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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen automatischen chemischen
Analysator zum Bestimmen von flüssigen
biologischen Proben. Insbesondere gibt die vorliegende Erfindung
ein Verfahren an, um vor einer endgültigen chemischen Analyse der
Probe zu bestimmen, ob ein bestimmter Grad der Mischungsgleichmäßigkeit
zwischen flüssigen Laborreagentien
und einer Patientenprobe erreicht wurde.
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Hintergrund der Erfindung
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Im
analytischen und diagnostischen Bereich besteht die Notwendigkeit,
flüssige
Laborreagentien und eine Patientenprobe während und vor der chemischen
Analyse gleichmäßig miteinander
zu mischen, und es ist bekannt, dass Ultraschallenergie verwendet
werden kann, um erfolgreich für
ein solches Mischen zu sorgen. Die Quelle der Ultraschallenergie ist
typischerweise eine Sonotrode, ein relativ längliches Element, das infolge
einer Umwandlung eines elektrischen Anregungssignals in eine mechanische Schwingung
mit einer Ultraschallfrequenz schwingt. In der Anwendung wird die
Ultraschallenergie in eine Reaktionskammer eingekoppelt, die das
oder die flüssigen
Laborreagentien und die Patientenprobe in einer zu mischenden Lösung enthält, was
zur Erzeugung von Zonen mit relativ hoher Schallenergie innerhalb
der Zusammensetzung führt.
Leider hat die Erfahrung gezeigt, dass das Ultraschallmischen einer
solchen Zusammensetzung aus verschiedenen Gründen, zu denen zu wenig Energie,
eine zu kurze Mischzeit oder ein unzweckmäßig geformtes Mischgefäß gehören, unzureichend
sein kann. In diesen Fällen
kann unzureichendes Mischen zu Zonen der Ungleichmäßigkeit
innerhalb der zu analysierenden flüssigen Lösung (Probe und Reagentien)
führen und während der
chemischen Analyse einen unerwünschten
Grad der Ungenauigkeit einführen.
Ein Ansatz zur Lösung
dieses Problems besteht darin, das Ultraschallmischen während einer
Zeitdauer durchzuführen,
die größer ist
als die Minimalzeit, die zum Erreichen des gewünschten Grades der Gleichmäßigkeit
vorbestimmt ist, doch hat ein solcher Ansatz einen nachteiligen
Einfluss auf den Durchsatz. Dementsprechend wäre es vorteilhaft, ein Verfahren anzugeben,
um zu bestimmen, ob die auf eine Lösung innerhalb eines Gefäßes angewendete
Mischungsenergie zu der gewünschten
Gleichmäßigkeit
des Mischens der Probe mit flüssigen
Reagentien geführt
hat. Wenn nicht, können
dort Zonen mit nichthomogener Lösung
verbleiben, und in diesem Fall kann das Bedienpersonal alarmiert
werden, um einen ansonsten nicht nachweisbaren nachteiligen Einfluss
auf die Genauigkeit einer angegebenen Probenanalyse zu verhindern.
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US 4,612,289 offenbart ein
Verfahren zum Analysieren einer flüssigen Probe zur quantitativen Bestimmung
eines in der Probe enthaltenen Analyten, das Folgendes umfasst:
- (1) einen Schritt des Messens einer Lichtintensität der flüssigen Probe,
bevor man die flüssige
Probe eine Reaktion zur Bestimmung eines Extinktionswerts (L) eingehen
lässt;
- (2) einen Schritt des Hinzufügens
von Reagens zu der flüssigen
Probe, wodurch die Reaktion zur Bestimmung des Analyten eingeleitet
wird, und dann des Messens der Lichtintensität des resultierenden flüssigen Gemischs
in mehreren Wiederholungen;
- (3) einen Schritt des Berechnens eines effektiven Grenzwerts
(L) aus dem im Messschritt (1) erhaltenen Extinktionswert (Ls) und einem auf dem Reagens beruhenden Extinktionswert
(Lt); und
- (4) einen Schritt des Berechnens eines Analysewerts des gewünschten
Analyten während
eines vorbestimmten Zeitintervalls, nur bis die Messwerte in Schritt
(2) den effektiven Grenzwert erreicht haben.
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Die
vorliegende Erfindung gibt ein Verfahren an, um zu bestimmen, ob
ein gewünschter
Grad der Mischungsgleichmäßigkeit
von chemischen Reagentien und einer flüssigen Probe erreicht wurde,
indem man eine erste Lichtmenge misst, die absorbiert wird, wenn
das Licht eine vorbestimmte Zeitspanne vor der Durchführung einer
endgültigen
Probenanalysemessung durch ein Gefäß tritt, das eine gemischte
Lösung
der Probe und des Reagens enthält.
Die erste absorbierte Lichtmenge wird mit einer zweiten Lichtmenge
verglichen, die absorbiert wird, wenn das Licht zu einem Zeitpunkt
durch das Gefäß tritt,
wenn eine endgültige
Probenanalysemessung durchgeführt
wird. Es hat sich Folgendes gezeigt: Wenn das Verhältnis zwischen
der ersten und der zweiten Menge des absorbierten Lichts größer ist
als ein vorbestimmter Prozentwert, hat ein ausreichendes Mischen
der Probe stattgefunden. Insbesondere gibt die Erfindung ein Verfahren
zur Bestimmung des Grades der Mischungseffizienz einer flüssigen Lösung in
einem Reaktionsgefäß in einem
chemischen Analysator an, wobei das Gefäß wenigstens ein Reagens sowie
eine flüssige
Probe, die eine kinetisch kontrollierte Reaktion zwischen diesen
aufrechterhalten kann, enthält,
wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
Messen einer ersten
Lichtmenge, die innerhalb der Lösung
absorbiert wird, zu einem ersten Zeitpunkt, nachdem die Reaktion
beginnt;
Messen einer zweiten Lichtmenge, die innerhalb der Lösung absorbiert
wird, zu einem zweiten Zeitpunkt bei Beendigung der Reaktion;
dadurch
gekennzeichnet, dass das Verfahren weiterhin Folgendes umfasst:
Bestimmen,
dass das Mischen ausreichend gleichmäßig ist, wenn das Verhältnis zwischen
der ersten und der zweiten gemessenen Menge an absorbiertem Licht
größer ist
als ein vorbestimmter Wert; oder
Bestimmen, dass das Mischen
nicht ausreichend gleichmäßig ist,
wenn das Verhältnis
zwischen der ersten und der zweiten gemessenen Menge an absorbiertem
Licht kleiner ist als ein vorbestimmter Wert.
