AT521238A1 - In-situ zellanalyse im zellkultursystem - Google Patents

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Abstract

Die vorliegende Erfindung umfasst ein in-situ-Verfahren umfassend a) Bestimmung eines Moleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenmolekülen und extrazellulären Matrixmolekülen in einem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium, umfassend die Schritte i) Bereitstellen einer Analytsonde bestehend aus einem Detektionselement, welches das Molekül bindet, und einem oder mehreren Erkennungselementen; ii) Binden der Analytsonde an das Molekül in dem Zellkultursystem, wobei die enthaltenen lebenden Zellen durch diesen Schritt in ihrer Wachstumsfähigkeit nicht wesentlich beeinträchtigt werden; iii) gegebenenfalls Entfernen ungebundener Analytsonden; iv) Ablösen der Analytsonde; v) Transfer in ein von dem Zellkultursystem unterschiedliches Behältnis; vi) Detektieren des oder der Erkennungselemente; und b) Fortsetzen der Zellkultivierung in dem Zellkultursystem.

Description

ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung umfasst ein in-situ-Verfahren umfassend
a) Bestimmung eines Moleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Zelloberflächenmolekülen und extrazellulären Matrixmolekülen in einem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium, umfassend die Schritte
i) Bereitstellen einer Analytsonde bestehend aus einem Detektionselement, welches das Molekül bindet, und einem oder mehreren
Erkennungselementen;
ii) Binden der Analytsonde an das Molekül in dem Zellkultursystem, wobei die enthaltenen lebenden Zellen durch diesen Schritt in ihrer Wachstumsfähigkeit nicht wesentlich beeinträchtigt werden;
iii) gegebenenfalls Entfernen ungebundener Analytsonden;
iv) Ablösen der Analytsonde;
v) Transfer in ein von dem Zellkultursystem unterschiedliches Behältnis;
vi) Detektieren des oder der Erkennungselemente; und
b) Fortsetzen der Zellkultivierung in dem Zellkultursystem.
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-1IN-SITU ZELLANALYSE IM ZELLKULTURSYSTEM
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der in-situ Analyse der Zelloberfläche, Zelloberflächenbestandteile oder ungebundener Zellbestandteile in einem Zellkultursystem.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Standardmethode zur Charakterisierung von tierischen Zellen ist die Durchflusszytometrie. Hierbei können Zellen oder Beads in einem dünnen Kanal mit Hilfe von Lasern und Detektoren gemessen werden. Die Zellen werden mit fluoreszenz-markierten Antikörpern vermischt, welche spezifische Moleküle auf der Oberfläche der Zellen binden und markieren. Anschließend können die Zellen im Durchflusszytometer auf Grund der Lichtstreuung und des resultierenden Fluoreszenzsignals analysiert werden.
Speziell im Rahmen von zell-therapeutischen Produkten ist das Monitoring von Zellen während des Kultivierungsprozesses von großem Interesse. Um die Sicherheit und Effizienz dieser Produkte zu gewährleisten und zu verbessern, ist laufendes Testen des Ausgangsmaterials, der Zwischenprodukte und des Endprodukts notwendig. Das Qualitäts-Kontroll-System ist hierbei von entscheidender Bedeutung, da es die Konsistenz des finalen Produkts in jedem einzelnen Produktionsprozess sichert. In diesem Zusammenhang mangelt es im Moment an geeigneten In-SituKontrollen, die Zwischenprodukte ohne Beeinflussung der Zellen in einem Zellkultursystem messen kann. Hierzu sind Verfahren gefragt, welche minimal in die Kultur eingreifen, aber dennoch eine hohe Sensitivität und Spezifität für die gesuchten Analyten aufweisen. Die Messung mittels Durchflusszytometer erfüllt zwar den aktuellen Erfordernissen nach Sensitivität und Spezifität, leidet jedoch unter der Notwendigkeit die Analyten (Zellen) aus der Kultur heraus zu isolieren und nach der Analyse meist zu verwerfen.
Zhang et al. (J. Clin. Microbiol. 46(4), 2008, 1292-1297) beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung eines bakteriellen Toxins, wobei das Toxin aus der Kultur in Form von Überstand entfernt und auf eine feste Platte gebunden wird. Immobilisierte Toxine wurden durch Antikörperbindung und iPCR (Immuno Polymerase Chain Reaction) bestimmt.
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-2Hansen et al. (BioTechniques 2014 56:217-228) betrifft einen Überblick zur PCR mit Vorschlägen zur Verbesserung der Sensitivität durch Optimierung von Blockier- und Waschschritten. Zu bestimmende Analyten werden auf feste Oberflächen gebunden.
EP 2189539 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Konjugatkomplexen für Immunoassays. Auch die Anwendung dieser Konjugatkomplexe setzt die vorherige Probenvorbereitung und Isolierung des Analyten voraus.
Malou et al. (Trends in Microbiology, 2011, 19(6):295) betrifft ein Verfahren zur Bestimmung geringer Mengen eines immobilisierten Analyten mittels iPCR.
Terazono et al. (Journal of Nanobiotechnology 2010, 8:8) beschreibt ein Verfahren zur Fluoreszenzmarkierung von lebenden Zellen. Dies hat jedoch den Nachteil, dass die Fluoreszenzfarbstoffe durch ein Reinigungsverfahren entfernt werden müssen, welches die Kulturbedingungen und/oder spätere weitere Analysen verändert. Eine Überwachung von Zellen ohne Eingriff in die Wachstumsbedingungen ist nicht möglich.
US2012/0077714A1 betrifft ein Verfahren zur Analyse beispielsweise einer Zelle, worin die Zelle an einen Marker gekoppelt wird und Marker-gebundene Zellen mithilfe eines Durchflusszytometers von nicht-gebundenen Zellen getrennt werden.
US 2008/0113875A1 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines oder mehrerer Moleküle in einer Probe mittels Bindung an einen Komplex, der an einen Masse-Tag gekoppelt ist. Dieser Masse-Tag wird nach Trennung von dem Komplex mittels Massenspektrometer detektiert. Die Probe kann Zelllysat, Gewebsschnitt oder Körperflüssigkeit sein.
AU2015/261546A1 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Moleküls in einer Probe mittels Bindung an einen Aptamer Komplex. Aptamer-gebundene Moleküle werden an eine feste Phase gebunden und detektiert.
WO2017/075265A1 betrifft ein Verfahren zur Analyse von hohem MultiplexProtein oder zellulären Bestandteilen in einzelnen Zellen oder einzelnen isolierten Aggregaten von zellulären Bestandteilen in einem Hydrogel-Netz und zur Markierung von zellulären Bestandteilen mit Markierungsliganden, die mit einem Nukleinsäure-Tag verbunden sind. Zelluläre Bestandteile können unter Verwendung von Sequenzierungsverfahren getestet werden. Vor Bindung an den Markierungsliganden werden die Zellen in einem Hydrogel eingebettet.
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-3US2017/0016909A1 betrifft Sonden, Zusammensetzungen, Verfahren und Kits für die simultane multiplexierte Detektion und Quantifizierung der Proteinexpression in einer benutzerdefinierten Region eines Gewebes, einer benutzerdefinierten Zelle und/oder einer benutzerdefinierten subzellulären Struktur innerhalb einer Zelle.
US2017/0137864A1 betrifft ein Verfahren zur Zellmarkierung für hochauflösende Bildgebungsverfahren. Die Zellen werden mit Detektionssonden, die spezifisch an ein Molekül binden, in Verbindung gebracht. (Fluoreszenz)-markierte Sonden binden anschließend an die Detektionssonden und werden durch ein bildgebendes Verfahren detektiert.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung ein verbessertes Verfahren zur Verfügung zu stellen, welche die Möglichkeit zur Bestimmung eines Moleküls in seinem qualitativen Umfeld erlaubt. Insbesondere soll in Zellkultursystemen ein bestimmtes Molekül festgestellt werden.
KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, verbesserte detektierende Verfahren zur Verfügung zu stellen, welche die Möglichkeit zur Bestimmung eines Moleküls in seinem qualitativen Umfeld erlauben. Insbesondere soll in Zellkultursystemen ein bestimmtes Molekül festgestellt werden.
