DE69929817T2 - Verfahren zur aktivitätsbestimmung einer substanz mittels eines funktionellen in vitro tests - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft den Bereich der Erforschung von Substanzen, die in der Lage sind, eine Funktion zu modifizieren, die einem Protein oder einer Menge an Proteinen entspricht, das (die) an einem biologischen Prozess beteiligt ist (sind). Diese Art von Arbeiten, auch als Screening oder Sieben bezeichnet, bilden heute eine Art der empirischen, jedoch besonders leistungsfähigen, Erforschung neuer Substanzen, die in zahlreichen Laboren gebraucht werden. Unter den zahlreichen Einsatzbereichen dieser Strategie des Siebens können die folgenden Beispiele zitiert werden:
    • – Pharmazeutische Labore verfügen über Molekülbibliotheken und erforschen jene, die in der Lage sind, die Aktivität jener Enzyme zu hemmen oder zu verlangsamen, die an der Entwicklung von genetischen oder infektiösen Krankheiten beteiligt sind, die bakteriellen oder viralen Ursprungs sind.
    • – Als Folge des intensiven Gebrauchs von Antibiotika ist gegenwärtig die Geschwindigkeit, in der neue Resistenzen auftauchen höher, als die der Entdeckung neuer Antibiotika. Manche Krankenhauslabore erforschen daher, immer ausgehend von sehr spezifischen Molekülbanken, neue Antibiotika oder Beta-Lactamase-Hemmer.
    • – Es werden auch Arbeiten ausgeführt, um Hemmer für die Multiplikation der Mikroorganismen zu finden, die an der biologischen Korrosion der Kanalisationen oder der Behälter, die in industriellen Verfahren gebraucht werden, beteiligt sind.
  • Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bestimmung der In-vitro-Aktivität einer oder mehrerer Substanzen, die einen funktionellen Test anwenden, der darin besteht, eine Veränderung mindestens einer bekannten Funktion aufzuspüren und/oder zu messen, die entweder einem oder mehreren Proteinen entspricht, die in vitro im Beisein und bei Abwesenheit besagter Substanz hergestellt werden, oder der Substanz, die im Beisein und bei Abwesenheit von Proteinen in vitro hergestellt wurde. Das Verfahren der Erfindung wird nachfolgend also auch als Sieb-Verfahren bezeichnet.
  • Die besagte bekannte Funktion entspricht vorzugsweise den in vitro exprimierten Proteinen, die auch Proteinziele genannt werden. Das Verfahren der Erfindung zielt also darauf, die Aktivität der getesteten Substanzen anhand einer bekannten Funktion zu bestimmen, die einem oder mehreren Protein(en) entspricht, das (die) in vitro hergestellt wird (werden).
  • Gleichwohl entspricht in einer anderen Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung die bekannte Funktion der oder den getesteten Substanzen. In diesem Fall ermöglicht das Verfahren der Erfindung die Bestimmung, ob die bekannte Aktivität dieser Substanz durch ein oder mehrere Proteine, die in vitro hergestellt wurden, modifiziert wird.
  • Unter Funktion ist die Aktivität eines oder mehrerer spezifischer Proteine zu verstehen, die auch Proteinziele mindestens eines Organismus oder mindestens eines Prozesses genannt werden, die gemäß der vorliegenden Erfindung auf dem Umweg über einen funktionellen Test aufgespürt und/oder quantifiziert wird. Vorzugsweise ist das Proteinziel ein Enzym. Dieses Enzym kann unter anderem der Umkehrtranskriptase oder der Aspartatprotease des Aidsvirus, dem RecA-Intein des Mycobacterium tuberculosis, einem Antibiotikaresistenzprotein, oder auch einer Menge an Enzymen, die an einem Stoffwechselweg beteiligt ist, entsprechen.
  • Unter einer bekannten Funktion ist die Funktion zu verstehen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung analysiert wird und die durch einen funktionellen Test aufgespürt und/oder gemessen werden kann.
  • In einem besonderen Fall des Verfahrens der Erfindung ist unter Funktion die Aktivität einer oder mehrerer Substanz(en) zu verstehen, die durch einen funktionellen Test aufgespürt und/oder gemessen wird (werden).
  • Unter Veränderung der Funktion ist der Aktivitätsunterschied der Funktion zu verstehen, die im Beisein oder bei Abwesenheit der Substanz gemessen wird. In einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung entspricht die Veränderung der Funktion dem Aktivitätsunterschied der Substanz im Beisein oder bei Abwesenheit von Proteinen, die in vitro exprimiert wurden.
  • Der funktionelle Test kann einen oder mehrere Zuträgermoleküle anwenden. Das Zuträgermolekül kann jedem Molekül entsprechen, das in der Lage ist, direkt oder indirekt die Aktivität eines oder mehrerer Proteinziele zu enthüllen, wobei es sich um ein Nukleinsäuremolekül, um ein Protein, ein Peptid, wie etwa einen Antikörper oder eine Mischung spezifischer Antikörper handeln kann, die in der Lage sind, die Aktivität eines Proteinziels zu enthüllen, oder um ein Substrat oder eine Substratkaskade, wovon eines das eines Proteinziels ist.
  • Die Funktion kann einer enzymatischen Aktivität oder einer Affinität entsprechen. Im Rahmen der Identifikation einer Veränderung der Funktion, die einer enzymatischen Aktivität entspricht, kann jede Art von spezifischem funktionellem Test vom Fachmann herangezogen werden, um diese Veränderung zu identifizieren. Der Fachmann kann sich zum Beispiel auf Werke wie Methods on Enzymology oder Annual Review of Biochemistry beziehen, in denen eine große Zahl von Methoden zur Dosierung von Enzymen und zur Vorbereitung von Substraten beschrieben wurden. Im Falle einer Identifizierung einer Veränderung der Funktion, die einer Affinität, zum Beispiel eines Antigens für einen Antikörper, eines Proteins für DNA, eines Rezeptors für einen Liganden usw. entspricht, kann die Identifizierung einer Veränderung der Funktion zum Beispiel durch Tests, wie etwa die Anbringung eines durch ein Isotop oder durch ein Enzym oder durch ein Fluorophor markierten Liganden, durch ein immunologisches Aufspüren, unter Gebrauch der Antikörper, die durch ein Metall oder durch ein Enzym oder durch ein Fluorophor markiert sind, hergestellt werden.
  • Unter Organismus ist jede Art von Organismus oder Mikroorganismus, wie Viren, Bakterien, Algen, Pilze, oder jedes Produkt zu verstehen, das natürliche oder synthetische Nukleinsäuren, die die Expression eines oder mehrerer Proteine erlauben, zu verstehen, die vorteilhafterweise für eine Funktion kodieren.
  • Unter Prozess ist die Entwicklung einer Krankheit, einer Infektion oder von Zellen zu verstehen, die zum Beispiel krebsartig oder ansteckend sind, oder von bakteriellen Resistenzmechanismen. Diese Prozesse können auf einem Wirt oder in einem industriellen Verfahren (Nahrungsmittel, Papierverarbeitung, Textil) stattfinden.
  • Unter Substanz sind Polynukleotide, Peptide, Proteine, Ionen, Moleküle oder natürliche oder synthetische chemische Zusammensetzungen, Hormone, aromatische Verbindungen, Antikörper, Fragmente von Antikörpern, Gene, zelluläre Rezeptoren, Aminosäuren, Glykopeptide, Lipide, Glykolipide, Zucker, Polysaccharide usw. zu verstehen, die in der Lage sind, die Aktivität einer oder mehrerer Funktionen eines Organismus oder eines Prozesses zu modifizieren. Diese besagten Substanzen können einem oder mehreren Serienköpfen entsprechen. Es kann sich um jedes Mittel handeln, das in der Lage ist, die Funktion(en) wie antivirale Mittel, Hemmer, Stimulanzien zu modifizieren.
  • Das Verfahren der Erfindung wird also insbesondere beim Sieben von Substanzen verwendet, die in der Lage sind, die Aktivität eines oder mehrerer Proteinziele oder einer Funktion, die am biologischen Prozess dank der Expression in vitro des (der) genannten Proteine beteiligt ist (sind), zu modifizieren. Das Verfahren der Erfindung lässt das Sieben mehrerer Substanzen gleichzeitig zu, insbesondere, wenn es sich um Substanzen handelt, die geeignet sind, zu interagieren, um eine Funktion zu exprimieren oder um eine Funktion zu modifizieren. Demnach ist im nachfolgend beschriebenen Verfahren der Erfindung Substanz sowohl im Singular als auch im Plural zu verstehen.
  • Ebenso deckt die nachfolgende Verwendung des Begriffs „Funktion" im Singular auch den Begriff „Funktionen" im Plural ab und umgekehrt, außer wenn ausdrücklich angegeben ist, dass es sich um die Anwendung der Methode der Erfindung auf mehrere Funktionen handelt.
  • Folglich ermöglicht das Verfahren der Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, Substanzen zu sieben, die in der Lage sind, die Aktivität eines einzigen Proteinziels zu modifizieren, das in vitro exprimiert ist und das zum Beispiel eine enzymatische Aktivität aufweist, wie eine Amylase, eine Polymerase, eine Protease, oder in der Lage ist, eine beobachtbare Eigenschaft dieses Protein zu modifizieren, wie zum Beispiel eine „DNA-Binding"-Aktivität, eine antigene Affinität, oder auch in der Lage ist, die Aktivität oder Eigenschaft einer Variante dieses Proteinziels zu modifizieren, wie zum Beispiel eine thermostabile Amylase, ein prozessivere Polymerase, eine Protease, die gegen eine Antiprotease resistent ist, oder ein „DNA-Binding"-Protein, das eine stärkere Affinität für die DNA hat. Aber das Verfahren der Erfindung erlaubt auch Substanzen zu sieben, die in der Lage sind, die Aktivität einer Menge an Proteinen zu modifizieren, die in vitro exprimiert sind. In diesem Fall ist es die Menge an Proteinen, die das Ziel der zu testenden Substanzen bilden. Diese Menge an exprimierten Proteinen kann zum Beispiel den Enzymen entsprechen, die einen Syntheseweg eines Stoffwechselprodukts oder einen Abbauweg einer toxischen Verbindung bilden, aber sie kann auch Proteinen entsprechen, die die Untereinheiten eines komplexen Proteins darstellen. Die zu testenden Substanzen werden also nach ihrer Fähigkeit bewertet, die gesamte Aktivität dieser Menge an Proteinen zu modifizieren, was voraussetzt, dass diese Substanzen entweder die Aktivität aller, eines Teils oder eines einzigen der Proteine aus der Menge modifizieren können, denn die Modifizierung der Aktivität eines oder eines Teils der Proteine bringt die Modifizierung der Aktivität der Menge mit sich. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht außerdem in einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung, das oder die in vitro exprimierten Proteine zu bestimmen oder zu sieben, die geeignet sind, die Aktivität einer oder mehrerer bekannter Substanzen zu modifizieren.
  • Die Qualität einer Technik des Siebens von Substanzen oder Proteinen, die in der Lage sind, die Aktivität einer Funktion zu modifizieren, beruht hauptsächlich auf der Wirksamkeit des Aktivitätstests. Dieser Test muss hochspezifisch, empfindlich, schnell und reproduzierbar sein. Die Schwierigkeit der In-Vivo-Sieb-Verfahren solcher Moleküle beruht unter anderem auf der Toxizität und der zellulären Lokalisierung (Membranbarriere) der Proteinziele. Die vorliegende Erfindung zielt darauf, ein Verfahren der hochproduktiven Isolierung von Substanzen oder Proteinen anzubieten, die geeignet sind, die Aktivität eines Proteinziels oder mehrerer Proteinziele oder bekannter Funktionen zu modifizieren, die es erlauben, die oben genannten Probleme abzuschwächen.
  • Dieses Ziel wird dank eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 erreicht.
  • Die Vorbereitung eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle aus Etappe (a) des Verfahrens der Erfindung besteht darin, das oder die Gene unter Kontrolle zu bringen, welche für das oder die Proteine kodieren, das (die) in Etappe (c) von Elementen hergestellt wird (werden), die für die Übertragung und die Übersetzung in vitro notwendig sind, das heißt, unter die Kontrolle eines Initiators (an 5') und eventuell eines Terminators einer RNA-Polymerase (an 3'), damit sie in vitro übertragen werden.
  • Eine besondere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, den Initiator und den Terminator der RNA-Polymerase des Phagen T7 oder SP6 oder Qß oder λ zu nutzen.
  • Ebenso wird, damit die Übersetzung in vitro erfolgen kann, ein Anbringungsort der Ribosome oberhalb des Gens oder der besagten Gene eingeführt.
  • Das oder die Gene, die für das oder die Proteine kodieren, entsprechen einer bekannten Funktion, die in der Etappe (d) des Verfahrens der Erfindung aufgespürt und/oder gemessen werden soll, sind bekannte oder unbekannte, synthetische oder nicht synthetische Gene, die unter die Kontrolle der vorstehenden Sequenzen durch klassische Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, gebracht werden.
