JPH0253897A - 精製グアヤク脂およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 に産業上の利用分野】 本発明は、体液中のブドウ糖ならびに潜血等の検出を目
的とする診断薬の被酸化性呈色指示薬として好適な、精
製グアヤク脂ならびにその製造方法に関する。

Ｋ従来の技術】 尿、血液或いはリンパ液などの体液中のブドウ糖の量を
迅速に且つ簡単に知ることは、糖尿病の早期発見９診断
ならびに管理に必要不可欠である。

従来、体液、特に尿中のブドウ糖を検出するには、主と
して、被酸化性呈色指示薬の呈色の程度で判定するブド
ウ糖検査試薬を濾紙に含浸した検査体、或いは基材に該
試薬組成物が塗布された検査体が用・いられてきた。こ
れらの検査体は、使用に際して操作が簡便でしかも判定
が短時間で行なえるという利点がある。ところで、体液
中のブドウ糖ならびに潜血等の検出を目的としている診
断薬では被酸化性呈色指示薬として０−トリジン。

グアヤク脂、０−フェニレンジアミンが適用できること
は既に米国特許第２，９８１，６０６号に記載されてい
る。なかでもベンジジン系の化合物は検出感度が高いこ
とから、主として〇−トリジンが使用されていた。とこ
ろが０−トリジンは高い感度を持つ反面、保存によって
変色や感度の低下が生じ易く、呈色反応で生じる青色物
質も不安定であるため、正確に読みとれる時間が短く、
実用上判定の不安定要素となり、改善が望まれていた。

別の被酸化性呈色指示薬として通常用いられるグアヤク
脂は天然物であり、熱帯性別ユソウ木の芯材より採取さ
れるため、α−グアヤコン酸、及びβグアヤコン酸、グ
アイアレチン酸、グアヤク酸。

レゼン、ゴム質、精油など呈色に有効とみられる成分以
外に複数の不純物を含有し、かつ有効成分ならびに不純
物の組成は必ずしも一定していないことが知られており
、感度、呈色の均−性等に安定した性能が得難い。該グ
アヤク脂に関し数例の精製方法が提案されており、例え
ば、石油エーテル、エーテル、アルコールで順次溶媒抽
出して３種のフラクションに分離した時、エーテル抽出
フラクションにペルオキシダーゼと過酸化水素の存在下
で青色に呈色する成分が存在し、このフラクションを薄
層クロマ１〜グラフイーで分離することにより、３種の
主要成分が分析的に得られることが知られている（Ｈ，
＾ｕｔｅｒｈｏｆｆ　ｅｔ　ａｔ　　”＾ｒｃｈＰｈａ
ｒｌｚ、　”　２９９．ＰＰ６１８−６２６（１９６６
）及び３０２．　ＰＰ５４５−５５４（１９６９）　）
。この中の１種の成分は、薄層クロマトグラフィーでＲ
ｆ値０．４５（トルエン／ジオキサン／氷酢酸　９０　
：　２５　：　１０）を有し、中性珪酸ゲルとｎ−へブ
タン／酢酸エステル混合物を用いたカラムクロマトグラ
フィーで工業的に得られることが特公昭５８−８４００
号に記載されている。従来の技術内容を明らかにするた
めに以下に説明すると、該特許中にも説明されている如
く、この手法で得られるグアヤク脂成分はそれ自体単一
物質でなく、非呈色物質を含む混合組成物として得られ
る。従って、該特許においては、該グアヤク脂成分の組
成の不安定さから、定性的に潜血の有無を判断する程度
の単純な判定で済む便潜血検査レベルでの適用可能性を
示したものとみられる。グアヤク脂成分を半定量的な判
定を要求される体液中のブドウ糖ならびに潜血などの高
性能な検査薬として使用するためには、更に低濃度にお
いても発色する感度を持ち、低濃度から高濃度まで段階
的に発色濃度が変化する性能が要求される。即ち、便潜
面の場合と異なり、体液等の液状検体の場合には最低限
検査薬を含む試薬層が検体によって均一に濡れることか
必要であるが、前記特公昭５８−８４００号に記載の方
法ではグアヤク脂から濡れを妨害する物質の混在を排除
できず、試薬層への不均一な検体の付着や浸透に起因す
る呈色むらや到達甲色濃度の不安定性が致命的な欠点に
なっていた。

更にグアヤク脂中には、同様に呈色するが前記薄層クロ
マトグラフィーのＲｆ＠　０．４５と異なるＲｆ値を有
する成分群が存在している。それらの中には発色する濃
度域の異なる成分も含まれており、定量的に広い濃度域
で発色濃度を異ならしめるにはこれらの成分も含むこと
が必要ではあるが、上記公報に記載の方法では、例えば
、Ｒｆ値が０．２〜０．６までの広い範囲の成分を含む
ため不純物も多くなり、実質的に精製できず、少なくと
も工業的に有効にこの被酸化性呈色指示薬として有効な
成分群を回収する方法は無かった。

Ｋ発明が解決しようとする課題】 本発明は、上記のような従来の呈色指示薬の有する問題
点を解決し、体液中のブドウ糖、ならびに潜血等の検出
を目的とする診断薬の被酸化性呈色指示薬として好適な
呈色妨害物質の除去された実質的に有効な成分を含有す
る精製グアヤク脂ならびにその製造方法を提供すること
を目的とする。

