DE69930662T2 - Humane rezeptortyrosinkinase - Google Patents

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Description

  • Die Anmelder beanspruchen hierin Priorität unter Titel 35 USC § 119(e) der vorläufigen Anmeldung HUMAN RECEPTOR TYROSINE KINASE, Seriennr.60/088,958, die am 11. Juni 1998 beim US-amerikanischen Patent und Markenamt beantragt wurde, welche hierin durch Bezugnahme enthalten ist.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen, die eine neuartige Rezeptortyrosinkinase betreffen, und die Verwendung dieser Sequenzen zur Identifizierung von Verbindungen, welche eine biologische und/oder pharmakokinetische Aktivität des nativen Biomoleküls modulieren. Die Erfindung betrifft auch biologisch wirksame Antisense-Moleküle sowie dominant-negative mutante Versionen der Rezeptortyrosinkinase, die für den therapeutischen Gebrauch geeignet sind. Die Erfindung betrifft auch die Diagnose, Untersuchung, Prävention und Behandlung pathophysiologischer Erkrankungen, die mit der Rezeptortyrosinkinase zusammenhängen oder von der Rezeptortyrosinkinase vermittelt werden.
  • Allgemeiner Stand der Technik
  • Pathologische Angiogenese tritt unter vielen Bedingungen auf, und es wird angenommen, dass sie durch lokale Ischämie ausgelöst wird. Zu den Erkrankungen, bei denen Angiogenese eine wichtige Rolle bei der zugrunde liegenden Pathologie spielen dürfte, gehören: Augenerkrankungen wie beispielsweise diabetische Retinopathie, Retinopathie oder Frühgeborenenretinopathie und altersbedingte Makuladegeneration, Gefäßerkrankungen wie beispielsweise ischämische Herzerkrankung und Atherosklerose, chronische Entzündungserkrankungen wie Psoriasis und rheumatoide Arthritis und Wachstum eines massiven Tumors. Eine kürzliche Übersicht konzentriert sich auf die Rolle von RTKs bei der Tumorangiogenese; Shawver, L.K., et al., Receptor Tyrosine Kinases as Targets for Inhibition of Angiogenesis, Drug Discovery Today (Elsevier Science Ltd.), 2(2):50 (1997). Die Übersicht beschäftigt sich vorwiegend mit der Rolle von Wachstumsfaktoren und deren Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) bei der Regulierung der Physiologie von Mikrogefäßen in Zusammenhang mit dem angiogenen Prozess. Zum Wachstum und zur Metastasierung massiver Tumore ist das Wachstum neuer Blutgefäße erforderlich. Die Signifikanz einer Angiogenese in menschlichen Tumoren wurde von kürzlichen Studien hervorgehoben, welche den angiogenen Phänotyp zum Überleben der Patienten in Bezug setzen. Diese Studien fanden heraus, dass die Anzahl an Mikrogefäßen in einem primären Tumor bei Brustkarzinom, Blasenkarzinom, Kolonkarzinom und Tumoren der Mundhöhle prognostische Signifikanz hat. Antiangiogene Mittel finden potenziell breite Anwendung in der Klinik. Idem. Siehe auch Herz, Jeffrey M., et al., Molecular Approaches to Receptors as Targets for Drug Discovery, J. of Receptor & Signal Transduction Research, 17(5):671(1997).
  • Marra et al: EMBL ACC Nr. AA098024, 27. Oktober 1996; beschreibt eine Maus-EST-Sequenz, deren korrespondierendes Polypeptid die zugewiesene Funktion eines Tyrosinkinaserezeptors hat. Auffray et al. EMBL ACC Nr. Z42722, 6. November 1994, beschreibt ein humanes EST ohne zugewiesene Funktion, das Identität zu Abschnitten der Sequenz der vorliegenden Erfindung zeigt.
  • RTKs (auch als Wachstumsfaktorrezeptoren bekannt) spielen bei vielen zellulären Prozessen eine wichtige Rolle. Alle diese Moleküle haben eine extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne. Bei Bindung des Liganden dimerisieren die Rezeptoren, die Tyrosinkinase wird aktiviert und die Rezeptoren werden autophosphoryliert. Ulrich, A., et al., Cell, 61:203 (1990). Die durch die RTK-Aktivierung ausgelöste Kaskade moduliert zelluläre Ereignisse, wobei Proliferation, Differenzierung und Morphogenese auf positive oder negative Weise beeinflusst werden. Störungen der Expression von Wachstumsfaktoren, ihrer verwandten RTKs oder Bestandteile der nachgeschalteten Signalwege sind im Allgemeinen mit vielen Arten von Krebs assoziiert. Es wurde gezeigt, dass Genmutationen, aus denen veränderte Proteinprodukte entstehen, die Regulierungsmechanismen verändern, wodurch die zelluläre Proliferation beeinflusst wird, was zur Initiierung und Progression eines Tumors führt. Shawver, L.K., et al., Receptor Tyrosine Kinases as Targets for Inhibition of Angiogenesis, DDT (Elsevier Science Ltd.), 2(2):50 (1997).
  • Eine Strategie des Eingreifens in die Signalübertragung des Rezeptors besteht aus der Hemmung der Ligandenbindung. Dies lässt sich mit spezifischen rezeptorbindenden Antagonisten wie beispielsweise Ligandenfragmenten oder mit unspezifischen Antagonisten wie beispielsweise Suramin, mit neutralisierenden Antikörpern gegen den Liganden oder Rezeptor oder mit einem Überschuss an löslichem Rezeptor oder ligandenbindendem Protein, das den Liganden bindet, erreichen. Eine zweite Strategie des Eingreifens in die Signalübertragung des Rezeptors besteht daraus, die Signalübertragung durch Überexpression eines dominant-negativen Rezeptors zu blockieren. Da Rezeptorkinasen typischerweise Dimere bilden, um durch Transphosphorylierung eine Signalübertragung auszulösen, schwächt die Prävention der Rezeptordimerisierung durch Überexpression kinase-defizienter Rezeptoren die Aktivierung der Signalübertragung ab. Rezeptoren lassen sich kinase-defizient machen, indem in Aminosäuren eine Punktmutation eingeführt wird, die für die Kinasefunktion ausschlaggebend sind, oder die Kinase oder gesamte zytoplasmatische Domäne deletiert wird. Eine andere Strategie, um die Rezeptorfunktion zu verstehen, umfasst die Depletion des Rezeptorproteins. Dies kann durch Einführen exogener Mittel wie beispielsweise von Antisense-Oligonukleotiden, Antisense-RNA oder Ribozymen erreicht werden, die alle eine Degradation der Rezeptor-mRNA und zu einer allmählichen Depletion des Proteins in der Zelle bewirken. Idem.
  • Die von Tyrosinkinasen und Phosphotyrosinphosphatasen vermittelten grundlegenden zellulären Effekte machen sie zu attraktiven Zielen für die Entwicklung neuer therapeutischer Moleküle. Es ist beispielsweise bekannt, dass die Überexpression von Tyrosinkinasen wie HER2 eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Krebs spielen kann und dass Antikörper, welche die Aktivität dieses Enzyms blockieren können, Tumorwachstum aufheben können. Slamon, D. J., et al., Science, 235:177 (1987); Drebin, et al., Oncogene 2:387 (1988). Vor kurzem ist versucht worden, kleine Moleküle zu identifizieren, die als Tyrosinkinaseinhibitoren wirken. Beispielsweise sind monozyklische, bizyklische oder heterozyklische Arylverbindungen (PCT WO 92/20642), Vinylenazaindol-Derivate (PCT WO 94/14808) und 1-Cyclopropyl-4-pyridylquinolone (US-Patent Nr. 5,330,992) allgemein als Tyrosinkinaseinhibitoren beschrieben worden. Styrylverbindungen (US-Patent Nr. 5,217,999), styrylsubstituierte Pyridylverbindungen (US-Patent Nr. 5,302,606), bestimmte Quinazolin-Derivative (EP Anmeldung Nr. 0 566 266 AI), Seleoindole und Selenide (PCT WO 94/03427), trizyklische Polyhydroxylverbindungen (PCT WO 92/21660) und Benzylphosphonsäureverbindungen (PCT WO 91/15495) sind als Verbindungen zur Verwendung als Tyrosinkinaseinhibitoren zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs beschrieben worden.
  • Die Verfügbarkeit einer neuartigen humanen Rezeptortyrosinkinaseart, bei der eine eindeutige funktionelle Verbindung mit der Erkrankung besteht, ist ideal für solche Wirkstofftests sowie für die Diagnose, Untersuchung, Prävention und Behandlung pathophysiologischer Erkrankungen in Zusammenhang mit dem biologischen Molekül.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein gereinigtes Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid mit wenigstens 80% Homologie zu einem Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 Positionen 1-122, SEQ ID NO:3 Positionen 26-422 und SEQ ID NO:3 Positionen 123-422), codiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein gereinigtes Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein die Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 dargestellt ist, umfassendes Polypeptid codiert, wobei Position 147 (Lysin) von SEQ ID NO:3 substituiert oder deletiert ist
  • Isolierte und gereinigte Polynukleotide der vorliegenden Erfindung enthalten Sequenzen umfassend SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein gereinigtes Polynukleotid, umfassend die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 dargestellt ist, oder eine Variante von SEQ ID NO:3 mit wenigstens 80%iger Homologie zu einem Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 Positionen 1-25, SEQ ID NO:3 Positionen 1-122, SEQ ID NO:3 Positionen 26-422 und SEQ ID NO:3 Positionen 123-422)
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein isoliertes und gereinigtes biologisch effektives Antisense-Polynukleotidmolekül, umfassend ein Oligomer mit einer Länge im Bereich von 12 bis 25 Nukleotiden, das zu einer Region innerhalb von Positionen 67-148 und 1333-1414 von SEQ ID NO:1 komplementär ist.
  • Die Erfindung betrifft des Weiteren einen Expressionsvektor sowie Wirtszellen, welche den Expressionsvektor enthalten, für die Expression eines Polypeptids, wobei der Vektor eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ein Polypeptid, wie es in SEQ ID NO:3 dargestellt ist, codiert, oder ein pharmakologisch und/oder biologisch aktives oder biologisch aktives Derivat, wie oben beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die eine biologische und/oder pharmakologische Aktivität einer Tyrosinkinase modulieren, welche umfassen:
    • (a) Kombinieren eines aus einer Kandidatenverbindung bestehenden Aktivitätsmodulators mit einem Polypeptid mit einer Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 dargestellt ist, oder einer Variante, wie oben beschrieben, und
    • (b) Messen eines Effektes des aus einer Kandidatenverbindung bestehenden Modulators der biologischen und/oder pharmakologischen Aktivität des Polypeptids.
  • Darüber hinaus betrifft die Erfindung Verfahren der Behandlung eines Patienten, der eine solche Behandlung benötigt, wegen eines Zustandes, der von einer Tyrosinkinase vermittelt wird, umfassend das Verabreichen: (a) einer wirksamen Menge eines Polynukleotids, das ein biologisch wirksames dominant-negatives mutantes Polypeptid codiert, umfassend die in SEQ ID NO:3 dargestellte Sequenz, oder eine in Betracht gezogene Variante davon; und/oder (b) eine wirksame Menge eines biologisch wirksamen Antisense-Moleküls, das aus dem Gegenstück von SEQ ID NO:1 abgeleitet ist.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Sofern nicht anders definiert, haben alle hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie von einem Fachmann aus dem technischen Bereich, zu dem diese Erfindung gehört, im Allgemeinen verstanden wird. Alle Veröffentlichungen und Patente, auf die hierin Bezug genommen wird, sind hierin durch Bezugnahme enthalten.
  • „Biologische Aktivität", wie hierin in Bezug auf die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf die Kinaseaktivität des Biomoleküls und/oder die Leistung einer beliebigen Funktion oder mehrerer Funktionen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, die Fähigkeit zur Autophosphorylierung, zur Phosphorylierung eines Substrates, zur Bindung von ATP und zur Vermittlung der Aktivierung von Cdc2-Kinase. Pharmakologische Aktivität, wie hierin in Bezug auf die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezieht sich auf die direkte oder indirekte transkriptionelle Aktivierung eines Gens oder mehrerer Gene, sowie auf die Fähigkeit zur Vermittlung eines beliebigen physiologischen Zustandes oder mehrerer physiologischer Zustände, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Mitose, Zelldifferenzierung, Proliferation, onkogene Transformation, Neoplasie, Makrophagenregulierung, Endothelzellregulierung, Fibroblastenregulierung, Zytoskelettstruktur, Metastasen, Zellaggregation, Zellmotilität, Zytokinese, Krebs, Angiogenese, Zellalterung, akute und chronische Entzündung, Autoimmunerkrankungen, Arthritis, neurogenerative Prozesse, allergische Reaktionen, Stressreaktionen, Sekretion, Apoptose, Kachexie, neurologische Erkrankungen, periphere Gefäßerkrankung, Atherosklerose, Herzerkrankung, Asthma und Atherom.
  • „Dominant-negative Mutante", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Polypeptid- oder auf eine Nukleinsäuresequenz einer Codierungsregion, die in Bezug auf mindestens eine Position in der Sequenz relativ zu der entsprechenden nativen Wildtyp-Version an einer Position verändert worden ist, wodurch die Position eines Aminosäurerestes an einer aktiven Stelle, welche für biologische und/oder pharmakologische Aktivität des nativen Peptids erforderlich ist, verändert wird. Dominant-negative Mutanten von SEQ ID NO:3, die hierin in Betracht kommen, umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Polypeptidarten, die jede Veränderung in Bezug auf jede Veränderung des Restes Lys (K)147 bekunden.
  • „Biologisch wirksam", wie hierin in Bezug auf Antisense-Nukleinsäuremoleküle sowie auf dominantnegative mutante Nukleinsäurecodierungsregionen und dominant-negative mutante Peptide verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit dieser Moleküle, die biologische und/oder pharmakologische Aktivität der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung zu modulieren, einschließlich direkte oder indirekte Modulierung transkriptioneller Aktivierung eines Gens oder mehrerer Gene und/oder Transkription/Translation von Nukleinsäurecodierungsregionen der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung. Biologisch wirksame Antisense-Moleküle sowie Nukleinsäuren, die biologisch wirksame dominant-negative mutante Versionen von SEQ ID NO:3 codieren, sind bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
  • „Wie dargestellt", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Sequenz sowie auf dazu gehörige Derivate wie oben beschrieben, z. B. funktionelle Derivate, die im Wesentlichen dieselbe biologische und/oder pharmakologische Aktivität auf im Wesentlichen dieselbe Art und Weise zeigen oder durchführen. „Wie dargestellt" soll daher biologisch und/oder pharmakologisch aktive trunkierte Versionen einschließen, die eindeutig von den beschriebenen Sequenzen abstammen und hierin charakterisiert sind (z. B. bewiesene Domänen), sowie chimäre Sequenzen, welche eine oder mehr davon enthalten.
  • „Variante", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Sequenzen, die im Wesentlichen wie gezeigt sind und die Änderungen aufweisen, z. B. eine Polypeptidsequenz, welche eine Sequenz umfasst, die sich von der Sequenz, auf die Bezug genommen wird, durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, -addition oder -deletion unterscheidet, vorzugsweise durch eine konservative Aminosäuresubstitution, die im Wesentlichen dieselbe biologische und/oder pharmakologische Aktivität auf im Wesentlichen dieselbe Art und Weise zeigt oder durchführt, sowie trunkierte Versionen dieser Varianten. „Variante", wie hierin verwendet, soll jedoch alle in Betracht kommenden biologisch wirksamen dominant-negativen Mutanten einschließen, wobei mehrere Arten davon hierin ausgeführt sind.
  • Der Begriff „Modulierung" wird hierin in Bezug auf die Fähigkeit verwendet, eine Funktion eines biologischen Moleküls zu verstärken oder zu hemmen, einschließlich, aber nicht ausschließlich eine biologische und/oder pharmakologische Aktivität eines Tyrosinkinasemoleküls, oder auf die Fähigkeit, eine funktionelle Eigenschaft einer Nukleinsäurecodierungsregion zu verstärken oder zu hemmen. „Modulierte Physiologie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die biophysiologische Regulierung von Zellen und/oder Gewebe und die Behandlung pathophysiologischer Erkrankungen, die damit zusammenhängen.
  • „Direkte Verabreichung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die direkte Verabreichung von Nukleinsäuremolekülen, Peptiden oder Verbindungen sowie von in Betracht gezogenen Derivaten/Varianten der vorliegenden Erfindung. „Direkte Verabreichung" umfasst, jedoch nicht ausschließlich, Gentherapietechniken ex vivo und in vivo.
