DK145286B - Middel til tilfoering af en afmaalt maengde af et vandoploeseligteller i vand dispergerbart reagens til et vandholdigt fast medium og tilhoerende fremgangsmaade til analyse af et proevestof - Google Patents

Description

(19) DANMARK (8)

W (12) FREMLÆGGELSESSKRIFT on 145286 B

DIREKTORATET FOR PATENT- OG VAREMÆRKEVÆSENET

(21) Ansøgning nr. l46l/76 (51) IntCI* Β 01 J 4/02 (22) Indleveringsdag 50 · mar. 1976 6 01 Ν 31/00 (24) Løbedag 50. mar. 1976 (41) Aim. tilgængelig 1 . okt. 1977 (44) Fremlagt 25 · okt. 1982 (86) International ansøgning nr. -(86) International indleveringsdag -(85) Videreførelsesdag -(62) Stamansøgning nr. -(30) Prioritet - (71) Ansøger FMC CORPORATION, Wilmington, US.

(72) Opfinder Donald Walter Renn, US.

(74) Fuldmægtig Internationalt Patent-Bureau.

(54) Middel til tilføring af en afmålt mængde af et van&opløsellgt eller i vand dispergerbart reagens til et vandholdigt fast medium og til= hørende fremgangsmåde til analyse af et prøvestof.

Den foreliggende opfindelse angår et middel til tilføring af en afmålt mængde af et vandopløseligt eller i vand dispergerbart reagens til et vandholdigt fast medium til anvendelse ved molekular-2 diffusions- eller affinitetsseparationsfremgangsmåder, og opfindel- D sen angår desuden en tilhørende fremgangsmåde til analyse af et prø- ^ vestof.

f) Der er udviklet mange forskellige analysefremgangsmåder til fraskillelse og identificering af forskellige i et prøvestof tilstedeværende molekylarter, hvorved man anbringer prøvestoffet i kon- ^ takt med et vandholdigt fast medium og fremkalder molekulardiffusion

J

af prøvestoffet gennem mediet. Der er navnlig blevet anvendt chroma-tografi- og elektroforesefremgangsmåder, herunder immunoelektrofore- 145286 2 sefremgangsmåder, hvilke fremgangsmåder alle giver adskillelse af forskellige molekylarter ved differentialdiffusion af et prøvestof gennem et vandholdigt fast medium. Ved sådanne fremgangsmåder kan der også til mediet tilføres mange forskellige reagenser, som reagerer med én eller flere af molekylarterne i prøvestoffet, før, under eller efter adskillelsesprocessen for at medvirke til adskillelse eller identificering af molekylarterne.

Disse reagenser er tidligere blevet indført i mediet på forskellige måder. I nogle tilfælde er de blevet indført i mediet på dettes fremstillingstidspunkt, men i de fleste tilfælde er de blevet tilført til overfladen af det vandholdige faste medium på det tidspunkt, hvor der har været brug for dem, enten ved anbringelse af en flydende opløsning eller dispersion af reagenset på overfladen af mediet og henstilling heraf eller ved neddypning af det faste medium i en opløsning eller en dispersion af reagenset i et passende flydende bæremiddel. I begge tilfælde er nøjagtig måling og regulering af mængden og anbringelsen i mediet, ind i hvilket reagenset diffunde-rer, vanskelig og ubestemt. Det er også blevet foreslået at disperge-re sådanne reagenser i et fast vandbestandigt bindemiddel, såsom af Rey et al. i USA-patentskrift nr. 3.630.957 og af Sherelis i USA-patentskrift nr.3.694.163, og at holde et reagensholdigt fast vandu-opløseligt bindemiddel i kontakt med overfladen af et vandholdigt eller absorberende medium, såsom papir, som af Verbeck i USA-patentskrift nr. 3.672.845. Reagenser i vandbestandige eller vanduopløselige bindemidler kan imidlertid ikke let ekstraheres og diffundere ind i et vandholdigt fast medium, hvilket gør regulering og måling af den i mediet indførte mængde uigennemførlig i praksis.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes der et middel og en fremgangsmåde, som letter nøjagtig og kvantitativ indføring af reagens i et fast vandholdigt medium til anvendelse ved molekulardiffusions- eller affinitetsseparationsfremgangsmåder.Opfindelsen er særlig anvendelig i forbindelse med et medium i form af et tyndt lag, dvs. et vandholdigt fast medium i form af et lag med en tykkelse på 0,1 til 2 mm.