１課題を解決するだめの手段】 本願発明は、天然グアヤク脂を逆相クロマトグラフィー
用ゲルを固定相に、極性溶媒を移動相に用いてクロマト
グラフィーにより分離して得られる精製グアヤク脂であ
り、該精製グアヤク脂を体液検査薬として濾紙に含浸ま
たは基材に塗布してペルオキシダーゼ及び過酸化水素の
存在下で呈色反応を行なわせる際に、実質的に検体を撥
水する等の呈色妨害物質や不安定な呈色を示す成分を含
まず、しかも広い濃度範囲で呈色する複数の呈色成分を
含む精製グアヤク脂に係るものである。

本発明に係る精製グアヤク脂は、天然グアヤク脂を逆相
クロマトグラフィー用ゲルを固定相とし、水：メタノー
ルの容量比１：９の溶媒より極性の高い溶媒を少なくと
も初期展開溶媒とし、撥水成分を含む非発色成分群と発
色不安定成分群を展開除去した後の親水性の発色成分群
を分取後溶媒除去して得られる。

天然グアヤク脂は上記の方法で分離していくと、大きく
４つの成分群に分離される。第１成分群は微量の発色成
分を含むが、実用に供ゼない程度のものであり、また撥
水性を示す成分を含有している。第１成分群が撥水性物
質を含むことは一見矛盾するようであるが、検査体の製
造上、その検査体中の極性担体に吸着するなどして疎水
基を表面にして配向するためと考えられる。

第２成分群は呈色成分は赤紫系であり、その上安定性に
乏しく、除去する必要のある成分である。

第３成分群は青色の深い発色を示す複数の有効成分があ
りそれ自身は親水性である。

第４成分群は様々な濃度域で発色する成分の混合よりな
り、比較的濃度は高くはないが感度の良い発色成分をも
含有しており親水性である。

本発明の精製グアヤク脂は、上記四成分群の第３．４成
分群から成るものである。本発明を具体例により詳細に
説明する。精製グアヤク脂の製造においては、先ず、天
然グアヤク脂をアセトンに溶解し、トルエンを添加する
ことによって精製した沈澱を除去し、濾液を蒸発乾固し
て残渣を極性溶媒に溶解することにより粗精製グアヤク
脂を得る。本発明に用いる逆相クロマトグラフィー用ゲ
ルの例としては、破砕状又は球状シリカゲルの表面シラ
ノール基とアルキル（またはアリール）クロロシランと
の反応で得られるアルキル化珪酸ゲル、化学結合型珪酸
ゲル、さらにポリマー系アルキル化硬質ゲル等を使用す
ることができる。具体的にはｃ、ｃ、ｃ、ｃ、ｃ　　等
のアルキル化珪酸ゲル、末端基が−ＮＨ２，−ＣＮ、フ
ェニル等の化学結合型珪酸ゲル、ポリマー系０１８等の
ポリマー系アルキル化硬質ゲルが挙げられる。これらの
種類により溶出時間に多少の差は認められるが、溶出成
分群としての溶出順位は大差なく、有効に分離し得る。

本発明に用いる極性溶媒としては、エタノール。

メタノール、エタノールアミン、エチレングリコール、
ホルムアミド、水、アセトニトリル、ジメチルスルホキ
シド、１．３−ジシアノプロパン、ジエチルエーテル、
塩化プロピル、■チルアセテート、プロピルアミン、臭
化エチル、　ＣＨＣｌ３．テトラヒドロフラン、メチル
アセテート、アセトン。

ＣＨ２Ｃｌ２．　Ｌ２−ジクロロエタン、オクタンスル
ホン酸ナトリウム、ジオキサン、ピリジン、ベンゾニト
リル、ニトロメタン、ニトロベンゼン等から適宜選択組
合せて使用することができる。

また、極性溶媒に非極性溶媒を５０％以下の割合で組合
せて使用する場合もある。更に、ｌ）Ｈを変化させるた
めに酢酸、トリフルオロ酢酸、オクタンスルホン酸ナト
リウム等を添加して用いる場合があるが、溶出後頁分離
する必要があるため、そのま）共存して用いる以外は添
加する機会は少ない。

本発明においては、上記のような固定相と移動相とを用
いて、先ず初期展開溶媒により呈色妨害成分である第１
及び第２の成分群を分離溶出し、ついで呈色に有効な親
水性の発色成分群を溶出する。妨害成分分離に使用する
初期展開溶媒としては、メタノールより極性のや）大き
いものが好ましく、具体的には、メタノールに水、オク
タンスルホン酸ナトリウム、酢酸、トリフルオロ酢酸等
を混合した混合溶媒が挙げられ、何れもメタノール：水
の容量比９：１の溶液の有する極性より大きい極性を有
することが望ましい。発色成分群である第３．第４の成
分群の回収に使用する展開溶媒は、初期展開溶媒と同様
の溶媒であって初期展間溶媒により、より保持時間の長
い成分として第３成分を分取することもできるが、初期
展開溶媒より、より極性の小さい溶媒を使用して第３．
第４の成分群をあわせて溶出させることができ、メタノ
ール単独又はエタノール等で溶出することも有効である
。