  • Dieses Gen oder diese Gene können auch in einer Probe vorhanden sein, die Nukleinsäuren enthält, wie zum Beispiel eine Bodenprobe, eine Pflanzenprobe, eine menschliche oder tierische Probe, eine Wasserprobe, eine Probe einer mikrobiellen Kultur, eine zelluläre oder virale Probe, eine Biopsieprobe, eine Probe eines Organismus oder eines Prozesses. Aber diese Probe kann auch den Produkten jeder Methode zur Verstärkung der genomischen DNA, der synthetischen DNA, der mRNA oder jedem anderen Nukleinsäureprodukt entsprechen, das aus Behandlungen, die üblicherweise vom Fachmann gebraucht werden, hervorgegangen ist. Es kann sich selbstverständlich um eine biologische Rohprobe, wie Blut, Gewebe, Urin oder jede andere Körperflüssigkeit, wie Zerebrospinal-, Synovial-, Pleural-, Pericardialflüssigkeit oder zuvor behandelte Flüssigkeit handeln, um die Nukleinsäuren vorzubereiten, die sie enthält.
  • Eine vorteilhafte Ausführungsform der Etappe (a) der Methode der Erfindung besteht darin, das oder die Nukleinsäuremoleküle durch eine Verstärkungsreaktion des oder der Gene vorzubereiten, die für das oder die Proteine kodieren, ausgehend von der Nukleinsäureprobe. Es kann sich um eine Verstärkung mittels PCR oder durch Techniken, die von der PCR vom Typ RT-PCR, Nested-PCR, Multiplex-PCR oder verschiedener PCR-Techniken vom Typ NASBA oder rollender Kreis und anderen abgeleitet sind. Vorteilhafterweise wendet diese Vorbereitung ein Paar aus Oligonukleotiden oder ein Paar aus spezifischen Anfangsstücken des oder der Nukleinsäuremoleküle an, das das oder die Gene umfasst, das (die) für das oder die Proteine kodiert (kodieren), das (die) der zu analysierenden Funktion entspricht (entsprechen). Diese Vorbereitung durch Verstärkung wird mit Hilfe eines oder mehrerer Paare von Anfangsstücken durchgeführt, wobei jedes zum Beispiel mittels PCR (1) und NASBA gebildet wird:
    • – für das Anfangsstück Richtung, der Sequenz die sich oberhalb eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle hybridisiert, das das oder die Gene beinhaltet, die für das oder die besagten Proteine kodieren, und einem Initiator der RNA-Polymerase und eventuell einem Anbringungsort der Ribosome, und
    • – für das Anfangsstück Gegenrichtung, der Sequenz die sich unterhalb eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle hybridisiert, das das oder die Gene beinhaltet, die für das oder die besagten Proteine kodieren, und eventuell einem Terminator von RNS Polymerase.
  • Die Etappe (a) kann mit jeder anderen geeigneten Technik durchgeführt werden. Denn die Vorbereitung des Nukleinsäuremoleküls aus Etappe (a) kann mit jeder anderen dem Fachmann bekannten Methode durchgeführt werden, wie etwa einem Restriktionsschnitt, der es erlaubt, das oder die interessierenden Gene wiederzugewinnen, gefolgt von einer gerichteten Ligation mit den für die zuvor angegebene Übertragung und Übersetzung in vitro notwendigen Kontrollelementen.
  • Die Nukleinsäuren haben vorzugsweise eine Größe zwischen 1 und mehreren Dutzend kb, bevorzugt zwischen 1 und 40 kb und vorteilhafterweise zwischen 1 und 10 kb, wenn die Probe prokaryotischen Ursprungs ist. Diese Fragmente können ein teilweises oder vollständiges Operon tragen.
  • Die Nukleinsäuren haben im Falle eines eukaryotischen Organismus vorzugsweise eine Größe in der Größenordnung von mehreren Dutzend bis mehreren Hundert Kilobasen. In dem besonderen Fall, in dem die cDNAs aus Etappe (a) behandelt werden, haben die Fragmente im Falle eines eurkaryotischen Organismus bevorzugt eine Größe zwischen 1 und 5 kb.
  • Die biologische Probe, aus der die Nukleinsäuremoleküle der Etappe (a) vorbereitet werden, kann von einem oder mehreren prokaryotischen Organismen oder eukaryotischen Zellen oder auch von gleichen oder verschiedenen Viren stammen, aber sie kann auch aus einer Sequenz oder einer Bank von synthetischen Nukleinsäuren bestehen oder auch aus Organismen und/oder unbekannten Nukleinsäuren bestehen. Es kann sich um eine Bank von eukaryotischer DNA handeln, und dann wird die Übertragungsreaktion von Etappe (b) durch eine Spleiß- und Reifungsreaktion in vitro der mRNA unter Gebrauch eines Nuklearextrakts abgeschlossen.
  • Das Sieb-Verfahren gemäß der Erfindung lässt mehrere Ausführungsformen zu, insbesondere abhängig von der Art der Aktivität des Proteinziels oder der Proteinziele. Denn das oder die Zielgene, die in Etappe (a) vorbereitet wurden, können für ein oder mehrere Proteinziele oder Funktionen kodieren, die an verschiedenen Arten von biologischen Prozessen beteiligt sind. Diese(s) Gen(e) kann (können) aus mehreren prokaryotischen Organismen oder eukaryotischen Zellen oder auch aus Viren stammen. Wie zuvor angegeben kann ein Prozess zum Beispiel eine Infektionskrankheit, ein bakterieller oder viraler Resistenzmechanismus, eine Stoffwechselkette oder auch ein Prozess sein, der an einem industriellen Verfahren der Nahrungsmittelherstellung, der Papierverarbeitung, der Herstellung von Detergenzien, der Fabrikation von Textilien usw. beteiligt ist.
  • Die Etappe (b) der Übertragung und die Übersetzungsphase von Etappe (c) können gleichzeitig erfolgen, was bedeutet, dass die Übersetzungsphase von Etappe (c) gleichzeitig mit der Übertragung von Etappe (b) durchgeführt wird, oder auf zwei verschiedene Etappen, Übertragung (b) und Übersetzung (c), aufgeteilt wird.
  • Die Entkoppelung der Etappen (b) und (c) ermöglicht die Optimierung der Ausbeute jeder Etappe, und so die Produktion von größeren Mengen an Proteinen, was ganz besonders nützlich ist, wenn es um das Aufspüren von Enzymen mit geringer spezifischer Aktivität geht.
  • Diese Entkoppelung ermöglicht auch die Normalisierung der Bildung der Produkte in Schritt (c) und erlaubt es, danach die verschiedenen exprimierten Funktionen zu vergleichen.
  • Die Entkoppelung zwischen der Übertragung aus Etappe (b) und der Übersetzung aus Etappe (c) erlaubt auch die Probleme des Abbaus der DNA-Matrix durch die Nukleasen zu vermeiden, wenn diese mittels PCR hergestellt wurde. Denn die Komponenten der Übertragungsreaktion sind im Gegensatz zu den Übersetzungsextrakten weniger mit Nukleasen kontaminiert.
  • Die Entkoppelung erlaubt zudem die Verwendung von verschiedenen Übersetzungsextrakten je nach Ur sprung der gesiebten DNA. Denn die Übersetzungsphase der Übertragung von Etappe (c) wird vorteilhafterweise mit einem Übertragungsextrakt gleichen Ursprungs oder eines Ursprungs durchgeführt, der nahe dem der biologischen Probe liegt, an der das Verfahren der Erfindung praktiziert wird. So wird die Anpassung zwischen dem Ursprung der Übersetzungssignale der Übertragungen und dem Übersetzungsextrakt für eine optimale Wirksamkeit der Übersetzung optimiert. Als Beispiel kann der Gebrauch eines Übersetzungsextrakts eines extremophilen Organismus zitiert werden, wenn die Vorbereitung aus Etappe (a) eine Probe einer Nukleinsäure anwendet, die vom gleichen Organismus oder einem anderen extremophilen (thermophilen, halophilen, azidophilen usw.) Organismus stammt, oder auch eines Übersetzungsextrakts aus eukaryotischen Zellen, wenn die Vorbereitung aus Etappe (a) eine Probe einer eukaryotischen Nukleinsäure anwendet. Diese jeweiligen Extrakte sind geeignet, die Wirksamkeit des Verfahrens zu verbessern. Diese Extrakte werden nach ihrer Fähigkeit ausgewählt, die Übertragungen der Etappe (c) zu übersetzen.
  • Das Verfahren der Erfindung ist dahingehend bemerkenswert, dass es eine Anpassung zwischen der Punktuation der Expression der Übertragungen aus Etappe (b) und den verwendeten Übersetzungsextrakten anwendet. Diese Extrakte sind auch dadurch gekennzeichnet, dass sie entweder die gesuchte Funktion nicht enthalten oder dass sie sie enthalten, aber nicht unter den Testbedingungen auf spürbar sind, die durchgeführt werden, um die gesuchte Funktion aufzuspüren. Es handelt sich zum Beispiel um den Gebrauch eines Übersetzungsextrakts, der eine mesophile beta-Galactosidase-Aktivität enthält, die es erlaubt, eine mRNA einer thermophilen beta-Galactosidase zu übersetzen und das Aufspüren deren Aktivität bei hoher Temperatur, was die mesophile beta-Galactosidase-Aktivität eliminiert.
  • Abhängig vom genetischen Ursprung der in Etappe (a) erhaltenen Gene, also zum Beispiel der DNA der grampositiven oder -negativen Mikroorganismen, der Eukaryoten, der Viren usw., und der getesteten Funktion, können verschiedene Übersetzungsextrakte gebraucht werden.
  • Eine besondere Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung besteht darin, dass in Etappe (c) eines Übersetzungsextraxts verwendet wird, der tatsächlich eine Mischung mehrerer Übersetzungsextrakte ist. Es kann sich zum Beispiel um einen Übersetzungsextrakt von E. coli handeln, der ein Chaperonprotein A überexprimiert, gemischt mit einem Übersetzungsextrakt von E. coli, der ein Chaperonprotein B überexprimiert. Sofern sie den oben beschriebenen Merkmalen entspricht, ist jede Art von Mischung denkbar. Auf die gleiche Weise ist es möglich, einen Übersetzungsextrakt zu verwenden, dem eine oder mehrere spezifische tRNAs mit einem oder mehreren Codonen zugefügt wurden. Die so erhaltenen Übersetzungsextrakte erlauben es also mRNAs zu übersetzen, die die spezifischen Codone umfassen, wie zum Beispiel die Übersetzung einer mRNA, die einen Ambre-Codon enthält, indem dem Übersetzungsextrakt eine oder mehrere Suppressor-tRNAs zugefügt werden.
  • Die Behandlung in Etappe (c) mit einem Übersetzungsextrakt kann auch mit einem universellen Übersetzungsextrakt durchgeführt werden, egal welchen Ursprungs die Probe ist, zum Beispiel einem E.-coli-Extrakt und/oder jedem/allen anderen zellulären Extrakt/Extrakten, der/die mit interessanten Molekülen, wie zum Beispiel jenen, die zuvor angegeben wurden (tRNA, Chaperon...), angereichert wurde/wurden oder nicht.
  • Es ist auch möglich, dem Übersetzungsextrakt aus Etappe (c) eine oder mehrere Substanzen zuzufügen, die eine wirkungsvollere Faltung oder Reifung der exprimierten Proteine begünstigen, wie zum Beispiel Chaperone, Detergenzien, Sulfobetaine, Membranextrakte usw.
  • Das Aufspüren und/oder das Messen der Veränderung mindestens einer bekannten Funktion, die dem oder den Proteinen, die in Etappe (c) hergestellt wurden, oder der Substanz entspricht, wird, wie in der Einführung definiert, mit jedem dem Fachmann bekannten funktionellen Test durchgeführt. Die Etappe (d) kann also darin bestehen, mehrere Veränderungen der Funktionen aufzuspüren und/oder zu messen, die einem oder mehreren Proteinen entsprechen, die in Etappe (d) hergestellt wurden, oder einer oder mehreren Substanzen entsprechen.
  • Die Veränderung(en) der Funktion(en) werden auf direkte oder indirekte Weise durch einen oder mehrere funktionelle Tests des oder der Proteine, das (die) in Etappe (c) hergestellt wurde(n), oder der oder den zu siebenden Substanzen aufgespürt oder dosiert. Die Funktion(en) wird (werden) zum Beispiel kontinuierlich gelesen, zum Beispiel mittels Fluorometrie oder mittels Colormetrie oder mittels Viskosimetrie oder mittels Massenspektrometrie...
  • Das Aufspüren und/oder das Messen der Veränderung der Funktion, die dem oder den Protein(en), das (die) in Etappe (c) hergestellt wird (werden), oder der oder den Substanz(en) entspricht (entsprechen), wird vorteilhafterweise in Etappe (d) mittels eines funktionellen Tests durchgeführt, der in einer der Etappen (a), (b), (c) oder (d) das Beisein eines Zuträgermoleküls oder mehrerer Zuträgermoleküle anwendet, die es erlauben, die Aktivität des oder der Protein(e) aufzuspüren und/oder zu messen, das (die) in Etappe (c) hergestellt wurde(n) oder der oder den zu siebenden Substanz(en), die der in Etappe (d) analysierten Funktion entsprechen.
  • Das Verfahren der Erfindung weist die folgenden Vorteile auf:
    • – Die Tatsache, dass es direkt auf die Aktivität des oder der Proteine, das (die) in Etappe (c) hergestellt wurde(n) oder auf die Aktivität der Substanz wirkt, ermöglicht eine gute Spezifität des Siebtests.
