DE9002258U1

DE9002258U1 - Nitrocellulose- oder Nylonpapier für die Immundiagnose

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Publication number: DE9002258U1
Application number: DE9002258U
Authority: DE
Original assignee: LIN MAW-YEONG KAOHSIUNG TW
Current assignee: LIN MAW-YEONG KAOHSIUNG TW
Priority date: 1990-02-26
Filing date: 1990-02-26
Publication date: 1990-05-03
Anticipated expiration: 2000-02-27

Description

Nitrocellulose- oder Nylonpapier für die Immundiagnoee

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Ausrüstung bzw. einen Bausatz (nachfolgend als Ausrüstung bezeichnet) aus Nitrocellulose(NC)- oder Nylonpapier, vva die- Durchführung äex* Imnrünseruitndiagnose (ID) (immunodot biet ng serological diganosis) zu vereinfachen und ?:u beschleunigen. Durch Anwendung dieser NC-Papierausrüstung zur Durchführung der ID kann dieser· Tes*. s?*hr einfach durchgeführt werden, üa einfach nur Mehr^g-Mikropipetten, Wasserschalen, Pinzetten verv^ndet werden, ohne oaß die. Zuhilfenahme des ELISA-Waschapparats, eines; EL^TSA-Lesers oder anderer spezieller Instrumente erforderlich ist. Die Geschwindigkeit des Ablaufs der einfachen ID (1 bis 2 h) ist größer als bei den bisher verwendeten (6 bis 10 h). Die Arbeitsbelastung für den Labortechniker kann sehr stark verbessert werden.

Der Mechanismus und das Verfahren des ID-Tests ist fast das gleiche wie bei der Znzym-gebundenen Immunsorptionsrnitteluntersuchung (ELISA) (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), die ein sehr zuverlässiger, empfindlicher und informativer Test zur Durchführung der Serumdiagnose in der Veterinärmedizin ist.

Das Verfahren des ELISA-Versucns wird wie folgt beschrieben:

Eine ELISA-Platte, die 96 (8 &khgr; 12) Vertiefungen aufweist, besteht aus Polystyrol. Die Oberfläche dieser Vertiefung zeigt eine gute Fähigkeit zur Absorption von Viren, Protein oder irgendwelcher anderen immunogenetischen Materialien. Im allgemeinen werden 100 yul dieser immuno-

I genetischen Antigene, die mit einer ELI SA-Arit igen-

ic Beschichtungslosung verdünnt sind, in die Vertiefung 51

4 der ELISA-Platte 5 gegeben (wie es in Fig. 2A gezeigt

j| ist), und es wird eine Nacht lang gewartet; die Antigene

M sollten die Innenwand der Vertiefung überzogen haben (wie

ff es in Fig, 2B gezeigt ist), und die in der Vertiefung ent-

i? haltend Lösung wird ausgegosse.i (wie es in Fig. 2C gezeigt

'■ß ist). Danach wird die Vertiefung 51 dreimal mit d<=m

^; ELISA-Waschapparat gewaschen (wie es in Fig. 2D gezeigt

g ist), eine Hemm- bzw. Blockierungslösung (nachfolgend als

p Blockierungslösung bezeichnet), die nicht iü«ii>unogeneti-

⁽- sches Protein oder Serum enthält, wird der Vertiefung zugegeben, um die anderen Proteinbindungsstellen der inneren

^;: Oberfläche zu blockieren, so daß eine Wechselwirkung im nachfolgenden Verfahren dieses Tests verhindert wird.

e Danach werden die Vertiefungen drei- bis fünfmal mit der

;^; ELISA-Waschlösung gewaschen, um die anderen nicht-

f absorbierten Proteine oder Antigene zu entfernen (wie es

£ in Fig. 2F gezeigt ist).

r Danach werden 100 ^il einer verdünnten Serumprobe, die den

primären Antikörper 611 enthält, in die Vertiefung 51 • gegeben und 2 bis 2 h stehengelassen (wie es in Fig. 2G

gezeigt ist), damit der Antikörper und das Antigen vollständig reagieren, danach wird die Vertiefung 51 rtrei- bis \} fünfmal mit der ELISA-Waschlösung gewaschen, um den Uber-

