DE931321C - Verfahren zur Herstellung von histologischen Schnitten - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung von histologischen Schnitten Pflanzliche, tierische und menschliche Gewebe müssen, um für mikroskopische Zwecke verwertbar zu sein, gewöhnlich einem Fixilerungs- unld Entwässerungsprozeß unterworfen werden. Bevor man sile in eines der bisher üblichen Mittel, z. B.
• Paraffin, einbettet, werden s.ie mit wäßriger Formalinlösung behandelt und anschließend mit organischen Lösungsmitteln, z. B. Alkohol, entwässert. Zu diesem Verfahren benötigt m!an etwa 3 Tage. Außerdem tritt dabei eine erhebliche Veränderung des nativen Gewebes ein; es veHiert seinen Wasser- und Fettgehalt, während die übrigen Bestandteile in ihrer chemischen und physikalischen Struktur stark verändert werden.
• Für elektronenmikroskopische Präparate ist diese Art der Einbettung völlig ungeeignet, da neben den erwähnten strukturellen Veränderungen, die hier noch wesentlich stärker in Erscheinung treten, als weiterer Nachteil hin zukommt, daß die in Paraffin eingebetteten Präparate nicht genügend dünn geschnitten werden können. Ebenfalls ungeeignet ist diese Methode für die Autoradiographie, das ist ein Verfahren zur Sichtbarmachung im Gewebe befindlicher radioaktiver Substanz, da wesentliche Zellbestandteile, wie Lipoide oder Fette, herausgelöst werden.
• In neuerer Zeit hat man auch versucht, bio logische Gewebe in Kunststoffe einzubetten bzw. in Lösungen von ungesättigten polymerisierbaren Verbindungen einzulegen und diese dann zu polymerisieren. Auch hierzu ist bei den üblichen Verfahren eine Vorbehandlung mit organischen Lö sungsmitteln erforderlich. Erwähnt seien die Einbettungsverfahren mit Hilfe von Acrylsälure oder Methacrylsäureestern.
• Bei der Einbettung von Gewebeteilen in wäßrige Lösungen von Acrylsäureamid und anschließender Polymerisation des Monomeren im Gewebe treten zwar die obengenannten Nachteile nicht auf, doch erhält man bei den für die Herstellung von Einbettungsmassen geeigneten Monomerenkonzentrationen sehr schwer lösliche und daher kaum vollständig aus dem Gewebe entfernbare, in den meisten Fällen sogar wasserunlösil-che, lediglich quellbare Polymerisate. Da der Schnitt aber auf Wasser gespreitet werden muß, treten bei Schnitten, die von quelilbaren Polymerisaten durchsetzt sind, stark störende strukturelle Veränderungen auf.
• Auch bei einer eventuellen Anfärbung ist egne Quellung nicht zu vermeiden, da die gebräuchlichen Farbstoffe, z. B. Hämatoxylin oder Eosin, in wäßriger Lösung angewendet werden. Arbeitet man mit Farbstoffen, die in organischen Flüssigkeiten löslich sind, so kann je nach der Natur des Lösungsmittels, abgesehen von der denaturierenden Wirkung auf das Gewebe, eine Trübung oder ebenfalls Quellung des Polymerisats auftreten. Bei der Verwendung eines auf diese Weise eingebetteten Präparates für die Elektronenmikroskipie wird durch den Verbleib des Polymerisats im Schnitt eine unkontrollierbare zusätzliche Streuung der Elektronen verursacht, die das Auflösungsvermögen und' die Schärfe der Bilder beeinträchtigt. Bei der Autoradiographie ergibt jede Veränderung der Struktur während der Expositionszeit, wie sie durch eine Quellung bzw. Schrumpfung hervorgerufen wird, unverwertbare Bilder. Hinzu kommt, daß durch das Eindringen der Monomerenlösung in das Gewebe der wasserlösliche Anteil der radioaktiven Substanz in unkontrollierbarer Weise verteilt wird. Bei einem Gewebeschnitt, der von einem lediglich quellbaren P olymeris at durchsetzt ist, ist das Herauslösen dieses Anteils naturgemäß erschwert, und da im allgemeinen nur der organisch gebundene, wasserunlösliche Anteil der radioaktiven Substanz interessiert, scheidet diese Methode aus.