Diese Aufgabe wird durch den Gegenstand der Erfindung gelöst.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein in-Kultur Verfahren zur Bestimmung eines Moleküls in einem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen. Insbesondere ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultivierung auch nach erfolgter Bestimmung des Moleküls fortgesetzt werden kann. Insbesondere können dadurch ein oder mehrere Moleküle in einer bestimmten Zellkultur zu verschiedenen Zeitpunkten bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst ein in-situ Verfahren, welches folgende Schritte umfasst
a) Bestimmung eines Moleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenmolekülen und extrazellulären Matrixmolekülen in einem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium, umfassend die Schritte, / 57
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i) Bereitstellen einer Analytsonde bestehend aus einem Detektionselement, welches das Molekül bindet, und einem oder mehreren Erkennungselementen;
ii) Binden der Analytsonde an das Molekül in dem Zellkultursystem, wobei die enthaltenen lebenden Zellen durch diesen Schritt in ihrer Wachstumsfähigkeit nicht wesentlich beeinträchtigt werden;
iii) gegebenenfalls Entfernen ungebundener Analytsonden;
iv) Ablösen der Analytsonde,
v) Transfer in ein von dem Zellkultursystem unterschiedliches Behältnis;
vi) Detektieren des oder der Erkennungselemente; und
b) Fortsetzen der Zellkultivierung in dem Zellkultursystem.
Insbesondere ist das vorliegende Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen, welche in dem Zellkultursystem enthalten sind, in ihrem Wachstum nicht wesentlich beeinträchtigt werden. Bevorzugt werden die Zellen in ihrem Wachstum nicht mehr als zu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50% beeinträchtigt. Insbesondere zeigt sich eine nicht wesentliche Beeinträchtigung im Zellwachstum durch ein um maximal 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50% verringertes Zellwachstum. Insbesondere zeigt sich das um maximal 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50% verringerte Zellwachstum nicht länger als 6, 12, 24, 36 oder 48 Stunden nach dem Verfahren. Bevorzugt ist das Zellwachstum um maximal 20%, noch bevorzugter um maximal 10% verringert, im Vergleich zu einer Referenz Kultur die dem Verfahren nicht ausgesetzt wurde.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung ein in-situ Verfahren, welches folgende Schritte umfasst
a) Bestimmung eines Moleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenmolekülen und extrazellulären Matrixmolekülen in einem dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium, umfassend die Schritte
i) Bereitstellen einer Analytsonde bestehend aus einem Detektionselement, welches das Molekül bindet, und einem oder mehreren Erkennungselementen;
ii) Binden der Analytsonde an das Molekül in dem Zellkultursystem, wobei die enthaltenen lebenden Zellen durch diesen Schritt in ihrer / 57
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-5Wachstumsfähigkeit nicht wesentlich beeinträchtigt werden, vorzugsweise worin das
Wachstum der Zellen um maximal 20%, verringert ist;
iii) gegebenenfalls Entfernen ungebundener Analytsonden;
iv) Ablösen der Analytsonde;
v) Transfer in ein von dem Zellkultursystem unterschiedliches Behältnis;
vi) Detektieren des oder der Erkennungselemente; und
b) Fortsetzen der Zellkultivierung in dem Zellkultursystem.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung ein in-situ Verfahren, welches folgende Schritte umfasst
a) Bestimmung eines Moleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenmolekülen und extrazellulären Matrixmolekülen in einem zweidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium, umfassend die Schritte
i) Bereitstellen einer Analytsonde bestehend aus einem Detektionselement, welches das Molekül bindet, und einem oder mehreren Erkennungselementen;
ii) Binden der Analytsonde an das Molekül in dem Zellkultursystem, wobei die enthaltenen lebenden Zellen durch diesen Schritt in ihrer Wachstumsfähigkeit nicht wesentlich beeinträchtigt werden, vorzugsweise worin das Wachstum der Zellen um maximal 20% verringert ist;
iii) gegebenenfalls Entfernen ungebundener Analytsonden;
iv) Ablösen der Analytsonde;
v) Transfer in ein von dem Zellkultursystem unterschiedliches Behältnis;
vi) Detektieren des oder der Erkennungselemente; und
b) Fortsetzen der Zellkultivierung in dem Zellkultursystem.
Insbesondere umfasst die vorliegende Erfindung ein in-situ Verfahren, welches folgende Schritte umfasst
a) Bestimmung eines Moleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenmolekülen und extrazellulären Matrixmolekülen in einem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium, umfassend die Schritte
i) Bereitstellen einer Analytsonde bestehend aus einem Detektionselement, welches das Molekül bindet, und einem oder mehreren Erkennungselementen;
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180509 ii) Binden der Analytsonde an das Molekül in dem Zellkultursystem, wobei die enthaltenen lebenden Zellen durch diesen Schritt in ihrer Wachstumsfähigkeit nicht wesentlich beeinträchtigt werden;
iii) gegebenenfalls Entfernen ungebundener Analytsonden;
iv) Ablösen eines oder mehrerer Erkennungselemente von der Analytsonde oder Ablösen der gesamten Analytsonde;
v) Transfer des oder der Erkennungselemente oder der gesamten Analytsonde in ein von dem Zellkultursystem unterschiedliches Behältnis;
vi) Detektieren des oder der Erkennungselemente; und
b) Fortsetzen der Zellkultivierung in dem Zellkultursystem.
Insbesondere ist das vorliegende Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass nach Ablauf einer bestimmten Zeitspanne das Molekül in demselben Zellkultursystem erneut bestimmt wird. Insbesondere wird das Molekül innerhalb von 1-10 Tagen erneut bestimmt, bevorzugt innerhalb von 1-7 Tagen, noch bevorzugter innerhalb von 1-3 Tagen. Die bestimmte Zeitspanne kann Stunden, Tage, Wochen, Monate oder mehr umfassen. Insbesondere kann die Zeitspanne mindestens 3, 8, 12 oder 24 Stunden umfassen. Bevorzugt umfasst die Zeitspanne maximal 1, 3, 6, 9 oder 12 Monate. Noch bevorzugter umfasst die Zeitspanne maximal 1, 2, 3 oder 4 Wochen.
Insbesondere ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Schritte ii) bis v) innerhalb von maximal 60, 30 oder 20 Minuten durchgeführt werden können. Eine Zeit außerhalb des Inkubators, mit 37°C und 5% CO2, von maximal 60, 30 oder 20 Minuten führt nicht zu einer wesentlichen Beeinträchtigung des Wachstums der Zellen in der Zellkultur.
Insbesondere ist das vorliegende Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionselement ein Aptamer, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus nukleotidbasierten und peptidbasierten Aptameren, ist.
Insbesondere ist das vorliegende Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionselement ausgewählt ist aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Antikörperderivat oder einem Antikörper-Aptamer Konjugat.
Des Weiteren ist das vorliegende Verfahren insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass die Analytsonde ein oder mehrere Verbindungselemente enthält. Insbesondere befindet sich das Verbindungselement zwischen Detektionselement und Erkennungselement oder zwischen zwei Erkennungselementen. Insbesondere ist das Verbindungselement ausgewählt aus der / 57
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-7Gruppe bestehend aus Peptiden, Oligonukleotiden und chemischen Crosslinkern. Bevorzugt enthält das Verbindungselement eine oder mehrere Spaltstellen oder eine oder mehrere lichtempfindliche Modifikationen. Bevorzugt ist die Spaltstelle eine enzymatisch schneidbare Spaltstelle oder eine lichtsensitive Spaltstelle. Dementsprechend kann das Verbindungselement mittels Enzymen oder Lichteinwirkung, vorzugsweise UV Licht, gespalten werden.
Des Weiteren ist das vorliegende Verfahren insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass das Zelloberflächenmolekül ein Membranprotein ist, beispielsweise ein Rezeptorprotein, Transporterprotein, Zell-Zell-Erkennungsprotein, Zell-Matrix Protein, Enzym, Signalübertragungsprotein oder ein anderer Bestandteil der Zellmembran oder Zellwand.
Des Weiteren ist das vorliegende Verfahren insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass das extrazelluläre Matrixmolekül ein Glykoprotein ist, beispielsweise Collagen, Fibrin, Elastin oder Vitronektin oder ein Glykosaminoglykan, beispielsweise Hyaluronsäure, Heparansulfat, Chrondoitinsulfat oder Keratansulfat.
Insbesondere ist das vorliegende Verfahren auch dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in dreidimensionaler Zellkultur auf einer Oberfläche, einem festen dreidimensionalen Gerüst oder einem Hydrogel angeheftet oder fixiert sind, oder als Zellaggregat oder Sphäroid in Suspension vorliegen. Insbesondere kann eine flüssige dreidimensionale Zellkultur in Erlenmeyerkolben, Bioreaktor, Mikrofluidiksystem oder einer gespülten Mikrotiterplatte vorliegen.
