DE69932187T2

DE69932187T2 - Verbindungen für krebs-therapie

Info

Publication number: DE69932187T2
Application number: DE69932187T
Authority: DE
Inventors: Oleg Strechenok
Original assignee: Ardenia Investments Ltd
Current assignee: Ardenia Investments Ltd
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 1999-12-28
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2019-12-29
Also published as: JP4643009B2; ID29246A; CN1332745A; CA2358420C; EP1159756A2; JP2002535251A; HK1041889A1; CA2358420A1; EP1159756B1; HK1041889B; WO2000042832A3; CN1149219C; ATE332013T1; WO2000042832A2; AU766256B2; DE69932187D1; AU1581800A

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung bezieht sich auf neue Verbindungen die bei der Behandlung von Krebs nützlich sind. Diese Verbindungen werden verwendet, um die Wirkung von herkömmlichen cytotoxischen Pharmazeutika zu erhöhen.
Hintergrund der Erfindung
Cytostatische oder cytotoxische Verbindungen werden bei der Behandlung von Krebs weithin verwendet. Doxorubicin ist ein aminoglycosidisches Anthracyclin Antibiotikum und wird als typisches Beispiel dieser Gruppe von Verbindungen verwendet.
Die Zellmembran stellt eine physikalische Barriere dar und es gibt einige Faktoren, die die Rate der Aufnahme von Doxorubicin bestimmen. Die Hauptfaktoren sind die Hydrophobizität (eine Erhöhung erhöht die Aufnahmerate) und der Protonierungsgrad der Aminogruppe –pKa (ein Verringern erhöht die Eintrittsrate). Doxorubicin hemmt das Zellwachstum und hat einen merklichen Effekt auf das nukleäre Material, das unspezifisch verdickt, agglutiniert oder zerbrochen wird. Die Hauptbindungskraft zwischen Doxorubicin und DNA ist die Interkalation des planaren Chromophors, die durch eine externe elektrostatische Bindung des positiv geladenen Aminozuckerrests mit der negativen Phosphatgruppe der DNA stabilisiert wird.
Die interkalierten Medikamentenmoleküle scheinen Veränderungen in der Helixkonformation, die als eine Voraussetzung für die Initiation der Nukleinsäuresynthese notwendig sind, zu verhindern. Die letale Hauptwirkung von Doxorubicin ist die Inhibition der Nukleinsäuresynthese. Als Folge ist das Medikament gegen sich teilende Zellen aktiver und die größte Wirkung besitzt es in der S-Phase des Zellzyklus (Brown J.R., Adriamycin and related anthracycline antibiotics in: Progress in Medicinal Chemistry edited by G. P. Ellis and G. B. West, Elsevier/North-Holland Biomedical Press v. 15, pp. 125–164, 1978).
Einige Beobachtungen sind mit der Bildung eines elektrostatischen Komplexes zwischen der positiven Aminogruppe von Doxorubicin und den negativen Phosphatgruppen von Phospholipiden, wie zum Beispiel Cardiolipin, Phosphatidyldserin, Phosphatidylinositol und Phosphatidsäure vereinbar. Cardiolipin ist ein nahezu charakteristischer Bestandteil der inneren Membran von Mitochondrien, die im Herzmuskel reichlich vorkommen. Die Pathogenese mitochondrialer Läsionen ist eine der Haupt- und spezifischeren subzellulären Veränderungen, die die Kardiotoxizität von Doxorubicin auszeichnen. Die ziemlich selektive Toxizität von Doxorubicin für Mitochondrien kann auf die hohen Konzentrationen an Cardiolipin in den Mitochondrien des Herzmuskels zurückgeführt werden (Duarte-Karim M., et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. V. 71, N. 2, pp. 658–663, 1976).
Die Wechselwirkung zwischen Doxorubicin und Lipiden wurde unter Verwendung von großen unilamellaren Vesikeln (LUVET), die aus Mischungen anionischer Phospholipide und verschiedenen zwitterionischen Phospholipiden bestehen, untersucht. Die Verdünnung anionischer Lipide mit zwitterionischen Lipiden führt zu der verringerten Membranassoziation des Medikaments, da bei der Wechselwirkung zwischen Doxorubicin und Membran elektrostatische Kräfte sehr wichtig sind. Die Bindung von Doxorubicin an LUVETs, die aus anionischen Phospholipiden kombiniert mit Phosphatidylethanolamin (PE) bestehen, ist jedoch viel höher als die Bindung an LUVETs, die aus anionischen Lipiden und einer Auswahl anderer zwitterionischer Lipide, wie zum Beispiel Phosphatidylcholin und den N-Methylethanolamin und N,N-Dimethylethanolamin Derivaten von PE, hergestellt sind (Speelmans, G. et al., Biochemistry, v. 36, N. 28, pp. 8657–8662, 1997).
