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Verfahren und Einrichtung zur Erzeugung eines Phasenkontrastes Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und die zugehörigen Einrichtungen zur
Erzeugung eines Phasenkontrastes insbesondere bei der Abbildung mikroskopischer
Objekte.
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Man kennt zwei 'Methoden, um unter Phasenkontrast zu beobachten; die
eine ist in der deutschen Patentschrift 636 168 und in dem Aufsatz von F. Zernike,
»Physica I«, (I934), S. 689 bis 704 dargestellt, die andere in »Journal of the Optical
Society of America 37« (I947), S. 726 bis 730 vori 1I. Osterberg beschrieben.
Es ist außerdem aus der Technik der Schlierenverfahren bekannt, das Beugungsbild
einer punktförmigen oder nahezu punktförmigen Lichtquelle teilweise durch eine Schneide
abzublenden, um auf diese Weise Inhomogenitäten eines Objekts oder Unebenheiten
einer Spiegelfläche sichtbar zu machen (vgl. auch den obengenannten Aufsatz von
Z e r n i k e) .
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Bei der erstgenannten Methode wird in der Austrittspupille eines jeden
zur Verwendung kommenden Objektivs eine Phasenplatte angebracht, die mit einer ringförmigen,
die Phase verändernden Schicht versehen ist und nach Lage und Breite zu einer ebenfalls
ringförmigen, im Kondensor des -IikroskopsbefindlichenÖffnungsblendekonjugiertist.
Die Phasenplatte hat den Zweck, den Phasenunterschied zwischen den beleuchtenden
und den im Objekt abgebeugten Strahlen zu verändern.
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Bei der zweiten -Methode, die unter dem Namen Polanretverfahren bekanntgeworden
ist, wird der Phasenunterschied durch polarisierende Hilfsmittel erzeugt.
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Durch eine besondere Ausbildung der Phasenplatte bzw. der polarisierenden
Hilfsmittel kann man außer der Phasenänderung noch eine Lichtschwächung der beleuchtenden
Strahlenbündel in der Austrittspupille des Objektivs herbeiführen.
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Durch den Eingriff, z. B. durch die Phasenplatte
nach
Z e r n i k e oder die Platte nach Osterberg wird bekanntlich die nicht absorbierende
Struktur des Objekts als Phasenkontrastbild sichtbar gemacht.
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Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird dieser Erfolg erreicht ohne
die erwähnten Hilfsmittel. Es hat ferner den Vorteil, daß man durch einfaches Hoch-
und Tiefstellen des Kondensors von der gewöhnlichen Hellfeldbeobachtung zur Phasenkontrastbeobachtung
und dann zur Dunkelfeldbeobachtung übergehen kann, so daß die drei Beobachtungsarten
unter ständiger Fixierung des Objektes ausgeübt werden können. Auch entfällt bei
Auswechslung des Objektivs das bei Verwendung einer Phasenplatte erforderliche Auswechseln
der Kondensorblende und deren Zentrierung; es genügt vielmehr, den Kondensor der
Höhe nach einzustellen.
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Das Beobachtungsverfahren nach der Erfindung besteht darin, daß man
in der Austrittspupille eines das Objekt abbildenden Objektivs ein durch Diffraktion
an der engsten Strahlenbegrenzung deutlich verbreitertes Beugungsbild einer schmalen,
ringförmigen Beleuchtungsbasis erzeugt und die dasselbe aufbauenden Lichtwellen
zur Bildung des Phasenkontrastbildes mit Hilfe von solchen Einrichtungen beeinflußt,
die in üblichen Abbildungssystemen bereits vorkommen. Die Forderung, daß die Breite
des Ringbildes in der Austrittspupille im wesentlichen durch die Diffraktion bestimmt
ist, setzt voraus, daß erstens die Beleuchtungsbasis genügend schmal ist und daß
zweitens die geometrischen Aberrationen bei der Abbildung der Beleuchtungsbasis
in die Austrittspupille genügend klein sind.
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Die zur Beeinflussung erforderlichen Mittel bestehen entweder in einer
ringförmigen und zentrierten teilweisen Abblendung des durch die Beugung verbreiterten
Bildes der Beleuchtungsbasis oder in der Änderung seiner Phase in der Weise, daß
das Beugungsbild auf diejenige Zone der Austrittspupille des Objektivs gebracht
wird, welche die gewünschte Phasenverzögerung bewirkt. Man kann auch bei Verwendung
eines Mikroskopobjektivs mit Korrektionsfassung die Wellenfläche so verändern, daß
in der benutzten Zone infolge der Aberrationen die erforderliche Phasenbeeinflussung
entsteht.