    • – Die Empfindlichkeit des Tests erklärt sich durch den Multiplikationskoeffizienten der enzymatischen Etappen (b) und (c), die jeweils der Übertragung und der Übersetzung und eventuell dem funktionellen Test entsprechen, der ein Enzym anwendet.
    • – Das Verfahren der Erfindung ist schnell, da es vollständig automatisierbar ist. Eine Platte mit 384 Vertiefungen kann zum Beispiel in 2 bis 3 Stunden behandelt werden.
    • – Schließlich wird die Reproduzierbarkeit dadurch erleichtert, dass kein Lagern des oder der in Etappe (c) hergestellten Proteins (Proteine) erforderlich ist. Hinzu kommt, dass das oder die Protein(e) in vitro exprimiert wird (werden), unabhängig von einem komplexen zellulären Kontext, der nicht immer kontrollierbar ist (Membrandiffusion, zelluläre Lokalisation, zelluläre Toxizität, zelluläre Physiologie, Induktions- oder Repressionsprobleme usw.).
  • Das Verfahren der Erfindung ist also bemerkenswert, denn neben der Durchführung des Siebens von Substanzen nach einer oder mehreren Funktionen ermöglicht es auch:
    • – neue funktionelle Test zu entwickeln,
    • – funktionelle Genomik auszuführen.
  • Denn das Verfahren der Erfindung ermöglicht die Entwicklung neuer funktioneller Tests. In den vergangenen Jahren haben wir einen Aufschwung der hochproduktiven Siebtests oder „High Throughput Screening (HTS)" miterlebt. Um optimal zu funktionieren, benötigen diese Siebtests die Anwendung empfindlicher funktioneller Tests. Diese funktionellen Tests sind jedoch nicht immer verfügbar. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es, einen oder mehrere funktionelle Tests zu identifizieren, die es ermöglichen, das Enthüllen einer oder mehrerer Funktion(en) eines Prozesses oder Organismus zu verbessern und so das Messen der Veränderung der Funktion(en) im Beisein oder bei Abwesenheit einer oder mehrerer Substanz(en) zu verbessern.
  • So ist es möglich, neue funktionelle Tests zu entwickeln, insbesondere auf folgende Weise:
    • a) die Vorbereitung von wenigstens einem Nukleinsäuremolekül, das das oder die Gene, die für ein oder mehrere Proteine kodieren, und die Kontrollelemente umfasst, die zur Übertragung und zur Übersetzung des oder der besagten Gene notwendig sind,
    • b) Die Übertragung des oder der Nukleinsäuremoleküle, die in Etappe (a) vorbereitet wurden.
    • c) Die Übersetzung in vitro des oder der in Etappe (b) vorbereiteten Übertragung(en),
    • d) Das Aufspüren und/oder das Messen der Veränderung einer bekannten Funktion, die den Proteinen entspricht, die in Etappe (c) im Beisein und bei Abwesenheit eines oder mehrerer Zuträgermolekül hergestellt wurden.
  • So entspricht im Rahmen dieses Einsatzes die Substanz einem Zuträgermolekül, das in der Lage ist, eine Funktion zu enthüllen.
  • Das Verfahren der Erfindung stellt einen realen Vorteil für die funktionelle Genomik dar.
  • Das Verfahren der Erfindung wird insbesondere bei der genomischen Nachsequenzierung verwendet. Das Projekt der Dekodierung des Humangenoms hat zu einer neuen Genomwissenschaft geführt, die jetzt im Mittel punkt des therapeutischen Unternehmens steht. Die Genomik ermöglicht es, die Gene, die die Fabrikation und die Anordnung aller Moleküle eines Organismus steuern, zu identifizieren und zu beschreiben. Diese Gene, die für Funktionen von Organismen oder Prozessen kodieren, können durch das verfahren der Erfindung exprimiert werden, das es ermöglicht, die kodierte Funktion durch ein Leseraster zu bestätigen, das durch Bioinformatik ausfindig gemacht werden kann, eine oder mehrere pharmazeutische Substanzen zu identifizieren, die in der Lage sind, die genannte Funktion durch ein oder mehrere Proteine zu modifizieren, die durch das Verfahren der Erfindung exprimiert werden, oder das es ermöglicht, die Ziele einer Substanz zu identifizieren, die einer oder mehreren Funktionen eines Organismus oder eines Prozesses entspricht, der in Etappe (c) exprimiert wurde.
  • Die pharmazeutische Industrie hat im Laufe ihres 100-jährigen Bestehens mehrere Hundert Rezeptorstellen identifiziert. Mit der funktionellen Genomik kann auf andere bestehende Rezeptorstellen zugegriffen werden, und auf ebenso viele potentielle Zielfunktionen für künftige Substanzen, die erst noch erdacht werden müssen.
  • Als Beispiel für einen solchen Einsatz kann das Ausfindigmachen mittels Bioinformatik eines ORF zitiert werden, das eventuell für ein Ziel kodiert, die Bestätigung dieses Ziels durch das Verfahren der Erfindung und das Finden von Substanzen dafür, die dessen Aktivität verändern können.
  • Ein anderes Beispiel der funktionellen Genomik besteht in der Identifikation auf genetischer Ebene eines Gens, das einem Protein entspricht, dessen Aktivität durch mehrere Substanzen modifiziert ist. In dem Fall, in dem die Wirkung einer pharmazeutischen Substanz auf einen Organismus oder Prozess bekannt ist, erweist sich dieser Einsatz des Verfahrens der vorliegenden Erfindung als ganz besonders interessant. Die Gene, die den Proteinen entsprechen, die durch diese Organismen oder Prozesse kodieren, werden dann gemäß einer besonderen Ausführungsform der Etappe (a), die zuvor beschrieben wurde, vorbereitet, so dass die besagten Gene isoliert werden und so dass sie in den Etappen (b) und (c) des Verfahrens der Erfindung exprimiert werden. Ein funktioneller Test aus Etappe (d) ermöglicht es, die Aktivität der Substanz in Beisein und in Abwesenheit eines jeden der in Etappe (c) exprimierten Proteine zu messen. Das Messen in Etappe (d) einer Veränderung der Aktivität der Substanz im Beisein und in Abwesenheit der Proteine, die in Etappe (c) exprimiert wurden, ermöglicht es also, das oder die Proteine zu identifizieren, deren Aktivität durch die genannte Substanz innerhalb des Organismus oder des Prozesses modifiziert ist.
  • Diese Ausführungsform der Erfindung weist den enormen Vorteil auf, direkt auf das Gen zurückgreifen zu können, ausgehend von dem oder den in Etappe (c) exprimierten und in Etappe (a) isolierten Protein(en). Das funktionelle Ziel einer oder mehrerer Substanzen kann also auf genetischer Ebene identifiziert werden.
  • Jedes Mal, wenn ein funktioneller Test angewendet werden kann (enzymatischer Test, Binding-Test usw.), ermöglicht es das Verfahren der Erfindung, die Menge an exprimierbaren Proteinen eines betrachteten Organismus hochproduktiv einem funktionellen Test zu unterziehen und innerhalb weniger Stunden auf Gene zurückzugreifen, die der gesuchten Funktion entsprechen.
  • Die folgende Beschreibung bezieht sich vorzugsweise auf Ausführungsformen des Verfahrens der Erfindung, in denen das oder die Proteine, die der oder den Funktionen entsprechen, die in Etappe (d) aufgespürt und/oder gemessen wurden, als Proteinziel(e) bezeichnet werden und das oder die entsprechenden kodierenden Gene als Zielgen(e) bezeichnet wird (werden). So umfasst das Verfahren der Erfindung, das es ermöglicht, Substanzen zu sieben, die in der Lage sind, die Aktivität eines Proteinziels oder mehrerer Proteinziele zu modifizieren, die in vitro exprimiert sind, die folgenden Etappen:
    • a) die Vorbereitung von wenigstens einem Nukleinsäuremolekül, das das oder die Gene, das oder die für ein oder mehrere Proteinziel(e) kodiert (kodieren), und die Kontrollelemente umfasst, die zur Übertragung und zur Übersetzung des oder der besagten Zielgene notwendig sind,
    • b) die Übertragung in vitro des oder der Nukleinsäuremoleküle, das (die) in Etappe (a) hergestellt wurde(n),
    • c) die Übersetzung in vitro der Übertragungen aus Etappe (b),
    • d) das Aufspüren und/oder das Messen der Veränderung mindestens einer bekannten Funktion, die dem oder den Proteinziele(n) entspricht, die in Etappe (c) im Beisein und bei Abwesenheit der zu siebenden Substanz hergestellt wurden.
  • Wenn es das Sieben von Substanzen betrifft, die geeignet sind, eine Funktion zu modifizieren, die einer Aktivität eines Proteinziels entspricht, umfasst das Verfahren der Erfindung die folgenden Etappen:
    • a) die Vorbereitung eines Nukleinsäuremoleküls, das das Gen, das für das besagte Protein in 5' des besagten Gens kodiert, einen Initiator der RNA-Polymerase und eine Anbringungsstelle der Ribosome und eventuell einen Terminator der RNA-Polymerase in 3' des besagten Gens umfasst,
    • b) die Übertragung in vitro des Nukleinsäuremoleküls, das in Etappe (a) hergestellt wurde,
    • c) die Übersetzung in vitro der Übertragungen aus Etappe (b),
    • d) das Aufspüren und/oder das Messen der Veränderung mindestens einer bekannten Funktion, die dem oder den Proteinziele(n) entspricht, die in Etappe (c) im Beisein und bei Abwesenheit der zu siebenden Substanz hergestellt wurden.
  • Aber das Verfahren der Erfindung kann auch beim Sieben von Substanzen eingesetzt werden, die in der Lage sind, die Funktion zu modifizieren, die einer Menge an Proteinzielen entspricht. Die Gene, die für diese Proteine kodieren, können auf dem gleichen DNA-Fragment situiert sein, wie im Falle eines Operons, oder an verschiedenen Orten der genomischen DNA, wie im Falle bestimmter Stoffwechselwege.
  • Wenn das Verfahren der Erfindung das Sieben einer Substanz betrifft, die in der Lage ist, die Aktivität einer Menge an Proteinen zu modifizieren, lässt Etappe (a) des Verfahrens die zwei folgenden Ausführungsformen zu:
    • i) Entweder werden die Gene in Form eines Operons zusammengeschlossen, und dann besteht Etappe (a) darin, ein Nukleinsäuremolekül vorzubereiten, das Gene (Operon), die für die Proteine in 5' der Gesamtheit der besagten Gene (des Operons) kodierten, einen Initiator der RNA-Polymerase, eventuell in 3' der Gesamtheit der besagten Gene (des Operons), einen Terminator der RNA-Polymerase und für jedes der besagten Gene seinen natürlichen Anbringungsort der Ribosome umfasst.
    • ii) Oder die besagten Gene werden getrennt, und dann besteht die Etappe (a) darin, ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle, die Gene enthalten, die für die Proteine in 5' eines jeden der besagten Gene kodieren, einen Initiator der RNA-Polymerase und einen Anbringungsort der Ribosome und eventuell in 3' von jedem der besagten Gene einen Terminator der RNA-Polymerase vorzubereiten.
  • In der oben stehenden ersten Ausführungsform (i) ist der Anbringungsort der Ribosome jedes Gens der natürliche Anbringungsort seiner Ribosome, und es ist also bevorzugt, in Etappe (c) einen Übersetzungsextrakt zu gebrauchen, der ausgehend von dem Organismus, aus dem das oder die Zielgen(e) stammen, oder von einem phylogenetisch nahen Organismus vorbereitet wurde.
  • In der oben stehenden zweiten Ausführungsform (ii) kann der Anbringungsort der Ribosome der natürliche Ort eines jeden Genes sein, oder ein anderer Anbringungsort der Ribosome, der besser an die Etappe (c) des Übersetzens angepasst ist.
  • Eine Variante der ersten (i) und der zweiten Ausführungsform (ii) des oben stehenden Verfahrens besteht in der parallelen oder gleichzeitigen Durchführung des Verfahrens der Erfindung, das zuvor mit einem einzigen Protein beschrieben wurde, wobei jede Etappe (a) mit jedem der Gene durchgeführt wird. Eine Alternative zur parallelen oder gleichzeitigen Durchführung des Verfahrens der Erfindung besteht in der getrennten Durchführung der Etappen (a), (b) und (c) für jedes der Gene und dem abschließenden Sieben, bei dem jedes der Proteine daran beteiligt ist, die Produkte der Etappen (c) zu sammeln, um Etappe (d) durchzuführen.
  • Ebenso, wenn das Verfahren das Sieben von Substanzen betrifft, die in der Lage sind, die Aktivität einer Menge an Proteinen zu modifizieren, deren Gene auf dem Genom eines Organismus physisch getrennt sind, besteht das Verfahren der Erfindung darin, das Verfahren der Erfindung, das zuvor beschrieben wurde, parallel oder gleichzeitig mit einem einzigen Protein durchzuführen, wobei jede Etappe (a) mit jedem der Gene durchgeführt wird. Eine Alternative zur parallelen oder gleichzeitigen Durchführung des Verfahrens der Erfindung besteht in der getrennten Durchführung der Etappen (a), (b) und (c) für jedes der Gene und dem abschließenden Sieben, bei dem jedes der Proteine daran beteiligt ist, die Produkte der Etappen (c) zu sammeln, um Etappe (d) durchzuführen.