Die Interaktion von Adriamycin mit menschlichen Erythrocyten wurde untersucht, um die Membranbindungsstellen und die resultierende strukturelle Störung zu bestimmen. Die Elektronenmikroskopie zeigte, dass rote Blutzellen, die mit einer therapeutischen Konzentration des Medikaments in menschlichem Plasma inkubiert wurden, ihre diskoide Form zu sowohl Stomatocyten als auch Echinocyten hin veränderten. Das Medikament wurde mit Molekülmodellen inkubiert. Eines von diesen bestand aus vielen Schichten Dimyristoylphosphatidylcholin und Dimyristoylphosphatidylethanolamin, Beispiele von Phospholipidklassen, die in der äußeren bzw. inneren Schicht der Erythrocytenmembran lokalisiert sind. Röntgenbeugung zeigte, dass die Wechselwirkung mit Adriamycin den polaren Kopf und die Acylkettenbereiche beider Lipide störte. Es wurde geschlussfolgert, dass Adriamycin in beide Schichten der Erythrocytenmembran eingebaut wird und ihre Membranstruktur beeinflusst (Suwalsky M., Z Naturforsch [C] v. 59, N3-4, pp. 271–277, 1999).
Die verschiedenen physiko-chemischen Eigenschaften von Dipalmitoylphosphatidcholin Liposomen mit von Sojabohnen abgeleiteten Sterolen wurden untersucht. Liposomales Doxorubicin erhöhte verglichen mit dem freien Medikament die pharmakologische Wirkung, was eine Verringerung von Nebenwirkungen und verlängerter Zirkulation vermuten lässt (Maitani Y., Yakugasku Zasshi, v. 116, N. 12, pp. 901–910, 1996).
Liposomen, die mit Polyethylenglykol derivatisierte Phospholipide enthalten, sind in der Lage, dem reticulo-endothelialen System auszuweichen und daher für einen längeren Zeitraum im Blutkreislauf zu verbleiben. Das Doxorubicin, das in diesen sterisch stabilisierten Liposomen verkapselt ist, unterdrückt das Wachstum von etablierten menschlichen Lungentumor Xenotransplantaten in Mäusen mit einer schweren kombinierten Immunschwäche und verhindert die spontanen Metastasen dieser Tumore (Sakakibara T., et al., Cancer Res., v. 56, N. 16, p. 3743–3746, 1996).
Eine Liposomverkapselung kann das umgebende Gewebe vor den cytotoxischen Wirkungen des Medikamentes nach subkutaner (s.c.) Verabreichung schützen. Liposomen, die aus „fluid-state" Phospholipiden bestehen, verzögern die schädigende Wirkung von Doxorubicin nur, wenn sie s.c. injiziert werden. Liposomen starrerer Art waren beim Verhindern lokaler Gewebeschädigungen über einen längeren Zeitraum viel wirksamer, wenn sie s.c. verabreicht wurden. (Oussoren, C., et al., Biochim. Biophys. Acta, v. 1369, N. 1, pp. 159–172, 1998).
Exogene polyungesättigte Fettsäuren modulieren die cytotoxische Aktivität von Antikrebsmedikamenten in der menschlichen Brustkrebszelllinie MDA-MB-231. Unter allen getesteten polyungesättigten Fettsäuren war Docosahexaensäure beim Erhöhen der Cytotoxizität von Doxorubicin am wirksamsten (E. Germain, et. al., Int. J. Cancer, v. 75, pp. 578–583, 1998).
Es verbleibt ein Bedarf für neuartige Verbindungen und Verfahren für die Behandlung von Krebs. Die vorliegende Erfindung zielt unter anderem darauf, die pharmakologische Aktivität von gegenwärtig verwendeten Antikrebsmedikamenten, wie zum Beispiel Doxorubicin, zu erhöhen und neuartige Ansätze bei der Behandlung von Krebs einzuführen.
Kurze Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung macht neue Verbindungen gemäß den angefügten Patentansprüchen verfügbar. Ferner offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Synthese dieser Verbindungen und eine modifizierte Form einer cytostatischen pharmazeutischen Verbindung; Doxorubicin.
Beschreibung der Erfindung
Es wurde gezeigt, dass in menschlichen Brustkrebszellen (Zelllinie MDA-MB-231) nach der Wirkung von Doxorubicin (DXR) in Gegenwart von Docosahexaensäure und Oxidationsmitteln die Menge an Lipoperoxiden ansteigt. Das kann Tumorzellen metabolischen Eigenschaften verleihen, die ihre Neigung, die Wirkungen von Doxorubicin zu überleben, verringern.