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Kurzbeschreibung der Figuren
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1 ist
eine schematische Draufsicht auf einen automatischen Analysator,
bei dem die vorliegende Erfindung mit Vorteil angewendet werden kann.
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2 ist
eine graphische Darstellung eines analytischen Endpunktassays des
ersten Typs, der analytisch ausreichendes Mischen aufweist.
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3 ist
eine graphische Darstellung eines analytischen Endpunktassays, der
analytisch unzureichendes Mischen aufweist.
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4 ist
eine graphische Darstellung von Signalabsorptionsverhältnissen,
die für
ein ausreichendes Mischen der Probe und der Reagentien, das beispielhaft
für die
vorliegende Erfindung für
den Assay von 2 ist, typisch sind.
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5 ist
eine graphische Darstellung von Signalabsorptionsverhältnissen,
die für
ein unzureichendes Mischen der Probe und der Reagentien, das beispielhaft
für die
vorliegende Erfindung für
den Assay von 3 ist, typisch sind.
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6 ist
eine graphische Darstellung von Ereignissen in einem zweiten Typ
von analytischem Endpunktassay, der analytisch ausreichendes Mischen
aufweist.
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7 ist
eine graphische Darstellung von Ereignissen in einem zweiten Typ
von analytischem Endpunktassay, der analytisch unzureichendes Mischen
aufweist.
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8 ist
eine graphische Darstellung von Signalabsorptionsverhältnissen,
die für
ein ausreichendes Mischen der Probe und der Reagentien, das beispielhaft
für die
vorliegende Erfindung für
den Assay von 6 ist, typisch sind.
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9 ist
eine graphische Darstellung von Signalabsorptionsverhältnissen,
die für
ein unzureichendes Mischen der Probe und der Reagentien, das beispielhaft
für die
vorliegende Erfindung für
den Assay von 7 ist, typisch sind.
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Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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1 zeigt
schematisch die Elemente eines herkömmlichen automatischen chemischen
Analysators
10, der Folgendes umfasst: ein Probengefäßkarussell
12,
das eine Menge von Probengefäßen
14 trägt, ein
Küvettenkarussell
16,
das geeignet ist, eine Menge von Reaktionsgefäßen oder Küvetten
18 aufzunehmen,
und eine Menge von Reagensflüssigkeitskartuschen
20,
die so gezeigt sind, wie sie sich unterhalb eines ausgeschnittenen
Teils eines Deckels
22 befinden, der verschiedene temperierte
Bereiche abdeckt. Bei den Reagenskartuschen
20 handelt
es sich vorzugsweise um einen Behälter mit mehreren Kammern,
wie solche, die von Dade Behring Inc., Newark, DE, unter dem Handelsnamen FLEX
TM vertrieben werden. Die Reaktionsküvetten
18 werden
durch Herausziehen von zwei Bändern
aus klarer Folie mit unterschiedlicher Zusammensetzung aus einer
Küvettenfolienpatrone,
die nicht gezeigt ist, auf den Rand des Küvettenkarussells
16 gebildet. Das
Küvettenkarussell
16,
das vorzugsweise in Form eines Rades vorliegt, weist etwa hundert
getrennte Küvetten
18 auf,
wobei die Innenwand jeder Küvette
18 eine Öffnung hat,
um den Durchtritt von Licht zu ermöglichen. Auf der Oberseite
der Küvette
18 bleibt eine
kleine Öffnung
frei, um die Zugabe von Reagensflüssigkeit und Probenflüssigkeit
zu ermöglichen.
Ein Probenflüssigkeitsarm
24 und
ein Waschhilfsmittel
26 befinden sich in der Nähe des Probengefäßkarussells
12 und
des Küvettenkarussells
16. Der
Probenflüssigkeitsarm
24 trägt einen
herkömmlichen
Probenflüssigkeitskopf
28 und
einen Ultraschallmischmechanismus
30 und ist auf einer
drehbaren Welle montiert, so dass die Bewegung des Probenflüssigkeitsarms
24 einen
Bogen beschreibt, der die drei Komponenten
14,
18 und
26 schneidet. Einzelheiten
sind im
US-Patent 4,863,693 der
Anmelderin zu finden.
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Ein
Flüssigkeitsreagensarm 25 ist
oberhalb des Küvettenkarussells 16 so
montiert, dass er eine Drehbewegung relativ dazu ausführen kann,
so dass es möglich
ist, den Reagensarm 25 zufällig auf jeder ausgewählten Winkelposition
oberhalb des Küvettenkarussells 16 anzuordnen.
Der Flüssigkeitsreagensarm 25 trägt auch
einen herkömmlichen
Reagensflüssigkeitskopf 27,
der geeignet ist, Reagensflüssigkeit
aus einer geeigneten Reagensflüssigkeitskartusche 20 zu saugen
und Reagensflüssigkeit
innerhalb einer vorbestimmten Küvette 18 zu
deponieren. Der Kopf 27 umfasst weiterhin einen Ultraschallmischmechanismus 31,
der zum Hydratisieren, Aufsaugen, Ausgeben und Mischen von Reagentien
verwendet wird. Jeder der Ultraschallmischmechanismen 30 und 31 beinhaltet
einen Sonotrodenteil mit einer länglichen
Form und ein dazugehöriges
Paar von piezoelektrischen Kristallen und geeignete Elektronik.
Die Schwingungsfrequenzen werden so eingestellt, dass sie mit der
natürlichen
Parallelresonanzfrequenz der Ultraschallmechanismen 30 und 31 zusammenfallen. Einzelheiten
der Konstruktion der Mischer sind in der Technik bekannt und umfassen
typischerweise einen piezoelektrischen λ/2-Ultraschallprobensignalwandler,
der durch O-Ringe in den Reagensarm 25 und den Probenarm 24 montiert
ist, und eine λ/2-Spitze, die
durch eine Koppelmutter am Signalwandlerkörper befestigt ist. Die Spitze
und der Signalwandlerkörper enthalten
einen axialen Flüssigkeitsdurchlass,
der in einem rechtwinkligen Rohrverschraubungsanschluss im Signalwandlerkörper austritt.
