KR20060105732A - 인간 원암유전자 trg 및 이에 의해 코드되는 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것으로, 본 발명의 원암유전자는 인간 암발생에 관여하며 자궁암, 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
Description
도 1은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 암세포에서 H20-121 DNA 단편(a); H93-811 DNA 단편(b); H117-321 DNA 단편(c);H38-211 DNA 단편(d);H38-621 DNA 단편(e);H96 DNA 단편(f);H94 DNA 단편 (g);H42 DNA 단편(h); H109 DNA 단편(i);H119 DNA 단편(j);H201 DNA 단편 (k);H151 DNA 단편(l);H132 DNA 단편(m);H141 DNA 단편 (n);H181 DNA 단편 (o);H134 DNA 단편 (p)의 발현여부를 확인한 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)의 결과를 나타낸 것이고,
도 2는 정상 자궁경부 조직, 자궁암 조직, 자궁경부 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주들에서 본 발명의 TRG3(a 상단); TRG4(b 상단); TRG5(c 상단); TRG6(d 상단); TRG7(e 상단); TRG9(f 상단); TRG10(g 상단); TRG11(h 상단); TRG12(i 상단) TRG13(j 상단); TRG14(k 상단); TRG15(l 상단) ; TRG16(m 상단); TRG17(n 상단); TRG18(o 상단); TRG20(p 상단)원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고, 각 도2의 하단은 각 도 2상단과 동일한 샘플들을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG3 원암유전자의 발현 여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 3b는 도 3a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 4a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 4b는 도 4a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 5a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 5b는 도 5a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 6a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 6b는 도 6a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 7a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 7b는 도 7a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 8a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 8b는 도 8a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 9a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 9b는 도 9a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 10a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 10b는 도 10a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 11a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 11b는 도 11a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 12a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 12b는 도 12a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 13a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 13b는 도 13a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 14a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 14b는 도 14a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 15a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 15b는 도 15a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 16a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 16b는 도 16a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 17a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 17b는 도 17a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 18a는 정상 인간 12-열 다중 조직에서 본 발명의 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 18b는 도 18a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 19a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 19b는 도 19a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 20a는 인간 암 세포주들에서 TRG4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 20b는 도 20a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 21a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 21b는 도 21a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 22a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 22b는 도 22a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 23a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확 인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 23b는 도 23a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 24a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 24b는 도 24a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 25a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 25b는 도 25a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 26a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 26b는 도 26a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 27a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 27b는 도 27a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 28a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 28b는 도 28a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 29a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 29b는 도 29a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 30a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 30b는 도 30a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 31a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 31b는 도 31a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고;
도 32a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 32b는 도 32a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 33a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 33b는 도 33a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이고,
도 34a는 인간 암 세포주들에서 본 발명의 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이고,도 34b는 도 34a와 동일한 샘플을 β-액틴으로 혼성화시켜 얻은 결과를 나타낸 것이다.
도 35는 본 발명의 TRG3 (a); TRG4(b); TRG5(c); TRG6(d); TRG7(e); TRG9(f); TRG10(g); TRG11(h); TRG12(i) TRG13(j); TRG14(k); TRG15(l); TRG16(m); TRG17(n); TRG18(o); TRG20(p) 원암유전자를 대장균에 형질도입시킨 후 엘 아라비노즈 (L-Arabinose) 유도 이전 및 이후에 발현되는 단백질의 크기를 소디움 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔 (SDS-PAGE)에서 전기영동한 결과이다.
본 발명은 암발생과 암전이 유발능을 나타내는 신규 원암유전자 및 이에 의해 코드되는 단백질에 관한 것이다.
인간을 포함한 고등동물들은 약 30,000개의 유전자들을 갖고 있으나 이들 중 약 15%만이 각각의 개체에서 발현된다. 따라서, 어떠한 유전자가 선택되어 발현되느냐에 따라서 생명의 모든 현상 즉, 발생, 분화, 항상성 (homeostasis), 자극에 대한 반응, 세포분열 주기조절, 노화 및 아폽토시스 (apoptosis; programmed cell death) 등이 결정된다 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992).
종양발생과 같은 병리학적 현상은 유전자 변이과정으로 유발되어 결국에는 유전자 발현의 변화를 유도하게 된다. 따라서, 상이한 세포들 사이에서 나타나는 유전자 발현들의 비교는 여러 생물학적 현상을 이해하는데 기본적이고 효과적인 접근방법이라고 할 수 있다. 예를 들면, 리앙과 파디 (Liang, P. and A. B. Pardee, Science 257: 967-971, 1992)에 의해 제안된 mRNA 감별전개 (differential display) 방법은 현재 종양억제 유전자나 세포분열 주기 (cell cycle)에 관련된 유전자 및 아폽토시스에 관련된 전사조절 유전자 (transcriptional regulatory gene) 등의 탐색에 효과적으로 이용되고 있으며, 또한 하나의 세포에서 일어나는 다양한 유전자들의 상호 관련성의 규명에도 다양하게 활용되고 있다.
종양발생에 대한 여러 연구결과들을 종합하여 보면 특정 염색체 부위의 소실 (loss of chromosomal heterozygosity), 원암유전자들의 활성화 및 p53 유전자를 포함한 다른 종양억제 유전자들의 불활성화 등과 같은 여러 가지 유전적 변화들이 종양조직에 축적되어 인간종양을 일으킨다고 보고되었다 (Bishop, J. M., Cell 64: 235-248, 1991; Hunter, T., Cell 64: 249-270, 1991). 또한, 암의 10 내지 30%는 원암유전자가 증폭됨으로써 활성화되어 일어난다고 보고되어 있어, 원암유전자의 활성화는 많은 암의 병인학 연구에 중요한 역할을 하며, 이를 밝히는 것이 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 자궁경부암의 발생기전을 원암유전자 수준에서 접근한 결과, 인간 형질전환 관련 유전자 (human transformation-related gene; TRG)로 명명된 원암유전자가 암세포에서만 특이하게 발현이 증가 된다는 것을 밝혀내었다. 상기 원암유전자는 자궁암, 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등과 같은 다양한 암의 진단, 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 목적은 신규 원암유전자 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자에 의해 코드되는 단백질 및 그의 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 서열번호: 1; 서열번호 5; 서열번호: 9; 서열번호: 13; 서열번호: 17; 서열번호: 21; 서열번호: 25; 서열번호: 29; 서열번호: 33; 서열번호: 37; 서열번호: 41; 서열번호: 45; 서열번호: 49; 서열번호: 53; 서열번호: 57; 또는 서열번호: 61의 염기 서열을 갖는 원암 유전자 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 이에 의해 형질전환된 미생물을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암 유전자에 의하여 코딩되는 서열번호: 2; 서열번호: 6; 서열번호: 10; 서열번호: 14; 서열번호: 18; 서열번호: 22; 서열번호: 26; 서열번호: 30; 서열번호: 34; 서열번호: 38; 서열번호: 42; 서열번호: 46; 서열번호: 50; 서열번호: 54; 서열번호: 58; 또는 서열번호: 62의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암단백질 또는 그의 단편을 포함하는 암 진단용 키트를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 원암유전자 또는 그의 단편으로부터 전사되는 mRNA 서열의 전부 또는 일부와 상보적인 염기서열을 지니고, 상기 mRNA에 결합하여 상기 원암유전자 또는 단편의 발현을 억제하는 안티-센스 유전자를 제공한다.
상기 또 다른 목적에 따라, 본 발명에서는 상기 안티-센스 유전자를 활성성분으로 포함하는 항암 및 항전이 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
1.
TRG
3
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 3 (human transformation-related gene 3; 이후 TRG3로 지칭함)은 서열번호: 1로 기재되는 1,703 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 113 내지 1522 부위 (1520-1522: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 2에 나타나 있으며 469개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG3 단백질"로 지칭함).
서열번호: 1의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY189688 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 4월 8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC011681호인 Homo sapiens CGI-51 protein 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서 는 발현이 매우 낮은 TRG3 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 1의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 2와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 1과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 469개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 2로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 52 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이 상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
2. TRG 4
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 4 (human transformation-related gene 4; 이후 TRG4로 지칭함)은 서열번호: 5로 기재되는 2,576 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 5의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 87 내지 482 부위 (480- 482: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 6에 나타나 있으며 131개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG4 단백질"로 지칭함).
서열번호: 5의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY189690 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 4월 8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_022463호인 Homo sapiens nucleoredoxin (NXN) 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었으나 단백질서열은 완전히 다른 유전자이다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG4 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화 시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 5의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 6과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 5와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 131개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 14 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
3.
TRG
5
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 5 (human transformation-related gene 5; 이후 TRG5로 지칭함)은 서열번호: 9로 기재되는 1,334 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 88 내지 1092 부위 (1090-1092: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 10에 나타나 있으며 334개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG5 단백질"로 지칭함).
서열번호: 9의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY189689 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 4월 8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_002300 호인 Homo sapiens lactate dehydrogenase B (LDHB) 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG5 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발 명은 상기 서열번호: 9의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 10과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 9와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 334개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 37 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
4.
TRG
6
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 6 (human transformation-related gene 6; 이후 TRG6로 지칭함)은 서열번호: 13으로 기재되는 3,309 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다. 서열번호: 13의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 233 내지 481 부위 (479-481: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유 도되는 아미노산 서열은 서열번호: 14에 나타나 있으며 82개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG6 단백질"로 지칭함).
서열번호: 13의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY191222 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 4월 8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AL354928호인 염색체 9 상의 RP11-175D17 클론 등과 유전자와 유전자 염기서열이 일부 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG6 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 13의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 14와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 13과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 82개의 아미노산으로 이루어 져 있고 서열번호: 14로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 9 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
5.
TRG
7
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 7 (human transformation-related gene 7; 이후 TRG7으로 지칭함)은 서열번호: 17로 기재되는 1,334 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 17의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 42 내지 1422 부위 (1420-1422: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 18에 나타나 있으며 175개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG7 단백질"로 지칭함).
서열번호: 17의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이스에 등록번호 제 AY191223 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 4월 8일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AK074557호인 Homo sapiens cDNA FLJ90076 fis, 클론 HEMBA1004444 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG7 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 17의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 18과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 17과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 175개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 18로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 20 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질 적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
6.
TRG
9
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 9 (human transformation-related gene 9; 이후 TRG9으로 지칭함)은 서열번호: 21로 기재되는 1,582 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 21의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 17 내지 1576 부위 (1574-1576: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 22에 나타나 있으며 519개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG9 단백질"로 지칭함).
서열번호: 21의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY272044 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_003100호인 Homo sapiens sorting nexin 2 (SNX2) 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG9 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유 전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 21의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 22와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 21과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 519개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 22로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 58 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
7.
TRG
10
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 10 (human transformation-related gene 10; 이후 TRG10으로 지칭함)은 서열번호: 25로 기재되는 3,979 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 25의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1100 내지 1270 부위 (1268-1270: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 26에 나타나 있으며 56개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG10 단백질"로 지칭함).
서열번호: 25의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277593 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_033346호인 Homo sapiens bone morphogenetic protein receptor, type II (serine/threonine kinase) (BMPR2), 전사 변이체 2 유전자 등과 유전자 서열이 유사한 것이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 낮은 TRG10 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 25의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 26과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서 열번호: 25와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 56개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 26으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 6 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
8.
TRG
11
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 11 (human transformation-related gene 11; 이후 TRG11로 지칭함)은 서열번호: 29로 기재되는 235 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 29의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 26 내지 214 부위 (227-229: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 30에 나타나 있으며 62개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG11 단백질"로 지칭함).
서열번호: 29의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터 베이에 등록번호 제 AY277594 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC022205호인 Homo sapiens IMAGE:5258564유전자 클론 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG11 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 29의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 30과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 29와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 62개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 30으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 7 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
9.
TRG
12
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 12 (human transformation-related gene 12; 이후 TRG12로 지칭함)은 서열번호: 33으로 기재되는 510 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 33의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 80 내지 475 부위 (473-475: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 34에 나타나 있으며 131개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG12 단백질"로 지칭함).
서열번호: 33의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277595 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AY358674호인 Homo sapiens DNA59497 MY047 (UNQ577) 유전자 클론 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG12 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 33의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 34와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 33과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 131개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 34로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 14 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
10.
TRG
13
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 13 (human transformation-related gene 13; 이후 TRG13으로 지칭함)은 서열번호: 37로 기재되는 1,301 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 37의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 18 내지 1193 부위 (1191-1193: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 38에 나타나 있으며 391개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG13 단백질"로 지칭함).
서열번호: 37의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277596 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 BC002940호인 Homo sapiens MGC11349 유전자와 제 BC012729호인 Homo sapiens MGC11349 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 이들 유전자는 아직 기능이 밝혀져 있지 않고 있다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG13 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 37의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 38과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 37과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 391개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 38로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 40 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
11.
TRG
14
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 14 (human transformation-related gene 14; 이후 TRG14로 지칭함)은 서열번호: 41로 기재되는 1,206 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 41의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 18 내지 1202 부위 (1200- 1202: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 42에 나타나 있으며 394개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG14 단백질"로 지칭함).
서열번호: 41의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277597 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_006096호인 Homo sapiens N-myc downstream regulated gene 1 (NDRG1)유전자 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG14 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 41의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 42와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 41과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서 열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 394개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 42로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 43 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
12.
TRG
15
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 15 (human transformation-related gene 15; 이후 TRG15로 지칭함)은 서열번호: 45로 기재되는 1,104 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 45의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1 내지 1104 부위 (1102-1104: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 46에 나타나 있으며 367개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG15 단백질"로 지칭함).
서열번호: 45의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277598 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염 기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_017952 호 인 Homo sapiens FLJ20758 protein 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. FLJ20758 protein 유전자는 아직 기능이 밝혀져있지 않고 있다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG15 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 45의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 46과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 45와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 367개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 46으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 42 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
13.
TRG
16
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 16 (human transformation-related gene 16; 이후 TRG16으로 지칭함)은 서열번호: 49로 기재되는 1,064 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 49의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 92 내지 1064 부위 (1062-1064: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 50에 나타나 있으며 324개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG16 단백질"로 지칭함).
서열번호: 49의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277601 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AF318376 호인 Homo sapiens pp9320 mRNA 유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. pp9320 유전자는 아직 기능이 밝혀져있지 않고 있다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG16 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 49의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 50과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 49와 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 324개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 50으로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 36 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
14.
TRG
17
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 17 (human transformation-related gene 17; 이후 TRG17로 지칭함)은 서열번호: 53으로 기재되는 432 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 53의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 1 내지 408 부위 (406-408: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 54에 나타나 있으며 135개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG17 단백질"로 지칭함). 서열번호: 53의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277599 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_032286호인 Homo sapiens MGC5309 (MGC5309)유전자와 제 BC003353호인 Homo sapiens MGC5309유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG17 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 53의 원암 유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 54와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 53과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 135개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 54로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 16 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
15.
TRG
18
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 18 (human transformation-related gene 18; 이후 TRG18로 지칭함)은 서열번호: 57로 기재되는 1,141 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 57의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 20 내지 1141 부위 (1139- 1141: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 58에 나타나 있으며 373개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG18 단백질"로 지칭함). 서열번호: 57의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY277600 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 AJ131389호인 Homo sapiens PEX3 단백질에 대한 mRNA 유전자 등과 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG18 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 57의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 58과 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 57과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 373개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 58로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 42 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
16.
TRG
20
본 발명의 원암 (原癌) 유전자 (protooncogene)인 인간 형질전환 관련 유전자 20 (human transformation-related gene 20; 이후 TRG20으로 지칭함)은 서열번호: 61로 기재되는 449 bp 길이의 전체 염기서열을 가진다.
서열번호: 61의 염기서열에서, 뉴클레오티드 번호 42 내지 449 부위 (447-449: 종료코돈)에 해당하는 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 전체 단백질 코딩 영역으로서 이로부터 유도되는 아미노산 서열은 서열번호: 62에 나타나 있으며 135개의 아미노산으로 이루어져 있다 (이후 "TRG20 단백질"로 지칭함). 서열번호: 61의 염기서열은 미국 국립보건원의 진뱅크(NIH GenBank) 데이터베이에 등록번호 제 AY453397 호로 등록되었으며(공개예정일: 2005년 3월 31일) 염기서열 분석결과 이 데이터베이스에 등록된 제 NM_032286호인 Homo sapiens 가상 단백질 MGC5309 (MGC5309)유전자와 제 BC003353호인 Homo sapiens 가상 단백질 MGC5309유전자와 유전자 염기서열이 유사함이 확인되었다. 그러나 금번 연구 결과 자궁암을 포함한 여러 인간 종양들에서는 발현이 높고 반면에 여러 정상조직들에서는 발현이 매우 낮은 TRG20 원암유전자를 발굴하게 되었다.