  • Wie zuvor angegeben, können mit dem Verfahren der Erfindung auch Substanzen gesiebt werden, die in der Lage sind, die Aktivität einer Menge von Proteinzielen zu modifizieren, die in vitro exprimiert ist. Das Verfahren der Erfindung kann also beim Sieben von Substanzen eingesetzt werden, die in der Lage sind, die Aktivität der Varianten eines Proteins oder der Varianten einer Menge an Proteinen zu modifizieren. Das oder die Gene, die der oder den Variante(n) entsprechen, können zum Beispiel in einer gleichen Ausgangs-Nukleinsäureprobe enthalten sein. Als Beispiel für den Einsatz des Verfahrens der Erfindung können verschiedene Mutanten des Gens der Protease des HIV zitiert werden, die in einer Probe eines Patienten enthalten sind, der mit diesem Virus infiziert ist. Die Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung besteht also darin, jede Etappe (a) mit jedem der Mutanten des Gens durchzuführen, um jeden davon getrennt zu exprimieren. Die Trennung der Mutanten, die in der Probe enthalten sind, kann mittels Klonierung, extremer Verdünnung oder mittels jeder anderen Methode durchgeführt werden, die dem Fachmann bekannt ist. Dieser Einsatz des Verfahrens der Erfindung besteht also darin, alle Substanzen zu sieben, die nicht an einem Proteinziel oder an einer Menge an Proteinzielen zu testen sind, sondern an allen existierenden Varianten davon, deren entsprechende Gene in einer einzigen Nukleinsäureprobe enthalten sind. Dieser Einsatz des Verfahrens der Erfindung ermöglicht also das Aktionsspektrum der zu testenden Substanzen zu bestimmen.
  • Die Erfindung bezieht sich also auch auf den Einsatz des Sieb-Verfahrens von Substanzen, die in der Lage sind, die verschiedenen Varianten eines Proteinziels oder einer Menge an Proteinzielen zu modifizieren. Denn wie oben bei der HIV-Protease angegeben, kann die Probe eines Patienten, der mit diesem Virus infiziert ist, mehrere Varianten des Virus enthalten, von denen jede eine andere Protease exprimiert. Es ist also interessant, das Sieben an jeder der verschiedenen Proteasen auszuführen, um jene zu bestimmen, die durch die bekannten Antiproteasen gehemmt sind, oder jene, die es durch die neu zu testenden Substanzen sein können.
  • Auf der Basis dieses Beispiels des HIV-Virus ermöglicht die Erfindung die Analyse in vitro der verschiedenen Varianten eines Proteinziels oder einer Menge an Proteinzielen. Dieses Ziel wird gemäß der Erfindung erreicht, indem eventuell die verschiedenen Mutanten verstärkt werden, zum Beispiel durch Zellkultur oder durch molekulare Verstärkung, dann indem jedes mutante Gen isoliert wird, zum Beispiel durch Klonieren oder durch extreme Verdünnung, und indem jedes dieser Gene gemäß den Etappen (a), (b) und (c) des Verfahrens der Erfindung exprimiert wird, und schließlich indem die Substanzen gesiebt werden, die in der Lage sind, die Aktivität des oder der Proteine zu modifizieren, die während der Etappe (d) hergestellt wurden. Das Sieb-Verfahren besteht zum Beispiel im Fall der HIV-Proteasen darin, einen Hemmungstest mit den verschiedenen Hemmern oder den verschiedenen Substanzen durchzuführen, die an jeder Protease individuell zu testen sind. Die Aktivität jeder der Proteasen, die gemäß dem Verfahren der Erfindung exprimiert wurden, kann also charakterisiert werden, um die Repräsentation der verschiedenen Varianten des Virus zu enthüllen, die einen Patienten infizieren. Das Ergebnis des Verfahrens des Siebens gemäß der Erfindung ermöglicht also die Anpassung der Therapie des Patienten.
  • Wie bereits zuvor gesagt, kann der funktionelle Test ein oder mehrere Zuträgermoleküle anwenden. In einer ersten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung kann das Zuträgermolekül in Etappe (c) oder (d) vorhanden sein, um die eventuelle Aktivität des Proteinziels, abhängig von der Rolle der beim Sieben getesteten Substanz, zu enthüllen.
  • Aber das Zuträgermolekül kann auch in der Reaktionsmischung einer der Etappen (a) bis (b) vorhanden sein, entweder in seiner endgültigen Form des Zuträgermoleküls oder, gemäß einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, in Form eines Nukleinsäuremoleküls (DNA oder RNA), die dem Gen entspricht, das für das Zuträgermolekül kodiert und also das nachfolgende Zuträgergen bezeichnet. In dieser besonderen Ausführungsform wird das Zuträgermolekül vorteilhafterweise in Etappe (c) zusammen mit dem oder den Proteinzielen hergestellt.
  • So ist gemäß einer besonderen Ausführungsform des Sieb-Verfahrens der Erfindung das Zuträgermolekül ein Protein, das in Etappe (c) zusammen mit dem oder den Proteinzielen hergestellt wird. vorteilhafterweise wird in dieser Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung das Gen, das für das Zuträgermolekül kodiert, unter Kontrolle von Regelsequenzen der Übertragung und der Übersetzung gestellt, ähnlich jenen des oder der Gene, die für das oder die besagten Proteinziele kodieren, auf solche Weise, dass das Zuträgergen mit dem oder den Zielgenen koexprimiert wird.
  • Beispielsweise kann das Zuträgergen das Gen des GFP-Gens (Green Fluorescent Protein) oder das der beta-Lactamase (TEM-1) sein. Im Falle des GFP ist es die Fluoreszenzemission, die evaluiert wird. Es ist also möglich, einen Test durchzuführen, wie etwa, dass das GFP nur dann fluoresziert, wenn die Aktivität der Produkte des oder der Zielgene durch das oder die getestete(n) Molekül(e) modifiziert ist. Im Fall der beta-Lactamase ist es die Aktivität dieses Enzyms, die evaluiert wird, indem eine Fraktion der Übersetzungsreaktion in einem Puffer inkubiert wird, der Nitrocephin enthält. Das Nitrocephin ist ein chromogenes beta-Lactamin, das die Eigenschaft hat, von gelb auf rot umzuschlagen, wenn es durch eine aktive beta-Lactamase hydrolysiert wird. Ein gelber Test gibt zum Beispiel an, dass das oder die getestete(n) Molekül(e) in der Lage ist (sind), die Aktivität des Produkts des Zielgens zu modifizieren.
  • Jedes andere Zuträgergen ist im Verfahren der Erfindung denkbar, wie jene der beta-Galactosidase, der Luciferase, der Peroxidase oder eine Mikroperoxidase usw. Es sollte hervorgehoben werden, dass das Zuträgergen des GFP den Vorteil aufweist, ein Protein herzustellen, dessen Aktivität unverzüglich messbar ist, was einen zusätzlichen Zeitgewinn ermöglicht. Aber ein Zuträgergen, das für ein Protein kodiert, das eine enzymatische Aktivität vom Typ beta-Lactamase hat, weist aufgrund des enzymatischen Multiplikatorkoeffizienten eine grobe Empfindlichkeit auf.
  • Eine besondere Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung mit einem Zuträgergen besteht darin, ein Zuträgergen in vitro zu exprimieren, in dessen Inneren ein Gen oder mehrere Gene, die für das oder die Proteine kodieren, inseriert wurden, wobei die Gesamtheit dieser Gene unter der Kontrolle der gleichen Regelsequenzen der Übertragung und Übersetzung stehen.
  • Ein Beispiel für ein Nukleinsäuremolekül, das in Etappe (a) hergestellt wird und das dieser Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung entspricht, ist im Anhang in 2 dargestellt. Dieser besondere Fall, in dem das Zielgen oder das Zuträgergen koexprimiert sind, ist völlig an das Zielgen angepasst, das den Inteinen, wie etwa dem RecA-Intein des Mycobacterium tuberculosis entspricht.
  • Eine andere besondere Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung mit einem Zuträgergen besteht darin, ein Zielgen zu gebrauchen (das für ein Proteinziel oder eine Funktion kodiert), das/die selbst ein Zuträgergen sein kann. Ein Beispiel für ein Nukleinsäuremolekül, das in Etappe (a) vorbereitet wird und das dieser Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung entspricht, ist im Anhang in 3 dargestellt. Diese Ausführungsform ist besonders an ein Proteinziel angepasst, das eine Aktivität hat, die in vitro direkt auf spürbar ist, wie eine enzymatische Aktivität, wie etwa die beta-Lactamase. Das Gen der beta-Lactamase spielt eine wesentliche Rolle in der Antibiotikaresistenz vom Typ beta-Lactamin, indem es diese Moleküle hydrolysiert, bevor sie auf ihren therapeutischen Zielen wirken konnten. So kann, sobald das Enzym in Etappe (b), (c) oder (d) mit den zu testenden Molekülen konfrontiert wurde, die Aktivität der beta-Lactamase dank eines Nitrocephin-Tests evaluiert werden.
  • Die Etappen des Verfahrens der Erfindung können nacheinander ohne Unterbrechung durch den gleichen Operator durchgeführt werden, vorteilhafterweise auf einer automatisierten Vorrichtung, in der alle Etappen integriert sind, oder sie können auf diskontinuierliche Weise durchgeführt werden, eventuell durch verschiedene Operatoren.
  • Wenn die getestete Substanz einer Polynukleotidsequenz entspricht, dann kann sie eine Rolle als solche haben oder als Gen, das für ein Protein kodiert. Im letzten Fall besitzt diese Polynukleotidsequenz alle Sequenzen, die für ihre Expression in vitro bei der Reaktion der Übertragung und der Übersetzung notwendig sind. Vorzugsweise wird sie durch die gleichen Regelsequenzen exprimiert, wie das oder die Zielgene, damit sie deren Expression begleitet, und damit das Molekül Zeit hat, die Aktivität der Produkte des oder der Gen(e) zu modifizieren, das (die) nach diesen Etappen (b) und (c) exprimiert wurden. Dadurch wird vermieden, falsch positive oder falsch negative Ergebnisse zu generieren.
  • Eine der möglichen Rollen der zu siebenden Substanzen ist es, in vitro die Aktivität eines Proteinziels oder eine Menge von Proteinzielen zu verlangsamen bzw. zu stoppen, die zum Beispiel beim Fortschreiten einer Krankheit beteiligt sein können. Diese Moleküle sind zum Beispiel aus Bibliotheken hervorgegangen, die ein besonderes pharmakologisches Interesse aufwei sen, oder aus Arbeiten der kombinatorischen Chemie hervorgegangen, unter Berücksichtigung der Struktur der bereits bestehenden wirksamen Hemmer und/oder der Struktur des aktiven Orts eines Zielenzyms und dessen besonderen Merkmalen.
  • Aber die im Rahmen des Verfahrens der Erfindung getesteten Substanzen können auch eine stimulierende oder aktivierende Wirkung auf die Aktivität des Produkts eines Zielgens oder mehrerer Zielgene haben, das (die) eine Schlüsselrolle in einem Prozess hat (haben). Solche Moleküle können sich als enzymatische Kofaktoren als nützlich erweisen, die es ermöglichen, die Aktivität eines Enzyms in einem gegebenen industriellen Phänomen (Nahrungsmittel oder anderes) zu entmultiplizieren und so die Ausbeute zu erhöhen.
  • Jedes Mal, wenn sich eine getestete Substanz bei der Modifikation der Aktivität des Proteinziels als wirksam erweist, ist es vorteilhaft, mittels irgend einer geeigneten Methode zu verifizieren, dass diese Substanz keine der Etappen des Verfahrens hemmt. Zudem kann, nachdem eine Substanz identifiziert wurde, die in der Lage ist, die Aktivität eines Proteinziels zu modifizieren, dieses Protein gemäß dem Verfahren der Erfindung auf Proteine getestet werden, die eine ähnliche Aktivität wie die des Proteinziels (der Proteinziele) haben.
  • Das Verfahren der Erfindung kann vorteilhafterweise auf jeder Art von Träger angewendet werden und ist daher leicht automatisierbar. Unter Träger sind zum Beispiel Vertiefungen von Mikrotiterplatten und auch Biochips zu verstehen. Diese können mehrere Dutzend bis mehrere Tausend Plätze enthalten. So können auf einem einzigen Träger Dutzende bis Tausende von Substanzen auf ihre Fähigkeit getestet werden, eine Aktivität zu modifizieren, die durch das oder die Zielgen(e) kodiert ist, oder mehrere Nukleinsäuremoleküle, die in Etappe (a) vorbereitet wurden.