Ein Paar von Motoren kann eingesetzt werden, um den Reagensarm 25 zu
drehen und ihn vertikal zu verschieben, so dass der Reagensarm 25 Zugang
zu jeder der Küvetten 18 haben
kann.
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Zur
Durchführung
der Ultraschallmischfunktionen werden piezokeramische Scheiben,
die zum Beispiel piezoelektrische Bleizirconattitanat(PZT)-Keramikscheiben
umfassen, werden elektrisch so betrieben, dass sie die Mischanordnung 30 zum
Schwingen bringen. Der Signalwandler, die Mutter und die Spitze
bilden eine aufeinander abgestimmte mechanische Anordnung, die so
ausgebildet ist, dass sie mit einer Frequenz in der Nähe ihrer
natürlichen
Longitudinalschwingungsfrequenz schwingt. Der elektronische Antriebsschaltkreis,
der an diesen Signalwandler angepasst ist, ist so ausgebildet, dass
er die natürliche
Longitudinalschwingungsfrequenz der Anordnung zur Resonanz bringt, und
verwendet eine Phasenrückkopplungsschleife, um
die Resonanzfrequenz aufrechtzuerhalten. Die Werte der Antriebsspannung
werden so gewählt, dass
man Spitzenschwingungsamplitudenwerte erhält, und diese werden durch
die piezoelektrische Konstante und die Kapazität der piezokeramischen Scheiben
bestimmt, zum Beispiel wird eine Antriebsspannung im Bereich von
300 bis 400 Volt verwendet, um eine Maximum-zu-Maximum-Spitzenschwingungsamplitude
von 51 bis 76 μm (2
bis 3 mil) zu erhalten, wobei die beispielhaften PZT-Scheiben eine piezoelektrische
Konstante im Bereich von etwa 200 × 10–9 m/V
und eine Kapazität
von etwa 1250 pF aufweisen, gemessen bei einer Frequenz von 1 kHz.
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Eine
Reaktionsüberwachungsvorrichtung
32,
wie ein Photometer, befindet sich unterhalb des Küvettenkarussells
16 und
ist an einem herkömmlichen
Antriebsmotor so montiert, dass sie eine unabhängige Drehbewegung relativ
dazu ausführen
kann. Die Reaktionsüberwachungsvorrichtung
32 umfasst typischerweise
eine Quelle für
einen Lichtstrahl, verschiedene Linsen, eine durch einen geeigneten
Antriebsmotor angetriebene Filterradanordnung und einen Photodetektor,
der neben dem äußeren Rand
einer Küvette
18 montiert
ist. Vorzugsweise wird ein System eingesetzt, wie es im
US-Patent Nr. 5,128,103 der
Anmelderin beschrieben ist. Ein abfragender Lichtstrahl tritt durch
die verschiedenen Linsen und wird durch einen ausgewählten Filter
im Rad fokussiert und dann mittels eines Spiegels durch die Innenwand
jeder Küvette
18 auf
den Photodetektor gerichtet. In einer kommerziell erhältlichen
Ausführungsform
werden zehn Filter bereitgestellt, die nominelle Strahlungstransmissionen,
die innerhalb von ±3 nm
auf den Wellenlängen
293, 340, 383, 405, 452, 510, 540, 577, 600 und 700 nm zentriert
sind, und Bandbreiten auf halber Signalhöhe von weniger als 12 nm aufweisen.
Die vom Photodetektor erzeugte Spannung ist direkt proportional
zur Menge der einfallenden Strahlung bei der filtrierten Wellenlänge.
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Wegen
der beschriebenen Konstruktionsbeziehung ist das Instrument 10 gemäß der vorliegenden
Erfindung vorteilhafterweise in der Lage, die Lichtextinktion, die
bei verschiedenen Wellenlängen während des
Durchgangs von Licht durch das in der Reaktionsküvette 18 enthaltene
Reaktiuonsfluid auftritt, zu messen, wodurch die Reaktion überwacht wird,
die in jeder Küvette 18 stattfindet,
welche sich auf irgendeinem vorbestimmten Punkt auf dem Küvettenkarussell 16 befindet.
So kann zu jedem Zeitpunkt während
des Assayvorgangs, einschließlich vor
der Zugabe von Reagensflüssigkeiten
zur Küvette 18,
nach der Zugabe von Reagensflüssigkeiten
zur Küvette 18,
nach der Zugabe von Probenflüssigkeiten
zu der flüssige
Reagentien enthaltenden Küvette 18,
während
des Mischens von Reagens und Probenflüssigkeiten innerhalb der Küvette 18,
die Lichtextinkti on, die als Ergebnis einer chemischen Reaktion
auftritt, photometrisch bestimmt werden, und zwar neben der Lichtextinktion,
die zu einem Zeitpunkt bestimmt wird, wenn die Lösung innerhalb der Küvette 18 ein
vorbestimmtes finales Endpunktstadium erreicht. Bei der Herstellung
solcher photometrischer Messungen misst die Reaktionsüberwachungsvorrichtung 32 die
resultierende Extinktion oder Trübung
der Lösung,
die in der Küvette 18 enthalten
ist, unter Verwendung wohlbekannter analytischer Verfahren. Die
photometrischen Ablesungen werden an einen Computer übermittelt,
wo die Ablesungen unter Verwendung wohlbekannter Techniken in Analytenkonzentrationseinheiten
umgerechnet und angezeigt oder aufgezeichnet werden können.
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Eine
Kombination von Flüssigkeiten,
im Allgemeinen Probe und Reagens plus andere Flüssigkeiten, die gleichmäßig gemischt
werden sollen, können
mit Hilfe des Probenarms 24 bzw. des Reagensarms 25 in
die Küvette 18 eingeführt werden.
