DK141123B

DK141123B - Fremgangsmåde til fremstilling af en beta-amylase.

Info

Publication number: DK141123B
Application number: DK393874AA
Authority: DK
Inventors: Eunice Jean Napier
Original assignee: Glaxo Lab Ltd
Priority date: 1973-07-23
Filing date: 1974-07-22
Publication date: 1980-01-21
Also published as: FR2238711A1; DE2435247C2; IE41613L; JPS5838157B2; DK393874A; DK141123C; CA1025383A; JPS5069288A; FR2238711B1; NL7409863A; US4011136A; LU70586A1; DE2435247A1; AU7147774A; ZA744664B; BE817919A; AT340861B; IE41613B1; ATA604674A; GB1476727A

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1 ^ 1 123 DANMARK 'nt.°i.3 c n 9/26 • (21) Ansøgning nr. 3938/74 (22) Indleveret den 22. jul. 1974 (23) Løbedag 22. jul. 1974 (44) Ansøgningen fremlagt og fremlæggelsesskriftet offentliggjort den 21. jan. 198Ο * ' DIREKTORATET FOR ^ .

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET (30) Prioritet begæret fra den

23. jul. 1973, 35057/73, GB

(71) GLAXO LABORATORIES LIMITED, Greenford, Middlesex, GB.

(72) Opfinder: Eunice Jean Napier, Longthorpe House, Hound Green, Matting= ley, Hampshire, GB.

(74) Fuldmægtig under sagens behandling:

Kontor for Industriel Eneret v. Svend Schønning.__ (54) Fremgangsmåde til fremstilling af en beta-amylase.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en hidtil ukendt β-amylase stammende fra Bacillus circulans.

β-Amylaser angriber a-1:4-bindingerne i de ikke-reduce-rende ender af glukosekæderne i stivelse og fraspalter maltoseen-heder med invertering til β-formen. De findes i almindelighed i højere planter, og den bedst kendte og mest udbredt anvendte er β-amylase fra byg. Der er beskrevet en bakteriel amylase stammende fra Bacillus polymyxa, men det er angivet at denne amylase har karakterer som både a- og β-typens amylaser, hvorfor den har tendens til at frembringe en væsentlig mængde glukose. Lige som byg-S-amylase har dette enzym optimal aktivitet ved en forholdsvis lav temperatur.

2 141123

Der er også beskrevet en bakteriel Ø-amylase fra stammer af Bacillus megaterium og Bacillus circulans IFO 3329, se US-PS 3 804 718. Den synes ikke at have nogen α-amylase aktivitet og er aktiv ved højere temperaturer. Begge disse to beskrevne enzymer samt den fra byg inhiberes af p-klormerkuribenzoesyre hvilket tyder på at enzymets aktive sted involverer en SH-gruppe.

Det er nu lykkedes at udvikle en ny bakteriel Ø-amylase fra en stamme af Bacillus circulans, en Ø-anylase scm er aktiv ved højere temperaturer end det ovenfor kendte enzym stammende fra Bacillus polymyxa, og som kan fremstilles uden indhold af nogen a-amylaseaktivitet. På grund af den bakterielle oprindelse kan dette enzym fremstilles i stor målestok til forholdsvis lav pris i sammenligning med prisen på β-amylaser stammende fra højere planter. Hvad der er særlig betydningsfuldt er at enzymet ikke inhiberes af organokviksølvforbindelser såsom p-klormerkuribenz-oater og p-klormerkurifenylsulfonater, hvilket tyder på at det aktive sted ikke involverer nogen SH-gruppe. Dette har den fordel at aktiviteten ikke afhænger af fravær af sulfhydryl-inhibi-torer såsom tungmetaller. Alle tidligere beskrevne β-amylaser inhiberes af organokviksølv. Det omhandlede hidtil ukendte enzym er af særlig værdi til nedbrydning af stivelse ved fremstilling af maltoseopløsninger til brug i konfitureindustrien, bageriindustrien og bryggeindustrien.

Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne.

Opmærksomheden henledes på det isoelektriske punkt. Der er grund til at tro at det isoelektriske punkt for den fra US-PS 3 804 718 kendte Ø-amylase er ca. pH 9.

Det skal desuden bemærkes at enzymet viser sig at udvise større affinitet til glykogen end til stivelse

Det omhandlede enzym er velegnet til fremstilling af maltose ved at stivelse behandles i vandigt medium dermed.