그러나, 코돈의 축퇴성 (degeneracy)으로 인해서 또는 상기 원암유전자를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여 본 발명의 원암유전자는 코딩영역으로부터 발현되는 발암단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 서열번호: 61의 원암유전자와 실질적으로 동일한 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 및 상기 유전자의 단편을 역시 포함한다. 실질적으로 동일한 폴리뉴클레오티드란 서열번호: 62와 동일한 단백질 번역 생성물을 암호화하는 DNA로서 서열번호: 61과 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자로부터 발현되는 단백질은 135개의 아미노산으로 이루어져 있고 서열번호: 62로 기재되는 아미노산 서열을 가지며 크기는 약 16 kDa이다. 그러나, 상기 단백질의 아미노산 서열에서도 역시 단백질의 기능에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 아미노산의 치환, 부가 또는 결실이 이루어질 수 있으며, 목적에 따라 단백질의 일부만이 사용될 수도 있다. 그러한 변형된 아미노산 서열 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 따라서, 본 발명은 상기 발암 단백질과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 그의 단편을 역시 포함하며, 실질적으로 동일한 폴리펩티드란 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것들을 의미한다.
본 발명의 원암유전자 및 단백질은 사람의 암 조직으로부터 분리하거나, 공지의 DNA 또는 펩타이드 합성 방법에 따라 합성할 수도 있다. 또한, 이렇게 제조된 유전자를 당 분야에 공지된 미생물 발현용 벡터에 삽입하여 발현벡터를 제조한 후 이를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 도입시킬 수 있다. 이와 같이 형질전환된 숙주를 이용하여 본 발명의 유전자의 DNA를 대향으로 복제하거나 단백질을 대량 생산할 수 있다.
벡터의 제작시에는, 상기 원암유전자 또는 단백질을 생산하고자 하는 숙주 세포의 종류에 따라 프로모터, 터미네이터 등과 같은 발현조절서열, 자가복제서열 및 분비 시그날 등을 적절히 선택하고 조합할 수 있다.
본 발명의 유전자는 노던 블롯 (northern blot) 등의 분석방법에서 정상 자궁경부 조직에서는 발현이 약한 반면 자궁경부암 조직과 자궁암 세포주들에서는 그 과발현이 확인되므로 자궁암을 유발시키는 강력한 발암 유전자로 판단된다. 자궁경부암과 같은 상피성 조직외에도, 본 발명의 원암유전자는 백혈병과 대장암 등과 같은 많은 다른 암 종양들에서 높게 발현된다. 따라서, 본 발명의 원암유전자는 다양한 암의 발생에 공통된 발암유전자일 것으로 판단되며, 다양한 암의 진단, 형질전환된 동물의 제조, 안티-센스 (anti-sense) 유전자 치료 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
상기 원암유전자를 이용한 암의 진단 방법은, 예를 들어, 상기 원암유전자의 전부 또는 일부를 프로브로 사용하여 대상자의 체액으로부터 분리한 핵산과 혼성화한 후 당 분야에 공지된 다양한 방법으로 이를 검출하므로써 대상자가 본 발명의 원암유전자를 가지고 있는지를 판단하는 과정을 포함한다. 상기 프로브를 방사선 동위원소 또는 효소 등으로 표지하면 용이하게 유전자의 존재를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 원암유전자의 전부 또는 일부를 포함하는 암 진단용 키트를 역시 제공한다.
형질전환 동물은 본 발명의 원암유전자를 포유동물, 예를 들어, 래트 등의 설치류 동물에 도입함으로써 제조할 수 있으며, 이 유전자를 적어도 8세포기 이전의 수정란 단계에서 도입하는 것이 바람직하다. 이렇게 제조된 형질전환 동물은 발암성 물질 또는 항산화제와 같은 항암성 물질의 탐색 등에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 유전자 치료에 효과적인 안티-센스 유전자를 제공한다. 본원에서, "안티센스 유전자 (anti-sense gene)"는 상기 원암유전자 또는 그의 일부로부터 전사되는 mRNA의 일부 또는 전부와 상보적인 서열을 가지는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 mRNA의 단백질 결합부위에 결합하여 원암유전자의 오픈 리딩 프레임 (open reading frame; ORF)을 파괴할 수 있는 서열을 갖는 DNA 서열을 환자의 체내로 도입함으로써 상기 원암유전자의 발현으로 인한 암을 예방 또는 치료할 수 있다. 본 발명은 또한 그 범위 내에 본 발명의 안티센스 유전자의 치료 효과량을 환자에게 투여하여 암 또는 암 전이를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다.
본 발명의 안티센스 유전자 치료에서, 본 발명의 안티센스 유전자는 통상적인 방법으로 환자에게 투여되어 원암유전자의 발현을 예방한다. 예를 들면, 문헌 (J. S. Kim et al., J. Controlled Release 53: 175-182, 1998)의 방법에 따라 안티센스 올리고데옥시뉴클레오티드 (ODN)를 폴리-L-리신 유도체와 정전기적 인력에 의하여 혼합시키고, 이 혼합체를 환자에게 정맥투여한다.
본 발명의 범위에는 또한, 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 경우에 따라 다른 첨가제와 함께 본 발명의 안티센스 유전자를 활성성분으로 포함하는 항암조성물을 포함한다. 본 발명의 약학 조성물을 주사제로 제제화하는 것이 바람직하다.
실제로 투여되는 안티센스 유전자의 양은 치료되는 증상, 투여 경로, 환자의 연령 및 체중, 증상의 중증도와 같은 다양한 관련되는 인자를 고려하여 결정한다.
본 발명의 원암유전자로부터 유도되는 단백질은 진단 도구로서 항체를 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 항체는, 본 발명의 원암유전자로부터 발현된 상기 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편을 이용하여 당 분야에 공지된 통상의 방법에 따라 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체로서 제조할 수 있으며, 이러한 항체들을 이용하여 당분야에 공지 된 효소 면역측정법 (enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사선면역측정법 (radioimmunoassay; RIA), 샌드위치 측정법 (sandwich assay), 폴리아크릴아미드 겔상의 웨스턴 블롯 또는 면역 블롯 등의 방법에 의해 대상자의 체액 시료 중에 상기 단백질이 발현되었는지를 확인함으로써 암을 진단할 수 있다.
또한, 본 발명의 원암유전자를 이용하여 지속적으로 증식할 수 있는 암 세포주를 확립할 수 있으며, 이러한 세포주는 예를 들어, 상기 원암유전자가 형질도입된 섬유모세포를 이용하여 누드 마우스 등에 형성시킨 종양조직으로부터 제조할 수 있다. 이러한 암 세포주는 항암제 등의 탐색에 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 종양세포의 배양 및 총 RNA의 분리
(단계 1) 종양세포의 배양
mRNA의 감별 전개를 위하여, 자궁적출술 (hysterectomy)을 받은 자궁근종 환자로부터 정상자궁경부 (exocervical) 조직, 그리고 이전에 항암요법과 방사선치료를 받지 않은 자궁암 환자로부터 수술시에 원발성 자궁경부 종양조직 및 전이 임파절 종양조식을 취하였다. 감별 전개법에는 인간 자궁경 부암 세포주로 CUMC-6 (Kim, J. W. et al ., Gynecol . Oncol . 62: 230-240, 1996)을 사용하였다.
상기 수득된 조직 및 CUMC-6 세포주로부터 얻은 세포를 2 mM 글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10% 우태아 혈청 (Gibco, USA)이 함유된 웨이마우쓰 (Waymouth's) MB 752/1 배양액 (Gibco)에서 증식시켰다. 실험에 사용한 배양 세포들은 지수적 증식 과정의 세포들로서 트리판 블루 (trypan blue) 염색에 의해 95% 이상의 생존도를 보이는 세포를 이용하였다 (Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique" 2nd Ed., A. R. Liss, New York, 1987).
(단계 2) RNA의 분리 및 mRNA의 감별 전개법
상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy 총 RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 단계 1에서 얻은 정상 자궁경부 조직, 원발성 자궁경부 종양조직, 전이 임파절 종양조직 및 CUMC-6 세포로부터 총 RNA를 추출하였다. 메시지 클린 키트 (Message clean kit, GenHunter Corp., Brookline, MA)를 사용하여 RNA로부터 DNA 오염원을 제거하였다.
<실시예 2> 감별 전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (differential display reverse transcription-PCR)
감별전개 역전사는 상기 리앙과 파디에 의해 기술된 역전사-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR)을 약간 변형하여 수행하였다.
2-1:
TRG
3
먼저, 실시예 1의 단계 1에서 얻은 총 RNA 0.2 ㎍씩에 고정된 올리고-dT 프라이머로서 서열번호: 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA)를 사용하여 역전사를 수행하였다.
이어서, 0.5 mM [α-35S] dATP (1200 Ci/mmole) 존재 하에, 동일한 고정 프라이머 및 무작위 5' 11 프라이머 (RNAimage primer sets 1-5) H-AP 1 내지 40 중 서열번호: 4로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP20 프라이머 (5'-AAGCTTGTTGTGC-3')를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 조건은 95℃에서 40초 반응 후 40℃에서 2분, 72℃에서 40초를 40회 반응시키며 최종 연장 (final extension)을 위하여 72℃에서 5분간 더 반응시켰다.
PCR로 증폭된 단편을 6% 폴리아크릴아미드 시퀀싱 겔에 용해시킨 후, 방사능 사진을 이용하여 서로 다른 발현 (differentially expressed) 정도를 보이는 밴드의 위치를 확인하였다.
건조된 겔로부터 258 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H20-121 cDNA (서열번호: 1의 1342-1599 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H20-121 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-2:
TRG
4
서열번호: 7로 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 8로 H-AP9 프라이머 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 393 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H93-811 cDNA (서열번호: 5의 2086-2478 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H93-811 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-3:
TRG
5
서열번호: 11로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 12로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP11 프라이머 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 292 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H117-321 cDNA (서열번호: 9의 933-1224 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H117-321 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-4:
TRG
6
서열번호: 15로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘- AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 16으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP38 프라이머 (5'-AAGCTTCCAGTGC-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 311 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H38-211 cDNA (서열번호: 13의 2823-3133 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H38-211 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-5:
TRG
7
서열번호: 19로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 20으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP38 프라이머 (5'-AAGCTTCCAGTGC-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 292 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H38-621 cDNA (서열번호: 17의 1404-1695 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H38-621 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-6:
TRG
9
서열번호: 23으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 24로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP9 프라이머 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')를 사용한 것 을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 275 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H96 cDNA (서열번호: 21의 1225-1499 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H96 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-7;
TRG10
서열번호: 27로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 28로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP9 프라이머 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 352 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H94 cDNA (서열번호: 25의 3528-3879 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H94 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-8;
TRG11
서열번호: 31로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 32로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP4 프라이머 (5'-AAGCTTCTCAACG-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 147 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H42 cDNA (서열번호: 29의 83-229 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H42 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-9:
TRG
12
서열번호: 35로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 36으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP10 프라이머 (5'-AAGCTTCCACGTA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 212 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H109 cDNA (서열번호: 33의 284-495 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H109 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-10:
TRG
13
서열번호: 39로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 40으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP11 프라이머 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 232 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H119 cDNA (서열번호: 37의 1004-1235 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H119 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기 와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-11:
TRG
14
서열번호: 43으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 44로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP20 프라이머 (5'-AAGCTTGTTGTGC-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 195 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H201 cDNA (서열번호: 41의 902-1096 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H201 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-12:
TRG
15
서열번호: 47로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 48로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP15 프라이머 (5'-AAGCTTACGCAAC-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 252 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H151 cDNA (서열번호: 45의 848-1099 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H151 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-13:
TRG
16
서열번호: 51로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 52로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP13 프라이머 (5'-AAGCTTCGGCATA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 227 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H132 cDNA (서열번호: 49의 813-1039 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H132 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-14:
TRG
17
서열번호: 55로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11G 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 56으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP14 프라이머 (5'-AAGCTTGGAGCTT-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 185 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H141 cDNA (서열번호: 53의 235-419 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H141 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-15:
TRG
18
서열번호: 59로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11C 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 60 으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP18 프라이머 (5'-AAGCTTAGAGGCA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 227 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H181 cDNA (서열번호: 57의 902-1128 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H181 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
2-16:
TRG
20
서열번호: 63으로 기재되는 염기서열을 갖는 H-T11A 고정 프라이머 (5‘-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage kit, Genhunter, Cor., MA, USA) 및 서열번호: 64로 기재되는 염기서열을 갖는 H-AP13 프라이머 (5'-AAGCTTCGGCATA-3')를 사용한 것을 제외하곤 상기 2-1과 동일한 과정으로 PCR을 수행하였다.
건조된 겔로부터 186 염기쌍 (bp) 크기의 밴드, H134 cDNA (서열번호: 61의 232-417 bp)를 도려내었다. 15분간 가열하여 H134 cDNA를 용출시킨 후, [α-35S] 표지된 dATP (1200 Ci/mmole) 및 20 μM dNTP를 사용하지 않는 것을 제외하고는 상기와 동일한 프라이머 및 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하여 재증폭시켰다.
<실시예 3> 클로닝
상기에서 얻은 재증폭된 H20-121; H93-811; H117-321;H38-211;H38-621;H96 ; H94; H42;H109;H119;H201;H151;H132;H141;H181; 또는 H134 PCR 산물을 TA 클로닝 시스템 (Promega, USA)을 사용하여 제조사의 방법에 따라 pGEM-T EASY 벡터에 삽입하였다.
(단계 1) 연결반응
실시예 2에서 얻은 재증폭된 H20-121; H93-811; H117-321; H38-211 ;H38-621 ;H96; H94;H42;H109 ;H119 ;H201 ;H151 ;H132 ;H141 ;H181 또는 H134 PCR 산물 2㎕, pGEM-T EASY 벡터 (50 ng) 1 ㎕, T4 DNA 연결효소 10X 완충액 1 ㎕ 및 T4 DNA 연결효소 (3 weiss units/㎕; T4 DNA ligase, Promega) 1 ㎕를 0.5 ㎖ 시험관에 넣은 후, 증류수를 가하여 최종 부피가 10 ㎕가 되도록 하였다. 연결 반응 혼합물은 14℃에서 밤새 배양하였다.
(단계 2) TA 클로닝 형질전환
대장균 JM109 (Promega, WI, USA)를 10 ㎖의 LB 브로쓰 (박토-트립톤 10 g, 박토-효모 추출물 5 g, NaCl 5 g) 중에서 600 ㎚에서의 광학밀도 값이 약 0.3 내지 0.6이 될 때까지 배양하였다. 배양 혼합물을 얼음에 약 10분간 방치한 후, 4℃에서 10분간 방치한 후, 4℃에서 10분간 4000 rpm으로 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 수집하였다. 수집한 세포 펠릿을 10 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl2에 30분 내지 1시간 가량 노출시켜 컴피턴트 (competent) 세포를 제조하였다. 결과물을 4℃, 4000 rpm에서 10분 동안 다시 원심분리하여 상청액을 버리고 세포를 모아서 2 ㎖의 빙냉 0.1 M CaCl2에 현탁시켰다.
컴피턴트 세포 현탁액 200 ㎕를 새로운 마이크로퓨즈 (microfuge) 튜브에 옮기고, 여기에 단계 1에서 제조한 연결 반응 산물 2 ㎕를 가하였다. 혼합물을 42℃의 수욕 (water bath)에서 90초간 배양시킨 후, 0℃에서 급냉시켰다. 여기에, SOC 배지 (박토-트립톤 2.0 g, 박토-효모 추출물 0.5 g, 1 M NaCl 1 ㎖, 1 M KCI 0.25㎖, TDW 97 ㎖, 2 M Mg2 + 1 ㎖, 2 M 글루코스 1 ㎖) 800㎕를 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 220 rpm의 회전진탕 배양기에서 45분간 배양시켰다.
37℃ 배양기에 미리 넣어둔, 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 X-gal (40 ㎎/㎖ 디메틸포름아미드에 저장) 25 ㎕를 유리봉으로 확산시킨 후, 여기에 25 ㎕의 형질전환된 세포를 넣어서 다시 유리봉으로 확산시키고 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후 형성된 백색 콜로니를 3-4개 선택하여 앰피실린이 첨가된 LB 플레이트에 각각의 선택된 클론들을 심었다. 플라스미드를 제조하기 위하여 이들 중 삽입이 확인된 콜로니, 즉, 형질전환된 대장균 JM109/H20-121;JM109/H93-811;JM109/H117-321;JM109/H38-211 ; JM109/H38-621 ; JM109/H96 ; JM109/H94; JM109/H42; JM109/H109 ; JM109/H119 ; JM109/H201 ; JM109/H151 ; JM109/H132 ; JM109/H141 ; JM109/H181; 또는 JM109/H134을 선택하여 10㎖의 테리픽 브로쓰 (terrific broth; TDW 900 ㎖, 박토-트립톤 12 g, 박토-효모 추출물 24 g, 글리세롤 4 ㎖, 0.17 M KH2PO4, 0.72 N K2HPO4 100 ㎖)에서 배양하였다.
<실시예 4> 재조합 플라스미드 DNA의 분리
위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 키트 (WizardTM Plus Minipreps DNA Purificatin Kit, Promega, USA)를 사용해서 제조사의 지시에 따라 형질전환된 대장균으로부터 H20-121;H93-811 ; H117-321; H38-211 ;H38-621 ;H96 ; H94 ;H42 ;H109 ;H119 ;H201 ;H151 ;H132 ;H141 ;H181 ; 또는 H134 플라스미드 DNA를 분리하였다.
분리된 플라스미드 DNA의 일부를 ECoRI 효소로 처리한 후, 2% 겔에서 전기영동을 실시하여 H20-121;H93-811; H117-321;H38-211 ;H38-621 ;H96 ; H94 ;H42;H109 ;H119 ;H201 ;H151 ;H132 ;H141 ;H181 ;또는 H134 부분서열이 플라스미드에 삽입되었음을 확인하였다.