Am häufigsten
wird eine Reagensflüssigkeitslösung anfangs
mit Hilfe eines Reagenskopfs 27 in eine Küvette 18 ausgegeben
und gemischt, wobei man Ultraschallenergie verwendet, die von dem
Ultraschallmechanismus 31 bereitgestellt wird, der am Reagensarm 25 befestigt
ist, während
der Reagensarm 25 in die Küvette 18 abgesenkt
wird. Durch die Betätigung des
Ultraschallmechanismus 31 wird Ultraschallenergie in die
Lösung
innerhalb der Küvette 18 eingeführt und
richtet die Energie im Wesentlichen axial zur Küvette 18 unter Erzeugung
eines Bereichs mit relativ hoher Ultraschallenergie innerhalb der
Küvette 18,
in den die zu mischenden Flüssigkeiten
eingeschlossen sind. Die Ultraschallenergie kann kontinuierlich
oder in Schüben
mit einer relativ konstanten oder variablen Frequenz angewendet
werden.
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Anschließend an
das Mischen des Reagens innerhalb der Küvette 18 wird eine
Probenflüssigkeitslösung unter
Verwendung des Probenkopfs 28 in die Küvette 18 ausgegeben
und gemischt, wobei man Ultraschallenergie verwendet, die von dem
Ultraschallmechanismus 30 bereitgestellt wird, der am Probenarm 24 befestigt
ist. Durch die Betätigung
des Ultraschallmechanismus 30 entsteht innerhalb der Küvette 18 ein ähnlicher
Bereich mit hoher Ultraschallenergie, in den die zu mischenden Flüssigkeiten
eingeschlossen sind. Infolge der Beschrän kung der Probe und der Reagentien
auf die energiereiche Zone, wird ein Hochgeschwindigkeitsmischen
der Flüssigkeiten
aufgrund der Anwendung von Ultraschallenergie erreicht. Zeiten zum
Mischen der Probe und der Reagentien von weniger als einer Sekunde
sind möglich.
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Im
Falle von Endpunktsreaktion-Analysemesstechniken hat sich gezeigt,
dass die ausreichende Gleichmäßigkeit
des Ultraschallmischens zum Erreichen von analytisch korrekten Messergebnissen
bestimmt werden kann, indem man die Reaktionsextinktion (RA) zu
einem Zeitpunkt, an dem etwa 50–70%
der Reaktionszeit abgelaufen sind, zu der Reaktionsextinktion zu
einem späteren
Endzeitpunkt in Bezug setzt, wenn die Reaktion beendet ist, ein Zeitpunkt,
der allgemein als Reaktionsendpunkt bekannt ist. Bei solchen Endpunktstechniken
wird typischerweise die Anwesenheit eines Markers überwacht,
der eine Konzentration aufweist, die mit der Analytenkonzentration
zusammenhängt,
oder man überwacht
die photometrischen Absorptionseigenschaften des Analyten, während der
Analyt aufgrund der Anwesenheit eines Enzyms oder dergleichen in eine
nicht photometrisch absorbierende Spezies umgewandelt wird. Der
Marker wird während
einer chemischen Reaktion zwischen einer Probe, von der man annimmt,
dass sie einen Analyten enthalten könnte, und verschiedenen Reagentien
erzeugt. Es ist entscheidend, eine ausreichende Gleichmäßigkeit des
Mischens zwischen Probe und den Reagentien herzustellen, da sonst
die Menge des Markers oder das Ausmaß der Umsetzung zu einer nichtabsorbierenden
Spezies die in der Probe vorhandene Menge des Analyten möglicherweise
nicht korrekt wiedergibt. Die folgenden beiden Beispiele veranschaulichen
die vorliegende Erfindung.
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Ein
erstes beispielhaftes Beispiel für
diese Technik zur Überprüfung der
Gleichmäßigkeit
des Mischens beinhaltet einen Assay, bei dem die Absorption während des
Messvorgangs zunimmt, einen Assay, der allgemein als "positiver Absorptionsassay" bekannt ist. Ein
Beispiel für
einen solchen "positiven Absorptionsassay" ist eine Messung
zur Bestimmung der Menge an Glucose in einer Probe unter Verwendung
eines Verfahrens, bei dem Enzyme eingesetzt werden, um die Spezifität zu erhöhen, typischerweise unter
Verwendung von entweder Glucose- Oxidase- oder
Hexokinase-Reaktionen. Das Hexokinaseverfahren beinhaltet zwei miteinander
gekoppelte Reaktionen, bei denen Hexokinase die Phosphorylierung von
Glucose durch Adenosin-5'-triphosphat
(ATP) zu Glucose-6-phosphat katalysiert, das durch Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
(G-6-PDH) unter gleichzeitiger Reduktion von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat
(NADP) zu 6-Phosphogluconolacton oxidiert
wird. NAADP wird zu NADPH reduziert, und die Glucosekonzentration
wird mit Hilfe einer bekannten bichromatischen Endpunkttechnik bestimmt.
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In
einem solchen beispielhaften Assay, der in 2 gezeigt
ist, beginnen die analytischen Messungen mit einer anfänglichen
RAt1-Ablesung der Extinktion durch eine Küvette 18 zum Zeitpunkt
t1 vor der Einführung
von Flüssigkeiten
und Reagentien, so dass man ein Paar von "Grundlinien"-Reaktionsextinktionsmessungen RA erhält, die
bei zwei Wellenlängen λ1 und λ2 durchgeführt werden,
wobei die erste Wellenlänge λ1 so gewählt wird,
dass sie charakteristisch für
das markierte Nebenprodukt der Reaktion der Probe und der Reagentien
innerhalb der Küvette 18 ist,
und die zweite Wellenlänge λ2 so gewählt wird,
dass sie charakteristisch für
Küvette 18 und
potentiell störende
Substanzen innerhalb der Küvette 18 und/oder
Diskrepanzen der optischen Messung, die zwischen der Lichtquelle,
der Küvette
und den Photodetektoren existieren können, ist. Die zweite Wellenlänge λ2 ist allgemein
auch als "Blindwellenlänge" bekannt und ist
in erster Linie charakteristisch für das eingesetzte analytische
System. In diesem beispielhaften Beispiel beträgt für eine Glucoseanalyse unter
Verwendung von NADPH als Marker die erste Wellenlänge λ1, die so
gewählt
wird, dass sie der Reaktion zuzuordnen ist, bekanntermaßen etwa
340 nm, und die zweite Wellenlänge λ2 wird so gewählt, dass
sie eine Extinktion anzeigt, die nicht mit dem Analyten zusammenhängt, typischerweise bei
etwa 383 nm. Das hier verwendete Symbol RAtn steht für die Differenz
zwischen einer Reaktionsextinktionsmessung RAtn(λ1), die bei λ1 gemessen wird, und einer Reaktionsextinktionsmessung RAtn(λ2), die bei λ2 gemessen
wird, wobei t den Zeitpunkt der jeweiligen Messung identifiziert.