Reaktionen med dette enzym forløber optimalt ved ca. 60°C i modsætning til de fleste tidligere beskrevne Ø-amylaser. Det kan imidlertid være hensigtsmæssigt at bruge en temperatur på ca.

70°C for at inhibere retrogradering, og en reaktionstemperatur på 50-70°C foretrækkes således. Det er muligt efter ind-dampning af vinde maltosesirup på op til 44°Be eller derover og 3 U1123 indeholdende over 505» af kulhydratet i form af maltose. Stivelsen, fortrinsvis fortyndet stivelse, er hensigtsmæssigt til stede i det vandige medium i en koncentration på 30-40%, med fordel ca. 35%. Enzymet er fortrinsvis til stede i en mængde på omkring 1 til 50 og med fordel 20 til 30 i.u. (40°) pr. kg stivelse. En international enhed (i.u.) af enzymet er i nærværende beskrivelse den mæng-de af enzymet som frigør 1 μπιοί maltose pr. minut fra overskud af opløselig stivelse ved pH 5,5 ved den angivne temperatur (i °C).

Beskrivelse af Bacillus circulans stamme NCIB 11.033 1. Morfologi Næringssuppe, 24 timer ved 37°C:

Lige eller svagt krumme bevægelige stave, enkeltvis eller i kæder på 2-5 enheder, siderne parallelle, enderne afrundet. Meget få sporer dannes på dette stadium. Ingen tegn på kapsel.

Leifson's flagelfarvning: flagellerne er peritri.che 2. Gramfarvning Næringsagar, 24 timer ved 37°C:

Gramnegative stave, 1,4-3,9 χ 0,4-0,75μ, siderne parallelle, enderne afrundet. På dette tidspunkt havde nogle få af bakterierne dannet sporer.

Peptonvand, 24 timer ved 37°C:

Udseendet lignende.

Næringsagar 48 timer ved 37°C:

Gramnegative stave, rigelig sporedannelse, sporerne gramnegative, nogle fastholder farven kraftigere. Sporer ægformede, tykvæggede, 1,2 x 1,9 μ, gennemsnitligt tykkere end vegetative celler, hyppigt med gammelt celledannende sporangiehylle. Sporestilling variabel, central til terminal.

141123 4 3. Koloniudseende Næringsagar, 19 timer ved 37°C:

Kolonier 0,5-1 mm, cirkulære, hele, gennemskinnelige, opalescerende, konvekse, glatte, skinnende. Kæmpe kolonier og nogle få mikrokolonier udviser motilitet og er spredende spiralt udefter.

Stivelsesagar (stivelse 1%, penton 0,5%, gærekstrakt 0,2% og mineralsalte), 19 timer ved 37°C:

Kolonier 1-2 mm, cirkulære, hele, gennemskinnelige, opalescerende til flødeagtige, konvekse, glatte, skinnende, ringe eller ingen tendens til spredning.

Blodagar (Næringsagar + 10% blod), 19 timer ved 37°C:

Kolonier 1-2 mm, ligner de foran nævnte men fladere og spredende ved en strømmende virkning over pladen. Ingen hæmolyse.

4. Agarskråkultur Næringsagar, 3 dage ved 37°C: Vækst sparsom, spredende, gennemskinnelig, undertiden vanskelig at iagttage, blegt, flødefarvet aggregat ved skråfladens basis.

Stivelsesagar (som ovenfor) 3 dage ved 37°C: Vækstmedium, opalescerende til flødefarvet, svagt skinnende, ringe eller ingen tendens til strømning.

U1123 ·<· *· · ; .· -··k ·' _ .. / 5 ">>· 5. Vækst i flydende medium Alle 24 timer ved 37°C.

Næringssuppe (statisk), uklarhed let til medium, intet sediment.

Næringssuppe (rystekultur). Turbiditet medium til tyk, intet sediment.

Peptonvand (statisk). Turbiditet let, sediment flokkulent, skinnende.

Stivelsessuppe (statisk). Turbiditet tyk, sediment kort trådagtigt.

Stivelsessuppe (rystekultur). Turbiditet meget tyk, flødeagtig, intet sediment.

6. Temperatur-vækst relation Næringsagar. Stuetemperatur. Vækst langsom - rimeligt god efter fire dage.

37°C Vækst god efter 24 timer.