Die vorliegende Erfindung betrifft therapeutisch nützliche Verbindungen und die Verwendung derselben für die Behandlung von Krebs. Die Erfindung bezieht sich ebenfalls auf die Synthese von Amiden von al-trans-Retinsäure und 13-cis-Retinsäure mit Doxorubicin, die die folgenden Strukturen besitzen:

1. N-(all-trans-Retinoyl)-Doxorubicin
2. N-(13-cis-Retinoyl)-Doxorubicin

Es ist bekannt, dass die Nützlichkeit von natürlichen Retinoiden für die Chemoprävention durch ihre Toxizität begrenzt wird. Synthetische Retinamide, die chemopräventive Aktivität besitzen, sind weniger toxisch als natürliche Retinoide (Shealy Y. F., et al., J. Med. Chem. V. 31., P. 190–196, 1988).
Die angesprochenen Verbindungen konnten nicht nur eine höhere Cytotoxizität gegenüber Tumorzellen, sondern auch eine merkliche Verringerung in der Toxizität ihrer Präparate zeigen.
Unsere experimentellen Ergebnisse zeigen, dass Verbindung 1 mit Bezug auf Ehrlich Aszites Karzinom (EAC), mit Passage in C3H Mäusen, höhere Antitumoraktivität zeigt. Der Antitumoreffekt der Verbindung 1 war dosisabhängig. Es ist offensichtlich, dass bei vergleichbarer Dosis Verbindung 1 höhere Aktivität besitzt als das freie Doxorubicin. Die Injektion von Verbindung 1 mit einer Dosis von 50 mcg/Maus (2,5 mcg/kg) hemmte das Tumorwachstum zu 57%, während freies Doxorubicin bei derselben Dosis das EAC Wachstum zu 45% hemmte.
Die stärkeren cytotoxischen Wirkungen der Konjugate von polyungesättigten Fettsäuren mit Daunomycin auf AFP-erzeugende Ratten-Hepatomzellen könnten auf die hohe Affinität von AFP an Arachidon- und Docosahexaensäuren zurückzuführen sein. Der Komplex aus AFP mit Fettsäuren, die mit Daunomycin modifiziert waren, wurde selektiv an AFP-erzeugende Ratten-Hepatomzellen abgegeben.
In unseren Experimenten wurde ein EAC verwendet, das kein AFP herstellt. Es ist bekannt, dass die Verringerung der Antitumoraktivität von Verbindung 1 durch die Gegenwart von diesem Protein (AFP) in den Präparaten, die für die Injektionen in Mäusen verwendet wurden, verursacht wird. Das Ergebnis dieser Experimente könnte als das Vorhandensein eines reversiblen Gleichgewichtskomplexes, der aus AFP und Retinsäure, die mit Doxorubicin modifiziert ist, gebildet wird, interpretiert werden. Somit könnte die im Vergleich mit Doxorubicin höhere cytotoxische Aktivität von Verbindung 1 auf ihre strukturellen Auffälligkeiten zurückzuführen sein. Verbindung 1 schließt zwei Antitumormittel-Amide von Retinsäuren und Doxorubicin ein.
Beispiel 1
Synthese von N-(all-trans-Retinoyl)-Doxorubicin (Verbindung 1)
All-trans-Retinsäure (300 mg, 1 mmol) und Triethylamin (104 mg, 1,02 mmol) wurden in 1 ml trockenem Tetrahydrofuran aufgelöst, dann wurde trockenes Acetonitril (4 ml) zugegeben und die Mischung auf –15°C abgekühlt. Dann wurden 140 mg (1,02 mmol) Butylchlorformiat zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Mischung, die frei von präzipitiertem Triethylaminhydrochlorid war, in eine gerührte Suspension eines Doxolem Präparats, das 400 mg Doxorubicin Hydrochlorid und 2 g Lactose in einer Mischung aus 1 ml Methanol und 0,1 ml Triethylamin enthielt, pipettiert, das Rühren für 15 Minuten bei –15°C fortgesetzt, und der erhaltenen Mischung dann erlaubt, sich auf Raumtemperatur zu erwärmen. Nachdem die Mischung bei Raumtemperatur für 2 Stunden unter Argon gerührt wurde, wurde sie mit 20 ml Benzol-Ethanol (4:1) behandelt. Die Suspension wurde für 5 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert und das Präzipitat wurde mit 20 ml Benzol-Ethanol (4:1) behandelt und durch Zentrifugation (5 Minuten, 3000 rpm) abgenommen. Die zwei erhaltenen Überstände wurden kombiniert und bei Unterdruck bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde in Chloroform aufgelöst und N-(all-trans-Retinoyl)-Doxorubicin wurde durch