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Wenige
Sekunden nach t1, gewöhnlich
zwischen 10 und 30 Sekunden später,
zu einem Zeitpunkt tr werden bekannte Volumina von Reagentien und
gereinigtem Wasser in die Küvette 18 eingeführt. 2 zeigt
die Wirkung auf die überachte
Reaktionsextinktion als scharfer Anstieg zum Zeitpunkt der Zugabe
der Reagentien und des Wassers. Im Falle von Assays mit einer kinetisch
kontrollierten Geschwindigkeit bewirkt Ultraschallmischen bekanntermaßen einen
hohen Grad der Gleichmäßigkeit
des Mischens. Es wurde experimentell bestimmt, dass das Ultraschallmischen
von Reagens und Wasser unter Verwendung eines Ultraschallmischers 31 mit
einer herkömmlichen
Struktur, wie der oben beschriebene, unter Verwendung von gepulsten
Anwendungen von Ultraschallenergie analytisch korrekte Ergebnisse
liefert. Typischerweise wird Ultraschallmischen über einen Zeitraum von etwa
einer Sekunde in einer gleichmäßig beabstandeten
Reihe von zehn 30-ms-Pulsanwendungen von Ultraschallenergie unter
Verwendung eines Spannungswerts von 325 Volt (Wechselstrom) mit
Stromzufuhr durch ein selbstresonantes Stromquellennetzwerk durchgeführt.
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Dann
erfolgt eine Probenzugabe in die Küvette 18 zum Zeitpunkt
ts etwa 30 Sekunden nach t2 unter Verwendung des Probenkopfs 28,
wie es in 2 gezeigt ist, wobei der Probenkopf 28 einen
Ultraschallmischer 30 mit einer herkömmlichen Struktur, wie sie
oben beschrieben wurde, unter Verwendung von gepulsten Anwendungen
von Ultraschallenergie umfasst, die so bestimmt wird, dass analytisch korrekte
Ergebnisse entstehen. Die Wirkung auf die Reaktionsextinktion RA
in einem "positiven
Absorptionsassay" wird
nach Zugabe der Probe zu dem oder den zuvor gemischten Reagentien
und Wasser als zunehmende photometrische Absorption beobachtet. In
Assays, die durch kinetische Prinzipien reguliert werden, folgt
nach der Probenzugabe ein Mischen mit gepulstem Ultraschall. Bei
kommerziellen Anwendungen einer solchen Glucoseanalyse wird nach
der Probenzugabe die Proben-Reagentien-Wasser-Lösung
mittels Ultraschall unter Verwendung des Ultraschallmischers 30 während eines
Zeitraums von etwa einer halben Sekunde in einer gleichmäßig beabstandeten
Reihe von fünf
40-ms-Pulsanwendungen von Ultraschallenergie unter Verwendung eines Spannungswerts
von 375 Volt gemischt. Wenn er bei etwa 375 Volt betrieben wird,
kann die durchschnittliche Leistung, die von dem Ultraschallmischmechanismus 30 aufgenommen
wird, aus Spannungs- und Stromdaten zu etwa 3 Watt bestimmt werden,
so dass während
eines zyklischen Betriebs mit 100% Auslastung über einen Zeitraum von 0,5
Sekunden etwa 1,5 Joule Energie an den Ultraschallmischer 30 abgegeben
werden. Messungen, die in Bezug auf die Wärmemenge durchgeführt werden,
die unter Verwendung des Ultraschallmischers 30 auf die
Flüssigkeit
innerhalb einer Küvette 18 übertragen
wird, zeigen an, dass etwa 30% der gesamten Energie innerhalb von
internen Teilen des Ultraschallmischers 30 verbraucht werden
und dass etwa 60% der Gesamtenergie auf die Flüssigkeit übertragen wird. Eine zweite
Extinktionsmessung RAt2, die der Küvette 18 plus den
hinzugefügten
Reagentien und Wasser zugeordnet werden kann, wird zum Zeitpunkt
t2 bei den beiden bichromatischen Wellenlängen λ1 und λ2 durchgeführt.
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Nach
diesem Mischen erfolgt eine Endpunkt-Reaktionsextinktionsmessung
RAt3, die der Küvette 18 plus
den Assayreagentien und Wasser und der Probe zugeordnet werden kann,
von der empirisch bestimmt werden kann, dass sie ausreicht, um eine
vollständige
Beendigung der Reaktion zu ermöglichen,
und die zu einem Zeitpunkt t3 etwa 180 Sekunden nach der Zugabe
der Probe in die Küvette 18 bei
den beiden bichromatischen Wellenlängen durchgeführt wird.
In diesem Fall ist die Endpunkt-Reaktionsextinktion somit dann durch
Formel 1 definiert.
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Endpunkt-Reaktionsextinktion = [RAt3 – RAt1] – [RAt2 – RAt1], Formel 1wobei
die Reaktionsextinktion zum Zeitpunkt RAtn definiert ist durch RAtn
= RAtn(λ1) – RAtn(λ2) für den Zeitpunkt
t1, t2, t3 usw.
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Wegen
der Anwesenheit von zusätzlicher Flüssigkeit
in Küvette 18 nach
der Zugabe von Probe und Wasser wird in einem Endpunktsmessungsverfahren
typischerweise eine Volumenkorrektur eingesetzt, um die erhöhte Extinktion,
die sich aus der zusätzlichen
Flüssigkeit
in Küvette 18 ergibt,
sowie die "Hintergrundabsorption" durch die Küvette 18 zu
berücksichtigen.