50°C Meget svag vækst selv efter fire dage

Stivelsesagar 50°C God vækst efter 24 timer.

7. Følsomhed for antimikrobielle midler (+ = følsom, - = ufølsom)

Bacitracin 5 enheder

Kloramfenikol 10 μg +

Sulfafurazol 100 μg +

Neomycin 10 μg +

Nitrofurantoin 200 ug +

Penicillin 1,5 enheder +

Streptomycin 10 ug

Polymyxin B 10 ug +

Erytromycin 10 ug +

Novobiocin 5 U9 +

Oleandomycin 5 ug +

Tetracyklin 10 ug + ) ....., ,. ....... . ·. . ,..,. . .·,·. ' ...λ·; ^ -ί'^^3.^1' U1 12|'Mi.

6 >M

8. Biokemiske reaktioner

Sukkerforgæring, tre dage ved 37°C - syre, men ingen gas: glukose, sakkarose, maltose, mannitol - stærkt sur; laktose, mannose - sur; galaktose - svagt sur.

Lakmusmælk koagulerer ikke, bliver sur efter 24 timer, beige-farvet sediment efter seks dage.

Gelatine - ingen smeltning.

Kosers citratmedium - ingen vækst.

Indol - dannes ikke.

Acetylmetylkarbinol - dannes ikke.

Nitrat - reduceret til nitrit.

H2S - dannes.

Katalase - positiv.

Metylenblåt - reduceres på 1 - 1 1/2 timer.

Kartoffelstykker - ingen vækst.

Stivelse - hydrolyseres.

Fremstilling af enzymet

Ved dyrkningen kan næringsmediet være et hvilket som helst medium der egner sig til dyrkning af arter af slægten Bacillus. Det må indeholde en kilde til nitrogen og en kulhydratkilde, herunder fortrinsvis stivelse eller et hvilket som helst nedbrydningsprodukt deraf til og med maltose. Nitrogenkilden kan fx være en konventionel gærekstrakt, pepton eller et præparat som fx tryptose, . kaseinhydrolysat eller vallepulver, men nitrogenkilden er med fordel simpelt majsstøbevand som ikke blot giver de bedste udbytter, men også er meget økonomisk at anvende. Bacillus circulans NCIB 11.033 danner enzymet udmærket på simple næringsmedier, og i betragtning af manglen på risiko for sulfhydrylforgiftning af enzymet er nævnte stamme særlig velegnet til industriel gæring i stor målestok i modsætning til de tidligere beskrevne β-amylase-producerende bakterier. Kulhydratkilden indeholder fortrinsvis en stivelse eller et nedbrydningsprodukt som defineret foran for at sikre produktionen af β-amylasen. Alle andre ' '·/·'· > ν ’} 141123 < ' Γ * · ···- 7 kulstofkilder, herunder sukkerarter såsom laktOse, glukose og sakkarose, understøtter væksten af bakterien men kan eventuelt kraftigt undertrykke dannelse af β-amylase. Sammenfattende går man således ifølge opfindelsen fortrinsvis frem som angivet i krav 2. Scm syreneutraliserende middel anvendes ifølge opfindelsen fortrinsvis kridt, der egner sig særlig godt til arbejde i stor målestok fordi det er lettilgængeligt, billigt, og simpelt at håndtere. En koncentration på 2% kridt har vist sig at være optimal.

Det mest hensigtsmæssige dyrkningsmedium indeholder ifølge opfindelsen 2% majsstøbevand, 4% stivelse og 2% kridt.

Den mest velegnede temperatur til enzymproduktionen er ifølge opfindelsen fra ca. 35 til ca. 50°C (optimalt navnlig 45°C) ved den optimale udgangs-pH-værdi for gæringen på 7-8.