本発明によって得られる精製グアヤク脂は、体液中のブ
ドウ糖、並びに潜血等の検出を目的とする検査紙の呈色
指示薬として好適なものである。

また、このような目的に使用するグアヤク脂は、上記第
３．第４成分群のみならず、溶出されるフラクションよ
り保持時間が長い成分を含んでいても、上記目的達成の
障害とはならないことが判明した。

体液検査体は公知の種々の方法によって製造される。例
えば通例のブドウ糖検出組成物、即ち呈色指示薬、１ｌ
ｌｉ酸化酵素、ペルオキシダーゼ、ｐＨ緩衝剤、ポリビ
ニルピロリドン等の水溶性結合剤に必要に応じ湿潤剤、
感度調節剤、安定剤等を添加して得たものを、水または
水−アルコール系の溶液とし、濾紙に含浸乾燥して得ら
れる検査紙に本発明の精製グアヤク脂を適用すると、感
度が高くなり、また発色の均一性も改良される等の効果
が得られる。

また、最近発明された非水溶剤系のブドウ糖検出インキ
組成物、即ち、呈色指示薬、ブドウ糖酸化酵素、ペルオ
キシダーゼ、ｐ１１緩衝剤、結合剤及び吸水性粉末等を
非水溶剤中に溶解或いは分散してなる組成物を調製し必
要に応じ湿潤剤、感度調節剤、安定剤等を加えて基月下
に塗布乾燥することによって得られるブドウ糖検出用検
査体では、前記の濾紙への含浸型検査紙よりも感度、安
定性の良いものが１埋られる。但し、呈色指示薬である
グアヤク脂中に前記第１成分群の混入があると、撥水性
が現われ易く不均一になることがある。この原因は検査
体の製造において非水溶媒の揮発乾燥時に、表面層に第
１成分群が偏在して撥水性を持つためと推定される。第
３．第４成分群よりなる本発明の！Ｆ［グアＡ７り脂を
用いると、グアヤク脂本来の高感度、呈色安定性の良さ
の特長がより強調され、特にこの非水溶剤系の体液検査
体に有効である。

ブドウ糖検査紙において、体液中のブドウ糖は、グルコ
ースオキシダーゼ等のブドウ糖酸化酵素の作用により、
空気中の酸素と反応して最終的にグルコン酸と過酸化水
素に酸化される。生成した過酸化水素は、ペルオキシダ
ーゼの作用により発生期の酸素を産生じ、この酸素は直
ちにグアヤク脂と反応して該指示薬を発色させる。この
発色の程度により体液中のブドウ糖の有無並びにその量
が半定量的に決定される。従って、体液が検査体上を均
一に濡らし、低？１度域から高濃度域までの広い範囲に
わたって発色の濃度が判別でき、かつ発色後も安定的に
色調を保持していることが必要である。この特性の上で
本発明の精製グアヤク脂は特に優れた感度、呈色濃度域
９発色安定性を有するものである。また、本発明の精製
グアヤク脂は、上記の用途ばかりでなく過酸化水素及び
活性な酸素を生成する物質の検出に有効であり、グルコ
ースに対するグルコースオキシダーゼ、尿素窒素に対す
るウレアーゼ、コレステロールに対するコレステロール
オキシダーゼ、潜血に対し凝ペルオキシダーゼ活性を有
するヘモグロビン等の共存下での反応検出、半定量等検
査薬分野に広く用い得る。

Ｋ実　施　例］ 以下に本発明を実施例によって説明するが、本発明はこ
れら実施例の記載に限定されるものではない。

実施例１゜ 精製グアヤク脂の分離（１） 天然グアヤク脂１００ｇをアセトン１５０蛇に溶解し、
攪拌下にトルエン１．５父を滴加し、沈澱物質（約２０
９）を吸引濾過した。濾液を真空中で濃縮乾燥し、これ
を前処理として約７０ｇの乾固物を得る。この乾固物の
一部をメタノール／Ｈ２０（６５：３５）混合液で０．
５ｇ／ｕの溶液とする。この溶液を予めメタノール／　
Ｈ２Ｏ（６５：３５）混合液で平衡化した直径４．６ｍ
ｍ、高さ１５　Ｃｍのオフタテシルシラン処理珪酸ゲル
（０１８）カラムに４０°Ｃにおいて１回２０μ文注入
し、メタノール／　＋１２０ｆ６５：３５）混合液を０
．５ｒＲｆ！／ｎｉｎの流量で送液し、第１成分群と第
２成分群の溶出を確認した後、保持時間１６分から後の
第３成分からなるフラクションを分取し、更に３２分後
からは溶出を促進させるため、移動相をメタノールに切
換えて第４成分群を６０分まで溶出１分取した。検出器
にはＵＶ　２８０ｎｍを使用する。

第１図は、この条件におけるカラムクロマトグラフィー
で分離された粗製グアヤク脂の溶出パターンである。縦
軸にＵＶ　２８Ｏｎｌ′Ｉｌの吸収、横軸に保持時間を
取った。第１図に第１成分群、第２成分群。