  • Eine besondere Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung besteht darin, die Vertiefungen dieser Platten mit einer konzentrierten, gekoppelten Mischung der Übertragungs- und Übersetzungsreaktion (Komponenten, die für die Übertragung und die Übersetzung notwendig sind) zu beladen, die ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle, die in Etappe (a) vorbereitet wurden, und das Zuträgermolekül enthält, und sie dann einzufrieren, um eine vorzeitige Initiierung der Übertragungs- bzw. Übersetzungsreaktion zu vermeiden. Die gefrorenen Platten werden in einen Automaten gegeben, der in jeder Vertiefung ein Volumen des zu testenden Moleküls gibt, wobei es ermöglicht wird, die Übertragungs- und Übersetzungsmischung so zu verdünnen, bis sie 1 Mal konzentriert ist. Eine Homogenisierung über den Automaten ist denkbar, aber die Reaktionsvolumina müssten ausreichend gering sein, damit die Diffusion diese Homogenisierung gewährleistet.
  • Das Messen der Aktivität eines oder mehrerer Proteinziele oder des Zuträgermoleküls aus Schritt (d) und also der Wirkung, die die getestete Substanz auf ein Proteinziel oder eine Menge an Proteinzielen hat, kann auch vorteilhaft automatisiert werden. Die eventuelle Modifizierung der Aktivität des Proteinziels wird direkt auf dem Träger in einem Fluorimetrie-Leser (wenn der Zuträger zum Beispiel GFP ist) oder in einem Colorimetrie-Leser (wenn der Zuträger zum Beispiel beta-Lactamase ist) abgelesen. Das automatisierte Ablesen wird an die Enthüllung des Zuträgers angepasst. So ist es möglich, ein kontinuierliches Ablesen der Aktivität des Zuträgers durchzuführen.
  • Die Automatisierung weist Vorteile im Hinblick auf das Siebpotential auf. Das Verfahren der Erfindung ist in einem Konzept der Mikro-Verarbeitung denkbar, um auf einem einzigen Träger Tausende von reaktionellen Nanovolumen zu manipulieren. Dies stellt einen sicheren Vorteil im Hinblick auf die Kosten, aber auch im Hinblick auf das Potenzial beim hochproduktiven Sieben dar. Das Verfahren der Erfindung, das auf Biochips angewendet wird, ermöglicht es, Sammlungen von Substanzen zu sieben, die zum Beispiel aus Arbeiten der kombinatorischen Chemie hervorgegangen sind, die zum Beispiel antifungische oder antibakterielle oder antivirale oder antikanzeröse Eigenschaften aufweisen, oder Sammlungen von Substanzen, die sich gegen Krankheiten, wie die Parkinson- oder die Alzheimerkrankheit richten. Das hochproduktive Verfahren der Erfindung ermöglicht es, die Schlüsselsubstanzen innerhalb einer minimalen Zeit zu identifizieren, die am besten an eine gegebene Schließfunktion angepasst sind. Es ermöglicht also, alle möglichen Kombinationen eines gegebenen Substanzenspektrums schnell und systematisch zu testen.
  • Demgemäß betrifft die Erfindung eine Vorrichtung, die eine Anordnung eines oder mehrerer Träger, Roboter und eines Lesers der besagten Träger für die Durchführung der Etappen des Verfahrens der Erfindung umfasst.
  • Aufgabe der Erfindung ist schließlich auch, ein Kit zum Sieben von Substanzen, die in der Lage sind, die Aktivität einer oder mehrerer Funktionen in vitro gemäß einer der Ausführungsformen des Verfahrens der Erfindung zu modifizieren.
  • In einer ersten Ausführungsform umfasst ein solches Kit Mittel zur Enthüllung der Funktion, eine RNA-Polymerase, Nukleotidsequenzen für die Vorbereitung der Nukleinsäuremoleküle, die das oder die Gene umfassen, die die Expression des oder der Proteine ermöglichen, die der aufgespürten und/oder quantifizierten Funktion entsprechen, die vier Triphosphat-Nukleotide, die für die genannte Vorbereitung notwendigen Mischungen für die Übertragung und die Übersetzung, eventuell Substanzen, eventuell Markierer.
  • In einer zweiten Ausführungsform umfasst ein Kit gemäß der Erfindung:
    • – eventuell Substanzen, die für die Vorbereitung der Nukleinsäuremoleküle notwendig sind, die das oder die Gene umfassen, die die Expression des oder der Proteine ermöglichen, die der aufgespürten und/oder quantifizierten Funktion entsprechen,
    • – jeden Träger, wie etwa eine Mikrotiterplatte oder einen Chip, der enthält: Mittel zur Enthüllung der Funktion, eine RNA-Polymerase, die vier Triphosphat-Nukleotide, die Übersetzungs- und Übertragungsmischungen, eventuell Markierer.
  • Die Kits und die Träger sind für das gleichzeitige oder nicht gleichzeitige Aufspüren und/oder das Messen einer Veränderung einer oder mehrerer Funktionen eines oder mehrerer Prozesse oder eines oder mehrerer Organismen denkbar.
  • Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist also ein Träger, der eine Reihe von Plätzen für die Anwendung der Methode der Erfindung aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass jede der besagten Stellen das Aufspüren und/oder das Messen einer Veränderung der Funktion ermöglicht.
  • Die zu siebende Substanz kann in den Vertiefungen vorhanden sein oder sie kann am Ende der Reaktion zugefügt werden.
  • Andere Vorteile und Merkmale der Erfindung erscheinen in den Ausführungsbeispielen der Erfindung, die folgen und die sich auf die Zeichnungen im Anhang beziehen, worin:
  • 1 eine Darstellung der Identifikation des Hemmers der Aspartatprotease des HIV-Virus durch das Verfahren der Erfindung ist;
  • 2 eine schematische Darstellung der Identifizierung des Hemmers der Proteinspleißung des RecA-Inteins von Mycobacterium tuberculosis durch das Verfahren der Erfindung ist;
  • 3 eine schematische Darstellung der Identifizierung der Suizid-Hemmer der beta-Lactamase durch das Verfahren der Erfindung ist;
  • 4, 5 und 6 den Vergleich der Empfindlichkeit und der Reproduzierbarkeit mehrerer Methoden zum Aufspüren einer Funktion gemäß dem Verfahren der Erfindung darstellen;
  • 7 die Wirkungen verschiedener Substanzen (0,4 μM Endvolumen) auf die Veränderung der Aktivität der beta-Lactamase TEM-1 darstellt;
  • 8 die Wirkungen verschiedener Substanzen (21,5 μM Endvolumen) auf die Veränderung der Aktivität der beta-Lactamase TEM-1 darstellt;
  • 9 die Charakterisierung der Resistenz eines Hemmers darstellt;
  • 10 die Wirkung der verschiedenen Substanzen (2,5 μM Endvolumen) auf die Veränderung der Aktivität der Protease des Virus HIV-1 bei t = 0 Min. und t = 180 Min. darstellt.
  • Beispiel I: Wirkungen der Substanzen A, B, C und D auf eine Funktion einer Probe
  • Die nachfolgenden Tabellen illustrieren die verschiedenen Ergebnisse, die durch das Verfahren der Erfindung auf einer Probe erhalten werden können, die eine Funktion umfasst. Das Messen der Signalveränderung erfolgt mit jeder Technik, die dem Fachmann bekannt ist. Die Signale werden nach ihrer Eigenschaft auf direkte oder nicht direkte Weise gemessen, wobei das Beisein eines Zuträgers notwendig sein kann oder nicht. Es ist denkbar, dass das (die) Signal(e) kontinuierlich zum Beispiel in kinetischer Form gelesen wird (werden).
  • Das Verfahren der Erfindung bietet also eine große Auswahl an Ausführungsformen, ausgehend von den Funktionen und den Mitteln, die angewendet werden, um sie zu enthüllen.
  • Unter Signalveränderung im Beisein einer Substanz ist zu verstehen (Tabelle 1):
    • – eine Erhöhung der Aktivität, die von der Menge der Substanz(en) abhängen kann oder nicht, die zugefügt wurde;
    • – eine Verringerung der Aktivität, die von der Menge der Substanz(en) abhängen kann oder nicht, die zugefügt wurde;
    • – eine Hemmung der untersuchten Aktivität, die von der Menge der Substanz(en) abhängen kann oder nicht, die zugefügt wurde.
    • 1) Die nachfolgende Tabelle 1 zeigt, dass es die Substanz A ermöglicht, die funktionelle Aktivität zu erhöhen. Je mehr A in großer Menge vorhanden ist, umso aktiver ist die Funktion. Tabelle 1
      Figure 00370001
    • 2) Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt, dass die Substanz B die gleiche Wirkung auf die Funktion hat, egal wie groß die Menge ist. Tabelle 2
      Figure 00380001
    • 3) Die nachfolgende Tabelle 3 zeigt, dass die Substanz C keinerlei Wirkung auf die Funktion hat. Hingegen hat die Substanz C oberhalb einer Schwelle von 2C eine negative Wirkung auf die Funktion. Tabelle 3
      Figure 00380002
    • 4) Die nachfolgende Tabelle 4 zeigt, dass die Substanz D die Funktion hemmt. Tabelle 4
      Figure 00380003
  • Beispiel II: Messen der Veränderungen der Aktivität der Funktionen 1 und 2 im Beisein einer Substanz.
  • Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es außerdem, die Wirkung einer Substanz auf eine oder mehrere Funktionen zu untersuchen. Denn eine Substanz ist geeignet, auf der aktiven Stelle von zwei verschiedenen Funktionen zu agieren. Das ist zum Beispiel der Fall bei bivalenten Ionenchelatbildern, wie IEDTA, die gleichzeitig die Metallproteasen und die Polymerasen hemmen (wobei diese zwei Enzyme bivalente Ionen benötigen, um zu funktionieren). Andererseits ist es auch möglich, dass die Wirkung einer Substanz auf eine Funktion sekundäre Stoffwechselprodukte induziert, die für die Veränderung der Aktivität einer oder mehrerer Funktionen verantwortlich sind. Die nachfolgenden Tabellen illustrieren diese verschiedenen Ergebnisse.
    • 1) Die nachfolgende Tabelle 5 zeigt, dass es die Substanz A ermöglicht, die Aktivität einer Funktion 1 zu erhöhen und die Funktion 2 zu hemmen. Tabelle 5
      Figure 00390001
    • 2) Die nachfolgende Tabelle 6 zeigt, dass es die Substanz A ermöglicht, die Aktivität einer Funktion 1 zu erhöhen, jedoch die der Aktivität 2 nur wenig. Dagegen gibt es eine Aktivierung der Funktion 2, sobald die Funktion 1 aktiviert ist. Aber im Beisein einer zu großen Menge an A, gibt es eine Überaktivierung von 1, was eine Hemmung von 2 induziert. Tabelle 6
      Figure 00400001
  • Beispiel III: Wirkungen einer Kombination von Substanzen auf eine Funktion einer Probe
  • Eine andere Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung besteht darin, mehrere Substanzen auf einer Funktion zu testen. Diese Substanzen können kombiniert oder bei jeder der Etappen des Verfahrens nacheinander zugefügt werden. Der Test mehrerer Substanzen auf eine Funktion wird es ermöglichen, zu bestimmen, ob diese Substanzen untereinander eine kooperative Wirkung oder eine antagonistische Wirkung haben, wenn sie untereinander konkurrierend oder komplementär sind. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es, alle möglichen Kombinationen von Substanzen auf eine oder mehrere Funktionen zu testen.
    • 1) Die nachfolgende Tabelle 7 zeigt, dass die Substanz A die funktionelle Aktivität erhöht. Die Substanz B hat keine Wirkung auf die Funktion. Das Substanzenpaar A und B erhöht die Aktivität der Funktion noch mehr als die Substanz A allein. Die Substanz B hat eine komplementäre oder kooperative Wirkung zur Substanz A. Tabelle 7
      Figure 00410001
    • 2) Die nachfolgende Tabelle 8 zeigt, dass die funktionelle Aktivität im Beisein der Substanz A allein oder der Substanzen A und B auf die gleiche Weise erhöht wird. Die Substanz B hat also keinerlei Wirkung auf die Funktion, wie es der funktionelle Test im Beisein der Substanz B allein zeigt. Tabelle 8
      Figure 00410002
    • 3) Die nachfolgende Tabelle 9 zeigt, dass die Substanzen A und B getrennt und das Paar der Substanzen A und B die Funktion hemmen. Tabelle 9
      Figure 00410003
    • 4) Die nachfolgende Tabelle 10 zeigt, dass die Substanzen A und B getrennt keine Auswirkung auf die Funktion haben, während das Paar der Substanzen A und B die Aktivität der Funktion erhöht. Tabelle 10
      Figure 00420001
  • Beispiel IV: Wirkungen einer Kombination von Substanzen auf eine oder mehrere Funktionen einer Probe
  • Die Veränderungen einer oder mehrere Funktionen, die im Beisein einer oder mehrerer Substanzen erhalten wurden, können untereinander verglichen werden, um die beste(n) Substanz(en) oder die beste Kombination von Substanzen sowie die beste Menge jeder Substanz zu bestimmen.
  • Das Verfahren der Erfindung kann also auch angewendet werden, um die verschiedenen galenischen Formen einer oder mehrerer Substanzen zu untersuchen. Nach der Identifikation einer oder mehrerer Substanzen, die in der Lage sind, die Aktivität einer oder mehrerer Funktionen zu modifizieren, werden diese Substanzen gebraucht, um ein Produkt zu behandeln. Die galenische Form der Substanz(en) wird für eine optimale Wirksamkeit der genannten Substanz(en) auf die Funktion(en) des oder der besagten Produkte bedeutsam sein. Aus diesem Grund können die Komponenten der galenischen Form der oder den genannten Substanzen im Verfahren der Erfindung zugefügt werden, um ihre Auswirkung auf die Veränderung der Aktivität einer oder mehrerer Funktionen zu studieren.
