JP2001502889A - エンテロトキシンを産生するブドウ球菌を検するための物品および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 加水分解されていないヌクレオチド、トルイジンブルーＯ、およびバインダーを含む、耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌を検出するための物品であって、ここで、前記物品は、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体に対して配置するのに適合する。該物品を利用して、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出する方法、および耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための、該物品を含有するキットについても記載している。

Description

【発明の詳細な説明】 エンテロトキシンを産生するブドウ球菌を検するための物品および方法発明の分野 本発明は、検体における耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシン を産生し得るブドウ球菌（Staphylococcus aureusを含む）の検出、および加水 分解されていないヌクレオチド、トルイジンブルーＯ、およびバインダーを含有 するそのような検出のための物品に関する。発明の背景 潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の検出は食品加工の重要な 局面であり、加工中および加工後の混入を示唆するためのスクリーニング手段と して使用され得る。潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌に対する 食物検体の評価は、食物中の可能な病原体種の存在を直接示唆するのに役立つこ とができる。公知のエンテロトキシン産生種であるStaphylococcus aureus（S.a ureus ）の検出は、食品加工において特に重要である。Staphylococcusのエンテ ロトキシンを潜在的に産生し得る他の種も知られており、これらの種による混入 について検体を試験することは重要であり得る。さらに、病原性ブドウ球菌感染 症を示唆する患者検体を試験することも臨床的環境において重要である。 S.aureusを検出するための現在の方法は、検体の分画部分におけるS.aureusの 推定される存在を測定するためのBaird-Parker卵黄−亜テルル酸塩−ピルビン酸 塩寒天培地（BPAと省略される）を使用する。本方法では、BPAプレートは48時間 のインキュベーション後の「代表的な」コロニーの存在について試験される。次 いでコロニーの検体を24時間までのさらなるインキュベーションのための脳−心 臓輸液に移す。ブロス培養物をさらなる６時間のインキュベーションのためにウ サギ血漿と混合する。次いで、培養物−血漿混合物を血漿の凝集(すなわち、凝 塊)の存在について評価する。凝塊を生じる培養物を「コアグラーゼ陽性」とす る。コアグラーゼ陽性の結果に従ってBPAから陽性が推定されれば、 検体においてS.aureusの存在が確認されたとみなす。 S ．aureusの存在に関連するコアグラーゼ活性の使用はまた、エンテロトキシ ン産生を含む病原性の可能性と相関すると考えられている。しかし、コアグラー ゼ試験は本質的に面倒で時間がかかるため、大量の検体を日常的に試験するには 実用的ではない。 現在、S ．aureusの存在については食品加工および臨床的環境の両方において 確認される。例えば、臨床的環境では、検体は「CNS」(コアグラーゼ陰性staph. )または「CPS」(コアグラーゼ陽性staph.)として報告される。 コアグラーゼ試験に対する２つの代替的方法は、S.aureusのコアグラーゼ反応 に対する良好な統計的関係：ヒアルロニダーゼおよび耐熱性ヌクレアーゼ（TNas e）を示している。しかし、ヒアルロニダーゼ系は複雑で費用が高い。TNase活性 のための試験も、Lachicaら、Applied microbiology21(4)、585〜87頁（1971） が異染性染料のトルイジンブルーＯ（加水分解されたおよび加水分解されていな いDNAの存在下における示差染色によってTnaseを検出するための染料）の使用に ついて記載するまでは面倒であった。 TNaseの検出方法については記載されており、（１）TBO/DNA寒天を充填したペ トリ皿においてウェルを形成し、煮沸した培養物をウェル内においてTNaseの存 在を決定すること、（２）顕微鏡用スライド（または等価物）の表面上に成型さ れたTBO/DNA寒天培地内にウェルを形成し、（１）の手順に従うこと、（３）発 達したBPAを60℃で少なくとも２時間プレインキュベートした後、Baird-Parker 寒天（または等価物）に溶融したTBO/DNA寒天を重層することを含む方法におい て使用される。(１)、(２)、および（３）は、TNaseについて陽性であるコロニ ーまたは懸濁物から２〜４時間内に読み取り可能な結果を生じる。