  • „Gereinigt", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Moleküle, entweder Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen, die aus ihrer natürlichen Umgebung entfernt und isoliert oder von mindestens einem anderen Bestandteil getrennt werden, mit dem sie natürlicherweise assoziiert sind.
  • „Expressionsvektor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Nukleinsäurevektorkonstruktionen, um die Transkription von Nukleinsäureregionen in Wirtszellen zu leiten. Expressionsvektoren umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Plasmide, retrovirale Vektoren, virale und synthetische Vektoren.
  • „Transformierte Wirtszellen", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Zellen, welche eine oder mehrere Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung enthalten.
  • RTKs
  • Inzwischen ist eine große Vielzahl von Polypeptid-Wachstumsfaktor-Rezeptoren charakterisiert worden, die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität besitzen. Aktivierte Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) durchlaufen Dimerisierung und lösen durch tyrosinspezifische Phosphorylierung verschiedener Zwischenstufen Signalübertragung aus, wodurch eine Kaskade intrazellulärer Mechanismen aktiviert wird, die den Phospholipid- und Arachidonatmetabolismus, Calciummobilisierung, Proteinphosphorylierung (an der noch andere Proteinkinasen beteiligt sind) und die Transkription regulieren. Die wachstumsfaktorabhängige Tyrosinkinaseaktivität der zytoplasmatischen Domäne von RTK ist der primäre Mechanismus zur Erzeugung intrazellulärer Signale, die mehrere zelluläre Reaktionen auslösen. Zelluläre Reaktionen, die von RTKs vermittelt werden, umfassen Veränderungen der Genexpression, Zellproliferation, Zytoskelettarchitektur, Zellmetabolismus, Differenzierung und Zellüberleben. Rezeptortyrosinkinasen bestehen aus einer aminoterminalen extrazellulären Ligandenbindungsdomäne, einer Transmembrandomäne und einer carboxyterminalen intrazellulären Tyrosinkinasedomäne. Herz, Jeffrey M., et al., Molecular Approaches to Receptors as Targets for Drug Discovery, J. of Receptor & Signal Transduction Research, 17(5):671 (1997).
  • Obgleich unter den zahlreichen Mitgliedern der RTK-Familie enorme Diversität herrscht, teilen die von diesen Rezeptoren verwendeten Signalmechanismen viele gemeinsame Merkmale. Biochemische und molekulargenetische Studien haben gezeigt, dass Bindung des Liganden an die extrazelluläre Domäne des RTK die intrinsische katalytische Tyrosinkinaseaktivität der intrazellulären Domäne schnell aktiviert. Enzymatische Aktivität der RTK-Kinasedomäne ist für die Signalübertragung essenziell. Die erhöhte Aktivität führt auch zur Phosphorylierung einer Anzahl von intrazellulären Substraten und Aktivierung zahlreicher nachgeschalteter (downstream) Signalmoleküle. Beispiele von Proteinen, die häufig aktiviert werden, umfassen: Phospholipase-C-γ (PLC-γ), Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI-3-Kinase), GTPaseaktivierendes Protein, Proteinkinase pp60c-arc, p21-ras und Andere. Idem.
  • Die Rolle von Rezeptortyrosinkinasen (RTKs) bei der Bildung eines neuen Blutgefäßsystems in Verbindung mit einer Erkrankung des Menschen lieferte schlagkräftige Gründe zur Identifizierung neuer Wege zur Hemmung der Funktion dieser Enzyme. Die meisten Bemühungen haben sich auf die Hemmung von FGF- und VEGF-Rezeptoren konzentriert. Andere RTKs sind mit Angiogenese in Zusammenhang gebracht worden. Diese Ziele wären für viele Ansätze zugänglich, die unter Verwendung der FGF- und VEGF-Rezeptorziele unternommen worden sind. Die therapeutischen Modalitäten, die zur Aufhebung der FGF- und VEGF-abhängigen Signalübertragung untersucht worden sind, umfassen die Verwendung von Nukleotiden (Gentherapie und Antisense), Proteinen (Antikörpern, Rezeptoren und Ligandenlockmittel), niedrigmolekulare Verbindungen sowie die Expression dominant-negativer Formen. Die Verwendung niedrigmolekularer Verbindungen zur Behandlung der Angiogenese stellt ein sich ständig erweiterndes Gebiet von Forschungsaktivitäten dar. Shawver, L.K., et al., Receptor Tyrosine Kinases as Targets for Inhibition of Angiogenesis, DDT (Elsevier Science Ltd.), 2 (2):50 (1997).
  • Obgleich rheumatoide Arthritis durch Entzündung und Immunproliferation gekennzeichnet ist, handelt es sich dabei um eine weitere Erkrankung, bei der Angiogenese mit dem Erkrankungsprozess in Verbindung gebracht worden ist. Da RTKs Proteine mit enzymatischer Funktion darstellen, bieten sie sich für eine pharmakologische Intervention mit kleinmolekularen Verbindungen an. Idem.
  • Humane Rezeptortyrosinkinase
  • Hierin ist eine cDNA-Sequenz mit 2607 Basenpaaren, SEQ ID NO:1, welche die humane Rezeptortyrosinkinase SEQ ID NO:3 betrifft, ausgeführt. Die strukturelle Region mit 1269 Basenpaaren, ATG bis TGA, SEQ ID NO:2, die SEQ ID NO:3 codiert (422 Aminosäuren) ist in SEQ ID NO:1 enthalten.
  • Die physikalische Sequenz (SEQ ID NO:3) enthält alle Signatursequenzen, Juxtamembransequenzen, Transmembransequenzen und extrazelluläre Sequenzen der Tyrosinkinase, die strukturelle Ähnlichkeit mit den bekannten Rezeptortyrosinkinasen aufweisen, z. B. FGF-R, EGF-R, PDGF-R, IGF-R, VEGF-R, FLK, FLT, TIE sowie Andere, die aus dem Stand der Technik bekannt sind. Siehe z. B. Dionne, C.A., et al., EMBO, 9:2685 (1990); Berchuck, A., et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 161:1247 (1989); Kraus, M.H., et al., Ann. NY Acad. Sci., 551:320 (1988); Bishop, J.M., et al., Science, 235:305 (1987). SEQ ID NO:3 zeigt Attribute des Polypeptids, welche eine Transmembrandomäne mit 24 Resten umfasst, die einen extrazellulären Abschnitt von der zytoplasmatischen Domäne trennt. Die zytoplasmatische Domäne enthält eine Juxtamembransequenz, der die Tyrosinkinasedomäne mit elf Unterdomänen unmittelbar folgt. Die Signatursequenzen, die in dem neuartigen humanen Rezeptortyrosinkinasesignalübertragungsmolekül (SEQ ID NO:3) gezeigt sind, sind jeweils die Unterdomäne I-XI.
  • Die Rolle von Rezeptortyrosinkinasen bei der zellulären Proliferation hat unter Anderem zu der Annahme geführt, dass RTKs signifikante Aufgaben bei der Vermittlung von Krankheiten und entsprechend signifikantes Potenzial als spezifische therapeutische Ziele haben. Entsprechend sind modulierende Mittel spezifischer RTK-Kinaseaktivität und/oder Rezeptoraktivität in der pharmazeutischen Industrie als Kandidatenkomponenten zur Entwicklung stark gefragt. Rezeptortyrosinkinasemoleküle, die für erkranktes Gewebe, z. B. ein Adenokarzinom, besonders kennzeichnend sind (z. B. SEQ ID NO:3), dienen als wichtigste Kandidaten in Richtung einer Diagnose von Erkrankungsbedingungen sowie als Ziele zur Modulierung der Gewebephysiologie.
  • SEQ ID NO:1 wurde mithilfe der Stanford G3 Radiation-Hybrid-Karte mittels Zellklonen, die von Research Genetics, Huntsville, AL, USA, erhalten wurden, auf Chromosom 21p12.3 kartiert. Stewart et al., Genome Res., 7, 422 (1997). Bei einer großen Anzahl von Tumortypen außer Adenokarzinomen, z. B. bei Keimzelltumoren, oralem Plattenepithelkarzinom, Ovarialkarzinom, akuter lymphoider Leukämie und testikulären Keimzelltumoren, wurden zytogenetische Anomalien und Verlust der Heterozygosität auf 12p12 festgestellt. Es wurde gezeigt, dass die Chromosomenregion 12p12-p13 bei einer großen Anzahl von Tumoren amplifiziert ist (4-11 Kopien).
  • SEQ ID NO:1 zeigt insgesamt 14 GT-Wiederholungs sequenzen zwischen Positionen 2125 und 2152. DNA-Sequenzierung der entsprechenden genomischen DNA von 27 nicht verwandten Kaukasiern zeigte 11, 12, 13, 14 und 15 Kopien der GT-Wiederholung in dem SEQ ID NO:1 entsprechenden Tyrosinkinasegen von 27 Kaukasiern mit den folgenden jeweiligen Häufigkeiten: 6/54; 2/54; 17/54; 16/54 und 13/54. Für kein Allel wurden Homozygoten beobachtet. Diese CA/GT-Wiederholung mit variabler Anzahl lässt sich als genetischer Marker für das Rezeptortyrosinkinasegen und für die Chromosomenregion 12p12.3 sowohl für Erkrankungsassoziationsstudien als auch für Studien des Heterozygositätsverlustes verwenden. Jedes dieser Allele soll im Schutzumfang der hier beiliegenden Ansprüche liegen (z. B. PCR-Primer, die von einem durchschnittlichen Fachmann für diagnostische Verfahren und/oder Zusammensetzungen leicht daraus konstruiert werden können). Siehe Beispiel II.
  • SEQ ID NO:1 betreffende Messenger-RNA wird selektiv im menschlichen Vorhirn exprimiert.
  • Von Clontech (Palo Alto, CA, USA) erhaltene Northern Blots zeigten, dass eines oder mehrere Gene, welche die neuartige Tyrosinkinase (SEQ ID NO:1) betreffen, in menschlichem Vorhirngewebe selektiv exprimiert wurden. Im Gegensatz zu nicht nachweisbaren Transkriptmengen im Zerebellum und Medullagewebe wurde im Putamen und Frontallappen eine hohe Expression von mRNA der Rezeptortyrosinkinase beobachtet.
  • SEQ ID NO:3 wird bei einer großen Anzahl von Tumoren und im Gehirngewebe von Alzheimer-Patienten überexprimiert.
  • In Zusammenarbeit mit LifeSpan Biosciences (Seattle, WA, USA) wurde eine immunzytochemische Analyse unter Anwendung primärer klinischer Proben und dem hierin beschriebenen Antikörper durchgeführt. In normalen Geweben zeigte der Anti-SEQ ID NO:3-Antikörper positive Färbung: in manchen Neuronen und Gliazellen und weniger häufig in deren Zellfortsätzen, im Epithel der Brust, den Enterozyten und Schwann-Zellen im Kolon, APUD-Zellen, Hepatozyten und Kupffer-Zellen, manchen Typ-2-Pneumozyten und in Makrophagen, polymorphkernigen Leukozyten und einer Untergruppe von Lymphozyten, Plasmazellen und Endothelzellen. Die Färbung ist negativ in normalen Zelltypen, einschließlich Fibroblasten, Adipozyten, Fresszellen, dem glatten Muskel der Lamina muscularis mucosa und der Lamina muscularis propria, in Gallengängen, Typ-I-Pneumozyten, den das respiratorische Epithel auskleidenden Bronchiolen und im Drüsenepithel der Prostata.
  • Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Immunzytochemische Analyse erkrankter Gewebe (Anti-SEQ ID NO:3-Antikörper)
    • A. Krebsgewebe: Bei neoplastischen Geweben ergab sich eine positive Färbung in zwei metastasierenden Adenokarzinomen, positive Färbung in fünf Brustadenokarzinomen, positive Färbung in den fünf Kolonadenokarzinomen, positive Färbung in den fünf rektosigmoiden Adenokarzinomen und positive Färbung in vier von fünf Prostata-Adenokarzinomen und in drei von fünf Lungenadenokarzinomen.
    • B. Alzheimer-Gewebe: Die drastischste Färbung mit dem Anti-Rezeptortyrosinkinase-Antikörper wurde in Fällen von Alzheimer-Krankheit beobachtet, sowohl bei denen mit als auch bei denen ohne zusätzliche ischämische Verletzung (d. h. Hinweis auf kürzlich erfolgten oder länger zurück liegenden Infarkt infolge einer Thromboembolie). Der Grad der Färbung in den Neuronen in Gehirngewebe und Gliazellen relativ normaler Bereiche war schwach und ähnlich wie die schwache gelegentliche Färbung von Zellen und Zellfortsätzen, wie sie in normalen Gehirnen zu sehen ist. Im Gegensatz zu der schwachen Färbung in normalen Regionen gab es eine signifikant erhöhte Signalstärke in Neuronen und deren assoziierten Zellfortsätzen in Verletzungsbereichen. Darüber hinaus war die Verstärkung des Signals nicht in den Zellfortsätzen des Neuropil ausgeprägt (eher als in dem perinukleären Zytoplasma des Neurons oder des Astrozyten), wobei hofähnliche Ringe in einer perisomatischen Verteilung um Neuronen, arborisierende Signale um Astrozyten und umfangreiche verstreute Ablagerungen in den Axonen und Zellfortsätzen des Neuropil produziert wurden. Die Verstärkung des Signals wurde in Gehirnen ohne Artefakte mit signifikanter Alzheimer-Krankheit (besonders in Regionen mit hoher Konzentration neuritischer Plaques oder neurofibrillären Tangles) und auch in Gehirnen beobachtet, die zusätzlich zu den klassischen Veränderungen der Alzheimer-Krankheit Infarktregionen enthielten.
  • SEQ ID NO:3-Tyrosinkinase ist markant in Prostatakrebsgewebe
  • Auf Basis der immunhistochemischen Befunde (supra) wurden Prostatatumorgewebe vom National Disease Research Interchange, Phila., PA, USA, erhalten. Western-Blot-Analyse der Gewebelysate bestätigte das Vorhandensein zweier Proteine (60 und 55 kDa), die mit dem Anti-SEQ ID NO:3-Antikörper reagierten. Um weiter zu bestätigen, ob diese Proteine tyrosinphosphoryliert sind, wurde das Prostatatumorpräparat mit Anti-Phosphotyrosin-Antikörper als Sonde inkubiert. Der Anti-pY-Antikörper band an das 55-kDa-Protein (das markanteste aller pY-reaktiven Proteine) in den Prostatalysaten, welches sich nach Blankmachen (Stripping) und erneuter Inkubation der Blots mit Anti-SEQ ID NO:3-Antikörper als SEQ ID NO:3 erwies.
  • Von SEQ ID NO:1 abgeleitete Antisense-Oligonukleotide hemmen Proliferation von A549-Zellen
  • In Anbetracht der Belege, dass die Rezeptortyrosinkinase in Tumorzelllinien und in primären klinischen Tumorgeweben überexprimiert ist, wurde die phyrmakologische Aktivität der Tyrosinkinase zur Induktion von Zellproliferation untersucht. Insbesondere entschlossen wir uns zu untersuchen, ob Antisense-Moleküle, die zu Regionen der Rezeptortyrosinkinase-mRNA komplementär sind, einen Effekt auf die Zellproliferation haben würden. Es wurden zwei exemplarische Antisense-Oligonukleotide und deren entsprechende Sense-Oligonukleotide (als Kontrollen) synthetisiert, die SEQ ID NO:1 Positionen 75-92 (Oligo 1) und 1348-1365 (Oligo 2) entsprachen (weitere bevorzugte Ausführungsformen von Antisense-Molekülen sind unten ausgeführt). Die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten zeigten eine im Durchschnitt 50%ige Hemmung der Proliferation von A549-Zellen nach Verabreichung von Antisense-Oligo 1. Verabreichung von Antisense-Oligo 2 zeigte eine Hemmwirkung von 20%. Jedes der korrespondierenden Sense-Oligonukleotide (Kontrollen) zeigte keine Wirkung auf die Proliferation. Siehe Beispiel III.