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Zur Schaffung einer schmalen, ringförmigen Beleuchtungsbasis bedient
man sich entweder eines ringförmigen Glühfadens oder beispielsweise eines Kondensors,
der unten näher beschrieben ist. Man kann auch den in der amerikanischen Patentschrift
2 130 494 beschriebenen Auflichtkondensor verwenden, falls man ihn
als Durchlichtkondensor unterhalb des Objekts anordnet. Bei diesem bekannten Kondensor
sind die reflektierenden Flächen so gekrümmt, daß sie in seiner Austrittsfläche
ein einfallendes paralleles Lichtbündel zu einer ringförmigen Brennlinie konzentrieren,
während bei sonst bekannten Dunkelfeldkondensoren das Lichtbündel im Objekt konzentriert
wird.
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Für den Fall der Anwendung von Immersionsobjektiven wird zwischen
den Kondensor und den Objektträger eine plankonvexe Saiiinielliiise eingefügt, deren
plane Seite finit dem Objektträger durch eine Immersionsflüssigkeit verbunden wird.
Diese Zwischenlinse darf an der Höheneinstellung des Kondensors nicht teilnehmen.
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In dem Aufsatz in der »Zeitschrift für Technische Physik«, 16. S.
454 bis 457 (I935) hat Zernike ausgeführt, daß das SchneidenverfalirenBilder ergibt,
die der Struktur des beobachteten Objekts unähnlich sind. Daß durch die ringförmige
Schneidenanordnung nicht bestimmte Richtungen im Bild ausgezeichnet sind wie bei
dein punktförmigen Schneidenverfahren, folgt aus der Rotationssymmetrie der Anordnung.
Darüber hinaus enthält aber die Erfindung die neue Erkenntnis, daß bei Verwendung
der ringförmigen Schneidenanordnung die Hell-Dunkel-Verteilung im Bild diejenige
eines Phasenkontrastbildes ist. Der Phasenkontrast ist positiv oder negativ, je
nachdem das Beugungsbild der Beleuchtungsbasis von innen oder von außen abgeblendet
wird.
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In der Zeichnung sind zur Ausübung des erfindungsgemäßen Verfahrens
geeignete Einrichtungen beispielsweise dargestellt, und zwar zeigt Fig. i ein Mikroskop
mit der erfindungsgemäßen Einrichtung, teilweise im Schnitt, den Tubus unterbrochen,
Fig. 2 bis 6 den Kondensor aus Fig. i in verschiedenen Gebrauchsstellungen.
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Das Mikroskop üblicher Bauart besteht aus dem nur teilweise gezeigten
Fuß i, dein ebenfalls nur teilweise gezeigten Oberteil e mit Scharfstellvorrichtung
3, Tubus 4, Objekttisch 5 und Beleuchtungsapparat 6. Letzterer kann insgesamt mittels
Zahntrieb 7, 8 in der Höhe eingestellt «-erden. Über dem Spiegel 9 ist die aus der
Kollektorlinse io und dem Kondensor i i bestehende Beleuchtungsoptik angeordnet.
Der Kondensor i i ist in seiner Fassung 12 mittels Zahntrieb 13, 13"
gegenüber der Kollektorlinse io in Richtung der bptischen Achse verstellbar. Der
Kondensor i i kann außerdem durch die in Fig. i a dargestellte Linse i ia ergänzt
werden, wie in Fig. 3 zu sehen. Auf dem Tisch 5 befindet sich der Objektträger i_5
und darüber im Arbeitsabstand von den am Revolver 16 sitzenden Objektiven 17 und
18 das Objektiv 17. Am oberen Ende des Tubus ,4 ist das Okular i9 eingeschoben.
Das Objektiv 17 besteht im wesentlichen aus drei Linsengruppen 17a, 17b, 17E und
der in der hinteren 17E Brennebene liegenden Austrittspupille 17d. Mit ist eine
Blende bezeichnet.
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Die für die Aufhellung des Objekts 15 bestimmten Beleuchtungsstrahlen
werden über den Spiegel 9 der Kollektorlinse io zugeführt, die dieselben leicht
konvergierend zum Kondensor i i weiterleitet. Die aus dem Kondensor austretenden
Strahlen hellen dann das Objekt 15 auf, das durch Objektiv 17 und Okular i9 abgebildet
wird.
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In den Fig. 2 bis 6 ist der Kondensor i i in verschiedenen Anwendungen
dargestellt, und zwar in den Fig. 2, 4, 6 mit demselben Objektiv 17, das eine mittlere
Brennweite haben möge, in der Fig. 3 mit einem kurzbrennweitigen Immersionsobjektiv
und
in der Fig. 5 finit einem schwachen, langbrennweitigen Objektiv
18. Diese drei Objektive sind jeweils mir durch ihre Frontlinse 17a, 25a und 18°
angedeutet, weil der Objektivaufbau an sich bekannt, und die Lage des Beugungsbildes
der Basis zur Austrittspupille eines jeden Objektivs der Darstellung in Fig. i analog
ist.
