til glucoseisomerisations-kolonnereakto- rer. Isomerasen C'Novo" SP-113B) stammede fra Bacillus coagulans og var immobiliseret over glutaraldehyd-tværbinding og sprøjtetørret som angivet i hollandsk offentliggjort patentansøgning nr. 73.12524. Sigteanalyse for sprøjtetørret immobiliseret isome-rase udviste 69% på sigte nr. 20. Ved det ene forsøg indførtes en dextrosefødesirup indeholdende Ο,ΟΟδΜ natriumbisulfit (som puffer) og 0,009M epsomsalt (MgSO^,?^© - metalionaktivator) ved pH 7,5 og 60°C kontinuerligt i kolonnereaktoren med strømnings- 3 hastigheder fra 1,62 til 6,18 cm /minut. Fødesiruppen i sammenligningsforsøget var den samme, dog med den forskel at den blev reguleret til pH 8,5 uden tilsat natriumbisulfitpuffer og holdtes

O

på en strømningshastighed på 0,80 til 4,54 cm /minut.

På lignende måde som i eksempel 1 var forsøget ved pH 7,5 signifikant mere produktivt end forsøget ved pH 8,5. Efter 1891 timers kontinuerlig brug havde kolonnen ved pH 7,5 28% af sin maximale isomereaselejeaktivitet tilbage med en produktivitet på 3,011. Den reaktor der arbejdede ved pH 8,5 var gået ned til en aktivitet på 21% efter 833 timer med en produktivitet på kun 838.

Eksempel 3

Forsøget ved pH 7,5 i eksempel 2 blev gentaget med forskellige isomerisationstemperaturer i området 55-65°C. Den oprindelige isomeraseaktivitet ved 65°C var væsentlig højere end ved 60°C (1,5 gange så stor), men ved længere tids brug blev produktiviteten og aktiviteten væsentligt under forsøget ved pH 7,5 i eksempel 2. De beregnede produktiviteter ved forskellige drifttemperaturer og kontinuerligt gennemført indtil isomeraselejets aktivitet var gået ned til 10% af den oprindelige aktivitet var 6.994 ved 55°C; 6.295 ved 56°Cj 5.670 ved 57°C; 5.110 ved 58°C; 4.608 ved 147579 23 59°Cf 4.158 ved 60°C; 3.754 ved 61°C? 3.392 ved 62°C} 3.066 ved 63°C; 2.773 ved 64°C og 2.510 ved 65°C. Kolonnedrift ved temperaturer på 55-60°C resulterer i en samlet stigning i produktionsudbyttet af fruktose på fra 179% til 66% over produktionsudbyttet ved 65°C.

/