  • Studien der biologischen Aktivität mit chimären CD8-Konstrukten
  • Zur Verifizierung einer bestimmten biologischen Aktivität der Rezeptortyrosinkinase wurden chimäre Konstrukte hergestellt, die aus der extrazellulären Domäne von CD8 (CD8 ist ein gut bekanntes CTL-spezifisches Zelloberflächenprotein) und der zytoplasmatischen Domäne von SEQ ID NO:3 (Positionen 26-422) zusammengesetzt waren. Diese Konstrukte wurden erfolgreich in COS-7-Zellen, NIH/3T3-Fibroblasten und HEK293-Zelllinien exprimiert, wie durch Western Blotting mit dem Anti-SEQ ID NO:3-Antikörper festgestellt wurde. Es wurde berichtet, dass die extrazellulären Cys-Reste von CD8 intermolekulare Disulfidbrücken bilden können; entsprechend wurde die Hypothese aufgestellt, dass die chimären Moleküle nach Expression dimerisieren würden, was die beiden Kinasedomänen zusammenbringt und Transphosphorylierung stimuliert. Mit dem von transfizierten HEK293-Zellen erhaltenen immunpräzipitierten Material wurde ein In-vitro-Kinasetest durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass auf den chimären Proteinen ein niedriger Grad an Tyrosinphosphorylierung beobachtet wurde. Um die zelluläre Funktion der Rezeptortyrosinkinase besser zu verstehen, wurde ein vorläufiges Experiment in U937-Zellen durchgeführt, die mit den Chimären transfiziert wurden, gefolgt von der Aktivierung mit Anti-CD8-Ab für 15 Minuten (U937-Zellen wurden gewählt, da es sich dabei um nicht adhärente Zellen handelt und die daher geringe Mengen an Anti-CD8-Ab benötigen). Ergebnisse wurden mittels Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Anti-Phosphotyrosin (pY)-Ab analysiert. Während es zwischen den Ab-aktivierten und inaktivierten Bahnen feine Unterschiede in Bezug auf die pY-Muster gab, zeigte ein markantes tyrosinphosphoryliertes 34-kDa-Protein eine verzögerte Mobilität in der Anti-CD8-Ab-aktivierten Probe. Dieses 34-kDa-Protein wurde nach Reinkubation des Blots mit monoklonalem Anti-Cdc2-Ab als Cdc2 identifiziert. Diese Daten weisen eindeutig darauf hin, dass die neuartige Rezeptortyrosinkinase (SEQ ID NO:3) mit Zellzyklusprogress verknüpft ist.
  • „Biologische Aktivität", wie hierin in Bezug auf die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung verwendet, bezieht sich unter Anderem auf die Vermittlung der Aktivierung von Cdc2-Kinase, welche wiederum Mitose vermittelt. Siehe z. B. Nishio K., et al., Antitumor effects of butyrolactone I, a selective cdc2 kinase inhibitor, on human lung cancer cell lines, Anticancer Research, 16(6B):3387 (1996); Vincent I., et al., Aberrant expression of mitotic cdc2/cyclin BI kinase in degenerating neurons of Alzheimer's disease brain, Journal of Neuroscience, 17(10):3588 (1997).
  • Expression der Rezeptortyrosinkinase bei Entzug von Nervenwachstumsfaktor (NGF) in PC12-Zellen
  • Es wurde berichtet, dass neuronale Apoptose, wie sie bei der Alzheimer-Krankheit auftritt, zum Teil auf den unkoordinierten Versuch einer sich teilungsunfähigen Zelle zurückzuführen ist, wieder in den Zellzyklus einzutreten und diesen zu durchlaufen. Davis PK, et al., Journal of Neurochemistry, 68:2338 (1997). Es wird angenommen, dass dies für die Tatsache, dass die hierin beschriebene Rezeptortyrosinkinase in Geweben, die von der Alzheimer-Krankheit betroffen sind, sowie in proliferierenden Primärtumoren überexprimiert ist, sowie als Beleg relevant ist, dass Aktivierung von SEQ ID NO:3 mit Zellzyklusprogression verknüpft ist. Als logische Folge wurde entschieden zu bestimmen, ob die neuartige Tyrosinkinase in apoptotischen neuralen Zellen überexprimiert ist. Andere haben gezeigt, dass sich die Menge an Cdc2-Kinase nach NGF-Entzug in apoptotischen PC12-Zellen um das Fünffache erhöht. Idem. PC12-Zellen wurden 10 Tage lang mit NGF behandelt. Anschließend wurden die Zellen in Medium gewaschen und in Abwesenheit von NGF eine Stunde lang inkubiert. Zellen wurden geerntet und Lysate einer SDS-PAGE-Elektrophorese unterzogen, gefolgt von Western Blotting mit einem Anti-SEQ ID NO:3-Antikörper. Die Ergebnisse zeigten, dass SEQ ID NO:3-Protein 1 Stunde nach NGF-Entzug drastisch hochreguliert wurde. Diese Daten lassen den Schluss zu, dass Expression von SEQ ID NO:3 an neuronaler Apoptose beteiligt sein könnte.
  • Pharmakologische Bedeutung
  • Die hierin beschriebene Rezeptortyrosinkinase (SEQ ID NO:3) ist höchstwahrscheinlich ein wichtiger Regulator zellulären Wachstums in bestimmten Tumoren. Ähnliche wie die EGFR-Familie von RTKs (EGF-R, FGF-R, PDGF-R, Flk-1/KDR, Flt-1, Tie-1 und Tek/Tie-2) ist die neuartige humane Signalübertragungstyrosinkinase bei verschiedenen Karzinomen (z. B. beim kolorektalen Adenokarzinom und Lungenkarzinom) überexprimiert und scheint eng mit der Entwicklung maligner Tumore zusammenzuhängen und möglicherweise direkt dazu beizutragen. Daher wird die Identifikation modulierender Stoffe für die Behandlung verschiedener Adenokarzinome in Betracht gezogen.
  • Es wird in Betracht gezogen, die pharmakologische und/oder biologische Aktivität der hierin in Verbindung mit der Behandlung vieler verschiedener Krankheitszustände beschriebenen Rezeptortyrosinkinase zu modulieren, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich eine Erkrankung, die sich durch anomale Angiogenese manifestiert, periphere Gefäßerkrankung, Arthritis, Augenerkrankungen wie beispielsweise diabetische Retinopathie, Retinopathie oder Frühgeborenenretinopathie und altersbedingte Makuladegeneration, ischämische Herzerkrankung und Wachstum und Metastasierung massiver Tumore.
  • SEQ ID NO:3 oder dafür codierende Nukleinsäuresequenzen, z. B. SEQ ID NO:1 und/oder SEQ ID NO:2, haben signifikantes Potenzial hinsichtlich der Fähigkeit pathophysiologische Reaktionen abzuschwächen. Die Fähigkeit, auf Antagonisten und/oder Agonisten zu testen, welche die biologische und/oder pharmakologische Aktivität des nativen humanen Tyrokinkinasemoleküls zu modulieren, wie hierin beschrieben, ist von erheblichem Wert für die Identifizierung und Entwicklung therapeutischer Mittel. Darüber hinaus sind diagnostische Anwendungen für die Feststellung pathophysiologischer Zustände, die sich durch anomale Mengen an Molekülen wie beispielsweise SEQ ID NO:2 und/oder SEQ ID NO:3 manifestieren, mittels PCR-Sequenzamplifizierung und anschließendem Nachweis und/oder antikörperbasierten Assays, z. B. ELISA-basierten Assays, die einem Fachmann gut bekannt sind und anhand der hierin beschriebenen Information leicht durchgeführt werden können, leicht offensichtlich.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen und Aminosäuresequenzen der Tyrosinkinase und Varianten wie oben beschrieben und die Verwendung dieser Sequenzen zur Identifizierung von Verbindungen, welche die biologische und/oder pharmakologische Aktivität eines Signalübertragungsmoleküls modulieren.
  • Polynukleotidsequenzen, welche die Tyrosinkinase, wie in SEQ ID NO:3 dargestellt, und hierin in Betracht gezogene Varianten, wie oben beschrieben, codieren, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung. Biologisch wirksame Antisense-Moleküle und Nukleinsäuren, die biologisch wirksame dominant-negative mutierte Versionen von SEQ ID NO:3 oder Derivate davon, wie oben beschrieben, sowie dominant-negative mutierte Versionen von SEQ ID NO:3 und Derivate, wie oben beschrieben, codieren, für die jeweils Beispiele oben beschrieben sind, sind bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und sollen in den Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche fallen.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Verfahren zum Behandeln eines Patienten bereit, der eine solche Behandlung benötigt, nämlich für einen Patienten, der an einem pathologischen Zustand leidet, der von der SEQ ID NO:3-Tyrosinkinase oder einem anderen Signalübertragungsmolekül oder einem nachgeschalteten (downstream) transkriptionellen Aktivator vermittelt wird, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge eines biologisch wirksamen Antisense-Nukleinsäuremoleküls, das von SEQ ID NO:1 oder SEQ 1 D NO:2 abgeleitet ist, oder das Verabreichen einer wirksamen Menge einer Nukleinsäure, welche eine biologisch wirksame dominant-negative mutierte Version der Tyrosinkinase codiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuresequenzen (z. B. SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2) und Aminosäuresequenzen (z. B. SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:3 Positionen 1-122, SEQ ID NO:3 Positionen 26-422 und SEQ ID NO:3 Positionen 123-422) der neuartigen humanen Signalübertragungskinase sowie dazugehörige Derivate, wie sie oben beschrieben sind, z. B. funktionelle Derivate, welche im Wesentlichen die gleiche biologische und/oder pharmakologische Aktivität auf die im Wesentlichen gleiche Art und Weise zeigen oder aufweisen. Die Erfindung soll auch biologisch und/oder pharmakologisch aktive trunkierte Versionen umfassen, welche eindeutig von den hierin beschriebenen und charakterisierten Sequenzen abstammen (z. B. nachgewiesene Domänen, wie oben beschrieben), sowie chimäre Sequenzen, welche eine oder mehrere davon enthalten.
  • Varianten
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Varianten von Nukleinsäuresequenzen (z. B. SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2) und Aminosäuresequenzen (z. B. SEQ ID NO:3), wie sie oben beschrieben sind, welche Änderungen aufweisen, z. B. eine Polypeptidsequenz, welche eine Sequenz umfasst, die sich von der Sequenz, auf die Bezug genommen wird, durch mindestens eine Aminosäuresubstitution, vorzugsweise eine konservative Aminosäuresubstitution, unterscheidet, die im Wesentlichen die gleiche biologische und/oder pharmakologische Aktivität auf die im Wesentlichen gleiche Art und Weise zeigen oder aufweisen sowie Moleküle, die trunkierte Versionen dieser Varianten umfassen. „Variante", wie hierin verwendet, soll im Rahmen der Einschränkungen des oben Beschriebe nen liegen, um alle in Betracht gezogenen biologisch wirksamen dominant-negativen Mutanten zu umfassen, von denen mehrere Arten hierin ausgeführt sind.
  • Eine Variante, wie in SEQ ID NO:3 dargestellt, ist eine, die zu SEQ ID NO:3 eine Aminosäuresequenzhomologie (-identität) von mindestens 80% aufweist; eine bevorzugte Variante ist eine, die eine Aminosäuresequenzhomologie von mindestens 90% aufweist, und eine am meisten bevorzugte Variante ist eine, die eine Aminosäuresequenzhomologie von mindestens 95% zu der in SEQ ID NO:3 dargestellten Aminosäuresequenz des Kinasemoleküls aufweist. „Varianten", wie oben beschrieben und im Schutzumfang dieser Erfindung liegend, umfassen biologisch wirksame dominant-negative Mutanten dieser in Betracht gezogenen Ausführungsformen.
  • Eine Variante, wie oben beschrieben, des humanen SEQ ID NO:3-Kinasemoleküls der vorliegenden Erfindung, kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich durch eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen unterscheidet. Ausführungsformen, die Aminosäuredeletionen und/oder -additionen umfassen, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Eine solche Variante kann konservative Änderungen aufweisen (Aminosäureähnlichkeit), wobei eine substituierte Aminosäure ähnliche strukturelle oder chemische Eigenschaften aufweist, beispielsweise der Austausch von Leucin durch Isoleucin. Eine wie oben beschriebene Variante kann nicht-konservative Änderungen aufweisen, z. B. Austausch eines Glycins durch Tryptophan. Ausführungsformen, die im beabsichtigten Schutzumfang der Erfindung liegen, umfassen auch SEQ ID NO:3 mit einer oder mehreren Aminosäuredeletionen oder -insertionen oder beidem, so lange die Variante so ist wie oben beschrieben. Richtlinien zur Festlegung, welche und wie viele Aminosäurereste substituiert, eingesetzt oder deletiert werden können, ohne eine biologische oder vorgeschlagene pharmakologische Aktivität aufzuheben, lassen sich angesichts dieser Beschreibung in vernünftiger Weise ableiten und sich darüber hinaus durch aus dem Stand der Technik bekannte Rechnerprogramme finden, beispielsweise mithilfe der Software DNAStar.
  • Aminosäuresubstitutionen von SEQ ID NO:3 können beispielsweise auf der Basis einer ähnlichen Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobizität, Hydrophilität und/oder ähnlichen amphipathischen Art der Reste vorgenommen werden, solange die biologische und/oder pharmakologische Aktivität des nativen Moleküls erhalten bleibt. Aminosäuresubstitutionen sind jedoch wichtig, um in Betracht gezogene biologisch wirksame dominantnegative Mutanten zu konstruieren, von denen. mehrere Arten hierin ausgeführt sind.
  • Negativ geladene Aminosäuren umfassen beispielsweise Asparaginsäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin, und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen mit ähnlichen Hydrophilitätswerten umfassen Leucin, Isoleucin, Valin; Glycin, Alanin; Asparagin, Glutamin; Serine, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin. Bei der Konstruktion biologisch wirksamer dominant-negativer Mutanten wird jedoch mindestens eine Aminosäurerestposition an einer für biologische und/oder pharmakologische Aktivität in dem nativen Peptid erforderlichen aktiven Stelle verändert, um ein Mittel oder eine Einheit herzustellen, die eine verringerte Aktivität oder keine feststellbare native Wildtypaktivität aufweist.
  • Geeignete Substitutionen von Aminosäuren umfassen die Verwendung eines chemisch derivatisierten Restes an der Stelle eines nicht-derivatisierten Restes. Die natürliche vorkommende Aminosäure kann durch D-Isomere sowie andere bekannte Derivate ersetzt werden. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,652,369, Amino Acid Derivatives, erteilt am 29. Juli 1997. Beispiele für Substitutionen sind wie folgt in TABELLE 1 aufgeführt: TABELLE 1
    Ursprünglicher Rest Beispiel für eine konser vative Substitution
    Ala (A) Gly; Ser; Val; Leu; Ile;
    Pro
    Arg (R) Lys; His; Gln; Asn
    Asn (N) Gln; His; Lys; Arg
    Asp (D) Glu
    Cys (C) Ser
    Gln(Q) Asn
    Glu (E) Asp
    Gly (G) Ala; Pro
    His (H) Asn; Gln; Arg; Lys
    Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe
    Leu (L) Ile; Val; Met; Ala; Phe
    Lys (K) Arg; Gln; His; Asn
    Met (M) Leu; Tyr; Ile; Phe
    Phe (F) Met; Leu; Tyr; Val; Ile;
    Ala
    Pro (P) Ala; Gly
    Ser (S) Thr
    Thr (T) Ser
    Trp (W) Tyr; Phe
    Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser
    Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala
  • „Homologie" ist ein Maß für die Identität von Nukleotidsequenzen oder Aminosäuresequenzen. Zur Charakterisierung der Homologie wird derart ein Alignment (Ausrichtung) der Sequenzen der Zielmoleküle durchgeführt, dass eine Homologie (Match) höchsten Grades erhalten wird. „Identität" hat eine aus dem Stand der Technik anerkannte Bedeutung und kann mithilfe veröffentlichter Techniken berechnet werden. Rechnerprogrammverfahren zur Bestimmung der Identität zwischen zwei Sequenzen umfassen beispielsweise die Software DNAStar (DNAStar Inc., Madison, WI); das Programmpaket GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1):387); BLASTP, BLASTN, FAST A (Atschul, S. F. et al., J Molec Biol (1990) 215:403). Homologie (Identität), wie hierin definiert, wird auf konventionelle Weise mit dem gut bekannten Rechnerprogramm BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 für Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711, USA) bestimmt. Wenn BESTFIT oder ein anderes Sequenzalignmentprogramm verwendet wird um zu bestimmen, ob eine bestimmte Sequenz beispielsweise zu 80% homolog zu einer Bezugssequenz ist, werden gemäß der vorliegenden Erfindung die Parameter derart festgesetzt, dass die prozentuale Identität über die gesamte Länge der Nukleotidbezugssequenz oder Aminosäuresequenz berechnet wird und dass Lücken in der Homologie von bis zu 20% der Gesamtanzahl von Nukleotiden in der Bezugssequenz erlaubt sind. Achtzig Prozent Homologie wird daher beispielsweise mit dem Programm BESTFIT mit derart festgesetzten Parametern bestimmt, dass die prozentuale Identität über die gesamte Länge der Bezugssequenz, z. B. SEQ ID NO:3, berechnet wird, und Lücken von bis zu 20% der Gesamtanzahl an Aminosäuren in der Bezugssequenz erlaubt sind, und wobei bis zu 20% der Aminosäurereste in der Bezugssequenz deletiert oder durch eine andere Aminosäure substituiert werden können, oder eine Anzahl von Aminosäuren bis zu 20% der gesamten Aminosäurereste in der Bezugssequenz in die Bezugssequenz eingefügt werden können. Prozentuale Homologien werden gleichermaßen bestimmt, beispielsweise, um bevorzugte Arten im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche zu identifieren, welche im Bereich von 80 Prozent bis 100 Prozent Homologie zu SEQ ID NO:3 liegen, sowie biologische und/oder pharmakologisch aktive funktionelle Derivate wie oben beschrieben und biologisch wirksame dominant-negative Mutanten, die hierin in Betracht gezogen werden.
