DK146298B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af 1-n-substituerede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler eller syreadditionssalte deraf - Google Patents

Description

146298

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte 1-N-substi-tuerede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-l,3-diamino-cyclitolerne gentamicin B, gentamicin B^, 5 gentamicin C , gentamicin C, , gentamicin C-, gentamicin C2^i gentamicin sisomicin, verdami- cin, Antibiotikum G-418, Antibiotikum 66-4OB,

Antibiotikum 66-40D, Antibiotikum JI-20A, Antibiotikum JI—20B, Antibiotikum G-52, mutamicin 1, mutamicin 2» mu-10 tamicin 4, mutamicin 5 og mutamicin 6, hvor substituenten er -ch2x hvor X er hydrogen, alkyl, alkenyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, N-alkylaminoalkyl, 15 aminohydroxyalkyl, N-alkylaminohydroxyalky1, phenyl eller benzyl, hvilke aliphatiske grupper har op til 7 C-atomer og, hvis de er substitueret med både amino og hydroxy, basrer substituenterne på forskellige carbonatomer, eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, 20 og fremgangsmåden er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Der kendes bredspektede antibakterielle midler, der kemisk kan klassificeres som 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler. Værdifulde antibakterielle midler fra 25 denne gruppe er sådanne, hvori aroinocyclitolen er 2-de-oxystreptamin eller et derivat deraf med aminofunktioner i stilling 1 og 3. Særligt værdifulde antibakterielle forbindelser blandt 4,6-di-(aminoglycosyl)-2-deoxystrep-taminerne er de, hvori aminoglycosylgruppen i stilling 6 30 er en garosaminylgruppe. Inden for klassen af 4-aminogly-cosyl-6-garosaminyl-2-deoxystreptaminer findes antibioti- 2 146298 ka, såsom gentamiciner B, B^, C^, Cla, C2' C2a' C2b og X2, sisomicin, verdamicin, Antibiotikum G-418, Antibiotikum G-52, Antibiotikum JI-20A og Antibiotikum JI-20B.

De ved den foreliggende analogifremgangsmåde frem-5 stillede hidtil ukendte 1-N-substituerede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-l,3-diaminocyclitoler eller syreadditionssalte deraf har vist sig at være bredspektrede antibakterielle midler, der udviser fordelagtig aktivitet over for mange organismer, i særdeleshed gram-negati-lo ve organismer, og udmærker sig i denne henseende sammenlignet med kendte antibakterielle midler, således son nærmere dokumenteret nedenfor, hvor de omhandlede forbindelser er sanmenlignet med kendte 1-N-substituerede 4,6-di-(aminoglycosyl)“l,3-diaminocyclitoler, hvor 1-N-substituenten er én acylgruppe. Derivaterne udmærker sig 15 navnlig ved at være aktive over for gram-negative organismer, der er resistente over for de tilsvarende kendte l-N-usubstituerede 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler.

Indbefattet blandt de substituenter, der kan udgøres af gruppen CH^X i de hidtil ukendte forbindelser, er li-2o gekædede og forgrenede alkylgrupper, såsom ethyl, n-pro-pyl, n-butyl, Ø-methylpropyl, n-pentyl, Ø-methylbutyl, γ-methylbuty1 og β,β-dimethylpropyl, n-hexyl, δ-methy1-pentyl, Ø-ethylbutyl, γ-ethylbutyl, n-heptyl, 6-methyl-heptyl, Ø-ethylpenty 1, γ-ethylpentyl, δ-ethyIpenty 1, γ-25 propylbutyl, n-octyl, iso-octyl, Ø-ethylhexyl, δ-ethyl-hexyl, £-ethylhexyl, Ø-propylpentyl og γ-propylpentyl, alkenylgrupper, såsom β-propenyl, β-methylpropenyl, 0-butenyl, β-methyl-Ø-butenyl og Ø-ethy1-0-hexenyl, hydroxysubstituerede ligekædede og forgrenede alkylgrupper, såsem 3 o f -hydroxypentyl, β -hydroxy- V -methylbutyl, (i -hydroxy- β -methylpro-pyl, S -hydroxybutyl, β -hydroxypropyl, Y -hydroxypropyl og ^-hydroxy-octyl, aminosubstituerede ligekædede og forgrenede alkylgrupper, såsom £-aminopentyl, (3 -aminopropyl, V -amino-propyl, S -aminobutyl, fi-amiro.-Y -methylbutyl og^-amino-35 octyl og mono-N-alkylerede derivater deraf, såsom N-me-thyl-, N-ethyl- og N-propylderivater, f.eks. é’-methyl-aminopentyl, β-methyl-amonipropyl, p-ethylaminopro- 3 146298 pyl, δ-methylaminobutyl, β-methylamino-Y-methylbutyl og ω-methylaminobutyl, amino- og hydroxydisubstituerede li-gekædede og forgrenede alkylgrupper, såsom β-hydroxy-6-aminopentyl, Y-hydroxy-Y~methyl-6-aminobutyl, . β-hydroxy-5 δ-aminobuty1, β-hydroxy-Y-aminopropyl og β-hydroxy-β-methyl-Y-aminopropyl, og mono-N-alkylerede derivater deraf, såsom β-hydroxy-C-methylaminopentyl, γ-hydroxy-Y-methyl- δ-methylaminobutyl, β-hydroxy-δ-methylaminobutyl, β-hydroxy-Y-ethylaminapropyl og β-hydroxy-β-methyl-γ-methyl-10 aminopropyl.

Forbindelserne er fortrinsvis l-N-Cl^X-derivater indeholdende garosaminyl som 6-aminoglycosidgruppe og navnlig indeholdende 2-deoxystreptamin som 1,3-diamino-cyclitol.

15 2-Deoxystreptamin forefindes i alle de i det fore gående anførte forbindelser, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, undtagen mutamicinerne.

1,3-Diaminocyclitolkernen i hver af l-N-CH2X-mutamici-nerne 1, 2, 4, 5 og 6 er henholdsvis streptamin, 2,5-20 dideoxystreptamin, 2-epi-streptamin, 5-amino-2,5-dideoxy-streptamin og 5-epi-2-deoxystreptamin.

l-N-CH2X-4-Aminoglycosyl-6-garosaminyl-2-deoxystrep-taminerne, der fremstilles ved den foreliggende fremgangsmåde, er derivaterne af gentamicin B, gentamicin B^, 25 gentamicin C^, gentamicin Cla, gentamicin C2, gentamicin C2a/ ?entamicin C2b' sisomisin, verdami- cin, Antibiotikum G-418, Antibiotikum JI-20A, Antibiotikum JI-20B og Antibiotikum G-52, hvilke forbindelser er defineret ved følgende strukturformel I: 30

?H2 j NHCH2X

T-x 35 ® L-o * \ 4 146298 hvori X har den tidligere betydning, og hvori Y er en aminoglycosylgruppe valgt fra gruppen bestående af: &a NH0 GH3

2 2 J

NH2-- “ i-n:ch2x- i-n-gh2x.

hq N'\F / gentamicin B) nJ γ/ gentamicin B^)

OH 0H

10 CH3ffl-|!3 [ζ (j 1-N-GH2X- Ιζ . J>|_(i 1-N-CH2X- gentamicin C^) N\v gentamicin C^) NH2 NH2

15 CH CH

m2—Lr — nh2 / >L(i 1-N"CH2X- K J>L (i 1-Ν-0Η2χ- gentamicin C^). l\j gentamicin C^) 20 NH2 NH2 ch2nhch3 / \l (i 1-N-GH X-25 N|_gentamicin C^) nh2 CH CH NH, --i- nh2 * 30 (i 1-N-CH2X- (i 1-N-CH X- \i i,/ verdamicin) n. sisomicin; nh2 nh2

CH NH CH

__i nh2 kf^OH (i (i i-N-C^"

Antibiotikum „j/V 9H Antibiotikum

Ho ^—γ jτ_20Α) ho —y ji_2ob) nh2 nh2 146298 5 CH„NHCH, I 2 3 HO-- U l-S-OHJE- (1 .5 \-Y ££“·***“ “tlim HH2 og NH2

Andre nyttige l-N-CH2X-4,6-di-(aminoglycosyl)-2-deoxystreptaminer, der fremstilles ved fremgangsmåden i-følge opfindelsen, omfatter l-N-CH2X-Antibiotikum 66-40D 10 med følgende formel III (som er blandt de foretrukne forbindelser) : ch2nh2 nh2 NH2

III

o 20 HO/) w—1 25 hvori X har den tidligere angivne betydning, og 1-N-CH2X-Antibiotikum 66-4oB med følgende formel IV:

NH

fH2NH2 L_1 HHGH„X

( 1V OH

hvori X har den tidligere angivne betydning.

6 146298 l-N-CH2X-mutamicinerne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, indbefatter 1-N-CH2X- 4-amino-glycosyl-6-garosaminyl-l,3-diaminocyclitoler med følgende formel V: 5 ™2m2 F2 V2

J-^ J—L NHCH„X

NH2 w5

10 V

0

HO J-Q

15 hvori X har den tidligere angivne betydning, og 2 5

i l-N-CH„X-mutamicin 1 betegner V og W hydro-2 5Z

gen og W og V hydroxy, 20 i l-N-CH2X-mutamicin 2 betegner W2, V2, og V5 hydrogen, 2 5 i l-N-CH„X-mutamicin 4 betegner W og W hydro-2 52 gen og V og V hydroxy, i 1-N-CH-X-mutamicin 5 betegner W2, V2 og 5 ^ 25 hydrogen og V amino , og i l-N-CH2X-mutamicin 6 betegner W2, V2 og V~* hydrogen, medens WD betegner hydroxy.

I de her anførte strukturformler betegner bindingsafslutninger uden anførte substituenter hydrogen-30 atomer.

De farmaceutisk acceptable syreadditionssalte af l-N-CH2X-4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolerne med formlerne I, II, III, IV og V fremstilles på i og for sig kendt måde, såsom ved neutralisering af den frie 35 base med den pågældende syre, sædvanligvis til pH ca. 5. Hensigtsmæssige syrer til dette formål indbefatter syrer, såsom saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre, salpetersyre, hydrogenbromidsyre, eddikesyre, propionsyre, ma- 7 14629$ leinsyre, ascorbinsyre og citronsyre. Syreadditionssaltene af l^N-C^X-i,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclito-lerne kan karakteriseres som hvide faste stoffer, som er opløselige i vand, sparsomt opløselige i de fleste andre 5 polære opløsningsmidler og uopløselige i ikke-polære organiske opløsningsmidler.

l-N-CH2X-4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocycli-tolerne som defineret ved formlerne I, III, IV og V samt deres ikke-toksiske farmaceutisk acceptable syre-1Q additionssalte udviser som nævnt i almindelighed en bredspektret antibakteriel virkning. Specielt 1-N-al-· kyl -derivaterne har forbedrede antibakterielle virkninger sammenlignet med de tilsvarende 1-N-usubstituerede antibiotika, hvilket specielt manifesterer sig i en forøget 15 aktivitet af forbindelserne over for organismer, der er resistente over for den 1-N-usubstituerede forbindelse. Forbindelserne er således f.eks. mere aktive over for organismer, som inaktiverer de tilsvarende 1-N-usubstituerede antibiotika ved acetylering af 3-aminogruppen 20 og/eller adenylylering af 2"-hydroxy1-gruppen. Af disse forbindelser udviser nogle også anti-protozoale, anti-amøbiske og anthelmintiske egenskaber.

En foretrukken gruppe forbindelser er de 1-N-sub-stituerede derivater af 4-aminoglycosyl-6-garosaminyl-2-25 deoxystreptaminerne gentamicin B, gentamicin B^, gentamicin C^, gentamicin C^a, gentamicin Q.^· sisomicin, verdamicin, Antibiotikum JI-20A, Antibiotikum JI-20B, Antibiotikum G-52 og Antibiotikum G-418, af hvilke derivaterne af gentamicin C^, gentamicin C^a, sisomi-30 cin, verdamicin og Antibiotikum G-52 er de mest foretrukne. Andre særligt nyttige forbindelser er de 1-N-substituerede derivater af Antibiotikum 66-40B.

I 1-N-substituenten er X fortrinsvis valgt blandt hydrogen, alkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, aminohydroxy-35 alkyl, phenyl eller benzyl, hvilke alifatiske grupper har op til 7 carbonatomer og, hvis de er substitueretmed både amino og hydroxy, bærer substituenterne på forskellige carbonatomer. Af disse er de foretrukne grupper 8 146298 hydrogen, alkyl, aminoalkyl og hydroxyalkyl med op til 7 carbonatomer og aminohydroxyalkyl med op til 3 carbon-atomer og bærende substituenterne på forskellige carbonatomer .

5 Særligt nyttige forbindelser er sådanne, hvor X

betegner hydrogen, methyl, ethyl og propyl, og fortrinsvis methyl og ethyl. En særlig værdifuld gruppe er de 1-N-CH2X-4-aminoglycosyl-6-garosaminyl-2-deoxystreptaminer med formlen I, hvori X betegner en alkylgruppe 10 med 1-3 carbonatomer, specielt 1-N-(C^-C^ alkyl)- derivater af gentamicin C^, gentamicin C^a, gentamicin C2, gentamicin C2a, gentamicin , sisomicin, verdami-cin og Antibiotikum G-52, såvel som l-N-iS^-C^ alkyl)-Antibiotikum 66-40D med formlen III, hvilke derivater er 15 bredspektrede antibakterielle midler, der er aktive over for gram-positive bakterier (f.eks. Staphylococcus aureus) og gram-negative bakterier (f.eks. Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa), som påvist ved standfortyndingsforsøg, indbefattende bakterier, der er resistente 20 over for de 1-N-usubstituerede forstadier. Særligt nyttige er 1-N-ethy1verdamicin (fysiske data for denne og følgende specielt anførte forbindelser, se nedenstående eksempler) og 1-N-alkyl-sisomiciner, f.eks. 1-N-methyl-sisomicin, 1-N-(n-propyl)sisomicin, 1-N-(n-butyl)sisomi-25 cin og fortrinsvis 1-N-ethyl-sisomicin, der udviser aktivitet over for gram-negative organismer, som er resistente over for forbindelsernes 1-N-usubstituerede forstadier. Andre særligt nyttige forbindelser er 1-N-ethyl-gen-tamicin C-^a, 1-N-ethyl-gentamicin C^, 1-N-ethyl-Antibio-30 tikum G-52, 1-N-(n-propyl)-verdamicin, 1-N-(δ-aminobutyl) -sisomicin, 1-N-(n-butyl)-verdamicin og 1-N-(S-2-hydroxy -4-aminobutyl)-gentamicin C-^.

De fleste af de ovennævnte 1-N-usubstituerede 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol-antibiotika, ud 35 fra hvilke de omhandlede 1-N-substituerede derivater kan fremstilles, er kendte. De udgangsforbindelser, der heri betegnes gentamicin C2a og C^, isoleres og karakteriseres, som angivet i det følgende under Fremstilling 1 og 2.