第３成分群、第４成分群の区分りを記載した。第３成分
群溶出後に移動相をメタノールに切換えて溶出し第４成
分群を得た。

精製グアヤク脂の製造（１） 精製グアＡ７り脂の分離（１）と同様に天然グアヤク脂
の前処理を行い、約７０３の乾固物にメタノール／　Ｈ
２０ｆ６：４）混合液を２．０℃加え溶解する。

この溶液を予めメタノール／　Ｈ２Ｏ（６：４）混合液
で平衡化した直径５ｃｍ、高さ５０ｃｍのオフタテシル
シラン処理珪酸ゲル（Ｃ１８）カラムに室温において８
０ｄ注入し、メタノール／　Ｈ２Ｏ（６：４）混合液を
１００ｍｆｌ／…１ｎの流量て送液した。第１成分群、
第２成分群の溶出した１８０分以後のフラクションを、
メタノールを送液しまとめて溶出して検出器Ｕｖ２８０
ｎ１１１の吸収が無くなるまで分取した。第２図にこの
溶出パターンを示す。得られた精製グアヤク脂を、Ｖ４
製クアヤク脂の分離　（１）と同様のクロマ１〜グラフ
イ一条件で展開したところ、第１成分群。

第２成分群は検出されず、第３成分群、第４成分群から
成ることが確認できた。回収量は約ｏ、ｅｇであった。

精製グアヤク脂の製造（２） 精製グアヤク脂の製造（１）と同様に天然グアヤク脂の
前処理を行い、約７０ｇの乾固物にメタノール／　Ｈ２
Ｏ（１１：９）混合液を２．Ｏｌを加え溶解する。

この溶液を予め分収用高速液体クロマトグラフに設置し
、メタノール／　１１２０ｍ：９）混合液で平衡化した
直径５ｃｍ、高さ５０　Ｃｍのブチル化学結合型珪酸ク
ル（Ｃ４）カラムに１回１００ｍ１！注入し、室温にＪ
５　イー（メタ／−ル／　Ｈ２Ｏ（１１，９）混合液ヲ
１００ｄ／ｌｌ１１ｎの流量で送液し不純物を分離、溶
出、ついでエタノールでカラム内に保持されている成分
を溶出させる。検出器にはＵＶ　２８０ｎｍを使用する
。メタノールで溶出させたフラクションをエバポレータ
により乾固することにより精製グアヤク脂（２）約０．
５ｇを得る。

精製グアヤク脂の製造（３） 精製グアヤク脂の製造（１）と同様に天然グアヤク脂の
前処理を行い、約７０ｇの乾固物にメタノール／　Ｈ２
Ｏ（６：４）混合液２．０℃を加え溶解する。この溶液
を予めメタノール／　１．２ｎ＋Ｈオクタンスルホン酸
ナトリウム水溶液（６：４）で平衡化した直径５ｃｍ　
、高さ５０　ｃｍのオクタデシルシ゛ラン処理珪酸ゲル
（０１８）カラムにおいて１回１００ｄ注入し、メタノ
ール／　１．２ｎ＋Ｈオクタンスルホン酸ナトリウム水
溶液（６：４）混合液を１００威／ｒｎｌ団の流量で送
液し不純物を分離溶出し、ついでメタノールでカラム内
に保持されている成分を溶出さ氾る。検出器にはＵＶ　
２８Ｏｒ＋ｍを使用する。メタノールで溶出さゼたフラ
クションをエバポレータにより乾固することにより精製
グアヤク脂（３）約０．５ｇを得る。

精製グアヤク脂のＶ造（４） 精製グアヤク脂の分離（１）同様に天然グアヤク脂の前
処理を行い、約７０７の乾固物にメタノール／　Ｈ２Ｏ
（６：４）混合液を２．Ｏｌ加え溶解する。この溶液を
予め分収用高速液体クロマトグラフに設置し、メタノー
ル／　Ｉｆ２０（６：４）混合液で平衡化した直径５Ｃ
ｍ、高さ５０　ｃｍのブチル化学結合型珪酸クル（Ｃ１
８）カラムに１回１００威注入し、室温においてメタノ
ール／　Ｈ２Ｏ（６：４）混合液を１００威／旧ｎの流
量で送液し不純物を分離、溶出、ついでアセトニトリル
／　Ｈ２Ｏ（６：４）でカラム内に保持されている成分
を溶出させる。検出器にはＵＶ　２８０ｎｆｆｌを使用
する。アセトニトリル／　Ｈ２Ｏ（６：４）で溶出させ
たフラクションをエバポレータにより乾固することによ
り精製グアヤク脂　（４）約０．５ｇを得る。

精製グアＡ７り脂の確認 上記の精製グアヤク脂の製造（１）の方法によって分取
された第１成分、第２成分及び第３．第４成分について
次のような試験を行った。各成分を含む物質群をそれぞ
れを珪酸ゲル調製板（１２５４）上にトルエン／ジオキ
サン／氷酢酸（９０／２５／１０）混合液で展開させ、
ペルオキシダーゼ−１１２０２水溶液を噴霧したところ
、粗製グアヤク脂中にみられた複数の呈色バンドのうち
、赤紫色の呈色を示し、呈色後、短時間で消色する物質
群ｔよ第２ＪｌｉＡ分群中に、青色の呈色を示し、呈色
後の安定性の良好な物質群は第３成分中に、また若干発
色濃度は低いが様々な濃度域で発色する物質群は第４成
分中に存在することが確認された。第１成分群中には呈
色物質は微量しか確認されなかった。また、第３．第４
成分群中においては、ｕＶ先光下観察されたバンドと呈
色のバンドが殆ど一致していた。