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Der Kondensor i i ist dem Aufbau nach ein bekannter Dunkelfeldkondensor.
Seine Abmessungen sind jedoch kleiner als die der meist gebräuchlichen Kondensoren,
so daß seine ringförmige Austrittsfläche 21 vollständig in der Austrittspupille
des Objektivs abgebildet wird, wenn der Kondensor sich in der Stellung (hig. 4)
für Phasenkontrast befindet.
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Wenn in der Eintrittsfläche 2o des Kondensors ein Gemisch von Strahlen
verschiedener Richtungen eintritt, so wird ein Teil dieser Strahlen zurückreflektiert
oder absorbiert, die anderen Strahlen verlassen den Kondensor in zwei voneinander
getrennten Bündeln, deren eines, das in Fig.2 mit 22 bezeichnet ist, zur Dunkelfeldbeleuchtung
dient, während das Bündel 23 je nach der Höhenstellung des Kondensors zur Phasenkontrastbeleuchtung
oder zur IIellfeldbeleuchtung dient.
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In Fig. 2 ist dargestellt, daß das zur Dunkelfeldbeleuchtung dienende
Bündel 22 innerhalb des Kondensors zweimal reflektiert und im Objekt 15 konzentriert
wird. Die Fig. 3 bis 6 zeigen, daß das andere Bündel 23 durch dreimalige Reflexion
entsteht und in der ringförmigen Beleuchtungsbasis konzentriert wird. Dieses Bündel
verläßt den Kondensor in allen Höhenlagen des Kondensors divergent und in demselben
Öffnungswinkel. Damit dieses Bündel voll zur Wirkung kommt, sind, wie in den Figuren
durch dickere Linien dargestellt, die Flächen an den das zweite Bündel reflektierenden
Stellen verspiegelt mit Ausnahme der Eintrittsfläche 20.
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In der dem Objekt 15 nahen Stellung des Kondensors i i, entsprechend
der Fig. 2, kommt nur das Strahlenbündel 22 zur Wirkung, so daß das Objekt 15 im
Dunkelfeld gesehen wird. Senkt man nun den Kondensor i i durch Drehen am Trieb 13
etwa in die Stellung nach Fig. ,4 ab, so wird das Objekt 15 von dein Büschel 23
beleuchtet, aus dem die Frontlinse 17a den Bereich 23a aufnimmt, der in der Figur
schraffiert ist. Es ist dies das Büschel, das in der Austrittspupille 17d des Objektivs
17 das Bild der Beleuchtungsbasis 24 in der zur Erzeugung des Phasenkontrastes richtigen
Lage entwirft.
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Senkt man den Kondensor i i noch weiter ab, und zwar in die Stellung
der Fig. 6, so wird ein anderer Bereich 23b des Büschels 23 von der Frontlinse
17a aufgenommen, wodurch das Bild der Basis vom Rand der Austrittspupille 17d nach
innen wegrückt, so daß ein reines Hellfeldbild entsteht.
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In der Fig.3 wird gezeigt, daß das Phasenkontrastverfahren mit dem
gleichen Kondensor i i auch bei Immersionsobjektiven ausgeübt werden kann, wenn
man die Linse i ja vorschaltet und diese mit dem Objektträger 14 durch eine Immersionsflüssigkeit
verbindet. Der Kondensor i i muß dann gegenüber der Stellung in Fig. 4 angehoben
werden. Aus dein gesamten Büschel wird der Bereich 23c von der Frontlinse 25a aufgenommen,
wodurch dann ebenfalls das Bild der Basis 24 in der richtigen Lage zur Austrittspupille
dieses Objektivs hervorgerufen wird.
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Schließlich zeigt die Fig. 5, daß nach Einschalten des schwach vergrößernden
Objektivs 18 der Kondensor i i sehr stark abgesenkt werden muß, um das Bild der
Basis in die richtige Lage zur Austrittspupille des Objektivs 18 zu bringen. Von
der Frontlinse wird darin der Bereich 23e aufgenommen.
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Durch entsprechende Höheneinstellung des Kondensors i i können auch
mit den Objektiven der Fig.3 und 5 Dunkelfeld- und reine Hellfeldbeobachtungen vorgenommen
werden. Lediglich zur Übersichtlichkeit der Darstellung sind die entsprechenden
Einstellungen des Kondensors nicht abgebildet.