  • Prozentuale Ähnlichkeit (konservative Substitutionen) zwischen zwei Polypeptiden kann auch bewertet werden, indem die Aminosäuresequenzen der beiden Polypeptide mithilfe von Programmen verglichen werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind, einschließlich dem Programm BESTFIT, indem Standardeinstellungen zur Bestimmung von Ähnlichkeit angewandt werden.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft zum Teil die Insertion des Polynukleotids, welches das Tyrosinkinasemolekül codiert, in einen Expressionsvektor, der zur Transformation von Wirtszellen oder -organismen verwendet werden kann. Solche transgenen Wirte sind für die Produktion der Proteinkinase sowie wertvoller Variationen davon, die hierin in Betracht gezogen werden, geeignet.
  • Die Nukleinsäuresequenz liefert auch das Design von Antisense-Molekülen, von denen beispielhafte Ausführungsformen hierin bereit gestellt sind und die sich zur Herunterregulierung, zur Verminderung oder Aufhebung von Expression, z. B. Transkription und/oder Translation von SEQ ID NO:2, in Zellen eignen.
  • Das Rezeptortyrosinkinasemolekül der vorliegenden Erfindung wird in Screening-Assays verwendet, um Antagonisten oder Inhibitoren zu identifizieren, welche die Kinase binden, ihr Substrat nachahmen oder das Biomolekül auf andere Weise inaktivieren oder biologisch mit dem nativen SEQ ID NO:3-Biomolekül konkurrieren, z. B. durch kompetitive Interaktion oder kompetitive Bindungshemmung. Die Tyrosinkinase kann auch in Screening-Assays verwendet werden, um Agonisten zu identifizieren, welche die biologische und/oder pharmakologische Aktivität verstärken oder nachahmen oder die Produktion des Moleküls auslösen oder die biologische Halbwertszeit des Moleküls in vivo oder in vitro verlängern.
  • Die Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die wie in SEQ ID NO:2 oder SEQ ID NO:3 dargestellte Moleküle oder Varianten, wie oben beschrieben, dieser Moleküle umfassen, wie hierin für die Behandlung pathologischer Erkrankungen definiert, die mit der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung in Verbindung stehen oder von ihr vermittelt werden.
  • Beispielhafte Ausführungsformen und dominant-negative Mutanten
  • Bevorzugt ist ein gereinigtes Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, welche ein Polypep tid, umfassend die Sequenz wie dargestellt in SEQ ID NO:3 oder eine Variante von SEQ ID NO:3 umfasst, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich SEQ ID NO:3, bei dem Positionen 147 (Lysin) von SEQ ID NO:3 substituiert oder deletiert ist, SEQ ID NO:3 Positionen 1-25 (extrazelluläre Domäne zur Wechselwirkung mit anderen Molekülen, einschließlich Liganden oder Agonisten/Antagonisten), SEQ ID NO:3 Positionen 1-122 (Nicht-Kinase-Domäne, die als dominant-negative Form verwendet werden kann), SEQ ID NO:3 Positionen 26-422 (intrazelluläre funktionelle Domäne, die auch verwendet werden kann, um Chimären mit anderen bekannten extrazellulären Proteinen herzustellen) und SEQ ID NO:3 Positionen 123-422 (Tyrosinkinasedomäne, die zum Screening von Verbindungen (sowie in Assayprotokollen) verwendet werden kann).
  • Die Tyrosinkinase (SEQ ID NO:3) codierende Region SEQ ID NO:2 kann aus vorhandener cDNA erhalten werden, beispielsweise durch PCR-Amplifikation mit Primern, die aus SEQ ID NO:1 abgeleitet sind. Siehe z. B. Beispiel I. SEQ ID NO:2 (sowie Varianten davon) kann beispielsweise in Expressionsvektoren mit oder ohne Fusionsproteinmarker (Tags) eingesetzt werden, um ein Protein zu exprimieren, z. B. SEQ ID NO:3, das gereinigt und auf biologische und/oder pharmakologische Aktivität getestet werden kann, einschließlich auf Signalübertragungsaktivität und Substrataktivierung. Es können prokaryotische Expressionsvektoren verwendet werden, einschließlich beispielsweise pGEX (GST-Fusion), pET (+/– His6- oder T7-Tag), sowie eukaryotische Expressionsvektoren, einschließlich beispielsweise pcDNA3.1 His, pIRES-E:GFP, pcDNA3 und pEBVHis. Rekombinante Proteine, die von SEQ ID NO:3 abgeleitet sind, werden zur Verwendung in Screening-Assays zur Identifizierung von Verbindungen bereitgestellt, welche die biologische und/oder pharmakologische Aktivität von Tyrosinkinasen modulieren können.
  • Ein Beispiel einer dominant-negativen Mutante von SEQ ID NO:3 (Lysin an Position 147 geändert zu Arginin) ist als eine Ausführungsform ausgeführt, die der Vorhersage nach katalytisch inaktiv ist.
  • Antisense-Moleküle
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können verschiedene Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, die zu den hierin bereit gestellten SEQ ID NO:1 und/oder SEQ ID NO:2 komplementär sind, um die Expression einer Tyrosinkinase oder die biologische Funktion eines nachgeschalteten (downstream) Signalübertragungsmoleküls oder eines transkriptionellen Aktivators, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, der Cdc2-Kinase, zu modulieren, indem die Transkription und/oder Translation von Sequenzen, die mit der neuartigen Tyrosinkinase korrespondieren (SEQ ID NO:1 und/oder SEQ ID NO:2), in Zellen beeinflusst wird. Pharmakologische Aktivität des endogenen Gens kann moduliert werden, indem die Transkription und/oder Translation beispielsweise des endogenen Gens durch Verwendung oder Verabreichung von Anti-Sense-Konstrukten beeinflusst wird, um Anti-Sense-Transkripte herzustellen, oder durch direkte Abgabe von Anti-Sense-Oligomeren. Antisense-Konstrukte und -Oligomere können jeweils als Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung verwendet werden und stehen jeweils in Zusammenhang mit Ausführungsformen therapeutischer Verfahren, die über direkte Verabreichung praktiziert werden, wie hierin definiert ist. Translation wird am wirksamsten gehemmt, indem die mRNA an einer Position oder in der Nähe eines Start- oder Stoppcodons blockiert wird. Oligonukleotide, die zur 5'- oder 3'-terminalen Region des mRNA-Transkripts der Rezeptortyrosinkinase komplementär sind, sind daher bevorzugt. Es sind Beispielarten bereit gestellt.
  • Antisense-Moleküle, die Oligomere im Bereich von 12 bis 25 Nukleotiden umfassen, die zu den Regionen von SEQ ID NO:1 und/oder der 5'-Region von pSEQ ID NO:2 komplementär sind, welche proximal zu dem Translationsstart- oder -stoppcodon gelegen sind oder diese umfassen, oder ein Abschnitt davon sind bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung. Antisense-Moleküle, die Oligomere mit einer Länge im Bereich von 12 bis 25 Nukleotiden umfassen, die zu einer Region innerhalb von SEQ ID NO:1 Positionen 67-148 oder 1333-1414 komplementär sind, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Oligonukleotide, die Sequenzen umfassen, welche komplementär zu den folgenden Positionen von SEQ ID NO:1 sind, sind beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung:
    Figure 00300001
  • Oligonukleotide, die Sequenzen umfassen, welche komplementär zu jedem der genannten Bereiche der mRNA der humanen Rezeptortyrosinkinase sind und diese Bereiche hybridisieren, werden für den therapeutischen Gebrauch in Betracht gezogen. Darüber hinaus ist US-Patent Nr. 5,639,595, Identification of Novel Drugs and Reagents, erteilt am 17. Juni 1997, in dem Verfahren für die Identifizierung von Oligonukleotidsequenzen, die Aktivität in vivo zeigen, ausführlich beschrieben sind, hierin durch Bezugnahme enthalten.
  • Für eine Antisense-Therapie können Nukleotidsequenzen, die komplementär zu der die Tyrosinkinase codierenden Nukleinsäuresequenz sind, synthetisiert werden. Bei diesen Antisense-Molekülen kann es sich um DNA, stabile Derivate von DNA wie beispielsweise Phosphorothioate oder Methylphosphonate, RNA, stabile Derivate von RNA wie beispielsweise 2'-O-Alkyl-RNA oder andere Oligonukleotidmimetika handeln. US-Patent Nr. 5,652,355, Hybrid Oligonucleotide Phosphorothioates, erteilt am 29. Juli 1997, und US-Patent Nr. 5,652,356, Inverted Chimeric and Hybrid Oligonucleotides, erteilt am 29. Juli 1997, welche die Synthese und den Effekt physiologisch stabiler Antisens-Moleküle beschreiben, sind hierin durch Bezugnahme enthalten. Tyrosinkinase-Antisense-Moleküle können durch Mikroinjektion, Liposomverkapselung oder durch Expression aus Vektoren, welche die Antisense-Sequenz beinhalten, in Zellen eingeführt werden. Antisense-Therapie kann besonders für die Behandlung von Krankheiten geeignet sein, bei denen es von Vorteil ist, die effektive biologische und/oder pharmakologische Aktivität der hierin präsentierten Tyrosinkinase zu modulieren.
  • Gentherapie
  • Bei der Gentherapie können einem Individuum Ausführungsformen von Tyrosinkinasenukleinsäuren oder dominant-negativen mutanten Versionen davon sowie hierin beschriebene Antisense-Ausführungsformen verabreicht werden, um die korrespondierende biologische und/oder pharmakologische Aktivität oder Genexpression einer endogenen Tyrosinkinase zu modulieren, d. h. zu verstärken oder abzuschwächen. Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können ex vivo oder in vivo in einer gewebespezifischen Art und Weise an die Zellen von Zielorganen abgegeben werden. Die Codierungsregion des humanen Tyrosinkinasepolypeptids kann in virale Vektoren ligiert sein, die den Transfer der Kinase-Polypeptid-DNA durch Infektion von Empfängerwirtszellen vermitteln. Geeignete virale Vektoren umfassen Retrovirus, Adenovirus, adenoassoziiertes Virus, Herpesvirus, Vakziniavirus, Poliovirus und dergleichen. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,624,820, Episomal Expression Vector for Human Gene Therapy, erteilt am 29. April 1997. Beispielsweise verfügt die GENOVO Corporation, Sharon Hill, PA, USA, zum Datum dieser Anmeldung über ein leicht im Handel erhältliches Expressionsvektorportfolio, das ein Sortiment von Vektoren, komplett mit gut etablierten Verfahren, umfasst, die einheitlich gewebespezifische Expression zeigen. Die GENOVO Corporation ist ein Beispiel für eine Quelle für Vektoren und Verfahren zur Durchführung gentherapeutischer Verfahren der vorliegenden Erfindung. Codierende Nukleinsäureregionen der vorliegenden Erfindung sind in wirksame Expressionsvektoren eingebaut, die zur Gentherapie direkt in somatische Zellen verabreicht oder eingeführt werden (es kann auch ein Nukleinsäurefragment, welches eine Codierungsregion, umfasst, vorzugsweise mRNA-Transkripte, in somatische Zellen direkt verabreicht oder eingeführt werden). Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,589,466, erteilt am 31. Dez. 1996. Solche Nukleinsäuren und Vektoren können episomal bleiben oder als ein Provirus oder ein Abschnitt davon, der die Genfusion und geeignete eukaryotische Transkriptions- und Translationssignale enthält, d. h. einen wirksam positionierten RNA-Polymerasepromotor 5' zur Transkriptionsstartstelle und ein ATG-Translationsstartcodon der Genfusion sowie ein oder mehrere Terminationscodons und Transkriptpolyadenylierungssignale, wirksam 3' zur Codierungsregion positioniert, in die chromosomale DNA des Wirts eingebaut werden. Alternativ kann die DNA eines Polypeptids einer humanen Tyrosinkinase für die Gentherapie durch nicht-virale Techniken in Zellen übertragen werden, einschließlich durch rezeptorvermittelten gezielten DNA-Transfer mit Ligand-DNA-Konjugaten oder Adenovirus-Ligand-DNA-Konjugaten, Lipofektion-Membranfusion oder direkte Mikroinjektion. Diese Verfahren und Varianten eignen sich für eine Gentherapie ex vivo und in vivo mit einem Gen eines Polypeptids einer humanen Tyrosinkinase nach etablierten Verfahren aus dem Stand dieser Technik.
  • Im Allgemeinen annehmbare Vektoren
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können Polynukleotidsequenzen, welche die Tyrosinkinase codieren, Fragmente des Polypeptids, Fusionsproteine oder funktionelle Äquivalente davon in rekombinanten DNA-Molekülen verwendet werden, welche die Expression des entsprechenden Moleküls in geeigneten Wirtszellen steuern. Aufgrund der ihm eigenen Degeneration des genetischen Codes können andere DNA-Sequenzen, die im Wesentlichen dieselbe und eine funktionell äquivalente Aminosäuresequenz codieren, verwendet werden, um die Tyrosinkinase sowie Varianten davon und dominant-negative Mutanten davon zu klonieren und zu exprimieren. Wie einem Fachmann bekannt ist, kann es von Vorteil sein, Nukleotidsequenzen herzustellen, die nicht natürlich auftretende Codons besitzen.
  • Klonierte Tyrosinkinase-cDNA, die anhand der hierin beschriebenen Verfahren erhalten wurde, kann rekombinant exprimiert werden, indem sie in einen Expressionsvektor molekular kloniert wird, der einen geeigneten Promotor und andere geeignete Transkriptionsregulationselemente enthält, und in prokaryotische oder eukaryotische Wirtszellen übertragen wird, um die Rezeptorkinase herzustellen. Techniken für solche Manipulationen sind vollständig beschrieben in Sambrook, J., el al., Molecular Cloning Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Press (1990), und aus dem Stand der Technik gut bekannt.
  • Expressionsvektoren sind hierin als Nukleinsäuresequenzen für die Transkription von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Solche Vektoren können verwendet werden, um Nukleinsäuresequenzen in verschiedenen Wirten zu exprimieren, beispielsweise in Bakterien, Blau-/Grünalgen, Pflanzenzellen, Insektenzellen, Pilzzellen, menschlichen und tierischen Zellen. Speziell konzipierte Vektoren erlauben den Shuttle-Transport von DNA zwischen Wirten wie beispielsweise zwischen Bakterien und Hefen oder Bakterien und Tierzellen oder Bakterien und Pilzzellen oder Bakterien und Zellen von Wirbellosen.
  • Zur Expression des rekombinanten humanen Tyrosinkinasemoleküls sowie hierin in Betracht gezogenen Varianten können verschiedene Säugetierexpressionsvektoren verwendet werden. Kommerziell verfügbare Säugetierexpressionsvektoren, die für die Expression von Rekombinanten geeignet sind, umfassen, jedoch nicht ausschließlich, pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1 (8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) und IZD35 (ATCC 37565), plXIN und pSIR (CLONTECH), pIRES-EGFP (CLONTECH). Die Firma INVITROGEN stellt eine große Vielfalt kommerziell erhältlicher Säugetierexpressionsvektoren/-systeme bereit, welche mit der vorliegenden Erfindung effektiv verwendet werden können. INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA. Siehe auch PHARMINGEN Produkte, Vektoren und Systeme, San Diego, CA, USA.
  • Es können auch bakulovirale Expressionssysteme mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um hohe Erträge an biologisch aktiver Kinase zu produzieren. Vektoren wie beispielsweise das Bakulovirusexpressionssystem BacPakTM von CLONTECH und dessen Protokolle sind kommerziell erhältlich und bevorzugt. CLONTECH. Palo Alto, CA, USA. Miller. L.K., et al., Curr. Op. Genet. Dev. 3:97 (1993); O'Reilly, D.R., et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, 127. Vektoren wie beispielsweise das Bakulovirusexpressions system MaxBacTM von INVITROGEN, dessen Insektenzellen und Protokolle sind ebenfalls bevorzugt und kommerziell erhältlich. INVITROGEN, Carlsbad, CA, USA.