Flash-Chromatographie auf Kieselgel (Korngröße 230–400) gereinigt. Die Säule wurde sukzessiv mit Chloroform, Aceton-Chloroform (1:9, v/v), Aceton-Chloroform (1:4, v/v) und schließlich mit Benzol-Ethanol (4:1) eluiert. Das reine Produkt wurde mit Benzol-Ethanol (4:1) als tiefrote Bande eluiert. Das Lösungsmittel wurde unter Unterdruck eingedampft, um 445 mg (78%) N-(all-trans-Retinoyl)-Doxorubicin als tiefrotes Wachs zu ergeben; TLC (Benzol-Dioxan-Essigsäure 10:5:1) R_f 0,5 (für Doxorubicin 0,08); UV (Ethanol) A^0,1% (345 nm) = 817; A^0,1% (497 nm) = 196; ¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ 0,9–1,0 (t und s, 6H, 3 Ring-CH₂ in Retinsäure), 1,2–1,3 (d, 3H, CH₃-5'), 1,4– 2,4 (m, 19H, 5CH₃-RA, CH₂-2' und CH₂-8), 2,9–3,3 (q, 2H, CH₂-10), 3,7 (s, 1H, H-4'), 3,9–4,3 (m, 6H, OH-4', OCH₃, H-3', H-5'), 4,6 (s, 1H, COCH₂OH), 4,8 (s, 2H, COCH₂OH), 5,0–5,1 (d, 1H, OH-9), 5,3 (s, 1H, H-7), 5,5 (s, 1H, H-1'), 5,6–7,0 (m, 7H, 6HC=C-RA und NH), 7,3–7,4 (d, 1H, H-3), 7,7–7,8 (t, 1H, H-2), 8,0–8,1 (d, 1H, H-1), 13,1 und 14,0 (zwei s, 2H, OH-6 und OH-11)
Beispiel 2. Die Antitumorwirkung von N-(all-trans-Retinoyl)-Doxorubicin (Verbindung 1) auf EAC-Zellen
Eine Studie der Antitumorwirkung von Verbindung 1 verglichen zu Doxorubicin wurde in EAC, mit Passage in C3H Mäusen, durchgeführt. Es wurden 20–22 g schwere männliche C3H Mäuse verwendet. Kontrolle und experimentelle Gruppen schlossen 7 Tiere ein, die an Tag 0 mit 5 × 10⁶ EAC Zellen in einem Volumen von 0,2 ml i.p. beimpft wurden. An dem zweiten, vierten und sechsten Tag nach der Beimpfung wurden Dosen von 20, 50 und 100 μg/Maus von Verbindung 1 und äquivalente Dosen von Doxorubicin in 200 μl normalem Mäuseserum (NMS) i.v. injiziert. Drei Gruppen von Tieren wurden Lösungen von Doxorubicin in Wasser in den Dosen 1, 2,5 und 5 μg/kg Körpergewicht (entsprechen 20, 50 und 100 μg/Maus bei einem Körpergewicht von 20 g) verabreicht. Eine Gruppe von Mäusen war eine unbehandelte Kontrolle. Die Ergebnisse der Experimente wurden am neunten Tag betrachtet. Die Mäuse wurden durch Genickbruch getötet. Die Aszitesflüssigkeiten wurden entfernt, gesammelt, ihre Volumina gemessen und der Bauchraum 6–7 Mal mit Salzlösung gewaschen. Die so erhaltenen Flüssigkeiten wurden vereinigt. Die Anzahl lebensfähiger Tumorzellen wurde mit einem Hämocytometer, unter Verwendung des Trypan-Blau-Ausschlusstests, gezählt. Der mittlere Fehler und der mittlere Standardfehler wurden für jede Gruppe von Mäusen berechnet. Der Vergleich der Zahl von Tumorzellen in den Kontroll- und experimentellen Gruppen wurde unter Verwendung des Student t-Tests durchgeführt. Der Einfluss der getesteten Präparate auf die EAC Wachstumshemmung wurde durch:
bewertet.
Die experimentellen Ergebnisse, die in Tabelle 1 gezeigt sind, zeigen an, dass Verbindung 1 gegenüber EAC hohe Antitumoraktivität zeigt. Die Antitumorwirkung von Verbindung 1 ist dosisabhängig. Verglichen mit unbehandelten Kontrolltieren (p < 0,01) ergibt die an dem zweiten, vierten und sechsten Tag nach der Beimpfung dreimal wiederholte Injektion von Verbindung 1 in einer Dosis von 1 mg/kg (20 μg/Maus) eine EAC-Wachstumshemmung von 47%. Es ist offensichtlich, dass in einer vergleichbaren Dosis Verbindung 1 eine höhere Aktivität als freies Doxorubicin besitzt. Im Fall einer Injektion von Verbindung 1 in einer Dosis von 2,5 mg/kg (50 μg/Maus) gemäß dem genommenen Schema erreichte die Inhibition des Tumorwachstums 56% (p < 0,01), während freies Doxorubicin bei derselben Dosis EAC-Wachstum zu 45% (p < 0,01) hemmte. Eine geringere Wirkung (EAC-Wachstumshemmung 53%) wurde im Fall einer Injektion von Verbindung 1 in einer Dosis, die 5 mg/kg (100 μg/Maus) Doxorubicin entspricht, erhalten. Es ist zu sehen, dass die cytotoxische Wirkung von freiem Doxorubicin bei dieser Dosis höher als die von Verbindung 1 ist.