U6298 9

Isoleringen af, egenskaberne af og plankonfigurationen for gentamicin C2 fremgår af beskrivelsen til U.S. patent nr. 3.651.042.

Antibiotikum 66-40B og Antibiotikum 66-40D, deres 5 fremstilling, isolering, egenskaber og konfiguration fremgår af beskrivelsen til belgisk patent nr. 811.370.

Disse antibiotika fremstilles sammen med sisomi-cin, der er hovedproduktet ved fermenteringen af Micro-monospora inyoensis (omtalt i beskrivelsen til bri- ' ’ 1Q tisk patent nr. 1.274.518), og kan skilles fra fermenteringsmediet ved anvendelse af specielt chromatografisk separationsteknik.

Mutamicin 1, 2, 4, 5 og 6, hvis konfiguration er vist i det foregående, kan fremstilles ved dyrkning af 15 en mutantstamme af Micromonospora inyoensis heri betegnet Micromonospora inyoensis stamme 1550F-1G i et vandigt næringsmedium. Denne mutantstamme er ude af stand til at danne et antibiotikumm, når den dyrkes under submerse aerobe betingelser i et vandigt næringsmedium uden 20 1,3-diaminocyclitol-byggeblokken. Når imidlertid visse sådanne forbindelser sættes til fermenteringsmediet, dannes mutamicinerne. Når 2-deoxystreptamin sættes til fermenteringen, dannes det kendte antibiotikum sisomjfcin.

De fornødne 1,3-diaminocyclitoler, som skal være 25 til stede under fermenteringen for at opnå mutamicinerne, er følgende: streptamin til mutamicin 1 2,5-dideoxystreptamin til mutamicin 2 · 2-epistreptamin til mutamicin 4 30 2,5-dideoxy-5-aminostreptamin til mutamicin 5 5-epi-2-deoxystreptamin til mutamicin 6.

Fremstillingen af mutamicinerne er beskrevet i den alment tilgængelige svenske patentansøgning nr.

7409945-8.

35 Af de anvendte fremstillingsmetoder a) til f) for de omhandlede 1-N-substituerede derivater bliver ved fremgangsmåden a) en tilsvarende 4,6-di-(aminoglycosyl)- 1,3-diaminocyclitol, der kan have amino-beskyttelsesgrup- 146298 ίο per ved en hvilken som helst anden aminogruppe end den i 1-stillingen, behandlet med et aldehyd med formlen

X'-CHO

hvor X1 er en gruppe som defineret for X ovenfor, hvori 5 enhver tilstedeværende amino- eller hydroxygrupper kan være beskyttet, i nærværelse af et hydriddonor-redukti-onsmiddel, hvorpå, om påkrævet, alle i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, hvilket sidste procestrin efterfølges af iso-10 lering af derivatet som sådant eller som et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

Denne fremgangsmåde, hvorved 1-aminogruppen i en 1-N-usubstitueret 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyc-litol selektivt kondenseres med et aldehyd og samtidig 15 reduceres in situ til dannelse af en antibakterielt virksom l-N-alkyl-4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyΟΙ itol, udføres sædvanligvis ved stuetemperatur i nærværelse af atmosfærisk luft, men den kan med fordel udføres under en indifferent atmosfære, f.eks. argon eller 20 nitrogen. Reaktionen fuldføres med fordel i løbet af kort tid, sædvanligvis mindre end 30 minutter, bestemt ved tyndtlagschromatografi.

Hydriddonor-reduktionsmidler, der kan anvendes ved denne fremgangsmåde, indbefatter dialkylaminoboraner 25 (f.eks. dimethylaminoboran, diethylaminoboran og fortrinsvis morpholinoboran), tetraalkylammoniumcyanobor-hydrider (f.eks. tetrabutylammoniumcyanoborhydrid), al-kalimetalborhydrider (f.eks. natriumborhydrid) og fortrinsvis alkalimetalcyanoborhydrider (f.eks. lithiumcy-30 anoborhydrid og natriumcyanoborhydrid).

Fremgangsmåden udføres hensigtsmæssigt i et indifferent opløsningsmiddel. Ved "indifferent opløsningsmiddel" menes et vilkårligt organisk eller uorganisk opløsningsmiddel , hvori 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diami-35 nocyclitol-udgangsmaterialerne og reagenserne er opløselige, og som ikke vil gribe ind i processen under reak- 11 146298 tionsbetingelserne for denne, således at der forekommer et minimum af konkurrerende sidereaktioner. Selvom vandfri aprotiske opløsningsmidler undertiden kan anvendes med fordel ved fremgangsmåden (såsom tetrahydrofuran, 5 når der anvendes morpholinoboran som hydriddonor-reduk-tionsmiddel), udføres fremgangsmåden sædvanligvis i pro-tiske opløsningsmidler, f.eks. i en lavere alkanol eller, fortrinsvis, i vand eller i en vandig lavere alkanol (f.eks. vandig methanol, vandig ethanol), men der kan 10 også anvendes andre med vand blandbare co-opløsningsmid-delsystemer, såsom vandig dimethylformamid, vandig hexa-methylphosphoramid, vandig tetrahydrofuran og vandig ethylenglycoldimethylether.

Fremgangsmåden udføres hensigtsmæssigt ved et pH 15 i området 1-11, fortrinsvis 2-5, og forløber bedst i området 2,5 til 3,5. Det sure medium, som foretrækkes, kan opnås ved tilsætning af en organisk eller uorganisk syre til 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolen.

Derved dannes syreadditionssalte af forbindelserne. Der 20 kan anvendes en vilkårlig organisk syre, såsom eddikesyre, trifluoreddikesyre eller p-toluensulfonsyre, eller uorganisk syre, såsom saltsyre, svovlsyre, phosphorsyre eller salpetersyre. Det er mest hensigtsmæssigt at anvende svovlsyre. Ifølge en foretrukken udførelsesform 25 for fremgangsmåden er det også hensigtsmæssigt at fremstille syreadditionssalt-udgangsforbindelsen in situ ved tilsætning af den ønskede syre (f.eks. svovlsyre) til en opløsning eller suspension af 4,6-di-(aminoglycosyl)- 1,3-diaminocyclitolen (f.eks. sisomicin) i et protisk 30 opløsningsmiddel (f.eks. vand), indtil opløsningens pH er indstillet på det ønskede pH.

Typiske aldehyder med formlen X'CHO, hvori X' har den tidligere angivne betydning, som kan anvendes ved fremgangsmåden, indbefatter ligekædede eller forgrenede 35 alkylaldehyder, såsom formaldehyd, acetaldehyd, n-pro-panal, n-butanal, 2-methylpropanal, n-pentanal, 2-methyl-butanal, 3-methylbutanal, 2,2-dimethylpropanal, n-hexa-nal, 2-ethylbutanal, n-heptanal og n-octanal, alkenylal- 12 146298 dehyder, såsom propenal, 2-methylpropenal, 2-butenal, 2-methyl-2-butenal og 2-ethyl-2-hexenal, benzaldehyd og phenylacetaldehyd, hydroxysubs ti tuerede, ligekædede eller forgrenede alkylaldehyder, såsom 5-hydroxypentanal, 2-hyd-5 roxy-3-methylbutanal, 2-hydroxy-2-methylpropanal, 4-hyd-roxybutanal, 2-hydroxypropanal og 8-hydroxyoctanal, ami-nosubstituerede ligekædede eller forgrenede alkylaldehyder, såsom 5-aminopentanal, 2-aminopropanal, 3-aminopro-panal, 4-aminobutanal, 2-amino-3-methylbutanal og 8-ami-10 nooctanal, og mono-N-alkylderivater deraf, og amino- og hydroxydisubstituerede ligekædede eller forgrenede alkylaldehyder, såsom 2-hydroxy-5-aminopentanal, 3-hydroxy-3-methyl-4-aminobutanal, 2-hydroxy-4-aminobutanal, 2-hydroxy- 3 -aminopropanal , 2-hydroxy-2-methyl-3-aminopropanal 15 og 2-amino-3-hydroxyoctanal, og mono-N-alkyl-derivater deraf.

Hvis aldehydet har et chiralt center, kan man ved denne fremgangsmåde anvende de enkelte enantiomere separat eller sammen som et racemat, og der vil blive vundet 20 tilsvarende diastereoisomere eller en blanding deraf.

De aldehydreagenser, der kan anvendes ved fremgangsmåden, er enten kendte forbindelser, eller de kan let fremstilles ud fra kendte forbindelser under anvendelse af på området velkendte fremgangsmåder. Således 25 kan f.eks. alkylaldehyder substitueret med både hydroxy-og aminogrupper (f.eks. 2-hydroxy-5-aminopentanal) fremstilles ud fra et aminoaldehydacetal (f.eks. 4-aminobu-tanaldiethylacetal) ved beskyttelse af aminogruppen deri som en acetamido- eller phthalimidogruppe under anvendel- O Λ se af kendte metoder efterfulgt af fjernelse af acetal- funktionen ved sur hydrolyse, hvorved der vindes et N- beskyttet aminoaldehyd (f.eks. ved overføring af 4-ami- nobutanaldiethylacetal i det tilsvarende N-phthalimido- derivat, som ved sur hydrolyse giver 4-phthalimidobuta-3 5 nal). Behandling af det N-beskyttede aminoaldehyd med hydrogencyanid giver den tilsvarende N-beskyttede aminoalkylhydroxynitril (f.eks. 2-hydroxy-5-phthalimido- 146298 13 valeronitril), som ved katalytisk reduktion (f.eks. med hydrogen i nærværelse af palladium) eller ved hydridre-duktion (f.eks. med diisobutyl-aluminiumhydrid) giver et N-beskyttet aminohydroxyaldehyd (f.eks. 2-hydroxy-5-5 phthalimidopentanal), som er et aldehydreagens, der anvendes ved denne fremgangsmåde.

Ved udøvelse af fremgangsmåden på den måde, hvor en 1-N-usubstitueret 4,6-di-(aminoglycosyl)-l,3-diamino-cyclitol behandles med en hydriddonor og et aldehyd til 10 opnåelse af det tilsvarende 1-N-substituerede derivat af en 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, er det for at begrænse konkurrerende sidereaktioner til et minimum, når et aminoaldehyd anvendes som reagens, foretrukket at beskytte aminogruppen i aldehydet, f.eks. med 15 en acylblokeringsgruppe, såsom acetamido eller phthali-mido, før udøvelse af fremgangsmåden, og derpå fjerne den N-beskyttende gruppe i den derved dannede forbindelse . Det kan også være fordelagtigt at beskytte hydroxy-gruppen i hydroxyholdige aldehyder ved udøvelse af frem-20 gangsmåden. Dette er imidlertid almindeligvis ikke nødvendigt.

Det er også muligt at anvende acetalen eller he-miacetalen af aldehydreagenset i surt medium, hvilket bevirker dannelse in situ af det fornødne aldehyd.

25 En hensigtsmæssig måde til udøvelse af fremgangs måden omfatter fremstilling af en opløsning af en anti-bakterieltvirksom 1-N-usubstitueret 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol (f.eks. sisomicin eller verda-micin) i et protisk opløsningsmiddel (fortrinsvis vand) 30 og indstilling af opløsningens pH til fra ca. pH 2 til ca. pH 5 med en syre (sædvanligvis fortyndet svovlsyre), hvorved der dannes det fornødne syreadditionssalt af udgangsforbindelsen. Når opløsningens pH er ca. 5, indeholder det derved fremstillede syreadditionssalt sædvan-35 ligvis ét ækvivalent syre for hver aminofunktion af 4,6-di- (aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolen (f.eks. er der pr. mol sisomicin 2,5 mol svovlsyre til stede). Efter fremstillingen af syreadditionssaltopløsningen tilsættes 14 146298 der mindst ét molækvivalent og fortrinsvis et stort molært overskud af det ønskede aldehyd (f.eks. acetalde-hyd, propanal eller butanal) efterfulgt i løbet af kort tid (sædvanligvis ca. 5 minutter) af tilsætningen af ca.

5 1 molækvivalent (baseret på udgangs-4,6-di-(aminoglyco- syl)-1,3-diaminocyclitolen) af et hydriddonor-reduktLons-middel, fortrinsvis et alkalimetalcyanoborhydrid, sædvanligvis natriumcyanoborhydrid. Reaktionen er ofte afsluttet på mindre end 30 minutter, som påvist ved tyndt-10 langschromatografi, og der opnås det tilsvarende 1-N-substituerede derivat af en 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diamino-cyclitol (f.eks. 1-N-ethylsisomicin eller 1-N-ethylverdamicin). Isolering og rensning af det derved fremstillede derivat udføres under anvendelse af kendt 15 teknik, såsom fældning, ekstraktion og fortrinsvis chro-matografisk teknik.

Nævnte fremgangsmåde tilvejebringer således en hensigtsmæssig én-beholderproces, hvorved et aminoglycosid omsættes in situ med et aldehyd (for-20 trinsvis i overskudsmængder) og med et hydriddonor-re-duktionsmiddel til fremstilling af, som hovedproduktet, et mono-N-substitueret derivat (f.eks. 1-N-ethylsisomi-cin), ved hvilken fremgangsmåde 1-aminogruppen bundet til et sekundært carbonatom sædvanligvis alkyleres for-25 trinsvist sammenlignet med andre aminogrupper knyttet til primære og andre sekundære carbonatomer i 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol-udgangsmaterialet.

Det er også muligt at anvende delvist N-beskyttede 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler som ud-30 gangsmaterialer ved nævnte fremgangsmåde. I almindelighed kan de 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler, der har en gruppe -CH^N^ som 6'-delen, være N-beskyttet ved denne stilling, da denne gruppe ved blokeringsproceduren er den mest reaktive. Sisomicin kan være beskyttet 35 i stilling 6' eller i stillingerne 2' og 6' eller i stillingerne 21, 3 og 6'. Andre aminobeskyttende grupper kan være brodannende grupper i stillingerne 3", 4", såsom 15 148298 carbonyl, i de 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocycli-toler, der har 3"-amino- og 4"-hydroxygruppen i indbyrdes cis-stilling. Man kan således f.eks. som udgangsforbindelse anvende en 1-N-usubstitueret 4,6-di-(aminogly-5 cosyl)-l/3-diaminocyclitol, hvori aminogruppen ved 6'-carbonatomet er N-beskyttet (f.eks. 6'-N-t-butoxycarbo-nylsisomicin) eller en 1-N-usubstitueret 4,6-di-(aminoglycosyl) -1,3-diaminocyclitol/ hvori aminogrupperne ved C-2‘ og C-3 er N-beskyttede (f.eks. 2', 3-di-N-trifluor-10 acetylgentamicin C^), og der vil dannes det tilsvarende delvist N-beskyttede 1-N-substituerede derivat (f.eks.

l-N-ethyl-6'-N-t-butoxycarbonylsisomicin og 1-N-ethyl-2', 3-di-N-trifluoracetylgentamicin C^), som efter fjernelse af de N-beskyttende grupper, på i og for sig kendt måde, giver l-N-O^X-forbindelserne, f.eks. 1-N-ethylsisomicin og 1-N-ethylgentamicin C^.