  • Beispiel für Wirtszellen
  • Wirtszellen, die mit einer Nukleotidsequenz transformiert sind, die das Signalübertragungsmolekül der vorliegenden Erfindung codiert, können unter Bedingungen kultiviert werden, welche für die Expression und Wiederfindung des codierten Proteins aus Zellkultur geeignet sind. Besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind Wirtszellen, die mit einem gereinigten Polynukleotid transformiert sind, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, um das Polypeptid mit der Sequenz wie dargestellt in SEQ ID NO:3 oder eine in Betracht gezogene Variante davon zu codieren. Zellen dieses Typs oder Zubereitungen, die davon hergestellt sind, können verwendet werden, um nach Modulatoren der biologischen und/oder pharmakologischen Aktivität der nativen Tyrosinkinase-Signalübertragungsmoleküle SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 und SEQ ID NO:3 zu suchen.
  • Eukaryotische rekombinante Wirtszellen sind besonders bevorzugt. Beispiele umfassen, jedoch nicht ausschließlich, Hefe- und Säugetierzellen, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Zelllinien, die vom Menschen, Rind, Schwein, Affen und von Nagetieren stammen, sowie Insektenzellen, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, Zelllinien, die von Drosophila und Seidenraupe abstammen. Zelllinien, die von Säugetierarten abstammen und geeignet und kommerziell erhältlich sind, umfassen, jedoch nicht ausschließlich, L-Zellen L-M(TK-) (ATCC CCL 1.3), L-Zellen L-M (ATCC CCL 1.2), 293 (ATCC CRL 1573), Raji (ATCC CCL 86), CV-1 (ATCC CCL 70), COS-1 (ATCC CRL 1650), COS-7 (ATCC CRL 1651), CHO-K1 (ATCC CCL 61), 3T3 (ATCC CCL 92), NIH/3T3 (ATCC CRL 1658), Hela (ATCC CCL 2), C1271 (ATCC CRL 1616), BS-C-1 (ATCC CCL 26) und MRC-5 (ATCC CCL 171).
  • Der Expressionsvektor kann in Wirtszellen, welche die neuartige Tyrosinkinase exprimieren, durch eine beliebige einer Anzahl von Techniken eingeführt werden, einschließlich, jedoch nicht ausschließlich, durch Transformation, Transfektion, Lipofektion, Protoplastenfusion und Elektroporation. Kommerziell erhältliche Ausrüstungen, die zum Gebrauch mit der vorliegenden Erfindung für die heterologe Expression geeignet sind, einschließlich gut charakterisierte Vektoren, Transfektionsreagenzien und -Bedingungen und Zellkulturmaterialien sind gut etabliert und einfach erhältlich. CLONTECH, Palo Alto, CA; INVITROGEN, Carlsbad, CA; PHARMINGEN, San Diego, CA; STRATAGENE, La-Jolla, CA., USA. Die Expressionsvektor-enthaltenden Zellen werden klonal propagiert und einzeln analysiert, um den Grad der Produktion des Tyrosinkinasepolypeptids zu bestimmen. Identifikation von Wirtszellklonen, welche die neuartige Kinase exprimieren, kann durch auf verschiedene Weise erfolgen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, durch immunologische Reaktivität mit den hierin beschriebenen Antikörpern und/oder dem Vorhandensein wirtszellassoziierter spezifischer biologischer Aktivität und/oder der Fähigkeit, ein spezifisches Substrat der Rezeptortyrosinkinase mit dem bifunktionellen Vernetzungsreagens Disuccinimidylsuberat oder ähnlichen Vernetzungsreagenzien kovalent zu vernetzen.
  • Das Signalübertragungsmolekül der vorliegenden Erfindung kann auch als ein rekombinantes Protein exprimiert werden, dem eines oder mehrere zusätzliche Polypeptiddomänen hinzugefügt wurden, um die Proteinreinigung zu erleichtern. Solche Domänen, welche die Reinigung erleichtern, umfassen metallchelatbildende Peptide wie beispielsweise Histidin-Tryptophan-Module, die Reinigung auf immobilisierten Metallen erlauben (Porath, J., Protein Exp. Purif. 3:263 (1992)), Protein-A-Domänen, die eine Reinigung auf immobilisiertem Immunglobulin ermöglichen, und die in dem FLAGS-Extensions-/Affinitätsreinigungssystem verwendete Domäne (Immunex Corp., Seattle, WA, USA), sind aber nicht darauf beschränkt. Der Einschluss einer spaltbaren Linkersequenz wie beispielsweise Faktor XA oder Enterokinase (Invitrogen, San Diego, CA, USA) zwischen der Reinigungsdomäne und der Codierungsregion ist nützlich, um die Reinigung zu erleichtern.
  • Systeme, wie beispielsweise die nichtdenaturierende Proteinreinigungsausrüstung von CLONTECH, TALONTM, zur Reinigung von 6xHis-markierten Proteinen unter nativen Bedingungen und Protokollen, sind bevorzugt und kommerziell erhältlich. CLONTECH, Palo Alto, CA.
  • Darüber hinaus kann ein Wirtszellstamm im Hinblick auf seine Fähigkeit, die Expression der eingefügten Sequenzen zu modulieren oder das exprimierte Protein in der gewünschten Weise zu verarbeiten, ausgewählt werden. Solche Modifikationen des Polypeptids umfassen Acetylierung, Carboxylierung, Glykosylierung, Phosphorylierung, Lipidierung und Acylierung, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Posttranslationale Verarbeitung, die eine naszierende Form des Proteins spaltet, kann ebenfalls für die korrekte Insertion, korrekte Faltung und/oder korrekte Funktion wichtig sein. Verschiedene Wirtszellen wie beispielsweise CHO, HeLa, MDCK, 293, W138, NIH-3T3, HEK293 etc. haben spezifische zelluläre Maschinerien und charakteristische Mechanismen für solche posttranslationalen Aktivitäten und können ausgewählt werden, um die korrekte Modifikation und Verarbeitung des eingeführten Fremproteins sicherzustellen.
  • Für die Langzeitproduktion rekombinanter Proteine mit hohem Ertrag ist eine stabile Expression bevorzugt. Beispielsweise können Zelllinien, die SEQ ID NO:2/SEQ ID NO:3 stabil exprimieren, beispielsweise mit Expressionsvektoren transformiert werden, die virale Replikationsursprünge oder endogene Expressionselemente und ein selektierbares Markergen enthalten. Nach der Einführung des Vektors kann man Zellen 1-2 Tage in einem angereicherten Medium wachsen lassen, bevor sie auf Selektionsmedium umgestellt werden. Der Selektionsmarker dient dem Zweck, eine Resistenz gegenüber Selektion zu verleihen, und seine Gegenwart ermöglicht Wachstum und Wiederfindung von Zellen, welche die eingeführten Sequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Klumpen stabil transformierter Zellen lassen sich mit für den Zelltyp angemessenen Gewebekulturtechniken vermehren.
  • Das Signalübertragungsmolekül, z. B. SEQ ID NO:3, kann in der Hefe S. cerevisiae nach der Insertion des optimalen cDNA-Cistrons in Expressionsvektoren hergestellt werden, die konzipiert sind, um die intrazelluläre oder extrazelluläre Expression des heterologen Proteins zu steuern. In dem Fall einer intrazellulären Expression werden Vektoren wie beispielsweise EmBLyex4 oder dergleichen mit dem Cistron der Betauntereinheit ligiert. Siehe z. B. Rinas, U., et al., Biotechnology, 8:543 (1990); Horowitz, B., et al., J. Biol. Chem., 265:4189 (1989). Für eine extrazelluläre Expression wird das Kinasecistron in Hefeexpressionsvektoren ligiert, welche ein beliebiges aus einer Reihe gut charakterisierter Sekretionssignale anwenden. Die Mengen an exprimierter neuartiger Kinase werden mit den hierin beschriebenen Assays bestimmt.
  • Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Protokolle zum Bestimmen und Messen der Expression des neuartigen Moleküls sowie funktioneller Derivate wie oben beschrieben bekannt, in denen entweder für das Protein spezifische polyklonale oder monoklonale Antikörper verwendet werden. Zu den Beispielen gehören der Enzyme-Linked-Immunosorbend-Assay (ELISA), der Radioimmunoassay (RIA) und Fluoreszenz-aktiviertes Cell-Sorting (FACS). Es kann ein an zwei Stellen reagierender, monoklonal-basierter Immunoassay eingesetzt werden, in dem monoklonale Antikörper verwendet werden, welche mit zwei nicht-wechselwirkenden Epitopen reagieren. Es können auch gut bekannte Techniken der kompetitiven Bindung angewandt werden. Siehe z. B. Hampton, R., et al. (1990), Serological Methods – a Laboratory Manual, APS Press, St Paul Minn.; Maddox, D. E., et al., J. Exp. Med. 158:1211.
  • Screening-Assays
  • Es sind Verfahren bereitgestellt, um Verbindungen einzeln oder durch Verwendung von Bibliotheken von Verbindungen zu testen, um Verbindungen zu identifizieren, welche die Fähigkeit haben, eine biologische und/oder pharmakologische Aktivität einer Rezeptortyrosinkinase, z. B. des hierin beschriebenen SEQ ID NO:3, zu modulieren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren des Screenings auf Verbindungen, welche die Expression (Transkription und/oder Translation) von DNA oder RNA modulieren, die das Tyrosinkinasepolypeptid SEQ ID NO:3 codieren. Bei den Verbindungen, die diese Aktivitäten modulieren, kann es sich um DNA, RNA, Peptide, Proteine oder nicht-proteinöse organische Moleküle handeln (z. B. kleinmolekulare Arzneimittelverbindungen).
  • Verbindungen können eine ultimative biologische und/oder pharmakologische Aktivität modulieren, indem sie die Expression von das humane Signalübertragungsbiomolekül codierender DNA oder RNA oder eine Funktion des nativen SEQ ID NO:3 verstärken oder abschwächen. Verbindungen, welche die Expression von das Tyrosinkinasepolypeptid codierender DNA oder RNA oder die Funktion des Polypeptids modulieren, lassen sich durch verschiedene Assays feststellen. Bei dem Assay kann es sich um einen einfachen „Ja/Nein"-Assay handeln um zu bestimmen, ob eine Veränderung der Expression oder Funktion vorliegt. Der Assay kann quantitativ gemacht werden, indem die Expression oder Funktion einer Testprobe mit dem Grad der Expression oder Funktion in einer Standardprobe verglichen werden.
  • Für das Screening prospektiver therapeutischer Verbindungen anhand einer beliebigen aus verschiedenen Wirkstoffscreeningtechniken können die hierin beschriebene humane Rezeptortyrosinkinase SEQ ID NO:3, ihre funktionellen Fragmente oder Oligopeptide, einschließlich SEQ ID NO:3 Positionen 1-25, SEQ ID NO:3 Positionen 1-122, SEQ ID NO:3 Positionen 26-422 und SEQ ID NO:3 Positionen 123-422, sowie hierin in Betracht gezogene Varianten verwendet werden. Das in einem solchen Test eingesetzte Fragment oder die in einem solchen Test eingesetzte Einheit können sich frei in Lösung befinden, an einen festen Trägerstoff befestigt sein, auf einer Zelloberfläche getragen werden oder sich intrazellulär befinden. Die Aufhebung oder Modulierung von Aktivität oder der Bildung von Bindungskomplexen zwischen der humanen Signalübertragungskinase und dem getesteten Stoff kann beispielsweise anhand der bereit gestellten Mittel gemessen werden.
  • Es wird erwartet, dass die neuartige human Signalübertragungsrezeptortyrosinkinase hohe katalytische Aktivität aufweist, die eine einfache Adaption an automatisierte Screening-Assays mit hohem Durchsatz erlaubt, einschließlich an aus dem Stand der Technik bekannte Scintillation-Proximity-Assay-Verfahren. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,763,198, Screening Assays for Compounds, erteilt am 9. Juni 1998 (ein Beispiel für schnelle, quantitative, spezifische Assay-Systeme mit hohem Durchsatz zum Screening von Testverbindungen wie beispielsweise Arzneistoffen, Liganden (natürliche oder synthetische), Ligandenantagonisten, Peptiden oder kleinen organischen Molekülen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Modulierung von Tyrosinkinaseaktivität in der Zelle oder in einem zellfreien System), US-Patent Nr. 5,763,584, Receptor Activation with Hepatocyle Growth Factor Agonists, erteilt am 9. Juni 1998 (ein Beispiel für Verfahren zum Aktivieren von aus Rezeptortyrosinkinasen ausgewählten Rezeptoren und zum Herstellen von Ligandenvarianten, die als kompetitive Agonisten der entsprechenden nativen Liganden wirken) und US-Patent Nr. 5,763,441, Compounds for the Treatment of Disorders Related to Vasculogenesis and/or Angiogenesis, erteilt am 9. Juni 1998, die hierin als Beispiele durch Bezugnahme enthalten sind. Darüber hinaus ist die Technologie des Scintillation-Proximity-Assay (SPA) als eine Ausführungsform ausgeführt, welche einen schnellen und empfindlichen Test einer breiten Vielfalt molekularer Wechselwirkungen in einem homogenen System zulässt (AMERSHAM, Bucks, GB).
  • Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Screenen einer Vielzahl von Verbindungen hinsichtlich spezifischer Bindungsaffinität zu dem nativen Polypeptid SEQ ID NO:3 oder einer hierin in Betracht gezogenen Variante davon bereit, umfassend das Bereitstellen einer Vielzahl von Verbindungen, Kombinieren einer Ausführungsform der Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung mit einer Jeden aus einer Vielzahl von Verbindungen über einen Zeitraum, der ausreichend ist, um eine Bindung unter geeigneten Bedingungen zu erlauben, sowie Feststellen der Bindung des Kinasepolypeptids oder von Fragmenten davon an Jede aus der Vielzahl von Verbindungen, wodurch die Verbindungen identifiziert werden, welche das Signalübertragungskinasepolypeptid spezifisch binden.
  • Im Allgemeinen sind Verfahren des Identifizierens von Verbindungen bevorzugt, welche eine biologische und/oder pharmakologische Aktivität eines Signalübertragungsmoleküls modulieren, die das Kombinieren eines Kandidatenverbindungsmodulators der Signalübertragungsaktivität (biologisch und/oder pharmakologisch) mit einem Polypeptid mit der wie in SEQ ID NO:3 dargestellten Sequenz oder einer hierin in Betracht gezogenen Variante davon und das Messen eines Effektes des Kandidatenverbindungsmodulators auf die biologische und/oder pharmakologische Aktivität des Polypeptids umfassen. Es können die Kinaseaktivität des Biomoleküls und/oder die Leistung Jeder oder Mehrerer der Funktionen, einschließlich, aber nicht ausschließlich, die Fähigkeit zur Autophosphorylierung, zur Phosphorylierung eines Substrates, zur Bindung von ATP und zur Vermittlung der Aktivierung von Cdc2-Kinase, getestet werden. Die pharmakologische Aktivität des Biomoleküls kann getestet werden, indem beispielsweise das Eintreten und die Rate der Mitose, Zelldifferenzierung, Proliferation, onkogene Transformation, Neoplasie, Zellaggregation und Zytokinese mit Kontrollzellen verglichen werden.
  • Assays der Kinaseaktivität der neuartigen Rezeptortyrosinkinase werden mit gut bekannten Ser/Thr-Kinaseassays durchgeführt, außer dass MBP durch Enolase ersetzt wird. Cooper, et al., J. Biol. Chem., 259:7835 (1984). Phosphorylation sites in enolase are utilized by tyrosine protein kinases in vivo and in vitro. Siehe Beispiele V und VI.
  • Die Fähigkeit der Rezeptortyrosinkinase, ein Substrat zu phosphorylieren und/oder einen verwandten Liganden zu binden, kann durch Verfahren gemessen werden, die einem Fachmann gut bekannt sind. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,763,584, Receptor Activation with Hepatocyte Growth Factor Agonists, erteilt am 9. Juni 1998 (ein Beispiel für Verfahren zum Aktivieren von aus Rezeptortyrosinkinasen ausgewählten Rezeptoren und zum Herstellen von Ligandenvarianten, die als kompetitive Agonisten der entsprechenden nativen Liganden wirken), US-Patent Nr. 5,763,198, Screening Assays for Compounds, erteilt am 9. Juni 1998 (ein Beispiel für schnelle, quantitative, spezifische Assay-Systeme mit hohem Durchsatz zum Screening von Testverbindungen wie beispielsweise Arzneistoffen, Liganden (natürliche oder synthetische), Ligandenantagonisten, Peptiden oder kleinen organischen Molekülen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Modulierung von Tyrosinkinaseaktivität in der Zelle oder in einem zellfreien System) und US-Patent Nr. 5,763,441, Compounds for the Treatment of Disorders Related to Vasculogenesis and/or Angiogenesis, erteilt am 9. Juni 1998, die hierin als Beispiele durch Bezugnahme enthalten sind.