Insbesondere ist das vorliegende Verfahren auch dadurch gekennzeichnet, dass die Durchführung der Schritte ii) bis iv) in dem Zellkultursystem in statischer Umgebung, vorzugsweise in einem Behältnis wie einer Mikrotiterplatte oder anderem Kulturgefäß, oder unter Perfusion, vorzugsweise in einem Bioreaktor, Mikrofluidiksystem oder einer gespülten Mikrotiterplatte stattfindet.
Insbesondere ist das vorliegende Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt ii) die Analytsonden in Relation zum Zelloberflächenmolekül oder extrazellulären Matrixmolekül im Überschuss vorliegen.
Des Weiteren ist das vorliegende Verfahren insbesondere dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungselement der Analytsonde in Schritt iv) mittels PCR, vorzugsweise qPCR, RT-PCR, digitale PCR, Touchdown PCR, asymmetrische PCR, Solidphase PCR oder Nested PCR, oder indirekt durch Bindung an ein / 57
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-8komplementäres Bindungselement detektiert wird. Vorzugsweise ist das komplementäre Bindungselement photodetektierbar.
Des Weiteren ist das vorliegende Verfahren insbesondere auch dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungselement der Analytsonde eine Luciferase, Peroxidase, alkalische Phosphatase oder ein Enzym-Reporterelement aufweist und die Detektion in Schritt v) mittels entsprechenden Substrats, in dem von dem Zellkultursystem unterschiedlichen Behältnis erfolgt. Bevorzugt ist das entsprechende Substrat Luciferin, Coelenterazin, ABTS (das Diammoniumsalz der 2,2'-Azino-di-(3ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)), PNPP (p-Nitrophenylphosphat), OPD (Peroxidase ortho-Phenylendiamin) oder TMB (3,3‘,5,5‘-tetramethylbenzidin).
Des Weiteren ist das vorliegende Verfahren insbesondere auch dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungselement der Analytsonde einen Fluoreszenzmarker aufweist, beziehungsweise mit einem Fluoreszenzmarker verbunden ist. Dieser Fluoreszenzmarker kann vorzugsweise mittels Fluoreszenzmikroskopie oder Durchflusszytometrie detektiert werden.
Des Weiteren ist das vorliegende Verfahren insbesondere auch dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungselement der Analytsonde in Schritt v) mittels massenspektrometrischer Bestimmung, mittels Durchflusszytometrie oder mittels Sequenzierung, vorzugsweise Next Generation Sequenzierung, detektiert werden kann.
Insbesondere ist das vorliegende Verfahren auch dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül durch Schritte ii) und v) abgesehen von Komplexbildung mit dem Detektionselement chemisch unverändert bleibt und weiter in dem Zellkultursystem geführt werden kann.
Weiters betrifft die Erfindung einen Kit, geeignet zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens. Der Kit kann eine oder mehrere Analytsonden, geeignet für ein erfindungsgemäßes Verfahren, beinhalten. Der Kit enthält beispielsweise mindestens eine Analytsonde mit einem Detektionselement, welches geeignet ist, einen gewünschten Analyten zu binden; ein Verbindungselement; mindestens ein erstes Erkennungselement; und mindestens eine Markierungssonde, welche ein zum ersten Erkennungselement komplementäres Bindungselement aufweist; wobei die Analytsonde und Markierungssonde in unterschiedlichen Behältern vorgesehen sind. Die beschriebenen Kitbestandteile können im erfindungsgemäßen Verfahren in Schritten für ihre augenscheinliche Eignung eingesetzt werden.
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-9Die weitere detaillierte Beschreibung der Erfindung betrifft alle Aspekte der gegenständlichen Erfindung gleichermaßen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Figur 1 zeigt eine Analytsonden aus einem Oligonukleotid mit einem Aptamer als Detektionselement (1a).
Figur 2 zeigt eine Analytsonde mit einem Antikörper als Detektionselement (9).
Figur 3 zeigt einen schematischen Ablauf eines Analyseverfahrens unter Verwendung einer Analytsonde mit einem Aptamer als Detektionselement. Durch Änderung der Bindungsbedingungen wird das Erkennungselement abgelöst.
Figur 4 zeigt einen schematischen Ablauf eines Analyseverfahrens unter Verwendung einer Analytsonde mit einem Antikörper als Detektionselement. Durch Restriktionsverdau wird das Erkennungselement abgelöst.
Figur 5 zeigt ein Analyseverfahren unter Verwendung einer Analytsonde mit einem Aptamer als Detektionselement und qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) zur Analyse des Erkennungselements.
Figur 6 zeigt ein Analyseverfahren unter Verwendung einer Analytsonde mit einem Antikörper als Detektionselement und qPCR (quantitative Polymerase Chain Reaction) zur Analyse des Erkennungselements.
Figur 7a zeigt die indirekte Detektion von CD105 auf adMSCs mittels einer Aptamersonde in einem 2D-Zellkultursystem, qPCR und Schmelzkurvenanalyse, Analytsonde in Verdünnung 1:250, 1:500 und 1:1000 in den oberen Graphen. Die unteren Graphen zeigen die Dissoziationskurve.
Figur 7b zeigt die indirekte Detektion von CD105 auf adMSCs mittels einer Aptamersonde in einem 2D-Zellkultursystem, qPCR und Schmelzkurvenanalyse, Analytsonde in Verdünnung 1:5000 und 1:1000 in den oberen Graphen. Die unteren Graphen zeigen die Dissoziationskurve.
Figur 7c zeigt eine entsprechende Standardkurve zu den Figuren 7a und 7b mit Verdünnungen von 1:1000 bis 1:10 Millionen.
Figur 8a zeigt die indirekte Detektion von CD105 auf adMSCs in der 2D Kontrolle mittles qPCR, Triplikat Proben (E2/F2/G2-A2/B2/C2-A5/B5/C5), Neg. Kontrollen (H2/D2/D2).
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-10Figur 8b zeigt eine entsprechende Standardkurve zur Figur 8a mit Verdünnungen von 1:1000 bis 1:1 Million.
Figur 9a zeigt die indirekte Detektion von CD105 auf adMSCs in dem 3D Zellkultursystem mittels Aptamersonde, qPCR, Triplikat Probe (A2/B2/C2-A3/B3/C3E3/F3/G3), Neg. Kontrollen (D2/D3/H3)
Figur 9b zeigt eine entsprechende Standardkurve zur Figur 9a mit Verdünnungen von 1:1000 bis 1:1 Million.
Figur 10 zeigt die indirekte Detektion von CD105 auf adMSCs mittels qPCR im Mikrofluidik-Chip und als Kontrolle in einer 2D 96-Wellplate.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß können Moleküle, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenmolekülen und extrazellulären Matrixmolekülen, in einem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium, bestimmt werden, ohne die Wachstumsfähigkeit der lebenden Zellen wesentlich zu beeinflussen. Insbesondere können die Zellen in dem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend Zellkulturmedium ohne wesentliche Beeinträchtigung durch die Bestimmung des Moleküls weiter wachsen.
Zellkultursysteme sind komplexe zelluläre Umgebungen welche durch lebende Zellen beeinflusst werden. Derartige Umgebungen werden durch eine Vielzahl an Zellsubstraten und Nährstoffen sowie zellulären Metaboliten sowie diversen anderen Komponenten gebildet und sind durch dieses Gemisch an Substanzen komplex. Diese Komplexität kann von sich aus manche Bestimmungsverfahren zur Detektion von Molekülen stören. Zudem kann der Zellmetabolismus selbst störende Nebenreaktionen hervorrufen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist ein in-situ Verfahren. Der Begriff „in-situ Verfahren“ oder „in-Kultur Verfahren“ bezieht sich auf ein Verfahren, das in einem lebende Zellen umfassenden in vitro Zellkultursystem stattfindet. Die lebenden Zellen werden in dem erfindungsgemäßen Verfahren daher nicht aus dem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend Zellkulturmedium entfernt. Die Zellen verbleiben im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens in dem Zellkultursystem. Das Zellkultursystem umfasst ein Behältnis, welches für die Zellkultur geeignet ist, optional enthaltend ein dreidimensionales Gerüst für dreidimensionale Zellkultur, und das Zellkulturmedium. In einzelnen Schritten des Verfahrens können die Zellen / 57
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-11gewaschen werden, jedoch werden auch Waschschritte mit zellverträglichem Kulturmedium durchgeführt. Da die Zellen im Verlauf des Verfahrens lediglich mit zellverträglichem Kulturmedium behandelt werden, wird das Zellwachstum nicht wesentlich beeinträchtigt und die Zellen können auch nach der Bestimmung eines oder mehrerer Moleküle weiter wachsen. Selbst sequentielle Bestimmungen von Molekülen an verschiedenen Tagen beeinträchtigen das Wachstum der Zellen nicht wesentlich. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich daher insbesondere zur Überwachung potenzieller Veränderungen eines Moleküls über einen bestimmten Zeitraum.