Midlet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det omfatter en fast film bestående i det væsentlige af et filmdannende, fast, organisk, polymert bindemiddel, der er opløseligt i vand i et omfang på mindst 1 vægt% ved 20°C, og inkorporeret i nævnte bin-demiddelfilm en afmålt mængde af nævnte reagens, hvorhos filmen er af en sådan størrelse og form, at den er egnet til at anbringes i kontakt med nævnte medium til muliggørelse af, at nævnte reagens U5286 3 og bindemiddel diffunderer fuldstændigt ind i mediet.

En hensigtsmæssig udførelsesform for midlet ifølge opfindelsen består i, at det desuden omfatter en bærende bagklædning af vanduopløseligt syntetisk plast bundet til den ene overflade af nævnte film.

Ifølge opfindelsen tilvejebringes der også en fremgangsmåde til analyse af et prøvestof, ved hvilken man underkaster prøvestoffet en molekulardiffusionsseparationsproces i et vandholdigt fast medium og bringer bestanddele af prøvestoffet til at reagere med et reagens i nævnte medium, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man anbringer den ene side af det ovenfor beskrevne middel ifølge opfindelsen, med eller uden nævnte bagklædning, i kontakt med nævnte medium og holder den i kontakt i tilstrækkelig tid til at muliggøre, at nævnte reagens og bindemiddel diffunderer fuldstændigt ind i mediet.

Ved bindemidler, der er "opløselige i vand",skal der forstås sådanne materialer, som danner kolloide opløsninger eller dispersioner, såvel som sådanne, der danner ægte opløsninger.

De bindemidler, der kan anvendes i midlet ifølge opfindelse, omfatter forskellige polymere materialer, såsom dextran, vandopløseligt polyacrylamid, polyacrylsyre og vandopløselige metalsalte heraf, vandopløselig polyvinylalkohol, polyethylenglycol, poly-ethylenoxid, polyvinylpyrrolidon, klaret guargummi, vandopløselig carboxymethylcellulose, vandopløselig hydroxyethylcellulose, vandopløselig methylcellulose, algin, carrageenan, xanthangummi, stivelse, vandopløselige copolymere af maleinsyreanhydrid med forskellige vinylmonomere som beskrevet f.eks. i USA-patentskrift nr. 2.047.398, navnlig copolymere af maleinsyreanhydrid med vinylethere eller vinylestere eller deres tilsvarende salte. Sammen med bindemidlet kan der også være konventionelle fugtighedsbindende midler eller overfladeaktive ’ midler (dispergeringsmidler) til stede til opretholdelse af bindemidlets fleksibilitet og til lettelse eller fremskyndelse af dets dispergering eller opløsning i vand.

Filmen af polymert bindemiddel kan have en vilkårlig ønsket tykkelse, men er fortrinsvis fra 0,01 til 2 mm. Den kan være forsynet med et midlertidigt, fjerneligt bærelag eller bagklædning i form af papir eller vanduopløselig plastfilm, men en sådan bagklædning eller bærelag er kun af betydning for yderst svage eller skøre film og kan udelades i tilfælde af selvbærende film. Når der anvendes et bærelag eller en bagklædning, er det/den hensigtsmæssig transparent. Egnede 145286 4 bagklædninger omfatter bagklædninger dannet af sådanne plast som polyestere, polystyren, celluloseacetat, polyamider og lignende af varierende tykkelse. Tykkelsen af bagklædningen holdes sædvanligvis mindst mulig for at holde omkostningerne lavest mulige under samtidig tilvejebringelse af den ønskede mekaniske forstærkning eller styrke. Bindingsgraden af reagens-bindemiddel-filmen til bagklædningsfilmen er ikke væsentlig. Der opnås sædvanligvis en tilstrækkelig bindingsgrad, hvis bindemiddelfilmen dannes in situ på overfladen af bagklædningsfilmen ud fra en opløsning eller en smelte.