  • Beispiel V: Folgeüberwachung der Wirksamkeit einer oder mehrerer Substanz(en) auf eine oder mehrere Funktion(en) eines oder mehrerer Organismen oder Prozesse
  • Das Verfahren der Erfindung kann auch ermöglichen, das Verhalten einer oder mehrerer Funktionen im Beisein einer oder mehrerer Substanzen zu verfolgen.
  • In anderen Worten, es ermöglicht, die Wirksamkeit einer oder mehrerer Substanz(en) zu untersuchen (Tabelle 11). Indem eine oder mehrere Funktionen eines Organismus oder Prozesses einer oder mehreren Substanzen ausgesetzt werden, können Veränderungen der genannten Funktion(en) induziert werden, die dazu führen, dass sie nicht mehr das gleiche Verhalten gegenüber einer oder mehreren Substanzen haben. Indem eine oder mehrere Funktionen durch eine oder mehrere Substanzen behandelt werden, werden sie auf gewisse Weise einem Selektionsdruck ausgesetzt. Diese Funktion(en) können zum Beispiel tolerant gegenüber einer oder mehreren Substanzen werden, oder sie können Resistenzphänomene aufweisen. So kann die Wirkung einer Behandlung einer oder mehrerer Funktionen eines Organismus oder Prozesses mit einer oder mehreren Substanzen durch das Verfahren der Erfindung getestet werden, indem deren Aktivitätsveränderung für eine oder mehrere Funktionen im Beisein der genannten Substanz(en) gemessen wird. Diese besondere Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung wird es auch ermöglichen, die Toxizität einer oder mehrerer Substanzen auf eine oder mehrere Funktionen eines Organismus oder Prozesses zu evaluieren.
  • Es handelt sich also zum Beispiel um ein Folgeüberwachung der Entwicklung einer (oder mehrerer) Funktionen, wenn sie dem Beisein einer (oder mehrerer) Substanzen ausgesetzt sind.
  • Die nachfolgende Tabelle 11 illustriert diese Art von Ergebnis auf die Toxizität einer Substanz A auf die Funktionen 1 und 2. Die Tabelle 11 zeigt, dass eine gleiche Substanz A die Aktivität einer Funktion 1 im Zeitraum t erhöht hat, die sich im Zeitraum t + 1 weiter erhöht. Dagegen hat die Substanz A im Zeitraum t + 2 ihre Wirksamkeit auf die Funktion 1 verloren. Die Funktion 1 wird also im Laufe der Zeit weniger empfindlich gegenüber der Wirkung der Substanz A. Tabelle 11 zeigt auch, dass die Substanz A im Laufe der Zeit eine Funktion 2 immer stärker hemmt.
  • Tabelle 11
    Figure 00440001
  • Das Verfahren der Erfindung ermöglicht also, die Wirksamkeit der besten Substanz(en) in einem Zeitraum zu bewerten, die in der Lage ist (sind), die Aktivität(en) der genannten Funktion(en) am besten variieren zu lassen.
  • Beispiel VI: Hochproduktives Sieben von Hemmern der Aspartatprotease
  • Unter den viralen Proteinen, die im Multiplikationszyklus des HIV-Virus notwendig sind, muss die Aspartatprotease hervorgehoben werden, die als Ziel in verschiedenen antiviralen Therapien (wie zum Beispiel der Dreifachtherapie) gebraucht wird. Die Suche nach wirksamen Hemmern der Aspartatproteasen wird angesichts der Anpassung des Virus an Hemmer stark ausgeweitet: 6 Wochen nach dem Beginn einer Therapie mit einem Hemmer der HIV-1-Protease (Indinavir) werden gegenüber dem Hemmer resistente Isolate aufgespürt. Sie äußern sich unter anderem durch eine Mutation auf der Ebene des Restes V82A/F/T der HIV-1-Protease (4). Ziel der verschiedenen pharmazeutischen Labore ist es also, ein System zum hochproduktiven Sieben zu entwickeln, um neue Hemmer der Aspartatprotease zu finden.
  • Der folgende Siebtest auf neue Hemmer der Apartatprotease (HIV) beruht auf dem Verfahren der Erfindung. Das Zielgen, das für die wilde Aspartatprotease des HIV kodiert, wird unter die Kontrolle des Initiators und des Terminators der RNA-Polymerase des Phagen T7 gestellt, was es ermöglicht, das entsprechende Protein in vitro zu übertragen und zu übersetzen.
  • Das in Etappe (d) gebrauchte Zuträgermolekül ist ein Peptid, das spezifische Schnittstellen der HIV-Protease enthält. Dieses Peptid ist jeweils am N- und C-Ende an ein fluoreszierendes Molekül (wie zum Beispiel das Fluorescein) kovalent gebunden und an einen Quencher des letzteren (wie zum Beispiel Rhodamin).
  • Das in Etappe (a) vorbereitete Gen wird in verschiedene Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gesetzt. Die entsprechenden Vertiefungen sind mit einer konzentrierten, gekoppelten Übertragungs- und Übersetzungsreaktionsmischung beladen (Komponenten, die für die Übertragung und die Übersetzung notwendig sind), die das Zuträgermolekül enthält. Die entsprechenden Platten werden schnell eingefroren, um die vorzeitige Initiierung der Übertragungs- und Übersetzungsreaktion zu verhindern. Diese Übertragungs- und Übersetzungsreaktion kann entweder mit einem zellulären Übersetzungsextrakt von E. coli oder mit einem Übersetzungsextrakt eukaryotischer Zellen durchgeführt werden. Der gewählte Übersetzungsextrakt hängt von der Art der gebrauchten Anfangsstücke in (a) ab, mit oder ohne Anbringungsort der Ribosome. Die gefrorenen Platten werden in einen Automaten gegeben, der in jeder Vertiefung ein Volumen der zu testenden Substanz(en) gibt, wobei es ermöglicht wird, die Übertragungs- und Übersetzungsmischung so zu verdünnen, bis sie ein Mal konzentriert ist.
  • Wenn diese Substanz als Hemmer der Proteinziele aktiv ist, dann hindert sie die Aspartatprotease des HIV daran, das Zuträgermolekül anzugreifen. Das Fluorescein und das Rhodamine befinden sich also in einer ausreichend nahen Umgebung, um einen Energietransfer vom Typ FRET (Fluorescence Resonance Energy of Transfert) zu gewährleisten. Nachdem das Zuträgerpeptid einer gegebenen Wellenlänge exponiert wurde (etwa 490 nm), wird nur das Fluoreszenzrot des Quenchers auf spürbar sein.
  • Wenn die getestete Substanz nicht in der Lage ist, die Aspartatprotease zu hemmen, wird das Zuträgerpeptid gespalten. Das Fluorescein und das Rhodamin sind dann zu weit entfernt, um einen Energietransfer zu gewährleisten. Nachdem die Spaltungsprodukte einer gegebenen Wellenlänge exponiert wurden (etwa 490 nm), ist nur das Fluoreszenzgrün aufspürbar.
  • Wenn eine die Aspartatprotease hemmende Substanz entdeckt wird, wird ein Spezifitätskontrolltest durchgeführt, indem diese Substanz in einer Übertragungs- und Übersetzungsreaktion inkubiert wird, die die Expression eines anderen Zuträgergens (Typ GFP) ermöglicht, um zu verifizieren, dass diese Substanz nicht tatsächlich ein Hemmer der Übertragung oder der Übersetzung ist.
  • Jedes Mal, wenn ein neuer Hemmer der Protease entdeckt wird, wird eine Reihe von komplementären Tests auf den Übertragungs- und Übersetzungsreaktionen durchgeführt, die die Expression der Proteasen ermöglicht, die gegen die Anti-Proteasen resistent sind. So kann die entdeckte Substanz schnell charakterisiert werden, um festzustellen, ob sie in der Lage ist, die Proteasen der Virusstämme zu hemmen, die gegenwärtig gegen Anti-Proteasen resistent sind.
  • Eine schematische Darstellung des Verfahrens der Erfindung findet sich in 1.
  • Beispiel VII: Hochproduktives Sieben nach einem Hemmer des Proteinspleißens des RecA-Inteins von Mycobacterium tuberculosis
  • Davis et al., (1992) zeigen, dass die Exzision des RecA-Inteins von Mycobacterium tuberculosis für die Aktivität dieses Proteins unabdingbar ist (1). Die Inteine sind Proteinintrone, die kürzlich im Innern von Proteinsequenzen entdeckt wurden. Sie besitzen die gesamte Information, die für ihre eigene Exzision notwendig ist. Dieser kürzlich identifizierte Prozess ist mit dem Spleißen der Prämessenger-RNA vergleichbar. So wird herkömmlich die interne Proteinsequenz Intein genannt, und die beiden externen Sequenzen Exteine (3). Dieses Phänomen der spezifischen Proteinexzision ist sehr schnell. Diese Inteine wurden in sehr unterschiedlichen Gengruppen entdeckt, und sie sind gleichzeitig bei den Prokaryoten und den Eukaryoten vorhanden.
  • Das Protein RecA von Mycobacterium tuberculosis enthält ein solches Element. Andere pathogene Mycobacterien können eine solche Sequenz in RecA besitzen, wie das Mycobacterium leprae. Dennoch unterscheiden sich diese beiden Proteinintrone im Hinblick auf ihre Größe, die Sequenz und ihre Lokalisierung, was sie sehr spezifisch macht (2).
  • Indem das Proteinspleißen des Inteins von Mycobacterium tuberculosis gehemmt wird, wird die Aktivität des Proteins RecA und damit die Multiplikation dieses pathogenen Organismus gehemmt. Im vorliegenden Fall stellt die Hemmung des Spleißens einen neuen Therapieweg gegen die Multiplikation der für die Tuberkulose verantwortlichen Bakterie dar. Nur ein In-vitro-Test wie der vorgeschlagene, ermöglicht es, die Hemmung eines Phänomens des Proteinspleißens zu analysieren, das zu schnell geht, um in vivo analysiert zu werden.
  • Ein System des Siebens der Spleißhemmer des RecA-Inteins von Mycobacterium tuberculosis wird entwickelt. Der vorgeschlagene Test beruht auf dem Verfahren der Erfindung und besteht darin, das Gen in vitro zu exprimieren, das für ein Zuträgergen wie das GFP kodiert, in dessen Inneres das Intein des RecA-Gens von Mycobacterium tuberculosis inseriert wurde. Vor jeder Expressionsreaktion wird eine Substanz einer pharmakologisch interessanten Bank der Übertragungs- und Übersetzungsmischung zugefügt. Wenn diese Substanz als Hemmer aktiv ist, verhindert sie das Spleißen des Inteins nach der Übersetzung, was die Expression des reifen GFP hemmt. Wenn diese Substanz dagegen inaktiv ist, kann die Aktivität des GFP aufgespürt werden (2).
  • Für jede Substanz, die eine das Inteinspleißen hemmende Aktivität aufweist, kann mit einem zweiten Test verifiziert werden, ob diese Substanz spezifisch ist. Dieser zweite Test besteht darin, die genannte Substanz in einer Übertragungs- und Übersetzungsmischung zu inkubieren, die das Gen gfp ohne jedes Intein enthält, und zu verifizieren, ob das Gen im Beisein dieser Substanz übertragen und übersetzt werden kann.
  • Die Automatisierung dieses Siebens kann unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie zuvor beschrieben.
  • Die so aufgespürten Substanzen können auf anderen Inteinen getestet werden, die in einem gegebenen Prozess von Interesse sind.
  • Beispiel VIII: Hochproduktives Sieben von beta-Lactamase-Hemmern
  • Die beta-Lactamine (Penicilline und Cephalosporine) stellen in der anti-infektiösen Therapie die am häufigsten gebrauchte Klasse von Antibiotika dar. Seit diese Moleküle in die Therapie eingeführt wurden, haben sich neue Resistenzen gegen diese Verbindungen entwickelt. Unter den verschiedenen Resistenzmechanismen, die von den resistenten Keimen erworben wurden, besteht der wichtigste darin, ein Enzym (vom Typ beta-Lactamase) herzustellen, das in der Lage ist, das Antibiotikum-Molekül zu hydrolysieren, noch bevor dieses wirken konnte. Als Folge des weltweiten und intensiven Gebrauchs von Antibiotika ist die Geschwindigkeit, in der neue Resistenzen auftauchen gegenwärtig höher als die Entdeckung neuer Antibiotika. Andererseits gibt es auf dem Markt nur wenige „Suizid"-Hemmer der beta-Lactamasen (Clavulansäure (in Verbindung mit Amoxicillin in Augmentin), Sulbactam und Tazobactam), und schon konnten Resistenzen gegen diese neuen Verbindungen im Krankenhausumfeld identifiziert werden. Ziel ist es also, ein hochproduktives System des Siebens zu entwickeln, um neue Hemmer für die beta-Lactamase TEM-1 zu finden.