Det er særlig værdifuldt at β-amylase viser sig at være det eneste extracellulære enzym, der dannes. Specielt er β-amyla-sen i alt væsentligt fri for α-amylaser. Der kan derfor bruges simple fraktioneringsprocesser som fx konventionel udfældningsteknik, i modsætning til selektivt ødelæggende slags teknik såsom blyacetat-udfældning og selektiv termisk denaturering som bruges til rensning af tidligere beskrevne β-amylasepræparater. Man kan derfor gå frem på den måde at man befrier næringsvæsken for uop-løst fast stof ved filtrering eller ved centrifugering, hvorefter man kan udfælde enzymet ved tilsætning af et med vand blandbart organisk opløsningsmiddel såsom en keton som fx acetone eller metyl- ætylketon eller en lavere alkohol såsom ætanol, isopropanol eller butanol. I almindelighed vil 0,5 til 2 rumfang, fx ca. 1 rumfang kold isopropanol bevirke tilfredsstillende udfældning. Dette rå bundfald kan derefter renses yderligere ved opløsning deraf i vand, dialysering af opløsningen, fjernelse af alt udfældet stof, genudfældning ved udsaltning med et opløseligt salt såsom ammoniumsulfat, genopløsning og dialysering samt frysetørring. Ved en fo-retrukken udførelsesform dispergerer man imidlertid bundfaldet i en puffer (fx tris-maleatpuffer 0,025M) ved pH 5,5 og behandler det med en kationisk detergent såsom cetyltrimetylammoniumbromid for at udfælde uønskede sure polysakkarider. Den ovenstående væske kan derefter genudfældes ved tilsætning af et vandblandbart opløs- 1411 2^¾¾ vV>v' · · '

3 '"V

ningsmiddel (fx isopropanol), og om nødvendigt kan processen gentages før man sluttelig isolerer produktet fra vandig opløsning, fx ved frysetørring.

Fordelen ved en β-amylase som er i det væsentlige fri for a-amylase består i at den muliggør gennemførelse af velkontrollerede hydrolysereaktioner. Ved produktion af maltose vindes der således et renere produkt når fortyndet stivelse hydrolyseres med β-amylase i fravær af α-amylase end ellers. Den fortyndede stivelse bør fortrinsvis have en dextroseækvivalent på under 10, fx på ca. 5 eller endog derunder.

Til fremstilling af mindre rene maltosepræparater, fx sirup med højt maltoseindhold, kan der tilsættes andre enzymer i kontrollerede mængder såsom α-amylase eller isoamylase, idet mængderne afhænger af den grad af nedbrydning af amylopektinske-lettet, der ønskes. Specielt kan der tilsættes en α-amylase som også har høj optimal temperatur såsom dem der er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.285.173 for at muliggøre opnåelse af optimal stivelseshydrolyse.

Et yderligere anvendelsesområde for ren β-amylase foreligger ved fremstilling af β-grænsedextrin til brug ved bestemmelse af α-amylase fx i mel.

Generelt opnås der ved den foreliggende opfindelse en-β-amylase med høj termostabilitet og lav følsomhed for sulfhydryl-gifte og som er i det væsentlige fri for α-amylase ved en økonomisk industriel proces, nemlig submers aerob dyrkning af bakterier, hvorved der er muliggjort en særlig hensigtsmæssig og økonomisk proces til fremstilling af sukkersirup med højt maltoseindhold.

Nogle eksempler tjener til nærmere belysning af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.

Eksempel 1 »

Fremstilling af en podekultur

Organismen Bacillus circulans stamme NCIB 11.033 podes fra skråkulturer af stivelsesagar (1% opløselig stivelse, 0,5% oxoidpepton, 0,2% gærekstrakt, C,0^% KgHPO^, 0,005% MgS0.,,7H20, 0,01% KaCl, 0,001% FeCl^, 1% agar) til et podet kulturstadium 141123 ’ 9 t ' 7" ’ ·'. · · ‘ *: med 2% gærekstrakt, 2% trypton og 0,5% stivelse (30 ml pr. 250 ml stor rystekolbe) og dyrket i 2-24 timer ved 50°C på et rystebord.

Gæring

Podekulturen (1-2%) overførtes til gæringsmediet (2% majsstøbevand, 4% stivelse, 2% kridt, pH 7,0) i en mængde på 30 ml i hver 250 ml stor rystekolbe, og der dyrkedes i 48-72 timer ved 50°C på et rystebord. Der vandtes en liter gæret medium med et indhold på 3,4 i.u. (20°C)/ml.

Mediet centrifugeredes og udfældedes med 10 rumfang acetone. Det resulterende bundfald blev optaget i 1/20 rumfang vand og dialyseret natten over, og det uopløselige materiale fjernedes ved centrifugering. Enzymet udfældedes fra den ovenstående væske ved tilsætning af ammoniumsulfat i en mængde på 50 g/100 ml og bundfaldet genopløstes i vand og dialyseredes før det frysetørredes .