Somit zeigt das Experiment, dass Verbindung 1 bei Dosen, die 1 und 2,5 mg/kg Doxorubicin entsprechen, hohe Antitumorwirkung gegenüber EAC zeigt, und ferner, dass die Cytotoxizität von Verbindung 1 höher als die von freiem Doxorubicin ist.
Antitumorwirkung von Verbindung 1 und Doxorubicin bei drei Mal wiederholten i.v. Injektionen in Mäuse mit EAC (M ± m, n = 7) Tabelle 1.
Beispiel 3. Wirkung von N-(all-trans-Retinoyl)-Doxorubicin (Verbindung 1) mit AFP auf das Wachstum von EAC in Mäusen
Der Einfluss von Verbindung 1 mit verschiedenen Mengen AFP auf das Wachstum von EAC wurde untersucht. Die Experimente wurden mit durch Inzucht erzeugten C3H Mäusen, die ein Anfangsgewicht von 20–23 g besaßen, durchgeführt. Die verwendete Tumorzelllinie wurde durch i.p. Passagen auf Mäuse derselben Linie unterstützt. Bei Beginn der Untersuchung (Tag 0) wurden vier Gruppen, von denen jede 7 Mäuse enthielt, gebildet. Alle Tiere wurden mit Tumorzellen in Kochsalzlösung i.p. beimpft (5 × 10⁶ Zellen in 0,2 ml pro Maus).
Die Injektionen der verschiedenen Präparationen von Verbindung 1 und Doxorubicin mit AFP wurden am zweiten, vierten und sechsten Tag nach der i.p. Implantation von EAC-Zellen an Mäuse durchgeführt. Die erste Gruppe von Tieren war unbehandelt (negative Kontrolle). Die Mäuse erhielten NMS injiziert. Die Mäuse der zweiten Gruppe wurden mit Verbindung 1, das Doxorubicin in einer Dosis von 1 μg/kg Körpergewicht (20 μg/Maus) enthielt, i.v. injiziert, wobei NMS als Lösungsmittel verwendet wurde. Die Tiere der dritten und vierten Gruppe wurden mit denselben Dosen der Verbindung 1 injiziert, wobei zu dem NMS das Protein zugegeben wurde (entsprechend 2,5 und 5 μg/Maus). Am neunten Tag nach der Beimpfung mit EAC-Zellen wurden die Mäuse getötet und die Aszitesflüssigkeiten gesammelt und quantitativ bewertet. Es wurden Suspensionen der Tumorzellen hergestellt und Aliquots mit gleichen Volumina 0,1% Trypan Blau Lösung gemischt. Die Zahl an Tumorzellen wurde mit einem Hämocytometer gezählt.
Die Ergebnisse der Experimente wurden mittels statistischen Variationsverfahren unter Verwendung des Student t-Tests bewertet. Die Werte der inhibierenden Wirkungen der Präparationen wurden als Prozentsatz im Vergleich zur Kontrolle dargestellt.
Wie aus den präsentierten Daten des Experiments entnommen werden kann (Tabelle 2), hemmt Verbindung 1 in einer Dosis von 1 mg/kg (20 μg/Maus) das EAC Wachstum zu 45% (p < 0,01). Dies entspricht den Daten des vorangehenden Experiments. Zu demselben Zeitpunkt ist der Einfluss von Verbindung 1 (20 μg/Maus), die mit AFP (2,5 μg/Maus) beladen ist, auf 33% Tumorwachstumshemmung (p < 0,01) abgesenkt. Der Wert der Antitumorwirkung von Verbindung 1 mit der doppelten Menge AFP in der injizierten Lösung (31%, p < 0,02) ist nicht wesentlich verändert. Es ist zu sehen, dass die Wirkung von Verbindung 1 mit AFP (2,5 und 5,0 μg/Maus) nahe dem von freiem Doxorubicin ist.
Wirkung von Verbindung 1 mit AFP in einer Dosis von 1 mg/kg (20μg/Maus) bei dreimal wiederholten i.v. Injektionen in C3H Mäuse auf das Wachstum von EAC (M ± m, n = 7) Tabelle 2.

* siehe Tabelle 1.