Dies ist ein wohlbe kanntes Verfahren, bei dem eine Formel wie die
folgende Formel 2 verwendet wird:
In Bezug auf Hintergrund
und Volumen (H & V)
korrigierte Endpunkt-Reaktionsextinktion, RAtn (B & V)
= [RAt3 – RAt1] – [RAt2 – RAt1] × V2/V3, Formel 2wobei
V2 das bekannte Volumen von Reagens und Wasser in der Küvette 18 zum
Zeitpunkt t2 ist und V3 das bekannte Volumen von Reagens und Wasser plus
Probe und Wasser in der Küvette 18 zum
Zeitpunkt t3 ist. Alle RA-Messungen werden hier so berechnet, dass
eine solche Hintergrund- und Volumenkorrektur durchgeführt wird.
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Die
vorliegende Erfindung führt
eine neue Reaktionsmessung RAt4 zu einem Zeitpunkt nach der Einführung der
Probe in die Küvette 18 und
vor der Messung der Endpunkt-Reaktionsextinktion RAt3 ein, so dass
der relative Wert einer Reaktionsextinktionskurve während der
Reaktion in Verbindung mit dem endgültigen Reaktionsextinktions-Endpunktwert verwendet
werden kann, um zu bestimmen, ob durch das Ultraschallmischverfahren
ein ausreichender Grad der Mischungseffizienz erreicht wurde. Wie
in 2 gezeigt und später beschrieben wird, wurde bestimmt,
dass der Zeitpunkt t4 innerhalb eines Bereichs so ausgewählt werden
kann, dass dann, wenn das Verhältnis
von RAt4 zu RAt3 in einem Bereich von etwa 98% bis 102% liegt, eine
ausreichende gleichmäßige Durchmischung
des Reagens, Wassers und der Probe erreicht wurde, so dass man ein analytisch
annehmbares Testergebnis erhält. Ähnlich wurde
bestimmt, dass der Zeitpunkt t4 innerhalb eines Bereichs so ausgewählt werden
kann, dass dann, wenn das Verhältnis
von RAt4 zu RAt3 kleiner als etwa 95% ist, eine unzureichende gleichmäßige Durchmischung
des Reagens, Wassers und der Probe erreicht wurde, was zu einem
analytisch unannehmbaren Testergebnis führt.
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Wir
beziehen uns wiederum auf 2. In einer
beispielhaften Erläuterung
der vorliegenden Erfindung nähert
sich eine kinetisch kontrollierte Glucosereaktion einer Endpunktsvervollständigung
zu einem Zeitpunkt t4, der so gewählt wird, dass er im Bereich
etwa 50–70%
des Zeitintervalls zwischen ts und t3 liegt, und eine neue Reaktionsextinktionsmessung RAt4,
die zum Zeitpunkt t4 durchgeführt
wird, kann mit der Endpunkt-Reaktionsextinktionsmessung RAt3 verglichen
werden, und die Differenz zwischen den beiden Reaktionsextinktionsmessungen
kann verwendet werden, um die ausreichende Durchmischung der analysierten
Probe unter Verwendung von Reaktionsextinktionsmessungen zu bestimmen. In
diesem Beispiel wird die zu analysierende Probe zu einem Zeitpunkt
ts etwa sechzig Sekunden nach tr zu der Küvette gegeben, und nach dieser
Zugabe erfolgt ein gepulstes Ultraschallmischen unter Verwendung
des Mischers 30, in diesem Fall eines Glucoseassays während eines
Zeitraums von etwa einer halben Sekunde in einer gleichmäßig beabstandeten Reihe
von fünf
40-ms-Pulsanwendungen von Ultraschallenergie wiederum bei einem
Spannungswert von etwa 375 Volt, wobei die Zeiten und die Ultraschallenergieniveaus
empirisch so bestimmt werden, dass man eine ausreichende Gleichmäßigkeit
des Mischens erhält,
das "analytisch
korrekte Messungen" ergibt.
Der hier eingesetzte Ausdruck "analytisch
korrekte Messungen" soll
Fälle definieren,
bei denen das Mischen von Probe und Reagentien ausreichend gleichmäßig erfolgt,
so dass keine nachteiligen messbaren Einflüsse auf die Genauigkeit des durchzuführenden
Assays auftreten.
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Eine
Endpunkt-Extinktionsmessung RAt3, die der Küvette 18 plus dem
oder den Reagentien sowie Wasser und Probe zugeordnet werden kann, kann
dann bei den beiden bichromatischen Wellenlängen λ1 und λ2 zu einem Zeitpunkt t3 von
etwa 180 Sekunden nach ts, dem Zeitpunkt der Probenzugabe, durchgeführt werden,
wobei t3 empirisch so bestimmt wird, dass es ausreicht, um zu ermöglichen, dass
die Reaktion nach der Zugabe der Probe in die Küvette 18 im Wesentlichen
vollständig
abgelaufen ist. Aus einer Untersuchung der Kurve geht hervor, dass
bei der Bestimmung der Endpunkt-Reaktionsextinktion der subtrahierte
Term [RAt2 – RAt1]
repräsentativ
für eine
Extinktion aufgrund der Küvette,
Reagens und Wasser ohne Probenwirkungen ist.
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Dagegen
zeigt 3 die Wirkung auf die Reaktionsextinktion RA in
einem "positiven
Absorptionsassay" in
einer Situation der "unzureichenden
Durchmischung",
in der die Differenz zwischen ts und t3 etwa 180 s beträgt, und
wenn entweder: (1) keine Ultraschallenergie durch den Mischer 30 auf
eine Reaktionslösung
angewendet wurde, die Glucose in 300 μl gereinigtem Wasser und 56 μl Hexokinase,
Adenosin-5'-triphosphat
(ATP) und Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (G-6-PDH) enthielt; oder
wenn (2) Ultraschallenergie durch den Mischer 30 während einer
20-ms-Pulsanwendung von Ultraschallenergie unter Verwendung eines
Spannungsniveaus von 375 Volt angewendet wurde, eines Energieniveaus,
das bekanntermaßen
etwa 10% des normalen Energieniveaus beträgt, von dem zuvor bestimmt
wurde, dass es eine analytisch annehmbare Gleichmäßigkeit
des Mischens ergibt.