これらの方法 を用いて、様々な研究者がTNase試験とS ．aureusに対するコアグラーゼ試験との 100％までの相関を明らかにしている。 TNase活性は、潜在的にエンテロトキシンを産生し得る他のStaphylococcus種 においても検出されており、それは、コアグラーゼ陰性のもの（例えば、Staphy lococcus hyicus ）も含む。従って、TNaseはコアグラーゼ試験よりも良好なエン テロトキシン原性の指示物であると思われる。すなわち、エンテロトキ シンを産生する微生物の大部分はTNase陽性であるが、エンテロトキシンを産生 する微生物のすべてが必ずしもコアグラーゼ陽性であるわけではない。 TNase試験の現在の方法は信頼することができるが、結果を得るためにはウェ ルを形成させるかまたは溶融寒天を調製する必要があることから、多数の検体を 試験またはスクリーニングする際のそれらの有用性はかなり制限される。これら の方法は時間がかかり、多数の検体を試験する場合には非効率的な技術である。 従って、食品加工または臨床アプリケーションにおいて、多数の検体のための効 率的かつ信頼できる試験またはスクリーニングを可能にする、潜在的にエンテロ トキシンを産生し得るブドウ球菌のためのTNase試験を開発することが所望され る。発明の概要 １つの局面において、本発明の特徴は、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜 在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の存在を検出または確認するた めの物品にある。物品は、加水分解されてないヌクレオチド、トルイジンブルー Ｏおよびバインダーを含有する。物品は、少なくとも２つの面を有し、S.aureus などのエンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体に対して配置する のに適合する。 好ましい実施態様において、バインダーはグアガム（guar gum）である。物品 は、さらに、コントラスト増強剤としてλ−カラゲナン（carrageenan）を含み 得る。物品は、任意の厚さまたは形状であり得る。例えば、物品は、ディスク状 の形状であり得、そのようなものとして、プレートまたはウェル内、あるいはPe trifilm^TMなどの薄フィルム培養プレートシステム上に配置するのに適合し得る 。好ましくは、物品は、約0.12〜0.25mmの厚さを有する。 物品は、好ましくは、物品の１つの面に接する、ポリエステルフィルムなどの 固体支持体を含有する。物品は、さらに、保護材を含み得る。保護材は、物品の 暴露面に接し得る。物品が、一方の面に接する固体支持体を含む場合、保護材は 対向面に接し得る。 本発明の物品は、物品中の加水分解されていないヌクレオチドの耐熱性ヌク レアーゼ（TNase）介在性の加水分解が、特定のｐＨで生じるように選択された 試薬を含有し得る。好ましくは、物品は、ヌクレオチドの加水分解が約9.0のｐ Ｈで生じるように選択された試薬を含有する。あるいは、物品は、好ましくは、 ヌクレオチドの加水分解が約7.3のｐＨで生じるように試薬を含有し得る。 もう１つの局面において、本発明は、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ 球菌の検出方法を特徴とする。方法は、（１）耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球 菌を検出するための上記の物品を、潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブド ウ球菌の含有が疑われる検体に貼付する工程、および（２）検体中の耐熱性ヌク レアーゼ陽性ブドウ球菌の有無を確認する工程を含む。該有無は、物品における 青色から赤色またはピンク色への色の変化の有無を検出することにより確認され る。 好ましい実施態様において、検体は食物検体である。他の好ましい実施態様に おいて、検体は、患者由来の検体である。 試験検体が貼付される培養培地は、例えば、Baird-Parker Agarなどの寒天を 基材とする培地、あるいはより好ましくは、ブドウ球菌を増殖させるために適合 した薄フィルム培養プレート装置であり得る。 培養培地で試験検体を培養する工程は、好ましくは、検体を約37℃で約18〜48 時間インキュベートする工程を含む。検体の加熱工程は、好ましくは、検体を少 なくとも約60℃で、少なくとも約30分間インキュベートする工程を含む。 方法は、さらに、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の数を定量する 工程を含み得る。定量は、物品における色の変化を伴うコロニーの数を計数する 工程、および潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の検体中の量と コロニー数とを相関させる工程を含み得る。 もう１つの面において、本発明は、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球 菌の検出キットを特徴とする。