&lgr; schüssigen ungebundenen primären Antikörper zu entfernen

(wie es in Fig. 2K gezeigt ist), und danach werden 100 &mgr;&idiagr; _;; eines Enzym-gebundenen sekundären Antikörperkomplexes

_u. zugegeben und 1 bis 2 h steher. ge lassen (wie es in Fig. 21

■ gezeigt 1st), damit dieser mit dem primären .Antikörper 511

reagiert. Danach wird die Vertiefung 51 dreimal mit der ELISA-Waschlösung gewaschen (wie es in Fig. 2J gezeigt ist). Schließlich werden der Vertiefung 25 &mgr;&idiagr; der Substratlösung zugegeben und 5 bis 10 min stehengelassen (wie es in Fig. 2K gezeigt ist). Am Ende des Tests werden

in die Vertiefung 51 50 ju.1 einer Unterbrecherlösung gegeben, um den Verlauf der Enzymaktivität zu unterbrechen. Das Ergebnis dieses Versuches wird mit einem teuren ELISA-Leser durch die Dichte der Farbbildung in jeder Vertiefung abgelesen.

Das obenbeschriebene ELISA-Verfahren kann in den folgenden Schritten zusammengefaßt werden:

1. Herstellung und Beschichtung des Antigens auf der Innenoberfläche der Vertiefung,eine Nacht lang;

2. Waschen der Vertiefung drei- bis fünfmal mit der ELISA-Waschlösung;

3. Blockierung der anderen Abschnitte mit aktiven Proteinbindungsstellen auf der Innenoberfläche der Vertiefung ohne Proteinadhäsion;

4. Waschen der Vertiefung drei- bis fünfmal;

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primären Antikörpers und des Antigens;

6. Waschen der Vertiefung drei- bis fünfmal;

7. Stehenlassen für die Bindungsreaktion des sekundären Antikörpers und des primären Antikörpers;

8. Waschen der Vertiefung drei- bis fünfmal;

9. Zugabe der Substratlösung und 15 min Stehenlassen;

10. Zugabe der Unterbrecherlösung;

11. Lesen der Ergebnisse mit dem ELISA-Leser.

Die Nachteile des bekannten ELISA-Verfahrens mit diesen elf Schritten sind :

1. Die Proteinadhäsion auf der ELISA-Polystyrolplatte ist gegenüber der auf dem Nitrocellulosepapier schlecht, folglich dauert das Uberzugsverfahren mit dem Antigen viel länger;

2. das ELTSA-Vfirfahren 1st insbesondere bei den Waschschritten ein sehr zeitaufwendiger Test, sie nehmen durch die Arbeit mit dem Waschapparat mindestens die 10- bis 15fache Zeit ein, und diese Arbeit ist sehr trivial;

3. zur Durchfuhrung des Versuchs sind ein teurer ELISA-Leser und teurer ELISA-Waschapparat erforderlich, somit ist die Durchführung dieses Versuchs durch die hohen Kosten der Instrumente und den Laboraufwand teuer;

4. da der Raum der bekannten ELISA-Platte viel größer als der des NC-Papiers ist, wird mehr Raum zur Gefrierauf-bewahrung oder zum Transport der mit Antigen überzogenen Platte gebraucht als beim NC-Papier;

5. das Diagnoseantigen kann mit viel mehr Punkten als bei der ELISA-Platte beschichtet werden;

6. weiterhin ist die seit kurzem handelsübliche Bio-Rad-Immunausrüstung zur Durchführung dieses Immuntests auf NC-Papier teuer, die Durchführung dieses Verfahrens ist labormäßig und gelegentlich erfolgt keine vollständige Trennung der Testserum-Probelösung.

Folglich ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes ID-Papier zu schaffen, das die obengenannten Nachteile überwindet.