<실시예 5> DNA 염기서열 분석
5-1;
TRG
3
실시예 2에서 수득한 H20-121 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H20-121 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 1의 뉴클레오티드 번호 1342 내지 1599에 해당하며, 본 발명에서는 "H20-121"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP20 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 258 bp cDNA 단편, 즉, H20-121를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1a에서 알 수 있는 바와 같이, 258 bp cDNA 단편인 H20-121은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-2;
TRG
4
실시예 2에서 수득한 H93-811 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H93-811 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 5의 뉴클레오티드 번호 2086 내지 2478에 해당하며, 본 발명에서는 "H93-811"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP9 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 393 bp cDNA 단편, 즉, H93-811 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1b에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1b에서 알 수 있는 바와 같이, 393 bp cDNA 단편인 H93-811은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-3;
TRG
5
실시예 2에서 수득한 H117-321 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H117-321 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 9의 뉴클레오티드 번호 933 내지 1224에 해당하며, 본 발명에서는 "H117-321"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP11 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 292 bp cDNA 단편, 즉, H117-321 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1c에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1c에서 알 수 있는 바와 같이, 292 bp cDNA 단편인 H117-321은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-4;
TRG
6
실시예 2에서 수득한 H38-211 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H38-211 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 13의 뉴클레오티드 번호 2823 내지 3133에 해당하며, 본 발명에서는 "H38-211"로 지칭하였다. 5' 무작위 프라이머 H-AP38 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 311 bp cDNA 단편, 즉, H38-211 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1d에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1d에서 알 수 있는 바와 같이, 311 bp cDNA 단편인 H38-211은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-5;
TRG
7
실시예 2에서 수득한 H38-621 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H38-621 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination) 에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 17의 뉴클레오티드 번호 1404 내지 1695에 해당하며, 본 발명에서는 "H38-621"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP38 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 292 bp cDNA 단편, 즉, H38-621 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1e에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1e에서 알 수 있는 바와 같이, 292 bp cDNA 단편인 H38-621은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-6;
TRG
9
실시예 2에서 수득한 H96 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H96 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 21의 뉴클레오티드 번호 1225 내지 1499에 해당하며, 본 발명에서는 "H96"으로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP9 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 275 bp cDNA 단편, 즉, H96을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시 키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1f에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1f에서 알 수 있는 바와 같이, 275 bp cDNA 단편인 H96은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-7;
TRG10
실시예 2에서 수득한 H94 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H94 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 25의 뉴클레오티드 번호 3528 내지 3879에 해당하며, 본 발명에서는 "H94"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP9 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 352 bp cDNA 단편, 즉, H94 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1g에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1g에서 알 수 있는 바와 같이, 352 bp cDNA 단편인 H94는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 약하였다.
5-8;
TRG11
실시예 2에서 수득한 H42 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H42 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 29의 뉴클레오티드 번호 83 내지 229에 해당하며, 본 발명에서는 "H42"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP4 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 147 bp cDNA 단편, 즉, H42를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1h에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1h에서 알 수 있는 바와 같이, 147 bp cDNA 단편인 H42는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 약하였다.
5-9;
TRG
12
실시예 2에서 수득한 H109 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H109 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination) 에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 33의 뉴클레오티드 번호 284 내지 495에 해당하며, 본 발명에서는 "H109"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP10 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 212 bp cDNA 단편, 즉, H109 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1i에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1i에서 알 수 있는 바와 같이, 212 bp cDNA 단편인 H109는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-10;
TRG
13
실시예 2에서 수득한 H119 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H119 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 37의 뉴클레오티드 번호 1004 내지 1235에 해당하며, 본 발명에서는 "H119"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP11 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 232 bp cDNA 단편, 즉, H119 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR) 시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1j에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1j에서 알 수 있는 바와 같이, 232 bp cDNA 단편인 H119는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-11;
TRG
14
실시예 2에서 수득한 H201 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H201 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 41의 뉴클레오티드 번호 902 내지 1096에 해당하며, 본 발명에서는 "H201"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP20 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 195 bp cDNA 단편, 즉, H201 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1k에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1k에서 알 수 있는 바와 같이, 195 bp cDNA 단편인 H201은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-12;
TRG
15
실시예 2에서 수득한 H151 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H151 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 45의 뉴클레오티드 번호 848 내지 1099에 해당하며, 본 발명에서는 "H151"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP15 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 252 bp cDNA 단편, 즉, H151 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1(l)에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1(l)에서 알 수 있는 바와 같이, 252 bp cDNA 단편인 H151은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-13;
TRG
16
실시예 2에서 수득한 H132 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H132 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination) 에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 49의 뉴클레오티드 번호 813 내지 1039에 해당하며, 본 발명에서는 "H132"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP13 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 227 bp cDNA 단편, 즉, H132 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1m에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1m에서 알 수 있는 바와 같이, 227 bp cDNA 단편인 H132는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-14;
TRG
17
실시예 2에서 수득한 H141 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H141 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 53의 뉴클레오티드 번호 235 내지 419에 해당하며, 본 발명에서는 "H141"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP14 및 3' H-T11G 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 185 bp cDNA 단편, 즉, H141 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR) 시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1n에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1n에서 알 수 있는 바와 같이, 185 bp cDNA 단편인 H141은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-15;
TRG
18
실시예 2에서 수득한 H181 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H181 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 57의 뉴클레오티드 번호 902 내지 1128에 해당하며, 본 발명에서는 "H181"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP18 및 3' H-T11C 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 227 bp cDNA 단편, 즉, H181 을 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1(o)에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1(o)에서 알 수 있는 바와 같이, 227 bp cDNA 단편인 H181은 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
5-16;
TRG
20
실시예 2에서 수득한 H134 PCR 산물을 통상적인 방법에 따라 증폭시킨 후, 클로닝하고 재증폭시킨 H134 PCR 단편을 시쿼나제 버전 2.0 DNA 서열분석 키트 (Sequenase version 2.0 DNA Sequencing kit; United States Biochemical, Cleveland, OH, USA)를 이용하여 디데옥시 쇄 종결법 (dideoxy chain termination)에 따라 서열 분석을 실시하였다.
상기 DNA의 염기 서열은 서열번호: 61의 뉴클레오티드 번호 232 내지 417에 해당하며, 본 발명에서는 "H134"로 지칭하였다.
5' 무작위 프라이머 H-AP13 및 3' H-T11A 고정 프라이머를 사용하여 상기에서 수득한 186 bp cDNA 단편, 즉, H134 를 감별전개 역전사 중합효소 연쇄반응 (DDRT-PCR)시키고, 전기 영동으로 확인하였다.
도 1p에 나타낸 바와 같이, 정상 자궁경부 조직, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 세포에서 DD에 의한 유전자 발현이 상이한 것으로 확인되었다. 도 1p에서 알 수 있는 바와 같이, 186 bp cDNA 단편인 H134는 자궁경부암, 전이 임파절 조직 및 CUMC-6 암세포에서는 발현되었으나, 정상 조직에서는 발현이 매우 약하였다.
<실시예 6> TRG 원암유전자의 전체 cDNA 서열 분석
6-1;
TRG
3
32P-표지된 H20-121을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하 였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1703 bp가 삽입된 전체 TRG3 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 12월 2일자로 등재번호 제AY189688호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 4월 8일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG3 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989). 상기 TRG3 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG3 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1703 bp로 이루어진 TRG3의 전체 염기서열은 서열번호: 1에 나타내었다.
서열번호: 1의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 113 내지 1522에 해당하며, 서열번호: 2의 469개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-2;
TRG
4
32P-표지된 H93-811을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 2576 bp가 삽입된 전체 TRG4 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 12월 2일자로 등재번호 제AY189690호로 미국 진뱅크 (GeneBank) 에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 4월 8일). 파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG4 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989). 상기 TRG4 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG4 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 2576 bp로 이루어진 TRG4의 전체 염기서열은 서열번호: 5에 나타내었다. 서열번호: 5의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 87 내지 482에 해당하며, 서열번호: 6의 131개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-3;
TRG
5
32P-표지된 H117-321을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1334 bp가 삽입된 전체 TRG5 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 12월 2일자로 등재번호 제AY189689호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 4월 8일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG5 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989). 상기 TRG5 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이 즈로 연결시켜 TRG5 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 1336 bp로 이루어진 TRG5의 전체 염기서열은 서열번호: 9에 나타내었다.
서열번호: 9의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 88 내지 1092에 해당하며, 서열번호: 10의 334개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-4;
TRG
6
32P-표지된 H38-211을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 3309 bp가 삽입된 전체 TRG6 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 12월 5일자로 등재번호 제AY191222호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 4월 8일).파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG6 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG6 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG6 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
3309 bp로 이루어진 TRG6의 전체 염기서열은 서열번호: 13에 나타내었다.
서열번호: 13의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 233 내지 481에 해당하며, 서열번호: 14의 82개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-5;
TRG
7
32P-표지된 H38-621을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1778 bp가 삽입된 전체 TRG7 cDNA 클론을 얻고, 이를 2002년 12월 5일자로 등재번호 제AY191223호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 4월 8일).파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG7 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG7 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG7 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다. 1778 bp로 이루어진 TRG7의 전체 염기서열은 서열번호: 17에 나타내었다.
서열번호: 17의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 42 내지 1422에 해당하며, 서열번호: 18의 175개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-6;
TRG
9
32P-표지된 H96을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1582 bp가 삽입된 전체 TRG9 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 9일자로 등재번호 제AY272044호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG9 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989). 상기 TRG9 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG9 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1582 bp로 이루어진 TRG9의 전체 염기서열은 서열번호: 21에 나타내었다.
서열번호: 21의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 17 내지 1576에 해당하며, 서열번호: 22의 519개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-7;
TRG10
32P-표지된 H94를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 3979 bp가 삽입된 전체 TRG10 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 12일자로 등재번호 제AY277593호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG10 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG10 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG10 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
3979 bp로 이루어진 TRG10의 전체 염기서열은 서열번호: 25에 나타내었다.
서열번호: 25의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1100 내지 1270에 해당하며, 서열번호: 26의 56개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-8;
TRG11
32P-표지된 H42를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 235 bp가 삽입된 전체 TRG11 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277594호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG11 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG11 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG11 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
235 bp로 이루어진 TRG11의 전체 염기서열은 서열번호: 29에 나타내었다.
서열번호: 29의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 26 내지 214에 해당하며, 서열번호: 30의 62개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-9;
TRG
12
32P-표지된 H109을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 510 bp가 삽입된 전체 TRG12 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277595호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG12 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG12 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG12 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
510 bp로 이루어진 TRG12의 전체 염기서열은 서열번호: 33에 나타내었다.
서열번호: 33의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 80 내지 475에 해당하며, 서열번호: 34의 131개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-10;
TRG
13
32P-표지된 H119를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1301 bp가 삽입된 전체 TRG13 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277596호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG13 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG13 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG13 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1301 bp로 이루어진 TRG13의 전체 염기서열은 서열번호: 37에 나타내었다.
서열번호: 37의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 18 내지 1193에 해당하며, 서열번호: 38의 391개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-11;
TRG
14
32P-표지된 H201을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1206 bp가 삽입된 전체 TRG14 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277597호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG14 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG14 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG14 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1206 bp로 이루어진 TRG14의 전체 염기서열은 서열번호: 41에 나타내었다.
서열번호: 41의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 18 내지 1202에 해당하며, 서열번호: 42의 394개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-12;
TRG
15
32P-표지된 H151을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1104 bp가 삽입된 전체 TRG15 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277598호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG15 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG15 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG15 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1104 bp로 이루어진 TRG15의 전체 염기서열은 서열번호: 45에 나타내었다.
서열번호: 45의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1 내지 1104에 해당하며, 서열번호: 46의 367개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-13;
TRG
16
32P-표지된 H132를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1064 bp가 삽입된 전체 TRG16 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 14일자로 등재번호 제AY277601호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG16 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG16 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG16 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1064 bp로 이루어진 TRG16의 전체 염기서열은 서열번호: 49에 나타내었다.
서열번호: 49의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 92 내지 1064에 해당하며, 서열번호: 50의 324개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-14;
TRG
17
32P-표지된 H141을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 432 bp가 삽입된 전체 TRG17 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277599호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일). 파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG17 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG17 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG17 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
432 bp로 이루어진 TRG17의 전체 염기서열은 서열번호: 53에 나타내었다.
서열번호: 53의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 1 내지 408에 해당하며, 서열번호: 54의 135개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-15;
TRG
18
32P-표지된 H181을 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 1141 bp가 삽입된 전체 TRG18 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 4월 13일자로 등재번호 제AY277600호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG18 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG18 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG18 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
1141 bp로 이루어진 TRG18의 전체 염기서열은 서열번호: 57에 나타내었다.
서열번호: 57의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 20 내지 1141에 해당하며, 서열번호: 58의 373개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
6-16;
TRG
20
32P-표지된 H134를 프로브로 사용하여 박테리오파지 λgt11 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989)를 스크리닝하였다. 상기 인간 폐 태아 섬유모세포 cDNA 라이브러리로부터 pCEV-LAC 벡터 중에 449 bp가 삽입된 전체 TRG20 cDNA 클론을 얻고, 이를 2003년 10월 29일자로 등재번 호 제AY453397호로 미국 진뱅크 (GeneBank)에 등록하였다 (공개예정일: 2005년 3월 31일).
파지로부터 λpCEV 벡터에 삽입된 TRG20 클론을 NotI 절단에 의해 앰피실린 내성 pCEV-LAC 파지미드 (phagemid) 벡터 형태로 분리하였다 (Miki, T. et al ., Gene 83: 137-146, 1989).
상기 TRG20 유전자를 함유하는 pCEV-LAC 벡터를 T4 DNA 리게이즈로 연결시켜 TRG20 플라스미드 DNA를 제조하고, 연결된 클론으로 대장균 DH5α를 형질전환시켰다.
449 bp로 이루어진 TRG20의 전체 염기서열은 서열번호: 61에 나타내었다.
서열번호: 61의 염기서열에서, 본 발명의 원암유전자의 전체 오픈 리딩 프레임 (open reading frame)은 뉴클레오티드 번호 42 내지 449에 해당하며, 서열번호: 62의 135개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 코드하는 것으로 예측된다.
<실시예 7> 다양한 세포에서의 TRG 유전자의 노던 블롯 분석
실시예 1에서와 같이, 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁암 전이 임파절조직 및 자궁경부암 세포주 CaSki (ATCC CRL 1550), CUMC-6으로부터 총 RNA를 추출하였다.
TRG 유전자들의 발현 정도를 결정하기 위하여, 각각의 조직 및 세포주로부터 추출한 변성된 총 RNA 20 ㎍씩을 1% 포름알데히드 아가로즈 겔에서 전기영동한 후 나일론 막 (Boehringer-Mannheim, 독일)으로 옮겼다. 레디프라임 Ⅱ (Rediprime Ⅱ) 무작위 프라임 표지 시스템 (Amersham, 영국)을 사용하여 제조한 32P-표지된 무작위 프라임된 TRG 전체 cDNA 프로브로 블롯을 혼성화시켰다. 노던 블롯 분석을 2회 반복 실시하였으며, 그 결과는 농도계 (densitometry)를 사용하여 정량화하였고, β-액틴 (actin)으로 표준화시켰다.
도 2a 상단은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.7 kb의 우점(dominant) TRG3 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2a에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2a 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 3a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 3b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 3a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 mRNA (약 1.7 kb의 우점(dominant) TRG3 mRNA 전사물)는 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다.
도 19a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG3 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 19b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 19a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 mRNA (약 1.7 kb의 우점(dominant) TRG3 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2b 상단은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2b에서 알 수 있는 바와 같이, TRG4 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 별현이 증가되었으며 즉 약 3.0 kb의 우점(dominant) TRG4 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2b에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2b 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 4a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대 장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 4a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG4 mRNA (약3.0 kb의 우점(dominant) TRG4 mRNA 전사물)는 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 심장, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현되고 있다.
도 20a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG4 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 20b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 20a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG4 mRNA (약 3.0 kb의 우점(dominant) TRG4 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 및 대장암 세포주 SW480 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2c는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2c에서 알 수 있는 바와 같이, TRG5 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.4 kb의 우점(dominant) TRG5 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2c에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2c 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 5a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 5a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG5 mRNA (약 1.4 kb의 우점(dominant) TRG5 mRNA 전사물)는 뇌, 심장, 정상근육 및 신장조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 대장, 흉선, 비장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다.
도 21a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG5 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 21b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 21a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG5 mRNA (약 1.4 kb의 우점(dominant) TRG5 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2d 상단은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확 인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2d에서 알 수 있는 바와 같이, TRG6 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 7.0 kb의 우점(dominant) TRG6 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2d에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2d 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 6a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 6a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG6 mRNA (약 7.0 kb의 우점(dominant) TRG6 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장, 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 되지 않고 있다.