キットは、検体由来の微生物を増殖させるための 試薬および栄養分、ならびに検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出 するための物品を含有する。 好ましい実施態様において、微生物を増殖させるための試薬および栄養分は、 ブドウ球菌を増殖させるために適合された薄フィルム培養プレート装置を含む。図の簡単な説明 図１は、本発明の物品の１つの実施態様を示す装置の断面図である。 図２は、本発明の物品の１つの実施態様を示す装置の部分分解斜視図である。 図3a〜図3cは、薄フィルム培養プレート装置を伴う本発明の物品の１つの実施 態様での使用を表す。発明の詳細な説明 本発明は、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための物品 を提供する。本発明の物品は、非常に多数の検体の迅速、効率的かつ高感度のTN ase分析を可能にし、従って、S ．aureusを含む、潜在的にエンテロトキシンを産 生し得るブドウ球菌の検出のために現在使用されている扱い難く時間のかかるTN ase法よりも明白な利点を提供する。物品はまた、コアグラーゼ試験以上の利点 を提供する；TNase試験は、潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌 の検出における感度がさらに高い。なぜなら、潜在的にエンテロトキシンを産生 し得るブドウ球菌のすべてが必ずしもコアグラーゼ陽性ではないが、エンテロト キシン産生ブドウ球菌の大部分はTNase陽性であるからである。本発明の物品は 、S.aureusの存在に関する食品検体の分析で特に有用である。 本発明の物品は、（１）検体中に耐熱性ヌクレアーゼ（TNase）が存在すれば 、潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌が検体中に存在することを 示し、そして（２）異染性染料のトルイジンブルーＯが、酸性多糖およびDNAの 存在下でTNase活性を検出するために使用され得るという指針を利用する。 トルイジンブルーＯは異染性染料である。異染性とは、いくつかの物質との複 合体が形成されることによって、本来の染料の吸収スペクトルと異なる吸収スペ クトルが生じるために、染料が正しく染まらない特性のことである。トルイジン ブルーＯの正しいまたは正染的な染色は、青色である。しかし、異染的な染色に よって、ピンク色〜赤色またはスミレ色が生じる。トルイジンブルーＯは、DNA との複合体が形成される場合には青色に染まるが、アガロース、λ−カラゲナン またはヘパリンなどの酸性多糖との複合体が形成されると、異染性が生じ、 染料は、赤みを帯びたピンク色〜赤みを帯びたスミレ色に染まる。 トルイジンブルーＯは、酸性多糖よりもDNAに対して大きな親和性を有し、DNA は、トルイジンブルーＯを青色の正染状態で安定化する。しかし、DNAse産生生 物が存在する場合、DNAは加水分解され、酸性多糖から保護されないトルイジン ブルーＯが遊離し、染料は、赤みを帯びたピンク色〜赤みを帯びた紫色の異染性 形態に変化する。青色から赤みを帯びたピンク色または赤みを帯びた紫色への色 の変化は、DNAse（例えば、耐熱性ヌクレアーゼ）産生微生物の肯定的な同定で ある。 従って、本発明は、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための物品 を提供する。物品は、加水分解されていないヌクレオチド、トルイジンブルーＯ およびバインダーを含有する。物品は、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有 が疑われる検体（通常は、培養された検体）に対して配置するのに適合する。 物品は、液体または溶融状態とは対照的に、試験時の使用のために安定な条件 で保存され得る程度に比較的乾燥した状態である。そのようなものとして、物品 は、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体に対して配置するの に適合する。従って、使用において、本発明の物品は、その都度調製される寒天 でのウェル形成を必要とする現在利用可能な方法、または溶融寒天の使用と比較 して非常に有利である。 検体中の加水分解されていないヌクレオチドは、典型的には、DNAの形態であ る。DNAは容易に購入することができる(例えば、Difco Laboratories、Detroit MIから入手可能なサケ精子DNA)が、トルイジンブルーＯで青色に染色される（す なわち、トルイジンブルーＯを青色の正染状態で安定化させる）ように十分な大 きさの任意のヌクレオチドであり得る。従って、本明細書中で使用される用語「 加水分解されていないヌクレオチド」は、そのような核酸をいう。トルイジンブ ルーＯは、市販されている(Sigma Chemical Company、St.Louis、MO)。 物品におけるバインダーは、トルイジンブルーＯに関して異染性を生じさせ、 そして物品の他の成分と溶液中で混合され、次いで物質上に被覆され、乾燥させ て物品を形成し得る任意のバインダーであり得る。酸性多糖は、トルイジンブル ーＯに関して異染性を生じさせることが知られており、好ましいバインダーであ る。