Erfindungsgemäß findet zumindest der erste Schritt der Detektion, nämlich die Bindung der Analytsonde an ein Molekül in diesem Zellkultursystem, also in Anwesenheit der Zellen und dem Zellkulturmedium, statt. Die Analytsonde oder ein Teil davon (z.B. das Detektionselement) kann in der komplexen zellulären Umgebung ohne Reinigungsverfahren verbleiben, wobei die Sonde oder der verbleibende Teil keine wesentliche Einflussnahme auf das Zellwachstum ausübt und das Zellwachstum daher nicht wesentlich beeinträchtigt. Alternativ kann die Analytsonde oder ein Teil davon in der komplexen zellulären Umgebung abgebaut werden, insbesondere auf natürliche Weise durch die Zellen oder deren katabolische Enzyme.
Das durch das erfindungsgemäße in-situ Verfahren zu bestimmende Molekül ist ein Zelloberflächenmolekül oder ein extrazelluläres Matrixmolekül.
Zelloberflächenmoleküle sind Moleküle, die mit der Zellmembran oder einer Biomembran von Zellkompartimenten bzw. Organellen einer Zelle assoziiert sind. Hierbei wird unterschieden zwischen peripheren Membranproteinen, als an die Membranoberfläche gebundenen Proteinen, und integralen Membranproteinen, welche mit einem hydrophoben Anteil in die Doppellipidschicht der Membran integriert sind und sie zumeist als Transmembranprotein durchspannen.
Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist der Anteil tierischen Gewebes (vor allem im Bindegewebe), der zwischen den Zellen im sogenannten Interzellularraum liegt. Die EZM umfasst nach heutiger Sicht die Gesamtheit der Makromoleküle, die sich außerhalb der Plasmamembran von Zellen in Geweben und Organen befinden. Glykosaminoglykane (GAGs), langkettige Polysaccharide aus Disaccharideinheiten bestimmter Zucker, sind in der EZM in großen Mengen vorhanden. Hierbei sind zu nennen: Hyaluronsäure, Heparansulfat, Dermatansulfat, Chondroitinsulfat und Keratansulfat. Bis auf die Hyaluronsäure sind alle GAGs an Proteine gebunden und bilden so Proteoglykane. So gut wie alle Zellen besitzen Rezeptoren, mit der sie mit / 57
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-12der EZM in Kontakt treten. Oft werden dabei verschiedene Adhäsionsproteine, Adapterproteine oder andere adhäsive Proteine benutzt, die selbst Bestandteil der EZM sind und zum einen mit anderen Bestandteilen der Matrix, zum anderen mit den Zellrezeptoren interagieren.
Bevorzugte Beispiele für Zelloberflächenmoleküle sind etwa Membranproteine, wie Rezeptorproteine, Transporterproteine, Zell-Zell-Erkennungsproteine, Zell-Matrix Proteine, Enzyme, Signalübertragungsproteine oder andere Bestandteile einer Zellmembran oder Zellwand. Bevorzugte Beispiele für extrazelluläre Matrixmoleküle sind etwa Glykoproteine wie beispielsweise Collagen, Fibrin, Elastin, Vitronektin, Laminin oder Glykosaminoglykane wie beispielsweise Hyaluronsäure oder Heparansulfat oder Chondroitinsulfat. Zelloberflächenmoleküle können auch rekombinante Proteine sein.
Eine erfindungsgemäße Analytsonde (im Verfahren) hat ein Detektionselement, welches geeignet ist, ein gewünschtes Molekül zu binden, und ein oder mehrere Erkennungselemente. Üblicherweise handelt es sich um eine chemische Verbindung, mit oder ohne Verbindungselement (Linker), dieser beiden Bestandteile. Die chemische Verbindung dieser beiden Elemente ist vorzugsweise eine kovalente Bindung.
Die Analytsonde ist vorzugsweise ein kleines Molekül von z.B. weniger als 50kD Größe. Mögliche Größen bzw. Molgewichte der Analytsonde sind 50 Da bis 40 kDa, 100 Da bis 30 kDa oder 200 Da bis 20 kDa oder vorzugsweise 400 Da bis 10 kDa. Im Fall von Nukleinsäuren kann das Detektionselement aus einem Oligonukleotid mit 6-80 Nukleotiden in Länge bestehen. Bevorzugt sind 10 bis 60 Nukleotide.
Eine Oligonukleotid-Sequenz kann sowohl aus Deoxyribonukleotiden, Ribonukleotiden, und/oder dessen Analoge sowie chemisch modifizierten Deoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden bestehen. Vorzugsweise besteht ein Erkennungselement aus einer Oligonukleotid-Sequenz mit 8 bis 100 Nukleotiden, z.B. 16-20 Nukleotiden, die Sequenz kann aber auch länger sein.
Das Detektionselement ist ein Molekül (bzw. ein Molekülbestandteil in der Analytsonde), welches ein Molekül nach Wahl bindet. Diese Bindungsreaktion ist spezifisch, um ein entsprechend spezifisches Signal zu erhalten. Zur Bindung an ein Molekül sind diverse Bindungsmechanismen möglich, vorzugsweise Komplexbildungsreaktionen oder ionische Interaktionen. Nicht-kovalente Bindungen sind reversibel und können durch eine Änderung der Bindungsbedingungen getrennt / 57
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-13werden, beispielsweise durch eine Steigerung der Temperatur oder eine Steigerung der Salzkonzentration oder durch Hinzufügen von chemischen Substanzen/Detergenzien, die zur Denaturierung der Bindung führen. Somit ist in Schritt iv) des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Abtrennen der gesamten Analytsonde vom Molekül möglich, vorzugsweise durch Änderung der Bindungsbedingungen. Auch kovalente Reaktionen sind möglich. Geeignete Bindungen an das Molekül sind Ligand-Ligand oder Ligand-Rezeptor Bindungen. Insbesondere, im Fall von Zelloberflächenmolekülen als Molekül, können entsprechende Liganden für diese Zelloberflächenmoleküle als Detektionselement eingesetzt werden.
Allgemein kann das Detektionselement ein Peptid, Protein oder eine Nukleinsäure sein.
Zu den vielseitigen Detektionselementen zählen Antikörper bzw. Antikörperfragmente oder Derivate mit einem Antigen-bindenden Teil. Ähnlich vielseitige Detektionselemente sind Aptamere. Antikörper (immer inklusive der genannten Fragmente oder Derivate) und Aptamere können für annähernd jedes beliebige Molekül gewonnen werden und erfindungsgemäß zum Einsatz kommen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des gegenständlichen Verfahrens werden Antikörper, Anitkörperfragmente oder -derivate als Detektions- und/oder Erkennungselement verwendet. Bevorzugte Antikörperfragmente oder -derivate sind Einkettenantikörper oder ihre Antigen-bindende Domäne, Fab, Fv, F(ab)2, Fab', F(ab')2, scFv, scfc, VHH. Antikörper können von den Klassen IgG, IgA, IgD, IgE, IgM, IgW und IgY sein bzw. die Fragmente oder Derivate die von diesen stammen. Die Antikörper können polyklonale als auch monoklonale Antikörper sein. Bindungen von Antikörpern an die weiteren Elemente der Analytsonde können kovalent oder durch Komplexbildung erfolgen - z.B. kann ein Aptamer den Antikörper binden, z.B. am Fc Teil und somit mit den restlichen Elementen der Analytsonde verbinden. Kovalente Bindungen sind über den Lysin-Rest des Antikörpers bevorzugt. Eine kovalente Bindung mit dem Antikörper kann auch über gebräuchliche Crosslinker wie beispielsweise EDC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid) und NHS (NHydroxysuccinimid) erfolgen. Hierbei wird eine Carboxyl-Gruppe mit einer primären Amino-Gruppe, beispielsweise von Lysin-Resten, verknüpft. In anderen Ausführungsformen kann die funktionelle Gruppe der Oligonukleotid-Sequenz auch an einer primären Amino- (-NH2), Sulfhydryl (-SH), Carbonyl (-CHO) oder sonst / 57
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-14gebräuchlichen Gruppen binden. Bindungen über photoreaktive Gruppen sind ebenfalls möglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden Aptamere als Detektionsund/oder Erkennungselement verwendet. Aptamere sind beispielsweise aus der WO 2009/012420 A1, WO2005/113817 A2, DE 102010038842 A1, WO 2012/130951 A1, EP 1918372 A1, Baumstummler et al. (Letters in Applied Microbiology 59, 2014: 422431) und Terazono et al. (Journal of Nanobiotechnology 2010, 8:8) für Detektionsverfahren bekannt und können erfindungsgemäß als Detektionselement, wie im Stand der Technik bekannt, eingesetzt werden. Besonders bevorzugt werden Slow off-rate modified Aptamere (SOMAmer - Baumstummler et al., supra). Bevorzugte Aptamere sind kurze einzelsträngige DNA- oder RNA-Oligonukleotide mit einer Länge zwischen 25 - 90 Basen. Diese Oligonukleotide sind in der Lage spezifische Moleküle zu binden, wobei sie passende 3D-Strukturen annehmen. Aptamere können an Proteine, bakterielle Gifte, niedermolekulare Stoffe (wie z. B. Antibiotika und Aminosäuren), Zellen, Zelloberflächenmoleküle, Zellmatrixmoleküle und Viruspartikel binden. Sie können Dissoziationskonstanten im pico- und nanomolaren Bereich aufweisen. Das bedeutet, dass sie ähnlich stark wie Antikörper binden können.