도 22a는 인간 암 세포주, HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 (Clontech)에서 TRG6 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 22b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 22a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG6 mRNA (약 7.0 kb의 우점(dominant) TRG6 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2e 상단은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2e에서 알 수 있는 바와 같이, TRG7 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 2.0 kb의 우점(dominant) TRG7 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2e에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2e 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 7a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 7b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 7a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG7 mRNA (약 2.0 kb의 우점(dominant) TRG7 mRNA 전사물)는 심장, 정상근육, 신장 및 태반조직에서는 발현이 되고 있으며 동시에 약 2.4 kb의 TRG7 mRNA 전사물도 약하게 발현되고 있다, 그러나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 간, 소장, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 되지 않고 있다.
도 23a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG7 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 23b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 23a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG7 mRNA (약 2.0 kb의 우점(dominant) TRG7 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 동시에 약 2.4 kb의 TRG7 mRNA 전사물도 인간 암세포주들에서 과발현되었다.
도 2f 상단은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2f에서 알 수 있는 바와 같이, TRG9 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG9 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2f에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2 f 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 8a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 8a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG9 mRNA (약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG3 mRNA 전사물)는 심장, 정상근육, 신장 및 태반 조직에서는 약하게 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 간, 소장, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현이 거의 되지 않고 있다.
도 24a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG9 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 24b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 24a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 mRNA (약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG9 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 동시에 약 2.0 kb의 TRG9 mRNA 전사물도 발현이 확인되었다.
도 2g는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2g에서 알 수 있는 바와 같이, TRG3 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 6.0 kb의 우점(dominant) TRG10 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2g에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2g 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 9a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 9a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG10 mRNA (약 6.0 kb의 우점(dominant) TRG10 mRNA 전사물)는 심장, 간, 말초백혈구, 및 정상비장 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 근육, 대장, 흉선, 신장, 소장, 태반, 및 폐 조직들에서는 발현이 확인되지 않고 있다.
도 25a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG10 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 25b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 25a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG10 mRNA (약 6.0 kb의 우점(dominant) TRG10 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었으며 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서도 증가된 수준으로 발현되었다. 동시에 약 3.0 kb의 TRG10 mRNA 전사물도 암세포주들에서 획인되 었다.
도 2h는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2h에서 알 수 있는 바와 같이, TRG11 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 전이조직, 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.5 kb의 우점(dominant) TRG11 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2h에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2h 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 10a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 10b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 10a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG11 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) TRG11 mRNA 전사물)는 심장과 정상 간 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 근육, 대장, 흉선, 비장, 신장, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 거의 발현되지 않고 있다.
도 26a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG11 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 26b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 26a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG11 mRNA (약 1.5 kb의 우점(dominant) TRG11 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 암세포주들에서는 약 1.3 kb의 TRG11 mRNA 전사물도 약하게 발현되고 있다.
도 2i는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2i에서 알 수 있는 바와 같이, TRG12 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 5.0 kb의 우점(dominant) TRG12 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2i에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2i 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 11a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 11b는 동일한 시 료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 11a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG12 mRNA (약 5.0 kb의 우점(dominant) TRG12 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장, 정상근육, 콩팥, 간, 태반 및 말초혈액 백혈구 조직에서는 약하게 발현이 되고 있으나 정상 대장, 흉선, 비장, 소장, 및, 폐 조직들에서는 발현이 거의 없었다.
도 27a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG12 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 27b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 27a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG12 mRNA (약 5.0 kb의 우점(dominant) TRG12 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2j는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2j에서 알 수 있는 바와 같이, TRG13 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 4.0 kb의 우점(dominant) TRG13 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2j에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2j 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 12a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 12b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 12a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG13 mRNA (약 4.0 kb의 우점(dominant) TRG13 mRNA 전사물)는 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다. 동시에 약 5.0 kb의 TRG13 mRNA 전사물도 동시에 약하게 발현되었다.
도 28a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG13 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 28b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 28a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG13 mRNA (약 4.0 kb의 우점(dominant) TRG13 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 동시에 약 5.0 kb의 TRG13 mRNA 전사물도 동시에 강하게 발현되었다.
도 2k는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2k에서 알 수 있는 바와 같이, TRG14 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG14 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2k에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2k 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 13a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 13b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 13a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG14 mRNA (약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG14 mRNA 전사물)는 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 약하게 발현되고 있다.
도 29a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG14 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 29b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 29a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG14 mRNA (약 3.5 kb 의 우점(dominant) TRG14 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2(l)은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2(l)에서 알 수 있는 바와 같이, TRG15 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG15 mRNA 전사물이 과발현되었다, 도 2(l)에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2(l) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 14a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 14b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 14a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG15 mRNA (약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG15 mRNA 전사물)는 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 뇌, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현되고 있다. 또한 동시에 약 3.0 kb 와 4.0 kb의 TRG15 mRNA 전사물들도 아주 약하게 발현되고 있다.
도 30a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG15 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 30b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 30a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG15 mRNA (약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG15 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 3.0 kb 와 4.0 kb의 TRG15 mRNA 전사물들도 강하게 발현되고 있다.
도 2m은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2m에서 알 수 있는 바와 같이, TRG16 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 4.5 kb의 우점(dominant) TRG16 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2m에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2m 하 단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 15a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 15b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 15a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG16 mRNA (약 3.5 kb의 우점(dominant) TRG15 mRNA 전사물)는 정상 뇌와 심장 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 근육, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현되고 있다. 또한 동시에 약 5.0 kb의 TRG16 mRNA 전사물들도 아주 약하게 발현되고 있다.
도 31a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG16 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 31b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 31a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG16 mRNA (약 4.5 kb의 우점(dominant) TRG16 mRNA 전사물)는 HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 5.0 kb의 TRG16 mRNA 전사물들도 강하게 발현되고 있다.
도 2n은 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인 한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2n에서 알 수 있는 바와 같이, TRG17 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG17 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2n에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2n 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 16a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 16b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 16a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG17 mRNA (약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG17 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육 조직에서는 발현이 되고 있으나 정상 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현되고 있다.
도 32a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG17 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 32b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 32a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG17 mRNA (약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG17 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
도 2(o)는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2(o)에서 알 수 있는 바와 같이, TRG18 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG18 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2(o)에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2(o) 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 17a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 17b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 17a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG18 mRNA (약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG18 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 콩팥, 간 및 태반 조직에서는 약하게 발현이 되고 있으나 정상 대장, 흉선, 비장, 소장, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 발현 이 되지 않고 있다. 또한 동시에 약 1.5 kb의 TRG18 mRNA 전사물들도 아주 약하게 발현되고 있다.
도 33a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG18 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 33b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 33a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG18 mRNA (약 2.4 kb의 우점(dominant) TRG18 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다. 또한 동시에 약 1.5 kb의 TRG18 mRNA 전사물들도 강하게 발현되고 있다.
도 2p는 정상 자궁경부 조직, 자궁경부암 조직, 자궁경부암 전이 임파절 조직 및 자궁경부암 세포주 (CaSki 및 CUMC-6)들에서 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2p에서 알 수 있는 바와 같이, TRG20 원암유전자는 자궁경부암 조직과 자궁경부암 세포주인 CaSki와 CUMC-6 세포주들에서는 유전자 발현이 증가되었으며 즉 약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG20 mRNA 전사물이 과발현되었다. 도 2p에서, 정상 (Normal)열은 정상 자궁 경부 조직을, 암 (Cancer)열은 자궁경부암 조직을, 전이 (metastasis)열은 자궁경부암 전이 임파절 조직을, 그리고 CaSki열 및 CUMC-6열은 각각 자궁암 세포주를 나타낸다. 도 2p 하단은 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다.
도 18a는 정상 인간 12-열 다중 조직 (Clontech), 뇌, 심장, 횡문근, 대장, 흉선, 비장, 신장, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직에서 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 18b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 18a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG20 mRNA (약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG20 mRNA 전사물)는 정상 뇌, 심장과 정상근육, 대장, 흉선, 비장, 콩팥, 간, 소장, 태반, 폐 및 말초 혈액 백혈구 조직들에서는 아주 약하게 발현이 되고 있으나 발현이 되지 않고 있다.
도 34a는 인간 암 세포주, HL-60, HeLa, K-562, MOLT-4, Raji, SW480, A549 및 G361 (Clontech)에서 TRG20 원암유전자의 발현여부를 확인한 노던 블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 34b는 동일한 시료를 β-액틴 프로브로 혼성화시켜 mRNA의 존재를 확인한 것이다. 도 34a에서 알 수 있는 바와 같이, TRG20 mRNA (약 1.3 kb의 우점(dominant) TRG20 mRNA 전사물)는 HL-60 전골수세포 백혈병 세포주, HeLa 자궁암 세포주, 만성 골수 백혈병 세포주 K-562, 임파구 백혈병 세포주 MOLT-4, 버키트 (Burkitt) 림프종 세포주 Raji, 대장암 세포주 SW480, 폐암세포주 A549 및 피부암세포주 G361 들에서 매우 증가된 수준으로 발현되었다.
<실시예 8> TRG 원암유전자를 대장균에 형질감염시킨 후 발현되는 단백질의 크기 결정
서열번호: 1; 서열번호: 5; 서열번호: 9; 서열번호: 13; 서열번호: 17; 서열번호: 21; 서열번호: 25; 서열번호: 29; 서열번호: 33; 서열번호: 37; 서열번호: 41; 서열번호: 45; 서열번호: 49; 서열번호: 53; 서열번호: 57; 또는 서열번호: 61;의 TRG 원암유전자 전체를 pBAD/thio-Topo 벡터 (Invitrogen, USA)의 다중-클로닝 부위 내에 삽입한 후, 생성된 pBAD/thio-Topo/TRG 벡터를 대장균 Top10 (Invitrogen, USA)에 형질감염시켰다. pBAD/thio-Topo 벡터의 다중-클로닝 부위의 앞부위에는 발현 단백질들인 HT-Thioredoxin이 삽입되어 있다. 형질감염된 대장균을 LB 브로쓰에서 진탕 배양한 후, 이를 1/100로 희석시켜 다시 3시간 동안 배양하였다. 여기에 0.5 mM의 엘 아라비노즈 (L-Arabinose, Sigma)를 첨가하여 단백질 생산을 유도하였다.
엘 아라비노즈 유도 전후의 배양액 중의 대장균 세포를 초음파 분쇄한 후, 12% 나트륨 도데실설페이트-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하였다 (SDS-PAGE).
도 5a는 pBAD/thio-Topo/TRG3 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 67 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 67 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG3 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 52 kDa의 TRG3 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5b는 pBAD/thio-Topo/TRG4 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 29 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 29 kDa 융합단백 질은 pBAD/thio-Topo/TRG4 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 14 kDa의 TRG4 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5c는 pBAD/thio-Topo/TRG5 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 52 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 52 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG5 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 37 kDa의 TRG5 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5d는 pBAD/thio-Topo/TRG6 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 24 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 24 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG6 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 9 kDa의 TRG6 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5e는 pBAD/thio-Topo/TRG7 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 35 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 35 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG7 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 20 kDa의 TRG7 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5f는 pBAD/thio-Topo/TRG9 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 73 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 73 kDa 융합단백질은 pBAD/thio- Topo/TRG9 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 58 kDa의 TRG9 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5g는 pBAD/thio-Topo/TRG10 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 21 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 21 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG10 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 6 kDa의 TRG10 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5h는 pBAD/thio-Topo/TRG11 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 22 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 22 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG11 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 7 kDa의 TRG11 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5i는 pBAD/thio-Topo/TRG12 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 29 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 29 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG12 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 14 kDa의 TRG12 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5j는 pBAD/thio-Topo/TRG13 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 55 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 55 kDa 융합단백질은 pBAD/thio- Topo/TRG13 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 40 kDa의 TRG13 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5k는 pBAD/thio-Topo/TRG14 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 58 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 58 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG14 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 43 kDa의 TRG14 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5(l)은 pBAD/thio-Topo/TRG15 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 57 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 57 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG15 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 42 kDa의 TRG15 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5m은 pBAD/thio-Topo/TRG16 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 51 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 51 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG16 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 36 kDa의 TRG16 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5n은 pBAD/thio-Topo/TRG17 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 31 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 31 kDa 융합단백질은 pBAD/thio- Topo/TRG17 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 16 kDa의 TRG17 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5(o)는 pBAD/thio-Topo/TRG18 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 57 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 57 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG18 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 42 kDa의 TRG18 단백질을 함유하고 있는 것이다.
도 5p는 pBAD/thio-Topo/TRG20 벡터로 형질감염된 대장균 Top10 균주의 단백질의 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과로서, 엘 아라비노즈 유도 후에 약 31 kDa의 융합 단백질 밴드가 뚜렷하게 관찰되었다. 이 31 kDa 융합단백질은 pBAD/thio-Topo/TRG20 벡터에 삽입되어 있는 약 15 kDa 크기의 HT-thioredoxin 단백질과 약 16 kDa의 TRG20 단백질을 함유하고 있는 것이다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 원암유전자는 인간 암발생에 관여하며 동시에 암전이 (metastasis) 유발능을 나타내는 유전자로서 자궁암, 백혈병, 림프종, 대장암, 폐암 및 피부암 등을 비롯한 암의 진단 등에 효과적으로 이용될 수 있다.