Et lignende resultat opnåedes der ved anvendelse af 4 rumfang kold ætanol i stedet for de 10 rumfang acetone. Det derved frembragte enzym havde følgende egenskaber: a) ved 60°C er ρΗ-værdien for optimal aktivitet 5,0- 6,5; b) enzymet deaktiveres ikke væsentligt af en sulfhydryl-inhibitor som fx natrium-p-klormerkuribenzoat ved koncentrationer i på op til 10~4M; c) hverken aktiviteten eller termostabiliteten påvirkes af kalciumklorid i området 0,01 til 0,1M; d) temperaturen for optimal aktivitet er ca. 60°G i et pH-område på 5,06 til 6,5, mens aktiviteten går hurtigt ned ved 65°C i fravær af substrat; e) enzymet er stabilt ved 60°C i mindst 30 minutter uden substrat (pH 6,0; 0.05M tris-maleatpuffer).

ψη-φφ:· V**^ ?> · ίο

Eksempel 2 Gæring

Podekulturen fremstilledes som beskrevet i eksempel 1 og brugtes ved en alder på 24 timer til at pode (2 rumfangs^) to 5 liter store gæringsbeholdere hvori der var anbragt sterilt majsstøbevand (2% vådvægt), kridt (2¾ v/r (dvs. vægt/rumfang, faststof og væske i samme indbyrdes relation som g og ml)), opløselig stivelse (4¾ v/r). Efter 24 timers vækst i dette medium ved 45°C under en omrøringshastighed på 500 omdrejninger pr. minut og et luftoptag på 3 liter pr. minut var pH-værdien faldet fra ca. 7,0 til 6,3-6,6 og uklarheden (Unicam SP1300; 1 cm celle; Ilford nr. 622 filter) var steget fra 2,8-3,4 til 5,6. Dette inoculum overførtes (2 rumfangs^ til 150 liter sterilt gæringsmedium som i eksempel 1 og gæringen fortsattes i 68 timer ved 250 omdrejninger pr. minut og 3 liter luft pr. minut. Efter dette tidsrum var pH-værdien steget fra 7,4 til 8,3, turbiditeten fra 4,7 til 5,7, indhold af frit reducerende sukker var forsvindende, den samlede mængde kulhydrat var faldet til halvdelen af det oprindelige niveau og β-amylase-titeren var 6,5 i.u. (35°C)/ml.

Ekstraktion 130 Liter indhøstet gæringsmedium afkøledes til 20°C og filtreredes på et roterende vakuumfilter som i forvejen var overtrukket med filterhjælp. Til filtratet (85 liter) sattes der ved 4°C et lige så stort rumfang kold isopropanol og blandingen hen-stod i en time ved 5°C før det udfældede materiale fjernedes ved centrifugering. Udfældningen dispergeredes i 14 ml tris-maleat-puffer (0,025M, pH 5,5) og genreguleredes til pH 5,5 med 2N HC1.

Til suspensionen sattes der 2,4 liter (ca. 0,2 rumfang) af en 5%s cetrimidopløsning (cetyltrimetylammoniumbromid). Efter sammenblanding holdtes detergentblandingen på 5°C i 1/2 time før udfældningen opsamledes ved centrifugering. Den ovenstående væske, 14 liter, afkøledes til 5°C og der tilsattes et lige så stort rumfang kold i.

11 U1123 isopropanol. Efter henstand i l/2 time ved 5°C udvandtes udfældningen ved centrifugering og genopløstes i 3 liter tris-maleat-puffer (0,025M, pH 5,5), pH-værdien reguleredes til 5,5 som foran og der genudfældedes ved 5°C med et lige så stort rumfang isopropanol. Denne behandling gentoges. Den endelige udfældning opsamledes ved centrifugering og opløstes i 2 liter tris-maleatpuffer (0f025M, pH 5,5) før tilbageværende isopropanol fjernedes ved roterende afdampning ved en temperatur på ikke over 40UC.

Den endelige opløsning fortyndedes til 3 liter med destilleret vand, filtreredes til klaring og frysetørredes til frembringelse af 524 g fast stof. Dette faste stof bestemtes til et indhold på 483 i.u. (35°C)/g.