物品での使用に適する多くのバインダーが存在する。適切なバインダーの非 限定的な例として、アガロース、グアガム、キサンタンガム、ローカストビーン ガムおよび他の天然ガムが挙げられる。好ましいバインダーは、グアガムである 。 物品はまた、好ましくは、（TNase活性のための）塩化カルシウム、（適切な イオン強度を提供するための）塩化ナトリウム、またはTris塩酸塩／Tris塩基な どの（TNase反応が生じるｐＨを制御するための）緩衝液系などの他の構成要素 を含み得る。 本発明の物品は、様々なｐＨの溶液から調製され得る。そのようなものとして 、物品は、TNase介在性のヌクレオチドの加水分解が、選択されたｐＨで生じる ような試薬を含有する。例えば、下記の実施例１に示すように、本発明の好まし い実施態様による物品は、ｐＨ7.3の溶液から作製され得る。あるいは、下記の 実施例２に示すように、本発明のもう１つの好ましい実施態様による物品は、ｐ Ｈ9.0の溶液から作製され得る。 TNase活性の最適ｐＨは、8.5〜9.0である。検体中のTNaseと物品中の加水分解 されていないヌクレオチドとの間のTNase反応がこの最適範囲のｐＨで生じるよ うに物品が調製される場合、物品における色の変化は、容易に検出することがで きる。 TNase反応がTNase活性の最適ｐＨ範囲外（例えば、それより低いｐＨ）で生じ るように物品が調製される場合、コントラスト増強剤を物品中に含めることは好 都合であり得る。例えば、λ−カラゲナンは、異染性シフト、従って核酸の存在 ／非存在下でのトルイジンブルーＯ／DNAにより認められるコントラストを増強 することが知られている。米国特許第4,241,181号を参照のこと。その開示内容 は、コントラスト増強剤としてのλ−カラゲナンの使用を記載することによって 、参考として本明細書中に援用される。従って、物品中にコントラスト増強剤が 含まれることは、TNase反応が耐熱性ヌクレアーゼ活性の最適ｐＨ範囲外で生じ る系では好都合である。 本発明による物品を調製するための例示的な条件を、以下の実施例で例示する 。 一般に、物品の調製は、物品に含まれるために選択される適量の成分（加水分 解されていないヌクレオチド、トルイジンブルーＯおよびバインダーを含む）を 含有する溶液を調製する工程、溶液を冷却する工程、次いで溶液を固体支持体に 被覆する工程を含む。次いで、被覆フィルムを乾燥し、被覆した溶液を固化させ る。１つの好ましい非限定的な実施態様を例示するために、3.6g/Lのサケ精子DN A、0.32g/LのトルイジンブルーＯ、および１％（w/v）のグアガムを含有する溶 液を、0.18mmのポリエステルフィルムの固体支持体に被覆し、次いで200°Fで２ 〜10分間乾燥する。得られる乾燥被覆物は、任意の所望の厚さであり得るが、好 ましくは、約0.12〜0.25mmの厚さを有する。成分およびその量は、特定の適用に 所望されるものに依存して、物品が不撓性であるかまたは可撓性であるように選 択され得る。 図１は、好ましい実施態様における物品を示す。物品２、固体支持体３および 保護材４を含む複合体１の断面を示す。物品２は、上記のように、バインダー、 加水分解されていないヌクレオチドおよびトルイジンブルーＯを含有する。図１ に示すように、物品２は、面５および面６の２面を有する。固体支持体３は第１ の面５に接し、保護材４は第２の面６に接する。 固体支持体３は、ポリエステルフィルムなどのポリマーフィルムであり得る。 固体支持体３は、乾燥後に成型される物品を提供するための鋳型から誘導され得 る。あるいは、固体支持体３は、被覆および乾燥の後、所望の大きさまたは形状 の物品に切断または、打抜きが可能なシート材から誘導され得る。固体支持体３ に使用される材料は、物品／固体支持体複合体に任意の程度の不撓性または可撓 性を与えるために選択され得る。さらに、物品および／または物品／固体支持体 複合体は、特定の適用に所望されるものに依存して任意の形状または厚さで調製 され得る。 固体支持体は、好ましくは、使用中の物品において生じる色の変化が視認でき るように透明であるか、または少なくとも光透過性である。固体支持体はまた、 物品を安定化し、損傷から保護する。 固体支持体は、物品から剥離可能であるように選択することができ、固体支持 体を伴わない試験において物品が自由に使用される。例えば、固体支持体として ポリエステルフィルムを使用する場合、使用している間に物品が水和すると、固 体支持体を物品から剥離させることができる。 本発明の物品は、さらに、保護材を含み得る。図１に、保護材４を断面で示す 。保護材は、物品の暴露面に隣接して配置してもよい。例えば、固体支持体が物 品の１つの面に隣接する場合、保護材は、対向面に隣接し得る。保護材は、貯蔵 および輸送するときに物品を保護するポリマーフィルムまたは格子であり得、乾 燥後には吸湿性である物品を互いに隔てるための物品間のスペーサーとして機能 し、安定な貯蔵およびより長い貯蔵期間を可能にし得ることが好ましい。図１に 、保護材４を、格子として断面で示す。 保護材は、使用前に物品の面から剥離可能または除去可能であるように選択さ れる。保護材としての使用に適切な材料は、当該分野で公知である。 