Beispiel 4. Die Antitumorwirkung von N-(13-cis-Retinoyl)-Doxorubicin (Verbindung 2) auf das Wachstum von EAC in Mäusen
20–22 g schwere C3H Mäuse wurden intraperitoneal mit 2 × 10⁶ lebensfähigen EAC Zellen beimpft. Beginnend zwei Tage später (Tag 2) bekamen die Mäuse intravenös jeden zweiten Tag, drei Mal (Tag 2, 4 und 6) Injektionen (mit einem Volumen von 10 ml/kg Körpergewicht oder 200 μl/Maus bei einem Körpergewicht von 20 g). Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten NMS. In zwei Gruppen von Doxorubicin (positive Kontrollen) Mäusen erhielten diese Doxorubicin allein (in NMS) in einer Dosis von 1 oder 2,5 mg/kg Körpergewicht (entspricht 20 oder 50 μg/Maus bei einem Körpergewicht von 20 g). Mäuse aus zwei Testgruppen erhielten die Verbindung 2 in NMS, die Doxorubicin in den Dosen 1 oder 2,5 mg/kg Körpergewicht (entspricht 20 oder 50 μg/Maus bei einem Körpergewicht von 20g) enthielt. Drei Tage nach der letzten Behandlung mit der Testverbindung wurden die Mäuse an Tag 9 durch Genickbruch getötet. Die Anzahl an Tumorzellen wurde gezählt und das Ausmaß der Inhibition des EAC Wachstums in Mäusen bewertet.
Die Mäuse der Kontrollgruppe besaßen (975,4 ± 81,37) × 10⁶ EAC-Zellen in der Bauchhöhle. In der Gruppe mit Doxorubicin allein in der Dosis 1 mg/kg betrug die Anzahl an Tumorzellen (635,9 ± 122,78) × 10⁶ und die EAC Wachstumshemmung 34,8%, p < 0,05. In Mäusen der Testgruppe mit Verbindung 2, die Doxorubicin in einer Dosis von 1 mg/kg enthielt, war die Zahl der Tumorzellen (533,5 ± 94,23) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 45,3%, p < 0,01. In der Gruppe mit Doxorubicin allein in der Dosis 2,5 mg/kg war die Zahl an Tumorzellen (537,4 ± 92,89) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 44,9%, p < 0,01. In Mäusen der Testgruppe mit Verbindung 2, die Doxorubicin in Dosen von 2,5 mg/kg enthielt, betrug die Zahl an Tumorzellen (405,7 ± 120,62) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 58,4%, p < 0,002.
Somit zeigt Verbindung 2 in Dosen, die 1 und 2,5 mg/kg Doxorubicin entsprechen, hohe Antitumorwirkung gegenüber EAC, und übertrifft die Wirkung von Doxorubicin allein.
Beispiel 5. Synthese von N-(13-cis-Retinoyl)-Doxorubicin/Verbindung 2/
Diese Verbindung wurde wie oben für Verbindung 1 beschrieben unter Verwendung von 1 mmol (300 mg) 13-cis-Retinsäure hergestellt; Ausbeute 429 mg (75%).
TLC (Benzol-Dioxan-Essigsäure 10:5:1) R_f0.5 (für Doxorubicin 0,08);
UV (Ethanol) A^0,1% (347 nm) = 817; A^0,1% (497 nm) = 196
¹H-NMR (CDCl₃, 200 MHz) δ 0,9–1,0 (t und s, 6H, 3 Ring-CH₂ in Retinsäure), 1,2–2,4 (m, 22H, CH₃-5', 5 CH₃-RA, CH₂-2' und CH₂-8), 2,9–3,3 (q, 2H, CH₂-10), 3,7 (s, 1H, H-4'), 3,9–4,3 (m, 6H, OH-4', OCH₃, H-3', H-5'), 4,6 (s, 1H, COCH₂OH), 4,8 (s, 2H, COCH₂OH), 5,0–5,1 (d, 1H, OH-9), 5,3 (s, 1H, H-7), 5,5 (s, 1H, H-1'), 5,6–7,0 (m, 7H, 6HC=C-RA und NH), 7,3–7,4 (d, 1H, H-3), 7,7–7,8 (t, 1H, H-2), 8,0–8,1 (d, 1H, H-1), 13,1 und 14,0 (zwei s, 2H, OH-6 und OH-11).
Beispiel 6. Anti-Tumorwirkung von DXR/(C4 + C4a) + C5 Komplexen
Die molaren Verhältnisse von (C4 + C4a):C5 entsprachen 1,2:1; 1,6:1; 1,9:1 und 2,5:1. Das molare Verhältnis von C4:C4a betrug 3:2. DXR – 3,5 mg/kg Körpergewicht. C5 – 6,4 mg/kg Körpergewicht.
20–22 g schwere ICR Mäuse wurden intraperitoneal mit 2 × 10⁶ lebensfähigen EAC-Zellen beimpft. Beginnend zwei Tage später (Tag 2) bekamen die Mäuse jeden zweiten Tag, drei Mal (Tag 2,4 und 6) intravenöse Injektionen (mit einem Volumen von 2,5 ml/kg Körpergewicht). Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten den Träger. In der Gruppe der DXR Mäuse erhielten diese DXR allein in der Dosis von 3,5 mg/kg. Mäuse der ersten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + C5 Komplex. Das molare Verhältnis von (C4 + C4a):C5 war gleich 1,2:1. Die Mäuse der zweiten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + C5 Komplex. Das molare Verhältnis von (C4 + C4a):C5 war gleich 1,6:1. Mäuse der dritten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + C5 Komplex. Das molare Verhältnis von (C4 + C4a):C5 war gleich 1,9:1. Die Mäuse der vierten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + C5 Komplex. Das molare Verhältnis von (C4 + C4a):C5 war gleich 2,5:1. Zwei Tage nach der Endbehandlung mit den Testkomplexen wurden die Mäuse an Tag 8 durch Genickbruch getötet. Die Anzahl an Tumorzellen wurde gezählt und das Ausmaß der Inhibition des EAC-Wachstums in Mäusen bewertet.
Mäuse der Kontrollgruppe besaßen (768,7 ± 102,8) × 10⁶ EAC Zellen in der Bauchhöhle. In der Gruppe mit DXR allein betrug die Zahl an Tumorzellen (465,1 ± 62,8) × 10⁶ und die EAC Wachstumshemmung betrug 39,5%, p < 0,05. In Mäusen der ersten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (283,6 ± 71,4) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 63,1%, p < 0,002. In Mäusen der zweiten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (218,3 ± 65,3) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 71,6%, p < 0,001, und bezogen auf die DXR Gruppe (positive Kontrolle) betrug die EAC-Wachstumshemmung 53,1%, p < 0,02. In Mäusen der dritten Testgruppe war die Zahl an Tumorzellen (299,7 ± 73,6) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung betrug 61,0%, p < 0,002. In Mäusen der vierten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (405,1 ± 81,5) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung betrug 47,3%, p < 0,02.
Somit übersteigt die Antitumoraktivität von DXR/(C4 + C4a) + C5 Komplexen bei molaren Verhältnissen von (C4 + C4a):C5 von 1,2:1; 1,6:1; 1,9:1 und 2,5:1 die Wirkung von DXR allein.
Beispiel 7. Anti-Tumorwirkung von DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13) Komplexen
Die molaren Verhältnisse von (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13) waren gleich 1:1; 1:1,4; 1:1,8 und 1:2,3. Das molare Verhältnis von C4:C4a war gleich 2:3. Die molaren Verhältnisse von C5:C9:C13 waren gleich 0,5:1:1. DXR – 3,5 mg/kg Körpergewicht. (C4 + C4a) – 8,15 mg/kg Körpergewicht.
20–22 g schwere ICR Mäuse wurden intraperitoneal mit 2 × 10⁶ lebensfähigen EAC-Zellen beimpft. Beginnend zwei Tage später (Tag 2) bekamen die Mäuse jeden zweiten Tag, dreimal (Tag 2, 4 und 6) intravenöse Injektionen (mit einem Volumen von 2,5 ml/kg Körpergewicht). Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten den Träger. In der Gruppe der DXR Mäuse erhielten diese DXR allein in der Dosis von 3,5 mg/kg. Mäuse der ersten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13) Komplex. Das molare Verhältnis von (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13) war gleich 1:1. Mäuse der zweiten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13) Komplex. Das molare Verhältnis von (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13) war gleich 1:1,4. Mäuse der dritten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13) Komplex. Das molare Verhältnis des (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13) Komplexes war gleich 1:1,8. Mäuse der vierten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13) Komplex. Das molare Verhältnis dieses (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13) Komplexes war 1:2,3. Zwei Tage später, an Tag 8, wurden die Mäuse nach der letzten Behandlung mit den Testkomplexen durch Genickbruch getötet. Die Anzahl an Tumorzellen wurde gezählt und das Ausmaß der Inhibition des EAC-Wachstums in Mäusen bewertet.
Mäuse in der Kontrollgruppe besaßen (817,2 ± 99,9) × 10⁶ EAC-Zellen in der Bauchhöhle. In der Gruppe mit DXR allein betrug die Anzahl an Tumorzellen (517,7 ± 74,9) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung betrug 36,9%, p < 0,05. In Mäusen der ersten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (326,1 ± 92,8) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 60,1%, p < 0,01. In Mäusen der zweiten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (259,0 ± 72,6) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 68,3%, p < 0,001, und bezogen auf die DXR-Gruppe (positive Kontrolle) betrug die EAC-Wachstumshemmung 49,8, p < 0,05. In Mäusen der dritten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (316,3 ± 81,3) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 61,3%, p < 0,002. In Mäusen der vierten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (431,5 ± 74,1) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 47,2%, p < 0,01.