Eksempel 3

Bacillus circulars stamme NCIB 11.033 podedes i et medium bestående af majsstøbevand 20 g/l majsmel 10 g/l kridt 20 g/l idet mediet var til stede i en mængde på 50 ml pr. 250 ml stor kolbe og pH-værdien var 6,6. Efter fire dage på et rystebord ved 42°C opnåedes der en titer på 8,6 i.u. (60°C)/ml i den ovenstående væske i gæringsmediet.

Eksempel 4

Der gennemførtes en gæring lignende den der er beskrevet i eksempel 3 under anvendelse som medium af \ oxoid gærekstrakt 20 g/l maltose 20 g/l kridt 20 g/l ved en pH-værdi på 7,0 i tre dage ved 42°C med 30 ml gæringsmedium pr. kolbe, hvorved der fremkom en titer på 5,8 i.u. (60°)/ ml.

12 U1123

Eksempel 5

Ved en lignende gæring som den der er beskrevet i eksempel 3 under anvendelse som medium af difcotryptose 20 g/l difcogærekstrakt 20 g/l opløselig stivelse (Hopkin & Williams Analar) 5 g/l ved pH 7,0 i tre dage med 30 ml medium pr. kolbe opnåedes der en titer på 3,5 i.u. (60°C)/ml.

Eksempel 6 Gæring

Podekulturen fremstilledes som beskrevet i eksempel 1.

Der gennemførtes fem gæringer lige som den der er beskrevet i eksempel 1, idet der ved de to brugtes 250 ml store o rystekolber ved 37 C (6a og 6e) og tre under anvendelse af 5 liter store gæringsbeholdere med omrøring og indeholdende 3 liter medium ved 45°C og under omrøring med enten 550 opm og 3 liter luft pr. minut (6b og 6c) eller 250 opm og luftning med 6 liter pr. minut (6d) med en 7,5 cm impeller. Ved 550 opm og en lufttilfør- i sel på 3 liter pr. minut opnåedes den maksimale titer på 4,0 i.u. (35°C)/ml ved indhøstning efter 70 timer, da pH-værdi var steget fra 7,0 til 8,75 og indholdet af frit reducerende sukker var lavt og den samlede mængde kulhydrat var faldet til 1/3 af den oprindelige værdi. Ved 250 opm og 6 liter luft pr. minut opnåedes den maksimale titer på 3,6 i.u. (35°C)/ml ved indhøstning efter 70 timer da pH-værdien var steget fra 7,0 til 7,8, indholdet af frit reducerende sukker var lavt og den samlede mængde kulhydrat var faldet til 1/3-1/2 af den oprindelige værdi.

t U1123 13

Ekstraktion

Hele næringsmediet centrifugeredes i 30 minutter og den klare ovenstående væske opsamledes ved dekantering og cellerne kasseredes. Der sattes langsomt 0,5 rumfang kold ætanol (A.R.) til den afkølede ovenstående væske mens der omrørtes i bad ved 4°C, hvorpå man lod blandingen ekvilibrere i 60 minutter. Det udfældede enzym opsamledes ved centrifugering (23.000 g) ved 4°C og det genopløstes i 0,025M tris-maleatpuffer, pH 5,5. Efter fjernelse af det uopløselige materiale ved centrifugering (23.000 g) ved 4°C frysetørredes den klare ovenstående væske.

Egenskaberne af alle de faste stoffer sammenlignedes med egenskaberne hos produktet fra en gæring (6f) udført som beskrevet i eksempel 1.

Aktivitet af β-amylasefaststof

Forsøg nr. Specifik Styrke, Vægt, g Samlet aktivitet aktivitet i.u.(35°)/ i.u. (35°C) i.u. (35 C)/ mg faststof ___________mg_protein________ 6a 19,5 0,82 3,4 2805 6b 15,0 0,45 4,6 2070 6c 19,5 0,60 3,8 2280 6d 12,2 0,60 6,8 4080 6e 15,8 0,38 4,4 1650 6f 12,5 0,62 3,3 2063

Eksempel_7

Der fremstilledes (3-amylase som i eksempel 1, dog med anvendelse af 4 rumfang kold ætanol i stedet for 10 rumfang acetone til udfældning fra centrifugeret medium.