上記のように、物品は、任意の所望の厚さ、形状または不撓性であり得、存在 すれば、固体支持体は、任意の所望の厚さであり、任意の所望の程度の不撓性ま たは可撓性が与えられるように選択され得る。 図２を参照すると、本発明の物品２を含有する複合体１について、部分分解透 視図で示されている。図２に示す物品は、一般に、円板様の形状であるが、物品 は、特定のアプリケーションのために所望される任意の形状であってもよい。図 ２に示す複合体１は、物品２、固体支持体３、および分解図において、格子とし て示される保護材４を含有する。物品２は、面５および面６の２面を有する。分 解図において格子状として示される保護材４が取り除かれ、検体に対して配置す るのに物品の面６が出現する。 本発明の物品は、Staphylococcus aureusなどのエンテロトキシン産生ブドウ 球菌の含有が疑われる検体に対して配置するのに適合する。そのようなものとし て、物品は、検体への押し付けまたは貼付が可能である。物品は、（液体または 溶融形態とは対照的に）比較的乾燥した形態であり、検体への容易な貼付または 設置を可能にする。検体への貼付の際、物品は水和する。 検体は、典型的には、培養された熱処理検体であり、例えば、薄層培養プレー ト装置（例えば、3M、St．Paul、MNより入手可能なPetrifilm^TM）またはBaird-P arker培地などの寒天ゲルを基材とする培養系で培養された検体である。 耐熱性ヌクレアーゼ酵素は、培養されたエンテロトキシン産生ブドウ球菌のコロ ニーから遠くに拡散しないため、試験しようとする検体は、推定されるエンテロ トキシン産生ブドウ球菌のコロニーの近くに本発明の物品を配置することを可能 にする形式で調製され得るべきである。耐熱性ヌクレアーゼの拡散には限界があ るため、薄フィルム培養プレート形式が特に好ましい。なぜなら、そのような装 置における培養培地の薄層は、好都合なことに、推定されるエンテロトキシン産 生ブドウ球菌のコロニーを含有する培養された検体の非常に近くに物品を配置す ることを可能にする。 使用において、物品は、物品が検体と接触するように、検体に貼付されるかま たは置かれる。例えば、エンテロトキシン産生ブドウ球菌の含有が疑われる検体 を、Baird-Parker寒天などの寒天培地で、プレートまたはウェルで増殖させ、熱 処理（例えば、60℃で30分間）して非耐熱性のヌクレアーゼ活性を不活性化させ た場合、物品を寒天にかぶせ、それにより検体と接触させて配置することができ る。TNaseが存在する（エンテロトキシン産生ブドウ球菌の存在と相関する）場 合、加水分解された核酸の存在下でのトルイジンブルーＯの特徴的な赤色または ピンク色の染色が、適切な条件下で約１〜４時間以内に生じる。その特徴的な染 色パターンは、通常、赤色またはピンク色の「輪」が、エンテロトキシン産生ブ ドウ球菌の含有が疑われるコロニーを取り囲む形態である。 薄フィルム培養プレート形式において、試験検体、例えば、Stomacherなどの 装置で希釈および処理された食品検体は、例えば、ゲル化剤および微生物を増殖 させるための栄養分を含有するフィルムに貼付される。栄養分は、ブドウ球菌を 増殖させるために選択され得る。試験検体はまた、患者由来の培養された検体、 例えば、血清、皮膚または他の供給源などであり、ここで、患者検体中の耐熱性 ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するために物品が使用される。 次いで、検体は、典型的には、カバーフィルムで覆われ、検体中の微生物を検 出可能なレベルまで増加させることが可能な温度および時間でインキュベートさ れる。微生物が検体中に存在すれば、インキュベーション中に微生物のコロニー が現れる。インキュベーションおよび非耐熱性ヌクレアーゼの活性を不活性化す るための熱処理の後に、本発明の物品を検体に接触させて置いてもよい。 米国特許第4,565,783号および同第5,232,838号（これらの開示は、参考として 援用される）は、本発明の物品との使用に適する薄フィルム培養プレート装置を 詳しく記載する。 図3a〜図3cは、薄フィルム培養プレート装置を伴う本発明の物品の使用を示す 。図3aは、本発明の物品との使用に適する薄フィルム培養プレート装置10の例を 示す。この装置は、乾燥した培養培地12が付着しているボトムフィルム11を含有 する。培養培地は、例えば、ブドウ球菌を増殖させるために適合された培地であ って、乾燥させたブロスまたは粉末化した栄養分としてフィルムに被覆された培 地を含有し得る。（ボトムフィルム11から剥離して示される）カバーフィルム13 は、貯蔵およびインキュベーションの間、培養培地12を覆う。カバーフィルム13 は、好ましくは、培養培地12と接触する面14に被覆されたゲル化剤を含有する。 試験検体を培養培地12に貼付するとき、カバーフィルム13は、検体および培養培 地13とともにゲル化剤と接触させるためにボトムフィルム11にかぶせられる。次 いで、装置をインキュベートして、検体中に存在する微生物を増加させ、ゲル化 した培養培地にコロニーを形成させる。インキュベーション後、次いで、培養検 体は、好ましくは、非耐熱性ヌクレアーゼの活性を不活性化させるのに十分な温 度に加熱される。次いで、カバーフィルム13は、ボトムフィルム11から剥離し得 る。