<110> KIM, HYUN-KEE
<120> HUMAN PROTOONCOGENE TRG AND PROTEIN ENCODED THEREIN
<160> 64
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1703
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
gggagttgcc ttgacctgca gctccgccac cgcggacccg ccttctgccc tcagcagcag 60
acgctctgtc ccgcccgggc agctctgcga ggcagcggct ggagagggaa ccatggggac 120
tgtgcacgcc cggagtttgg agcctcttcc atcaagtgga cctgattttg gaggattagg 180
agaagaagct gaatttgttg aagttgagcc tgaagctaaa caggaaattc ttgaaaacaa 240
agatgtggtt gttcaacatg ttcattttga tggacttgga aggactaaag atgatatcat 300
catttgtgaa attggagatg ttttcaaggc caaaaaccta attgaggtaa tgcggaaatc 360
tcatgaagcc cgtgaaaaat tgctccgtct tggaattttt agacaagtgg atgttttgat 420
tgacacatgt caaggtgatg acgcacttcc aaatgggtta gacgttacct ttgaagtaac 480
tgaattgagg agattaacgg gcagttataa caccatggtt ggaaacaatg aaggcagtat 540
ggtacttggc ctcaagcttc ctaatcttct tggtcgtgca gaaaaggtga cctttcagtt 600
ttcctatgga acaaaagaaa cttcgtatgg cctgtccttc ttcaaaccac ggcccggaaa 660
cttcgaaaga aatttctctg taaacttata taaagttact ggacagttcc cttggagctc 720
actgcgggag acggacagag gaatgtcagc tgagtacagt tttcccatat ggaagaccag 780
ccacactgtc aagtgggaag gcgtatggcg agaactgggc tgcctctcaa ggacggcgtc 840
atttgctgtt cgaaaagaaa gcggacattc actgaaatca tctctttcgc acgccatggt 900
catcgattct cggaattctt ccatcttacc aaggagaggt gctttgctga aagttaacca 960
ggaactggca ggctacactg gcggggatgt gagcttcatc aaagaagatt ttgaacttca 1020
gttgaacaag caactcatat ttgattcagt tttttcagcg tctttctggg gcggaatgtt 1080
ggtacccatt ggtgataagc cgtcaagcat tgctgatagg ttttaccttg ggggacccac 1140
aagcatccgc ggattcagca tgcacagcat cgggccacag agcgaaggag actacctagg 1200
tggagaagcg tactgggccg gcggcctgca cctctacacc ccattacctt tccggccagg 1260
ccagggtggc tttggagaac ttttccgaac acacttcttt ctcaacgcag gaaacctctg 1320
caacctcaac tatggggagg gccccaaagc tcatattcgt aagctggctg agtgcatccg 1380
ctggtcgtac ggggccggga ttgtcctcag gcttggcaac atcgctcggt tggaacttaa 1440
ttactgcgtc cccatgggag tacagacagg cgacaggata tgtgatggcg tccagtttgg 1500
agctgggata aggttcctgt agccgacacc cctacaggag aagctctggg actggggcag 1560
cagcaaggcg cccatgccac acaccgtctc tcgaggaaac gcggttcagc gattctttga 1620
ctgcggaccc tgtgggaaac cccgtcaata aatgttaaag acacaaaaaa aaaaaaaaaa 1680
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1703
<210> 2
<211> 469
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Gly Thr Val His Ala Arg Ser Leu Glu Pro Leu Pro Ser Ser Gly
1 5 10 15
Pro Asp Phe Gly Gly Leu Gly Glu Glu Ala Glu Phe Val Glu Val Glu
20 25 30
Pro Glu Ala Lys Gln Glu Ile Leu Glu Asn Lys Asp Val Val Val Gln
35 40 45
His Val His Phe Asp Gly Leu Gly Arg Thr Lys Asp Asp Ile Ile Ile
50 55 60
Cys Glu Ile Gly Asp Val Phe Lys Ala Lys Asn Leu Ile Glu Val Met
65 70 75 80
Arg Lys Ser His Glu Ala Arg Glu Lys Leu Leu Arg Leu Gly Ile Phe
85 90 95
Arg Gln Val Asp Val Leu Ile Asp Thr Cys Gln Gly Asp Asp Ala Leu
100 105 110
Pro Asn Gly Leu Asp Val Thr Phe Glu Val Thr Glu Leu Arg Arg Leu
115 120 125
Thr Gly Ser Tyr Asn Thr Met Val Gly Asn Asn Glu Gly Ser Met Val
130 135 140
Leu Gly Leu Lys Leu Pro Asn Leu Leu Gly Arg Ala Glu Lys Val Thr
145 150 155 160
Phe Gln Phe Ser Tyr Gly Thr Lys Glu Thr Ser Tyr Gly Leu Ser Phe
165 170 175
Phe Lys Pro Arg Pro Gly Asn Phe Glu Arg Asn Phe Ser Val Asn Leu
180 185 190
Tyr Lys Val Thr Gly Gln Phe Pro Trp Ser Ser Leu Arg Glu Thr Asp
195 200 205
Arg Gly Met Ser Ala Glu Tyr Ser Phe Pro Ile Trp Lys Thr Ser His
210 215 220
Thr Val Lys Trp Glu Gly Val Trp Arg Glu Leu Gly Cys Leu Ser Arg
225 230 235 240
Thr Ala Ser Phe Ala Val Arg Lys Glu Ser Gly His Ser Leu Lys Ser
245 250 255
Ser Leu Ser His Ala Met Val Ile Asp Ser Arg Asn Ser Ser Ile Leu
260 265 270
Pro Arg Arg Gly Ala Leu Leu Lys Val Asn Gln Glu Leu Ala Gly Tyr
275 280 285
Thr Gly Gly Asp Val Ser Phe Ile Lys Glu Asp Phe Glu Leu Gln Leu
290 295 300
Asn Lys Gln Leu Ile Phe Asp Ser Val Phe Ser Ala Ser Phe Trp Gly
305 310 315 320
Gly Met Leu Val Pro Ile Gly Asp Lys Pro Ser Ser Ile Ala Asp Arg
325 330 335
Phe Tyr Leu Gly Gly Pro Thr Ser Ile Arg Gly Phe Ser Met His Ser
340 345 350
Ile Gly Pro Gln Ser Glu Gly Asp Tyr Leu Gly Gly Glu Ala Tyr Trp
355 360 365
Ala Gly Gly Leu His Leu Tyr Thr Pro Leu Pro Phe Arg Pro Gly Gln
370 375 380
Gly Gly Phe Gly Glu Leu Phe Arg Thr His Phe Phe Leu Asn Ala Gly
385 390 395 400
Asn Leu Cys Asn Leu Asn Tyr Gly Glu Gly Pro Lys Ala His Ile Arg
405 410 415
Lys Leu Ala Glu Cys Ile Arg Trp Ser Tyr Gly Ala Gly Ile Val Leu
420 425 430
Arg Leu Gly Asn Ile Ala Arg Leu Glu Leu Asn Tyr Cys Val Pro Met
435 440 445
Gly Val Gln Thr Gly Asp Arg Ile Cys Asp Gly Val Gln Phe Gly Ala
450 455 460
Gly Ile Arg Phe Leu
465
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11A Anchor primer for TRG3
<400> 3
aagctttttt ttttta 16
<210> 4
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP20 Primer for TRG3
<400> 4
aagcttgttg tgc 13
<210> 5
<211> 2576
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ccgaatttcc aacattccat cactaatatt cctcgacgcc accactggga aggttgtgtg 60
caggaacggg ctgctggtga tccgagatga cccagaaggt ctggagttcc cctggggacc 120
gaaacccttc agggaagtca ttgcagggcc cttgcttaga aacaatgggc agtctctgga 180
gagcagcagc ctggaggggt ctcacgtggg cgtctatttc tccgcacatt ggtgtccgcc 240
ctgccgaagc ctcacccggg tcctggtgga atcctaccgg aagatcaagg aggcaggcca 300
gaacttcgag atcatcttcg ttagtgcaga caggtcggag gagtccttca aacagtactt 360
cagtgagatg ccctggctcg ccgtccccta cacggatgag gcccggcggt cgcgcctcaa 420
ccggctgtac ggaatccaag gcatccccac gctcatcatg ctggacccgc agggcgaggt 480
gatcacgcgg caggggcggg tggaggtgct gaacgacgag gactgccggg agttcccctg 540
gcaccccaag cccgtgctgg agctctccga ctccaacgcc gcgcagctta acgagggccc 600
ctgcctcgtc ctttttgtag attctgagga tgacggagag tccgaggcgg ccaagcagct 660
gattcagccg atagctgaga aaatcattgc caagtacaaa gccaaagagg aggaggcacc 720
ccttctgttc ttcgtagccg gggaggatga catgactgac tccctgcgag attacaccaa 780
cctgcctgag gctgcccctt tgctcaccat cctggacatg tcagcccggg ccaagtacgt 840
gatggacgtg gaggagatca cccccgccat cgtggaggcc tttgtgaatg acttcctagc 900
agagaagctc aaaccggagc ccatctagcg tggctccggc ctcctgagac gttatttaaa 960
actcagcctt ctcctcctcc ccctccttcc ttccgccctt ggacttaccc agcgtgcccc 1020
gaatcccacc acccaagtgt ccagcctctc tgtggtgcct tgtttctgca gtaaactcct 1080
cagccagcac cctggggtgt ggaatcagca gcggcagagt ccaccgtgtt tggagactct 1140
gtttgggagc acgggatggc cgggggcccg gccagagcgg ggctgcatgg ctttcgcaaa 1200
gtcactagct tttggtgaag gatctgccag ggtgtcctgg gcagagtgag cgtggagggc 1260
cggtgggtcc cgctcgggct ctgactctga cgtcggcaca cacggccccg gacggccaga 1320
ggggaaccgc cgggtgacac ctgcgtggag gctgagctga gaaagggcct ccgcttagag 1380
ctgcgggtga ggacgtcctt ttctaagcaa cacagtcttc ctcggtctga gagaaaagca 1440
gcccactctt gtgttctcag gcaggggatc tccaaatgca aaaggaagct tgtagaggtt 1500
ttttgggtga gaagaaaaat gtagctaagg taatggttca tatcatacaa acagctccca 1560
cgatcctgaa attctgttaa cgaatccttc tctttggaca tcttcccaag aaacttagcc 1620
ctgagtccta ggaggagcac ctctgcacca gcacggacct ctcgctccac ccagctctgt 1680
gcccaaggcc cctgatctct gctgaggtgc ccacacccac gttcgatcac ccctgccatt 1740
cccttttatt ttcttttttt tgagatggag tcttgctctg tcgcccaggc tggagtgcag 1800
tggcaccatc ttggctcact tcaacctccg cccccaaggt tcaagtgatt ctcctgcctc 1860
agcctcccga gtagctggga ttacaggcac ccgccaccgt acctggctaa tttttgtatt 1920
tttagtagag atggggtttc accatgttgg ctaggctggt ctcgaactcc tgacctcagg 1980
tgatccaccc gcctcggcct cccaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc cccgtgcccg 2040
gccccctttt cttttcaaag cagaactaca aagatgagaa attaccagaa gcctcgcctt 2100
ttcctaagca ccagcggaag gagctgtgcc ccgggatgga gtgagggtgg agggcgcgtc 2160
agccacgggt gggccttgtg tcgccttgta tcggcccagg taggttgttg gcctcttact 2220
tgggctgacc tgacccccga aagagaaaca gacaactctg ttctcaggat tggggatgga 2280
cggcttcggc caagcgtttt agcctcattc actcaggccc cactcagcac tctgccagcc 2340
aagaccattg atttggaaaa tccggtcccc acccgctaat gagctgttga cactgttgtt 2400
ccttgctgaa ttggattgtt gacttgtagt tcagaggcgt acaactagtt ggcgattaga 2460
cttgttatgt gatgttacca gcctgaaatg cgatcacccc gtaggaaata aagcaggcat 2520
ctctggacct caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaacaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 2576
<210> 6
<211> 131
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Met Thr Gln Lys Val Trp Ser Ser Pro Gly Asp Arg Asn Pro Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ser Leu Gln Gly Pro Cys Leu Glu Thr Met Gly Ser Leu Trp Arg
20 25 30
Ala Ala Ala Trp Arg Gly Leu Thr Trp Ala Ser Ile Ser Pro His Ile
35 40 45
Gly Val Arg Pro Ala Glu Ala Ser Pro Gly Ser Trp Trp Asn Pro Thr
50 55 60
Gly Arg Ser Arg Arg Gln Ala Arg Thr Ser Arg Ser Ser Ser Leu Val
65 70 75 80
Gln Thr Gly Arg Arg Ser Pro Ser Asn Ser Thr Ser Val Arg Cys Pro
85 90 95
Gly Ser Pro Ser Pro Thr Arg Met Arg Pro Gly Gly Arg Ala Ser Thr
100 105 110
Gly Cys Thr Glu Ser Lys Ala Ser Pro Arg Ser Ser Cys Trp Thr Arg
115 120 125
Arg Ala Arg
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<210> 7
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11G anchor primer for TRG4
<400> 7
aagctttttt tttttg 16
<210> 8
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP9 Primer for TRG4
<400> 8
aagcttcatt ccg 13
<210> 9
<211> 1334
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
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ggggaacatg gcgactcaag tgtggctgtg tggagtggtg tgaatgtggc aggtgtttct 720
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Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Ala
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Glu His Gly Asp Ser Ser Val Ala Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala
195 200 205
Gly Val Ser Leu Gln Glu Leu Asn Pro Glu Met Gly Thr Asp Asn Asp
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Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Asn Trp Ala Ile Gly Leu Ser
245 250 255
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Pro Val Ser Thr Met Val Lys Gly Met Tyr Gly Ile Glu Asn Glu Val
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Ile Asn Gln Lys Leu Lys Asp Asp Glu Val Ala Gln Leu Lys Lys Ser
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11C anchor primer for TRG5
<400> 11
aagctttttt tttttc 16
<210> 12
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP11 Primer for TRG5
<400> 12
aagcttcggg taa 13
<210> 13
<211> 3309
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
tgggaacggg gagggaagaa ctgagggtct gcagactgga cttttcctgg ctcgacccag 60
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cctcagaccc acacagccca gaggacgagg ccttcaagcc tgcccctctt ctgctttttt 180
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gaaaagaggc tcagaaaagt ttagagagca gctcagtgtc acactgggag ctgggcacag 300
ccgatctcct tccagaaggg ttctgtctgt atcctttatt ctccgcacat ggaggctgcc 360
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cctggccctt gctgccttca ttctgtccca atgccagctc cctggatgtc tgtatgtttg 480
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cagcctccct agtagctggg actacagcac ccaccaccac acccagctaa tttttgtatt 720
tttagtagag acaggggttt caccacgttg gccaggctgg tctcgaactc ctgaccttag 780
gtgatccgcc cgcctcagcc tcccaaagtg ttgggattac aggcatgagc cactgcgcct 840
ggccagcaaa tgctttttgt gcagaataca cttctttcag gcattgtcag gtgctgtttt 900
gtttaagctc taactcaccc ctggaataca ggggaatgat gacaaccagc ccagccaggc 960
ctgactcatc atggtcacat ccagccccca cccccggcca actaaccact gcaggctcct 1020
cttccagact caccaggggg cctcgaggcc ccggcatctc ccttggccct gggtgtgggt 1080
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ttcactaggc ctcttctgtt ttcataccct tgtaagtggg ttatgtggtg ggtatggtca 1320
gttttttctt ttttcttttc ttttcttttt tttgagacag agtttcgctt ttgttgcccg 1380
ggctggaatg caatggcgcg attcagctca ctgcaatctc cgcctcccgg gttcaagtga 1440
ttctcctgcc ttagcctcct gaaaagctgg gattacaggg ccctgccacc aagcccagct 1500
aattgtattt ttagtagaga caggatttca ccatgttggc caggccagtc tcaaactcct 1560
gacctcaggt gatccacctg cctcagcctc ccagactgtt gggattacag gcatgagcca 1620
ccacgcctgg ccagtttctt cattttacat atggtcacat tggcgcctag aacagttagg 1680
tcgctcgtca cataggcagt taagtggaga accaggtttc aaaatcaggt aagaaaacca 1740
tcatcattaa ctgagcacca gctgtgctaa gcctgccacg ggcgtatcct tgcagcctca 1800
caacagtggg aggtctgtat cctgaatgtc ctcattttac agatgaggac attgaggaga 1860
agagacttac ccaggctcac acagcagctc agcctgttcc aggcgctggt cagtgcgtgt 1920
tctttgccac cagcctgtca ctccagtggc agctccagaa acggaggctg ttgcttttat 1980
ccctaaactg catccacaga gaagccccaa gaaggaggtt ggggccagct cataaaaagc 2040
ctgaatgcca agccaaggag tggatgcctc cagtcatatt tagaacaaag tcaagtataa 2100
atttacagag aaaaaattct aagacagttg gatgttgtcc tgttggtgag gaagggaaag 2160
gtttttcttg tagggaactg gaaccagccc acaactgcac acttgtgagc tgtcatggaa 2220
acctgatccc caacagcttt tgaggttgtt tgtttgtttg tttgtttacc tgtcttgggc 2280
tttgttgctt ttggcaaaag gtacttcaaa caagggaggg cctggactga gggggaccag 2340
gtcttcttgc tgacctcgtc tacaaaggca aaggaaggca aaggaagctg tctcgggtgt 2400
ttctgaacaa cgtgactcat gaggggcttt ggctacctct tgcgttcccc ctagagatgt 2460
ccaggcctta catttaatcg gctttctctg cggtggggta gagaatggag ctcccgcctt 2520
gcgggcagtg ctaaaggtgg agctggggga ttttcctggg aatgatttga gggctcttga 2580
aagcccatgt gttccaaagc gtctttaact ctgggatagc attggaagcc gctgtcatga 2640