Suspensioner af 35% syrehydrolyseret stivelse med en tilnærmet dextroseækvivalent på 16 og indeholdende 7% glukose, 6% maltose og 8,5 maltotriose inkuberedes med forskellige mængder af den fremstillede β-amylase i prøver på 25 ml i 72 timer ved 50°C (naturlig pH-værdi, ingen puffer), og sukkerarterne i den resulterende sirup analyseredes. Der var kun tre pletter synlige på papirkromatogrammer: glukose, maltose og maltotriose. Der 1A1123 14 • t iagttoges ingen isomaltose. Siruppens forgærbarhed prøvedes ved inkubering af en prøve med celler af Saccharomyces cerevisiae; al glukosen og maltosen og det meste af maltotriosen blev konsumeret.

Stivelsesfordøjelse (40^C)/g*U' ækSiållnt Sukkerarter (% på tørstofbasis) stivelse af den re- --------------------------------------- suiterende Glukose Maltose Maltotriose sirup 0,0015 36,9 14,6 48,2 22,0 0,0075 39,9 14,7 49,5 19,4 0,03 42,2 11,6 58,0 17,8

Forbehandlingen af stivelsen er åbenbart af stor betydning eftersom enzymet antagelig hæmmes af a-1:6-bindinger i amy-lopektinmolekylet.

Maltosen påvistes at være Ø-maltose ved polarimetri.

> Eksempel 8

Rensning af rå Ø-amylase

Rensning af 25 g rå β-amylase (fremstillet i henhold til eksempel 2) udførtes ved ionbytterkromatografi på DEAE-cellu-losekolonner. I kolonnerne anbragtes 5 mM tris/HCl-puffer (pH 8,5) indeholdende 1 mM ditiotreitol (DTT) og enzymet elueredes med natriumklorid-gradienter fra 0 til 250 mM i samme puffer. De aktive fraktioner dialyseredes mod 5 mM 2-merkaptoætanol og frysetørredes. Produktet indeholdt 31% af den oprindelige aktivitet med en specifik aktivitet på 16,3 i.u. (37°C)/mg tørvægt. Ved analyse udviste materialet 32 vægt% kulhydrater, 33% protein og havde følgende egenskaber: i 15 141123

Elektrofokusering

Elektrofokusering udførtes ved 4°C i en 8101 elektrofo-kuseringskolonne (LKB Productor) under anvendelse af en Ampholin- koncentration på 1% og en sakkarosegradient. Anoden holdtes på bunden af kolonnen og belastningen påførtes på gradientens centralfraktioner .

Område 3-10

Belastning 20 ml produkt fra DEAE-cellulosekolonne Løb - 450 volt i 65 timer

Område 3-6

Belastning som ovenfor Løb - 500 volt i 65 timer

Der opsamledes 4 ml store fraktioner fra kolonnerne og de overvågedes for pH, absorption ved 280 nm og β-amylaseaktivitet (manuel bestemmelse mod glykogen i fosfat 7,0). Det fandtes en top med β-amylaseaktivitet mellem pH 4,2 og pH 5 med maksimum ved pH 4,6·. Tyndlags-gelelektrofokusering viste at mindst 90% af β-amy-> laseaktiviteten optrådte i et tæt bånd ved pH 4,6.

Molekylvægtbestemmelse

Gelfiltrering udførtes på polyakrylamidgel (Biogel P100) under de betingelser der er angivet af Andrews, J. Biochem 95, 569, 1965. De anvendte molekylvægtmarkører var: krystallinsk β-amylase fra batat: 150.000 okseserumalbuminfraktion V: 65.000-70.000 ribonuklease fra oksepancreas: 13.700

Der iagttoges en enkelt top svarende til en molekylvægt på 58.000.

16 141123 pH Optimum

Under anvendelse af den bestemmelsesmetode der er angivet af Robyt og Whelan ("Starch and its Derivatives" Ed. Radley Chapman and Hall, London 1968 side 432) fandtes der et pH optimum på 7,0 på et glykogensubstrat ved 37 C.

Virkning af p-klormerkurifenylsulfonat

Fordøjelsespræparater indeholdende glykogen (l mg), β-amylase (2,5 mg) og fosfatpuffer pH 7,0 (40 pmol) og forskellige mængder p-klormerkurifenylsulfonat inkuberedes i ti minutter ved 37°C, og man målte 3-amylaseaktiviteten under anvendelse af den ovenfor beskrevne, af Robyt og Whelan udarbejdede metode. Der be-virkedes ingen signifikant inhibering ved koncentrationer på op til 2 mM.