１０％■２０２水溶液２ｍｌ！、エタノール４ｄ、西洋
わさびペルオキシダーゼ５ｏｍｇを蒸溜水で９．９ｄに
調製し、得られた本発明による精製グアヤク脂（１）２
ｍｇをエタノール２０威に溶解した溶液０．１戒を加え
る。速やかに混合した溶液を３０秒後に１ｃｍのキュ八
ツｌ−中６０ＯｎＩｎで透過率を測定したところ、比吸
光係数Ｆ１％３００を得た。

ｃｆｆＬ 参考例１゜ 順相精製グアヤク脂の製造 天然グアヤク脂１００をアセ１〜ン１５０ｄに溶解し、
攪拌下に１−ルエン１．５℃を滴加し、沈澱物質（約２
０９）を吸引濾過しｌζ。１ｌｆｉ液を真空中で濃縮乾
燥し、これを前処理として約７０ｇの乾固物を得る。

この乾固物にｎ−へブタン／酢酸エステル（２：５）混
合液５００ｄを加温下に加え溶解する。この溶液１ｏｏ
ｙを予めｎ−ヘプタン／酢酸エステル（２：５）混合液
で平衡化した珪酸ゲルカラム（直径８Ｃｍ。

高さ７０ｃｍ）に添加し、ｎ−へブタン／酢酸エステル
（２：５）混合液で分離、溶出した。−回１ｏｏｙづ゛
つ分取し、各フラクションについて薄層クロマトグラフ
ィーで検査後、所望するフラクションを集め、１００　
ｍｌに濃縮した。この溶液をｎ−ヘキサン２℃に加え再
結晶させることにより、精製グアヤク脂約３．５ｇを得
た。

順相精製グアヤク脂の確認 得られた精製グアヤク脂を珪酸ゲル調製板上にトルエン
／ジオキサン／氷酢酸（９０／　２５／　１０　）混合
液で展開させ、ベルオキシターゼーＨ２０２水液を噴霧
することにより、青色に呈色さぜたところ、Ｒｆ値０．
４５を得た。

順相精製グアヤク脂中の第１成分の分離順相精製グアヤ
ク脂３ｇにメタノール／Ｈ２０（６：４）混合液１００
ｄを加え溶解する。この溶液を予め分取用高速液体クロ
マ１−グラフに設置し、メタノール／　Ｈ２Ｏ（６：４
）混合液で平衡化した直径５ｃｍ　、高さ５０ａｎのオ
クタデシルシラン処理珪酸ゲル（０１８）カラムに室温
において注入し、メタノール／　Ｈ２Ｏ（６：４）混合
液を１００７／ｌｌ１ｉｎの流量で送液し不純物を分離
溶出し、ついでメタノールでカラム内に保持されている
成分を溶出させる。検出器にはＵＶ　２８ＯｎＩｎを使
用する。

メタノール／　Ｈ２Ｏ（６：４）混合液で溶出させた保
持時間の短いフラクション（０〜８０分）をエバポレー
タで乾固することにより順相＠製グアヤク脂中の第１成
分群約１．０ｇを得た。また、順相）ｌＷ製グアヤク脂
を本発明の精製方法で分離した時、第２成分群（保持時
間８０〜１６０分）はメタノールで溶出させた精製グア
ヤク脂より除去されていることを確ル２した。

実施例２゜ ブドウ糖検出用検査体の製造ならひに 性能評価（１） 実施例１で得られた逆相＠製グアヤク脂および参考例１
で得られた順相精製グアヤク脂、順相精製グアヤク脂中
の第１成分群のみを下記の容量でインキに混入し、ブド
ウ糖検出用検査体を作成した。尚、実施例１のうち精製
グアヤク脂の製造（１）〜（３）において得られた本発
明品は何れも性能には差が認められないので以下におい
ては単に逆相精製グアヤク脂と記載する。

以　　下　　余　　白 表 表１のようなグアヤク脂を用い、下記組成のブドウ糖検
出用インキ組成物をホモミキザーで微細分散させた後、
スクリーン印刷により、厚さ３００μの白色ポリスヂレ
ンシートに一辺が５１１１１ｎの四角形となるように印
刷した。用いたスクリーン版は８０メツシユレジスｉ・
及びスクリーン紗の厚さの合泪は１３０μであった。