caggacatgg cactggatgg ctggcagaga gccctggctg ggagttaggg agccctgggt 2700
tggaatccag ccccacctct tttatgccac aggtttggtc aagttctctc ccgctcaggg 2760
tagggctgtg aactccctct tacagctaag aacatgcagc ttagtgagga caagaccctt 2820
ctagagcttt acccctaatc cccccccagg agccccgagg ccggcattat tcctccccat 2880
tacaggtgat gagcctcaaa ttcagagagc ttaagcaacc tgctcagggt cacgtctcca 2940
acaggcagta gagtcaaggt ataaaccagg tctgtttttg taccagagtc ccagactaac 3000
tgttggtagg aatcttgtaa ccagtcatgt tttcttcctt gttttggccg ctgggaagct 3060
caaagtcaaa ttcgagaccc ttttttttcc aattgtgctg agtctcctac tagactcgct 3120
tcattctagc tttctgcttt tacctttacc ctaatctttt tatttttatg ctattgtact 3180
ttatttttgt aagttgctga gatatctgtt ttgcaacaag atgggctata tctaaataaa 3240
gacatgatca aaggtttgat ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaataaaaa 3300
gaaaaaaaa 3309
<210> 14
<211> 82
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Met Lys Glu Lys Arg Gly Ser Glu Lys Phe Arg Glu Gln Leu Ser Val
1 5 10 15
Thr Leu Gly Ala Gly His Ser Arg Ser Pro Ser Arg Arg Val Leu Ser
20 25 30
Val Ser Phe Ile Leu Arg Thr Trp Arg Leu Pro Tyr Leu Gly Arg His
35 40 45
Pro Ser Thr Cys Glu Gly His Leu Leu Leu Ile Leu Thr Cys Pro Leu
50 55 60
Ala Leu Ala Ala Phe Ile Leu Ser Gln Cys Gln Leu Pro Gly Cys Leu
65 70 75 80
Tyr Val
<210> 15
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11A anchor primer for TRG6
<400> 15
aagctttttt ttttta 16
<210> 16
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP38 Primer for TRG6
<400> 16
aagcttccag tgc 13
<210> 17
<211> 1778
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 17
ggccattacc aatcgcgaaa ccggctgggc ctctgcgggc gatggggcgg caggccctgc 60
tgcttctcgc gctgtgcgcc acaggcgccc aggggctcta cttccacatc ggcgagaccg 120
agaagcgctg tttcatcgag gaaatccccg acgagaccat ggtcatcggc aactatcgta 180
cccagatgtg ggataagcag aaggaggtct tcctgccctc gacccctggc ctgggcatgc 240
acgtggaagt gaaggacccc gacggcaagg tggtgctgtc ccggcagtac ggctcggagg 300
gccgcttcac gttcacctcc cacacgcccg gtgaccatca aatctgtctg cactccaatt 360
ctaccaggat ggctctcttc gctggtggca aactgcgggt gcatctcgac atccaggttg 420
gggagcatgc caacaactac cctgagattg ctgcaaaaga taagctgacg gagctacagc 480
tccgcgcccg ccagttgctt gatcaggtgg aacagattca gaaggagcag gattaccaaa 540
gggcaagtgc atatctcctt gtaatttgag agggcagttg acctttatac ccactatacc 600
tactcaagtt tctgcttggg agatcagctc tgcagagaat ggaatgagaa gtattggttt 660
agataggttg tttgtttgtt gtttttgaga cggagtttca ctcttgttgc ccatgctgga 720
gtgcaatgcc atgatcttgg ctcactgcaa cctccgcctc cccaggttca agcgattctc 780
ctgcctcagc ctcctgagta gctgggatta caggcatgcg ccaccatgcc tggctaattt 840
tgtactttta gtagagacgg gggtttctcc acgttggtca ggctggtctc gaactcccga 900
catcaagtga tccgcccgcc tcagcctccc aaagtgctgg gattacaggt gtgagctacc 960
gcgccctgcc tgttttgctt ttttatcaaa acattttatt gtggtaaaat ataacaccaa 1020
atgtgtcatt ttaactgtct atatagttca gtggtattaa gtgccttcat aatgttgtgc 1080
taccaacacc atcatccagc tccagaactt tttcatcttc tcaaactaaa aatctgtact 1140
tattttgttt tgtttttgag atggagtctc gctctgttgc ccaggctgga gcgcagtggc 1200
gccatctcgg ctcactgcac cctccgcctc ccaggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc 1260
tcccaagtag ctgggattac aggcaagtgc caccatgcgt ggctcatttt tgtgttttta 1320
gtagagactg ggtttcacca tgttggccag gctggtcttg aactcctggc ctcaggcaat 1380
ccactgccgc agcctcccaa agtgttggga ttacaggcgt gagccactgc acccagcaaa 1440
tctgtactta ttataaacaa taacttcccg tttccttttg tcctgacacc caccattcta 1500
ctttctgtct ctatgatcct gactacccta tctcatataa gtggaatcat tcagtatttg 1560
tccttttgtg actggcttat ttcactgagt ataatgttct cacagttcat ccatgttata 1620
gcatgtgtca gaatttctta aggctaatat tccattgtat gcatgtgcca catttcgctt 1680
tcagtagtca tttttaagct ctataaaata aaatgaagaa aggacagttc acaatctaaa 1740
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1778
<210> 18
<211> 175
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Met Gly Arg Gln Ala Leu Leu Leu Leu Ala Leu Cys Ala Thr Gly Ala
1 5 10 15
Gln Gly Leu Tyr Phe His Ile Gly Glu Thr Glu Lys Arg Cys Phe Ile
20 25 30
Glu Glu Ile Pro Asp Glu Thr Met Val Ile Gly Asn Tyr Arg Thr Gln
35 40 45
Met Trp Asp Lys Gln Lys Glu Val Phe Leu Pro Ser Thr Pro Gly Leu
50 55 60
Gly Met His Val Glu Val Lys Asp Pro Asp Gly Lys Val Val Leu Ser
65 70 75 80
Arg Gln Tyr Gly Ser Glu Gly Arg Phe Thr Phe Thr Ser His Thr Pro
85 90 95
Gly Asp His Gln Ile Cys Leu His Ser Asn Ser Thr Arg Met Ala Leu
100 105 110
Phe Ala Gly Gly Lys Leu Arg Val His Leu Asp Ile Gln Val Gly Glu
115 120 125
His Ala Asn Asn Tyr Pro Glu Ile Ala Ala Lys Asp Lys Leu Thr Glu
130 135 140
Leu Gln Leu Arg Ala Arg Gln Leu Leu Asp Gln Val Glu Gln Ile Gln
145 150 155 160
Lys Glu Gln Asp Tyr Gln Arg Ala Ser Ala Tyr Leu Leu Val Ile
165 170 175
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11G anchor primer for TRG7
<400> 19
aagctttttt tttttg 16
<210> 20
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP38 Primer for TRG7
<400> 20
aagcttccag tgc 13
<210> 21
<211> 1582
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 21
gttcgggtga gcgaagatgg cggccgagag ggaacctcct ccgctggggg acgggaagcc 60
caccgacttt gaggatctgg aggacggaga ggacctgttc accagcactg tctccaccct 120
agagtcaagt ccatcatctc cagaaccagc tagtcttcct gcagaagata ttagtgcaaa 180
ctccaatggc ccaaaaccca cagaagttgt attagatgat gacagagaag atctttttgc 240
agaagccaca gaagaagttt ctttggacag ccctgcaagg gaacctatcc tatcctcgga 300
accttctcct gcagtcacac ctgtcactcc tactacactc attgctccta gaattgaatc 360
aaagagtatg tctgctcccg tgatctttga tagatccagg gaagagattg aagaagaagc 420
aaatggagac atttttgaca tagaaattgg tgtatcagat ccagaaaaag ttggtgatgg 480
catgaatgcc tatatggcat atagagtaac aacaaagaca tctctttcca tgttcagtaa 540
gagtgaattt tcagtgaaaa gaagattcag cgactttctt ggtttgcaca gcaaattagc 600
aagcaaatat ttacatgttg gttatattgt gccaccagct ccagaaaaga gtatagtagg 660
gatgaccaag gtcaaagtgg gtaaagaaga ctcatcatcc actgagtttg tagaaaaacg 720
gagagcagct cttgaaaggt atcttcaaag aacagtaaaa catccaactt tactacagga 780
tcctgattta aggcagttct tggaaagttc agagctgcct agagcagtta atacacaggc 840
tctgagtggt gcaggaatat tgaggatggt gaacaaggct gccgacgctg tcaacaaaat 900
gacaatcaag atgaatgaat cggatgcatg gtttgaagaa aagcagcagc aatttgagaa 960
tctggatcag caacttagga aacttcatgt cagtgttgaa gccttggtct gtcatagaaa 1020
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ccagttacat caagaacaag cttttgctga cttttatatg ttttcagaac tacttagtga 1200
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caaagccatt gcctagcaat aa 1582
<210> 22
<211> 519
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 22
Met Ala Ala Glu Arg Glu Pro Pro Pro Leu Gly Asp Gly Lys Pro Thr
1 5 10 15
Asp Phe Glu Asp Leu Glu Asp Gly Glu Asp Leu Phe Thr Ser Thr Val
20 25 30
Ser Thr Leu Glu Ser Ser Pro Ser Ser Pro Glu Pro Ala Ser Leu Pro
35 40 45
Ala Glu Asp Ile Ser Ala Asn Ser Asn Gly Pro Lys Pro Thr Glu Val
50 55 60
Val Leu Asp Asp Asp Arg Glu Asp Leu Phe Ala Glu Ala Thr Glu Glu
65 70 75 80
Val Ser Leu Asp Ser Pro Ala Arg Glu Pro Ile Leu Ser Ser Glu Pro
85 90 95
Ser Pro Ala Val Thr Pro Val Thr Pro Thr Thr Leu Ile Ala Pro Arg
100 105 110
Ile Glu Ser Lys Ser Met Ser Ala Pro Val Ile Phe Asp Arg Ser Arg
115 120 125
Glu Glu Ile Glu Glu Glu Ala Asn Gly Asp Ile Phe Asp Ile Glu Ile
130 135 140
Gly Val Ser Asp Pro Glu Lys Val Gly Asp Gly Met Asn Ala Tyr Met
145 150 155 160
Ala Tyr Arg Val Thr Thr Lys Thr Ser Leu Ser Met Phe Ser Lys Ser
165 170 175
Glu Phe Ser Val Lys Arg Arg Phe Ser Asp Phe Leu Gly Leu His Ser
180 185 190
Lys Leu Ala Ser Lys Tyr Leu His Val Gly Tyr Ile Val Pro Pro Ala
195 200 205
Pro Glu Lys Ser Ile Val Gly Met Thr Lys Val Lys Val Gly Lys Glu
210 215 220
Asp Ser Ser Ser Thr Glu Phe Val Glu Lys Arg Arg Ala Ala Leu Glu
225 230 235 240
Arg Tyr Leu Gln Arg Thr Val Lys His Pro Thr Leu Leu Gln Asp Pro
245 250 255
Asp Leu Arg Gln Phe Leu Glu Ser Ser Glu Leu Pro Arg Ala Val Asn
260 265 270
Thr Gln Ala Leu Ser Gly Ala Gly Ile Leu Arg Met Val Asn Lys Ala
275 280 285
Ala Asp Ala Val Asn Lys Met Thr Ile Lys Met Asn Glu Ser Asp Ala
290 295 300
Trp Phe Glu Glu Lys Gln Gln Gln Phe Glu Asn Leu Asp Gln Gln Leu
305 310 315 320
Arg Lys Leu His Val Ser Val Glu Ala Leu Val Cys His Arg Lys Glu
325 330 335
Leu Ser Ala Asn Thr Ala Ala Phe Ala Lys Ser Ala Ala Met Leu Gly
340 345 350
Asn Ser Glu Asp His Thr Ala Leu Ser Arg Ala Leu Ser Gln Leu Ala
355 360 365
Glu Val Glu Glu Lys Ile Asp Gln Leu His Gln Glu Gln Ala Phe Ala
370 375 380
Asp Phe Tyr Met Phe Ser Glu Leu Leu Ser Asp Tyr Ile Arg Leu Ile
385 390 395 400
Ala Ala Val Lys Gly Val Phe Asp His Arg Met Lys Cys Trp Gln Lys
405 410 415
Trp Glu Asp Ala Gln Ile Thr Leu Leu Lys Lys Arg Glu Ala Glu Ala
420 425 430
Lys Met Met Val Ala Asn Lys Pro Asp Lys Ile Gln Gln Ala Lys Asn
435 440 445
Glu Ile Arg Glu Trp Glu Ala Lys Val Gln Gln Gly Glu Arg Asp Phe
450 455 460
Glu Gln Ile Ser Lys Thr Ile Arg Lys Glu Val Gly Arg Phe Glu Lys
465 470 475 480
Glu Arg Val Lys Asp Phe Lys Thr Val Ile Ile Lys Tyr Leu Glu Ser
485 490 495
Leu Val Gln Thr Gln Gln Gln Leu Ile Lys Tyr Trp Glu Ala Phe Leu
500 505 510
Pro Glu Ala Lys Ala Ile Ala
515
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11A anchor primer for TRG9
<400> 23
aagctttttt ttttta 16
<210> 24
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP9 Primer for TRG9
<400> 24
aagcttcatt ccg 13
<210> 25
<211> 3979
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 25
caaaacttct gcctttaata actttagaaa atttactaat ctatagaact aattgagtag 60
gatataggaa ggatacaagg atataatgtc ctttttataa aagtttagta tagcttcttt 120
acatgtatcc acttgttcca gaaaatgtgc attggttctg aatgtgaaaa tatttaaaga 180
gagaaaggaa cactcaagta agtgtgggct tcagtgggaa ttatcacaaa acattggcaa 240
gtatttttat ttaaattatt ttcaaatttg acttctacag ccaagtggaa ttggtaggct 300
gtagctgtta cactgaaatt tctagtcttt gtaagtgcct cctgaaagtc atttaaaatg 360
gaaaaatatt tcaatgagct tttccttttt tcatatttat ggacatgaat attttattgg 420
agatcattaa ctcctagaat ttgagattat atttccatac aacattttat aaagttatgt 480
tgaacttact acctgttatg tgcaggttat tatgtaacta ttcacagatt gcttcatata 540
ttgctttatc ttcccatcta acttcttaaa gttaaaatcc ggacacacat gttgattatc 600
tagaccagtc attctggaaa ttgtaacact cccacataaa ccccaggaga ctttttcaga 660
atgcaatgtt tctaaatgta ctgttactgg cagtttactc tccagcatat aaggttgcat 720
tttaactttt agattatgaa ctgtgcaaac tttacccaaa actatcttgc atgattccct 780
cctaaatata ttccttgatt aagtaaatct ggcaaatcac tgtttgagct agttacataa 840
aatttgttat caagagaagg cttttctaca agtttccaga ttaacataaa gaaaagaggg 900
aatcacaggg catttaagtg caccttccca ttactttcct taaatcacct catagttagg 960
ctgggcgcgg tggctcacgc ctgtaatccc agcactttgg gaggccgaga cggtggatca 1020
cgaggtcagg ggactgagat catcctggct aacacgatga aacctcatct ctactaaaaa 1080
tacaaataat tagccaggca tggtggcacg cgcctgtagt cccagctact cgggaggcag 1140
agacaggaga atcgtttgca cccgggaggc ggaggttgtt gcagtgagcc gagatcgcgc 1200
caatgcactc cagcctgggc tacagagtga gactccatct caaaaaaaaa caaaaaaaat 1260
cacctcatag tttatgtctg acttactcca aacctcagtt atctgatttg tagtctgtgt 1320
caggaaagtt ttcttcatat ctattctgtc tccctcctct ttgattttaa atttttttct 1380
tttacccagt aggacaaaaa agagcagttg gtcatcatcc ccaatattct tagtcttcag 1440
tatgcttcag gcctctcaat gaacacttaa gtctcaattc ttcagacaaa attgcttaag 1500
ctcttctcct cagtcctatt ttaatgactt tatatttaag aatatagaat tatattttct 1560
tttatattca aattcattac tccagttaag taatagtttg atagtttgat agaatcgaga 1620
gttaagatgt ttctatttga aagtggattc aaccatcaga ccaccagcaa atcggcactt 1680
aatttttgtg ttatctaaca ttttctattg tggaatttta tgattttata ttctcattag 1740
ttataactaa aaagccatgc acacagaatt gtatatcatt ttgccattaa aattttttaa 1800
catattgcag caagcttagt tttatgattg agccacaacc ttttacatat tttttgtatg 1860
aaatattaaa cactaaatgc aagattaact ttcaaaagca aaccctacat taatcaggta 1920
ttatctatgg acatttttgt agaccacttt tgaaatactt attattttgc aacatagact 1980
ggactataca actttcattt aacttttagg tgactgattt aagttgagtg tgcatataga 2040
gaaaaaccta gaaatttatc tcatggcaga tacatttgaa agtacttcag aagaatttat 2100
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tattactgtg atgtttgtag tgttactatt aaacattgtg aacatacaca tttttaaaac 2220
aacttgaaac ccattttaaa atctgggtaa gagagaagga atcttcagaa caaaatcaca 2280
tcattagggt gtccagttta tgattgaatt tttaagcaaa ttactgtatt tgaaactaca 2340
acttgatttg gttttcagtt ttaaaaggca acatgtgggt tttatccatt ttatttatac 2400
ctttagattt cagaaacatc ttcatgtttt agatgcattc tacagacatc atgttactta 2460
aaaactcagg gcccctttca tccctttgta cactgaaaaa gttcaattgt tagcaagtaa 2520
gcaattagat ccagttgaat atttaaagtg tttgttgcac agttcattta atgtttcatc 2580
ttatttgact ttttcacata gatataatat cagatttcat taattataaa aagttgccca 2640
gttctgtaat tactgaacag agggaatgac tcaactaatt ggctacatgt tgcaacaaat 2700
ttaggccttt agagttgaag cactgactta aaacgactta cattctgttc tttggtcaaa 2760
tgaccataca tgatatggga caaattgttt cattttgttt gttttttaat aagggaactt 2820
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tctaaaagtg aactaaatat tttataactt tagtaatagc ttggatggtt ttgagaaaat 2940
aacctgtatt tatcacattg tcaaacagaa tttttctttg aatcagacaa gttcaagctc 3000
taaattgatg tgctatatac ttaaaatcct aggaagttat ctgtaaccag tctcttgtct 3060
caggctcttc accttgttac caatcctcgt aagtatgtaa aggaaacata tttttaaaga 3120
agcttaacag taagaaaaaa ttactaaaag atgcaattca aagataggtc ccagtttaac 3180