その結果、本実施態様では、コロニーを含有するゲル化した培養培地がカバ ーフィルムの面14に付着する。 図3bは、インキュベーション後に剥離された薄フィルム培養プレート装置10を 示す。コロニー21を含有するゲル化した培養培地20が、カバーフィルム13に付着 される。図3bには、本発明の物品２および支持層３を含有し、耐熱性ヌクレアー ゼの検出において使用される複合体１も示されている。示された複合体１は円板 形であるが、使用状況に適切な任意の形状であり得る。使用において、物品２を 含有する複合体１は、カバーフィルム13をボトムフィルム11に貼付するとき、物 品２の暴露面６が、ゲル化した培養培地20およびコロニー21と接触するように装 置に置かれる。例えば、図3bに示す実施態様において、複合体１は、ゲル化した 熱処理培養培地に対して物品２の暴露面６を上向きにして、ボトムフィルム11に 単純に置かれる。次いで、カバーフィルム13は、複合体 １がカバーフィルム13とボトムフィルム11との間に配置されるように、物品２を 覆ってボトムフィルム11に貼付される。次いで、装置をインキュベートし、耐熱 性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌の有無 を確認するために色の変化を見る。 図3cは、本発明による物品２を用いたインキュベーション後の薄フィルム培養 プレート装置10を示す。透明または少なくとも光透過性のカバーフィルム13を通 して視認できるハッチングで示した領域22は、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球 菌の存在を認める色の変化を表す。 本発明の物品は、耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産生 し得るブドウ球菌について行われる定性的および定量的試験で使用され得る。定 性的試験において、青色から赤色またはピンク色への色の変化を見えるようにす ることによって、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の存在が認められる。定量 的な試験において、物品を使用することによって、TNase陽性（潜在的にエンテ ロトキシンを産生し得る）ブドウ球菌のコロニー数の計数、および標準的な計数 技術を使用してそのような微生物の定量が可能となる。 従って、本発明はまた、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロ トキシンを産生し得るブドウ球菌の検出方法を提供する。方法は、耐熱性ヌクレ アーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための物品を、エンテロトキシン産生ブドウ球 菌の含有が疑われる検体に貼付する工程、および検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽 性ブドウ球菌の有無を確認する工程を含む。 物品を検体に貼付する工程に先立って、検体は、典型的には、エンテロトキシ ン産生ブドウ球菌の含有が疑われる試験検体を培養培地に最初に貼付し、培養培 地中の試験検体をインキュベートし、非耐熱性ヌクレアーゼの活性を不活性化さ せるのに十分な温度および時間で検体を加熱することによって行われる試験のた めに調製される。試験検体のインキュベーションは、典型的には、30〜37℃で約 18〜48時間行われる。検体を加熱して行われる非耐熱性ヌクレアーゼの活性の不 活性化は、少なくとも約60℃で約30分間行われる。 本発明の方法において物品を貼付する検体は、Baird-Parker寒天培養物などの 寒天を基材とする培養物、または本明細書中に記載の薄フィルム培養プレート 装置であり得る。方法は、さらに、検体中のエンテロトキシン産生または潜在的 にエンテロトキシンを産生し得るブドウ球菌を定量する工程を含み得る。定量化 工程は、物品での色の変化を伴うコロニー数を計数する工程、および当該分野で 公知の技術を使用して、その数と検体中のエンテロトキシン産生ブドウ球菌の量 とを相関させる工程を含み得る。 本発明は、さらに、耐熱性ヌクレアーゼ陽性で潜在的にエンテロトキシンを産 生し得るブドウ球菌の検出キットを提供する。キットは、微生物を増殖させるた めの広範囲な形式のいずれか、例えば、寒天および薄フィルム培養プレートなど に適合し得る。本発明のキットは、微生物を増殖させるための試薬および栄養分 を、好ましくは薄フィルム培養プレート装置の形態で含み、さらに、耐熱性ヌク レアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための本発明による物品を含む。実施例Ｉ ｐＨ7.3物品の調製 以下の成分を、Staphylococcus aureusを検出するための物品の調整に使用し た： 培地（ｐＨ7.3と呼ぶ）を以下のように調製した：すべての試薬（TBOおよびグ アガムを除く）を、１リットルの脱イオン水中でともに混合した。懸濁物を一定 の撹拌で混合し、沸騰するまで加熱した。TBOを混合物に添加し、撹拌を維持し ながら熱を除去した。