De reagenser, som kan inkorporeres i filmen af polymert bindemiddel, kan være vilkårlige af de vandopløselige eller i vand dis-pergerbare stoffer, hvoraf mange er almindelig anvendt ved prøvningsmetoder, såsom antistoffer, antigener, enzymer, enzymsubstrater, precipitin-fluorescensstoffer, farvereagenser, fældningsmidler, mikrobiologiske organismer og/eller næringsstoffer herfor, puffere, salte og lignende, samt radioaktivt mærkede eller fluorescererde reagenser af de ovennævnte typer.

De relative mængder af reagens og vandopløseligt polymert bindemiddel i det omhandlede middel kan varieres inden for vide grænser afhængig af størrelsen eller mængden af den afmålte mængde reagens, som ønskes t °<J er et spørgsmål om valg eller hensigstmæssig-hed. Sædvanligvis er det mest hensigtsmæssigt at anvende et middel, hvori mængden af vandopløseligt polymert bindemiddel beløber sig til ca. 10 til 95 vægt% af filmen, medens reagenset udgør den resterende del. Der kan benyttes to eller flere reagenser i blanding med hinanden. En blanding af to eller flere forskellige polymere bindemidler kan også anvendes, men der er dog sædvanligvis ikke nogen fordel ved at anvende et sådan blanding.

Reagenserne kan inkorporeres i filmen af polymert bindemiddel på mange forskellige måder, idet man tager i betragtning, at det sædvanligvis er vigtigt at have reagenset fordelt så ensartet som muligt gennem hele massen af polymert bindemiddel. Reagenset kan blandes med det polymere bindemiddel, medens sidstnævnte er i smeltet form eller i form af en opløsning i et flygtigt opløsningsmiddel, hvorefter man former blandingen til en film af den ønskede tykkelse og lader den tørre eller afkøle, således at den bliver fast. Filmen af vandopløseligt polymert bindemiddel kan også dannet særskilt ud fra en opløsning af bindemidlet eller ud fra en smelte, hvorefter man kan påføre en opløsning eller dispersion af reagenset i et egnet flydende bæremiddel på overfladen af filmen og lade den diffundere 145286 5 ind i filmen og derpå tørre filmen. I nogle tilfælde kan reagenset i tør, findelt partikelform adspredes på overfladen af filmen af vandopløseligt polymert bindemiddel, hvorefter man smelter sidstnævnte og lader det størkne påny. Medens der sædvanligvis kan benyttes tørring med tvungen luftcirkulation ved dannelse af filmen og/eller inkorporering af reagenset i filmen, kan der også benyttes vakuumtørring eller frysetørring i tilfælde af varmefølsomme materialer.

Størrelsen af midlet ifølge opfindelsen er et spørgsmål om valg, afhængig af arten af den prøvemetode der skal udføres. Almindeligvis er det ikke hensigtsmæssigt at anvende midler, hvor filmens 2 dimensioner er mindre end ca. 5 mm , men mindre midler kan dog anvendes i særlige tilfælde, hvor det ønskes at afgrænse reagenset til et lille lokaliseret område på mediet, og der kan anvendes større midler og herunder sådanne, som er store nok til at dække hele den blottede overflade af det medium, hvortil reagenset skal tilføres, 2 hvilken overflade kan være af størrelsesordenen 100 cm eller endog mere. Filmen kan have en vilkårlig ønsket form, og den kan f.eks. være rørformet eller perforeret.