De nødvendige udgangsforbindelser, hvori amino-grupper er beskyttede, kan fremstilles ved fremgangsmåder svarende til eller identiske med de i det følgende 20 under Fremstilling 3 anførte. Anvendt her betegner udtrykkene "blokeringsgruppe" eller "beskyttende gruppe" grupper, som gør de blokerede eller beskyttede amino-grupper indifferente over for efterfølgende kemisk manipulation, men som let kan fjernes efter udførelse af den 25 kemiske manipulation. Eksempler på sådanne aminobeskyt-tende grupper er benzyl, 4-nitrobenzyl, triphenylmethyl, 2,4-dinitrophenyl, acylgrupper, såsom acetyl, propionyl og benzoyl, alkoxycarbonylgrupper, såsom methoxycarbo-nyl, ethoxycarbonyl, 2,2,2-trichlorethoxycarbonyl, t-20 butoxycarbonyl og 2-iodethoxycarbonyl, og arylalkoxycar-bonylgrupper, såsom carbobenzyloxy- og 4-methoxybenzyl-oxycarbonylgrupper.

Ved blokeringsprocessen benyttes den beskyttende gruppe sædvanligvis i form af et surt imidazolderivat 35 og surt azid eller som aktive estere, såsom ethylthiol-trifluoracetat, N-benzyloxycarbonyloxysuccinimid eller p-nitrophenyItrichlorethylearbonat. Blokeringsgrupper kan således beskrives som værende afledt af en forbin- 16 146298 delse BgLg, hvor Bg bliver blokeringsgruppen, såsom syre-delen af en aktiv ester, og Lg er en bortgående gruppe, såsom imidazol.

Alternativt kan den i det foregående beskrevne pro-5 ces udføres på en måde, der tillader dannelse af et 1-N-(Schiffsk base]-derivat, hvorefter den således opnåede Schiffske base reduceres. Fremgangsmåden b) til fremstilling af de omhandlede 1-N-substituerede derivater af de ovennævnte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler 10 går ud på, at N,C-dobbeltbindingen i et Ι-Ν^ϊ^Χ'-substitueret derivat af en tilsvarende 4,6-di-(aminoglycosyl)- 1,3-diaminocyclitol, hvor alle grupper NH2 er beskyttet, og grupper NHCH^ kan være beskyttet, hvorhos X' er en gruppe som defineret for X ovenfor, hvori enhver tilste-15 deværende amino- eller hydroxygruppe kan være beskyttet, reduceres, hvorpå alle i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, hvorefter det ønskede derivat isoleres som sådant eller i form af et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

2Q De 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler, hvori 6-aminoglycosylgruppen er garosaminyl, har sædvanligvis en 3"-N-4"-O-beskyttende gruppe, som er identisk med 1-N-substituenten i udgangsmaterialet, fordi oxazoli-dinringen dannes samtidigt med 1-N-(Schiffsk base)-grup-25 pen. Således omdannes f.eks. 21,3-di-N-trifluoracetyl-gentamicin ved omsætning med et aldehyd (f.eks. benz-aldehyd, phenylacetaldehyd eller acetaldehyd) til det tilsvarende 3", 4"-oxazolidin-l-yliden-(Schiffsk base)-udgangsmateriale for denne fremgangsmåde (f.eks. 1-N,3", 30 4 "~N,G-dibenzyliden-2',3-di-N-trifluoracetylgentamicin C^, 1-N,3",4"-N,0-diphenethyliden-2',3-di-N-trifluoracetylgentamicin Cog 1-N,3",4"-N,0-diethyliden-21,3-di-N-tri-fluoracetylgentamicin C^), som ved reduktion med natrium-borhydrid og methanolisk natriummethoxid giver den til-35 svarende l-N-CH2X-3" ,4"-oxazolidin (f.eks. l-N-benzyl-3", 4"-N,O-benzylidengentamicin , l-N-phenethyl-3",4"-N,0- phenethyliden-gentamicin og l-N-ethyl-3",4"-N,0-ethyl-idengentamicin C^), som ved behandling med syre giver et 17 146298 af de omhandlede l-N-C^X-derivater (f.eks. 1-N-benzyl-gentamicln C.^, 1-N-phenethylgentamicin og 1-N-ethyl-gentamicin C^).

De hidtil ukendte 1-N-substituerede derivater af 5 4,6-di-(aminoglycosyl)-l,3-diaminocyclitolerne som defineret ved formlerne I, III, IV og V, kan også fremstilles ved en fremgangsmåde (den foreliggende fremgangsmåde c), som er ejendommelig ved, at et 1-N-substitueret derivat af en tilsvarende 4,6-di-(aminoglycosyl)-l,3-diamino-10 cyclitol, hvor én eller flere aminogrupper kan være be- 0

II

skyttet, og 1-N-substituenten er -C-X", hvor X" betegner hydrogen, alkyl, alkenyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, N-alkylaminoalkyl, aminohydroxyalkyl, N-alkylamino-hydroxy-15 alkyl, phenyl, benzyl eller hydrocarbyloxy, hvilke alifatiske grupper har op til 7 carbonatomer og, hvis de er stubstitueret med både amino og hydroxy, bærer substituenterne på forskellige carbonatomer, og hvori enhver tilstedeværende amino- eller hydroxygruppe kan være beskyt-20 tet, behandles med et amidreducerende hydridreagens, hvorpå alle i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, hvorefter det ønskede derivat isoleres som sådant eller i form af et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

25 Fremgangsmåden udføres sædvanligvis i et ikke- reaktivt organisk opløsningsmiddel, hvorved der tænkes på et opløsningsmiddel, hvori udgangsforbindelserne og det amidreducerende reagens er opløselige, og som ikke reagerer med nævnte reagens, således at der forekommer 30 et minimum af konkurrerende sidereaktioner. Ikke-reak-tive organiske opløsningsmidler, som er meget velegnede ved reduktionsprocessen, er for eksempel ethere, såsom dioxan, tetrahydrofuran og diethylenglycoldimethylether.

Foretrukne amidreducerende hydridreagenser er 35 aluminiumhydrider og borhydrider, herunder lithiumalumi-niumhydrid, lithiumtrimethoxyaluminiumhydrid, aluminium-hydrid, diboran, diisoamylboran og 9-borabicyclo-[3,3,1> nonan.

C .:v 146298 18

Det foretrækkes i almindelighed at anvende dit boran som det amidreducerende middel, undtagen når udgangsforbindelsen har en dobbeltbinding, som f.eks. i 1-N-acylsisomicin, 1-N-acylverdamiein, 1-N-acyl-Antibio- 5- tikum 66-40B, l-Nracyl-? Antibiotikum, 66-40D og 1-N-acyl--Antibiotikum G-52, hvilke forbindelser hensigtsmæssigt reduceres· ved hjælp af lithiumaluminiumhydrid.

. Når X" betegner hydrocarbyloxy, såsom t-butoxy,

'. og amidet underkastes, reduktion, dannes den tilsvarende 10 1-Nrmethylforbindelse. Q

Ved denne fremgangsmåde, hvor en l-N-C-X"-4,6-di-(aminoglycosyl) ri, 3-diaminQcyclitol reduceres til det tilsvarende l-N-C^X-derivat, kan· der, hvis acylsidekæ-• den i -1-N-acy Mellemproduktet har et chiralt center, an-15 ::vendes de-enkelte stereoisomere hver for sig .eller eri blanding deraf, og. der vid vindes de tilsvarende dias-tereoisomere eller en blanding deraf.

En fremgangsmåde (den foreliggende ..'fremgangsmåde -:.-d) til fremstilling af de ovennævnte 1-N-substituerede 20 derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclito-7; ler, - hvori eubstituenten er ligekædet alkyl med op til 5 C-atomer.> består i, :at en tilsvarende 4,6-di-(aminogly-eosyl)-l,3-diaminocycli.tol, der har amino-beskyttelses-grupper ved enhver.anden aminogruppe end den i 1-stillin-25 gen, og hvori 1-aminogruppen kan være aktiveret på i og for, sig kendt måde, omsættes med et alkyleringsmiddel indeholdende den ligeksdede alkylgruppe med op til 5 C-ato-mer.og en bortgående gruppe, hvorpå i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper og, om påkrævet, tilstedevæ-30 rende* aktiverende gruppe eller grupper fjernes på i og for sig kendt.måde, hvorefter derivatet isoleres som sådant eller.i form af et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

. Eksempler på alkyleringsmidler, der med .fordel 35 .. kan „anvendes ved denne fremgangsmåde,, er alkyliodid, al-’ ... kylbromid, dialkylsulfat, alkylfluorsulfonat og alkyl-p-foluensulfonat, hvori alkylgruppen er den fornødne li-gekædede alkylgruppe med op til 5 carbonatomer. Andre 19 146298 alkyleringsmidler, hvori alkylgruppen fortrinsvis har 1 eller 2 carbonatomer, er trialkylaniliniumhydroxid, tri-alkyloxoniumfluorborat, trialkylsulfoniumfluorborat eller trialkylsulfoxoniumfluorborat. Alle disse alkyle-5 ringsmidler indeholder en gruppe, der let fjernes, såsom Br , I , OSC^F-, dialkylanilin eller dialkylether.

Aminogruppen i stilling 1 i 4,6-di-(aminoglycosyl) -1,3-diaminocyclitolen kan være fri eller aktiveret på i og for sig kendt måde. Et eksempel på en aktiveren-10 de gruppe er trifluormethylsulfonyl. Disse aktiverende grupper kan indføres i molekylet ved omsætning af en 4,6-di-(aminoglycosyl)-l,3-diaminocyclitol, som har aminobe-skyttende grupper ved enhver anden stilling end 1-stil-lingen, f.eks. 3",4"-N,0-carbonyl-2',3,6'-tri-N-t-butoxy-15 carbonylsisomicin, med en forbindelse, der giver den aktiverende gruppe, såsom trifluormethylsulfonylchlorid.

1-Aminogruppen kan også alkyleres via det tilsvarende di-(2-cyanoethyl)-derivat, som er afledt ved at behandle 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, 20 som har aminobeskyttende grupper ved enhver anden amino-gruppe end den i 1-stillingen, med acrylonitril. Det således fremstillede 1-N-di-(2-cyanoethyl)-derivat alkyleres derpå med et af de i det foregående anførte alkyle-ringsmidler efterfulgt af fjernelse af cyanoethylgrupper-25 ne.

Nævnte fremgangsmåde ifølge opfindelsen udøves under lignende betingelser som de, der anvendes i de velkendte direkte alkyleringsmetoder for aminer.

Endnu en fremgangsmåde (den foreliggende frem-30 gangsmåde e) til fremstilling af de ovennævnte 1-N-sub-stituerede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-di-aminocyclitoler, hvori substituenten er methyl, består i, at en tilsvarende 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, der har amino-beskyttelsesgrupper ved enhver 55 anden aminogruppe end den i 1-stillingen, omsættes med formaldehyd og et cyclisk imid, fortrinsvis succinimid, og den herved vundne forbindelse behandles med et hydrid-donor-reduktionsmiddel, fortrinsvis natriumborhydrid, og 20 146298 alle i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, hvorefter derivatet isoleres som sådant eller i form af et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

5 Endnu en fremgangsmåde (den foreliggende fremgangs måde f) til fremstilling af de ovennævnte 1-N-substituerede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-l,3-diaminocyc-litoler, hvori substituenten er methyl, består i, at en tilsvarende 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, 10 der har amino-beskyttelsesgrupper ved enhver anden amino-gruppe end den i 1-stillingen, omsættes med formaldehyd i nærværelse af myresyre, og alle i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, hvorefter derivatet isoleres som sådant eller i 15 form af et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

Dannelsen af 1-N-methylsubstituenten med formaldehyd og myresyre er velkendt son Eschweiler-Clarke-reaktionen.

Af de ovennævnte fremgangsmåder er fremgangsmåden å), der er anvendelig til fremstilling af samtlige om-20 handlede forbindelser, særligt velegnet, da den benytter let tilgængelige udgangsmaterialer, forløber let og giver gode udbytter. Det foretrækkes derfor ifølge opfindelsen, at der anvendes fremgangsmåde a).

Endvidere foretrækkes det ifølge opfindelsen, at 25 der fremstilles det særligt aktive 1-N-ethylisomicin, der isoleres som sådant eller som et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.

I almindelighed afhænger den indgivne dosis af de omhandlede forbindelser af alderen og vægten af de dyre-30 arter, der behandles, indgiftsmåden og af typen og styrken af den bakterieinfektion, der skal undgås eller reduceres . I almindelighed vil dosis af de omhandlede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolerne svare til dosiskravene for de tilsvarende 1-N-usubstitu-35 erede 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler.

De omhandlede forbindelser kan indgives oralt. De kan også anvendes lokalt i form af salver, såvel hydrofile som hydrofobe, i form af lotioner, som kan være 21 146298 vandige/ ikke—vandige eller af emulsionstypen eller i form af cremer. Farmaceutiske bærere/ der er nyttige ved fremstillingen af sådanne kompositioner, vil indbefatte f.eks. sådanne stoffer som vand, olier, fedtstoffer, po-5 lyestere og polyoler.

Til oral indgift kan de omhandlede forbindelser foreligge i form af f.eks. tabletter, kapsler eller eliksirer, eller de kan blandes med dyrefoder. Det er i disse doseringsformer, at de antibakterielle stoffer er 10 mest effektiv til behandling af bakterieinfektioner i mave-tarmkanalen, hvilke infektioner forårsager diarré.

I almindelighed indeholder præparaterne til lokal anvendelse fra ca. 0,1 til ca. 3,0 g af de omhandlede forbindelser pr. 100 g salve, creme eller lotion. Præpa-15 raterne til lokal anvendelse påføres sædvanligvis forsigtigt på læsioner ca. 2 til ca. 5 gange om dagen.

De omhandlede antibakterielle stoffer kan anvendes i væskeform såsom opløsninger eller suspensioner, til brug i ører og øjne og kan også administreres paren-2Q teralt ved intramuskulær injektion. Den injicerbare opløsning eller suspension vil sædvanligvis blive indgivet med fra ca. 1 mg til ca. 15 mg antibakterielt stof pr. kg. legemsvægt pr. dag opdelt i ca. 2 til ca. 4 doser.

Den præcise dosis afhænger af stadiet og styrken af in-25 fektionen, den inficerede organismes følsomhed over for det antibakterielle stof og de individuelle egenskaber hos de dyrearter, der behandles.

De efterfølgende fremstillinger eksemplificerer fremstilling af mange af de fornødne udgangsmaterialer, 3Q og de efterfølgende eksempler beskriver fremgangsmåden ifølge opfindelsen nærmere.