ブドウ糖検出用インキ組成物 ブドウ糖酸化酵素 （東洋紡製：　Ｇｒａｄｅ　ＩＩ　）　　　　　　　　
３．６１ｆｉｉ部ペルオキシダーゼ （東洋紡製：　Ｇｒａｄｅ　ｍ　）　　　　　　　　２
．４重量部グアヤク脂　　　　　　　　　　　　所定重
量部（表１に記載） ソルビクンモノラウレ−１〜 （花王石鹸製ニスパン２０　）　　　　　　　７．２重
量部１−−アスコルビルステアレート　　　０．４８重
量部クエン酸　　　　　　　　　　　　　　２．８重量
部クエン酸す［〜リウム　　　　　　　　１１０重量部
ポリヒ゛ニルピロリドン　（ＢＡＳＦ製：コリドン９０
）１２６重Φ部　ポリビニルブチラール （積水化学製：エスレツク８Ｘ−１）　　　２．２５重
ｉ部セルロース微粉末 （脂化成製；アビセルＴＧ−Ｄ）　　　　　　１７１重
量部ｒ１−アミルアルコール　　　　　　　２２８重屯
部プチルセロソルツアセデート　　　　３３．５重Φ部
得られた印刷物を６０°Ｃで４０分間乾燥後、スティッ
ク状に裁断して一ノドウ糖検出用検査体を得た。

性能試験（１） 本発明品と対照例Ａ、Ｂ、Ｃ，［）のブドウ糖検出用検
査体について、正常尿及び正常尿にβ−Ｄグルコースを
２５ｍ９／ｄ１．５０ｍｇ／（Ｊｌ、　　１００ｍ９／
旧。

２５０ｍｇ／ｄｌ及び５００ｍｇ／ｄｌの濃度になるよ
うに溶解したものを検体として用い、スティックを浸漬
後直ちに取出して、甲信に要する時間と検査部の色調を
観察したところ、表２のような結果が得られた。

表　２ 以　　下　　余　　白 （光色淵度十〜　／′Ｒ５色までの時間）表中の色調の
記号は任意の色調表と標準光源下で比色し決定した。本
発明の精製グアヤク脂は、Ｋｆｌ製クアりク脂や既知の
精製クアＡ７り脂に比べ、感度、呈色速度ともに良好で
あり、本発明の精製方法によって除くことが可能になっ
た第１成分群は実質的に検査体の感度を低下さぜること
か？ｌＩ、！察された。

得られた検査体をガラス容器中に畜卦１し、４０°Ｃで
１２ケ月保存した後、上記と同様にして試験を行ったと
ころ、本発明品と対照例１３．ｃ、ｌ）は保存前と同様
に均一、鮮明、且つ安定であり、検体中のブドウ糖濃度
も保存前と同様に判別可１１Ｌであった。しかし、対照
例Ａについては、同様の試験で保存前と比較して検査試
薬部の呈色は不拘−且つ不鮮明となり、検体中のブドウ
糖濃度の判別も困難であった。このことから第２成分群
か不安定成分であると認められた。

性能試験（２） 本発明品と対照例Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄのブドウ糖検出用検査
体について、β−Ｄ−クルコースを５００ｍｇ／　ｄ　
ｌの濃度になるように溶解した水溶液を用い、スティッ
クを浸漬後、直らにＩＩ′ｙ、出して　１分間放置後、
検査部の１０％以上におよぶ色ムラの発生を検査した。

ステック　１００本について色ムラの発生率を測定し７
ｊところ表３のような結果か１ｑられた。

表　　３ このことから第１成分群の除去と♀色成分の有効な分取
て均一性に優れた特性を゛持つことが判明した。

実施例３゜ ブドウ糖検出用検査体の製造４ｆらひに性能評価　（２
） 実施例１て得られた逆４１１粕製クアＡ／り脂を含む繍
紙含浸タイゾの検査体以下の／ノ法でｆ１成した。

濾紙（東洋濾紙Ｎｏ、　５２６）を次の組成の溶液て含
浸し、ついで６０℃で乾燥さゼる。

ブドウ糖酸化酵素 （東洋紡製：　Ｇｒａｄｅ　’ｆｌ　）ペルオキシダー
ゼ （東洋紡製：　Ｇｒａｄｅ　ｍ　） 逆相精製グアヤク脂 ソルビタンモノラウレート （花王Ｇ＠製ニスパン２０） １−アスコルビルステアレート クエン酸 り−１−ン酸すＩ〜ツリウ ムリビニルピロリドン （ＢＡＳＦ製：コリドン９０）　　　　　　　１．２６
小量部エタノール　　　　　　　　　　　　３０．０小
量部水　　　　　　　　　　　　　　　　　　７０，０
重量部これを−’Ｉ）５ｍｍの四角形に裁断し、３００
μの白色ポリスチレンシート上に両面接着テープで接着
後、スディック状に裁断してブドウ糖検出用検査体をｆ
ｑ５また。正常尿及び正常尿にβ−１）−クルコースを
５０ｍｇ／ｄｌ、　　１１００１Ｎ／旧、　　２５０ｍ
ｇ／ｄｌ、　　５００ｍｙ／旧。

及び２．０００ｍｇ／　ｄ　ｌの濃度になるｊ、うに液
解したも重量部 重量部 重量部 重量部 ０．７２重量部 ０．４８車吊部 ０．９６重量部 １．４４ ０．１０ ０．５６ ２．２０ のを検体として用い、スティックを浸漬後直ちに取出し
て１分間静置し、検査試薬部の色調を観察した。検査試
薬部の呈色は均−且つ鮮明であり、呈色温度は検体中の
ブドウ糖の濃度の増加に伴って段階的に高くなり、上記
の範囲内で検体中のブドウ糖濃度を明確に判別可能であ
った。呈色した検査体を至温で３分間静置しても色調の
変化は認められなかった。