次いで、懸濁物をエアミキサー（激しいボルテックス）で 混合し、グアガムを添加して均質になるまで混合した。懸濁物を40℃で一晩冷却 し、次いでナイフコータ一で0.18mmポリエステルフィルム上に被覆した。0.12〜 0.25mmのナイフ間隙を評価した(0.05〜0.10gの被覆重量／24平方インチ)。フィ ルムを２〜10分間、200°Fで加熱乾燥した。実施例II ｐＨ9.0物品の調製 以下の成分からもう１つの培地を作製した： 本培地（ｐＨ９と呼ぶ）は、pH7.3培地と同一に調製し、同様に被覆した。被 覆重量は両培地とも同じであった。被覆したフィルムは、評価のために２インチ 平方に切断した。実施例III TBO/DNA 寒天の調製 これらの培地を、以下のように作製したTBO/DNA寒天と比較した： 培地（TBO/DNA寒天と呼ぶ）を以下のように調製した：すべての試薬（TBOを除 く）を、１リットルの脱イオン水中でともに混合した。懸濁物を一定の撹拌で混 合し、沸騰するまで加熱した。TBOを混合物に添加し、撹拌を維持しながら熱を 除去した。混合物をオートクレイブ（250°F／15気圧／15分）した。培地を46℃ まで下げ、次いで15×100mmペトリ皿に小分けした(12〜15ミリリットル／プレー ト）。固化後、プレートを倒置し、室温で一晩インキュベートした。次いでプレ ートを使用するまで４℃で保持した。実施例IV Staphylococcus aureus の検出 以下のブドウ球菌単離物の一晩（37℃）のトリプチカーゼソイブロス（DiMed 、St.Paul、MN）培養物を調製した： American Type Collection#；凝集結果 培養物をBufferfieldのリン酸緩衝液で希釈して、約50cfu/mmとした。それぞ れの希釈培養物の１ミリリットル検体を３つの同一な3M^TM Petrifilm^TMAerobic Countプレート上にプレート化し、37℃で18〜24時間インキュベートした。フィ ルムを60℃で１時間プレインキュベートした。２つのプレートを別に設定し、ｐ Ｈ９およびｐＨ7.3確認ディスクを評価した。 付着したゲルを伴うフィルムを他方のフィルムから分離するように、寒天評価 のためのPetrifilm^TMプレートを分離した。これらのフィルム（ゲルを伴う）を 寒天プレートの表面上に重層し、次いで評価のために37℃でインキュベートした 。 Petrifilm^TMプレートフィルムを分離し、次いでディスクをゲルに接触するよ うに配置することによって確認ディスクを評価した。次いで、Petrifilm^TMプレ ートフィルムを再密封し、次いで寒天プレートしてこれらを37℃でインキュベー トした。結果は以下の通りである： プレートを30分毎に読み取った。すべてのコロニーは、37℃のインキュベーショ ンの90分以内に陽性となった。ディスクの結果（ｐＨ９またはpH7.3）間または 寒天プレートの結果間に差異は認められなかった。実施例Ｖ Baird Parker 寒天でのStaphylococcus aureusの検出 本実施例において、一晩ブロス培養物をBufferfieldのリン酸緩衝液で希釈し て、約500cfu/ミリリットルとした。希釈培養物の0.1ミリリットルをBaird-Park er寒天（DiMed）上にプレート化し、次いで37℃で48時間インキュベートした。4 8時間後、プレートを60℃で２時間インキュベートした。TBO/DNA寒天を上記に概 説したように調製した。但し、46℃まで下げ、12〜15ミリリッ トルを敷き詰めたBPAプレートに小分けした。被覆した側が寒天に接触するよう に、ｐＨ9.0およびｐＨ7.3ディスクを寒天プレートの表面に置いた。次いで、プ レートを37℃でインキュベートし、次いで30分毎に読み取ったところ、以下の結 果を得た： プレート上のすべてのコロニーは、37℃のインキュベーションの２時間以内に陽 性となった。デイスクおよびTBO/DNA寒天間に差異は認められなかった。実施例VI Petrifilm^TM 形式を使用したStaphylococcus aureusの検出 ｐＨ7.3確認ディスクを、以下の増殖培地を用いるPetrifilm^TM形式における確 認として評価した： 培地（PSAと呼ぶ）を以下のように調製した：すべての試薬を、１リットルの 脱イオン水中でともに混合した。懸濁物をエアミキサー（激しいボルテックス） により一定の撹拌で混台し、80℃に加熱した。懸濁物を４℃で一晩冷却し、次い でナイフコーターで0.18mmポリエステルフィルム上に被覆した。約31mmのナイフ 間隙を評価した(0.22〜0.25ｇの被覆重量／24平方インチ)。フィルムを２〜10分 間、200°Fで加熱乾燥した。 アクリル酸を基材とする接着剤を用いて、0.05cmポリスチレンフォームをPSA 被覆したフィルム上に積層した。それぞれのポリスチレンプレートのほぼ中央か ら直径５cmの円を取りだし、ウェルに提供した。フォームの頂部（全表面を覆っ ている）にプリプロピレンフィルム（0.1mm）の１片を（ヒンジテープの１片に よって）付着させた。このフィルムの片側を、0.15g/Lの塩化トリフエニルテト ラゾリウムを含有するアクリル酸接着剤で被覆した。この接着剤上に、約0.4ｇ ／24平方インチでグアガムを粉末被覆した。 