Beispiele für kovalente Bindungen durch das Detektionselement an das Molekül sind photoreaktive Reaktionen, wie z.B. durch Photoaptamere. Unter Lichteinwirkung kann das Detektionselement an das Molekül kovalent binden. Photoaptamere werden beispielsweise in den US 5,763,177, US6,001,577, US 6,291,184 und US 6,458,539 beschrieben und haben meist eine photoreaktive Gruppe.
Aptamere können mittels SELEX hergestellt werden. Unter dem Akronym SELEX (engl.: Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, zu Deutsch: Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) versteht man in der Molekularbiologie ein kombinatorisches Verfahren zur gerichteten Evolution von Oligonukleotid-Strängen, beispielsweise einsträngiger DNA oder RNA. Diese können als Liganden spezifisch an ausgewählte Targets binden.
Über die Erstellung von großen Zufallsbibliotheken von Oligonukleotiden unterschiedlicher Basenabfolge und aus den Sequenzen dieser Basenabfolge werden über eine systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung diejenigen herausgefiltert, die das gewünschte Molekül am stärksten binden. Dabei werden die Aptamer-Kandidaten mit immobilisierten Liganden vermischt und die nicht / 57
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-15gebundenen Teile weggewaschen. In einer bevorzugten Ausführungsform des gegenständlichen Verfahrens werden die Aptamer-Kandidaten bereits in der ersten SELEX Runde oder einer der weiteren SELEX Runden in dem Zellkulturmedium mit den Zellen inkubiert. Dies führt dazu, dass Aptamere selektiert werden, die speziell in der komplexen zellulären Umgebung enthaltend Zellkulturmedium spezifisch an entsprechenden Zellen und das zu bestimmende Molekül binden. Eine Selektion in der komplexen zellulären Umgebung hat den Vorteil, dass Aptamere selektiert werden, die nicht durch die Vielzahl an Zellsubstraten und Nährstoffen sowie zellulären Metaboliten sowie diversen anderen Komponenten oder den Zellmetabolismus in ihrer Bindungsspezifität negativ beeinflusst werden. Eben diese Aptamere können ein definiertes Molekül in dieser komplexen zellulären Umgebung spezifisch binden und werden gemäß der Erfindung als zellkulturselektierte Aptamere bezeichnet.
Nach diesem Schritt werden die Aptamer-Kandidaten zusätzlich einer Negativselektion und einer Proteinselektion unterworfen. Nach den oben beschriebenen Selektionsrunden werden in den weiteren Runden, jene Aptamere selektioniert, die spezifisch das definierte Molekül binden. Hierbei wird das definierte Molekül an einen festen Träger, vorzugsweise magnetische Beads, gebunden und nachfolgend die Selektion durchgeführt. Bei einer Negativselektion findet die Selektion gänzlich ohne das Molekül statt. Ziel dieses Schrittes ist es Aptamere, die lediglich den festen Träger und nicht das Molekül binden, aus der Bibliothek zu entfernen. Alle den festen Träger bindenden Aptamere verbleiben dabei auf diesem, die restlichen werden vorzugsweise weiteren Selektionen unterzogen.
Übrig bleiben schließlich Kandidaten mit hohen Affinitäten (Bindungsstärke) zu dem Zielmolekül. Die Eigenschaften von Aptameren sind im Einzelnen sehr hohe chemische Stabilität, niedrige Immunogenität, hohe Spezifität und Affinität und die Fähigkeit der gezielten Beeinflussung von Protein-Protein-Interaktionen. Aptamere werden üblicherweise nicht biologisch hergestellt, sondern chemisch synthetisiert. Das macht die Aptamer-Herstellung wesentlich kostengünstiger. Die Synthese erlaubt zahlreiche Modifikationen, wie den Einbau von einem Fluoreszenz-Reportermolekül oder einer Affinitätsmarkierung. Bevorzugte Aptamere oder modifizierte Aptamere sind Photo-Aptamere und Spiegel-mere. Die Analytsonden, das Detektionselement und/oder das erste Erkennungselement können aus Nukleinsäuren bestehen, wie DNA oder RNA oder Mischungen hiervon. Bevorzugt wird DNA aufgrund der höheren Stabilität. Die Nukleotide können modifiziert sein, wie z.B. Methylierung, Arylierung, / 57
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-16Acetylierung. Modifizierte Nukleotide sind bsp. 2'-Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'Amino-modifiziertes Nukleotid, 2'- Fluoro-, 2'-Methoxy- und/oder 2'-Amino-modifizierte sowohl Ribonukleotide als auch Desoxyribonukleotide. Eine weitere Möglichkeit ist LNA (locked nucleic acid) oder PNA (peptidic nucleic acid)- insbesondere in Teilen, die nicht gespalten werden sollen bzw. vor einer Spaltung geschützt werden sollen.
Das Detektionselement bindet vorzugweise mit hoher Affinität an das Molekül, z.B. mit einer Bindungskonstante (Assoziationskonstante) Ka von 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 oder mehr, sowie Bereiche zwischen diesen Ka-Werten.
Das Erkennungselement der Analytsonde ist eine chemische Einheit, die die Generierung eines Signals in weiterer Folge ermöglicht. Sie muss nicht selber ein Signal tragen (auch wenn dies eine Option ist), jedoch ist es möglich, ein Signal in ihrer Abhängigkeit zu generieren. Das Erkennungselement ist daher üblicherweise eine Markierung (auch bezeichnet als label oder tag, gemäß der aus dem Engl. kommenden Fachsprache), die später gebunden wird und diese Bindung wird zur Signalerzeugung eingesetzt. Sinnvollerweise bleibt keine oder nur eine unwesentliche Menge signalerzeugender Komponenten nach der Abtrennung in Schritt iv) in der zellulären Umgebung zurück (entweder durch Transfer oder durch Abbau in der zellulären Umgebung). Übliche Erkennungselemente sind Oligonukleotide mit einer charakteristischen Sequenz, die später zur Detektion erkannt wird, z.B. durch Bindung an eine weitere Substanz, feste Phase oder ein weiteres Erkennungselement. Das Erkennungselement kann auch ein Peptid sein, welches zur Detektion spezifisch erkannt wird. Die Signalgenerierung erfolgt dann analog zu den Oligonukleotiden. Ebenso ist jede andere Form von chemischen Substanzen, welche später zur Detektion spezifisch erkannt wird, möglich. Die erfindungsgemäße Analytsonde kann ein Erkennungselement oder mehrere beinhalten. Insbesondere können bis zu, 5, 10, 20 oder mehr Erkennungselemente in einer Analytsonde enthalten sein.
Das Verfahren kann auch Waschschritte oder Schritte zur kurzfristigen Denaturierung der Analytsonde bzw. fixierter Komponenten auf Beads oder Vertiefungen/Wells einer Mikrotiter-Platte umfassen. Diese Schritte können auch verwendet werden um das Erkennungselement abzutrennen.