Fremstilling 1 Gentamicin C2a 35 Fraskillelse af gentamicin C2a fra samtidigt fremstillede antibiotika.

22 146298 96 g Gentamicinbase (fremstillet ud fra det sulfatsalt, der opnås ved fremgangsmåden ifølge eksempel 4 i U.S. patentskrift nr. 3.091.572) opløses i 400 ml af den øvre fase, som dannes, når methanol, chloroform og 17%'s am-5 moniumhydroxid blandes i volumenforholdet 1:2:1. En tiendedel af opløsningen sættes til hver af de første ti rør i en 500x80 ml rør-modstrømsektraktor. Alle rørene, også de første ti, fyldes til deres kapacitet med den nedre fase af den ovenfor beskrevne opløsningsmiddel-10 blanding. Opløsningsmiddelreservoiret sættes til at give 40 ml af den øvre fase til rør nr. 1 for hver overførsel. Apparatet indstilles til 500 overførsler. Når overførslerne er gennemført, afprøves hver ottende rør chro-matografisk (dobbeltbestemmelse) på Schleicher og Schuell 15 papir nr. 589 under anvendelse af den nedre fase af den i det foregående beskrevne opløsningsmiddelblanding.

Chromatogrammerne får lov at udvikles i ca. 16 timer, hvorpå papirerne tørres. Det ene stykke papir anbringes på en agarplade podet med Staphylococcus aureus (A.T.

20 C.C. 6538P), det andet papir sprøjtes med sædvanlig nin-hydrinopløsning og opvarmes til fremkaldelse. Agarpladen inkuberes natten over ved 37°C, og man kombinerer opløsningen fra rør indeholdende det materiale, der vandrer ligesom gentamicin C^, dvs. rør nr. 290-360.

25 Rør nr. 290-360 erstattes med friske rør indehol dende 40 ml af den øvre fase og 40 ml af den nedre fase. Apparatet indstilles på yderligere 2800 overførsler, og den i det foregående beskrevne chromatografiske fremgangsmåde gentages. Indholdet af rør nr. 1-16 kombineres 30 og koncentreres i vacuum til opnåelse af 1,3 g gentamicin C2a med følgende egenskaber: (a) En molekylvægt på 463 som bestemt ved masse-spektrometri, hvilket er overensstemmende med en empirisk formel Ο_ηΗ..Ν^0-, 20 41 5 7 35 (b) en specifik optisk drejning målt ved D-linien for natrium ved 26°C på +114° - 5° i vand ved en koncentration på 0,3%, og (c) et protonmagnetisk resonansspektrum (pmr) 23 148298 som følger: pmr(ppm) (D20): 50,99 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH-CH3), CH-CH3), 1,17 (3H, S, C-CH3), 2,47 (3H, s, N-CH3), 2,51 (IH, d, J= 10,5 Hz, H-3"), 3,75 (IH, q, J = 10,5, 4 HZ, H-2"), 4,00 (IH, d, J = 12 Hz, H-5" 5 ækv.), 5,04 (IH, d, J =4 Hz, H-l") , 5,13 (IH, d, J = 3,5 Hz, H-l').

Bestråling af den sekundære methylgruppe ved 60,99 ppm viser H-6' som en dublet (J = 6,5 Hz) ved 62,81 ppm.

10

Fremstilling 2 Gentamicin

Fraskillelse af gentamicin fra samtidigt fremstillede antibiotika.

15 Hovedkomponenterne af gentamicin C (C-^, C2 og C^a) fraskilles, som beskrevet i U.S. patentskrift nr.

3.651.042, eksempel 2, og de fraktioner, der hovedsageligt indeholder overlapninger af gentamiciner C·^ og C2 på fri baseform (500 g gentamicin C-blanding giver 53,4 g 20 overlapninger) samles. 1,5 g af denne gentamicin C^- og C2~blanding tilføres til en søjle indeholdende 50 g si-licagel frembragt i et opløsningsmiddelsystem omfattende chloroform: methanol: 15%1 s ammoniumhydroxid (1:2:1).

Søjlen elueres med samme opløsningsmiddelsystem, og de 25 eluerede fraktioner undersøges ved tyndtlagschromatogra-fi på silicagelplader under anvendelse af opløsningsmiddelsystemet chloroform: methanol: 22%'s ammoniumhydroxid (1:2:1) som fremkalder. De fraktioner, der indeholder en blanding af gentamiciner og C2 sammen med gentamicin 30 C2b (frakt;i-oner 39-57 [410 mg]), kombineres. Fraktionerne 39-57 chromatograferes igen over silicagel under anvendelse af opløsningsmiddelsystemet chloroform: methanol: 7%'s ammoniumhydroxid (1:2:1), og fraktioner (98— 130) indeholdende rent gentamicin C2tj, som bestemt ved 35 tyndtlagschromatografi, kombineres (udbytte 45 mg) og n har følgende konstanter [dip + 165,5 (c = 0,3%, H20), massespektrum m/e 463 (M+l) , 446, 445, 433, 350, 332, 322, 304, 333, 305, 287, 191, 173, 163, 145, 160, 142, 24 146298 118, 143, pmr (ppm) (D2O): 51,25 (3H, s, C-CH^), 2,40 (3H, s, N-CH3), 2,55(3H, s, N-CH3), 5,12 (IH, d, J=4 Hz, H-l"), 5,22 (IH, d, J = 3 Hz, H-l').

Rent gentamicin kan skelnes fra gentamicin 5 og C3 ved dets bevægelighed ved tyndtlagschromatografi under anvendelse af silicagelplader og et opløsningsmiddelsystem af chloroform: methanol: 22%'s ammoniumhydroxid (1:2:1) som fremkalder. De omtrentlige R^-værdier i dette system er som følger: 10 gentamicin 0,47 gentamicin C2 0,47 gentamicin 0,35

Fremstilling 3 15 Selektivt blokerede 4,6-di- (aminoglycosyl)-1,3-diamino-cyclitoler.

A. 2',3,61-Tri-N-t-butoxycarbonyl-3",4"-N,0-carbonylsiso- micin 1. Penta-N-carbobenzoxysisomicin.

20 25 g Sisomicin og 13 g natriumcarbonat opløses i 625 ml destilleret vand. Der tilsættes 100 ml carbobenz-oxychlorid til den omrørte opløsning ved 25°C, og blandingen omrøres i 16 timer. Det faste stof frafiltreres, vaskes omhyggeligt med vand, tørres i vacuum og vaskes 25 derpå med hexan til opnåelse af penta-N-carbobenzoxysisomicin (62 g) som et farveløst amorft fast stof. Smp.: 165-173°C, [<x]J6 : +96,2° (CH-.0H) . IR: (CHC1-) 3400,

U J 1 IuciX J

1720, 1515, 1215, 1050, 695 cm-1.

NMR: 6(CDC13) 1,03 (3H, bred singlet, 4"-C-CH3), 3,02 30 (3H, bred singlet, 3"-NCH3), 5,02 (10H, bred singlet, CH2CgHg), 3,28, 3,30 ppm (25H, brede singletter, -CH2C6H5>· 2. Tetra-N-carbobenzoxy-3!l,4"-N,0-carbonyl-sisomicin.

35 5 g Penta-N-carbobenzoxy-sisomicin opløses i 50 ml dimethylformamid, 250 mg natriumhydrid sættes til den omrørte opløsning, og reaktionsblandingen omrøres under argon ved stuetemperatur i 2 timer. Der filtreres, og til 25 146298 filtratet sættes iseddikesyre (2 ml), og derpå koncentreres i vacuum. Resten ekstraheres med chloroform (200 ml) , der i forvejen har passeret gennem basisk aluminiumoxid) , ekstrakten vaskes med vand og tørres over 5 natriumsulfat. Opløsningen inddampes, hvilket giver tet-ra-N-carbobenzoxy-3",4"-N,0-carbonyl-sisomicin som et amorft pulver (3,5 g).

Smp.: 210-213°C, [a]£6 : + 68,8 (c = 0,22) IR·· (nujol) 3550, 1840, 1760, 1580 cm”1 max 10 NMR: 6(CDC13) 1,34 (3H, singlet, 4"-CH3), 2,68 (3H, singlet, 3"-N-Me), 5,04 (8H, bred singlet, -CI^CgHg).

3. 3",4"-N,0-carbonyl-sisomicin.

Til en opløsning af l,3,2',6,-tetra-N-benzyloxy-carbonyl-3" ,4"'i-N-,0-carbonyl-sisomicin (10,1 g) i tetra-15 hydrofuran (200 ml) sættes 1 liter væskeformig ammoniak (redestilleret fra natrium). Til den omrørte opløsning sættes 6 g natrium i små stykker. Efter 3 timers omrøring destrueres overskuddet af natrium ved tilsætning af ammoniumchlorid. Opløsningsmidlerne får lov at afdampe 20 under en strøm af nitrogen. Resten opløses i vand og passeres gennem et medium af "Amberlite"® IRC-50-har-piks (H -form), og harpiksen vaskes godt med vand, hvorpå produktet elueres med 2N ammoniumhydroxidopløsning. Ammoniumeluatet inddampes i vacuum, hvilket giver titel-25 forbindelsen (3",4"-N,0-carbonyl-sisomicin). Udbytte ca.

4 g. IR: v (nujol) 1745 cm”1. Produktet blev anvendt i d^:efterfølgende trin uden yderligere rensning. En meget ren prøve kan imidlertid opnås ved chromatografering af produktet over silicagel under anvendelse af den ned-30 re fase af et chloroform:methanol:koncentreret ammonium-hydroxid-opløsningsmiddelsystem (1:1:1) som eluerings-middel.

4. 2',3,6’-Tri-N-t-butoxycarbonyl-3",4"-N,0-carbonyl-sisomicin.

35 3”,4"-N·,0-carbonyl-sisomicin (1,4 g, 3 mmol) op løses i 10 ml 50%'s vandig methanol indeholdende tri-ethylamin (3,5 mmol). t-Butoxycarbonylazid (3,5 mmol) 26 146298 tilsættes dråbevis under omrøring. Blandingen omrøres i 2 dage ved stuetemperatur. Der tilsættes 5 ml "Amberli-te”® IRA-401S (OH-)-ionbytterharpiks sammen med 5 ml methanol, og der omrøres i ½ time. Harpiksen fjernes ved 5 filtrering, og der vaskes med methanol. Filtratet koncentreres, og resten chromatograferes på en søjle af si-licagel (60-100 mesh, 20,0 g) under anvendelse af chloroform: methanol: ammoniumhydroxid (30:10: 0,4) som opløsningsmiddelsystemet. De homogene fraktioner indehol-10 dende titelforbindelsen samles, og opløsningsmidlet fjernes ved inddampning i vacuum. Resten opløses i methanol, og der fældes med overskud af ether. Det faste produkt isoleres ved filtrering og tørres.

B. 2',3-Di-N-trifluoracetyl-gentamicin C^.

15 1. 2'-N-trifluoroacetyl-gentamicin

1,7 g Gentamicin C-^ opløses i 20 ml methanol, blandingen afkøles til 4°C, og der tilsættes 0,46 ml (0,563 g) ethylthioltrifluoracetat under omrøring. Reaktionen får lov at fortsætte i 2 timer, og opløsningen 20 koncentreres til en rest i vacuum. Produktet chromatograferes på 80 g silicagel under anvendelse af den nedre fase af en blanding af chloroform: methanol: vand: ammoniumhydroxid i volumenforholdet 10:5:4:1 som elu-eringsmiddel. De fraktioner, der indeholder hovedkompo-25 nenten, kombineres og koncentreres til opnåelse af 1,4 g af titelforbindelsen, smp.: 108-111°C, [a]^6 : + 128°C

(c = 0,3%, H20). Analyse for C23H42N5°8F3,H20:

Beregnet: C = 46,69%, H = 7,50%, N = 11,84%, F = 9,63%.

Fundet : C = 46,66%, H = 7,65%, N = 11,60%, F = 9,24%.

30 2. 21,3-Di-N-trifluoroacetyl-gentamicin C^.

0,66 g Af produktet fra trin 1 opløses i 10 ml methanol, blandingen afkøles til 4°C, og der tilsættes 0,148 ml (0,182 g) ethylthioltrifluoracetat opløst i 3 ml methanol. Reaktionsblandingen omrøres i ca. 16 ti-35 mer, og der koncentreres til en rest i vacuum. Produktet chromatograferes på 30 g silicagel, som beskrevet under trin 1. Søjlen undersøges ved tyndtlagschromatografi, de 27 146298 hensigtsmæssige fraktioner kombineres, og der koncentreres til opnåelse af 0,32 g af titelforbindelsen, smp.: 121-129°C, [a]£6 : 121° (c = 0,3%, H20). Analyse for C25H4iN5°9F6: 5 Beregnet: C = 44,84%, H = 6,17%, N = 10,46%.

Fundet : C = 44,94%, H = 6,35%, N = 10,17%.

Eksempel 1 1-N-substitueret sisomicin.

10 A. 1-N-ethylsisomicin.

Til en opløsning af 5 g sisomicin i 250 ml vand sættes IN svovlsyre, indtil opløsningens pH er indstillet på ca. 5. Til den derved dannede opløsning af siso-micin-svovlsyreadditionssalt sættes 2 ml acetaldehyd, 15 der omrøres i 10 minutter, hvorpå der tilsættes 0,85 g natriumcyanoborhydrid. Omrøringen fortsættes ved stuetemperatur i 15 minutter, hvorpå opløsningen koncentreres i vacuum til et volumen på ca. 100 ml, opløsningen behandles med en basisk ionbytterharpiks (f.eks. "Amber-2Q lite"® IRA 401S (OH )), hvorpå der lyofiliseres til en rest omfattende 1-N-ethyl-sisomicin.

Der renses ved chromatografering på 200 g silica-gel, idet der elueres med den nedre fase af et chloroform: methanol: 7%'s vandig ammoniumhydroxid (2:1:1)-25 system. Ensartede eluater, som bestemt ved tyndtlags-chromatografi, kombineres, og de kombinerede eluater af hovedkomponenten koncentreres i vacuum til en rest omfattende 1-N-ethylsisomicin (udbytte 1,25 g). Der renses yderligere ved igen at chromatografere på 100 g silica-30 gel under eluering med et chloroform: methanol: 3,5%'s ammoniumhydroxid (1:2:1)-system. De kombinerede, ensartede eluater (som bestemt ved tyndtlagschromatografi) passeres gennem en søjle af basisk ionbytterharpiks, og eluatet lyofiliseres til opnåelse af 1-N-ethylsisomicin 35 (udbytte 0,54 g), [a]j^ + 164° (0,3%, H20) , pmr (ppm) (D20): 61,05 (3H, t, J = 7 Hz, -CH2CH3), 1,19 (3H, s, -C-CH3), 2,5 (3H, s, N-CH3), 4,85 (IH, m, =CH-), 4,95 28 148298 (IH, d, J = 4Hz, H1"), 5,33 (IH, d, J = 2,5 Hz, H^). Massespektrum: (M + 1)+ m/e 476 også m/e 127, 154, 160, 173, 191, 201, 219, 256, 299, 317, 332, 345, 350, 360, 378, 390, 5 400.