Midlet ifølge opfindelsen kan anvendes til tilføring af reagenser til et vilkårligt vandholdigt fast medium, som anvendes ved molekulardiffusions- eller affinitetsseparationsfremgangsmåder,som f.eks. chromatografi og elektroforese, navnlig sådanne medier, som er i form af tynde lag (dvs. med en maksimal tykkelse på 2 mm), hvadenten de er i form af en gel, en membran, et cellulært produkt eller et væv. Af særlig betydning er hydratiserede geler dannet af agarose, agar, polyacrylamid (tværbundet til forhindring af opløsning) eller celluloseacetat, og papir og celluloseacetatmembraner er også af betydning.

Ved anvendelse af midlet ifølge opfindelsen anbringer man simpelthen overfladen af den reagensholdige film i kontakt med det vandholdige faste medium og lader den blive der, indtil der sker fuldstændig opløsning eller diffusion af reagenset og det polymere bindemiddel, og reagenset og bindemidlet diffunderer ind i mediet. Dette trin udføres sædvanligvis ved stuetemperatur, men der kan dog anvendes andre temperaturer fra 1°C til 60°C. Når filmen har et vand-uopløseligt bagklædningslag eller bærelag som en del af det omhandlede middel, kan man lade dette forblive på plads på overfladen af det vandholdige medium, eller man kan om ønsket fjerne det, når diffusionen af reagenset og bindemidlet er fuldstændig. Det omhandlede 145286 6 middel kan også benyttes til at indføre reagenser i medier, der anvendes til dyrkning af bakterier, og det kan anvendes til histologisk farvning ved anbringelse af et farvereagensholdigt middel i kontakt med væv.

Midlet og fremgangsmåden ifølge opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de efterfølgende eksempler.

Eksempel 1

En opløsning af mælkesyre-dehydrogenase (LDH) lokaliseringsreagens fremstilledes ud fra et i handelen gående substratfarvestof og en pufferblanding. Til 1 ml af denne opløsning sattes 9 ml af en 0,5 vægt%'s vandig opløsning af polyethylenglycol-4000-bindemiddel, og blandingen omrørtes. 5 ml af denne blandede opløsning anbragtes derefter jævnt på en 8 1/4 x 10 cm bagklædning eller bærefilm af vanduopløseligt hydrofilt polyethylenterejiithalat solgt under handelsbetegnelsen "CronaP^' og blev tørret hurtigt ved 40°C i en ovn med tvungen luftcirkulation til dannelse af en bindemiddel-LDH-film af en tykkelse på ca. 0,02 mm på bagklædningen.

Et konventionelt hydratiseret agarose-elektroforesemedium (et 1 ^il 2 mm tykt lag af hydratiseret agarose på et bærelag af "Cronar*"-film) blev ækvilibreret med vandig standardpufferopløsning, podedes med humant serum og underkastede elektroforese. Efter fuldendelse af elektroforesen anbragtes LDH-bindemiddel-filmen på agarose-mediet med bagklædningen øverst, og denne sandwichslignende kombination anbragtes i en inkubator ved 37°C i 1 time. Der fremkom synlige violette linier i mediet, som viste beliggenheden af de serumkomponenter, hvormed LDH havde reageret. Bagklædningsfilmen fjernedes derefter fra overfladen af mediet, sidstnævnte vaskedes kortvarigt i rindende vand og gennemvædes derefter i 5 vægt%'s vandig eddikesyre til fiksering af de farvede linier og tørredes til dannelse af en permanent optagelse.

Om ønsket kan reagens-bindemiddel-filmen efter fremstillingen oplagres ubegrænset før anvendelsen ved indeslutning i en pose af 0,075 mm polyethylen og opbevaring ved 4-8°C.

Eksempel 2

Man fremstillede den samme type reagens-bindemiddel-film som i eksempel 1, bortset fra at opløsningen af polyethylenglycol 4000 anbragtes særskilt på bagklædningsfilmen og tørredes. LDH-Synliggø-relsesopløsningen (1 ml) fordeltes derefter jævnt på overfladen af 145286 7 det nævnte polyethylenglycol 4000 og tørredes. Det således fremstillede middel anvendtes derefter ved samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 1.

