DK142547B - Fremgangsmåde til fremstilling af thymosin. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1^2547 VRiw DANMARK <51> *n*· ^·3 ^ o/ s 15/00 // Αβίκ 37/24 §(21) Ansegning nr. 4835/78 (22) Indleveret den 30· Okt · 1978 (24) Lebedag 30. Okt. 1978 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 17· nOV · 1 980

DIREKTORATET FOR

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET OO) Prioritet begæret fra den (71) PABST BREWING COMPANY, 917 West Juneau Avenue, Milwaukee, WiBccn= sin, US.

(72) Opfinder: Robert Naylor, 1158 West Riverview Dr., Glendale, Wisconsin, US: Howard Fredrick Coyer, 6039 W. Lloyd Street, Wauwatosa, Wisconsin, US.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Patentbureauet Hof man-Bang & Boutard. ________________ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af thymosin.

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde af den i kravets indledning angivne art til fremstilling af thymosinfraktion 3 ud fra kalvebrisler.

Rensning og egenskaberne af oksethymosin er blevet beskrevet af Hooper et al., Annals New York Academy og Sciences, Vol. 249, side 125- 144 (1975).

Et råt thymosin, der betegnes som "thymosinfraktion 3", er beskrevet af Hooper et al, og en fremgangsmåde til fremstilling af dette er også beskrevet i det nedenfor omtalte -US patentskrift nr. 4 010 148.

Thymosinfraktion 3 er et vigtigt mellemprodukt ved fremstillingen af rent thymosin ud fra kalvebrisler. Thymosinfraktion 3 indeholder alt det thymosin, der oprindeligt var tilstede i kalvebrisleme, 142547 2 men indeholder kun 1% af brislernes oprindelige vægt. Den stærkt reducerede masse og den 100-dobbelte rensning tillader anvendelsen af kendte og sædvanlige proteinrensningsprocedurer til fremstillingen af rent thymosin.

Renset thymosin vides at bestå af flere proteiner med molekylvægte i området fra 1200 til 14000. Det er blevet vist at stimulere væksten af lymphoidt væv og derved forøge immuniteten overfor infektiøse processer. Nylige kliniske forsøg med immunomangel-sygdomme har vist, at thymosin forøger antallet af perifere blod-T-celler og derved delvis genopretter immunologisk kompetance.

Fra US patentskrift nr. 4 010 148 kendes en fremgangsmåde til ekstraktion af thymosin fra brisler, som indebærer homogenisering af kirtlerne i saltopløsning og centrifugering af homogenisatet. Derpå udfældes de varmelabile proteiner i saltvandsekstrakten ved opvarmning af ekstrakten til 80°C i et vandbad, og efter fjernelse af de varmelabile proteiner blandes den opnåede ekstrakt direkte med 5 eller 10 volumener kold acetone til udfældning af et hvidt pulver, som svarer til den ovennævnte thymosinfrakt ion 3. En sådan fremgangsmåde er arbejdskrævende til ekstraktion af store mængder (200-500 kg) brisler og resulterer i ekstraktion af uønskede fedtbestanddele fra kirtlerae, som skader den efterfølgende oparbejdning. Desuden er opvarmningen af saltvandsekstrakten på vandbad langsom og upraktisk, og til den efterfølgende udfældning af thymosinfraktion 3 kræves meget store mængder acetone.

Opfindelsens formål er at angive en ny og forbedret fremgangsmåde til fremstilling af thymosin, hvorved thymosinfraktion 3 fremstilles på en mere simpel måde end ved de hidtidige fremgangsmåder og med en minimal produktion af generende stoffer, såsom fedtstoffer og uønskede eller inaktive proteiner.

Dette opnås ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen formales brislerne groft, ekstraheres i saltopløsning, som filtreres, og filtratet eller ekstrakten injiceres med damp i et kort tidsrum for at denaturere uønskede proteiner uden at denaturere thymosinet, hvorved der dannes et bundfald, som skilles fra ved filtrering. Filtratet koncentreres 3 142547 og afkøles, og råt thymosin udfældes ved tilsætning af koncentratet til acetone.

Ved udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen formales frosne brisler, som f.eks. kalvebrisler, i en kødhakkemaskine, således at der dannes relativt grove formalede partikler med diametre på fra omkring 1,5 til omkring 5 mm. Disse grove partikler ekstraheres derpå ved omrøring med en saltopløsning på konventionel måde. Det faste stof frafiltreres, fortrinsvis under anvendelse af et filterhjælpemiddel, såsom diatoméjord eller ethvert andet egnet filterhjælpemiddel, og filterkagen smides væk. Filtratet i form af en flydende strøm bringes derpå i kontakt med damp ved injektion af damp i strømmen under et tryk over atmosfæretryk, således at filtratet øjeblikkeligt bringes op til en temperatur på omkring 80-85°C. Den tid, hvorunder filtratet holdes ved denne temperatur, skal være mindst tilstrækkelig til at denaturere det uønskede protein, men ikke lang nok til at denaturere thymosin. Sædvanligvis kræves øjeblikkelig opvarmning i et tidsrum på mindst et minut.