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tttttgtatg ccttgttatt tcatttccat agggattata ttgtatcagt gtttatgtaa 3300
gctggaatca tcctcagttt tttgctgata atttttcaaa taaagataca tggataattg 3360
taaaatacac taactcttag ggtgttgtag tagctgaaac atggagatgc gtagctgtca 3420
tgctttttct gaatggacag gagaaacata agctacggag tattcacttc tgaggatgct 3480
tttccggaaa aagaaaggct agaaaatact cgcacttcct cagaaccctc tttcttgtta 3540
acgggtatct tttgttggtg tgttttgctc ttacattaca gatagactat catatatgac 3600
tttatgaata atttcagtta ttttgctttt gtataagctg tctgaagcct tgctatgctg 3660
tataagttgt gtttgatgga tcagtgtgag tataaaataa agcaaatcac ttttcttttg 3720
tattatctat ggatgccact atgaaagctg acattaagcc actaaagagt tttctatgaa 3780
taagtgtaag taaatgcttt gatatatata aacctaaata aaaagattgt attgatacag 3840
agacattgga gaaggagatt ttaaggcagt tctttaggtt taaaaaggct tgctgtaaaa 3900
tggtgcgtta ttccgtttat taaagatcat attaatgaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3960
aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 3979
<210> 26
<211> 56
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
Met Val Ala Arg Ala Cys Ser Pro Ser Tyr Ser Gly Gly Arg Asp Arg
1 5 10 15
Arg Ile Val Cys Thr Arg Glu Ala Glu Val Val Ala Val Ser Arg Asp
20 25 30
Arg Ala Asn Ala Leu Gln Pro Gly Leu Gln Ser Glu Thr Pro Ser Gln
35 40 45
Lys Lys Thr Lys Lys Ile Thr Ser
50 55
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11A anchor primer for TRG10
<400> 27
aagctttttt ttttta 16
<210> 28
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP9 Primer for TRG10
<400> 28
aagcttcatt ccg 13
<210> 29
<211> 235
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
cttccggggt aatgacagtg atgaaatgca ggggacctgg ttgcccccaa gtttcctggc 60
agtgtgtgat actgaggagg tgagcttgtt tctggagctg tgctttaaga ttcatgttac 120
atgtaaagct gtcctcattt gtgactatgg acctatggag ttgggacaat ctctatggga 180
agcagaaggc aaggaccccg gtcattttag gtagaaacaa cagcatgcta atgca 235
<210> 30
<211> 62
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
Met Gln Gly Thr Trp Leu Pro Pro Ser Phe Leu Ala Val Cys Asp Thr
1 5 10 15
Glu Glu Val Ser Leu Phe Leu Glu Leu Cys Phe Lys Ile His Val Thr
20 25 30
Cys Lys Ala Val Leu Ile Cys Asp Tyr Gly Pro Met Glu Leu Gly Gln
35 40 45
Ser Leu Trp Glu Ala Glu Gly Lys Asp Pro Gly His Phe Arg
50 55 60
<210> 31
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11C anchor primer for TRG11
<400> 31
aagctttttt tttttc 16
<210> 32
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP4 Primer for TRG11
<400> 32
aagcttctca acg 13
<210> 33
<211> 510
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 33
gtagcgcgtc ttgggtctcc cggctgccgc tgctgccgcc gccgcctcgg gtcgtggagc 60
caggagcgac gtcaccgcca tggcaggcat caaagctttg attagtttgt cctttggagg 120
agcaatcgga ctgatgtttt tgatgcttgg atgtgccctt ccaatataca acaaatactg 180
gcccctcttt gttctatttt tttacatcct ttcacctatt ccatactgca tagcaagaag 240
attagtggat gatacagatg ctatgagtaa cgcttgtaag gaacttgcca tctttcttac 300
aacgggcatt gtcgtgtcag cttttggact ccctattgta tttgccagag cacatctgat 360
tgagtgggga gcttgtgcac ttgttctcac aggaaacaca gtcatctttg caactatact 420
aggctttttc ttggtctttg gaagcaatga cgacttcagc tggcagcagt ggtgaaaaga 480
aattactgaa ctattgtcaa atggacttcc 510
<210> 34
<211> 131
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 34
Met Ala Gly Ile Lys Ala Leu Ile Ser Leu Ser Phe Gly Gly Ala Ile
1 5 10 15
Gly Leu Met Phe Leu Met Leu Gly Cys Ala Leu Pro Ile Tyr Asn Lys
20 25 30
Tyr Trp Pro Leu Phe Val Leu Phe Phe Tyr Ile Leu Ser Pro Ile Pro
35 40 45
Tyr Cys Ile Ala Arg Arg Leu Val Asp Asp Thr Asp Ala Met Ser Asn
50 55 60
Ala Cys Lys Glu Leu Ala Ile Phe Leu Thr Thr Gly Ile Val Val Ser
65 70 75 80
Ala Phe Gly Leu Pro Ile Val Phe Ala Arg Ala His Leu Ile Glu Trp
85 90 95
Gly Ala Cys Ala Leu Val Leu Thr Gly Asn Thr Val Ile Phe Ala Thr
100 105 110
Ile Leu Gly Phe Phe Leu Val Phe Gly Ser Asn Asp Asp Phe Ser Trp
115 120 125
Gln Gln Trp
130
<210> 35
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11G anchor primer for TRG12
<400> 35
aagctttttt tttttg 16
<210> 36
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP10 Primer for TRG12
<400> 36
aagcttccac gta 13
<210> 37
<211> 1301
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 37
tcacctccaa gcacagcatg aaggcgcaca tggtcagaca gcacagccgg cgccaagatc 60
tcttacctca gctagaagct ccgagttctc ttactcccag cagtgaactc agcagcccag 120
gccaaagtga gctcactaac atggatcttg ctgcactctt ctctgacaca cctgccaatg 180
ctagtggttc tgcaggtggg tcggatgagg ctctgaactc cggaatcctg actattgacg 240
tcacttctgt gagctcctct ctgggaggga acctccctgc taataatagc tccctagggc 300
cgatggaacc cctggtcctg gtggcccaca gtgatattcc cccaagcctg gacagccctc 360
tggttctcgg gacagcagcc acggttctgc agcagggcag cttcagtgtg gatgacgtgc 420
agactgtgag tgcaggagca ttaggctgtc tggtggctct gcccatgaag aactcgagtg 480
acgacccact ggctttgacc tccaatagta acttagcagc acatatcacc acaccgacct 540
cttcgagcac cccccgagaa aatgccagtg tcccggaact gctggctcca atcaaggtgg 600
agccggactc gccttctcgc ccaggagcag ttgggcagca ggaaggaagc catgggctgc 660
cccagtccac gttgcccagt ccagcagagc agcacggtgc ccaggacaca gagctcagtg 720
caggcactgg caacttctat ttggaaagtg ggggctcagc aagaactgat taccgagcca 780
ttcaactagc caaggaaaaa aagcagagag gagcggggag caatgcagga gcctcacagt 840
ctactcagag aaaaataaaa gaaggcaaaa tgagtcctcc ccatttccat gcaagccaga 900
acagttggtt gtgtgggagc ctcgtggtgc ccagcggagg acggccagga ccagctccag 960
cagctggggt gcagtgcggg gcgcagggcg tccaggtcca gctggtgcag gatgacccct 1020
ccggcgaagg tgtcctgccc tcggcccgcg gcccagccac cttcctcccc ttcctcactg 1080
tggacctgcc cgtctacgtc ctccaggagg tgctcccctc atctggaggc cctgctggac 1140
cggaggccac ccagttccca ggaagcacta tcaacctgca ggatctgcag tgacggcagc 1200
ctcggcctgg gcaggcccaa ggccacggtc taggacacac cttccctgag actcatgaca 1260
tgagcctggg gagacctcat ttggtttccg ttcagaagac c 1301
<210> 38
<211> 391
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 38
Met Lys Ala His Met Val Arg Gln His Ser Arg Arg Gln Asp Leu Leu
1 5 10 15
Pro Gln Leu Glu Ala Pro Ser Ser Leu Thr Pro Ser Ser Glu Leu Ser
20 25 30
Ser Pro Gly Gln Ser Glu Leu Thr Asn Met Asp Leu Ala Ala Leu Phe
35 40 45
Ser Asp Thr Pro Ala Asn Ala Ser Gly Ser Ala Gly Gly Ser Asp Glu
50 55 60
Ala Leu Asn Ser Gly Ile Leu Thr Ile Asp Val Thr Ser Val Ser Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gly Gly Asn Leu Pro Ala Asn Asn Ser Ser Leu Gly Pro Met
85 90 95
Glu Pro Leu Val Leu Val Ala His Ser Asp Ile Pro Pro Ser Leu Asp
100 105 110
Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Ala Ala Thr Val Leu Gln Gln Gly Ser
115 120 125
Phe Ser Val Asp Asp Val Gln Thr Val Ser Ala Gly Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Ala Leu Pro Met Lys Asn Ser Ser Asp Asp Pro Leu Ala Leu
145 150 155 160
Thr Ser Asn Ser Asn Leu Ala Ala His Ile Thr Thr Pro Thr Ser Ser
165 170 175
Ser Thr Pro Arg Glu Asn Ala Ser Val Pro Glu Leu Leu Ala Pro Ile
180 185 190
Lys Val Glu Pro Asp Ser Pro Ser Arg Pro Gly Ala Val Gly Gln Gln
195 200 205
Glu Gly Ser His Gly Leu Pro Gln Ser Thr Leu Pro Ser Pro Ala Glu
210 215 220
Gln His Gly Ala Gln Asp Thr Glu Leu Ser Ala Gly Thr Gly Asn Phe
225 230 235 240
Tyr Leu Glu Ser Gly Gly Ser Ala Arg Thr Asp Tyr Arg Ala Ile Gln
245 250 255
Leu Ala Lys Glu Lys Lys Gln Arg Gly Ala Gly Ser Asn Ala Gly Ala
260 265 270
Ser Gln Ser Thr Gln Arg Lys Ile Lys Glu Gly Lys Met Ser Pro Pro
275 280 285
His Phe His Ala Ser Gln Asn Ser Trp Leu Cys Gly Ser Leu Val Val
290 295 300
Pro Ser Gly Gly Arg Pro Gly Pro Ala Pro Ala Ala Gly Val Gln Cys
305 310 315 320
Gly Ala Gln Gly Val Gln Val Gln Leu Val Gln Asp Asp Pro Ser Gly
325 330 335
Glu Gly Val Leu Pro Ser Ala Arg Gly Pro Ala Thr Phe Leu Pro Phe
340 345 350
Leu Thr Val Asp Leu Pro Val Tyr Val Leu Gln Glu Val Leu Pro Ser
355 360 365
Ser Gly Gly Pro Ala Gly Pro Glu Ala Thr Gln Phe Pro Gly Ser Thr
370 375 380
Ile Asn Leu Gln Asp Leu Gln
385 390
<210> 39
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11C anchor primer for TRG13
<400> 39
aagctttttt tttttc 16
<210> 40
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP11 Primer for TRG13
<400> 40
aagcttcggg taa 13
<210> 41
<211> 1206
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 41
caggtgacag cagggacatg tctcgggaga tgcaggatgt agacctcgct gaggtgaagc 60
ctttggtgga gaaaggggag accatcaccg gcctcctgca agagtttgat gtccaggagc 120
aggacatcga gactttacat ggctctgttc acgtcacgct gtgtgggact cccaagggaa 180
accggcctgt catcctcacc taccatgaca tcggcatgaa ccacaaaacc tgctacaacc 240
cccccttcaa ctacgaggac atgcaggaga tcacccagca ctttgccgtc tgccacgtgg 300
acgcccctgg ccagcaggac ggcgcagcct ccttccccgc agggtacatg tacccctcca 360
tggatcagct ggctgaaatg cttcctggag tccttcaaca gtttgggctg aaaagcatta 420
ttggcatggg aacaggagca ggcgcctaca tcctaactcg atttgctcta aacaaccctg 480
agatggtgga gggccttgtc cttatcaacg tgaacccttg tgcggaaggc tggatggact 540
gggccgcctc caagatctca ggatggaccc aagctctgcc ggacatggtg gtgtcccacc 600
tttttgggaa ggaagaaatg cagagtaacg tggaagtggt ccacacctac cgccagcaca 660
ttgtgaatga catgaacccc ggcaacctgc acctgttcat caatgcctac aacagccggc 720
gcgacctgga gattgagcga ccaatgccgg gaacccacac agtcaccctg cagtgccctg 780
ctctgttggt ggttggggac agctcgcctg cagtggatgc cgtggtggag tgcaactcaa 840
aattggaccc aacaaagacc actctcctca agatggcgga ctgtggcggc ctcccgcaga 900
tctcccagcc ggccaagctc gctgaggcct tcaagtactt cgtgcagggc atgggataca 960
tgccctcggc tagcatgacc cgcctgatgc ggtcccgcac agcctctggt tccagcgtca 1020
cttctctgga tggcacccgc agccgctccc acaccagcga gggcacccga agccgctccc 1080
acaccagcga gggcacccgc agccgctcgc acaccagcga gggggcccac ctggacatca 1140
cccccaactc gggtgctgct gggaacagcg ccgggcccaa gtccatggag gtctcctgct 1200
aggcgg 1206
<210> 42
<211> 394
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
Met Ser Arg Glu Met Gln Asp Val Asp Leu Ala Glu Val Lys Pro Leu
1 5 10 15
Val Glu Lys Gly Glu Thr Ile Thr Gly Leu Leu Gln Glu Phe Asp Val
20 25 30
Gln Glu Gln Asp Ile Glu Thr Leu His Gly Ser Val His Val Thr Leu
35 40 45
Cys Gly Thr Pro Lys Gly Asn Arg Pro Val Ile Leu Thr Tyr His Asp
50 55 60
Ile Gly Met Asn His Lys Thr Cys Tyr Asn Pro Pro Phe Asn Tyr Glu
65 70 75 80
Asp Met Gln Glu Ile Thr Gln His Phe Ala Val Cys His Val Asp Ala
85 90 95
Pro Gly Gln Gln Asp Gly Ala Ala Ser Phe Pro Ala Gly Tyr Met Tyr
100 105 110
Pro Ser Met Asp Gln Leu Ala Glu Met Leu Pro Gly Val Leu Gln Gln
115 120 125
Phe Gly Leu Lys Ser Ile Ile Gly Met Gly Thr Gly Ala Gly Ala Tyr
130 135 140
Ile Leu Thr Arg Phe Ala Leu Asn Asn Pro Glu Met Val Glu Gly Leu
145 150 155 160
Val Leu Ile Asn Val Asn Pro Cys Ala Glu Gly Trp Met Asp Trp Ala
165 170 175
Ala Ser Lys Ile Ser Gly Trp Thr Gln Ala Leu Pro Asp Met Val Val
180 185 190
Ser His Leu Phe Gly Lys Glu Glu Met Gln Ser Asn Val Glu Val Val
195 200 205
His Thr Tyr Arg Gln His Ile Val Asn Asp Met Asn Pro Gly Asn Leu
210 215 220
His Leu Phe Ile Asn Ala Tyr Asn Ser Arg Arg Asp Leu Glu Ile Glu
225 230 235 240
Arg Pro Met Pro Gly Thr His Thr Val Thr Leu Gln Cys Pro Ala Leu
245 250 255
Leu Val Val Gly Asp Ser Ser Pro Ala Val Asp Ala Val Val Glu Cys
260 265 270
Asn Ser Lys Leu Asp Pro Thr Lys Thr Thr Leu Leu Lys Met Ala Asp
275 280 285
Cys Gly Gly Leu Pro Gln Ile Ser Gln Pro Ala Lys Leu Ala Glu Ala
290 295 300
Phe Lys Tyr Phe Val Gln Gly Met Gly Tyr Met Pro Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Thr Arg Leu Met Arg Ser Arg Thr Ala Ser Gly Ser Ser Val Thr Ser
325 330 335
Leu Asp Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser
340 345 350
Arg Ser His Thr Ser Glu Gly Thr Arg Ser Arg Ser His Thr Ser Glu
355 360 365
Gly Ala His Leu Asp Ile Thr Pro Asn Ser Gly Ala Ala Gly Asn Ser
370 375 380
Ala Gly Pro Lys Ser Met Glu Val Ser Cys
385 390
<210> 43
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11G anchor primer for TRG14
<400> 43
aagctttttt tttttg 16
<210> 44
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP20 Primer for TRG14
<400> 44
aagcttgttg tgc 13
<210> 45
<211> 1104
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 45
atggttgcac agaaggtgaa accaaatctt cagactttta ataccattct gaaatgtctc 60
cgaagatttc atgtgtttgc aagatcgcca gccttacagg ttttacgtga aatgaaagcc 120
attggaatag aaccctcgct tgcaacatat caccatatta ttcgcctgtt tgatcaacct 180
ggagaccctt taaagagatc atccttcatc atttatgata taatgaatga atcaatggga 240
aagagatttt ctccaaagga cccggatgat gataagtttt ttcagtcagc catgagcata 300
tgctcatctc tcagagatct agaacttgcc taccaagtac atggcctttt aaaaaccgga 360
gacaactgga aattcattgg acctgatcaa catcgtaatt tctattattc caagttcttc 420
gatttgattt gtctaatgga acaaattgat gttaccttga agtggtatga ggacctgata 480
ccttcagcct actttcccca ctcccaaaca atgatacatc ttctccaagc attggatgtg 540
gccaatcggc tagaagtgat tcctaaaatt tggaaagata gtaaagaata tggtcatact 600
ttccgcagtg acctgagaga agagatcctg atgctcatgg caagggacaa gcacccacca 660
gagcttcagg tggcatttgc tgactgtgct gctgatatca aatctgcgta tgaaagccaa 720
cccatcagac agactgctca ggattggcca gccacctctc tcaactgtat agctatcctc 780
tttttaaggg ctgggagaac tcaggaagcc tggaaaatgt tggggctttt caggaagcat 840
aataagattc ctagaagtga gttgctgaat gagcttatgg acagtgcaaa agtgtctaac 900
agcccttccc aggccattga agtagtagag ctggcaagtg ccttcagctt acctatttgt 960