  • „Biologische Aktivität", wie hierin in Bezug auf die Tyrosinkinase der vorliegenden Erfindung verwendet, betrifft unter Anderem die Vermittlung der Aktivierung von Cdc2-Kinase, die Mitose vermittelt. Siehe z. B. Nishio K., et al., Antitumor effects of butyrolactone I, a selective cdc2 kinase inhibitor, on human lung cancer cell lines, Anticancer Research, 16(6B):3387 (1996); Vincent I., et al., Aberrant expression of mitotic cdc2/cyclin B1 kinase in degenerating neurons of Alzheimer's disease brain, Journal of Neuroscience, 17(10):3588 (1997).
  • Entsprechend sind Verfahren des Identifizierens von Verbindungen besonders bevorzugt, welche eine biologische und/oder pharmakologische Aktivität einer Tyrosinkinase modulieren, die das Kombinieren eines Kandidatenverbindungsmodulators mit einer Wirtszelle, welche ein Polypeptid mit der wie in SEQ ID NO:3 dargestellten Sequenz oder eine hierin in Betracht gezogene Variante davon exprimiert, und das Messen eines Effektes des Kandidatenverbindungsmodulators auf die biologische und/oder pharmakologische Aktivität des Polypeptids umfassen. Bevorzugte zelluläre Assays für Modulatoren des betreffenden Tyrosinkinasesignalübertragungsmoleküls fallen in zwei allgemeine Kategorien:1) direkte Messung einer biologischen Aktivität und 2) Messung nachgeschalteter (downstream) Ereignisse in der Signalübertragungskaskade, einschließlich physiologische Manifestationen in der Zelle/dem Gewebe/dem Organismus.
  • Zur Messung der Aktivität der Tyrosinkinase kann die Herkunft des zu testenden Moleküls ein Ganzzelllysat sein, welches durch einen bis drei Einfrier-Auftau-Zyklen in Gegenwart standardmäßiger Proteaseinhibitoren hergestellt wird. Alternativ kann die Kinase partiell oder vollständig durch Standardverfahren der Proteinreinigung gereinigt werden. Die Kinase kann durch Affinitätschromatographie mithilfe hierin beschriebener Antikörper oder mithilfe von Liganden gereinigt werden, die für den Epitopmarker (-Tag) spezifisch sind, die, wie ebenfalls hierin beschrieben, in die rekombinante Kinase gentechnisch eingefügt wurde. Die Zubereitung kann dann auf Aktivität getestet werden. Beispielhafte Assays, die zum Screening auf Verbindungen verwendet werden, die beispielsweise Kinaseaktivität modulieren, sind unten ausgeführt. Siehe z. B. Beispiel V und VI.
  • In einer anderen erfindungsgemäßen Verfahrensausführungsform zum Identifizieren von Mitteln, welche eine biologische Aktivität des hierin ausgeführten neuartigen Biomoleküls modulieren, kann eine Nukleinsäuresequenz, die ein Signalübertragungsmolekül codiert, beispielsweise wie dargestellt in SEQ ID NO:3, mit einer heterologen Sequenz ligiert werden, um ein Fusionsprotein zur Verwendung in einem Hefe-2-Hybrid-System zu codieren. Zum Screenen von Verbindungen hinsichtlich der Modulierung der biologischen Aktivität von SEQ ID NO:3 ist es erforderlich, ein chimäres Peptid zur Expression in heterologen Wirtszellen zu codieren. Chimäre Konstrukte werden auch verwendet, um nach gut bekannten Verfahren mithilfe eines Hefe-Zwei-Hybrid-Systems einen „Aufhänger" zu exprimieren, wobei native Hilfspeptide verwendet werden, von denen erwartet wird, dass sie mit dem hierin beschriebenen Tyrosinkinasemolekül assoziiert sind. Das Zwei-Hybrid-System nutzt die Fähigkeit eines Paares wechselwirkender Proteine, eine Transkriptionsaktivierungsdomäne nahe an eine DNA-Bindungsstelle heranzubringen, welche die Expression eines benachbarten Reportergens reguliert. Verbindungen, die in der Lage sind, die biologische Aktivität des hierin definierten neuartigen Biomoleküls zu modulieren, werden durch ihre Fähigkeit identifiziert, Protein:Protein-Wechselwirkungen herbeizuführen (Rekonstitution der chimären Transkriptionsaktivatoren), und damit durch die Hefe-2-Hybrid-Ableseassays identifiziert, die einem Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen in diesem Bereich der Molekularbiologie gut bekannt sind. Fields, S., et al., Trends Genet., 10:286 (1994); Allen, J.B., et al., TIBS, 20:511 (1995). Fields, S., Song, O., Nature 340:245 (1989). Mit der vorliegenden Erfindung können kommerziell erhältliche Systeme wie die MatchmakerTM Systeme und Protokolle von CLONTECH verwendet werden. CLONTECH, Palo Alto, CA, USA. Siehe auch Mendelsohn, A. R., Brent, R., Curr. Op. Biotech., 5:482 (1994); Phizicky. E.M., Fields, S., Microbiological Rev., 59(1):94 (1995); Yang, M., et al., Nucleic Acids Res., 23(7):1152 (1995); Fields, S., Sternglanz, R., TIG, 10(8):286 (1994) und US-Patent 5,283,173, System to Detect Protein-Protein Interactions, und 5,468,614, die hierin durch Bezugnahme enthalten sind.
  • Zur weiteren Evaluierung der Fähigkeit einer Verbindung, die pharmakologische Aktivität beispielsweise von SEQ ID NO:3 zu modulieren, werden humane Tumorzellen in SCID(Severe Combined Immunodeficiency)-Mäuse injiziert, um palpierbare Tumormassen zu bilden. Siehe Beispiel VII.
  • Es ist ein Verfahren des Modulierens einer biologischen und/oder pharmakologischen Aktivität einer Signalübertragungskinase in einer Zelle, einem Gewebe oder einem Organismus bevorzugt, welches das Verabreichen einer wirksamen Menge eines hierin in Betracht gezogenen Polynukleotids umfasst. „Polynukleotid" umfasst ein Polynukleotid, das eine Nukleinsäure umfasst, welche ein Polypeptid mit einer Homologie von mindestens 80% zu SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 Positionen 1-122, SEQ ID NO:3 Positionen 26-422 und SEQ ID NO:3 Positionen 123-422 codiert, sowie ein Polynukleotid, das eine Nukleinsäuresequenz codiert, welche eine wie in SEQ ID NO:3 dargestellte Sequenz umfasst, wobei Position 147 (Lysin) von SEQ ID NO:3 substituiert oder deletiert ist, sowie Antisense-Moleküle, welche zu einer Region innerhalb von SEQ ID NO:1 Positionen 67-148 oder 1333-1414 komplementär sind, wobei therapeutische Ausführungsformen davon supra ausgeführt sind.
  • Antikörper
  • Die Rezeptortyrosinkinase kann verwendet werden, um diagnostische Antikörper herzustellen, um anomale Biomolekülmengen in vivo festzustellen. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung sind Antikörper gegen das Rezeptortyrosinkinasepolypeptid bereit gestellt, die als Teil verschiedener diagnostischer Assays zum Feststellen physiologischer Erkrankungen, einschließlich Krebsgewebe, verwendet werden können. Ein Beispiel für die Herstellung wirksamer polyklonaler Antikörper gegen von SEQ ID NO:3 abstammende Peptide zur Anwendung in hierin beschriebenen Verfahren ist EADRPSPRELRLRLE (SEQ ID NO:4), das in der C-terminalen Region der neuartigen humanen Tyrosinkinase (SEQ ID NO:3) identifiziert wurde, wobei ein gut etabliertes Algorithmusverfahren verwendet wurde, das von Jameson and Wolf The antigenic Index: A novel Algorithm for Predicting Antigenic Determinants, CABIOS, 4:181 (1988), entwickelt wurde. Dieses Peptid wurde mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin konjugiert und von GENOSYS BIOTECHNOLOGIES, 1442 Lake Front Circle, Suite 185, The Woodlands, Texas 77380, USA, zur Antikörperherstellung verwendet. Spezifische Antikörper können durch Immunisierung von Tieren mit einer geeigneten Konzentration der humanen Tyrosinkinase mit oder ohne ein Immunadjuvans hergestellt werden, wobei Kaninchen bevorzugt sind.
  • Monospezifische Antikörper gegen das Polypeptid der vorliegenden Erfindung werden aus Säugetierantiseren gereinigt, die gegen das Polypeptid reaktive Antikörper enthalten, oder sie werden anhand der Technik von Köhler and Milstein, Nature, 256:495 (1975) als monoklonale Antikörper hergestellt, die mit dem Signalübertragungspolypeptid reagieren. „Monospezifische Antikörper", wie hierin verwendet, ist definiert als eine Antikörperart oder mehrere Antikörperarten mit homogenen Bindungseigenschaften im Hinblick auf das neuartige Signalübertragungsmolekül. „Homogene Bindung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Fähigkeit der Antikörperart, an ein spezifisches Antigen oder Epitop zu binden, beispielsweise die, die mit SEQ ID NO:3 assoziiert sind. Monoklonale Antikörper werden in vivo durch Injektion von mit Pristan geprimten Balb/c-Mäusen hergestellt, wobei etwa 0,5 ml je Maus verwendet mit etwa 2 × 106 bis etwa 6 × 106 Hybridomzellen etwa 4 Tage nach dem Priming verwendet werden. Etwa 8-12 Tage nach der Übertragung der Zellen wird Aszitesflüssigkeit entnommen, und monoklonale Antikörper werden mithilfe von aus dem Stand der Tech nik bekannten Techniken gereinigt. In-vitro-Produktion des Anti-Polypeptid-mAb erfolgt, indem die Hybridomas in DMEM mit etwa 2% fetalem Kälberserum gezüchtet werden, um ausreichende Mengen des spezifischen mAb zu erhalten. Die mAb werden mithilfe von aus dem Stand der Technik bekannten Techniken gereinigt.
  • Reinigung von SEQ ID NO:3 über Affinitätssäulen
  • Für einen Fachmann ist es offensichtlich, dass Verfahren zum Herstellen von Antikörpern verwendet werden können, um Antikörper herzustellen, die für die Tyrosinkinasepolypeptidfragmente oder das naszierende Polypeptid in voller Länge, z. B. SEQ ID NO:3, spezifisch sind. Für einen Fachman ist insbesondere leicht offensichtlich, dass Antikörper hergestellt werden können, die für das voll funktionelle Protein und Fragmente und Varianten davon, wie hierin beschrieben, spezifisch sind.
  • Tyrosinkinasepolypeptid-Antikörper-Affinitätssäulen werden hergestellt, indem die Antikörper an Affigel-10 (Biorad) angebracht werden, einen Gelträger, der mit N-Hydroxysuccinimidestern derart aktiviert wird, dass die Antikörper kovalente Verknüpfungen mit dem Träger aus Agarosegelkügelchen bilden. Die Antikörper werden dann über Amidbindungen mit dem Abstandhalter(Spacer)-Arm mit dem Gel gekoppelt. Die verbleibenden aktivierten Ester werden dann mit 1 M Ethanolamin-HCl (pH 8) gedämpft (gequencht). Die Säule wird mit Wasser, gefolgt von 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6) gewaschen, um etwaige nicht-konjugierte Antikörper oder irrelevantes Protein zu entfernen. Die Säule wird anschließend in phosphatgepufferter Salzlösung (pH 7,3) mit einem geeigneten Detergens äquilibriert, und die Zellkulturüberstände oder Zellextrakte, die humanes Tyrosinkinasepolypeptid enthalten und mithilfe geeigneter Membransolubilisierungsdetergenzien hergestellt wurden, werden langsam durch die Säule geleitet. Die Säule wird anschließend mit phosphatgepufferter Salzlösung/Detergens gewaschen, bis die optische Dichte bis auf Hintergrundwerte abfällt, anschließend wird das Protein mit 0,23 M Glycin-HCl (pH 2,6)/Detergens eluiert. Das gereinigte Polypeptid wird dann gegen phosphatgepufferte Salzlösung/Detergens dialysiert.
  • Rekombinante Tyrosinkinasemoleküle lassen sich durch Verwendung einer Immunaffinitätssäule, die mit monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern hergestellt ist, welche für die volle Länge des naszierenden Signalübertragungspolypeptids oder Polypeptidfragmente spezifisch sind, von anderen zellulären Proteinen abtrennen.
  • Hierin beschriebene Polypeptide können verwendet werden, um biologische Effektoren durch Affinitätsreinigung aus nativen biologischen Materialien, z. B. erkranktem Gewebe, zu erhalten. Affinitätschromatographische Techniken sind einem Fachmann gut bekannt. Ein hierin beschriebenes Tyrosinkinasepeptid oder ein wirksames Fragment davon wird nach dem Protokoll des Anbieters (Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) an eine feste Matrix fixiert, z. B. an CNBr-aktivierte Sepharose, und eine homogenisierte/gepufferte zelluläre Lösung, die ein potenzielles Molekül von Interesse enthält, wird durch die Säule geleitet. Nach dem Waschen hält die Säule nur den biologischen Effektor zurück, der anschließend eluiert wird, z. B. mit 0,5 M Essigsäure oder einem NaCl-Gradienten.
  • Diagnostische Assays
  • Antikörpertiter von Aszites- oder Hydbridomakulturflüssigkeit werden mit verschiedenen serologischen oder immunologischen Assays bestimmt, die Präzipitation, passive Agglutinierung, die Enzyme-Linked-Immunosorbent-Antibody(ELISA)-Technik und Radioimmunoassay(RIA)-Techniken umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Ähnliche diagnostische Assays werden verwendet, um das Vorhandensein des neuartigen Signalübertragungskinasepolypeptids in Körperflüssigkeiten oder Gewebe- und Zellextrakten festzustellen.
  • Diagnostische Assays, die für das humane Signal übertragungspolypeptid spezifische Antikörper verwenden, sind für die Diagnose von Zuständen, Erkrankungen oder Krankheiten geeignet, die von einer anomalen Expression der Rezeptortyrosinkinase oder Expression von mit anomalem Zellwachstum assoziierten Genen gekennzeichnet sind. Diagnostische Assays für die erfindungsgemäße Signalübertragungskinase umfassen Verfahren, die den Antikörper und eine Markierung nutzen, um das humane Kinasepolypeptid in menschlichen Körperflüssigkeiten, Zellen, Geweben oder Schnitten oder Extrakten solcher Gewebe festzustellen. Die Polypeptide und Antikörper der vorliegenden Erfindung können mit oder ohne Modifikation verwendet werden. Häufig werden die Polypeptide und Antikörper markiert, indem sie entweder kovalent oder nicht-kovalent mit einem Reportergen verbunden werden, von denen einem Fachmann unzählig viele bekannt sind.
  • Aus dem Stand der Technik sind verschiedene Protokolle zum Messen des Kinasepolypeptids anhand von für das entsprechende Protein spezifischen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern bekannt. Beispiele umfassen Enzyme-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA), Radioimmunoassay (RIA) und Fluoreszenz-aktiviertes Cell-Sorting (FACS). Ein an zwei Stellen reagierender, monoklonal-basierter Immunoassay eingesetzt werden, in dem monoklonale Antikörper verwendet werden, welche mit zwei nicht-wechselwirkenden Epitopen auf dem humanen Signalübertragungskinasepolypeptid reagieren, ist bevorzugt, aber es kann auch ein kompetitiver Bindungassay angewandt werden. Diese Assays sind unter Anderem beschrieben in Maddox, D.E. et al., J. Exp. Med. 158:1211 (1983); Sites, D.P., et al., Basic and Clinical Immunology, Kap. 22, 4. Aufl., Lange Medical Publications, Los Altos, CA (1982); US-Patent Nr. 3,654,090, Nr. 3,850,752 und Nr. 4,016,043.