B. 1-N-methylsisomicin.

Til en opløsning af 4,64 g sisomicin i 180 ml vand sættes IN svovlsyre, indtil opløsningen har et pH på ca. 5. Der tilsættes 1,2 ml 37%'s vandig formaldehyd, ^ omrøres i 10 minutter, hvorpå der tilsættes 460 mg nat-riumcyanoborhydrid. Reaktionsopløsningen passeres gennem en søjle af en basisk ionbytterharpiks (f.eks. "Amber-lite"® IRA 401S (OH form)) og lyofiliseres. Den resulterende rest chromatograferes på silicagel i den nedre 15 fase af en chloroform: methanol: 7%'s vandig ammoniumhydroxid (2:1:1)-opløsningsmiddelblanding. Ensartede eluater indeholdende i det væsentlige 1-N-methylsisomicin som bestemt ved tyndtlagschromatografi kombineres.

Der inddampes i vacuum til en rest af 1-N-methylsisomi- 20 cin.

[a]p6 + 153° (0,3%, H20).

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 462 også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336 (w), 346, 376, 2 5 386.

C. 1-N-(n-propyl)-sisomicin.

På lignende måde som den i eksempel 1A beskrevne behandles svovlsyreadditionssaltet af sisomicin i vand 30 med propanal og natriumcyanoborhydrid. Det resulterende produkt isoleres og renses på en måde svarende til den beskrevne til opnåelse af 1-N-(n-propyl)sisomicin.

[a]£6 + 140° (0,3%, H20), pmr (ppm) (D20): 60,83 (3H, t, J = 7 Hz, 35 -CH2CH3), 1,14 (3H, s, -C-CH3), 2,45 (3H, s, -N-CHj), 4,82 (IH, m, =CH-) , 4,90 (IH, d, J = 4 Hz, H^') , 5,78 (IH, d, J = 2 Hz, H1 ').

4*

Massespektrum: (M + 1) m/e 490 29 146298 også 127, 160, 168, 187, 205, 215, 233, 256, 313, 331, 346, 359, 364, 374, 404, 414.

D. 1-N-(n-butyl)sisomicin.

Til en opløsning af 3 g sisomicin i 200 ml vand 5 sættes IN svovlsyre, indtil opløsningen har et pH på ca.

3,5. Der tilsættes 1,5 ml n-butanal, omrøres i 10 minutter, hvorpå der tilsættes 450 mg natriumcyanoborhydrid. Omrøringen fortsættes i 1 time, hvorpå opløsningen koncentreres i vacuum til et volumen på ca. 100 ml. Denne 10 opløsning passeres gennem en søjle af en basisk ionbyt-terharpiks (f.eks. "Amberlite" ® IRA 401S (OH )) og lyo-filiseres. Den resulterende rest chromatograferes på 140 g silicagel i den nedre fase af en chloroform: methanol: 7%'s vandig ammoniumhydroxid (2:l:l)-opløs-15 ningsmiddelblanding. Ensartede fraktioner indeholdende 1-N-(n-butyl)sisomicin som bestemt ved tyndtlagschroma-tografi kombineres, og de kombinerede eluater inddampes i vacuum til en rest omfattende 1-N-.(n-butyl)sisomicin.

[a]26 + 129° (0,3%, H20), pmr (ppm) (D2G) 60,82 (3H, t, 20 J = 7 Hz, -CH2CH3), 1,15 (3H, s, C-CH3), 2,46 (3H, s, -N-CH3) , 4,82 (IH, m, =CH-) , 4,92 (IH, d, J = 4 Hz, H^'), 5,29 (IH, d, J = 2 Hz, H ').

^ 4-

Massespektrum: (M + 1) m/e 504, også m/e 127, 160, 182, 201, 219, 25 229, 247, 256, 327, 345, 360, 373, 388, 418, 428.

E. Andre 1-N-alkyl- og- 1-N-alkenyl-sisomiciner.

Ved fremgangsmåden ifølge eksempel 1A erstattes acetaldehyd med ækvivalente mængder af hver af følgende 3Q aldehyder: 1. 2-ethylbutanal, 2. propenal.

I hvert tilfælde udføres reaktionen på en måde svarende til den i eksempel 1A beskrevne, og de resulte-35 rende produkter isoleres og renses på en måde svarende til den beskrevne, hvorved man opnår: 1. 1-N-(β-ethylbutyl)sisomicin, [a]26 + 121° (c = 0,4%, H20), pmr (ppm) (D20): 60,75 (6H, 146298 30 t, 6,5 Hz, CH2-CH3), 2,4 (3H, s, N-CH3), 4,78 (IH, m, =CH-), 4,88 (IH, d, 4,0 Hz, H^'), 5,22 (IH, d, 2,0 Hz, H^').

Massespektrum: (M + l)"*" m/e 532 5 også m/e 127, 160, 210, 229, 256, 275, 355, 373, 388, 401, 406, 416, 446, 456, 2. 1-N- (β-propenyl) sisomicin, [a]^ + 147° (0,4, CH30H), nmr (D20) 61,18 (s, 3H, C-CH3), 2,48 10 (s, 3H, N-CH3), 3,75 (IH, dd, J = 4,11 Hz, H-2") , 3,95 (IH, d, J = 13 Hz, H-5e), 4,84 (IH, m, H-4'), 4,94 (IH, d, J = 4 Hz, H-l"), 5,30-5,0 (3H, m, H-l*, =CH,), 5,8 (IH, m, -CN=CH„), MS m/e 488 (M ).

15 F. 1-N-(6-Aminobuty1)sisomicin.

Til en opløsning af 3 g sisomicin i 120 ml vand sættes dråbevis IN svovlsyre, indtil opløsningens pH er indstillet på ca. 5. Til den vandige opløsning af det 2q derved dannede svovlsyreadditionssalt af sisomicin sættes 60 ml dimethylformamid efterfulgt af en opløsning af 2 g 4-phthalimidobutanal i 10 ml dimethylformamid. Omrøringen fortsættes i 10 minutter, hvorpå der tilsættes 420 mg natriumcyanoborhydrid. Efter ca. 20 minutters 23 forløb sættes reaktionsopløsningen til 1 liter vandfri methanol under omrøring, og ved filtrering samles det resulterende bundfald omfattende svovlsyreadditionssaltet af 1-N-(δ-phthalimidobutyl)sisomicin.

Der renses ved opløsning af bundfaldet i vand og 3q passage af den vandige opløsning gennem en basisk ionby tterharpiks. Der inddampes i vacuum til en rest, resten chromatograferes over silicagel ved eluering med den nedre fase af en chloroform: methanol: 7%'s vandig ammoniumhydroxid (2:1:1)-opløsningsmiddelblanding, og de 33 kombinerede, ensartede eluater inddampes til en rest omfattende 1-N-(δ-phthalimidobutyl)sisomicin.

Til 0,5 g 1-N-(δ-phthalimidobutyl)sisomicin sættes 5 ml 5%*s ethanolisk hydrazinhydrat, og der opvarmes 31 146298 under tilbagesvaling i 3 timer. Reaktionsopløsningen udhældes i et stort volumen tetrahydrofuran, og det resulterende bundfald omfattende 1-N-(δ-aminobutyl)sisomicin samles ved filtrering.

5 Forbindelsen ifølge dette eksempel kan alterna tivt fremstilles som følger: (1) 4-Acetamidobutyraldehyd.

5 g 4-Acetamidobutyraldehyd-diethylacetal opløses i 75 ml destilleret vand og 5 ml IN svovlsyre. Opløsnin-10 gen får lov at henstå ved stuetemperatur, indtil hydrolysen er fuldstændig bestemt ved tyndtlagschromatografi. Opløsningen neutraliseres med natriumbicarbonat, hvorpå opløsningen mættes med natriumchlorid og ekstraheres med chloroform. De kombinerede chloroformekstrakter destil-15 leres til en rest omfattende 4-acetamidobutyraldehyd, som kan anvendes uden yderligere rensning i den efterføl* gende procedure.

(2) 1-N-(δ-Acetamidobutyl)sisomicin.

Til 3 g sisomicin i 120 ml destilleret vand sæt-20 tes 0,1N svovlsyre, indtil opløsningen har pH ca. 5. Der tilsættes 6 g δ-acetamidobutyraldehyd, fremstillet som beskrevet i det foregående, efter 10 minutters forløb fulgt af 600 g fast natriumcyanoborhydrid. Efter 2 timers forløb koncentreres opløsningen til et lille volu-25 men og udhældes i methanol. Det resulterende bundfald samles ved filtrering, opløses i vand, og den vandige opløsning passeres gennem en søjle af "Amberlite"® IRA 401-S (OH-)-ionbytterharpiks. Elueringsmidlet afdampes, og den resulterende rest chromatograferes på silicagel, o n idet man eluerer med den nedre fase af en chloroform: methanol: 7%'s ammoniumhydroxid-opløsningsmiddelblandlng. Elueringsmidlet afdampes til opnåelse af en rest omfattende 1-N-(δ-acetamidobutyl)sisomicin.

35 (3) 1-N-(δ-Aminobuty1)sisomicin.

Det i det foregående eksempel opnåede 1-N-(δ-ace-tamidobutyl)sisomicin behandles med 10%'s vandig natriumhydroxid ved 100°C i 3 timer, hvorpå der neutraliseres med "Amberlite"® IRC-50-ionbytterharpiks og elu- 146298 32 eres med 2N vandig ammoniumhydroxid. Det eluerede koncentreres, og den resulterende rest opløses i vand og lyofiliseres til opnåelse af 1-N-(δ-aminobutyl)sisomi-cin.

5 [a]^6 + 109° (c = 0,3%, H20J.

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 519 også 127, 160, 197, 216, 234, 244, 256, 262, 342, 360, 375, 388, 393, 403, 443.

G. 1-N-(β-Aminoethyl)sisomicin og 1-N-(γ-aminopropyl)- 10 sisomicin.

På en lignende måde, som den i eksempel 1F beskrevne alternative procedure, behandles en vandig opløsning af sisomicin, hvortil der er sat 0,1N svovlsyre, indtil opløsningens pH er ca. 5, med β-acetamidoacetal-X 5 dehyd efterfulgt af fast natriumcyanoborhydrid. Det resulterende produkt isoleres og renses på en lignende måde, som den beskrevne, til opnåelse af 1-N-(β-acetamido-ethyl)sisomicin.

2Q 1-N-(β-acetamidoethyl)sisomicin hydrolyseres med 10%'s vandig kaliumhydroxid, og det resulterende produkt isoleres og renses på en lignende måde, som den i afsnit (3) af den alternative procedure i eksempel 1F beskrevne, til opnåelse af 1-N-(β-aminoethyl)sisomicin.

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 491, 25 også 160, 169, 187, 206, 216, 234, 256, 283, 314, 325, 334, 347, 360, 370, 375, 405, 415.

Ved den ovennævnte metode dannes der ved at er-statte β-acetamidoaldehyd med γ-acetamidopropanal 1-N-(γ-acetamidopropyl)sisomicin, som, når det hydrolyseres med 10%'s vandig kaliumhydroxid og isoleres og renses på den beskrevne måde, giver 1-N-(γ-aminopropyl)sisomicin.

[<x]p6 + 127° (H20), 35 nmr (D20): S 1,2 (3H, s, -C-CH3), 2,5 (3H, s, N-CH3), 3,8 (IH, dd, J = 4, 10,5 Hz,H2"), 4,0(IH, d, J = 12,5Hz, H5"e), 4,85 (IH, m, -OCH-) , 4,95 (IH, d, J = 4Hz, H1"), 5,34 (IH, d, J = 2,5Hz, 146298 33 Η, ') .

*· +

Massespektrum:Μ + 1 m/e 504, > også 160, 202, 220, 230, 248, 256, 328, 346, 361, 374, 379, 389, 407, 419 og 429.

5 Eksempel 2 1-N-ethylgentamicin Cla.

Til 5 g gentamicin C^a i 125 ml vand sættes IN svovlsyre, indtil opløsningens pH er ca. 5,2. Derpå tilsættes 2 ml acetaldehyd. Opløsningen omrøres i 5 minut-10 ter, hvorpå der tilsættes 1 g natriumcyanoborhydrid. Omrøringen fortsættes ved stuetemperatur i 30 minutter, opløsningen koncentreres i vacuum til et volumen på ca.

75 ml, opløsningen passeres gennem en søjle af en basisk ionbytterharpiks (f.eks. "Amberlite"® IRA. 401S (OH )), 15 hvorpå der lyofiliseres til en rest omfattende 1-N-ethylgentamicin c^a.

Der renses ved chromatografering på 200 g sili-cagel og eluering med den nedre fase af et chloroform: methanol: 7%'s vandig ammoniumhydroxid (2:1:1)-system.

20 Ensartede eluater som bestemt ved tyndtlagschromatografi kombineres, og de kombinerede eluater af hovedkomponenten koncentreres i vacuum til en rest omfattende 1-N-ethylgentamicin C^a (udbytte 0,95 g). Yderligere rensning ved gentagen chromatografering af 1-N-ethylgentami-25 cin Cla på 100 g silicagel og eluering med chloroform: methanol: 3,5%'s ammoniumhydroxid (1:2:1)-system. De kombinerede ensartede eluater (som bestemt ved tyndtlagschromatografi) behandles med en basisk ionbytterharpiks, og eluatet lyofiliseres til opnåelse af 1-N-ethyl-30 gentamicin C^a (0,42 g), [a]p6 + 118° (c = 0,3%, H2<D) , pmr (ppm) (D20): δ 1,06 (3H, t, J = 7Hz, -CH2CH3), 1,19 (3H, s, -C-CH3), 2,51 (3H, s, -N-CH3), 4,97 (IH, d, J = 4Hz, H^'), 5,16 (IH, d, J = 3,5Hz, H^).

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 478, 35 også m/e 129, 154, 160, 173, 191, 201, 219, 258, 301, 317, 319, 329, 332, 347, 350, 360, 378 og 402.

146298 34

Eksempel 3 1-N-substitueret verdamicin.