次に上記組成中の逆相＠製グアヤク脂を以下の様に変更
したところ、検査部の色調および呈色に要する時間は次
のようになった。

以　　下　　余　　白 本発明品と対照例Ｆ、Ｇ間には感度の違いはみられなか
ったが、第１成分群が過剰に混入している対照Ｈにおい
ては感度の低下が観察されｌＣ０しかし本発明品は、対
照例Ｆ、Ｇより発色までの時間が知く、実質的な感度は
高いことがわかった。得られた検査体をガラス容器中に
密封し、４０″Ｃで６ケ月保存した後、上記と同様にし
て試験を行ったところ、本発明品、対照例Ｅ、Ｆ、Ｇ、
Ｈともに保存前と比較して検査試薬部の９色は不拘−月
つ不鮮明となり、検体中のフドウＶ３濃度の判別も困九
であった。

実施例３゜ 潜血軸検出用検査体の製造 下記の潜血検出用組成物のうち、クメンヒドロペルオキ
シド、及び増感剤である６−メ１ヘキシキノリンをアラ
ビアゴムを用いてマイクロカプセル化し、他の成分を加
えて潜血検出用組成物を調製した。次いで、該潜血検出
用組成物をホモミキサーで微細分散さゼ、スクリーン印
刷法により厚み３００μの白色ポリスチレンシー１〜上
に一辺が５ｍｍの正方形の検査試薬部を印刷し、印刷後
６０°Ｃの温度で４０分間乾燥した。印刷に使用した版
の線数は８０メツシユ、レジス１〜おＪ：ひスクリーン
紗の厚みの合削は１３０μｍであった。乾燥後、所定の
寸法のスティック状に裁断して検査用試験片を得た。

潜血検出用組成物 クメンヒドロペルオキシド ６−メトキシキノリン ３．６重量部 １．０重量部 く以上カプセル内） アラビアコム　　　　　　　　　　　　９．４小量部精
製グアヤク脂〔実施例１−（１）　）　　　１．５重量
部クエン酸　　　　　　　　　　　　０．５６重置部ク
エン酸すトリウム　　　　　　　　　２．２重一部ラウ
リル硫酸トリエタノールアミン１．６２重量部ポリエチ
レンクリコール　　　　　　２．５２重帝都ポリビニル
ツチラール　　　　　　　　３．６重量部（積水化学製
：エスレックＢＸ−１） ゼルロース微粉末　　　　　　　　　２２４重量部（脂
化成製：アビセルＴＧ−Ｄ　） ｎ−アミルアルコール３９，７重量部 ブチルセロソルブアセデート　　　　１３．０重量部被
検査液として、 ■正常尿 Ｃ０，０６ｍＦ！　／　ｄ　ｌのヒトヘモクロビン（シ
グマ社製）含有尿 ■０．１５１１１！？／旧のと１へへモクロビン（シグ
マ社製）含有尿 ■０．７５ｍｇ／旧のヒトヘモクロビン（シグマ社製）
含有ｊボ のく種類を準備し、上記で留られた検査用試験片を■〜
■の被検査液中に浸漬し、浸漬後直ちに取出して１分間
静置した後の検査試薬部の呈色を観察した。

検査試薬部の呈色は均一かつ鮮明であり、呈色濃度は被
検査液中のヒトヘモクロビン濃度の通船に伴って段階的
に高くなり、上記の範囲内で被検査液中の潜血の温度を
明確に判別可能であった。

呈色した検査用試験ハを室温で゛５分間静置しても色調
の変化（よ認められなかった。

また、得られた検査用試験片をガラス容器中に密封し、
４０℃で１２ケ月保存した後に、上記と同様にして試験
を行ったところ、検査試薬部の呈色は保存前と同様に均
一、ｊ！￥明、かつ安定であり、被検査液中のヒ１へへ
モクロビン淵度を保存前と同様に明確に判別することが
可能であった。

実施例４゜ 尿素窒素検出用検査体の製造 血清中の尿素窒素を検出するために、実施例２における
ブドウ糖検出用インキ組成物に変えτ以下の尿素窒素検
出用インキ組成物を用いる以外は、実施例２と同様にし
て検査体を製造した。

尿素窒素検出用インキ組成物 ウレアーゼ （東洋紡￥！Ｊ　：　Ｇｒａｄｅ　ＩＩ　）　　　　　
　　　３．６小母部ペルオギシターＵ （東洋防禦：　Ｇｒａｄｅ　ｍ　）　　　　　　　　２
．４小母部精製グアヤク脂〔実施例１−（１））　　　
４．８重量部ソルビタンモノラウレート （花王石鹸製ニスパン２０）　　　　　　　７．２小石
部クエン酸　　　　　　　　　　　　　　　２，０重量
部クエン酸す１ヘリウム　　　　　　　　１１．０単歯
部ポリビニルピロリドン （ＢＡＳＦ製：コリドン９０）　　　　　　　　１２．
６重量部ポリビニルブヂラール （積水化学製二二［スレツクＢＸ−１）　　　２．２５
重ω部セルロース微粉末 （脂化成製：アビゼルＴＧ−Ｄ）　　　　　　１７１重
吊重巾−アミルアルコール　　　　　　　　２２８重量
部ブヂブチルセロソルブアセテ〜　　　　３３．５＠量
部得られた検査体をヒ１〜血液を遠心分離して得た血清
中に浸漬し、浸漬後直らに取出して約１分間放置しても
のを観察すると、試薬層は青色に呈色しており、標準比
０表と比較したところ、約１ｏｍｇ７旧の尿素窒素を含
有することが判明した。