Der kan anvendes enten lavtryksdamp, f.eks. ved 103 kPa, eller højtryksdamp, f.eks. ved 413 kPa, til frembringelse af øjeblikkelig opvarmning. Sædvanligvis kræves ikke mere end nogle minutter.

Dette frembringer en suspension af udfældet protein, som derpå afkøles, fortrinsvis ved udhældning på is, og filtreres, fortrinsvis under anvendelse af et filterhjælpemiddel, såsom diatoméjord. Filtreringen gennemføres fortrinsvis ved hjælp af en filterpresse, og filterkagen smides væk.

Det resulterende filtrat koncentreres til omkring det halve volumen ved inddampning i vakuum, sædvanligvis ved en temperatur omkring 30° C, og afkøles til ca. 4° C. Koncentratet sættes derpå til et større volumen acetone, som er blevet afkølet til en lavere temperatur end koncentratet, fortrinsvis til omkring -10° C. Dette giver et bundfald af råt thymosin. Overvæsken kan dekanteres fra, og thymosinet opsamles ved filtrering, vaskes med frisk acetone og tørres under vakuum.

I modsætning til hidtidige fremgangsmåder,' hvorved brisler er blevet homogeniseret i saltopløsning og centrifugeret, er den foreliggende fremgangsmåde simplere derved, at de frosne brisler formales med en kødhakkemaskine, og de formalede kirtler ekstrahe- 4 U2547 res ved omrøring med saltopløsning. Ved denne fremgangsmåde kan 227 kg kalvebrisler formales og ekstraheres i løbet af 1 time. Endvidere opnås ved grov formaling i modsætning til homogenisering, at frigørelsen af generende stoffer, især fedt, holdes på et minimum, og ekstrakten er i det væsentlige fri for fedtagtigt materiale og kan let filtreres på en filterpresse.

Medens de varmelabile proteiner i saltvandsekstrakten ved de hidtil kendte procedurer udfældes ved opvarmning af ekstrakten til 80° C i et vandbad, udfældes de varmelabile proteiner ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved injektion af damp i en flydende strøm af ekstrakten, hvorved strømmens temperatur øjeblikkeligt hæves til 80°C og ekstraktens temperatur holdes ved 80°C i 1-2 minutter. Strømmen pumpes derpå ud på is for at sænke temperaturen, blandes med filterhjælpemiddel og filtreres på en filterpresse. Denne proces medfører udfældning af de uønskede varmelabile proteiner, men den hurtige opvarmning (i modsætning til opvarmning på et vandbad) formindsker det tidsrum, hvorunder ekstrakten holdes ved høj temperatur, og sænker derved risikoen for at denaturere thymosinet og bevarer thymosinets integritet.

Medens den efter fjernelse af de varmelabile proteiner opnåede ekstrakt ved de hidtil kendte procedurer blandes direkte med 5 eller 10 volumener kold acetone til udfældning af thymosinfraktion 3, koncentreres den ved den foreliggende fremgangsmåde i vakuum ved 25-30°C til omkring halvdelen af dens oprindelige volumen.

Den endelige koncentrerede ekstrakt sættes derpå til et 4-10 gange så stort volumen kold acetone for at udfælde thymosinfraktion 3.

Denne fremgangsmåde giver den samme mængde fraktion 3 som de kendte procedurer, men reducerer den nødvendige mængde acetone med 50% og simplificerer i høj grad udfældnings- og opsamlingsprocedureme.

Det er derfor indlysende, at den foreliggende opfindelse i høj grad letter fremstillingen af thymosin. Medens råt thymosin (thymosinfraktion 3) sædvanligvis indeholder mindre end 1 vægtpct. thymosin, vil det forstås, at dette kan renses yderligere på enhver egnet måde, f.eks. ved de procedurer, der er beskrevet i de førnævnte refererencer.

5 U25A7

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen skal belyses nærmere ved det efterfølgende eksempel, hvori mængderne er angivet i vægtdele, med mindre andet er anført.

EKSEMPEL

227 kg frosne kalvebrisler blev formalet i en kødhakkemaskine, og de formalede kirtler blev blandet med 700 1 0,15M natriumchlorid-opløsning ved 4°C i 5-30 minutter.

113 kg filterhjælpemiddel blev udrørt i blandingen, og blandingen blev filtreret i en filterpresse. Filterkagen blev smidt væk. Filtratet blev bragt op på 80-85°C ved injektion af damp i en flydende strøm af ekstrakten, og dampen og ekstrakten fik lov at forblive i kontakt i 1-2 minutter. Den resulterende suspension af udfældet protein blev hældt ud på 90 kg is, der tilsattes 36 kg filterhjælpemiddel, og den resulterende opslæmning blev filtreret på en filterpresse. Filterkagen blev smidt væk.

De 757 liter filtrat blev koncentreret til 378 liter og afkølet til 4°C. Koncentratet sattes til 1514 liter acetone afkølet til -10°C. Dette gav et bundfald af råt thymosin. Overvæsken blev dekanteret fra, og thymosinet opsamlet ved filtrering, vasket med frisk acetone og tørret i vakuum. Det tørrede pulver vejede 2500 g.