A. 1-N-ethylverdamicin.

Til 0,5 g verdamicin i 65 ml vand sættes IN svovl-5 syre, indtil opløsningens pH er indstillet på ca. 4,9, hvorpå der tilsættes 0,2 ml acetaldehyd. Opløsningen omrøres i 5 minutter, der tilsættes 65 mg natriumcyanobor-hydrid, opløsningen koncentreres i vacuum til et volumen på ca. 10 ml, og opløsningen udhældes i 50 ml methanol 1Q under omrøring. Ved filtrering samles det resulterende bundfald omfattende 1-N-ethylverdamicin. Der renses ved chromatografering på 100 g silicagel ved eluering med et chloroform: methanol: 3,5%'s ammoniumhydroxid (1:2:1)-system. Ensartede fraktioner som bestemt ved tyndtlags-15 chromatografi samles, og de kombinerede fraktioner indeholdende hovedkomponenten inddampes i vacuum til en rest omfattende 1-N-ethylverdamicin. Der renses yderligere ved gentagen chromatografering på 7 g silicagel ved eluering med den nedre fase af et chloroform: methanol: 2Q 7%'s ammoniumhydroxid (2:1:1)-system. De ensartede elu-ater kombineres og inddampes i vacuum til en rest af 1-N-ethylverdamicin (udbytte 50 mg).

-f.

Massespektrum: (M + 1) m/e 490, også m/e 141, 154, 160, 173, 191, 25 201, 219, 270, 313, 317 (w), 331, 332, 341, 350 (w), 357, 359, 360, 378, 390, 414.

B. I proceduren ifølge eksempel 3A erstattes acetaldehyd med propanal og butanal·. Hvert af de resulterende produkter isoleres og renses på en lignende måde til opnåel- 3(^ se af henholdsvis 1-N- (n-propyl) verdamicin, [α]3δ + 122° (c = 0,3%, H20), pmr (ppm) (D2<D) : δ 0,88 (3H, t, J = 7Hz, CH2CH3), 1,19 (3H, s, C-CH3), 1,16 (3H, d, J = 6Hz, CH-CH3), 4,81 (IH, m, = CH-), 4,97 (IH, d, J = 4,0Hz, H"), 5,30 (IH, d, J = 2,0Hz, = H.1).

35 x + x

Massespektrum: (M +1) m/e 528, også m/e 141, 160, 168, 187, 205, 146298 35 215, 233, 270, 346, 355, 373, 504, og Ι-N- (n-butyl)verdamicin, [α]^δ + 121° (c = 0,3%, Η2<0) , pmr (ppm) (D20): δ 0,8 (3H, t, J = 6,5Hz , CH2-CH3), 2,45 (3H, s, NCH3), 4,8 (IH, m, C=CH-), 4,92 (IH, d, J = 4,0 5 Hz, H1"), 5,25 (IH, d, J = 2,0Hz, H^).

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 518 også m/e 141, 160, 182, 201, 219, 229, 247, 270, 341, 360, 378, 387, 388, 418, 442.

10 Eksempel 4 1-N-substitueret gentamicin A. 1-N-ethylgentamicin C^.

På lignende måde som den i eksempel 1A beskrevne behandles 5 g gentamicin i 250 ml vand med IN svovl-15 syre, indtil pH for opløsningen er ca. 5. Derpå behandles den syrnede opløsning med acetaldehyd og nåtriumcyanobor-hydrid på lignende måde som den beskrevne, og det resulterende produkt isoleres og renses til opnåelse af 1-N- 26 o ethylgentamicin C^, [a]D + 114 (c = 0,3%, H20) pmr 20 (ppm) (D20): 6 1,03 (3H, t, 7Hz, -CH2CH3), 1,03 (3H, d, J = 6,5Hz, -CH-CH3), 1,17 (3H, s, C~CH3), 2,32 (3H, s, 6'N-CH3), 2,49 (3H, s, 3"-NHCH3), 4,94 (IH, d, J = 4Hz, H^'), 5,13 (IH, d, J = 3,5Hz, H^).

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 506, 25 også m/e 154, 157, 160, 173, 191, 201, 219, 286, 317, 329 (w), 347, 350, 360, 375, 430.

B. I proceduren ifølge eksempel 4A anvendes i stedet for acetaldehyd et andet tilsvarende aldehydreagens. Hvert af de resulterende produkter isoleres og renses på en lignende 30 måde til opnåelse af henholdsvis 1-N-methylgentamicin C^, δ (D20) 1,04 (3H, d, J = 6,5Hz, 6'-CH3), 1,18 (3H, S, 4"-CH3), 2,29 (3H, s, 1-HCH3, 2,32 (3H, s, 6'-HCH3), 2,49 (3H, s, 3"-HCH3), 4,95 (IH, d, ,2" = 4Hz' E±"> ' og 5,13 ppm (IH, d, 1#2 * = 3'5Hz' Hi')' M+ m/e 491, 35 også 416, 384, 364, 361, 346, 343, 336, 333, 318, 315, 303, 286, 205, 187, 177, 160, 159, 157, 1-N-(Ø-hydroxyethyl)gentamicin C^, [α]^δ+98,0° (c = 0,3%, H20), pmr (ppm) (D20): δ 0,99 (3H, d, J = 6,5 146298 36

Hz, 6'“CH3), 1,13 (3H, s, 4"-CH3), 2,28 (3H, s, β'-ΝΟ^), 2,45 (3H, s, 3"-NCH3), 4,97 (IH, d, J = 4Hz, H^') og 5,11 (IH, d, J = 3,5Hz, H. ") .

Massespektrum: (M + 1) m/e 522, 5 også m/e 446, 404, 394, 391, 376, 373, 366, 363, 348, 345, 333, 286, 235, 217, 207, 189, 160, 157, v (KBr) 3300, 1060 cm-1, og 1-N-(phenyl-max oe n ethyl)gentamicin C^, [a]D + 99,4 (c = 0,3%, ^0) , pmr (ppm) (030): 6 0,99 (3H, d, J = 6,5Hz, 6'-CH3), 1,10 10 (3H, s, 4n-CH3), 2,28 (3H, s, 6'-NCH3), 2,43 (3H, s, 3”- NCH3) , 4,88 (IH, d, J = 4Hz, H^) , 5,08 (1H, d, J=3,5Hz, H^) og 7,33 (5H, s, -CgH5) .

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 582, også m/e 506, 464, 454, 451, 436, 15 433, 426, 423, 408, 405 (w), 393, 295, 286, 277, 267, 249, 160, 156, (KBr) 3300, 1050, 1030 cm"1.

Eksempel 5 1-N-Ethyl-Antibiotikum G-52.

875 mg Antibiotikum G-52 opløses i 40 ml destil-20 leret vand, og der tilsættes IN svovlsyre, indtil opløsningens pH er indstillet på ca. 3,5. Der tilsættes 0,7ml acetaldehyd, reaktionsblandingen omrøres i 10 minutter, hvorpå der tilsættes 100 mg natriumcyanoborhydrid. Reaktionsopløsningen undersøges ved tyndtlagschromatografi, 25 og når det som udgangsmateriale anvendte Antibiotikum G-52 viser sig at være fuldstændigt omsat (dvs. ca. 10 minutter), koncentreres opløsningen i vacuum ved ca. 35-40°C til et volumen på ca. 10 ml. Den koncentrerede opløsning passeres gennem en basisk ionbytterharpiks, hvor-30 på der lyofiliseres til en rest omfattende 1-N-ethyl-Antibiotikum G-52. Der renses ved chromatografering på en silicagelsøjle ved eluering med den nedre fase af et chloroform: methanol: 7%'s vandig ammoniumhydroxid (2:1: 1)-system. Ensartede eluater som bestemt ved tyndtlags-35 chromatografi kombineres, og de kombinerede eluater af hovedkomponenten koncentreres i vacuum til en rest omfattende 1-N-ethyl-Antibiotikum G-52 (udbytte 60 mg). De 146298 37 overlappende eluater fra den foregående chromatografe-ring renses yderligere ved chromatografering på silica-gel under eluering med den nedre fase af et chloroform: methanol: 7%'s vandig ammoniumhydroxid (1:2:1)-system 5 til opnåelse af en yderligere rest på 35 mg omfattende 1-N-ethyl-Antibiotikum G-52. De kombinerede rester af 1-N-ethyl-Antibiotikum G-52 passeres gennem en søjle af basisk ionbytterharpiks (f.eks. "Amberlite"® IRA 40 IS), og eluatet lyofiliseres til opnåelse af 1-N-ethyl-Anti-10 biotikum G-52 (udbytte 90 mg), [a]^ + 122,1° (c = 0,3%, H20), pmr (ppm) (D20): δ 1,06 (3H, t, J = 6,5Hz, 1N-CH2~ CH3), 1,21 (3H, s, 4"-C-CH3), 2,30 (3H, s, 3"-N-CH3), 2,50 (3H, s, 6'-N-CH3), 4,94 (IH, m, H4'), 4,97 (IH, d, J = 4,0Hz, H"), 5,34 (IH, d, J = 2,5Hz, H,').

·*· -f. X

15 Massespektrum: (M + 1) m/e 490, også m/e 141, 154, 160, 173, 191, 201, 219, 270, 313, 317 (w), 331, 332, 341, 350, 359, 360, 378, 390, 414.

Eksempel 6 20 På lignende måde, som den i eksempel 1A beskrevne, behandles hver af følgende 4,6-diaminoglycosyl-l,3-di-aminocyclitoler i vand med svovlsyre efterfulgt af acet-aldehyd og natriumcyanoborhydrid: 1. gentamicin B, 25 2. antibiotikum JI-20B, 3. mutamicin 2, 4. mutamicin 6.

Hvert af de resulterende produkter isoleres og renses på en lignende måde, som den i eksempel 1A be-30 skrevne, til opnåelse af den tilsvarende 1-N-ethylfor-bindelse, dvs.: 1. 1-N-ethylgentamicin B, [a]^6 +119,7° (c, li vand)

Massespektrum; m/e [MH]+ 380, 352, 334, 378, 350, 35 332, 219, 191, nmr (60 MHz D20): δ 5,55 (H-l',

JlV = 3'0Hz)' 5'05 Ji"'2" = 4Hz) i 2,9 (N-CH3), 1,05-1,5 (2C-CH3).

146298 38 2. 1-N-ethyl-Antibiotikum JI-20B, [α]ρ6 + 112,5° (H20) nmr (D20): δ 1,1 (3H, t, J = 7Hz, CH2~CH3), 1.22 (3H, s, C-CH3), 1,3 (3H, d, -CH-CH3), 5 4,95 (IH, d, J = 4Hz, H^') , 5,35 (IH, J = 3,5Hz,

Hl').

Massespektrum: M+ + 1 m/e 524, også 154, 160, 173, 175, 191, 201, 219, 304, 317, 332, 333, 350, 360.

3. 1-N-ethylmutamicin 2,

10 smp. 80-84°C

pmr (D20): δ 1,06 (t, J = 7Hz, 3, 1-N-CH2CH3), 1,19 (s, 3, 4"-CH3), 2,50 (s, 3, 3"-N-CH3), 2,53 (d, J2",3" = 10,5Hz, 1, H3"), 3,75 (dd, J1n,2n = 4Hz, J211,3" = 10,5Hz, 1, H2") , 15 3,83 (d, H5" eq 5" 2x 12Hz, 1, Hg"), 4,86 (m, 1, H4*), 4,98 (d, H2",1" = 4Hz, 1, H^') og 5,10 (d, Ji'» 2' = 2/5Hz, 1, H-j/).

Massespektrum: m/e 459, 384, 329, 316, 311, 301, 282, 203, 185, 175, 160, 142, 127.

20 4. 1-N-ethylmutamicin 6, smp. 118-122°C (dek.)

Massespektrum: (M)+ m/e 475, (M + 1)+ m/e 476,

Monosaccharider: m/e 160, 127 2-deoxystreptaminer: m/e 219, 201, 191, 171 25 Disaccharider: m/e 355, 317, 299, m/e 378, 350, 322 pmr (δ) D20

5,14 d, J = 2,5Hz 1*-H

5,00 d, J = 4,1Hz 1"-H

30 4,9 bred singlet 4'-H

4.38 bred singlet 5-H

3,93 d, J = 12,5Hz 5"e-H

3,78 q. 2"-H

3.38 d, J = 12,5Hz 5"a-H

35 3,21 (IH) bred singlet 6'-H

2,65 d, J = 11,0Hz 3"-H

2,52 singlet 3"-N-CH 3 1.22 singlet 4'-0-0Η3 146298 39 1,07 triplet 1-N-CH2-CH3 cmr (D20): ppm: δ 149,8, 102,9, 97,4, 97,0, 83,9, 80,5, 73,2, 70,1, 69,6, 68, 63,9 54,5, 47,1, 47,0, 5 43,1, 40,8, 37,5, 33,0, 25,6, 22,4, 14,6.

Eksempel 7

Fremstilling af 1-N-substituerede 4,6-di-(aminoglyco-syl)-l,3-diaminocyclitoler via selektivt blokerede mellemprodukter .

1Q A. 1-N-ethylgentamicin via ét 21,3-di-N-substitUeret mellemprodukt.

240 mg 21,3-di-N-trifluoracetylgentamicin op løses i 10 ml vand/methanol (2:1), og opløsningens pH indstilles til ca. 3,5 ved tilsætning af IN svovlsyre.

15 Der tilsættes 0,19 ml acetaldehyd, omrøres i 10 minutter, hvorpå der tilsættes 27 mg natriumcyanoborhydrid, og reaktionsblandingen omrøres i yderligere 10 minutter. Reaktionsblandingen inddampes i vacuum til en rest omfattende 1-N-ethy1-2',3-di-N-trifluoracetylgentamicin C^.

2Q Resten opløses i 50 ml koncentreret ammoniumhydroxid, og opløsningen får lov at henstå ved stuetemperatur i 24 timer. Blandingen inddampes i vacuum, og den resulterende rest chromatograferes over silicagel (12 g) ved elu-ering med den nedre fase af en blanding af chloroform: 25 methanol: 10%'s vandig ammoniumhydroxid (2:1:1). Ensartede fraktioner (som bestemt ved tyndtlagschromatografi) kombineres, og de kombinerede eluater inddampes i vacuum til en rest omfattende l-N-ethylgentamicin (udbytte 80 mg) med samme, karakteristika som .angivet i eksempel : 3Q 4a.

B. 1-N-Ethylsisomicin via et 6.'-N-substitueret mellemprodukt.

På lignende måde som den i eksempel 7A beskrevne behandles 6'-N-t-butoxycarbonylsisomicin i vandig metha-35 nol med svovlsyre og derpå med acetaldehyd og natriumcyanoborhydrid. Reaktionsblandingen får lov at henstå ved 146298 40 stuetemperatur i 30 minutter, hvorpå den inddampes i vacuum til opnåelse af l-N-ethyl-61-N-t-butoxycarbonylsi-somicin. Resten opløses i trifluoreddikesyre, og opløsningen får lov at henstå i 10 minutter. Derpå tilsættes 5 der vandfri methanol til et overskud, det resulterende bundfald af trifluoreddikesyresaltet af 1-N-ethylsisomi-cin filtreres og chromatograferes over silicagel under anvendelse af den nedre fase af et chloroform: methanol: ammoniumhydroxid-opløsningsmiddelsystem på en lignende 10 måde, som den i eksempel 7A beskrevne, til opnåelse af 1-N-ethylsisomicin med samme karakteristika som angivet i eksempel 1A.