• Es wurde un gefunden, daß durch Mischpolymerisation von Monomeren, die im menschlichen, tienischen oder pflanzlichen Gewebe leicht polymerisieren, wie Acrylsäureamid, mit solchen Monomeren, die Wasserlöslichkeit der Polymerisate bewirken, wie z. B. Vinylpyrrolidon oder Vinylcaprollactam, al4e zuvor erwähnten Nachteile vermieten werden. Ohne jede Vorbehandlung kann man durch Einlegen des Gewebes in die wäßrigen Lösungen derartiger Monomerengemische und anschließende Polymerisation Präparate anfertigen, aus denen sich Schnitte von einer Dicke bis zu o,o8 µ herstellen lassen. Beim Spreiten des Schnittes auf Wasser wird das Polymerisat in kurzer Zeit aus dem Gewebe herausgelöst. Bei so hergestellten Präparaten bleibt auch bei länger andauernder Lagerung die Wasserlöslichkeit des Polymerisats voll erhalten und wird nicht durch Vernetzungsreaktionen beeinträchtigt.
• Die Elektronenmikroskopie ergab bisher nur scharfe Gewebebilder nach vorheriger Osmiumfixierung. Überraschenderweise erhält man mit Hilfe des neuen Verfahrens. hervorragend scharfe und kontrastreiche Aufnahmen ohne eine derartige Vorbehandlung. Selbstverständlich kann dieses Verfahren jedoch mit einer solchen Fixierung kombiniert werden.
• Auch für die Lichtmikroskopie ist das beanspruchte Verfahren von Bedeutung. Somit ist es von Vorteil bei der Anwendung aller herkömmlichen und modernen histologischen Verfahren.
• Die Herstellung von Gewebeschnitten nach dem neuen Verfahren ist sehr einfach. Das Gewebe wird z. B. in eine konzentrierte wäßrige Lösung von Vinylpyrrolidon und Acrylsäureamid eingelegt. Zweckmäßig wendet man Monomerenmischungen an, die zwischen 20 und 750/0 Vinylpyrrolidon und zwischen 80 und 25% Acrylsäureamid. enthalten.. Den wäßrigen Lösungen der Monomeren setzt man zuvor die üblichen Polymerisationskatalysatoren, wie Kaliumpersulfat, Wasserstoffperoxyd, Azo-bis-(isobuttersäurenitril). oder Redoxsysteme, wie K aliump ersulfat-Ascorbinsäure u. a., zu. Die Katalysatoren können auch erst dann zugegeben werden, wenn das Gewebe einige Zeit in der Monomerenlösung aufbewahrt wurde. Das Monomerengemisch polymenisiert auch ohne Zusatz von Katalysatoren im Gewebe; bei der umgebenden Lösung tritt aber dann im allgemeinen keine Polymerisation ein.
• Die Bildung von Blasen während der Polymerisation kann vermieden werden, indem man die wäßrige Lösung des Monomerengemisches vor oder nach dem Einlegen des Gewebestückes evakuiert.
• Bei Zimmertemperatur ist die Polymerisation in einigen Stunden beendet, jedoch kann man schon blei Temperaturen von 30 bis 400 eine wesentliche Beschleunigung erzielen. Durch Bestrahlung mit einer gewöhnlichen Glühlampe kann man die Polymerisation ebenfalls sehr beschleunigen, wobei eine Temperatur von 250 ausreicht. Man erhält so bereits n'aoh 5 bis 15 Minuten Bestrahlung einen gummiartigen Körper, in dem das Präparat eingebettet ist. Bei der Verwendung von Redoxsystemen, z. B. von. Kaliumpersulfat-Ascorbinsäure, kann die Polymerisation sogar unter Eiskühlung vorgenommen werden.
• Die nach dem Verfahren erhaltenen Präparate, die eine gummiartige Konsistenz besitzen, sind spätestens nach 3stündiger Aufbewahrung im Trockenschrank bei 35 bis 40° völlig erhärtet und vorzüglich schneidbar. Die Entfernung des Polymerisates -aus dem Schnitt findet in kurzer Zeit bei dem für die Elektronenmikroskopie und die Auto radiographie erforderlichen Spreiten auf einer Wasseroberfläche statt. Der Schnitt kann nun in der üblichen Weise verwendet werden, und es ist ohne weiteres möglich, Aufnahmen von Präparaten z. B. (der Augenlinse, Leber, Lunge, von Muskeln, Hefezellen und anderen Organen herzustellen.