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4 zeigt
eine Reihe von Verhältnissen zwischen
RAt3 und RAt4, die zu verschiedenen Zeitpunkten für t4 in
einer kinetisch kontrollierten "positiven
Absorptionsreaktion",
während
sich die Reaktion einer Endpunktsvervollständigung zu einem Zeitpunkt
t3 annähert,
unter Bedingungen des ausreichenden Ultraschallmischens bestimmt
wurden, was zu analytisch korrekten Messergebnissen führte. In dieser
Reaktion beträgt
die Differenz zwischen ts und t3 etwa 180 s, und es wurde ein annehmbares
Mischen durchgeführt,
wobei der Ultraschallmischmechanismus 30 bei einem Spannungswert
von 375 Volt während
eines Zeitraums von etwa einer halben Sekunde in einer gleichmäßig beabstandeten
Reihe von fünf
40-ms-Pulsanwendungen von Ultraschallenergie verwendet wurde, wie
es oben beschrieben ist und bekanntermaßen zu einem analytisch annehmbaren
Mischen führt.
Die Daten wurden an einer Gruppe von 5 verschiedenen Proben bestimmt.
In diesem Fall zeigt dieselbe Reihe von Verhältnissen zwischen RAt3 und
RAt4, die zu verschiedenen Zeitpunkten während einer Reaktion bestimmt
wurden, dass das Verhältnis
zwischen RAt4 und RAt3 zu einem Zeitpunkt t4 innerhalb eines Bereichs
von etwa 50–70%
des Endpunkts t3 größer ist
als etwa 98%.
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Dagegen
zeigt 5 die Reihe von Verhältnissen zwischen RAt4 und
RAt3, die zu verschiedenen Zeitpunkten für t4 für das oben beschriebene Beispiel
des "unzureichenden
Mischens" bestimmt wurden,
wenn entweder keine Ultraschallenergie angewendet wurde oder wenn
ein Energieniveau des Ultraschallmischens verwendet wurde, das bekanntermaßen etwa
10% des normalen Energieniveaus beträgt, welches bekanntermaßen eine
analytisch annehmbare Gleichmäßigkeit
des Mischens erzeugt. Für
diese beiden Fälle
des "schwachen" Mischens zeigt sich
im Allgemeinen, dass das Verhältnis
zwischen RAt4 und RAt3 zum Zeitpunkt t4 im Allgemeinen kleiner als
etwa 95% ist. Für
diese beiden Fälle des "schwachen" Mischens ist klar,
dass das Verhältnis
zwischen RAt4 und RAt3 zu einem Zeitpunkt t4 innerhalb eines Bereichs
von etwa 50–70%
des Endpunkts t3 im Allgemeinen kleiner als etwa 95% ist. In einigen
Ausnahmefällen
wurde das Verhältnis
zwischen RAt4 und RAt3 höher
als etwa 95% gemessen, aber in diesen Fällen zeigte sich, wenn es auch nicht
ganz verstanden wird, dass die Messungen einen anormal großen Wertebereich
haben.
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Ein
zweites beispielhaftes Beispiel für diese Technik der Bestätigung der
Gleichmäßigkeit
des Mischens beinhaltet einen Assay, bei dem die photometrische
Absorption von Licht, das durch die Reagentien-Wasser-Probe-Lösung geleitet
wird, während
des Assayverfahrens abnimmt, im Allgemeinen als Ergebnis eines Verlusts
der Absorptionseigenschaften eines Analyten bei einer bestimmten
Wellenlänge. Solche
Assays sind als "negative
Absorptionsassays" bekannt.
Ein Beispiel für
einen solchen "negativen
Absorptionsassay" ist
ein diagnostischer in-vitro-Assay
für die
quantitative Bestimmung von Harnsäure in Serum, Plasma und Urin.
In dem Assay wird Harnsäure,
die bei 293 nm stark absorbiert, durch die gezielte Zugabe von Uricase
in Allantoin umgewandelt, das bei 293 nm nicht absorbiert. Die Menge
an negativer oder verringerter Extinktion bei 293 nm, die durch
das Verschwinden der Harnsäure
verursacht wird, ist also direkt proportional zur ursprünglichen Konzentration
von Harnsäure
in der Probe. Solche "negativen
Absorptionsassays" können unter
Verwendung einer bichromatischen Endpunktmessung ähnlich wie
die Technik, die im oben genannten Glucoseassay beschrieben ist,
durchgeführt
werden.
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Ein
kommerziell erhältlicher "negativer Absorptionsassay", in diesem Fall
für Harnsäure, ist
in 6 gezeigt. Wiederum beginnen analytische Messungen
mit einer Anfangsablesung RAt1 zum Zeitpunkt t1 einer Extinktion
durch eine Küvette 18 vor der
Einführung
von Flüssigkeiten
und Reagentien, so dass man ein Paar von "Grundlinien"-Extinktionsmessungen RAt1 bei den beiden
Wellenlängen λ1 und λ2 erhält, wobei λ1 bei 293
nm ausgewählt
wird und λ2,
die "Blindwellenlänge", bei 700 nm ausgewählt wird.
Wenige Sekunden nach t1, gewöhnlich zwischen
10 und 25 Sekunden später
zu einem Zeitpunkt tr, werden bekannte Volumina von Reagentien und
gereinigtem Wasser in die Küvette 18 eingeführt. 6 zeigt
die Wirkung auf die überwachte
Reaktionsextinktion als scharfe Zunahme, gefolgt von einer allmählichen
Abnahme, die zum Zeitpunkt ts der Zugabe der Probe zu den zuvor
miteinander kombinierten Assayreagentien und dem Wasser beginnt.
Wiederum zeigte sich, dass Ultraschallmischen unter Verwendung von
gepulsten Energieanwendungen wirksam einen hohen Grad der Gleichmäßigkeit
des Mischens ergibt. Es wurde experimentell bestimmt, dass ein erstes
Ultraschallmischen von Reagens und Wasser mit Hilfe des Mischers 31,
wenn es über
einen Zeitraum von etwa einer halben Sekunde in einer gleichmäßig beabstandeten
Reihe von zehn Pulsanwendungen von Ultraschallenergie während etwa
5 ms unter Verwendung eines Spannungswerts von 325 Volt durchgeführt wird,
zu einem zufriedenstellend gleichmäßigen Mischen von Reagentien
und Wasser führt.