C. 1-N-Methylsisomicin ud fra 3",4"-N>O-carbony1-siso-micin.

3",4"-N,O-carbony1-sisomicin (5 g) i destilleret vand (300 ml) behandles med IN svovlsyre, indtil opløsningens pH er 2,5. Der tilsættes vandig formaldehyd {37%1 s) (2 ml), og efter 10 minutters forløb tilsættes en opløsning af natriumcyanoborhydrid (500 mg) i vand 20 (5 ml) dråbevis. Efter 1 times forløb reduceres opløsningens volumen til halvdelen ved inddampning i vacuum, den koncentrerede opløsnings pH indstilles til 11 ved tilsætning af IN natriumhydroxidopløsning, og opløsningen inddampes til tørhed. Resten ekstraheres med metha-25 nol (3 x 100 ml), og de kombinerede methanolekstrakter fortyndes med et lige så stort volumen chloroform, filtreres og inddampes til tørhed til dannelse af rå 1-N-methyl-3 ", 4"-N, O-carbonylsisomicin.

^ Det rå produkt behandles med 10%'s vandig kalium hydroxid ved 100°C i 5 timer. Den afkølede opløsning passeres ned gennem en "Amberlite"® IRC-50 (H+)-ionbytterharpiks og elueres med 2N vandig ammoniumhydroxid, og det eluerede koncentreres og lyofiliseres til opnåel-^ se af rå 1-N-methylsisomicin.

Chromatografi af det rå materiale på silicagel (300 g) i chloroform: methanol: 7%'s ammoniumhydroxid (2:1:1) giver 1-N-methylsisomicin. [a]^ + 153° (0,3%, 146298 41 EUO) .

Δ +

Massespektrum: (M + 1) m/e 462, også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336 (w), 346, 376, 5 386.

Eksempel 8 1-N-Benzylgentamicin via et tri-N-beskyttet 1-N-Schiff'sk base-mellemprodukt.

10 (1) 0,3 g 21,3-di-N-trifluoracetylgentamicin oplø ses i 12 ml ethanol, og der tilsættes 0,9 ml benzaldehyd. Reaktionsblandingen omrøres i 3 timer, hvorpå den inddampes i vacuum. Resten opløses i 0,8 ml chloroform, og opløsningen sættes dråbevis til 25 ml hexan/ether (3:1).

15 Det resulterende bundfald fraskilles ved filtrering og tørres i vacuum til opnåelse af 1-N, 3 ",4"-Nr0-bis-benzy-lidin-2 ' ,3-di-N-trifluoracetylgentamicin C·^, (udbytte 0,38 g), smp. 128-134°C, [a]: + 74,6° (c = 0,26%, ethanol).

20 (2) 1,37 g af det i eksempel 8(1) opnåede produkt op løses i 100 ml ethanol og sættes til en omrørt blanding af 1,37 g natriummethoxid og 1,94 g natriumborhydrid i 100 ml ethanol. Der omrøres i 3 timer, blandingen syrnes til et pH på ca. 3 med saltsyre, hvorpå der omrøres i 25 yderligere 16 timer. Opløsningen ekstraheres med ether, etherlaget fraskilles og bortkastes. Til den vandige fase sættes ammoniumhydroxid, indtil den er basisk, hvorpå den inddampes i vacuum til en rest. Resten ekstraheres med 35 ml varm ethanol. Ekstrakterne kombineres og ind-30 dampes i vacuum. Den resulterende rest chromatograferes over 75 g silicagel ved eluering med den nedre fase af et chloroform: methanol: ammoniumhydroxid: vand (2:1: 0,2:0,8)-opløsningsmiddel-system. Ensartede fraktioner som bestemt ved tyndtlagschromatografi kombineres og 35 inddampes til en rest omfattende 1-N-benzylgentamicin Cir smp.: 83-88°C, [a]^6 + 90° (c = 0,3%, H20), pmr (ppm) (D20) : δ 1,03 (3H, d, J = 7Hz, HC-CH-j) , 1,16 (3H, 146298 42 s, C-CH3)7 2,27 (3H, s, N-CH3), 2,50 (3H, s, N-CH3), 4,7 (D20 + PhCH2N-), 4,92 (IH, d, J = 4Hz, H-l"), 5,08 (IH, d, J = 3,5Hz, H-l'), 7,43 (5H, s, aromatisk H).

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 568, 5 også m/e 440, 437, 412, 394, 379, 281, 263, 253, 235, 160, 157.

Eksempel 9 1-N-substituerede 4,6-diaminoglycosyl-l,3-diaminocycli-toler fremstillet ved hydrid-reduktion af de tilsvarende 1 o 1-N- acy Ider ivat er.

1-N-(S-S-amino-p-hydroxybutyl)gentamicin C1.

98 mg 1-N-(S-δ-amino-β-hydroxybutyryl)gentamicin suspenderes i 8 ml tetrahydrofuran. Der tilsættes 14 ml IN diboran i tetrahydrofuran og koges under tilbage-15 svaling i 6 timer under en atmosfære af nitrogen. Der tilsættes forsigtigt 2 ml vand til dekomponering af eventuelt overskud af diboran og inddampes. Den resulterende rest opløses i hydrazinhydrat, og der koges under tilbagesvaling under en atmosfære af nitrogen i 16 timer.

20 Opløsningen inddampes, og resten ekstraheres med varm vandig ethanol. De kombinerede ethanolekstrakter inddampes, og den resulterende rest chromatograferes over 10 ml silicagel ved eluering med den nedre fase af et chloroform: methanol: koncentreret ammoniumhydroxid 25 (2:1:1)-opløsningsmiddelsystem. Ensartede fraktioner som bestemt ved tyndtlagschromatografi kombineres og inddampes til opnåelse af 1-N-(S-S-amino-p-hydroxybu-tyl)gentamicin (udbytte 14,5 mg), smp.: 93-98°C, [a]^: +72,4° (c = 0,35%, H20), pmr (ppm) (D20)δ 1,18 30 (3H, d, J = 7Hz, CH-CELj) , 1,24 (3H, s, C-CH3) , 2,49 (3H, s, N-CH3), 2,54 (3H, s, N-CH3), 5,07 (IH, d, J = 3,5Hz, H-l"), 5,24 (IH, d, J = 3,5Hz, H-l').

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 565, også m/e 528, 516, 490, 437, 434, 410, 35 397, 278, 250, 232, 160, 157.

På analog måde fremstilles 1-N-(S-Y-methylamino-β-hydroxypropyl)-gentamicin B, pmr: D20: δ 1,21 (3H, s, 146298 43 C-CH3) , 2,33 (3H, s, 3*"-N-CH3) , 2,62 (3H, s, 3"-N-CH3) , 5,02 (IH, d, J = 4,5Hz, H-l"), 5,12 (IH, d, J = 3,0Hz, H-l*).

Eksempel 10 5 1-N-Methylsisomicin ud fra 3",4"-N,0-carbonyl-2',3,6'-tri-Khfc-butoxycarbonyl-sisomicin.

3",4"-N,0-carbonyl-2',3,6'-tri-N-t-butoxycarbo-nyl-sisomicin (0,77 g) opløses i tetrahydrofuran (20ml), og opløsningen afkøles i et isbad. Der tilsættes methyΙ-ΙΟ fluorsulfonat (0,12 g), og opløsningen får lov at opvarme til stuetemperatur. Opløsningsmidlet fjernes, og resten opløses i trifluoreddikesyre. Efter 5 minutters forløb ved stuetemperatur fjernes trifluoreddikesyren i vacuum, og resten behandles med 10%'s kaliumhydroxidop-15 løsning ved 100°C i 5 timer.

Den afkølede opløsning passeres ned gennem en søjle af "Amberlite"® IRC-50 (H+)-ionbytterharpiks og elueres med 2N vandig ammoniumhydroxid. Det eluerede koncentreres og lyofiliseres til opnåelse af det rå ti-20 telprodukt.

Det rå materiale chromatograferes på silicagel med den nedre fase af en chloroform: methanol: 7%'s ammoniumhydroxid (2:1:1)-opløsningsmiddelblanding til opnåelse af 1-N-methylsisomicin. [a]^: + 153° (0,3%, 25 H«0).

Massespektrum (M + 1) m/e 462, også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336 (w), 346, 376, 386.

30 Eksempel 11 1-N-Methylsisomicin.

2', 3,6 ' -Tri-N-t-butoxycarbonyl-3", 4"-N, 0-carbonyl-sisomicin (5 g) i ethanol (100 ml) behandles med 37%'s vandig formaldehyd (1 ml) og ammoniumformiat (5 g), og 35 opløsningen koges under tilbagesvaling i 24 timer. Opløsningen fortyndes med vand (200 ml) og ekstraheres med 146298 44 chloroform (3 x 100 ml). De kombinerede ekstrakter inddampes til tørhed, og resten indeholdende 2',3,6'-tri-N-t-butoxycarbonyl-3",4"-N,0-carbonyl-1-N-methyl-s i so-micin opløses i trifluoreddikesyre, og efter 5 minutters 5 forløb ved stuetemperatur fjernes opløsningsmidlet i vacuum. Resten behandles med 10%'s kaliumhydroxid (25 ml) ved 100°C i 5 timer. Den afkølede opløsning passeres ned gennem en søjle af "Amberlite"® IRC 50 (H+)-ion-bytterharpiks, og det rå produkt elueres med 2N vandig 10 ammoniumhydroxid. De kombinerede eluerede fraktioner inddampes til tørhed i vacuum, og resten chromatografe-res på silicagel (200 g) i den nedre fase af et chloroform: methanol: 7%’s ammoniumhydroxid (2:1:1)-opløsrings- 26 middelsystem til opnåelse af 1-N-methylsisomicin. [a]D : 15 +153° (0,3%, H„0).

^ +

Massespektrum: (M + 1) m/e 462, også m/e 122, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336 (w) , 346, 376, 386.

20 Eksempel 12 1-N-Methylsisomicin.

2 1,3,6 '-Tri-N-t-butoxycarbonyl-3 " -rå "-N, 0-carbo-nyl-sisomicin (0,77 g) behandles i tetrahydrofuran (25 ml) med methylamin (101 mg) og trifluormethylsulfonsyre-25 anhydrid (290 mg) ved 0°C i 18 timer. Opløsningen inddampes til tørhed, og resten opløses i dimethylformamid (10 ml), og der omrøres med methyliodid (300 mg) og ka-liumcarbonat (130 mg) i yderligere 18 timer. Opløsningsmidlet fjernes ved inddampning, og resten behandles med 30 10%'s vandig kaliumhydroxid ved 100°C i 12 timer. Den afkølede opløsning passeres gennem en søjle af "Amberli te" ®IRC 50 (H+)-ionbytterharpiks. Det rå produkt elueres med 2N vandig ammoniumhydroxid. Det kombinerede eluat inddampes til tørhed i vacuum, og resten chromato-35 graferes på silicagel (200 g) i den nedre fase af et chloroform: methanol: 7%'s ammoniumhydroxid (2:1:1)-opløsningsmiddelsystem til opnåelse af 1-N-methylsisomi- 146298 45 cin. [α]£6: +153° (0,3%, H20).

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 462, også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336(w), 346, 376, 5 386.

Eksempel 13 1-N-Methylsisomicin.

2', 3,6 ' -Tri-N-t-butoxycarbonyl-3 "·, 4 "τΝ,0-carbo-nyl-sisomicin (0,77 g) i tetrahydrofuran (20 ml) be-10 handles med 37%'s vandig formaldehyd (3 ml) og succini-mid (170 mg) ved stuetemperatur i 18 timer. Opløsningen dryppes i en blanding af diethylether/hexan (1:1), og bundfaldet samles ved filtrering. Dette materiale behandles med natriumborhydrid (200 mg) i ethanol (20 ml) 15 ved stuetemperatur i 5 timer. Ethanolen fjernes i vacuum, og resten behandles med 10%'s vandig kaliumhydroxid i 12 timer ved 100°C. Den afkølede opløsning passeres ® + IRC 50 (H )-ionbytter- harpiks, og det rå produkt elueres med 2N vandig ammo-20 niumhydroxid. Det kombinerede eluat inddampes til tørhed i vacuum, og resten chromatograferes på silicagel (200g) i den nedre fase af et chloroform: methanol: 7%'s ammoniumhydroxid (2:1:1)-opløsningsmiddelsystem til opnåelse af 1-N-methylsisomicin. [a]j?^ : +153° (0,3%, H20) .

oc 3 Massespektrum: (M + 1) m/e 462, også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336 (w) , 346, 376, 386.

Eksempel 14 -a n 1-N-Methylsisomicin.

21,3, 6'-Tri-N-t-butoxycarbonyl-3";4"-N,0-carbo-nyl-sisomicin (0,77 g) opløses i dichlormethan (100 ml) med acrylonitril (0,25 g) og efterlades ved stuetemperatur i 24 timer. Opløsningsmidlet fjernes i vacuum og 35 efterlader en rest, som opløses i dimethylformamid og behandles med methyliodid (180 mg) ved 50°C i 12 timer.

146298 46

Opløsningsmidlet fjernes, og resten behandles med 10%'s vandig kaliumhydroxid ved 100°C i 8 timer. Den afkølede opløsning passeres gennem en søjle af "Amberlite"®IRC 50 (H+)-ionbytterharpiks, og det rå produkt elueres med 5 2N vandig ammoniumhydroxid. Det kombinerede eluat inddampes til tørhed i vacuum, og resten chromatograferes på silicagel (200 g) i den nedre fase af et chloroform: methanol: 7%'s ammoniumhydroxid (2:1:1)-opløsningsmid- 26 delsystem til opnåelse af l-N-methylsisomicin. [a]D : 10 +153° (0,3%, ELO) .

^ +

Massespektrum: (M + 1) m/e 462, også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336 (w) , 346, 376, 386.

Den efterfølgende tabel angiver den minimale haan— 15 mende koncentration (MIC) for nogle af de omhandlede forbindelser. Forsøgene blev udført i Mueller-Hinton Broth (pH 7,2) under anvendelse af standmetoder.

Den in vitro minimale hæmmende koncentration (MIC) Betegnelse af forbindelser i tabellen: 20 a) Hidtil ukendte forbindelser fremstillet ifølge opfindelsen:

Forbindelse 1: 1-N-ethylgentamicin Cla Forbindelse 2: 1-N-ethylgentamicin C^

Forbindelse 3: 1-N-ethyl-Antibiotikum G-52 25 Forbindelse 4: 1-N-(4-amino-2(S)-hydroxybutan)- gentamicin C^

Forbindelse 5: 1-N-hydroxyethylgentamicin C^

Forbindelse 6: 1-N-phenethylgentamicin C^

Forbindelse 7: 1-N-ethylverdamicin 30 Forbindelse 8: 1-N-ethylsisomicin

Forbindelse 9: 1-N-(2-ethylbutyl)-sisomicin Forbindelse 10: 1-N-(4-aminobutyl)-sisomicin Forbindelse 11: 1-N-ethylgentamicin B Forbindelse 12: 1-N-ethyl-Antibiotikum JI-20B 3^ Forbindelse 13: l-N-ethylmutamicin 2

Forbindelse 14: l-N-ethylmutamicin 6 146298 47 b) Forbindelser ifølge kendt teknik:

Forbindelse 15: 1-N-(S-4-amino-2-hydroxybutyryl)- gentamicin C^a (US-patentskrift nr.