  • Um eine Basis für die Diagnose einer Krankheit bereit zu stellen, müssen normale Werte oder Standardwerte für die Tyrosinkinase, und normale Expressionsmengen etabliert werden. Dies wird erreicht, indem Körperflüssigkeiten oder Zellextrakte, die aus normalen Individuen, entweder Tier oder Mensch, entnommen sind, mit einem Antikörper gegen das humane Kinasepolypeptid unter für eine Komplexbildung geeigneten Bedingungen kombiniert werden, die aus dem Stand der Technik gut bekannt sind. Die Menge der Standardkomplexbildung kann quantifiziert werden, indem sie mit einer Verdünnungsreihe von positiven Kontrollen verglichen wird, bei der eine bekannte Menge Antikörper mit bekannten Konzentrationen eines gereinigten Tyrosinkinasepolypeptids kombiniert wird. Anschließend können Standardwerte, die mit normalen Proben erhalten wurden, mit Werten verglichen werden, die von Proben aus Individuen erhalten wurden, welche möglicherweise von einer Erkrankung oder Krankheit in Verbindung mit der Expression der humanen Tyrosinkinase betroffen sind. Eine Abweichung zwischen Standardwerten und den Werten der Proben aus dem Individuum etabliert das Vorhandensein des Krankheitzustandes.
  • Es können Ausrüstungen, die eine korrespondierende Tyrosinkinasenukleinsäure oder Antikörper für ein korrespondierendes Polypepeptid oder Protein, z. B. SEQ ID NO:3, enthalten, hergestellt werden. Solche Ausrüstungen werden verwendet, um eine heterologe Nukleinsäure festzustellen, welche an die Nukleinsäure hybridisiert oder über PCR amplifiziert werden kann, oder um das Vorhandensein von Protein- oder Peptidfragmenten in einer Probe festzustellen. Eine solche Charakterisierung ist für verschiedene Zwecke nützlich, einschließlich, aber nicht ausschließlich, die Diagnose pathologischer Zustände, für forensische Analysen und epidemiologische Studien.
  • Die DNA-Moleküle, RNA-Moleküle, rekombinanten Proteine und Antikörper der vorliegenden Erfindung können zum Screenen und Messen der Mengen an DNA, RNA oder Protein der neuartigen Kinase verwendet werden. Die rekombinanten Proteine, DNA-Moleküle, RNA-Moleküle und Antikörper eignen sich für die Formulierung von Ausrüstungen, die für die Feststellung und die Typisie rung der Signalübertragungstyrosinkinase geeignet sind. Eine solche Ausrüstung umfasst einen kompartimentierten Trägerstoff, der geeignet ist, um mindestens einen Behälter in enger Einbindung zu halten. Der Trägerstoff würde des weiteren Reagenzien wie beispielsweise rekombinante Kinase oder Anti-Kinase-Antikörper umfassen, die zum Feststellen des neuartigen Moleküls, wie dargestellt in SEQ ID NO:3, geeignet sind. Der Trägerstoff kann auch ein Mittel zum Feststellen enthalten, wie beispielsweise markiertes Antigen oder Enzymsubstrate oder dergleichen.
  • Polynukleotidsequenzen, die das Übertragungsmolekül codieren, können für die Diagnose von Zuständen oder Krankheiten verwendet werden, mit denen die Expression der neuartigen humanen stressaktivierten Kinase assoziiert ist. Beispielsweise können Polynukleotidsequenzen, die das Signalübertragungsmolekül codieren, bei der Hybridisierung oder bei PCR-Assays von Flüssigkeiten oder Geweben aus Biopsien verwendet werden, um eine Expression der Kinase festzustellen. Die Form solcher qualitativer und quantitativer Verfahren kann Southern- oder Northern-Analyse, Dot-Blot oder andere membranbasierte Technologien, PCR-Technologien, Dip-Stick-, Pin-, Chip- und ELISA-Technologien umfassen. Alle diese Techniken sind aus dem Stand der Technik gut bekannt und sind die Basis vieler kommerziell erhältlicher diagnostischer Ausrüstungen. Solche Assays können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit eines bestimmten therapeutischen Behandlungsplanes in Tierstudien, in klinischen Studien oder bei der Überwachung der Behandlung eines individuellen Patienten zu beurteilen. Sobald sich eine Krankheit etabliert hat, wird ein therapeutisches Mittel verabreicht und ein Behandlungsprofil erzeugt. Solche Assays können auf regelmäßiger Basis wiederholt werden, um zu untersuchen, ob die Werte in dem Profil auf die normalen Muster oder Standardmuster zulaufen oder zu ihnen zurückkehren. Erfolgreiche Behandlungsprofile können verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Behandlung über einen Zeitraum von mehreren Tagen oder mehreren Monaten zu zeigen.
  • Polynukleotidsequenzen, welche die neuartige Kinase codieren, können auch bei Analysen zur Kartierung chromosomaler Positionen verwendet werden, z. B. zum Screening hinsichtlich einer funktionellen Assoziation mit Krankheitsmarkern. Die hierin beschriebenen Sequenzen werden darüber hinaus in Betracht gezogen, um humane Sequenzpolymorphismen und eine mögliche Assoziation mit Krankheit zu identifizieren, sowie für Analysen, um eine optimale Sequenz aus möglichen polymorphen Sequenzen für das Design von Verbindungen zum Modulieren der biologischen und/oder pharmakologischen Aktivität auszuwählen. Darüber hinaus werden die Sequenzen als Screening-Hilfsmittel zur Anwendung bei der Identifizierung geeigneter menschlicher Individuen und Patienten für therapeutische klinische Studien in Betracht gezogen.
  • PCR-Diagnostik
  • Die Nukleinsäuresequenz, Oligonukleotide, Fragmente, Abschnitte oder Antisense-Moleküle davon können in diagnostischen Assays von Körperflüssigkeiten oder biopsiertem Gewebe verwendet werden, um den Grad der Expression des neuartigen humanen Signalübertragungskinasemoleküls festzustellen. Beispielsweise können Sequenzen, die von der cDNA-Sequenz SEQ ID NO:1 konzipiert wurden, oder Sequenzen, die in SEQ ID NO:2 enthalten sind, verwendet werden, um das Vorhandensein der mRNA-Transkripte in einem Patienten festzustellen oder um die Modulierung von Transkripten während einer Behandlung zu überwachen. Mehrere Beispiele von PCR-Primern, die aus SEQ ID NO:1 abgeleitet sind, sind hierin ausgeführt.
  • Diagnostik oder Zusammensetzungen für die pharmakogenomische Analyse sind für die Identifizierung einer Polynukleotidsequenz bevorzugt, umfassend PCR-Primer, die aus SEQ ID NO:1 abgeleitet sind, oder Allelsequenzen, die hierin beschrieben sind und 11, 12, 13 oder 15 GT-Wiederholungen zwischen Positionen 2125 und 2152 von SEQ ID NO:1 wiedergeben.
  • Ein Verfahren für die Amplifizierung von Zielnukleinsäuren oder für die spätere Analyse durch Hybridisierungsassays ist als Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, „PCR") oder PCR-Technik bekannt. Die PCR-Technik kann angewandt werden, um erfindungsgemäße Sequenzen in verdächtigen Proben anhand von Oligonukleotidprimern festzustellen, die voneinander beabstandet sind und auf der hierin ausgeführten genetischen Sequenz, z. B. SEQ ID NO:1, beruhen. Die Primer sind zu gegenüber liegenden Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls komplementär und typischerweise durch etwa 50 bis 450 Nukleotide oder mehr (in der Regel nicht mehr als 200 Nukleotide) getrennt. Dieses Verfahren umfasst das Herstellen der spezifischen Oligonukleotidprimer, gefolgt von wiederholten Zyklen der Denaturierung der Ziel-DNA, Primerbindung und Extension mit einer DNA-Polymerase, um DNA-Fragmente der erwarteten Länge beruhend auf der Beabstandung der Primer zu erhalten. Eine beispielhafte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist eine diagnostische Zusammensetzung für die Identifizierung einer Polynukleotidsequenz, umfassend die Sequenz wie dargestellt in SEQ ID NO:2, umfassend PCR-Primer, die von SEQ ID NO:1 abgeleitet sind. Der Grad der Amplifikation einer Zielsequenz wird durch die Anzahl der durchgeführten Zyklen kontrolliert und theoretisch anhand der einfachen Formel 2n berechnet, wobei n die Anzahl der Zyklen ist. Siehe z. B. Perkin Elmer, PCR Bibliography, Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey; CLONTECH Produkte, Palo Alto, CA, USA; US-Patent Nr. 5,629,158, Solid Phase Diagnosis of Medical Conditions, erteilt am 13. Mai 1997.
  • Zusammensetzungen
  • Pharmazeutisch nützliche therapeutische Zusammensetzungen, die eine Nukleinsäurecodierungsregion, eine für eine dominant-negative Mutante codierende Region, ein hierin beschriebenes Antisense-Molekül, ein Polypeptid wie dargestellt in SEQ ID NO:3 oder eine hierin in Betracht gezogene Variation davon umfassen, können in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren formuliert werden, beispielsweise durch Beimischung eines pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoffes. Beispiele solcher Trägerstoffe und Formulierungsverfahren befinden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co, Easton, PA, USA). Zur Bildung einer pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzung, die für eine wirksame Verabreichung geeignet ist, enthalten solche Zusammensetzungen eine wirksame Menge des Proteins, DNA oder RNA.
  • Erfindungsgemäße therapeutische oder diagnostische Zusammensetzungen werden einem Individuum verabreicht oder in Mengen verwendet, die ausreichend sind, um Erkrankungen zu behandeln oder zu diagnostizieren, welche mit der hierin beschriebenen Rezeptortyrosinkinase in Verbindung stehen oder von ihr vermittelt werden. Die wirksame Menge kann je nach verschiedenen Faktoren variieren, beispielsweise dem Zustand, dem Gewicht, dem Geschlecht und dem Alter des Individuums. Andere Faktoren umfassen den Verabreichungsmodus.
  • Der Begriff funktionelles Derivat umfasst ein Molekül, das zusätzliche chemische Einheiten enthält, die normalerweise kein Teil des Basismoleküls sind. Solche Einheiten können die Löslichkeit, Halbswertszeit, Absorption, etc. des Basismoleküls verbessern. Alternativ können die Einheiten unerwünschte Nebenwirkungen des Basismoleküls abschwächen oder die Toxizität des Basismoleküks verringern. Beispiele solcher Einheiten sind in verschiedenen Texten, beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, beschrieben.
  • Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen umfassen Zusammensetzungen, bei denen die Wirkstoffe in einer wirksamen Menge enthalten sind, um den beabsichtigten Zweck zu erreichen. Die Festlegung einer wirksamen Dosis gehört zu den Fähigkeiten eines Fachmannes. Die therapeutisch wirksame Dosis lässt sich zunächst entweder in Zellkulturassays, z. B. von neoplastischen Zellen, oder in Tiermodellen, in der Regel an Mäusen, Kaninchen, Hunden oder Schweinen, abschätzen. Das Tiermodell wird auch verwendet, um einen wünschenswerten Konzentrationsbereich und einen wünschenswerten Verabreichungsweg zu erreichen. Solche Informationen können dann verwendet werden, um nützliche Dosen und Wege zur Verabreichung an Menschen festzulegen. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf die Menge einer Verbindung, eines Proteins, eines Peptids, einer Nukleinsäure, von Antikörpern, Antagonisten oder Inhibitoren, welche die Symptome oder den Zustand lindern. Die exakte Dosis wird von dem individuellen Arzt im Hinblick auf den zu behandelnden Patienten gewählt.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können dem Individuum auf verschiedenen Wegen bereitgestellt werden, beispielsweise subkutan, topisch, oral und intramuskulär. Die Verabreichung pharmazeutischer Zusammensetzungen erfolgt oral oder parenteral. Verfahren der parenteralen Abgabe umfassen topische, intraarterielle (direkt in das Gewebe), intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die vorliegende Erfindung hat außerdem die Aufgabe, geeignete topische, orale, systemische und parenterale pharmazeutische Formulierungen zur Verwendung in den neuartigen Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung bereit zu stellen. Die Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß identifizierte Verbindungen als Wirkstoff zur Verwendung bei der Modulierung eines Signalübertragungsmoleküls enthalten, können in einer großen Vielfalt von therapeutischen Dosierungsformen in herkömmlichen Verabreichungsvehikeln verabreicht werden. Beispielsweise können die Verbindungen in solchen oralen Dosierungsformen wie Tabletten, Kapseln (jeweils einschließlich Formulierungen mit zeitlich festgelegter Abgabe und anhaltender Abgabe), Pillen, Pulvern, Granula, Elixieren, Tinkturen, Lösungen, Suspensionen, Sirupen und Emulsionen oder durch Injektion verabreicht werden. Entsprechend können sie in intravenöser (sowohl als Bolus als auch als Infusion), intraperitonealer, subkutaner, topischer mit oder ohne Okklusion oder intramuskulärer Form verabreicht werden, wobei alle Anwendungsformen einem auf dem Gebiet der Pharmazeutik durchschnittlich bewanderten Fachmann gut bekannt sind. Eine wirksame, aber nicht-toxische Menge der gewünschten Verbindung kann als ein Signalübertragungstyrosinkinasemodulator eingesetzt werden.
  • Die tägliche Dosis der Produkte kann über einen weiten Bereich von 0,01 bis 1.000 mg je erwachsenem Menschen/Tag variiert werden. Für die orale Verabreichung werden die Zusammensetzungen vorzugsweise in der Form von Tabletten mit oder ohne Bruchstellen bereit gestellt, die 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0 und 50,0 Milligramm des Wirkstoffes für die symptomatische Anpassung der Dosierung an den zu behandelnden Patienten enthalten. Eine wirksame Menge des Arzneimittels wird für gewöhnlich in einer Dosisstufe von etwa 0,0001 mg/kg bis etwa 100 mg/kg Körpergewicht pro Tag gegeben. Der Bereich beträgt insbesondere etwa 0,001 mg/kg bis 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Noch spezieller variiert der Bereich von etwa 0,05 bis etwa 1 mg/kg. Natürlich variiert die Dosisstufe je nach der Potenz der jeweiligen Verbindung. Bestimmte Verbindungen sind potenter als andere. Darüber hinaus variiert die Dosisstufe je nach der Bioverfügbarkeit der Verbindung. Je höher die Bioverfügbarkeit und Potenz der Verbindung, desto weniger Verbindung muss über einen Abgebeweg verabreicht werden, einschließlich, aber nicht ausschließlich orale Abgabe. Die Dosierungen der humanen Signalübertragungskinasemodulatoren werden angepasst, wenn sie kombiniert werden, um gewünschte Effekte zu erreichen. Auf der anderen Seite können Dosierungen dieser verschiedenen Mittel unabhängig optimiert und kombiniert werden, um ein synergistisches Ergebnis zu erreichen, wobei die Pathologie stärker reduziert wird, als wenn die beiden Mittel jeweils alleine verwendet würden. Ein Fachmann verwendet andere Formulierungen für Nukleotide als für Proteine oder deren Inhibitoren. Gleichermaßen ist die Abgabe von Polynukleotiden oder Polypeptiden spezifisch für bestimmte Zellen und Zustände.
  • Beispiele
  • Beispiel I
  • Produktion und Reinigung von GST-Fusionsprotein enthaltend das neuartige humane Signalübertragungstyrosinkinase-Polypeptid
  • Die cDNA (SEQ ID NO:1), welche die neuartige humane Signalübertragungstyrosinkinase (SEQ ID NO:3) codiert, kann mithilfe folgender Primer hergestellt werden:
    • 1. 5'-GCCGTCGACTGTGGGCCTAGCAGGGAA-3' (SEQ ID NO:5)
    • 2. 5'-GCCGCGGCCGCTCAAAGCATGCTATAG-3' (SEQ ID NO:6)
  • Das PCR-Produkt wird in die SalI- und NotI-Restriktionsenzymschnittstellen in den pGEX-5X-3-Vektor (PHARMACIA BIOTECH, Piscataway, NJ, USA) kloniert.