Entsprechend dieser Erfindung wird diese Aufgabe durch ein ID-Papier gelöst, das ein Papier aus Nitrocellulose oder Nylcr! umfaßt, das unter seiner Rückseite mit einer Schicht eines dicken Klebstoffe Überzogen ist, an dem eine wasserbeständige Papierkarte klebt. Dieses Papier ist außerdem durch Reliefdruck bzw. Prägedruck (nachfolgend als Prägedruck bezeichnet) mit einer mit einer ständig erhabenen Druckverbindung vermischten Druckfarbe in Form einer Vielzahl von Vertiefungen bedruckt, die gleichmäßig und voneinander getrennt sind, um verschiedene Antigene aufzutragen, so daß das Vorhandensein verschiedener möglicher Krankheitsantikörper in diesem Serum durch ein Verfahren nachgewiesen werden kann.

Die beigefügten Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 eine Perspektivansicht der bekannten ELISA-Platte mit vergrößertem Querschnitt ihrer Vertiefung;

Fig. 2 das bekannte ELISA-Verfahren; und

Fig. 3 und 4 verschiedene Ausführungsformen der erfindungsgemäßen NC-Papiere zur Iinmununtersuchung.

Es folgt eine detaillierte Beschreibung der kürzlich entwickelten AusfUhrungsform dieser Erfindung. Diese Beschreibung dient nicht der Begrenzung dieser Erfindung, sondern nur der Verdeutlichung der allgemeinen Prinzipien dieser Erfindung.

Wie es in den Fig. 3 und 4 gezeigt ist, umfaßt das einfache NC-Papier zur Immununtersuchung ein Papier aus Nitrocellulose oder Nylon, das unter seiner Rückseite mit einer Schicht eines dicken Klebstoffs überzogen ist, an

dem eine wasserbeständige Karte 2 haftet. Dieses Papier ist durch Prägedruck mit einer Druckfarbe bedruckt, danach erfolgt eine Vermischung mit einer dauerhaft erhabenen Druckverbindung in den in den Fig. 3 und 4 gezeigten Formen, danach wird diese Verbindung im Ofen geschmolzen, um die Absorption der Verbindung auf dem Papier zu erleichtern.

Eine Vielzahl isolierter Vertiefungen 4, die längs und quer ausgerichtet und so angeordnet sind, daß die Diffusion der einzelnen Seren oder der Gewebeprobelösung aus einer Vertiefung in die anderen Vertiefungen und das Vermischen dieser beiden Lösungen und somit eine Störung des Ergebnisses verhindert wird, sind gleichmäßig im ID-Papier 2 angeordnet, wobei zur Bezugnahme Kennziffern und/ oder Buchstaben auf dem Rand aufgedruckt sind, wie es beim ELISA-Verfahren erfolgt.

Bei diesem Verfahren kann das erfindungsgemäße NC-Papier zur Immununtersuchung hergestellt werden, indem die Vertiefungen 4 mit verschiedenen immunogenetisehen Antigenen überzogen werden, die Vertiefungen 4 mit der ELISA-Waschlösung gewaschen werden, um das nichthaftende Antigen zu entfernen. Die Vertiefung wird mit der ELISA-Blockierungslösung behandelt, um die aktive Proteinbindungsstelle des Bodens der NC-Papiervertiefung zu blockieren, die Vertiefungen 4 werden erneut mit der ELISA-H?~chlösung gewaschen und in einen Kühlraum gebracht, der bei etwa 20⁰C gehalten wird. Danach ist das NC-Papier fertig und kann mit 50 &mgr;&idiagr; des primären Antikörpers, der in Serie durch die Lösung der Probe verdünnt ist, etwa 1 h lang in die Vertiefungen 4 betropft werden, und die in den Vertiefungen 4 verbleibenden restlichen Lösungen werder« entfernt, indem das NC-Papier 1 2 bis 3 min lang in die ELISA-Waschlösung getaucht und darin gerührt wird. Das NC-Papier wird dann lh lang in die mit Enzym gekennzeichnete sekundäre Anti-