gagggcctca cccagagagt aatgagtgat tttgcaatca accaggaaca aaaggaagcc 1020
ctaagtaatc taactgcatt gaccagtgac agtgatactg acagcagcag tgacagcgac 1080
agtgacacca gtgaaggcaa atga 1104
<210> 46
<211> 367
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 46
Met Val Ala Gln Lys Val Lys Pro Asn Leu Gln Thr Phe Asn Thr Ile
1 5 10 15
Leu Lys Cys Leu Arg Arg Phe His Val Phe Ala Arg Ser Pro Ala Leu
20 25 30
Gln Val Leu Arg Glu Met Lys Ala Ile Gly Ile Glu Pro Ser Leu Ala
35 40 45
Thr Tyr His His Ile Ile Arg Leu Phe Asp Gln Pro Gly Asp Pro Leu
50 55 60
Lys Arg Ser Ser Phe Ile Ile Tyr Asp Ile Met Asn Glu Ser Met Gly
65 70 75 80
Lys Arg Phe Ser Pro Lys Asp Pro Asp Asp Asp Lys Phe Phe Gln Ser
85 90 95
Ala Met Ser Ile Cys Ser Ser Leu Arg Asp Leu Glu Leu Ala Tyr Gln
100 105 110
Val His Gly Leu Leu Lys Thr Gly Asp Asn Trp Lys Phe Ile Gly Pro
115 120 125
Asp Gln His Arg Asn Phe Tyr Tyr Ser Lys Phe Phe Asp Leu Ile Cys
130 135 140
Leu Met Glu Gln Ile Asp Val Thr Leu Lys Trp Tyr Glu Asp Leu Ile
145 150 155 160
Pro Ser Ala Tyr Phe Pro His Ser Gln Thr Met Ile His Leu Leu Gln
165 170 175
Ala Leu Asp Val Ala Asn Arg Leu Glu Val Ile Pro Lys Ile Trp Lys
180 185 190
Asp Ser Lys Glu Tyr Gly His Thr Phe Arg Ser Asp Leu Arg Glu Glu
195 200 205
Ile Leu Met Leu Met Ala Arg Asp Lys His Pro Pro Glu Leu Gln Val
210 215 220
Ala Phe Ala Asp Cys Ala Ala Asp Ile Lys Ser Ala Tyr Glu Ser Gln
225 230 235 240
Pro Ile Arg Gln Thr Ala Gln Asp Trp Pro Ala Thr Ser Leu Asn Cys
245 250 255
Ile Ala Ile Leu Phe Leu Arg Ala Gly Arg Thr Gln Glu Ala Trp Lys
260 265 270
Met Leu Gly Leu Phe Arg Lys His Asn Lys Ile Pro Arg Ser Glu Leu
275 280 285
Leu Asn Glu Leu Met Asp Ser Ala Lys Val Ser Asn Ser Pro Ser Gln
290 295 300
Ala Ile Glu Val Val Glu Leu Ala Ser Ala Phe Ser Leu Pro Ile Cys
305 310 315 320
Glu Gly Leu Thr Gln Arg Val Met Ser Asp Phe Ala Ile Asn Gln Glu
325 330 335
Gln Lys Glu Ala Leu Ser Asn Leu Thr Ala Leu Thr Ser Asp Ser Asp
340 345 350
Thr Asp Ser Ser Ser Asp Ser Asp Ser Asp Thr Ser Glu Gly Lys
355 360 365
<210> 47
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11A anchor primer for TRG15
<400> 47
aagctttttt ttttta 16
<210> 48
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP15 Primer for TRG15
<400> 48
aagcttacgc aac 13
<210> 49
<211> 1064
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 49
gatcaaaagg ccatgggtag gaggcttgca ggtgtgactt taggatcatg gcttctcccc 60
acgatttttt gggggtcgag ggaagcagag catggtgctc caatcccaga acccagctgc 120
cctcaagctc agaggaccag gtcctggcct ggctgctgct gctgggactc ctccctatgg 180
gcatccctgc atgtcctgtg tgtccctgag gagggacatg gggaactcag gggccacctc 240
tcctcgaact gcggggccag agcagagagc ccttgcacac caccagcctc tcctccctgt 300
gccccaggag ttcatccttt gctgcctggc ccgggaccct gcccgccggc cctctgccca 360
cagcctcctc ttccaccgcg tgctcttcga ggtgcactcg ctgaagctcc tggcagccca 420
ctgcttcatc cagcaccagt acctcatgcc tgagaatgtg gtggaggaga agaccaaggc 480
catggacctg cacgcggtct tggcggagct tccccggccc cgcaggcccc cgctgcagtg 540
gcggtactcg gaagtctcct tcatggagct ggacaaattc ctggaggatg tcaggaatgg 600
aatctaccca ctgatgaact ttgcagccac tcgacccctg gggctgcccc gtgtgctggc 660
cccacccccg gaggaggtcc aaaaggccaa gaccccgacg ccagagccct ttgactctga 720
gaccagaaag gtcatccaga tgcagtgcaa cctggagaga agcgaggaca aggcgcgctg 780
gcatctcact ctgcttctgg tgctggaaga ccggctgcac cggcagctga cctacgacct 840
gctcccaagt aggctgggca ggggacttgg gcggcgggcg gtgaccccag gcggcgggtg 900
ggcagcggcc tcatgcctcg ccttacgcca ttgcctcagc ggacagcgcc caggacctcg 960
cctcggagct cgtgcactat ggcttcctcc acgaggacga ccggatgaag ctggccgcct 1020
tccaggagag caccttcctc aagtaccgtg ggacccaggc ctga 1064
<210> 50
<211> 324
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
Met Val Leu Gln Ser Gln Asn Pro Ala Ala Leu Lys Leu Arg Gly Pro
1 5 10 15
Gly Pro Gly Leu Ala Ala Ala Ala Gly Thr Pro Pro Tyr Gly His Pro
20 25 30
Cys Met Ser Cys Val Ser Leu Arg Arg Asp Met Gly Asn Ser Gly Ala
35 40 45
Thr Ser Pro Arg Thr Ala Gly Pro Glu Gln Arg Ala Leu Ala His His
50 55 60
Gln Pro Leu Leu Pro Val Pro Gln Glu Phe Ile Leu Cys Cys Leu Ala
65 70 75 80
Arg Asp Pro Ala Arg Arg Pro Ser Ala His Ser Leu Leu Phe His Arg
85 90 95
Val Leu Phe Glu Val His Ser Leu Lys Leu Leu Ala Ala His Cys Phe
100 105 110
Ile Gln His Gln Tyr Leu Met Pro Glu Asn Val Val Glu Glu Lys Thr
115 120 125
Lys Ala Met Asp Leu His Ala Val Leu Ala Glu Leu Pro Arg Pro Arg
130 135 140
Arg Pro Pro Leu Gln Trp Arg Tyr Ser Glu Val Ser Phe Met Glu Leu
145 150 155 160
Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Arg Asn Gly Ile Tyr Pro Leu Met Asn
165 170 175
Phe Ala Ala Thr Arg Pro Leu Gly Leu Pro Arg Val Leu Ala Pro Pro
180 185 190
Pro Glu Glu Val Gln Lys Ala Lys Thr Pro Thr Pro Glu Pro Phe Asp
195 200 205
Ser Glu Thr Arg Lys Val Ile Gln Met Gln Cys Asn Leu Glu Arg Ser
210 215 220
Glu Asp Lys Ala Arg Trp His Leu Thr Leu Leu Leu Val Leu Glu Asp
225 230 235 240
Arg Leu His Arg Gln Leu Thr Tyr Asp Leu Leu Pro Ser Arg Leu Gly
245 250 255
Arg Gly Leu Gly Arg Arg Ala Val Thr Pro Gly Gly Gly Trp Ala Ala
260 265 270
Ala Ser Cys Leu Ala Leu Arg His Cys Leu Ser Gly Gln Arg Pro Gly
275 280 285
Pro Arg Leu Gly Ala Arg Ala Leu Trp Leu Pro Pro Arg Gly Arg Pro
290 295 300
Asp Glu Ala Gly Arg Leu Pro Gly Glu His Leu Pro Gln Val Pro Trp
305 310 315 320
Asp Pro Gly Leu
<210> 51
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11C anchor primer for TRG16
<400> 51
aagctttttt tttttc 16
<210> 52
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP13 Primer for TRG16
<400> 52
aagcttcggc ata 13
<210> 53
<211> 432
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 53
atggcggaga agtttgacca cctagaggag cacctggaga agttcgtgga gaacattcgg 60
cagctcggca tcatcgtcag tgacttccag cccagcagcc aggccgggct caaccaaaag 120
ctgaatttta ttgttactgg cttacaggat attgacaagt gcagacagca gcttcatgat 180
attactgtac cgttggaagt ttttgaatat atagatcaag gtcgaaatcc ccagctctac 240
accaaagagt gcctggagag ggctctagct aaaaatgagc aagttaaagg caagatcgac 300
accatgaaga aatttaaaag cctgttgatt caagaacttt ctaaagtatt tccggaagac 360
atggctaagt atcgaagcat ccggggggag gatcacccgc cttcttaacc agctcaccct 420
ccctgtgtga ag 432
<210> 54
<211> 135
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 54
Met Ala Glu Lys Phe Asp His Leu Glu Glu His Leu Glu Lys Phe Val
1 5 10 15
Glu Asn Ile Arg Gln Leu Gly Ile Ile Val Ser Asp Phe Gln Pro Ser
20 25 30
Ser Gln Ala Gly Leu Asn Gln Lys Leu Asn Phe Ile Val Thr Gly Leu
35 40 45
Gln Asp Ile Asp Lys Cys Arg Gln Gln Leu His Asp Ile Thr Val Pro
50 55 60
Leu Glu Val Phe Glu Tyr Ile Asp Gln Gly Arg Asn Pro Gln Leu Tyr
65 70 75 80
Thr Lys Glu Cys Leu Glu Arg Ala Leu Ala Lys Asn Glu Gln Val Lys
85 90 95
Gly Lys Ile Asp Thr Met Lys Lys Phe Lys Ser Leu Leu Ile Gln Glu
100 105 110
Leu Ser Lys Val Phe Pro Glu Asp Met Ala Lys Tyr Arg Ser Ile Arg
115 120 125
Gly Glu Asp His Pro Pro Ser
130 135
<210> 55
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11G anchor primer for TRG17
<400> 55
aagctttttt tttttg 16
<210> 56
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP14 Primer for TRG17
<400> 56
aagcttggag ctt 13
<210> 57
<211> 1141
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 57
acacccctag ggcctaaaga tgctgaggtc tgtatggaat tttctgaaac gccacaaaaa 60
gaaatgcatc ttcctgggca cggtccttgg aggagtatat attctgggga aatatggaca 120
gaagaaaatc agagaaatac aggaaaggga ggctgcagaa tacattgccc aagcacgacg 180
acaatatcat tttgaaagta accagaggac ttgcaatatg acagtgctgt ccatgcttcc 240
aacactgaga gaggccttaa tgcagcaact gaattccgag agcctcacag ctctgctaaa 300
aaacaggcct tcaaacaagc tagaaatatg ggaggatctg aagataataa gtttcacaag 360
aagtactgtg gctgtataca gtacctgtat gctggttgtt cttttgcggg tccagttaaa 420
cataattggt ggatatattt acctggataa tgcagcagtt ggcaaaaatg gcactacaat 480
tcttgctccc ccagatgtcc aacagcagta tttatcaagt attcagcacc tacttggaga 540
tggtctgaca gaattgatca ctgtcattaa acaagctgtg cagaaggttt taggaagtgt 600
ttctcttaaa cattctttgt cccttttgga cttggagcaa aaactaaaag aaatcagaaa 660
tctcgttgag cagcataagt cttcttcttg gattaataaa gatggatcca aacctttatt 720
atgccattat atgatgccag atgaagaaac tccattagca gtgcaggcct gtggactttc 780
tcctcgagac attaccacta ttaaacttct caatgaaact agagacatgt tggaaagccc 840
agattttagt acagttttga atacctgttt aaaccgaggt tttagtagac ttctagacaa 900
tatggctgag ttctttcgac ctactgaaca ggacctgcaa catggtaact ctatgaatag 960
tctttccagt gtcagcctgc ctttagctaa gataattcca atagtaaacg gacagatcca 1020
ttcagtttgc agtgaaacac ctagtcattt tgttcaggat ctgttgacaa tggagcaagt 1080
gaaagacttt gctgctaatg tgtatgaagc ttttagtacc cctcagcaac tggagaaatg 1140
a 1141
<210> 58
<211> 373
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
Met Leu Arg Ser Val Trp Asn Phe Leu Lys Arg His Lys Lys Lys Cys
1 5 10 15
Ile Phe Leu Gly Thr Val Leu Gly Gly Val Tyr Ile Leu Gly Lys Tyr
20 25 30
Gly Gln Lys Lys Ile Arg Glu Ile Gln Glu Arg Glu Ala Ala Glu Tyr
35 40 45
Ile Ala Gln Ala Arg Arg Gln Tyr His Phe Glu Ser Asn Gln Arg Thr
50 55 60
Cys Asn Met Thr Val Leu Ser Met Leu Pro Thr Leu Arg Glu Ala Leu
65 70 75 80
Met Gln Gln Leu Asn Ser Glu Ser Leu Thr Ala Leu Leu Lys Asn Arg
85 90 95
Pro Ser Asn Lys Leu Glu Ile Trp Glu Asp Leu Lys Ile Ile Ser Phe
100 105 110
Thr Arg Ser Thr Val Ala Val Tyr Ser Thr Cys Met Leu Val Val Leu
115 120 125
Leu Arg Val Gln Leu Asn Ile Ile Gly Gly Tyr Ile Tyr Leu Asp Asn
130 135 140
Ala Ala Val Gly Lys Asn Gly Thr Thr Ile Leu Ala Pro Pro Asp Val
145 150 155 160
Gln Gln Gln Tyr Leu Ser Ser Ile Gln His Leu Leu Gly Asp Gly Leu
165 170 175
Thr Glu Leu Ile Thr Val Ile Lys Gln Ala Val Gln Lys Val Leu Gly
180 185 190
Ser Val Ser Leu Lys His Ser Leu Ser Leu Leu Asp Leu Glu Gln Lys
195 200 205
Leu Lys Glu Ile Arg Asn Leu Val Glu Gln His Lys Ser Ser Ser Trp
210 215 220
Ile Asn Lys Asp Gly Ser Lys Pro Leu Leu Cys His Tyr Met Met Pro
225 230 235 240
Asp Glu Glu Thr Pro Leu Ala Val Gln Ala Cys Gly Leu Ser Pro Arg
245 250 255
Asp Ile Thr Thr Ile Lys Leu Leu Asn Glu Thr Arg Asp Met Leu Glu
260 265 270
Ser Pro Asp Phe Ser Thr Val Leu Asn Thr Cys Leu Asn Arg Gly Phe
275 280 285
Ser Arg Leu Leu Asp Asn Met Ala Glu Phe Phe Arg Pro Thr Glu Gln
290 295 300
Asp Leu Gln His Gly Asn Ser Met Asn Ser Leu Ser Ser Val Ser Leu
305 310 315 320
Pro Leu Ala Lys Ile Ile Pro Ile Val Asn Gly Gln Ile His Ser Val
325 330 335
Cys Ser Glu Thr Pro Ser His Phe Val Gln Asp Leu Leu Thr Met Glu
340 345 350
Gln Val Lys Asp Phe Ala Ala Asn Val Tyr Glu Ala Phe Ser Thr Pro
355 360 365
Gln Gln Leu Glu Lys
370
<210> 59
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11C anchor primer for TRG18
<400> 59
aagctttttt tttttc 16
<210> 60
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP18 Primer for TRG18
<400> 60
aagcttagag gca 13
<210> 61
<211> 449
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 61
ctgctggttg aggctgtgtg ggtgggggac gggccgaggc gatggcggag aagtttgacc 60
acctagagga gcacctggag aagttcgtgg agaacattcg gcagctcggc atcatcgtca 120
gtgacttcca gcccagcagc caggccgggc tcaaccaaaa gctgaatttt attgttactg 180
gcttacagga tattgacaag tgcagacagc agcttcatga tattactgta ccgttagaag 240
tttttgaata tatagatcaa ggtcgaaatc cccagctcta caccaaagag tgcctggaga 300
gggctctagc taaaaatgag caagttaaag gcaagatcga caccatgaag aaatttaaaa 360
gcctgttgat tcaagaactt tctaaagtat ttccggaaga catggctaag tatcgaagca 420
tccgggggga ggatcacccg ccttcttaa 449
<210> 62
<211> 135
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62
Met Ala Glu Lys Phe Asp His Leu Glu Glu His Leu Glu Lys Phe Val
1 5 10 15
Glu Asn Ile Arg Gln Leu Gly Ile Ile Val Ser Asp Phe Gln Pro Ser
20 25 30
Ser Gln Ala Gly Leu Asn Gln Lys Leu Asn Phe Ile Val Thr Gly Leu
35 40 45
Gln Asp Ile Asp Lys Cys Arg Gln Gln Leu His Asp Ile Thr Val Pro
50 55 60
Leu Glu Val Phe Glu Tyr Ile Asp Gln Gly Arg Asn Pro Gln Leu Tyr
65 70 75 80
Thr Lys Glu Cys Leu Glu Arg Ala Leu Ala Lys Asn Glu Gln Val Lys
85 90 95
Gly Lys Ile Asp Thr Met Lys Lys Phe Lys Ser Leu Leu Ile Gln Glu
100 105 110
Leu Ser Lys Val Phe Pro Glu Asp Met Ala Lys Tyr Arg Ser Ile Arg
115 120 125
Gly Glu Asp His Pro Pro Ser
130 135
<210> 63
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-T11A anchor primer for TRG20
<400> 63
aagctttttt ttttta 16
<210> 64
<211> 13
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> H-AP13 Primer for TRG20
<400> 64
aagcttcggc ata 13
Claims (7)
- 서열번호: 50의 아미노산 서열을 갖는 인간 원암단백질.
- 제 1항의 원암단백질을 암호화하는 인간 원암유전자.
- 제 2항에 있어서,상기 유전자는 서열번호: 49의 염기 번호 92 내지 1064에 해당하는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
- 제 2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호: 49의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 원암유전자.
- 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 벡터.
- 제 1항의 원암단백질을 포함하는 암 진단용 키트.
- 제 2항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 원암유전자를 포함하는 암 진단용 키트.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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KR1020060092996A KR100675971B1 (ko) | 2006-09-25 | 2006-09-25 | 인간 원암유전자 trg 및 이에 의해 코드되는 단백질 |
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-
2006
- 2006-09-25 KR KR1020060092996A patent/KR100675971B1/ko not_active IP Right Cessation
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