Eksempel 9 trin a) Tre portioner på hver 15 g opløselig stivelse (svarende til 3 x 13,5 g tørvægt) suspenderedes i 290 ml 50 mM tris-maleatpuffer pH 5,5 og opvarmedes på et kogende vandbad for at : i bevirke fuldstændig opløseliggørelse. Opløsningerne afkøledes til 60°C og der tilsattes 0,159 i.u. (37°C)/mg rå β-amylase fremstillet som i eksempel 2) sammen med 10 ml puf fer til koncentrationer på henholdsvis 1,76, 8,8 og 17,6 i.u. (37°C)/g tør stivelse. Kolberne lukkedes hermetisk og inkuberedes ved 60°C i 65 timer. Prøverne bestemtes for reducerende sukker og viste sig at svare til henholdsvis 67, 69 og 69% omdannelse til maltose. Maltose var det eneste produkt som konstateredes ved papirkromatografi. Ensartetheden af omdannelsesgraden ved de tre forskellige enzymkoncentrationer formodes at vise produktion af β-grænsedextrin.

U1123 17 b) 2 x 5 ml fordøjelsespræparater anbragtes i 50 mM natriumfosfatpuffer pH 7,0 indeholdende henholdsvis glykogen og amylopektin ved koncentrationer på 2%. Der sattes 50 mg, 300 i.u. (37°C) β-amylase (fremstillet som i eksempel 8) til hver af prøverne og der tilsattes desuden nogle få dråber toluen så at der dannede sig et beskyttende lag på overfladen. Opløsningerne inkuberedes ved 37°C i 72 timer. De resulterende opløsninger bestemtes for maltosedannelse og viste sig at svare til omdannelseseffektiviteter på henholdsvis 44% (glykogen) og 62% (amylopektin). Opløsningerne bestemtes også for glukose under anvendelse af glukose-oxidase. Der kunne ikke konstateres nogen glukose. De resterende portioner af β-amylase-fordøjelsespræparaterne dialyseredes mod 50 mM natriumfosfatpuffer pH 7,0 (72 timer, 4°C). De dialyserede opløsninger udviste ingen frigivelse af reducerende sukker ved behandling med yderligere β-amylase, men en udtalt afgivelse af reducerende sukker ved behandling med pancreatisk α-amylase. Dette tages som bevis for at β-amylasepræparatet frembringer en β-grænsedextrin ved reaktion med amylopektin eller glykogen og derfor er fri for a-amylase.

i

Claims

13 141123 <

1. Fremgangsmåde til fremstilling af en β-amylase stammende fra Bacillus circulans, kendetegnet ved at man foretager submers aerob dyrkning af stammen Bacillus circulans NCIB 11.033 i et næringsmedium for organismen og derefter fraktionering til frembringelse af fraktioner rige på en β-amylase i det væsentlige fri for andre extracellulære enzymer og med følgende egenskaber: a) ved 37°c er pH for optimal aktivitet på glykogensubstrat 6,5-7,5, b) enzymet er stabilt ved 60°C i mindst 30 minutter uden substrat (pH 6,0, 0,05M tris/maleatpuffer), c) enzymet inhiberes ikke signifikant af en sulfhydrylinhibitor såsom natrium-p-klormerkurifenylsulfonat ved koncentrationer op til 2 mM, d) gelfiltrering på en porøs polyakrylamidgel med en molekylvægt-udelukkelsesgrænse på 100.000 udviser en enkelt top med β-amylaseaktivitet svarende til en molekylvægt på 53.000 til 63.000, e) isoelektrisk punkt bestemt ved tyndlags-gel-elektrofokusering er pH 4,6, f) hverken aktivitet eller termostabilitet påvirkes af kalciumklorid i området 0,001 til 0,1 M.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at næringsmediets kulhydratkilde indeholder stivelse eller et hvilket som helst af dets nedbrydningsprodukter til og med maltose, samt som nitrogenkilde majsstøbevand og derudover et syreneutraliserende middel.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at det syreneutraliserende middel er kridt.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved at mediet indeholder 2% majsstøbevand, 4% stivelse og 2% kridt.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved at mediets temperatur er 35-50°C ved en start-pH-værdi på 7-8. Fremdragne publikationer: Japansk patentansøgning nr. 46-76484, som svarer til USA patent nr. 3804718.