• Die in den folgenden Beispielen genannten Teile sind Gewichtsteile.
• Beispiel I Ein Gemisch aws. 7 Teilen Aaryl!säureamid, 3 Teilen Vinylpyrrolidon und 5 Teilen Wasser wird bis zur homogenen Lösung erwärmt. In diese Lösung wird bei etwa 18° ein Gewebestück eingelegt und je nach seiner Größe 1 bis 5 Stunden belassen. Anschließend fügt man der umgebenden Lösung 0,02 Teile Kaliumpersulfat zu und bestrahlt mit einer 60-Watt-Glühlampe. Nach 5 bis 15 Minuten wird die das Gewebe umgebende Lösung zähflüssiger, worauf die Bestrahlung unterbrochen und mit Eis gekühlt wird. Im Verlauf von weiteren 3 bis 4 Minuten nimmt die Einbettungsmasse eine gummiartige Beschaffenheit an und wird sodann 1 bis 3 Stunden bei 30 bis 40° im Wärmeschrank aufbewahrt. Das Präparat ist nun schnittfähig, und es können davon Schnitte bis zu einer Dicke von 0,08 µ hergestellt werden.
• Nach Aufbringen der Schnitte auf eine Wassercherfläche oder die Oberfläche einer wäßrigen, z. B. gewebeisotoinischen Lösung ist das Polymerisat bei einer Schnittdicke von z. B. 0,2 bis 0,8 µ nach 30 Sekunden völlig aus dem Gewebe herausgelöst. Das Präparat kann nun für mikroskopische, elektronenmikroskopische und autoradiographische Zwecke verwendet werden.
• Beispiel 2 Ein Gewebestück wird mit einer Mischung aus 7 Teilen Vinylpyrrolidon, 3 Teilen Acrylsäureamid und 2 Teilen Wasser durchtränkt. Man verfährt, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhöht die Bestrahlungszeit jedoch auf 45 Minuten. Die Eigenschaften des Präparates gleichen denen des nach Beispiel 1 gewonnenen.
• Beispiel 3 Ein Gewebe wird in eine Mischung aus 7 Teilen Acrylsäureamid, 3 Teilen Vinylpyrrolidon und 5 Teilen Wasser eingelegt. Sodann wird das Präparat 3 bis 4 Stunden bei 35 bis 40° gehalten und schließlich das Gewebe, das nun eine gummiartige Beschaffenheit hat, aus der nicht polymerisierten Lösung genommen. Nach 3- bis 4stündiger Erwärmung auf 35 bis 40 im Trockenschrank ist es schnittfähig und kann, wie in Beispiel 1 angegeben, verwendet werden.
• Beispiel 4 Ein Stück menschlichen oder tierischen Gewebes wird in eine Mischung aus 6 Teilen Acrylsäureamid, 2,6 Teilen Vinylpyrrolidon und 4 Teilen Wasser eingelegt, sodann werden 0,02 Teile Kaliumpersulfat uns 0,02 Teile Ascorbinsäure zugesetzt. Das Präparat wird bis zur gummiartigen Beschaffenheit im Eisschrank belassen und schließlich 3 Stunden im Trockenschrank auf 35° erwärmt, worauf es schnittfähig ist. Die Herauslösung des Polymerisates erfolgt, wie in Beispiel 1 beschriebe.

Claims (2)

1. PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung von Schnitten histologischer Präparate, insbesondere für lichtmikroskopische, elektronenmikroskopische und autoradiographische Zwecke, dadurch gekennzeichnet, daß biologische Gewebe mit Mischungen von monomeren Verbindungen, die im menschlichen, tierischen und pflanzlichen Gewebe leicht polymerisieren, mit solchen Monomeren, die dem Mischpolymerisat Wasserlöslichkeit verleihen, in wäßriger Lösung mit oder ohne Zusatz von Polymerisationskatalysatoren getränkt und die Monomeren anschließend polymerisiert werden.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerisation durch Lichteinwirkung beschleunigt und bei niedrigen Temperaturen durchgeführt wird.