Vorzugsweise bleibt das Molekül durch Schritte ii) und iv) abgesehen von der Komplexbildung mit dem Detektionselement chemisch unverändert und kann vorzugsweise unverändert weiter in dem Zellkultursystem geführt werden. Dies betrifft insbesondere Zellen oder Zellbestandteile, ist im Allgemeinen jedoch auf jedes / 57
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-17Molekül anwendbar, das der Umgebung und den darin vorhandenen Zellen weiterhin zur Verfügung steht.
Das erfindungsgemäße Verfahren enthält den Schritt des Bindens des Moleküls mit der Analytsonde über ihr Detektionselement in einem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium. Dies wird auch als Schritt ii) bezeichnet. Das zwei- oder dreidimensionale Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium, ist die oben genannte komplexe zelluläre Umgebung. Vorzugsweise beinhaltet die komplexe zelluläre Umgebung lebende Zellen, die durch diesen Schritt nicht wesentlich beeinträchtigt oder nur minimal beeinflusst werden. Insbesondere das Zellwachstum sollte nicht wesentlich beeinträchtigt werden. Die Zellen werden insbesondere nicht isoliert für diesen Schritt sondern werden in-situ gemessen und bleiben während der gesamten Analyse in dem Zellkultursystem, ergo ihrem Kulturmedium. Die Zellen können beispielsweise zuvor bereits seit 1 Tag oder länger, oder 2, 3, 4 Tagen oder länger kultiviert worden sein. Vorzugsweise werden die Zellen nach Schritt ii) weiter kultiviert, z.B. 1, 2, 3, 4 Tage oder länger, bevor die Zellen innerhalb einer bestimmten Zeitspanne erneut Schritt ii) des gegenständlichen Verfahrens unterworfen werden. Bevorzugt wird das Zellkultursystem, mit Ausnahme von Mediumswechsel und etwaiger Passagierung, nicht verändert.
Insbesondere umfasst das Zellkultursystem das Behältnis und das Kulturmedium, nicht jedoch die spezielle atmosphärische Zusammensetzung. Somit können die Zellen in Schritt ii) des gegenständlichen Verfahrens aus dem Inkubator, in dem atmosphärische Bedingungen herrschen, die ein möglichst gutes Wachstum begünstigen sollen, herausgenommen werden. Die bevorzugten atmosphärischen Bedingungen für ein möglichst gutes Zellwachstum für tierische Zellen sind 35-38 °C, besonders bevorzugt ungefähr 37°C, und 0-10% CO2, besonders bevorzugt 3-6% CO2.
Die Analytsonden können in Relation zum Molekül im Überschuss vorliegen.
Vorzugsweise wird im erfindungsgemäßen Verfahren eine zellverträgliche Flüssigkeit eingesetzt, insbesondere Zellkulturmedium. In dieser Flüssigkeit werden vorzugsweise die Schritte ii) bis v) durchgeführt. Diese Flüssigkeit wird als Teil der komplexen zellulären Umgebung eingesetzt. Sie kann ein zum Wachstum der Zellen oder zur Zellversorgung geeignetes Medium sein. Definierte Zellkulturmedien basieren auf den Komponenten-Gruppen Aminosäuren, Kohlenhydrate, Anorganische Salze / 57
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-18und Vitamine. Häufig enthaltene Salze sind zumindest Calciumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumchlorid und Mononatriumphosphat. Häufig enthaltene Vitamine sind zumindest Folsäure, Nicotinamid, Riboflavin und B12. Zusätzlich kann das Zellkulturmedium FCS (Fetal Calf Serum) oder FBS (Fetal Bovine Serum) enthalten. Bevorzugte Zellkulturmedien sind MEM, α-MEM, DMEM, RPMI und Variationen oder Abwandlungen davon.
Das Zellkultursystem kann Zellen in zwei- oder dreidimensionalen Kulturen aufweisen. Das klassische zweidimensionale Verfahren beinhaltet die Kultivierung einer Zellsuspension in Zellkulturgefäßen, wo die Zellen anheften und sich vermehren können. Das Verfahren ist grundsätzlich einfach, günstig und weltweit verbreitet, allerdings verhalten sich Zellen unter dieser Art der Kultivierung physiologisch anders als Zellen im Körper. Aus diesem Grund wird intensive Forschung in der Entwicklung neuer Konzepte zur Kultivierung von Zellen in der dritten Dimension betrieben. Beispielsweise können Zellen mittels einer dreidimensionalen Matrix (Scaffold) in speziellen Bioreaktoren kultiviert werden. Bei einer anderen Variante werden diese mit Hilfe von speziellen Mikrotiterplatten, Hanging Drops oder zu Zellkügelchen/Spheroiden transformiert. In der dritten Dimension war bisher eine zellspezifische Charakterisierung in vielen Fällen nicht möglich oder konnte nur durch spezielle zeitintensive Analysemethode am Ende der Kultivierungsperiode erfolgen. Mit der vorliegenden Erfindung ist es nun möglich geworden, ein in-situ Detektionsverfahren auch im dreidimensionalen Zellkultursystem durchzuführen.
Dreidimensionales Zellkultursystem bezeichnet die Kultivierung von Zellen in einer mikrostrukturierten dreidimensionalen Zellkultur unter in vitro Bedingungen. Die Kultur bzw. ihre Zellen sollen eine räumliche Orientierung einnehmen. Dies geschieht hauptsächlich in Form von Hydrogelen aus Gerüstproteinen wie etwa Fibrin, Kollagen, Gelatine-(Poly)Methacrylat oder Matrigel sowie festen Scaffolds wie beispielsweise aus Polystyrol Polylactatsäure oder anderen chemischen Substanzen. In einer dreidimensionalen Umgebung bilden viele Zelllinien Sphäroide aus, deren Durchmesser im Laufe der Zeit nach der Einbettung der Zellen anwächst. Auch nicht Sphäroid bildende Zellen zeigen oft eine Morphologie, die sich von 2D Kulturen stark unterscheidet. Zweidimensionale Kulturen betreffen Monolagen und schichtförmige Kulturen auf Oberflächen ohne dreidimensionale strukturgebende Bestandteile, die in dreidimensionalen Kulturen eingesetzt werden. Dieses Zellkultursystem umfasst auch dynamische Zellkultursysteme, in denen einzelne Zellen, Sphäroide oder / 57
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-19Zellaggregate in Suspension vorliegen. Beispiele für dynamische Zellkultursysteme können sein Spinner-Flask-Bioreaktoren, Hollow-Fiber-Bioreaktoren, „Wave“/CellbagBioreaktoren oder Perfusionsbioreaktoren. Der Medium Transport kann in Bioreaktoren sowohl unidirektional, bidirektional, pulsierend, gleichmäßig oder zufällig erfolgen.
Die Zellen können ausgewählt sein aus prokaryotischen Zellen, eukaryotischen Zellen, Zellen mit Zellwand, insbesondere Pflanzenzellen und Pilzzellen, Zellen ohne Zellwand, insbesondere tierische Zellen. Vorzugsweise sind die Zellen Säugerzellen, insbesondere bevorzugt menschliche aber auch nicht-menschliche.
Die Zellen können Stammzellen sein, z.B. pluripotent, multipotent oder unipotent, oder differenzierte Gewebezellen oder Blutzellen bzw. Lymphozyten sein. Die Zellen können von immortalisierten Zelllinien sein, z.B. Tumorzellinien. Es ist möglich, dass die Zellen so kultiviert werden, dass eine Differenzierung stattfindet. Somit können Zellen den Differenzierungsgrad auch ändern. Dies sollte vorzugsweise durch die Kulturbedingungen festgelegt werden (z.B. Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren) und nicht durch die Analytsondenbindung beeinflusst werden.