  • Eine einzelne Kolonie von DH5alpha (LIFE TECHNOLOGIES, Gaithersburg, MD, USA), die GST, fusioniert mit der neuartigen Tyrosinkinase mit und ohne die Transmembranregion, exprimiert, wird in 10 ml LB/amp (100 μg/ml) zur Übernachtkultur mit einer Rotation von 275 Umdrehungen pro Minute bei 37°C inokuliert. Am nächsten Tag wird die ÜN-Kultur auf 100 ml LB/amp verdünnt und eine Stunde lang wachsen gelassen. IPTG wird auf 0, 5 mM zugegeben und für weitere 3 Std. wachsen gelassen. Die übrigen Schritte werden bei 4°C durchgeführt. Bakterien werden durch Zentrifugation bei 5000 Umdrehungen pro Minute für 5 Min. geerntet und in 15 ml Lysepuffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5% Triton-X-100, 1 mM PMSF und kompletten Proteaseinhibitorcocktail, aufgenommen. Zellen werden durch Ultraschallbehandlung auf Eis lysiert. Die lysierten Zellen werden zentrifugiert und der die Fusionsproteine enthaltende Überstand wird gesammelt. Das GST-Fusionsprotein wird mit 150 μl gepackten Glu tathion-Sepharose-4B-Kügelchen gereinigt. Die Kügelchen werden 1 Std. lang mit Zelllysat inkubiert, und die Kügelchen werden 5 × mit 50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 1 mM PMSF und komplettem Proteaseinhibitorcocktail gewaschen. Die gewaschenen Kügelchen werden bei 4°C als eine 2%ige Suspension im gleichen Puffer mit 0,02% Azid aufbewahrt.
  • Beispiel II
  • Demonstration einer variablen Anzahl von GT-Wiederho lungen im Tyrosinkinasegen
  • Zur Bestimmung der Allelhäufigkeit der Tyrosinkinase beim Menschen wurden Positionen 2062-2083 von SEQ ID NO:1 (Vorwärtsprimer) und Positionen 2239-2250 von SEQ ID NO:1 (Rückwärtsprimer) bei der PCR-Amplifikation dieses Fragmentes genomischer DNA von 27 nicht verwandten Kaukasiern verwendet. Das Rückwärtsoligo wurde modifiziert, um an seinem 5'-Ende die M13F-Sequenz zu umfassen (Vieira, J. and Messing, J., Methods in Enzymol., 153:3 (1987)). Die PCR-Produkte wurden durch eine Farbstoff-Primer-Sequenzierung mit einem M13F-Primer sequenziert (Martin, et al., Bio/Technology, 3:911 (1985).
  • Die Anzahl an CA/GT-Wiederholungen zwischen Positionen 2125 und 2152, die SEQ ID NO:1 entsprechen, wurde gezählt. SEQ ID NO:1, wie hierin aufgeführt, zeigte insgesamt 14 GT-Wiederholungssequenzen zwischen Positionen 2125 und 2152. DNR-Sequenzierung der PCR-Fragmente zeigte 11, 12, 13, 14 und 15 Kopien der GT-Wiederholung in der genomischen DNA des Gens der neuartigen Tyrosinkinase von 27 Kaukasiern mit den folgenden Häufigkeiten:
    Allel Häufigkeit
    11 6/54
    12 2/54
    13 17/54
    14 16/54
    15 13/54
  • Für keines der Allele wurden Homozygote beobachtet. Jedes Allel soll im Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche liegen (SEQ ID NO:1).
  • Beispiel III
  • Von SEQ ID NO:1 abstammende Antisense-Oligonukleotide hemmen Proliferation von A549-Zellen
  • Oligonukleotide werden unter folgenden Versuchsbedingungen in einer Konzentration von 2 μM zu A549-Zellen gegeben. A549-Zellen werden in einer Konzentration von 3000 Zellen je Vertiefung in einer Zellkulturplatte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Die Zellen werden vor der Transfektion über Nacht inkubiert. Das Medium wird abgesaugt, und die Zellen werden einmal mit 150 μl Opti-MEM gewaschen. Anschließend werden 70 μl Opti-MEM, enthaltend 30 μl Lipofektin/ml Opti-MEM, je 2 μM Oligo verwendet. Die Zellen werden mit dem ausgewählten Oligomer für 3-6 Std. bei 37°C mit 5% CO2 inkubiert. Nach dieser Inkubation werden 70 μl Komplettmedium, enthaltend 2x FBS, in jede Vertiefung gegeben. Zwanzig Stunden nach der Transfektion wird die Zellproliferation mit einem One Solution Cell Proliferation Assay Kit von Promega gemessen. In Kürze beschrieben, werden in jede Vertiefung 28 μl One Solution Reagent gegeben und die Platten 2 Stunden bei 37°C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% CO2 inkubiert. Nach zweistündiger Inkubation wird die Absorption bei 490 nm gemessen.
  • Beispiel IV
  • Immunpräzipitation
  • Experimente zeigen das Vorhandensein der neuartigen humanen Signalübertragungstyrosinkinase. Eine menschliche Lungenkarzinomzelllinie (A549) wurde in Lysepuffer, enthaltend 50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 1 mM PMSF und kompletter Proteaseinhibitorcocktail, lysiert. Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Zelllysate von etwa 2,5 × 106 Lungenkarzinomzellen wurden mit 10 μl polyklonalem Kaninchen-Antiserum 2 Std. lang unter ständiger Rota tion inkubiert. Als Negativkontrolle wurde Präimmunserum von demselben Kaninchen verwendet. Immunkomplexe wurden durch Addition von Protein-A-Sepharose-Kügelchen (Pharmacia) und Hin- und Herschwenken für 1 weitere Stunde eingefangen. Die Kügelchen wurden 5 Mal in Lysepuffer gewaschen. Das gebundene Protein wurde in Probenpuffer eluiert und einer SDS-PAGE auf einem 8%igen Gel unterzogen.
  • Beispiel V
  • Kinaseaktivitätsassay
  • Rekombinante gereinigte GST/SEQ ID NO:3-Kinase (oder ein anderes rekombinantes Protein, das von SEQ ID NO:3 abgeleitet ist) wird zu 20 μg Enolase in 10 μl eines 3x-Kinasereaktionspuffers (KRB) gegeben, der Folgendes enthielt: 60 mM HEPES (pH 7,5), 30 mM Magnesiumacetat, 0,15 mM ATP, 3 mM DTT, 0,03 mM Natriumorthovanadat. Die Reaktion begann durch Zugabe von 5 μCi [γ-32P]ATP (10 μl). Proben wurden für 5 Minuten bei 30°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4x-Lämmli-Probenpuffer angehalten. Proteine werden auf 12%igen Tris/Glycin-SDS-Gelen aufgetrennt, mit Coomassie-Blau gefärbt, getrocknet und einem Autoradiographiefilm ausgesetzt.
  • Beispiel VI
  • Screening mit hohem Durchsatz auf aktivitätsmodulierende Verbindungen
  • Screening auf Modulatorverbindungen mit hohem Durchsatz wird mithilfe von Enolase-beschichteten FlashPlates® mit 96 Vertiefungen (NENTM Life Science Products) durchgeführt. In jede Vertiefung werden Kinasereaktionspuffer (3x Kinasereaktionspuffer (KRB) enthält: 60 mM HEPES (pH 7,5), 30 mM Magnesiumacetat, 0,15 mM ATP, 3 mM DTT, 0,03 mM Natriumorthovanadat), 0,25 μCi [γ-32P]ATP in einer Konzentration von höchstens 1 μg/ml (bestimmt durch Titration einzelner Enzympräparationen hinsichtlich einer Konzentration, die kinetische Bestimmungen der Tyrosinkinase über einen 1-stün digen Zeitverlauf erlaubt) gegeben und 1 Stunde bei 30°C in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM Testverbindung inkubiert. Das Gesamtreaktionsvolumen beträgt 100 μl. Nach der Reaktion wird die Reaktionsmischung abgesaugt und die Vertiefungen zweimal mit 300 μl PBS gespült. Der Einbau von radioaktiv markiertem Phosphat wird durch Szintillationszählung mit dem TopCount-12-Detektor-Szintillationszähler von Packard Instrument Co. für Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen und einem Lumineszenzzähler, Modell B991200, festgestellt. Verbindungen, welche die Kinaseaktivität bei 10 μM um ≥ 50 Prozent hemmen, werden durch eine Reduktion der Szintillationswerte um > 50% angezeigt. Spezifität und Selektivität werden durch Titration von hemmenden Verbindungen, um den IC50-Wert (oder eine andere aus dem Stand der Technik gut bekannte Standardquantifizierung zum Vergleich) zu bestimmen, oder durch die Substitution anderer Kinasen in dem Assay festgestellt. Beispielsweise liefert die Bestimmung der relativen Hemmaktivität von Kinasen im Vergleich zu rekombinanter SEQ ID NO:3, die auf gleiche Weise exprimiert und isoliert und unter gleichen Bedingungen getestet werden, Selektivitätsdaten. Cooper, et al., J. Biol. Chem., 259:7835 (1984). Phosphorylation sites in enolase are utilized by tyrosine protein kinases in vivo and in vitro.
  • Alternativ kann ein Filterassay verwendet werden. Dieses Protokoll ist dasselbe, aber die Reaktion wird durch Zugabe von EDTA (pH 7,0) auf eine Endkonzentration von 80 mM angehalten. Anschließend werden die Proben zentrifugiert und 50 μl des Überstand punktförmig auf ein p81-Kationenaustauschfilterpapier (Whatman, Nr. 3698915) aufgetragen. Die Filter werden dann dreimal in 200 ml 180 mM H3PO4 (jeweils 5-10 Min.) und einmal in 200 ml 96%igem Ethanol gewaschen. Nach dem Lufttrocknen wird die Radioaktivität durch Cerenkov-Zählung in einem Szintillationszähler bestimmt.
  • Beispiel VII
  • In-vivo-Testung der Wirksamkeit (pharmakologische Aktivität)
  • Zur weiteren Evaluierung der Fähigkeit einer Verbindung, das Wachstum humaner Tumore zu hemmen, werden beispielsweise Tumorzellen in SCID(Severe Combined Immunodeficiency)-Mäuse injiziert, um palpierbare Tumormassen zu bilden. Die Wirksamkeit verschiedener Dosen (z. B. 0,5-50 mg) einer Verbindung bei der Hemmung von Tumorwachstum kann wie folgt bestimmt werden: etwa 1 × 107 Zellen der Zelllinie CCL 221 (ATCC, Rockville, Md.), einer humanen Kolonadenokarzinomzelllinie, werden in 100 μl DMEM aufgenommen und derart subkutan in SCID-Mäuse injiziert, dass sich in jeder Maus zwei Tumore bilden. SCID-Mäuse erhielten CCL 221-Zellen, und die Tumoren konnten 7 Tage ohne Behandlung wachsen; am 7. Tag (Tag 0) werden die maximalen Durchmesser der Tumore und das Gewicht der Tiere aufgezeichnet und die mittlere Tumorgröße der Mäuse bestimmt. An Tag 1 (acht Tage nach der Tumorzellinjektion) begann die Behandlung der Mäuse mit der Kandidatenverbindung oder Vehikel allein. Eine Gruppe von Mäusen (Kontrollen) werden intraperitoneal mit 0,2 ml Vehikel injiziert, und eine zweite Gruppe von Mäusen erhält die Verbindung durch intraperitoneale Injektion. In gesonderten Gruppen von Mäusen können verschiedene Dosen (0,25-75 mg) der Verbindung getestet werden. An Tag 7 und Tag 14 werden das Gewicht der Tiere und der maximale Tumordurchmesser gemessen. Die durchschnittliche maximale Tumorgröße in jeder Gruppe an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 werden verglichen. An Tag 14 wird ein Tier, das eine hohe Dosis erhielt, einen weiteren Tag verfolgt um zu bestimmen, ob der Stoff eine dosisabhängige Hemmung des Tumorwachstums bewirkt. Toxizitätseffekte können untersucht werden, indem das Gewicht der Mäuse nachverfolgt und Lunge, Leber und Milz der Tiere für die histologische Färbung entnommen werden.
  • Sequenzliste
    Figure 00630001
  • Figure 00640001
  • Figure 00650001

Claims (16)

  1. Gereinigtes Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid mit wenigstens 80% Homologie zu einem Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 Positionen 1-122, SEQ ID NO:3 Positionen 26-422 und SEQ ID NO:3 Positionen 123-422), codiert.
  2. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein die Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 dargestellt ist, umfassendes Polypeptid codiert.
  3. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein die Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 dargestellt ist, umfassendes Polypeptid codiert, wobei Position 147 (Lysin) der SEQ ID NO:3 substituiert oder deletiert ist.
  4. Polynukleotid gemäß Anspruch 3, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein die Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 dargestellt ist, umfassendes Polypeptid codiert, wobei in Position 147 der SEQ ID NO:3 Arginin vorliegt.
  5. Polynukleotid gemäß Anspruch 1, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die ein eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 Positionen 1-25, SEQ ID NO:3 Positionen 1-122, SEQ ID NO:3 Positionen 26-422 und SEQ ID NO:3 Positionen 123-422), umfassendes Polypetid codiert.
  6. Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei die Polynukleotidsequenz die Sequenz, wie sie in SEQ ID NO:2 dargestellt ist, umfaßt.
  7. Antisense-Molekül, umfassend ein Oligomer mit einer Länge im Bereich von 12 bis 25 Nukleotiden, das: (a) zu einem innerhalb der Positionen 67-148 der SEQ ID NO:1 liegenden Bereich komplementär ist oder (b) eine Sequenz umfaßt, die zu einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe (SEQ ID NO:1 Positionen 67-79; 70-82; 73-85; 75-92; 76-88; 79-91; 80-92; 81-93; 82-94; 83-95; 84-96; 85-97; 86-98; 87-99; 88-100; 89-101; 90-102; 91-103; 92-104; 93-105; 94-106; 95-107; 96-108; 97-109; 98-110; 99-111; 100-112; 101-113; 102-114; 103-115; 104-116; 105-117; 106-118; 107-119; 108-120; 109-121; 110-122; 111-123; 112-124; 113-125; 114-126; 115-127; 116-128; 117-129; 118-130; 119-131; 120-132; 121-133; 122-134; 123-135; 124-136; 125-137; 126-138; 127-139; 128-140; und 136-148) komplementär ist.
  8. Antisense-Molekül, umfassend ein Oligomer mit einer Länge im Bereich von 12 bis 25 Nukleotiden, das: (a) zu einem innerhalb der Positionen 1333-1414 der SEQ ID NO:1 liegenden Bereich komplementär ist oder (b) eine Sequenz umfaßt, die zur einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe (SEQ ID NO:1 Positionen 1333-1345; 1336-1348; 1339-1351; 1342-1354; 1345-1357; 1346-1358; 1347-1359; 1348-1360; 1348-1365; 1349-1361; 1350-1362; 1351-1363; 1352-1364; 1353-1365; 1354-1366; 1355-1367; 1356-1368; 1357-1369; 1358-1370; 1359-1371; 1360-1372; 1361-1373; 1362-1374; 1363-1375; 1364-1376; 1365-1377; 1366-1378; 1367-1379; 1368-1380; 1369-1381; 1370-1382; 1371-1383; 1372-1384; 1373-1385; 1374-1386; 1375-1387; 1376-1388; 1377-1389; 1378-1390; 1379-1391; 1380-1392; 1381-1393; 1382-1394; 1383-1395; 1384-1396; 1385-1397; 1386-1398; 1387-1399; 1388-1400; 1389-1401; 1390-1402; 1391-1403; 1392-1404; 1393-1405 und 1394-1406) komplementär ist.
  9. Expressionsvektor, umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 1.
  10. Wirtszelle, transformiert mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 9.
  11. Gereinigtes Polypeptid, umfassend die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 dargestellt ist, oder eine Variante von SEQ ID NO:3 mit wenigstens 80% Homologie zu einem Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe (SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:3 Positionen 1-122, SEQ ID NO:3 Positionen 26-422 und SEQ ID NO:3 Positionen 123-422).
  12. Antikörper, spezifisch für das Polypeptid SEQ ID NO:3.
  13. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids gemäß Anspruch 11, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 10 unter zur Expression des Polypeptids geeigneten Bedingungen und b) Isolieren des Polypeptids aus der Wirtszellkultur.
  14. Verfahren zur Identifizierung von eine biologische und/oder pharmakologische Aktivität einer Tyrosinkinase modulierenden Verbindungen, bei dem man (a) eine Kandidaten-Modulatorverbindung mit einem Polypetid gemäß Anspruch 11 kombiniert und einen Effekt der Kandidaten-Modulatorverbindung auf die biologische und/oder pharmakologische Aktivität des Polypeptids mißt.
  15. Verfahren zur Identifizierung von eine biologische und/oder pharmakologische Aktivität einer Tyrosinkinase modulierenden Verbindungen, bei dem man eine Kandidaten-Modulatorverbindung mit einer ein Polypeptid gemäß Anspruch 11 exprimierenden Wirtszelle kombiniert und einen Effekt der Kandidaten-Modulatorverbindung auf die biologische und/oder pharmakologische Aktivität des Polypeptids mißt.
  16. Diagnostische Zusammensetzung zur Identifizierung eines die Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ ID NO:3 dargestellt ist, umfassenden Polypeptids, umfassend den Antikörper nach Anspruch 12.
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