以下のブドウ球菌単離物の一晩（37℃）のトリプチカーゼソイブロス（DiMed 、St.Paul、MN）培養物を調製した： American Type Collection#；凝集結果 培養物をBufferfieldのリン酸緩衝液で希釈して、約50cfu/mmとした。それぞ れの希釈培養物の１ミリリットル検体を２つのPSAプレート上にプレート化し、3 7℃で18〜24時間インキュベートした。次いで、フィルムを60℃で１時間プレイ ンキュベートした。２つのプレートを別に設定し、ｐＨ7.3被覆溶液（ディスク ）およびTBO/DNA寒天を評価した。 付着したゲルを伴うフィルムを他方のフィルムから分離するように、寒天評価 のためのPetrifilm^TMプレートを分離した。これらのフィルム（ゲルを伴う）を 寒天プレートの表面上に重層し、次いで評価のために37℃でインキュベートした 。 Petrifilmプレートフィルムを分離し、次いでディスク（被覆側）をゲルに接 触するように配置することによってｐＨ7.3確認ディスクを評価した。次いで、P etrifilm^TMプレートフィルムを再密封し、次いで寒天プレートしてこれらを37℃ でインキュベートした。結果は以下の通りである： プレートを30分毎に読み取った。すべてのコロニーは、37℃のインキュベーシ ョンの90分以内に陽性となった。ディスクの結果（ｐＨ7.3）間または寒天プレ ートの結果間に差異は認められなかった。 他の実施例は、本発明の請求の範囲内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．加水分解されていないヌクレオチド、トルイジンブルーＯ、およびバイン ダーを含み、少なくとも２つの表面を含み、耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌 の含有が疑われる検体に対して配置するのに適合する耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブ ドウ球菌の存在または量を測定するための物品。 ２．前記バインダーがグアガムを含む、請求項１に記載の物品。 ３．前記物品がλ−カラゲナンをさらに含む、請求項１に記載の物品。 ４．前記物品が前記物品の１つの表面に隣接する固体支持体をさらに含む、請 求項１に記載の物品。 ５．前記固体支持体がポリエステルフィルムを含む、請求項４に記載の物品。 ６．前記物品が前記固体支持体に対向する表面に隣接する保護材をさらに含む 、請求項４に記載の物品。 ７．前記物品が約０．１２ｍｍ〜約０．２５ｍｍの厚さを有する、請求項１に 記載の物品。 ８．前記ヌクレオチドの耐熱性ヌクレアーゼ介在性加水分解が約７．３のｐＨ で生じるように前記物品が試薬を含む、請求項１に記載の物品。 ９．前記ヌクレオチドの耐熱性ヌクレアーゼ介在性加水分解が約９．０のｐＨ で生じるように前記物品が試薬を含む、請求項１に記載の物品。 １０．耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌を検出するための請求項１に記載の 物品と前記検体とを接触させる工程であって、ここで、前記物品は加水分解され ていないヌクレオチド、トルイジンブルーＯ、およびバインダーを含み、少なく とも２つの表面をさらに含み、そして前記検体に対して配置するのに適合し、な らびにここで、前記検体はブドウ球菌を増殖するために選択される栄養培地を含 み、そして非耐熱性ヌクレアーゼ活性を不活化するために加熱処理されている； ならびに 前記物品中の青色から赤色またはピンク色への色の変化の有無を検出すること によって、前記検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の有無を確認する工 程、 を含む検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の測定方法。 １１．前記検体が食物検体を含む、請求項１０に記載の方法。 １２．前記検体が患者由来の検体を含む、請求項１０に記載の方法。 １３．前記検体がブドウ球菌を増殖させるために適合された薄フィルム培養プ レート装置中で培養された検体を含む、請求項１０に記載の方法。 １４．前記加熱が前記検体を少なくとも約６０℃で約３０分間インキュベート することを含む、請求項１０に記載の方法。 １５．前記検体が寒天を基材として培養された検体を含む、請求項１０に記載 の方法。 １６．前記寒天を基材として培養された検体がＢａｉｒｄ−Ｐａｋｅｒ寒天で 培養された検体を含む、請求項１５に記載の方法。 １７．前記検体において耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の数を定量する工 程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。 １８．前記定量が前記物品における色の変化を伴う前記検体中のコロニーの数 を計数する工程、および前記数と前記検体中の潜在的にエンテロトキシンを産生 し得るブドウ球菌の量とを相関する工程を含む、請求項１７に記載の方法。 １９．検体から微生物を増殖するための試薬および栄養分、ならびに請求項１ に記載の物品を含む、検体中の耐熱性ヌクレアーゼ陽性ブドウ球菌の検出用キッ ト。