Vorzugsweise sind die lebenden Zellen auf einer Oberfläche oder einem extrazellulären dreidimensionalen Gerüst angeheftet oder fixiert. Die Zellen können jedoch auch (oder in Kombination damit) als Zellaggregat(e) oder Sphäroid(e) in Suspension vorliegen. Die Zelle ist vorzugsweise eine adhärent gebundene Zelle. Alternativ kann die Zelle nicht adhärent gebunden sein. Besonders bevorzugt sind Zellen, die in Suspension vorliegen. Beispiele für Kulturen in 3D mit meist ohne adhärenter Bindung, ist eine Kultur in einem Gel, insbesondere einem Hydrogel, wie Fibrin oder Matrigel. Diese Oberfläche können auch andere Zellen sein, wie FeederZellen, welche das Wachstum der zu analysierenden Zellen beeinflussen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst weiters den optionalen Schritt des Entfernens ungebundener Analytsonden (Schritt iii)). Ob dieser Schritt durchgeführt wird oder nicht, hängt von der Art des weiteren Detektionsverfahrens zur Bestimmung von gebundenen Analytsonden bzw. ihrem ersten Erkennungselement ab. Hier sind selektive Schritte möglich, z.B. die spezifische Abspaltung von nur molekülgebundenen Erkennungselementen oder umgekehrt - nur von Erkennungselementen von freien (nicht molekülgebundenen) Analytsonden und deren quantitative Bestimmung, um eine Abnahme durch Molekülbindung anderer / 57
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-20Analytsonden festzustellen. Am einfachsten ist es jedoch meist, die ungebundenen Analytsonden durch Waschen oder Abbau zu entfernen, sodass sie im weiteren Verfahren nicht mehr detektiert werden können. Abbau kann beispielsweise durch enzymatischen Abbau, wie durch Nukleasen oder Peptidasen/Proteasen, vorgenommen werden.
Ein wesentlicher Schritt im erfindungsgemäßen Verfahren, welcher zum Ziel der möglichst minimalen Störung des Zellkultursystems beiträgt, ist das Ablösen der Analytsonde oder eines oder mehrerer Erkennungselemente von der Bindung an das Molekül und Transfer der Analytsonde oder des oder der Erkennungselemente in ein von dem Zellkultursystem unterschiedliches Behältnis, Schritt v). Die Ablösung kann durch beliebige Schritte vorgenommen werden. Diese Ablösung wird meist durch Trennung einer chemischen Verbindung z.B. zwischen Detektionselement und erstem Erkennungselement vorgenommen. Das freie Erkennungselement wird dann in ein anderes Behältnis transferiert, womit es von dem Zellkultursystem, in dem die Zellen weiter wachsen können, getrennt ist. Dies erlaubt den Zellen, ohne störende Einwirkung durch das Detektionsverfahren weiterwachsen zu können.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Analytsonde durch Änderung der Bindungsbedingungen vom Molekül abgelöst. Insbesondere findet diese Ablösung durch Änderung der Salzkonzentration statt. Die Salzkonzentration der komplexen zellulären Umgebung kann vorübergehend erhöht oder gesenkt werden, ohne das Wachstum der Zellen wesentlich zu beeinträchtigen. Bevorzugt wird die Salzkonzentration des Zellkulturmediums auf 300-600mM NaCl erhöht, noch bevorzugter auf 400-500mM NaCl, oder auf 500mM NaCl. Um das Wachstum der Zellen nicht wesentlich zu beeinträchtigen sollte die Salzkonzentration nicht länger als 15 Minuten, bevorzugt nicht länger als 10 Minuten wesentlich erhöht oder verringert sein.
Der Transfer kann beispielsweise durch Affinitätsbindung des ersten Erkennungselements oder eines anderen Teils der Analytsonde erfolgen. So kann eine Einfangeinheit, z.B. gebunden an eine feste Phase, wie feste Kügelchen (beads), das Erkennungselement binden. Mit dieser Einfangeinheit bzw. festen Phase kann es leicht aus der komplexen Umgebung entfernt und in ein neues Behältnis transferiert werden. Im neuen Behältnis kann das Erkennungselement von der festen Phase gelöst werden oder an ihr verbleiben. Beliebige andere Schritte sind für einen derartigen Transfer möglich. Die Beads sind vorzugsweise MikroBeads, auf denen / 57
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-21wiederum eine Bindungseinheit, z.B. ein komplementäres Oligonukleotid zum abgetrennten Teil (erstes Erkennungselement oder einem Teil davon), fixiert ist. Dabei wird je nach Methode entweder das gelöste Detektionselement, insb. Aptamer (Pufferwechsel/Depletation), oder das Erkennungselement gebunden. Diese Beads sind vorzugsweise nicht wie Luminex-Beads oder Vera-Code Beads modifiziert. Es können Beads gleicher Größe verwendet werden, wobei im Fall der Multiplexmessung durch unterschiedliche Aliquots unterschiedliche Erkennungselemente zu unterschiedlichen Molekülen gebunden werden. Durch räumliche Trennung, beispielsweise in unterschiedlichen Tubes oder einzelnen Wells in einer Wellplatte, können unterschiedliche Ziele/Beadpopulationen gleichzeitig analysiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst des Weiteren den Schritt des Detektierens des Erkennungselements, Schritt vi). Dies kann auf beliebige Arten - nun ohne Rücksicht auf Zellwachstumsbedingungen - im von dem Zellkultursystem anderen Behältnis vorgenommen werden. Möglichkeiten zur Detektion sind beispielsweise Binden an eine markierte Sonde (Markierungssonde) und Bestimmung der Markierung. Die Markierungssonde kann ein zum Erkennungselement komplementäres Bindungselement aufweisen und dadurch an dieses binden. Die Markierung liefert vorzugsweise ein quantifizierbares Signal. Das Signal kann beispielsweise ein Lichtsignal (insbesondere Fluoreszenz) oder ein radioaktives Signal sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere auch zur Konzentrationsbestimmung von beliebigen Molekülen, insbesondere auch von Zelloberflächenmolekülen und extrazellulären Matrixmolekülen, da eine direkte Markierung des Zielmoleküls erfolgt. Die Detektion findet indirekt statt, wobei die Konzentration des gelösten/abgeschnittenen ersten Erkennungsteils der Konzentration des Zielmoleküls/Protein entspricht oder proportional dazu ist. Vorzugsweise aber nicht ausschließlich, besteht der gelöste/abgeschnittene erste Erkennungsteil aus einer Nukleinsäure-Sequenz und kann mit jeder üblichen Standard-NukleinsäureMessmethode erfolgen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens hat die Analytsonde zwischen Detektionselement und erstem Erkennungselement kein Verbindungselement. Die Analytsonde kann in Schritt iv) von der Bindung an das Molekül gänzlich abgelöst werden, sodass die gesamte Analytsonde mit dem oder den Erkennungselementen von der Bindung an das Molekül gelöst wird.
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-22Andere Ausführungsformen sind Analytsonden mit Verbindungselementen. Das Verbindungselement kann in Schritt iv) zum Abtrennen des Erkennungselements von der Bindung an das Molekül geschnitten werden, sodass der Teil der Detektionssonde mit dem mindestens einem Erkennungselement von der Bindung an das Molekül gelöst wird. Das Verbindungselement kann eine Spaltstelle, insbesondere enzymatische Spaltstelle, aufweisen. Geeignete Spaltstellen können beispielsweise in Form eines Peptids oder Oligonukleotids sein. Auch chemische Modifikationen sind möglich, wie ein Oligonukleotid-Rückgrat mit einer lichtempfindlichen Modifikation. Auch ist es möglich, dass das Verbindungselement an das Detektionselement über einen lichtempfindlichen chemischen Crosslinker gebunden ist. Diese Lichtempfindlichkeit ermöglicht die Abspaltung durch Lichteinstrahlung in Schritt iv).
Die Verwendung von 2 oder mehreren Erkennungselementen ermöglicht die Unterscheidung von 2 oder mehreren Zielmolekülen. Dabei bindet ein Detektionselement A mit einem Erkennungselement A an ein Molekül A, während ein Detektionselement B mit einem Erkennungselement B an das Molekül B bindet. Nach dem Schritt des Abtrennens (z.B. durch Änderung der Salzkonzentration) verbleiben die Analytsonden bestehend aus Detektionselement und Erkennungselement im Überstand und können transferiert werden. Mit einem Detektionsmittel, z.B. einer Markierungssonde mit Signalgebender Einheit, können die transferierten Analytsonden anhand der Erkennungselemente bestimmt werden. Z.B. können mit unterschiedlichen Markierungssonden (A‘ bzw. B‘) zu den Erkennungselementen oder durch räumliche Trennung, die unterschiedlichen Erkennungselemente zu den unterschiedlichen Molekülen bestimmt werden, die durch diese (A bzw. B) gebunden werden. Dadurch ist eine parallele Mehrfachbestimmung möglich (Multiplex). In einer Ausführungsform können bis zu 25, bis zu 50, bis zu 100, bis zu 200, bis zu 500, bis zu 1000 und bis zu 10000 Analyten gleichzeitig analysieren werden.