Eine Probe, die auf die Gegenwart von Harnsäure analysiert werden soll,
wird zum Zeitpunkt ts etwa 60 Sekunden nach tr hinzugefügt, und
nach dieser Zugabe erfolgt ein gepulstes Ultraschallmischen mit
Hilfe des Mischers 30 in diesem Harnsäureassay während eines Zeitraums von etwa
einer halben Sekunde in einer gleichmäßig beabstandeten Reihe von
fünf 40-ms-Pulsanwendungen von
Ultraschallenergie bei einem Spannungswert von etwa 375 Volt, wobei
die Zeiten und die Ultraschallenergieniveaus empirisch so bestimmt
werden, dass sie eine Gleichmäßigkeit
des Mischens erzeugen, die zu "analytisch
korrekten Messungen" führt. In
kommerziellen Anwendungen einer solchen Harnsäureanalyse, wie sie in 6 gezeigt
ist, wird eine Endpunkt-Reaktionsextinktionsmessung
RAt3, die der Küvette 18 plus
dem ersten Reagens und Wasser und der Probe zugeordnet werden kann,
zum Zeitpunkt t3 durchgeführt,
in diesem Fall nach einer verstrichenen Zeit von etwa 300 Sekunden
nach der Probenzugabe. Die Zeit, die man verstreichen lässt, bevor
eine Endpunktsmessung bei t3 durchgeführt wird, wird empirisch so
ausgewählt,
dass sie ausreicht, um eine im Wesentlichen vollständige Beendigung
der Reaktion nach der Zugabe der Probe in die Küvette 18 zu ermöglichen.
Es wird dieselbe Endpunkt-Reaktionsextinktion gemessen wie im vorigen Beispiel,
wobei wiederum Formel 1 verwendet wird.
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Wie
bereits oben für
den Fall einer "positiven Absorptionsreaktion" beschrieben wurde,
hat sich auch gezeigt, dass bei "negativen
Absorptionsassays" der
Reaktionsextinktionswert, der während
der Zeit der Reaktion bestimmt wurde, im Vergleich zum endgültigen Endpunkt-Reaktionsextinktionswert
verwendet werden kann, um den Grad der Mischungseffizienz zu bestätigen. Wie
in 6 gezeigt ist, kann, während sich die Reaktion einer
Endpunktsvervollständigung
zu einem Zeitpunkt t4 annähert,
der so gewählt
wird, dass er in etwa 50–70%
des Zeitintervalls zwischen ts und t3 liegt, eine neue Reaktionsextinktionsmessung
RAt4, die zum Zeitpunkt t4 durchgeführt wird, mit der Endpunkt-Reaktionsextinktionsmessung
RAt3 verglichen werden, und das Verhältnis von RAt4 zu RAt3 kann
verwendet werden, um die ausreichende Durchmischung der analysierten Probe
unter Verwendung von Reaktionsextinktionsmessungen zu bestimmen.
Wie in 8 gezeigt ist und später beschrieben wird, wurde
Folgendes bestimmt: Wenn der Zeitpunkt t4 innerhalb dieses Bereichs
ausgewählt
wird und wenn das Verhältnis
von RAt4 zu RAt3 in einem Bereich von etwa 98% bis 102% liegt, ist
das gleichmäßige Mischen
von Reagens, Wasser und Probe ausreichend gleichmäßig, so
dass eine analytisch annehmbare Gleichmäßigkeit des Mischens erreicht
wird. Die Daten wurden an einer Gruppe von fünf verschiedenen Proben bestimmt.
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Im
Gegensatz zu 6 zeigt 7 eine Situation
der "unzureichenden
Durchmischung" in demselben "negativen Absorptionsassay" für Harnsäure bei
verschiedenen Zeitwerten für
t4, wenn t3 300 s beträgt
und die Ergebnisse des analytisch unannehmbaren Mischens, wenn entweder:
(1) keine Ultraschallenergie durch den Mischer 30 auf eine
Reaktionslösung
angewendet wurde, die Harnsäure
in Lösung
mit Uricase enthielt; oder wenn (2) Ultraschallenergie durch den
Mischer 30 während
einer 20-ms-Pulsanwendung von Ultraschallenergie bei einem Spannungsniveau
von etwa 375 Volt angewendet wurde, eines Energieniveaus, das bekanntermaßen etwa
10% des normalen Energieniveaus beträgt, das bekanntermaßen es eine
analytisch annehmbare Gleichmäßigkeit
des Mischens ergibt.
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8 zeigt
eine Reihe von Verhältnissen zwischen
RAt4 und RAt3, die so bestimmt wurden, wie es für den "negativen Absorptionsassay" von 6 für Harnsäure gezeigt
wurde, wobei man Energieniveaus des Ultraschallmischens verwendete,
die bekanntermaßen "analytisch korrekte
Messungen" ergeben.
In diesem Fall eines analytischen "negativen Absorptionsassays" machen die zeitabhängigen Verhältnisse
zwischen RAt4 und RAt3, die zu verschiedenen Zeitpunkten t4 während einer
Reaktion bestimmt wurden, klar, dass das Verhältnis zwischen RAt4 und RAt3
zu einem Zeitpunkt t4 gleich etwa 50–70% der Differenz zwischen
ts und dem Endpunkt t3 in einem Bereich von etwa 98% bis 102% ist.
Dagegen zeigt 9 die Reihe von Verhältnissen
zwischen RAt4 und RAt3, die in 7 gezeigt
sind, bei Ultraschallenergieniveaus, die bekanntermaßen etwa
10% des normalen Energieniveaus betragen, das bekanntermaßen es eine
analytisch annehmbare Gleichmäßigkeit
des Mischens ergibt. Bei diesen Fällen des "unzureichenden Mischens", und wie sich auch
im Falle des "positiven
Absorptions"-Glucoseassays
zeigt, zeigt sich im Allgemeinen, dass die Differenz zwischen RAt4
und RAt3 zum Zeitpunkt t4 gleich etwa 50–70% der Differenz zwischen
ts und dem Endpunkt t3 kleiner als etwa 95% ist. In einigen Ausnahmefällen wurde
das Verhältnis
zwischen RAt4 und RAt3 höher
als etwa 95% gemessen, aber in diesen Fällen zeigt sich, wenn es auch
nicht ganz verstanden wird, dass die Messungen einen anormal großen Wertebereich
haben.