■ ' , _t ' ' , &igr; I t « ■ « » I I C 1 I « ' J

körperlösung getaucht, danach wird die Vertiefung wieder wie oben beschrieben mit der ELISA-Waschlösung gereinigt. Danach wird das NC-Papier herausgenommen und 10 bis 30 min in die ELISA-Substratlösung getaucht. Die Diagnoseergebnisse können sofort abgelesen werden, indem die sich auf U der mit Antigen überzogenen Seite der Vertiefungen 4 K zeigende Farbdichte mit einer Reihe von Standardfarbtafeln ^ verglichen wird. ■:

Die bevorzugte AusfUhrungsform dieser Erfindung besteht in den folgenden Merkmaler:

1. Es kann eine Vielzahl der mit Antigen beschichteten und mit der Blockierungslösung behandelten NC-Papiere hergestellt werden, und diese können gebratichsfertig im Kühlraum aufbewahrt werden. Wenn das ID-Verfahren durchgeführt werden muß, können sie jederzeit zur Durchführung des Tests herausgenommen werden;

2. es kann ein HilfsInstrument verwendet werden, um die Antigene nacheinander in den Vertiefungen der NC- &iacgr; Papiere aufzubringen, damit das Antigenbeschichtungs- ■ verfahren beschleunigt wird;

3. das Waschen der Vertiefungen des NC-Papiere ist einfach, da die Papiere in die ELISA-Waschlösung getaucht und darin gerührt werden;

4. die Adhäsion der Proteine« des Antigens oder des Antikörpers auf dem ID-Papier aus Nitrocellulose oder Nylon ist besser als bei der bekannton ELISA-Polystyrolplatte, d. h. die Überzüge der Antigene auf der Bodenoberfläche des NC-Testpaplers sind fester und einfacher als bei der ELISA-Platte;

5. auf dem NC-Papier gibt es eine Vielzahl isolierter Vertiefungen zum Überziehen mit verschiedenen Antigenen, um durch ein einfaches Verfahren verschiedene mögliche Krankheits-Antikörper in diesem Serum getrennt aufzuzeigen;

6. es gibt keine gegenseitigen Wechselwirkungen zwischden Antikörper enthaltenden Seren, die in die ber^jchbarten isolierten Vertiefungen des NC-Pap.ters diffun- < -art sind, somit wird mit diesem Verfahren tin exaktes Ergebnis erzielt;

7. durch Verwendung des NC-Papiers kann das ELISA-Verfahren ohne die teuren HiIfsinstrumente, z. B. der teure ELISA-Waschapparat und der ELISA-Leser, durchgeführt werden, und

8. das NC-Papier ist sehr dünn und erfordert nur einen geringen Raum, damit wird die Lagerung im Gefrier- bzw. Kühlraum erleichtert.

Dem Fachmann wird deutlich, daß Modifikationen dieser Erfindung vorgenommen werden können, ohne vom Inhalt und Umfang dieser Erfindung abzuweichen.

Claims

• * &igr; • > I .311 < &agr; j &igr; Schutzanspriiche

1. Nitrocellulose- oder Nylonpapier sur iEj&u-untsrsuchung, gekennzeichnet durch:

(1) ein Papier aus Nitrocellulose oder Hyion,

(2) wobei das Papier unter der Rückseite mit einer Schicht eines dicken Klebstoffs Überzogen ist,

(3) eine wasserbeständige Karte, die an die Rückseite dee Papiers angekiöbt ''st, und

(4) wobei dos mit der —asSerbeständigen Karte verbundene Papier durch Prägedruck ss-t einer Druckfarbe, die mit einer dauerhaft erhabs^sr Druckverbindung vermischt iFt, in Form einer Vielzahl von gleichmäßigen und getrennten Vertiefungen bedruckt ist.

2. Nitrocellulose- oder Nylonpapier zur Iminununtersuchung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß zumindest eine Reihe von Ziffern und/oder Buchstaben auf dem Rand des Papiers aufgedruckt ist.