3.796.699) 5 Forbindelse 16: 1-N-(S-4-amino-2-hydroxybutyryl)- gentamicin (US-patentskrift nr.

3.780.018)

Forsøgsmetode

Fremstil og steriliser 2000 ml Mueller-Hinton-10 næringsvæske indstillet til pH 7,2. Overfør 5 ml af det sterile medium til hvert af 120 sterile 16 x 150 mm forsøgsrør med bomuldspropper. Arranger rørene i 10 grupper hver på 12 rør. Tilføj til hver gruppe et kontrolrør. Tilsæt til 4 hvert rør 10 celler af en af de bakteriestairmer, scm skal testes.

15 Tilsæt til hver gruppe en vandig opløsning af det antibiotikum, scm skal testes, under dannelse af følgende slutkoncentrationer pr. rør: 50 mcg/ml, 25 mcg/ml, 10 mcg/ml, 5 mcg/ml, 2 mcg/ml, 1 mcg/ml, 0,5 mcg/ml, 0,2 mcg/ml, 0,1 mcg/ml, 0,05 mcg/ml, 0,01 mcg/ml, 0,005 mcg/ml og 0,0 mcg/ml 20 (kontrol). Inkuber rørene i 24 timer ved 37°C. Bestem visuelt for hver gruppe af rør den laveste koncentration af antibiotikum, som hæmmer bakterievækst, og den højeste koncentration af antibiotikum, som tillader bakterievækst.

25 Bestem den minimale hæmmende koncentration af de anvendte forsøgs-antibiotika over for hver af testbakterierne ved beregning af middelværdien mellem de to ovenfor fundne værdier.

Tabel 30 Escherichia coli Forb. 1 Forb. 2 Forb. 3 Forb. 4 W677/R55 - 3,0 0,3 0,03 JR 66 3,0 3,0 0,3 3,0 JR 88 3,0 .7,5 3,0 3,0 JR 90 0,75 17,5 7,5 3,0 35 LA290 R55 0,3 0,75 0,3 3,0 R5/W677 - 0,3 17,5 0,75 HL97/W677 - 3,0 0,75 3,0

Swidinsky 4195 0,75 3,0 3,0 7,5 146298 48

Tabel (forts.)

Escherichia coli Forb. 1 Forb. 2 Forb. 3 Forb. 4

St. Michael 589 0,3 0,75 0,75 3,0

Baker 2 0,3 0,3 0,3 3,0 5 F14-BK 0,075 0,3 0,3 3,0 1574-1 0,075 0,3 3,0 3,0 ATCC 10536 0,075 0,3 0,3 0,75

Pseudomonas

Travers 1 3,0 7,5 3,0 17,5 10 Stone 130 3,0 - 7,5 17,5

Stone 138 7,5 17,5 7,5 7,5

Capetown 18 3,0 17,5 7,5 3,0

Shreveport 3796 >25 17,5 >25 >25

Stone 20 0,05 0,3 0,03 0,3 15 Stone 39 0,3 3,0 3,0 3,0

St. Michael 762 0,3 3,0 3,0 3,0 1395 0,75 17,5 3,0 17,5 NRRL 3223 0,3 3,0 3,0 3,0 GN 315 - 3,0 17,5 3,0 20 Klebsiella

Georgetown 3694 3,0 0,75 3,0 7,5 3020 3,0 0,075 0,3 0,3

Oklahoma 6 - 3,0 0,75 3,0 AD 17 0,075 0,75 3,0 3,0 25 Ad 18 0,075 0,3 3,0 3,0

Providencia 164 17,5 >25 >25 >25

Proteus mirabillis

Harding 0,3 3,0 7,5 3,0 30 rettgeri Membel 0,75 3,0 17,5 17,5 rettgeri Anderson - >25 >25 >25

Serratia

Dalton 0,75 0,3 0,3 3,0

Salmonella 35 Group B typhim 0,3 3,0 3,0 3,0 146298 49

Tabel (forts.)

Escherichia coli Forb. 5 Forb. 6 Forb. 7 Forb. 8 W677/R55 3,0 0,75 0,3 0,3 JR 66 3,0 0,75 0,3 0,3 5 JR 88 3,0 0,75 3,0 0,8 JR 90 3,0 0,75 3,0 0,3 LA290 R55 3,0 0,75 0,3 0,3 R5/W677 3,0 7,5 3,0 17,5 HL97/W677 0,01 - >25 >25 10 Swidinsky 4195 3,0 17,5 3,0 3,0

St. Michael 589 3,0 7,5 0,8 0,3

Baker 2 3,0 17,5 0,3 0,3 F14-BK 3,0 0,75 0,3 0,3 1574-1 3,0 7,5 0,3 0,3 15 ATCC 10536 0,75 0,75 0,1 0,08

Pseudomonas

Travers 1 7,5 - 3,0 0,8

Stone 130 17,5 - 3,0 0,8

Stone 138 17,5 - 3,0 0,8 20 Capetown 18 7,5 - 3,0 0,3

Shreveport 3796 17,5 - 3,0 >25

Stone 20 0,3 - 0,03 0,03

Stone 39 3,0 - 0,8 0,3

St. Michael 762 3,0 - 3,0 0,3 25 1395 17,5 - 3,0 0,3 NRRL 3223 3,0 - 0,8 0,3 GN 315 3,0

Klebsiella

Georgetown 3694 3,0 - 0,3 0,3 30 3020 0,75 - 0,3 0,3

Oklahoma 6 7,5 - 0,3 0,3 AD 17 3,0 - 0,3 0,1 AD 18 3,0 - 0,3 0,1

Providencia 35 164 >25 - 17,5 17,5 146298 50

Tabel (forts.)

Proteus Forb. 5 Forb. 6 Forb. 7 Forb. 8 mirabillis

Harding 3,0 - 0,8 0,3 5 rettgeri Membel 17,5 - 0,8 0,3 rettgeri Anderson >25 - >25 >25

Serratia

Dalton 3,0 - 0,3 0,9

Salmonella 10 Group B typhim 3,0 - 0,8 3,0

Escherichia coli Forb. 9 Forb. 10 Forb. 11 Forb. 12 W677/R55 - 0,3 3,0 3,0 JR 66 0,075 0,3 3,0 7,5 JR 88 - 0,3 3,0 17,5 15 JR 90 0,75 0,3 3,0 LA290 R55 0,3 0,3 3,0 7,5 R5/W677 17,5 3,0 >25 17,5 HL97/W677 17,5

Swidinsky 4195 0,75 3,0 >25 >25 20 St. Michael 589 0,3 0,75 7,5 17,5

Baker 2 0,3 0,3 3,0 17,5 F14-BK 0,3 0,3 3,0 0,75 1574-1 0,3 0,3 3,0 0,75 ATCC 10536 0,3 0,03 0,3 0,3 25 Pseudomonas

Travers 1 17,5 0,3 3,0 3,0

Stone 130 17,5 0,3 7,5

Stone 138 17,5 0,3 7,5

Capetown 18 7,5 0,3 3,0 30 Shreveport 3796 >25 >25 >25 17,5

Stone 20 0,03 0,03 0,3 0,075

Stone 39 3,0 0,3 3,0 3,0

St. Michael 762 7,5 0,3 3,0 3,0 1395 17,5 0,3 3,0 7,5 35 NRRL 3223 3,0 0,03 3,0 3,0 GN 315 >25 >25 >25 >25 51 148 2 9 8

Tabel (forts.)

Klebsiella Forb. 9 Forb. 10 Forb. 11 Forb. 12

Georgetown 3694 7,5 0,03 3,0 7,5 5 3020 0,3 0,03 3,0 0,75

Oklahoma 6 0,75 0,03 3,0 7,5 AD 17 7,5 0,3 - 0,75 AD 18 7,5 0,3 - 0,75

Providencia 10 164 - >25 7,5 >25

Proteus mirabillis

Harding 3,0 0,75 17,5 17,5 rettgeri Membel - 3,0 3,0 17,5 rettgeri Anderson - >25 >25 >25 15 Serratia

Dalton 17,5 3,0 7,5 17,5

Salmonella

Group B typhim 3,0 0,75 3,0 3,0

Escherichia coli Forb. 13 Forb. 14 Forb. 15 Forb. 16 20 W677/R55 0,075 0,125 17,5 7,5 JR 66 0,075 1 7,5 7,5 JR 88 0,075 0,25 17,5 17,5 JR 90 0,3 0,5 17,5 7,5 LA290 R55 0,075 0,25 7,5 7,5 25 R5/W677 17,5 >16 HL97/W677 8

Swidinsky 4195 0,3 1 - 7,5

St. Michael 589 0,3 2 7,5 7,5

Baker 2 0,3 1 7,5 17,5 30 F14-BK 0,075 0,125 3,0 7,5 1574-1 0,075 0,25 - 7,5 ATCC 10536 0,03 0,125 3,0 17,5

Pseudomonas

Travers 1 0,3 0,125 17,5 7,5 35 Stone 130 0,3 0,5 >25 17,5

Stone 138 0,3 0,5 >25 17,5

Capetown 18 0,3 0,25 >25 17,5

Shreveport 3796 7,5 4 - >25

Claims (4)

1. 5 St. Michael 762 0,3 0,25 >25 7,5 1395 0,3 0,25 >25 7,5 NRRL 3223 0,075 0,25 >25 17,5 GN 315 >25 >16 Klebsiella
2. 10 Georgetown 3694 0,3 0,125 3,0 7,5 3020 0,3 0,06 3,0 7,5 Oklahoma 6 0,3 0,25 - - AD 17 0,075 0,25 3,0 7,5 AD 18 0,075 0,06 3,0 7,5
3. 15 Providencia 164 3,0 8 Proteus mirabillis Harding 3,0 0,5 - 17,5 rettgeri Membel 0,3 0,5 >25 >25 20 rettgeri Anderson >25 16 - - Serratia Dalton 0,75 0,5 3,0 7,5 Salmonella Group B typhim 0,3 0,25 3,0 7,5 25
4. 1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af 1-N-substituerede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolerne gentamicin B, genta- 30 micin B^, gentamicin C^, gentamicin Cla, gentamicin C2, gentamicin C2a, gentamicin sisomi- cin, verdamicin, Antibiotikum G-418, Anti biotikum 66-40B, Antibiotikum 66-40D, Antibiotikum JI-20A, Antibiotikum JI-20B, Antibiotikum G-52, mutamicin 35 1, mutamicin 2, mutamicin 4, mutamicin 5 og mutamicin 6, hvor substituenten er 1Λ6298 hvor X er hydrogen, alkyl, alkenyl, hydroxyalkyl, amino-alkyl, N-alkylaminoalkyl, aminohydroxyalky1, N-alkylami-nohydroxyalkyl, phenyl eller benzyl, hvilke aliphatiske grupper har op til 7 C-atomer og, hvis de er substitueret 5 med både amino og hydroxy, bærer substituenterne på forskellige carbonatomer, eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, kendetegnet ved, at a) en tilsvarende 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diami-10 nocyclitol, der kan have amino-beskyttelsesgrupper ved en hvilken som helst anden aminogruppe end den i 1-stillin-gen, behandles med et aldehyd med formlen: X*-CHO hvor X' er en gruppe som defineret for X ovenfor, hvori 15 enhver tilstedeværende amino- eller hydroxygruppe kan være beskyttet, i nærværelse af et hydriddonor-redukti-onsmiddel, hvorpå, om påkrævet, alle i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, 20 b) N,C-dobbeltbindingen i et 1-N=CHX'-substitueret derivat af en tilsvarende 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-di-aminocyclitol, hvori alle grupper NH2 er beskyttet, og grupper NHCH3 kan være beskyttet, hvorhos X' er en gruppe som defineret for X ovenfor, hvori enhver tilstedevæ-25 rende amino- eller hydroxygruppe kan være beskyttet, reduceres, hvorpå alle i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, c) et 1-N-substitueret derivat af en tilsvarende 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, hvori én el-30 ler flere aminogrupper kan være beskyttet, og 1-N-substi- 0 il tuenten er -C-X", hvor X" er hydrogen, alkyl, alkenyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, N-alkylaminoalkyl, aminohydro-xyalkyl, N-alkylaminohydroxyalkyl, phenyl, benzyl eller 35 hydrocarbyloxy, hvilke aliphatiske grupper har op til 7 C-atomer og, hvis de er substitueret med både amino og hydroxy, bærer substituenterne på forskellige carbonatomer, og hvori enhver tilstedeværende amino- eller hydro- 146298 xygruppe kan være beskyttet, behandles med et amid-reducerende hydridreagens, hvorpå alle i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, 5 d) til fremstilling af de ovennævnte 1-N-substitue rede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyc-litoler, hvori substituenten er ligekædet alkyl med op til 5 C-atomer, en tilsvarende 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3 -diaminocyclitol, der har amino-beskyttelsesgrupper ved 10 enhver anden aminogruppe end den i 1-stillingen, og hvori 1-aminogruppen kan være aktiveret på i og for sig kendt måde, omsættes med et alkyleringsmiddel indeholdende den ligekædede alkylgruppe med op til 5 C-atomer og en bortgående gruppe, hvorpå i molekylet tilstedeværende beskyt- 15 telsesgrupper og, om påkrævet, tilstedeværende aktiverende gruppe eller grupper fjernes på i og for sig kendt måde, e) til fremstilling af de ovennævnte 1-N-substitue-rede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyc- 20 litoler, hvori substituenten er methyl, en tilsvarende 4.6- di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, der har amino-beskyttelsesgrupper ved enhver anden aminogruppe end den i 1-stillingen, omsættes med formaldehyd og et cyc-lisk imid, og den herved vundne forbindelse behandles med 25 et hydriddonor-reduktionsmiddel, og alle i molekylet tilstedeværende beskyttelsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, eller f) til fremstilling af de ovennævnte 1-N-substitue- ... rede derivater af 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyc- 30 litoler, hvori substituenten er methyl, en tilsvarende 4.6- di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, der har amino-beskyttelsesgrupper ved enhver anden aminogruppe end den i 1-stillingen, omsættes med formaldehyd i nærværelse af myresyre, og alle i molekylet tilstedeværende beskyt- 35 telsesgrupper fjernes på i og for sig kendt måde, og at der efter nævnte fremgangsmåder a) til f) foretages isolering af derivatet som sådant eller som et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt.