DE69931749T2

DE69931749T2 - Von membran-proteoliposomen patient-spezifischen bösartigen weissen blutzellen impstoff

Info

Publication number: DE69931749T2
Application number: DE69931749T
Authority: DE
Inventors: C. Mircea Plainsboro POPESCU; Lawrence Monmouth Junction BONI; J. Richard Princeton Junction ROBB; M. Michael Hamilton BATENJANY
Original assignee: Biomira USA Inc
Current assignee: Biomira USA Inc
Priority date: 1998-01-16
Filing date: 1999-01-15
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2019-01-16
Also published as: EP1045698A1; US20020155135A1; CA2318557A1; AU2031899A; DE69931749D1; ATE328607T1; US6207170B1; WO1999036085A1; AU737330B2; US20010012517A1; EP1045698B1; JP2002509114A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf die Herstellung neuer Zusammensetzungen gerichtet, die als Impfstoffe zur Behandlung von Malignitäten der weißen Blutkörperchen (WBC) geeignet sind. Die Erfindung betrifft einen patientenspezifischen liposomalen Impfstoff, der aus WBC-Membranen besteht und durch Hinzufügen weiterer Lipide und/oder Immunstimulatoren formuliert werden kann, wodurch eine neue Membranproteoliposom-(MP-)Struktur gebildet wird.
Bekannte Impfstoffe verwenden typischerweise entweder ein gereinigtes Antigen oder ein abgeschwächtes Pathogen als Immunogen. Jedoch können abgeschwächte Impfstoffe sogar die Infektion verursachen, gegen die eine Person immunisiert wird. Andererseits induzieren gereinigte Antigene möglicherweise keine langfristige Immunantwort, und manchmal induzieren sie überhaupt keine Antwort. Im Gegensatz zu der kurzfristigen Immunantwort, die durch direkte Immunisierung mit bestimmten Antigenen erhalten wird, kann die Präsentation des Antigens in der Gegenwart von Liposomen eine langfristige Antwort induzieren, was für jeden wirksamen Impfstoff wesentlich ist.
Obwohl sie typischerweise aus gereinigten oder teilweise gereinigten Lipiden gebildet werden, können Liposome wenigstens zum Teil auch aus Zellmembranen von malignen Zellen, die potentielle Antigene enthalten, gebildet werden. Aufgrund des Vorhandenseins von membranassoziierten Antigenen können diese von Membranen abgeleiteten Präparationen als malignitätsspezifische Impfstoffe verwendet werden. Tatsächlich wurden einige Arten der von Membranen abgeleiteten Präparationen als tumorspezifische Antigene (TSA) verwendet, um Melanome und das SL2-Lymphosarkom der Maus zu behandeln. Siehe Gershman et al., Vaccine Res. 3:83-92 (1994), Bergers et al., J. Confr. Rel. 29:317-27 (1994), Bergers et al., J. Liposome Res. 6:339-35 (1996). In diesen Fällen hatte die Herstellung von Impfstoffen schwerewiegende Nachteile. So erforderte sie die Vereinigung von für Kulturen geeignete Zellen, um große Mengen der gewünschten Zellpopulationen zu erhalten, die Verwendung von ganzen γ-bestrahlten Tumorzellen, die Solubilisierung mit Detergenzien oder Butanol für die Rohextraktion von tumorassoziierten Antigenen (TAA). Siehe Gershman et al. (1994), supra, Abbas et al., CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY, S. 372-73 (W. B. Saunders Company, Philadelphia 1994), Bergers et al. (1994), supra, LeGrue et al., J. Natl. Cancer Inst. 65:191-96 (1980). Dieser Ansatz ist darüber hinaus nicht patientenspezifisch.
Im Stand der Technik sind auch einige Impfstoffe bekannt, die auf bestimmte B-Zell-Malignitäten gerichtet sind. Typischerweise haben Versuche zur Herstellung von Impfstoffen gegen das B-Zell-Lymphom auf die kostenintensive und zeitaufwendige Hybridomtechnik zurückgegriffen. Diese Verfahren beruhen auf der Erzeugung eines Hybridoms, welches in der Lage ist, das tumorspezifische Immunglobulin (Ig) in ausreichender Menge zu produzieren, damit es dann als Impfstoff verwendet werden kann. Kwak et al., Blood 76:2411-17 (1990), Kwak et al., N. Engl. J. Med. 327: 1209-15 (1992). Bekannte Impfstoffe gegen das B-Zell-Lymphom verwenden den Ig-Idiotyp (Id), um anti-idiotypische Antikörper gegen B-Zellen zu erzeugen. Levy et al., PCT/US94/08601 (23. Feb. 1995), Levy et al., US-Patent Nr. 4,816,249 (1989). In ähnlicher Weise brachten bekannte Melanomimpfstoffe das Ernten von Zelloberflächenantigenen, die während der Kultivierung abgeworfen werden, mit sich. Bystryn, US-Patent Nr. 5,635,188 (1997), Bystryn, US-Patent Nr. 5,194,384 (1993), Bystryn, US-Patent Nr. 5,030,621 (1991).
Es besteht daher im Stand der Technik ein unerfüllter Bedarf nach verbesserten Impfstoffen auf Liposombasis. Insbesondere besteht ein Bedarf nach verbesserten Impfstoffen gegen Malignitäten der weißen Blutkörperchen.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend ist es ein Ziel der Erfindung, neue Impfstoffzusammensetzungen bereitzustellen, die die oben genannten sowie weitere Nachteile des Standes der Technik überwinden. Gemäß diesem Ziel der Erfindung werden Membranproteoliposome (MPs) bereitgestellt, die malignitätsspezifisch, patientenspezifisch und leicht herzustellen sind. In einer Ausführungsform werden somit MPs bereitgestellt, welche die Zellmembran eines malignen weißen Blutkörperchens, wenigstens einen Immunstimulator und wenigstens ein Lipid umfassen, wobei das Lipid in Form von Lipidpulver oder vorgeformten Liposomen zugegeben werden kann. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung liefert neue Impfstofformulierungen, die ein MP enthalten, welches die Zellmembran eines weißen Blutkörperchens umfaßt, und wenigstens einen Immunstimulator beinhalten können.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, Verfahren zur Herstellung von MPs und Impfstoffen bereitzustellen, die die Nachteile des Standes der Technik ebenfalls überwinden. Gemäß diesem Ziel der Erfindung werden Verfahren offenbart, die nicht auf das Ernten des Impfstoffantigens, auf die Hybridomherstellung oder andere Zwischenstufen zurückgreifen. Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen das Formulieren eines Impfstoffs direkt aus isolierten, Antigen enthaltenden Membranen aus den eigenen weißen Blutkörperchen (WBCs) des Patienten, was sie überaus wirksam und patientenspezifisch macht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Überlebensergebnisse, nachdem Mäuse mit der in Beispiel 5 beschriebenen MP-Formulierung geimpft wurden.
2 zeigt die zusammengefügten Teile in Membranproteoliposomen, wobei die zusammengefügten Teile aus DMPC-reichen und WBC-Membran-reichen Bereichen bestehen.
Ausführliche Beschreibung
Einleitung
Die vorliegende Erfindung stellt Membranproteoliposomstrukturen (MPs) bereit, die bei der Formulierung patientenspezifischer Impfstoffe zur Behandlung von Malignitäten weißer Blutkörperchen (WBC) geeignet sind.
Die Erfinder haben zuvor einen proteoliposomalen Impfstoff aus Antigen-Idiotyp- (Id-) und Interleukin-2- (IL-2-) Proteinen in einer liposomalen Struktur beschrieben (Popescu et al., PCT/US97/02351). Im Gegensatz zu dieser früheren Arbeit wird hier eine neue, als Membranproteoliposom (MP) bezeichnete liposomale Struktur offenbart, die für gewöhnlich Phospholipid, eine integrale Membran aus einem malignen WBC und einen wirksamen Immunstimulator umfaßt. Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entdeckung, daß Membranen von WBC-Malignitäten mit anderen Komponenten verschmolzen werden können, um einen wirksamen Impfstoff gegen die Malignität zu bilden.
Alle WBCs, einschließlich polymorphonukleärer Zellen (PMN), Monozyten und T- oder B-Lymphozyten, unterliegen einer malignen Transformation, die zu einem ganzen Spektrum von Krankheiten führt. Beispielsweise umfaßt eine B-Zell-Malignität Non-Hodgkins-Lymphome, chronische lymphozytische Leukämie und multiples Myelom. Die vorliegende Erfindung ist bei der Behandlung oder Prävention vieler solcher Malignitäten von Bedeutung.
Bei der Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe können WBCs direkt vom Patienten erhalten werden, um die intakten Membranen, die reich an tumorspezifischen Antigenen (TSA) und tumorassoziierten Antigenen (TAA) sind, zu isolieren. Im allgemeinen werden die Zellen entkernt und ihre Plasmamembranen werden von anderen Komponenten (z.B. Mitochondrien, Lysosomen) getrennt. Die Plasmamembranen werden typischerweise gewaschen, um zelluläre Verunreinigungen, die Zytoskelettstrukturen enthalten können, und das Trennmaterial zu entfernen. Die Plasmamembransuspensionen können dann einer mechanischen Größenreduzierung, beispielsweise mittels Extrusion, Homogenisierung oder anderer Scherverfahren, ausgesetzt werden. Dies erlaubt eine Filtration durch einen Sterilisationsfilter. Die WBC-Membranen können auch mit Detergenzien löslich gemacht, mit Lipiden nach Wahl wiederhergestellt und dann in der Größe reduziert werden. Anstelle von mechanischen Größenreduktionsverfahren können die isolierten Membranen beispielsweise mittels γ-Bestrahlung sterilisiert werden.
Die isolierten Membranen von malignen Zellen können dann allein oder in Kombination mit zugegebenen Lipiden verwendet werden, um einen Immunmodulator einzuschließen. Das Ausmaß des Einschlusses des Immunmodulators, der Immunogenizität und der Wirksamkeit des MP als Impfstoff kann durch die Art der die Grundlage bildenden Lipide moduliert werden. Eine so optimierte MP-Formulierung kann dann verwendet werden, um den Patienten gegen seine spezifische WBC-Malignität zu impfen.
Die vorliegende Erfindung ist insbesondere zur Impfung gegen Non-Hodgkins-Lymphome geeignet. Diese Lymphome sind gekennzeichnet durch die Expression von monotypischem Immunglobulin (Ig), welches als tumorspezifisches Antigen dienen kann. Zusätzlich exprimieren diese Zellen typischerweise Oberflächenmoleküle, die an der Antigen-Präsentation beteiligt sind, wie MHC-Moleküle der Klasse I und Klasse II (mit assoziiertem TSA- oder TAA-Peptid), und die an der Costimulation beteiligt sind, wie Adhäsionsproteine und B7.1 und B7.2 (CD80 und CD86). Insbesondere verstärkt das Vorliegen eines MHC-Moleküls der Klasse I in der erfindungsgemäßen Formulierung potentiell die zytotoxische Immunantwort gegen den Tumor. Diese Charakteristika machen die Plasmamembran des B-Zell-Lymphoms zu einem attraktiven Kandidaten, der als potentiell starkes immunogenes Werkzeug bei der aktiven spezifischen Immuntherapie verwendet werden kann.
Die vorliegende Erfindung liefert einen proteoliposomalen, patientenspezifischen Impfstoff gegen WBC-Malignitäten, der in einer Ausführungsform hergestellt wird, indem ein wirksamer Immunmodulator zusammen mit Membranen maligner weißer Blutkörperchen eingeschlossen wird. Das resultierende Membranproteoliposom kann entweder (1) eine von einer Zelle abgeleitete Membran sein, in die wenigstens ein zugegebenes membranbildendes Lipid eingeflickt ist, oder (2) eine Lipidmembran (z.B. ein Liposom), in die eine von einer Zelle abgeleitete Membran eingeflickt ist. Mit "eingeflickt" ist gemeint, daß das resultierende MP im Hinblick auf die Lipidquellen der Komponenten nicht homogen ist. Somit sind zusammenhängende Abschnitte des MP im wesentlichen von WBC-Membranen abgeleitet, wohingegen andere im wesentlichen von den zugegebenen membranbildenden Lipiden abgeleitet sind. In den drei unten aufgeführten Beispielen werden MP-Formulierungen beschrieben, die eine Membran aus einem B-Zell-Lymphom der Maus (38C13) enthalten und die in einem Mausmodell des Non-Hodgkins-B-Zell-Lymphoms als wirksame Impfstoffe verwendet wurden.
Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung
Die Impfstoffzusammensetzungen der Erfindung umfassen typischerweise wenigstens eine Membrankomponente eines malignen weißen Blutkörperchens. Wichtige Membrankomponenten umfassen insbesondere an der Immunität beteiligte Komponenten. An der Immunität beteiligte Komponenten können irgendwelche Makromoleküle, wie Proteine, Lipide und Kohlenhydrate, beinhalten, die normalerweise ein integraler Bestandteil der Zellmembran oder einfach mit dieser assoziiert sind. Andere organische und anorganische Substanzen, die in ähnlicher Weise mit der Zellmembran assoziiert sind, sind ebenfalls enthalten. Einige bevorzugte, an der Immunität beteiligte Komponenten umfassen tumorspezifische Antigene (TSA), tumorassoziierte Antigene (TAA), wichtige Histokompatibilitäts-(MHC-)Antigene (Moleküle der Klasse I und Klasse II) und costimulatorische Moleküle.
Costimulatorische Moleküle sind Zweitsignalimmunstimulatoren, die mit der T-Zell-Aktivierung verbunden sind. Costimulatorische Moleküle sind typischerweise Zelloberflächenmoleküle, die zusammen mit primären Immunsignalen, d.h. durch MHC-Moleküle präsentiertem Antigen, wirken, um eine Immunantwort zu erzeugen. Da sie zusammenwirken, erleichtern primäre und sekundäre Signalmoleküle somit die Antigen-Präsentation durch Antigen-präsentierende Zellen (APC) an T-Zellen. Beispiele costimulatorischer Moleküle umfassen Zelladhäsionsmoleüle und CD-40. Spezifische bevorzugte costimulatorische Moleküle beinhalten B7.1, B7.2 und ICAM-1 (CD 56).
Vorzugsweise hat die Membrankomponente die Form einer isolierten Plasmamembran (ganz oder teilweise). Die isolierte Plasmamembran besteht vorzugsweise aus einem Lipid, welches membranbildend ist. Somit liegen typischerweise alle Komponenten vor, die normalerweise ein integraler Bestandteil der Zellplasmamembran oder mit dieser assoziiert sind, einschließlich an der Immunität beteiligter Komponenten. Diese bevorzugte Membrankomponente wird für gewöhnlich aus einem Patienten isoliert, der geimpft werden soll. Der diese Membrankomponente enthaltende resultieren de Impfstoff ist somit patientenspezifisch und spezifisch für die WBC-Malignität, aus der die Membrankomponente isoliert wurde. Es ist vorgesehen, daß ein mit einer Membrankomponente aus einem Patienten formulierter Impfstoff auch beim Impfen eines anderen Patienten nützlich ist, wenn ähnliche antigene Determinanten gegeben sind. Natürlich ist es aufgrund von Kreuzreaktivität oder gemeinsamen antigenen Determinanten auch möglich, daß der Impfstoff gegen eine Malignität sich auch beim Impfen gegen eine andere Malignität als nützlich erweist. Der Begriff "patientenspezifisch", wie er hier verwendet wird, bezieht sich also darauf, daß der Impfstoff von einem bestimmten Patienten abgeleitet ist (und somit für die Behandlung dieses Patienten geeignet ist), und bedeutet nicht, daß er nur dazu geeignet ist, den Patienten oder die spezifische Malignität, aus dem bzw. aus der er abgeleitet wurde, zu behandeln. Obwohl der Patient normalerweise ein Mensch ist, können auch nicht-menschliche Tiere Patienten sein.
Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen können speziell für jede Malignität weißer Blutkörperchen hergestellt werden. Der Krankenhausarzt ist mit den verschiedenen Arten von weißen Blutkörperchen und deren Malignitäten vertraut. Repräsentative weiße Blutkörperchen umfassen polymorphonukleäre Zellen (PMNs), Monozyten, T-Lymphozyten und B-Lymphozyten. Einige repräsentative Malignitäten von weißen Blutkörperchen umfassen Lymphome, Leukämien und Myelome. Weitere Malignitäten von weißen Blutkörperchen sind im Stand der Technik bekannt. Weitere Beispiele von WBC-Malignitäten sind zu finden in McCance et al., PATHOPHYSIOLOGY: THE BIOLOGIC BASIS OF DISEASE IN ADULTS AND CHILDREN, Kapitel 24 Und 25, S. 800-855 (The C.V. Mosby Company 1990).
Einige bevorzugte Impfstoffzusammensetzungen umfassen weiterhin wenigstens einen Immunstimulator. Immunstimulatoren beinhalten insbesondere jede Substanz, die verwendet werden kann, um die Immunantwort zu modulieren. Besonders geeignete Immunstimulatoren sind diejenigen, die verwendet werden können, um die spezifische Immunantwort auf an der Immunität beteiligte Komponenten zu stimulieren. Beispielhafte Klassen solcher geeigneter Immunstimulatoren beinhalten: Lymphokine, wie IL-2, IL-4 und IL-6, Interferone, wie IFN-γ und IFN-α, andere Zytokine, wie GM-CSF und M-CSF, und Adjuvanzien, wie Lipid A, Monophosphoryllipid A (MPL) oder Muramyldipeptid (MDP). Immunstimulatoren können allein oder in irgendeiner Kombination miteinander verwendet werden. Einige Zusammensetzungen umfassen wenigstens zwei Immunstimulatoren, wie IL-2 und MPL oder MDP, und andere Kombinationen von Zytokinen mit Adjuvanzien.
Weitere bevorzugte Impfstoffzusammensetzungen umfassen Lipide, welche andere sind als diejenigen, die in der Zellmembrankomponente vorliegen (d.h. aus einer exogenen Quelle stammen). Diese "exogenen" Lipide können aus natürlichen oder synthetischen Quellen stammen. Bevorzugte Lipide umfassen Phospholipide, Glycolipide und insbesondere gesättigte Phospholipide. Gesättigte Phospholipide umfassen 1,2-Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), 1,2-Dimyristoylphosphatidylglycerol (DMPG). Weitere geeignete Lipide umfassen Cholesterol und Derivate davon. Natürlich sind auch Kombinationen dieser und anderer Lipide geeignet.
Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffe
Die Herstellung eines erfindungsgemäßen Impfstoffs umfaßt zunächst das Isolieren der WBC-Membrankomponenten, so daß sie frei von anderen Zellkomponenten sind. Ein solches Beispiel ist unten als Beispiel 4 angegeben. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden isolierte Membranen typischerweise mit anderen Lipiden und/oder Immunstimulatoren kombiniert, um MPs zu bilden. Im Stand der Technik gibt es viele Verfahren zur Liposombildung, und bei der Herstellung des vorliegenden MP kann irgendeines dieser Standardverfahren verwendet werden.
In einem beispielhaften Verfahren können MPs hergestellt werden, die IL-2 als einen Immunstimulator enthalten. Das IL-2 wird mit den WBC-Membranen gemischt und durch Einfrieren/Auftauen von –70°C bis 37°C, gefolgt von kurzem Vortexen und einer kurzen Ultraschallbadbehandlung (30 Sekunden) eingeschlossen. Die Herstellung kann das Zugeben eines geeigneten Lipidpulvers in einer Menge von 50 bis 300 mg/ml (Endkonzentration) umfassen. Unter Verwendung dieses Verfahrens können daher MPs unabhängig von exogenen Lipiden oder von WBC-Membrankomponenten im Gemisch mit exogenen Lipiden gebildet werden.
Es können auch MPs hergestellt werden, die nur WBC-Membrankomponenten enthalten, die mit bereits vorhandenen Liposomen, welche exogene Lipide umfassen, verschmolzen werden können. Eine WBC-Membransuspension wird lyophilisiert, dann mit einer geeigneten Flüssigkeit, z.B. Wasser, normaler Salzlösung (NSS) oder einem geeigneten Puffer, hydratisiert. Die Hydratisierungsflüssigkeit kann einen Immunmodulator enthalten. So werden WBC-Membrankomponenten enthaltende MPs gebildet. Zusätzlich können vor der Lyophilisierung zuvor gebildete multilamellare Vesikel (MLVs), die aus geeigneten exogenen, für die Liposombildung geeigneten Lipiden bestehen, mit der WBC-Membransuspension gemischt werden. Die MLVs können einen zuvor aufgenommenen Immunmodulator enthalten, wobei dann die lyophilisierte Präparation mit einer geeigneten Flüssigkeit, die wenigstens einen Immunmodulator enthalten kann, hydratisiert wird. Bei allen Verfahren zur Herstellung von MPs kann daher jede Kombination aus mehreren Immunstimulatoren an irgendeinem geeigneten Punkt in dem Prozeß aufgenommen werden.
Bei einem anderen Verfahren wird die WBC-Membransuspension mittels Extrusion, Homogenisierung oder anderer Scherverfahren größenreduziert, um kleine unilamellare Vesikel (SUVs) zu bilden. Die SUVs werden dann lyophilisiert und mit einer geeigneten Flüssigkeit, die optional einen Immunmodulator enthält, hydratisiert. Aus exogenen Lipiden hergestellte SUVs können auch vor der Stufe der Lyophilisierung zugegeben werden. Zusätzlich kann der Immunmodulator vor der Lyophilisierung mit den SUVs gemischt werden. In jedem Fall kann, wann immer die lyophilisierte Präparation hydratisiert wird, die Flüssigkeit einen Immunmodulator enthalten.
Bei noch einem weiteren Verfahren wird eine WBC-Membransuspension zu MLVs zugegeben, die exogene Lipide enthalten. Das resultierende Gemisch wird lyophilisiert und mit Wasser, NSS oder Puffer hydratisiert, gefolgt von einer Größenreduktion (Extrusion, Homogenisierung oder andere Scherverfahren), um SUVs zu bilden. Ein Immunmodulator kann zugegeben werden, und man läßt das Gemisch über Nacht verschmelzen.
Ein weiteres Verfahren umfaßt das Zugeben einer WBC-Membransuspension zu MLVs, die exogene Lipide umfassen. Das Gemisch wird lyophilisiert und mit einer geeigneten Flüssigkeit hydratisiert. Die resultierende Suspension wird mittels Extrusion, Homogenisierung oder anderer Scherverfahren größenreduziert, um SUVs zu bilden. Die SUVs werden lyophilisiert und mit einer geeigneten Flüssigkeit, die optional einen Immunmodulator enthält, hydratisiert.
Die WBC-Membransuspension kann auch mittels Extrusion, Homogenisierung oder anderer Scherverfahren größenreduziert werden, um SUVs zu bilden. Ein Immunmodulator wird zu den SUVs zugegeben, und man läßt das Gemisch über Nacht verschmelzen.
Impfstoffe können auch mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff formuliert sein. Solche Hilfsstoffe sind im Stand der Technik gut bekannt, sollten jedoch typischerweise physiologisch verträglich und inert sein oder im Hinblick auf die Impfstoffeigenschaften der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verstärkend wirken. Wenn ein Hilfsstoff verwendet wird, kann er an irgendeinem Punkt bei der Formulierung des Impfstoffs zugegeben werden oder er kann mit der fertiggestellten Impfstoffzusammensetzung gemischt werden.
Impfstoffe können für mehrere Verabreichungswege formuliert werden. Besonders bevorzugte Verabreichungswege umfassen die intramuskuläre, perkutane, subkutane oder intradermale Injektion, die Verabreichung als Aerosol oder oral oder über eine Kombination dieser Wege gleichzeitig oder in mehreren Dosierungseinheiten. Die Verabreichung von Impfstoffen ist gut bekannt und hängt letztlich von der betreffenden Formulierung und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab.
Impfstofformulierungen können als Suspension gehalten werden oder sie können lyophilisiert und später hydratisiert werden, um einen verwendbaren Impfstoff zu erzeugen.
BEISPIELE
Beispiel 1 Isolierung von Plasmazellmembranen
Dieses Beispiel demonstriert ein Verfahren zum Isolieren von WBC-Plasmamembranen. Eingefrorene (–70°C) 38C13-B-Lymphomzellen der Maus wurden bei 37°C schnell aufgetaut und mit 2 × 10⁸ Zellen/ml in Homogenisierungspuffer (HB) suspendiert. Die Zusammensetzung des HB bestand aus 0,25 M Saccharose, 10 mM Tris-HCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM KCl, Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, 2 mM, Endkonzentration), Trypsin-Chymotrypsin-Inhibitor (200 μg/ml, Endkonzentration), DNase (10 μg, Endkonzentration) und RNase (10 μg/ml, Endkonzentration), pH 7,3. Die 38C13-Zellen wurden in einem tragbaren Dounce-Homogenisator (20-30 Durchläufe auf Eis) entkernt. Die Aufschlämmung wurde bei 500 × g zentrifugiert (10 Minuten, 4°C), und der Überstand wurde gesammelt. Das Pellet wurde in HB resuspendiert, und die Stufen der Homogenisierung und der Zentrifugation wurden wiederholt, bis das Pellet im wesentlichen frei von intakten Zellen war (nur ~95% Kerne), wie es anhand von Lichtmikroskopie beurteilt wurde. Die vereinigten Überstände wurden auf einen diskontinuierlichen Saccharosegradienten (p = 1,11, 1,18 und 1,25 g/ml) aufgeschichtet und bei 28000 × g zentrifugiert (30 Minuten, 4°C). Der an Plasmamembran reiche Bereich wurde gesammelt (p = Grenzfläche 1,11/1,18), zweifach mit NSS verdünnt und bei 28000 × g zentrifugiert (1 Stunde, 4°C). Das Pellet wurde erneut zweifach mit NSS verdünnt und wie oben zentrifugiert. Die gewaschenen Membranen wurden in einer minimalen Menge von NSS resuspendiert und bei 4°C gelagert.
Beispiel 2 Herstellung von Membranproteoliposomen
Dieses Beispiel demonstriert ein Verfahren zum Formulieren eines Impfstoffs aus isolierten WBC-Membranen. Der experimentelle Impfstoff MB-RM-1A wurde wie folgt formuliert: DMPC-Pulver (1 g), 4 ml der isolierten 38C13-Membranen (225 μg/ml IgM) in NSS und 160 μl IL-2 (1,25 × 10⁸ IU/ml) wurden in ein steriles 5 ml-Glasfläschchen gegeben, unmittelbar gevortext, in einem Wasserbad für 15 Minuten auf 37°C erhitzt, dann bei 37°C für 30 Sekunden in einem Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Diese Suspension wurde den folgenden Einfrier-/Auftauzyklen unterzogen:

1) Einfrieren bei –70°C (Trockeneis/Methanolbad) für 15 Minuten
2) Auftauen bei 37°C (Wasserbad) für 15 Minuten
3) kurzes Vortexen
4) Ultraschallbehandlung für 30 Sekunden in einem Ultraschallbad bei 37°C

Die Präparation wurde mit NSS auf ein Gesamtvolumen von 5 ml eingestellt und bei –70°C gelagert.
Beispiel 3 Wirksamkeit eines Vergleichsimpfstoffs
Dieses Beispiel demonstriert die Wirksamkeit von beispielhaften Impfstoffen, die gemäß der Erfindung und insbesondere mit dem Einfrier-/Auftauverfahren aus Beispiel 2 hergestellt wurden. Die unten angegebenen und in 1 gezeigten Ergebnisse zeigen, daß die geimpften Mäuse bei einer letalen Herausforderung mit B-Zell-Lymphom überlebten.
Wie es in der nachstehenden Tabelle zu erkennen ist, schützte der beispielhafte eingefrorene und aufgetaute MP-Impfstoff, MB-RM-1A, effektiv 85% der Mäuse, die mit einer letalen Dosis von 38C13-Lymphomzellen herausgefordert wurden. Im Vergleich dazu und wie es unten zusammengefaßt ist, war die Überlebensrate bei Kontroll-Impfstofformulierungen niedriger.
Tabelle
Die vorstehenden Probenbezeichnungen entsprechen dem folgenden: 4C5-Id ist eine nichtspezifische Antigenkontrolle, 38C13-Id ist ein Impfstoff, der aus löslichem 38C13-Immunglobulin besteht, 38C13-Id-KLH ist ein Impfstoff, der aus einem Konjugat zwischen Schlüsselloch- Napfschnecken-Hämocyanin und löslichem 38C13 besteht, OV XIV-2 ist ein liposomaler Impfstoff, der lösliches 38C13-Id und IL-2 enthält. Siehe Kwak et al., J. Immunol. 160: 3637-3641 (1998), Popescu et al. PCT/US97/02351.
Beispiel 4 Wirksamkeit eines Vergleichsimpfstoffs
Herstellung.
Ein gefrorenes (–70°C) Pellet von 38C13-Zellen wurde bei 37°C in einem Wasserbad schnell aufgetaut und dann auf Eis gegeben. Alle nachfolgenden Behandlungen wurden bei 4°C auf Eis durchgeführt, wenn es nicht anders angegeben ist. Das Pellet wurde bei 1 K × g × 10 Minuten mit (5) Volumen eiskalter PBS gewaschen. Das Pellet wurde in eiskalter NSS, die 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und jeweils 100 μg/ml DNase und RNase enthielt, resuspendiert. Die Zellen wurden mittels Emulgieren durch eine Nadel mit 22 Gauge (50 Durchläufe) und unter Verwendung eines tragbaren Dounce-Homogenisators (50 Durchläufe) entkernt. Die Suspension wurde zentrifugiert, um die Zellkerne bei 330 × g × 10 Minuten zu pelletieren, und der Überstand wurde auf einen Nycodenz-Gradienten (p = 1,22) aufgeschichtet und bei 60K × g × 1 Stunde zentrifugiert. WBC-Plasmamembranen wurden an der Grenzfläche von Wasser/Nycodenz gesammelt und mit (7) Volumen NSS bei 60K × g × 30 Minuten gewaschen. Die pelletierten Membranen wurden in NSS resuspendiert. Ein Teil dieser Membranen wurde verwendet, um MCFC9803 unter Verwendung des in Beispiel 2 beschriebenen Einfrier-/Auftauverfahrens zu formulieren. Der Rest der gewaschenen Zellmembranen wurde bei –22K psi (15-20 Durchgänge) homogenisiert und verwendet, um die Präparationen MCFA9803 und MCFB9803 zu formulieren. Das Folgende beschreibt den experimentellen Aufbau der Formulierungen MCFA9803, MCFB9803 und MCFC9803:
MCFA9803:

a) Homogenisierte WCB-Membranen wurden zu DMPC-SUVs und IL-2 zugegeben.
b) Man ließ das Gemisch durch Inkubation über Nacht bei 19°C zu MLVs verschmelzen (Boni et al., PCT-Anmeldung basierend auf US-Seriennummer 60/060,606 "Multilamellar Coalescence Vesicles (MLCV) Containing Biologically Active Compounds").

MCFB9803:

a) Homogenisierte WCB-Membranen wurden zu DMPC-SUVs zugegeben und lyophilisiert.
b) MLVs wurden nach Wiederherstellung mit Puffer, der IL-2 enthielt, gebildet.

MCFC9803:

a) DMPC (Pulver) und IL-2 wurden zu einer Suspension von WCB-Zellmembranen zugegeben.
b) MLVs wurden durch das in Beispiel 2 beschriebene Einfrier-/Auftauverfahren gebildet.

Überlebensdaten.
1 zeigt die Wirksamkeit von MP-Impfstoffen, die gemäß der Erfindung hergestellt wurden, und insbesondere die Überlebensdaten nach der Formulierung unter Verwendung dreier verschiedener Verfahren zur Herstellung. Die Ergebnisse zeigen, daß die geimpften Mäuse eine letale Reizsetzung mit B-Zell-Lymphom überlebten. Die beispielhaften MP-Impfstoffe, MCFA9803 und MCFC9803, schützten effektiv 78% (7/9) bzw. 90% (9/10) der mit einer letalen Dosis von 38C13-Lymphomzellen gereizten Mäuse. Die Zugabe von IL-2 nach der Lyophilisierung und während der Wiederherstellung war weniger effektiv (MCFB9803, 20% Überlebensrate). Bei diesem Lymphommodell bieten jedoch alle Formulierungen einen gewissen Schutz.
Beispiel 5 Membranproteoliposom-Charakterisierung
Dieses Beispiel zeigt ein alternatives Verfahren zur Formulierung eines Impfstoffs aus isolierten WCB-Membranen. SUVs (0,5 ml bei 200 mg/ml), hergestellt aus DMPC, WBC-Membranen (0,5 ml) und IL-2 (19 μl bei 1,07 × 10⁸ IU/ml), werden vereinigt, und das Gemisch wird lyophilisiert. Bei Wiederherstellung mit 0,5 ml destilliertem Wasser werden 59% des IL-2 wiederhergestellt, wovon 100% in die Membranproteoliposome aufgenommen werden, und 84% des IgM werden wiederhergestellt, wovon 80% in die Membranproteoliposome aufgenommen werden. Die mittlere Größe der Membranproteoliposome beträgt 2,8 Mikrometer. Die in 2 gezeigte Gefrierbruch-Elektronenmikroskopie zeigt Membranproteoliposome mit den charakteristischen DMPC-Liposomen der zackigen Phase im Gemisch mit WBC-Membranen, die Intramembranpartikel enthalten. Die beiden unterschiedlichen Bereiche in einem Membranproteoliposom definieren das "Flicken" von WBC-Membranen mit DMPC-Lipiden.

Claims

Impfstoff für die Behandlung bösartiger weißer Blutzellen, der ein Liposom umfaßt, das eine Plasmamembran von einer eigenen bösartigen weißen Blutzelle des Patienten enthält.
Impfstoff nach Anspruch 1, bei dem die bösartige weiße Blutzelle eine Lymphomzelle ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, worin die bösartige weiße Blutzelle eine Leukämiezelle ist.
Impfstoff nach Anspruch 1, worin die bösartige weiße Blutzelle eine Myelomzelle ist.
Liposom mit integraler Membran von einer bösartigen weißen Blutzelle, wenigstens einem Immuno-Stimulator und einem exogenen Lipid.
Liposom nach Anspruch 5, worin die Membran wenigstens eine Membrankomponente enthält, die bei Immunität beteiligt ist.
Liposom nach Anspruch 5 oder Anspruch 6 mit wenigstens zwei Immuno-Stimulatoren.
Liposom nach Anspruch 6 oder Anspruch 7, bei dem die Komponente aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem tumorspezifischen Antigen, einem Antigen mit einem Histokompatibilitätskomplex und einem Co-Stimulatormolekül besteht.
Liposom nach Anspruch 8, worin das Co-Stimulatormolekül B7.1, B7.2 oder ICAM-1 ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 5 bis 9, worin der Immuno-Stimulator ein Lymphokin ist.
Liposom nach Anspruch 10, worin das Lymphokin IL-2 ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 5 bis 11, worin der Immuno-Stimulator ein Interferon ist.
Liposom nach Anspruch 12, worin das Interferon IFN-γ ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 5 bis 13, worin der Immuno-Stimulator ein Cytokin ist.
Liposom nach Anspruch 14, worin das Cytokin GM-CSF oder M CSF ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 5 bis 15, worin der Immuno-Stimulator ein Hilfsmittel ist.
Liposom nach Anspruch 16, worin das Hilfsmittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Monophosphoryl-Lipid A, Lipid A und Muramyldipeptid (MDP)-Lipidkonjugat besteht.
Liposom nach einem der Ansprüche 5 bis 17, worin das Lipid ein gesättigtes oder ungesättigtes Phospholipid oder ein Glycolipid ist.
Liposom nach Anspruch 18, worin das Lipid aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 1,2-Dimyristoylphosphatidylcholin, 1,2-Dipalmitoylphosphatidylcholin, 1,2-Dimyristoylphosphatidylglycin, Cholesterin und Kombinationen hiervon besteht.
Liposom nach einem der Ansprüche 5 bis 19, worin das Lipid eine Membran bildet, in welcher die integrale Membran eingeflickt ist.
Liposom nach einem der Ansprüche 5 bis 20, worin das Lipid Flicken in der integralen Membran bildet.
Liposom nach einem der Ansprüche 5 bis 21 zur Verwendung bei der Behandlung bösartiger weißer Blutzellen.
Verwendung eines Liposoms nach einem der Ansprüche 5 bis 21 bei der Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung für die Behandlung bösartiger weißer Blutzellen.