実施例５゜ 総コレステロール検出用検査体の製造 血清中の総＝ルステロールを検出するために、実施例２
にａ月プるブドウ糖検出用インキ組成物に変えて以下の
総コレステロール検出用インキ組成物を用いる以外は、
実施例２と同様にして検査体を製造した。

総コレステロール検出用インキ組成物 コレステロールエステラーゼ （東洋防禦：　Ｇｒａｄｅ　［１）　　　　　　　　１
．６小母部コレステロールオキシターピ （東洋防禦：　Ｇｒａｄｅ　ＩＩＩ　）　　　　　　　
　１．６ΦΦ部ベルオキシターゼ （東洋防禦：　Ｇｒａｄｅ　ＩＩＩ　）　　　　　　　
　２．４重量部精製グアヤク脂（実施例１−（１））　
　　４．８重量部ソルビタンモノラウレート （花王製ニスパン２０　＞　　　　　　　　　７．２重
量部リン酸−ナトリウム　　　　　　　　　６，０＠量
部リン酸二ナトリウム　　　　　　　　　９．０重量部
ポリビニルピロリドン （ＢＡＳＦ製：コリドン９０）　　　　　　　　１２．
６小母部ポリビニルブチラール （槓水化学製：エスレックＢＸ−１）　　　２．２５重
量部セルロース微粉末 （脂化成製：アビセルＴＧ−Ｄ）　　　　　　１７１重
但重吊）−アミルアルコール　　　　　　　２２８小吊
部ブチルセロソルブアセテー１−　　　　３３．５重量
部得られた検査体を任意のヒ１へ白液を遠心分離して得
たＭ酒中に浸漬し、浸漬後直ちに取出して、約２分間放
置したものを観察すると、試薬層は青色に呈色しており
、標準比０表と比較したところ、約２００ｍｇ／ｄｌの
総コレステロールを含有することが判明した。

Ｋ発明の効果】 本発明によれば、逆相クロマトグラフィー用ゲルを充填
したカラムを通すことによって、まず天然グアヤク脂に
含まれる光色を妨害する不純物を分離溶出し、体液中の
ブドウ糖ならひに潜血等の検出を目的とする検査体の呈
色に有効な成分群を分離溶出覆ることによって、広い濃
度範囲で発色する成分て構成される精製グアＡ７り脂が
得られる。

また、木５を明において（よ、分離能が極めて良好であ
り、）Ｊラムの再利用が可能であるので経済的である。

実施例の記載のようにＹ色指示薬として本発明の製造方
法で得られる精製グアＡ７り脂を用いた体液中のブドウ
糖ならひに潜血等の検出を目的とする検査体では、実質
的に発色を妨害する不純物を含有しないために診断時の
９色が鮮明であり、しかも複数の発色成分で構成される
ため、高感度でかつ高温度まで段階的に発色し、かつ検
査体の保存安定性が良好である。特にノ１水溶媒系組成
物を基材に塗布してなる検査体において、９色が均一で
高感度のものが得られる。

【図面の簡単な説明】

第１図はツノラムクロマトクラフィーで分離された粗製
クアＡ７り脂の溶出パターンを示す図、第２図は自動分
取型クロマトグラフを用いて溶出した場合の粗製グアヤ
ク脂の溶出パターンを示す図である。 特許出願人　　大日本印刷株式会社 代理人　弁理士　　　　人　野　克躬 代理人　弁理士　　　　人　野　令　子手 続 補 正 竜（自 発）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、天然グアヤク脂から逆相クロマトグラフィー用ゲル
   を固定相とし、水：メタノールの容量比１：９の溶媒よ
   り極性の高い溶媒により、初期に溶出する非発色成分群
   と発色不安定成分群を展開除去後に分取される、親水性
   発色成分群を含む精製グアヤク脂。 ２、特許請求の範囲第１項に記載の精製グアヤク脂より
   なる呈色指示薬を含む検査試薬層を基材上に設けてなる
   体液検査体。 ３、検査試薬層が、該呈色指示薬、ブドウ糖酸化酵素、
   ペルオキシダーゼ、ｐＨ緩衝剤、結合剤及び吸水性粉末
   等を非水溶剤中に溶解或いは分散してなるブドウ糖検出
   用検査試薬層である特許請求の範囲第２項に記載の体液
   検査体。 ４、天然グアヤク脂を前処理して得た粗精製グアヤク脂
   を、逆相クロマトグラフィー用ゲルを固定相とし、水：
   メタノールの容量比１：９の溶媒より極性の高い溶媒を
   初期展開溶媒とし、初期に溶出する非発色成分群と発色
   不安定成分群とを展開除去した後、該初期展開溶媒より
   極性の低い溶媒により、親水性の発色成分群を分取し、
   該親水性の発色成分群を含む溶液から溶媒を除去するこ
   とを特徴とする精製グアヤク脂の製造法。