Eksempel 3

Til 10 ml af en 0, 5%'s vandig opløsning af polyvinylpyrrolidon-bindemiddel sattes som reagens 0,4 ml anti-human-helserum fremstillet i geder, og blandingen omrørtes kortvarigt. 5 ml af denne blanding fordeltes på en 8 1/4 x 10 cm bagklædningsfilm som i eksempel 1 og tørredes ved 25°C i en ovn med tvungen luftcirkulation til dannelse af en ca. 0,1 mm tyk reagens-bindemiddel-film på bagklædningsfilmen.

Det således fremstillede middel anvendtes ved anbringelse af reagens-bindemiddel-filmen i kontakt med overfladen af et 8 1/4 χ 10 cm almindeligt hydratiseret agarose-elektroforesefilmmedium forsynet med de sædvanlige prøvehuller til elektroimmunodiffusion. Efter 30 minutters forløb ved stuetemperatur blev bagklædningsfilmen fjernet, prøvehullerne tømtes for tilbageværende væske, og prøvemængder af serum indførtes i hullerne. Efter elektroforese i 45 minutter ved 100 V var der udviklet de ønskede synlige "raket"-precipitinmønstre, hvor der var indtruffet reaktion af reagenset med serumbestanddelene.

Eksempel 4

En reagens-bindemiddel-film fremstillet som beskrevet i eksempel 3 anbragtes i kontakt med et frisk fremstillet 1 mm tykt 1%’s-vandig agarosegelmedium indeholdende 0,85% natriumchlorid og 0,05% natriumazid, i hvilket medium der blev udskåret to huller på 2 mm i diameter til radialimmunodiffusion. Efter 30 minutters forløb ved stuetemperatur fjernedes bagklædningsfilmen, og den tilbageværende væske fjernedes fra hullerne. Prøvemængder på 5 mikroliter af humant serum anbragtes i hullerne, og gelmediet anbragtes i et fugtigheds-kairaner. Efter 24 timers forløb viste gelen de ønskede precipitinringe omkring hullerne, hvilke ringe viste beliggenheden af reaktionsprodukterne af serummet og reagenset efter diffusion.

Eksempel 5

En reagens-bindemiddel-film, der kan anvendes til de i eksempel 3 og 4 beskrevne fremgangsmåder, kan også fremstilles ved, at man blander 0,4 ml af antiseraene med 10 ml af en 0,5%'s vandig polyvinyl-pyrrolidonbindemiddelopløsning, frysetørrer den blandede opløsning 145286 8 og udspreder det frysetørrede faste stof på en plastbagklædning enten på et tyndt lag af våd polyvinylpyrrolidonfilm eller andet kontaktklæbemiddel.

Eksempel 6

Man gik frem på samme måde som i eksempel 3/ 4 og 5, bortset fra at antigenet, normalt humant serum, anvendtes som reagenset i binde-middelfilmen, og antistoffet anvendtes som prøvestoffet.

Eksempel 7

Man gik frem på samme måde som i eksempel 3, bortset fra at man i stedet for polyvinylpyrrolidonbindemiddel anvendte henholdsvis polyviiiylalkohol, polyethylenoxid, polyethylenglycol 20000, poly-acrylamid (vandopløseligt), natriumalginat, methylcelulose, klaret guargummi, vandopløseligt hydroxyethylcellulose, xanthangummi, opløselig stivelse og dextran som bindemiddel. Desuden anvendtes der i stedet for bagklædningsfilmen film af polyvinylidenchlorid ("Saran^ Wrap"), polycarbonat, polymethylmethacrylat og celluloseacetat, der alle er vanduopløselige. Selvbærende film af reagens-bindemiddel fremstilledes ud fra de ovennævnte blandinger ved anvendelse af polytetra-fluorethy lenf ilm ( "Tef lo'i^) som bagklædning og efterfølgende afrivning af den tørrede reagens-bindemiddel-film fra bagklædningen før anvendelse.