Somit übersteigt die Antitumoraktivität von DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13) Komplexen bei molaren Verhältnissen von (C4 + C4a)(C5 + C9 + C13) von 1:1; 1:1,4; 1:1,8 und 1:2,3 die Wirkung von DXR allein.
Beispiel 8. Antitumorwirkung von DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13 + C17) Komplexen
Die molaren Verhältnisse von (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13 + C17) waren gleich 1:1,3; 1:1,6; 1:2 und 1:2,5. Das molare Verhältnis von C4:C4a war gleich 1:1. Die molaren Verhältnisse von C5:C9:C13:C17 waren gleich 1:1:1:1. DXR – 3,5 mg/kg Körpergewicht. (C4 + C4a) – 8,15 mg/kg Körpergewicht.
20–22g schwere ICR-Mäuse wurden intraperitoneal mit 2 × 10⁶ lebensfähigen EAC-Zellen beimpft. Beginnend zwei Tage später (Tag 2) bekamen die Mäuse jeden zweiten Tag, dreimal (Tag 2, 4 und 6) intravenöse Injektionen (mit einem Volumen von 2,5 ml/kg Körpergewicht). Die Mäuse der Kontrollgruppe erhielten den Träger. In der Gruppe der DXR Mäuse erhielten diese DXR allein in der Dosis von 3,5 mg/kg. Mäuse der ersten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13 + C17) Komplex. Das molare Verhältnis von (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13 + C17) war gleich 1:1,3. Mäuse der zweiten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13 + C17) Komplex. Das molare Verhältnis von (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13 + C17) war gleich 1:1,6. Mäuse der dritten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13 + C17) Komplex. Das molare Verhältnis des (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13 + C17) Komplex war gleich 1:2. Mäuse der vierten Testgruppe erhielten den DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13 + C17) Komplex. Das molare Verhältnis dieses (C4 + C4a):(C5 + C9 + C13 + C17) Komplexes war 1:2,5. Zwei Tage später, an Tag 8, wurden die Mäuse nach der letzten Behandlung mit den Testkomplexen durch Genickbruch getötet. Die Anzahl an Tumorzellen wurde gezählt und das Ausmaß der Inhibition des EAC-Wachstums in Mäusen wurde bewertet.
Mäuse in der Kontrollgruppe besaßen (738,1 ± 73,9) × 10⁶ EAC-Zellen in der Bauchhöhle. In der Gruppe mit DXR allein betrug die Anzahl an Tumorzellen (431,1 ± 57,4) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung betrug 41,6%, p < 0,01. In Mäusen der ersten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (235,9 ± 65,1) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 68,0%, p < 0,001, und bezogen auf die DXR-Gruppe (positive Kontrolle) betrug die EAC-Wachstumshemmung 45,3%, p < 0,05. In Mäusen der zweiten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (223,7 ± 70,3) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 69,7%, p < 0,001 und bezogen auf die DXR-Gruppe (positive Kontrolle) betrug die EAC-Wachstumshemmung 48,1%, p < 0,05. In Mäusen der dritten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (322,6 ± 88,5) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 56,3%, p < 0,01. In Mäusen der vierten Testgruppe betrug die Zahl an Tumorzellen (417,2 ± 69,7) × 10⁶ und die EAC-Wachstumshemmung 43,5%, p < 0,01.
Somit übersteigt die Antitumoraktivität von DXR/(C4 + C4a) + (C5 + C9 + C13 + C17) Komplexen bei molaren Verhältnissen von (C4 + C4a)(C5 + C9 + C13 + C17) von 1:1,3; 1:1,6; 1:2 und 1:2,5 die Wirkung von DXR allein.

Claims

Eine Verbindung, die die folgende Formel besitzt:
oder
Die Verwendung von N-(all-trans-Retinoyl)-Doxorubicin (I) für die Herstellung eines therapeutischen Mittels.
Die Verwendung von N-(13-cis-Retinoyl)-Doxorubicin (II) für die Herstellung eines therapeutischen Mittels.
Die Verwendung von N-(all-trans-Retinoyl)-Doxorubicin (I) für die Herstellung eines therapeutischen Mittels für die Behandlung von Krebs.
Die Verwendung von N-(13-cis-Retinoyl)-Doxorubicin (II) für die Herstellung eines therapeutischen Mittels für die Behandlung von Krebs.
Die Verwendung von N-(all-trans-Retinoyl)-Doxorubicin (I) für die Herstellung eines intravenös zu verabreichenden therapeutischen Präparats für die Behandlung von Krebs.
Die Verwendung von N-(13-cis-Retinoyl)-Doxorubicin (II) für die Herstellung eines intravenös zu verabreichenden therapeutischen Präparats für die Behandlung von Krebs.