  • Das Sieben nach neuen Suizid-Hemmern besteht darin, eine Übertragungs- und Übersetzungsreaktion durchzuführen, die die Expression der beta-Lactamase TEM-1 ermöglicht. Das Gen bla ist unter der Kontrolle der Initiator- und Terminator-Sequenzen der RNA-Polymerase des Phagen T7. Nach dieser Übertragungs- und Übersetzungsreaktion wird der Reaktionsmischung eine Substanz zugefügt, die aus einer pharmakologisch interessanten Molekülbank hervorgegangen ist. Wenn diese Substanz als Hemmer der beta-Lactamase aktiv ist, hemmt sie die katalytische Aktivität des Enzyms. Im anderen Fall wird eine aktive beta-Lactamase hergestellt. Die Aktivität der beta-Lactamase wird dann mittels eines chromogenen Substrats der beta-Lactamase: dem Nitrocephin, evaluiert.
  • Die Automatisierung dieses Siebens kann unter den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, die zuvor beschrieben wurden.
  • Wenn eine hemmende Substanz identifiziert wurde, wird eine Reihe von komplementären Tests durchgeführt, um die Wirksamkeit des entdeckten Moleküls bei der Gesamtheit der Mutanten der beta-Lactamase zu testen, die als resistent gegenüber Hemmern bekannt sind. Aus diesem Grund wird die Aktivität der verschiedenen Varianten dieser beta-Lactamase, die in vitro gemäß dem Verfahren der Erfindung exprimiert sind, im Beisein der hemmenden Substanz evaluiert, und der Test der Aktivität dieser beta-Lactamasen wird dann, wie oben beschrieben, durchgeführt.
  • Beispiel IX : Vergleich mehrerer funktioneller Tests, die im Verfahren gemäß der Erfindung angewendet werden
  • 1) Vergleich mehrerer funktioneller Tests
  • Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es, die Empfindlichkeit und die Reproduzierbarkeit mehrerer Arten funktioneller Tests in einer sehr kurzen Zeit zu vergleichen. In diesem Versuch wurde die beta-Lactamase TEM-1 in vitro exprimiert, unter Verwendung von 0,5 μg mRNA dieses Gens und indem dieses Enzym, wie von Zubay beschrieben, in einem Endvolumen von 100 μl übersetzt wurden.
  • a) Test 1: Dosierung der Hydrolyse des Nitrocephins
  • Verschiedene Volumen (5, 10, 15, 20, 25, 30 μl) dieser Übersetzungsmischung wurden bei 37°C in einem Endvolumen von 250 μl des Nachweispuffers für die Aktivität inkubiert (Endkonzentration: NaP 40 mM, pH-Wert 7.0, 100 μg/ml Nitrocephin und 0,25 mM DMSO). Die Reaktion wurde mittels Spektrophotometrie bei 486 nm verfolgt, und die erhaltenen Aktivitätswerte wurden im Prozentanteil der erhaltenen Maximalaktivität ausgedrückt. Diese Messungen wurden in dreifacher Ausführung gemacht, um die Reproduzierbarkeit der Nachweistechnik zu evaluieren.
  • b) Test 2 : Dosierung der Hydrolyse von Ampicillin mittels direkter Enthüllung
  • Verschiedene Volumen (5, 10, 15, 20, 25, 30 μl) der Übersetzungsmischung wurden bei 37°C in einem Endvolumen von 250 μl des Nachweispuffers für die Aktivität inkubiert (Endkonzentration: NaP 35 mM, pH-Wert 7,5, und 160 μg/ml Ampicillin). Die Reaktion wurde mittels Spektrophotometrie bei 235 nm verfolgt, und die erhaltenen Aktivitätswerte als Prozentsatz der erhaltenen Maximalaktivität ausgedrückt. Diese Messungen wurden in dreifacher Ausführung gemacht, um die Reproduzierbarkeit der Nachweistechnik zu evaluieren.
  • c) Test 2: Dosierung der Hydrolyse von Ampicillin mittels Enthüllung durch Fluoreszenz
  • (Chen K.C. et Holmes K.K., 1986, Enhancement of fluorescence development of end products by use of a fluorescence developer solution in a rapid and sensitive fluorescent spot test for specific detection of microbial beta-lactamases, J. Clin. Microbiol., 23(3), 539-544).
  • Verschiedene Volumen (5, 10, 15, 20, 25, 30 μl) der Übersetzungsmischung wurden bei 25°C 15 Minuten lang in einem Endvolumen von 210 μl des Puffers I inkubiert (Endkonzentration: 200 μg/ml Ampicillin). 40 μl des Nachweispuffers II wurden zugefügt (Puffer II: Natriumtartrat 0,78 M, pH-Wert 4,5, Formaldehyd 12 %), und die Reaktion wurde 10 Minuten lang bei 45°C inkubiert. Das Ablesen erfolgte mittels Fluorometrie mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und einer Emissionswellenlänge von 430 nm, und die erhaltenen Aktivitätswerte wurden als Prozentsatz der erhaltenen Maximalaktivität ausgedrückt. Diese Messungen wurden in dreifacher Ausführung gemacht, um die Reproduzierbarkeit der Enthüllungstechnik zu evaluieren. Ein Markierer wurde ohne Enzym erstellt.
  • d) Schlussfolgerungen
  • 4, 5 und 6 illustrieren den Vergleich der Empfindlichkeit und der Reproduzierbarkeit mehrerer Methoden zum Aufspüren einer Funktion.
  • 4 zeigt an, dass der Aktivitätstest 2 (Ampicillin) es nicht ermöglicht, die Aktivität des Enzyms zu enthüllen, unabhängig von dessen Konzentration. Dagegen kann mit den Tests 1 und 3 ein Signal erhalten werden, das mit dem Übersetzungsvolumen korreliert ist, das im Test zugefügt wird. Andererseits scheint der Aktivitätstest 3 (Fluoreszenz) bei geringeren Enzymkonzentrationen weniger empfindlich zu reagieren als der Aktivitätstest 1 (Nitrocephin). Aber die 5 und 6 zeigen an, dass der Test 3 besser reproduzierbar ist als der Test 1. Der Test 3 kann also als Test der Wahl erachtet werden, um die Aktivität dieser beta-Lactamase-Funktion zu messen.
  • Das Verfahren der Erfindung ermöglicht also, in sehr kurzer Zeit die Empfindlichkeit mehrerer Methoden zum Aufspüren einer Funktion zu testen und zu validieren. Diese Art von Einsatz ist besonders interessant im Rahmen der Entwicklung eines Systems des Siebens, das häufig einen Empfindlichkeitstest benötigt, der so genau und so reproduzierbar wie möglich ist, um die Veränderung einer Funktion mit diesem Test aufzuspüren, wenn eine Substanz zugegeben wird.
  • 2) Molekulares Sieben von Substanzen, deren Aktivität sich auf ein Ziel auswirken könnte
  • a) Sieben neuer TEM-1-Hemmer
  • Die β-Lactamine (Penicilline und Cephalosporine) stellen die am häufigsten gebrauchte Klasse von Antibiotika bei der anti-infektiösen Therapie dar. Seit diese Moleküle in die Therapie eingeführt wurden, haben sich neue Resistenzen gegen diese Verbindungen entwi ckelt, die die Ausbreitung von nosokomialen Infektionen begünstigen. Unter den verschiedenen Resistenzmechanismen, die von den Keimen erworben wurden, besteht einer der wichtigsten darin, ein Enzym (β-Lactamase TEM-1 zum Beispiel für gewisse Enterobakterien oder beta-Lactamase PSE für Pseudomonas qeruginosa) herzustellen, das in der Lage ist, das Antibiotikum zu hydrolysieren, noch bevor es wirken konnte. Es existieren einige β-Lactamase-Hemmer, die zusammen mit einem Antibiotikum gebraucht werden, aber in dem Maße, in dem sie gebraucht wurden, tauchten neue Formen von β-Lactamasen auf, die gegen diese Hemmer resistent waren.
  • Ein Sieben neuer Hemmer für beta-Lactamase TEM-1 wurde mit dem Verfahren der Erfindung durchgeführt. Dieses Enzym wurde in vitro, wie von Zubay beschrieben, unter Verwendung von 300 μg mRNR in einem Endvolumen von 5 ml Übersetzungsmedium exprimiert. Jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte wurde mit 5 μl einer Lösung eines potenziellen Hemmers (darunter Clavulansäure und Sulbactam) gefüllt, damit dieser Hemmer in einer Konzentration von 0,4 μM im Endvolumen des Tests vorhanden ist. Dann wurden 3 μl der Übersetzungsmischung jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte zugefügt, und die Mischung wurde 3 Minuten lang bei 25°C inkubiert. Das Volumen wurde dann mit 58 μl einer Enthüllungslösung vervollständigt (Endkonzentration: NaP 40 mM, pH-Wert 7,0, 100 μg/ml Nitrocephin und 0,25 mM DMSO). Die Reaktion wurde mittels Spektrophotometrie bei 486 nm verfolgt. Es wurden drei Markierer durchgeführt: einer ohne Übersetzungsextrakt (also ohne Enzym), einer nur mit dem Substrat und einer ohne jeden potenziellen Hemmer.
  • Aus 7 geht hervor, dass nur die Substanz, die der Vertiefung E2 zugefügt wurde, die Aktivität der beta-Lactamase TEM-1 gehemmt hat.
  • Aus der Messung der Restaktivität der Vertiefung E2 und aus dem Vergleich mit dem Markierer ohne Hemmer, geht hervor, dass dieser potenzielle Hemmer #1 (bei dem es sich in der Tat um Clavulansäure handelt) die TEM-1-Aktivität um 52 % verringert.
  • Ein ähnlicher Versuch wurde mit einer Endkonzentration an potenziellen Hemmern von 21,5 μM durchgeführt. Nun geht aus 8 hervor, dass der potenzielle Hemmer #1 immer noch aktiv ist und ein neuer potenzieller Hemmer #2 in der Vertiefung B12 enthüllt wird. Eine Dosierung der Restaktivität in den Vertiefungen E2 und B12 zeigt an, dass der Hemmer #1 bei 21,5 μM die Aktivität von TEM-1 um 80 % verringert, im Vergleich mit 73 % für den Hemmer #2 (bei dem es sich tatsächlich um Sulbactam handelt).
  • Nach dieser ersten Art des Siebens ist es denkbar, den oder die potenziellen Hemmer auf äquivalenten Zielen (zum Beispiel andere beta-Lactamasen) oder auf Mutanten des ursprünglichen Ziels (Mutanten der beta-Lactamase TEM-1, die gegen die beta-Lactamase-Hemmer resistent sind) zu charakterisieren.
  • Diese Charakterisierung wurde für den potenziellen Hemmer #1 (der gemäß der oben angeführten Versuche am wirksamsten war) auf zwei Mutanten der beta-Lactamase TEM-1 durchgeführt, die als resistent gegen einen beta-Lactamase-Hemmer beschrieben werden. Zu diesem Zweck wurden 5 μl einer Übersetzungsmischung, die entweder das wilde Enzym oder einen der zwei Mutanten exprimiert, getrennt bei 25°C 3 Minuten lang in einem Endvolumen von 500 μl des Puffers I inkubiert (Endkonzentration: NaP 50 mM, pH-Wert 7,0, 1,5 μM des potenziellen Hemmers #1). Dann wurden 100 μg/ml Nitrocephin und 0,25 mM Endvolumen DMSO zugefügt und die Reaktion wurde mittels Spektrophotometrie bei 486 nm verfolgt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden als Prozentsatz der Maximalaktivität ausgedrückt, die am Enzym bei Abwesenheit des Hemmers gemessen wurde.
  • 9 zeigt an, dass unter diesen Bedingungen, das wilde Enzym TEM-1 um 87% gehemmt ist, während die zwei Mutanten ihre jeweilige Restaktivität von 26 bzw. 35 % bewahren. Wenn es scheint, dass der Hemmer #1 gegen das wilde Enzym wirksam ist, erweist sich, dass er es gegen Enzyme, die bereits gegen einen beta-Lactamase-Hemmer resistent sind, nicht ist.
  • Dieser Versuch ist mit jeder anderen Art von Ziel (Protease des HIV-Virus, Rezeptoren usw.) durchführbar. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es also, schnell ein Sieben auf molekularer Ebene von Substanzen einzusetzen, die in der Lage sind, die Aktivität eines Ziels zu modifizieren, und dann die Ergebnisse auf äquivalenten Zielen zu validieren.
  • b) Sieben neuer Hemmer der Protease des HIV-1-Virus
  • Ein Sieben neuer Hemmer für die Protease des HIV-Virus wurde mit dem Verfahren der Erfindung durchgeführt. Dieses Enzym wurde in vitro, wie von Zubay beschrieben, unter Verwendung von 150 μg mRNA in einem Endvolumen von 1 ml Übersetzungsmedium exprimiert. Jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte wurde mit 60 μl einer Mischung, die 10 μl der Übersetzungsmischung, 30 μl Puffer (2 M NaCl, 12 mM EDTA, 200 mM Natriumacetat, 2 mM DTT und 20% DMSO), 1 μl bei 600 μM des Peptidsubstrats BACHEM M 1865 (Peptid DABCYL-_-Abu-Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Val-Gln-EDANS) und 2,5 μM Endvolumen der verschiedenen potenziellen Hemmer gefüllt. Eine Eigenschaft dieses Peptids FRET ist es, Fluoreszenz freizusetzen, wenn es durch die Protease des HIV-Virus gespalten wird. Eine Substanz, die die Aktivität der HIV-Protease nicht hemmt, ist also durch das Entstehen eines fluoreszierenden Signals gekennzeichnet, wenn die Vertiefung UV-Strahlung exponiert wird. Es wurden drei Markierer durchgeführt: einer ohne Übersetzungsextrakt (also ohne Enzym), einer nur mit dem Substrat und einer ohne jeden potenziellen Hemmer.