Eksempel 8

En mængde på 0,2 g af lipoprotein-farvestof "Fat Red 7B" (Sigma) opløstes i 0,2 ml polyethylenglycol 400 og blandingen indrørtes grundigt i 2 g smeltet polyethylenglycol 4000 , hvorefter man udspredte blandingen hurtigt og jævnt på en 81/4 x 10 cm bagklædningsfilm af hydrofiltpolyethylenterephthalat og lod den størkne. Filmen anvendtes uden yderligere ændring ved, at man anbragte reagens-bindemiddel-overfladen i kontakt med overfladen af et hydratiseret agarosegel-medium, hvori serumprotein på forhånd var blevet underkastet elektrofor ese. Efter 10 minutters kontakt ved stuetemperatur blev bagklædningsfilmen fjernet, hvorefter bånd af reageret lipoprotein var synlige i mediet.

Ved en anden udførelsesform sattes der til reagens-bindemiddel-blandingen 0,01 g af et nonionisk overfladeaktivt middel, octylphe-noxypolyethoxy-(9yl0)-ethanol forhandlet under handelsbetegnelsen "Triton^i-100". Den således fremstillede reagens-bindemiddel-film 145286 9 udviste hurtigere diffusion ind i agarosegelmediet.

Eksempel 9

Lige store rumfang af en barbitalpuffer med pH 8,2 og en ionstyrke på 0,08 og 1%'s vandig polyethylenglycol-4000-bindemiddel blandedes. 5 ml af denne blanding hældtes ud på overfladen af en 0,1 ran hydrofil polyethylenterephthalatbagklædningsfilm og tørredes i en ovn med tvungen luftcirkulation ved 40°C. Den opnåede, ca. 0,5 mm tykke reagens-bindemiddel-film anbragtes i kontakt med overfladen af et ca. 2 mm tykt hydratiseret agarosegelfilmmedium, idet man efterlod bagklædningsfilmen på plads på den side af reagens-bindemiddel-filmen, der vendte bort fra mediet. Efter 10 minutters forløb ved stuetemperatur fjernedes bagklaadningsfilmen, og gelmediet var parat til at modtage et prøvestof før en elektroforetisk proces.

Eksempel 10

Dextran-sulfat, et specifikt fældningsmiddel for lipoprotéi-ner, kan anvendes som sådant, når det inkorporeres i en reagens-bindemiddel-f ilm. Ca. 0,5 g dextran-sulfat-reagens opløstes i 1 ml vand og udspredtes jævnt på overfladen af en forud fremstillet tørret film af polyethylenglycol-4000-bindemiddel af en tykkelse på ca.

0,25 mm og tørredes derefter i en ovn med tvungen luftcirkulation ved 40°C.

Prøvemængder af humant serun underkastedes elektroforese i et ca. 1 mm tykt konventionelt hydratiseret agarosegelmedium båret på en bagklædning af hydrofil polyethylenterephthalatfilm.Efter fuldendelse af elektroforesen anbragte man overfladen af reagens-bindemiddel-f ilmen i kontakt med gelmediet, og lod det forblive der i 15 minutter ved stuetemperatur, hvorefter man vaskede mediets overflade med vand. Hvide bånd af de udfældede reaktionsprodukter af lipoproteiner med dextransulfatet var synlige i mediet, og måling af disse bånd muliggjorde en bestemmelse af mængden af lipoproteiner.

Eksempel 11

En reagens-bindemiddel-film fremstilledes ved, at man fordelte 1 ml af et 1:5 alpha^-antitrypsin-antisera-reagens i 0,85% saltopløsning jævnt på overfladen af en forud fremstillet og tørret, ca.

0,25 mm tyk film af polyethylenglycol-6000-bindemiddel. Det opnåede produkt tørredes hurtigt ved 20°C. Denne reagens-bindemiddel-film anvendtes på den i eksempel 10 beskrevne måde til humant serum af