  • Aus 10 geht hervor, dass nur die Substanz, die der Vertiefung E8 (Pepstatin A) zugefügt wurde, die Aktivität der HIV-Protease gehemmt hat.
  • Das Verfahren der Erfindung ermöglicht also die sehr einfache Durchführung des Siebens in vitro einer Substanz, die in der Lage ist, die Aktivität einer Funktion zu modifizieren.
  • Diese Versuche sind mit jeder anderen Art von Ziel (Protease des HIV-Virus, Rezeptoren usw.) durchführbar. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es also, schnell ein Sieben auf molekularer Ebene von Substanzen einzusetzen, die in der Lage sind, die Aktivität eines Ziels zu modifizieren, und dann die Ergebnisse auf äquivalenten Zielen zu validieren.
  • LITERATURSTELLEN
    • 1 – Davis, E.O., Jenner, P.J., Brooks, P.C., Colston, M.J., Sedgwick, S.G. (1992). Protein epissage in the maturation of M. tuberculosis RecA protein. A mechanismm for tolerating a novel class of intervening sequence. Cell 71, 201-210.
    • 2 – Davis, E.O., Thangaraj, H.S., Brooks, P.C. et Colston, M.J. (1994). Evidence of selection for protein introns in the recAs of pathogenic mycobacteria. EMBO J. 13 (4), 699-703.
    • 3 – Perler, F.B., Davis E.O., Dean, G.E., Gimble, F.S., Jack, W.E., Neff, N., Noren, C.J., Thorner, J. et Belfort, M. (1994). Protein epissage elements : inteins and exteins – a definition of terms and recommended nomenclature. Nucl. Acids Research 22, 1125-1127.
    • 4 – Vasudevachari, M.B., Zhang, Y.M., Imamichi, H., Imamichi, T., Falloon, J. et Salzman, N.P. (1996). Emergence of protease inhibitor resistance mutations in human immunodeficiency virus type 1 isolates from patients and rapid screening procedure for their detection. Antimicrob Agents Chemother 40 (11), 2535-2541.
    • 5 – Chen K.C. et Holmes K.K., 1986, Enhancement of fluorescence development of end products by use of a fluorescence developer solution in a rapid and sensitive fluorescent spot test for specific detection of microbial beta-lactamases, J. Clin. Microbial., 23(3), 539-544.
    • 6 – Gurevich V.A., Pokrovskaya I.D., Obukhova T.A. et Zozulya S., 1991, Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 polymerases, Anal. biochem., 195, 207-213
    • 7 – Zubay G., 1973, In vitro synthesis of protein in microbial systems, Ann. Rev. Genet., 7, 267-287

Claims (25)

  1. Verfahren des Siebens einer Substanz fähig zu modifizieren die bekannte Funktion eines oder mehrerer Proteine, charakterisiert dadurch dass sie enthält die folgenden Etappen: a) die Vorbereitung von wenigstens einem Molekül Nukleinsäure enthaltend den oder die Gene kodierend für ein oder mehrere Proteine und Varianten besagter Proteine aufweisend besagte Funktion und die Kontrollelemente notwendig zur Übertragung und zur Übersetzung des oder der Gene, b) die Übertragung in vitro in ein azelluläres System des oder der in Etappe (a) vorbereiteten Nukleinsäuremoleküle, c) die Übersetzung in vitro in ein azelluläres System des oder der in Etappe (b) vorbereiteten Übertragung(en), d) die Aufspürung und/oder die Messung der Veränderung von besagter Funktion bekannt bei den Proteinen oder Varianten besagter Proteine hergestellt bei Etappe (c) im Beisein und bei Abwesenheit besagter Substanz, das azelluläre System der Etappen (b) und (c) nicht enthaltend besagte Funktion oder wenn sie sie enthält ist sie nicht auf spürbar unter den Bedingungen des Aufspürens und/oder der Messung, e) die Bestätigung auf Varianten der Substanzen erzeugend eine Veränderung besagter Funktion.
  2. Verfahren des Siebens nach Anspruch 1, charakterisiert dadurch dass besagte Funktion eine enzymatische Aktivität ist.
  3. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche, charakterisiert dadurch dass besagte Substanz ausgewählt ist aus Polynukleotiden, Peptiden, Proteinen, Ionen, Molekülen oder natürlichen oder synthetischen chemischen Zusammensetzungen, Hormonen, aromatischen Zusammensetzungen, Antikörper, Fragmente von Antikörpern, Genen, Zellrezeptoren, Aminosäuren, Glykopeptiden, Lipiden, Glykolopiden, Zucker, Polysacchariden.
  4. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche, charakterisiert dadurch dass besagte Substanz entspricht einer oder mehreren Serienköpfen.
  5. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche, charakterisiert dadurch dass besagte Substanz hemmend ist für die bekannte Funktion.
  6. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche, charakterisiert dadurch dass besagte Substanz ein antivirales Mittel ist.
  7. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 6, charakterisiert dadurch dass die Vorbereitung von einem oder mehreren Molekülen Nukleinsäure der Etappe (a) darin besteht unter Kontrolle zu bringen den oder die Gene welche für das oder die besagten Proteine kodiert: – für die Übertragung eines Initiators (in 5') und eventuell eines Terminators einer RNS Polymerase (in 3'), – für die Übersetzung eines Anbringungsortes der Ribosome oberhalb des oder der Gene.
  8. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 7, charakterisiert dadurch dass die Etappe (a) darin besteht vorzubereiten das oder die Nukleinsäuremoleküle durch eine Verstärkungsreaktion des oder der Gene kodierend für das oder die besagten Proteine.
  9. Verfahren des Siebens nach Anspruch 8, charakterisiert dadurch dass die Etappe (a) darin besteht vorzubereiten das oder die Nukleinsäuremoleküle durch eine Verstärkungsreaktion vom Typ PCR oder NASBA des oder der Gene kodierend für das oder die besagten Proteine, mit Hilfe eines oder mehreren Paaren von Anfangsstücken, jedes bestehend: – für das Anfangsstück Richtung, der Sequenz die sich hybridiert oberhalb eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle beinhaltend den oder die Gene kodierend für das oder die besagten Proteine, und einen Initiator von RNS Polymerase und eventuell einem Anbringungsort der Ribosome, und – für das Anfangsstück Gegenrichtung, der Sequenz die sich hybridiert unterhalb eines oder mehrerer Nukleinsäuremoleküle beinhaltend den oder die Gene kodierend für das oder die besagten Proteine, und eventuell einem Terminator von RNS Polymerase.
  10. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche, charakterisiert dadurch dass besagte Funktion entspricht einer Menge von Proteinzielen deren Gene kodierend für diese Proteine situiert sind auf demselben DNS Fragment wie im Falle eines Operons, oder an verschiedenen Stellen der DNS.
  11. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 10, charakterisiert dadurch dass die Etappe (a) darin besteht vorzubereiten ein Nukleinsäuremolekül enthaltend die Gene (das Operon) kodierend für die Proteine, in 5' der Gesamtheit der besagten Gene (des Operons) einen Initiator von RNS Polymerase, eventuell in 3' der Gesamtheit der besagten Gene (des Operons) einen Terminator von RNS Polymerase, und für jeden der besagten Gene seinen natürlichen Anbringungsort der Ribosome.
  12. Verfahren des Siebens nach Anspruch 11, charakterisiert dadurch dass man gebraucht bei der Etappe (c) ein Übersetzungsextrakt vorbereitet ausgehend von dem Organismus woher stammt der oder die Zielgene oder eines phytogenetisch nahen Organismus.
  13. Verfahren des Siebens nach einem der Ansprüche 1 und 10, charakterisiert dadurch dass die Etappe (a) darin besteht vorzubereiten ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle enthaltend die Gene kodierend für die Proteine, in 5' eines jeden der besagten Gene ein Initiator von RNS Polymerase und ein Anbringungsort der Ribosome, und eventuell 3' von jedem der besagten Gene ein Terminator von RNS Polymerase.
  14. Verfahren des Siebens nach Anspruch 13, charakterisiert dadurch dass der Anbringungsort der Ribosome der natürliche Ort eines jeden Genes sein kann oder ein anderer Anbringungsort der Ribosome besser angepasst an die Etappe (c) des Übersetzens.
  15. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche, charakterisiert dadurch dass die besagten Proteine Varianten eines Proteins sind oder Varianten einer Menge von Proteinen.
  16. Verfahren des Siebens nach einem der Ansprüche 1 bis 15, charakterisiert dadurch dass das Aufspüren und/oder das Messen der Veränderung der Funktion des oder der Proteine hergestellt bei Etappe (c) oder der Substanz hergestellt bei der Etappe (d) durch einen funktionellen Test anwendend das Gegenwärtigsein bei einer der Etappen (a), (b), (c) oder (d) eines oder mehrerer Zuträgermoleküle erlaubend aufzuspüren und/oder zu messen die Aktivität besagter Proteine.
  17. Verfahren des Siebens nach Anspruch 16, charakterisiert dadurch dass das Zuträgermolekül ein Molekül ist fähig zu enthüllen direkt oder indirekt die Aktivität eines oder mehrerer besagter Moleküle.
  18. Verfahren des Siebens nach Anspruch 17, charakterisiert dadurch dass das Zuträgermolekül ein Molekül ist das hergestellt wird in der Etappe (c) gemeinsam mit dem oder den besagten Proteinen.
  19. Verfahren des Siebens nach Anspruch 18, charakterisiert dadurch dass der Gen kodierend für das Zuträgermolekül unter Kontrolle gestellt wird von Regelsequenzen der Übertragung und der Übersetzung ähnlich wie jene des oder der Gene kodierend für das oder die besagten Proteine, auf solche Weise dass der Zuträgergen zusammen ausgedrückt wird mit dem oder den besagten Genen.
  20. Verfahren des Siebens nach Anspruch 16, charakterisiert dadurch dass das oder eines der Proteine hergestellt in Etappe (c) auch ein Zuträgermolekül bilden.
  21. Verfahren des Siebens nach einem der Ansprüche 1 bis 19, charakterisiert dadurch dass besagte Substanz eingeführt wird vor oder während wenigstens einer der Etappen (b) bis (d).
  22. Verfahren des Siebens nach einem der vorangehenden Ansprüche, charakterisiert dadurch dass nach der Messung und/oder der Aufspürung einer Veränderung einer Funktion, man überprüft das besagte Substanz nicht hemmt die Übertragung und die Übersetzung in vitro in einem azellulären Proteinsystem.
  23. Kit für die Anwendung einer Verfahren des Siebens einer Substanz fähig zu modifizieren die Aktivität einer Funktion bekannt nach einem der vorangehenden Ansprüche, charakterisiert dadurch dass er enthält: – eine RNS Polymerase, nukleotide Sequenzen für die Vorbereitung der Nukleinsäuremoleküle enthaltend den oder die Gene erlaubend den Ausdruck des oder der Proteine beinhaltend besagte Funktion, sowie Varianten des besagten oder der besagten Proteine, die vier Triphosphat Nukleotide, – die nötigen Mischungen zu besagter Vorbereitung, für die Übertragung und die Übersetzung nicht enthaltend besagte Funktion oder sie enthaltend aber dann ist sie nicht auf spürbar in den Bedingungen des Aufspürens und/oder der Messung, – wenigstens eine Substanz geeignet die Aktivität der bekannten Funktion zu verändern, – eventuell Markierer die so genannte Funktion die sowie Varianten der so genannten oder der so genannten Proteine enthalten.
  24. Kit für die Anwendung einer Verfahren des Siebens einer Substanz fähig zu modifizieren die Aktivität einer Funktion bekannt nach einem der vorangehenden Ansprüche, charakterisiert dadurch dass er außerdem enthält wenigstens einen Halter enthaltend eine Serie von Positionen für die Anwendung der Etappen des Ausdrückens, des Aufspürens und der Bestätigung.
  25. Gebrauch einer Kombinierung von Reagensen für die Anwendung einer Verfahren des Siebens einer Substanz fähig zu modifizieren die Aktivität einer Funktion bekannt nach einem der Ansprüche 1 bis 22, besagte Kombinierung enthaltend: – eine RNS Polymerase, nukleotide Sequenzen für die Vorbereitung der Nukleinsäuremoleküle enthaltend den oder die Gene erlaubend den Ausdruck eines oder mehrerer Proteine, sowie Varianten des besagten oder der besagten Proteine, beinhaltend besagte Funktion, die vier Triphosphat Nukleotide, – die nötigen Mischungen zu besagter Vorbereitung, für die Übertragung und die Übersetzung, besagte Mischungen nicht enthaltend die Funktion des oder der besagten Proteine oder sie enthaltend aber dann ist sie nicht aufspürbar in den Bedingungen des Aufspürens und/oder der Messung, – eventuell Markierer die so genannte Funktion die sowie Varianten der so genannten oder der so genannten Proteine enthalten.
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