Im Fall von Oligonukleotiden kann die Sequenz des Erkennungselements so gewählt werden, dass weder Autodimere noch Dimere mit dem Detektionselement oder einem Verbindungselement auftreten. Ist eine Dimerisierung nicht vermeidbar, könnte durch eine komplementäre RNA-Sequenz zum Erkennungselement eine Bindung an andere Elemente unterbunden werden. Mit RNase ist diese z.B. vor der Detektion abbaubar.
Im Fall von Oligonukleotiden kann die Erfindung auch wie folgt beschrieben werden: Verfahren zur Bestimmung eines Moleküls, umfassend die Schritte / 57
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-23Bereitstellen einer Analytsonde aus einem Oligonukleotid mit einem Aptamer als Detektionselement, welches geeignet ist, ein gewünschtes Molekül zu binden und mindestens einem ersten Erkennungselement; Binden des Moleküls mit der Analytsonde über das Aptamer; Entfernen ungebundener Analytsonden; Ablösen der Analytsonde von der Bindung an das Molekül durch Änderung der Salzkonzentration; Binden des Erkennungselements der abgelösten Analytsonde an eine hierzu spezifisch bindende Markierungssonde, welche ein Oligonukleotid umfasst, welche eine zum Erkennungselement hybridisierende Sequenz als Bindungselement aufweist; optional Entfernen von nicht an Markierungssonden gebundenen Erkennungselementen; Detektieren von an die Markierungssonde gebundenen Erkennungselementen.
Im neuen Behälter nach dem Transfer der Analytsonde mit dem Erkennungselement kann dieses über eine Markierungssonde - oder über einen Zwischenschritt mit Bindung eines zweiten Erkennungselements, welches wiederum an die Markierungssonde bindet, - bestimmt werden. Derartige zweite Erkennungselemente können zugeführt werden oder vor Ort, z.B. durch PCR direkt am ersten Erkennungselement hergestellt werden.
Bevorzugterweise wird eine quantitative PCR vorgenommen, um das Signal mindestens eines ersten Erkennungselements quantitativ zu verstärken. Erzeugte zweite sekundäre Erkennungselemente sind daher in einer Menge vorhanden, welche ein Vielfaches der Menge des ersten Erkennungselements ist bzw. zur Menge des ersten Erkennungselements korreliert. Bevorzugt ist in dieser Ausführungsform das erste Erkennungselement ein PCR Primer und das sekundäre Erkennungselement eine TaqMan Markierungssonde. Die Markierungssonde, welche an das erste oder zweite oder beliebige weitere Erkennungselement, welches zum ersten Erkennungselement korreliert, bindet, wird zur Signalerzeugung genutzt. So kann es beispielsweise zur Generierung einer kolorimetrischen, Fluoreszenz oder massenspektrometrischen Bestimmung sowie einer Bestimmung durch Graphenbasierte Detektion, Kapillarelektrophorese, Chromatographie, HPLC oder Sequenzbestimmung wie durch NGS, zugeführt werden.
Vorzugsweise ist das Erkennungselement der Analytsonde ein Oligonukleotid. Es kann in Schritt vi) mittels PCR, vorzugsweise qPCR, RT-PCR, digitale PCR, Touchdown PCR, asymmetrische PCR, Solidphase PCR oder Nested PCR, oder indirekt durch Bindung an ein komplementäres Bindungselement detektiert werden, / 57
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-24wobei vorzugsweise das komplementäre Bindungselement (z.B. einer Markierungssonde) photodetektierbar ist. Das erste Erkennungselement der Analytsonde kann eine signalgebende Substanz aufweisen. Z.B. kann es eine Luciferase, Peroxidase bzw. alkalische Phosphatase oder anderweitiges EnzymReporterelement aufweisen. Die Detektion in Schritt vi) kann mittels entsprechenden Substrats in dem von der Umgebung oder Probe unterschiedlichen Behältnis erfolgen. Vorzugsweise wird das Erkennungselement der Analytsonde in Schritt vi) mittels massenspektrometrischer Bestimmung, mittels Durchflusszytometrie oder mittels Sequenzierung, vorzugsweise Next Generation Sequenzierung (NGS), bestimmt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann im Fall von Oligonukleotidsonden das Erkennungselement in einen geeigneten Hybridisierungspuffer transferiert und eine Standard-Hybridisierungs-Methode durchgeführt werden. Um eine möglichst hohe effiziente Bindung der beiden Stränge zu gewährleisten, kann beispielsweise die Oligonukleotid-Lösung bis zu 2 Stunden, oder kürzer, zwischen 37-60°C, bevorzugt 37-50°C, inkubiert werden, wobei jede einzelne Bead-Population in einem separaten Well der Mikrotiterplatte vorliegt. Zusätzlich bzw. danach wird entweder ein interkalierender Fluoreszenz-Farbstoff oder der komplementäre fluoreszenz-markierte Detektorstrang hinzugefügt. Danach wird die Lösung entweder im Wellplate-Reader oder im Durchflusszytometer oder ähnlichen Geräten gemessen. In einer Ausführungsform können mit dieser Messung bis zu 25, bis zu 50, bis zu 100, bis zu 200, bis zu 500, bis zu 1000 und bis zu 10000 Erkennungselemente zu unterschiedlichen Molekülen gleichzeitig analysieren werden. Alternativ oder zusätzlich zur räumlichen Trennung, kann auch ohne Trennung der Erkennungselemente zu unterschiedlichen Molekülen gemessen werden (Multiplex), wobei jeweils unterschiedliche komplementäre Proben auf einer Beadpopulation fixiert sein können. Die abgelösten Erkennungselemente können mit unterschiedlichen Markierungssonden gebunden werden. Zur Unterscheidung der Moleküle werden unterschiedliche signalgebende Mittel, wie Fluoreszenz-Farbstoffe mit unterschiedlichen Extinktions/Emissionsspektren, verwendet, wobei diese an der komplementären Markierungssonde gekoppelt sind.
In einer weiteren Ausführungsform werden Beads unterschiedlicher Größe verwendet, wobei jede Größe eine einzigartige Markierungssonde, die unterschiedliche Erkennungselemente zu den jeweiligen durch das Detektionselement gebundene Molekül bindet, enthält. Eine räumliche Trennung ist nicht notwendig.
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-25Dabei wird je nach Methode entweder das erste Erkennungselement also z.B: das Detektionselement selber (bei Bindungsänderungsmethode) oder das geschnittene erste Erkennungselement für die Messung verwendet. Die Messung kann durch Durchflusszytometrie erfolgen, wobei ein Signal in Abhängigkeit der Größe der Beads erhalten wird, z.B. ein Fluoreszenzsignal (siehe US2010/279888 A1). Vorzugsweise werden durch diese unterschiedlich großen Mikro-Beads bis zu 5 oder mehr Zielmoleküle gleichzeitig analysiert. Durch räumliche Trennung dieser Beads, beispielsweise in unterschiedlichen Eppendorf Tubes oder Wells einer Wellplate, kann eine unbestimmte Zahl an Molekülen gleichzeitig analysieren werden.
In einer Ausführungsform erfolgt die Messung über einen DNA HybridisierungsChip. Hierbei werden insbesondere Oligonukleotid Analytsonden verwendet. Dabei wird je nach Methode das Erkennungselement mit einer Probe auf einer einzelnen Stelle des Chips hybridisiert. Im Verfahren, nach Abtrennen des ersten Erkennungselements wird es in einen geeigneten Hybridisierungspuffer transferiert und eine Standard Hybridisierungs-Methode durchgeführt. Um eine möglichst effiziente Bindung der beiden Stränge zu gewährleisten, kann beispielsweise die Oligonukleotid-Lösung für 12 Stunden mit dem Chip bei 37-60°C, bevorzugt 37-50°C, inkubiert werden. Danach kann ein interkalierender Fluoreszenz-Farbstoff oder die komplementäre fluoreszenz-markierte Markierungssonde hinzugefügt werden. Der Chip wird gewaschen und in einem Fluoreszenz-Scanner eingelesen. Als Resultat liegt die Intensität des Fluoreszenzsignals in einem Bild vor, welches mittels Software quantifiziert werden kann. In einer Ausführungsform kann durch den Einsatz des Chips bis zu 25, bis zu 50, bis zu 100, bis zu 200, bis zu 500, bis zu 1000 und bis zu 10000 Erkennungselemente gleichzeitig analysiert werden.
In den oben erwähnten Methoden ist es möglich, vor Detektion eine Amplifikation der Erkennungselemente, insbesondere im Fall der Verwendung von Aptameren als Erkennungselemente, durchzuführen. Beispielweise kann diese mittels PCR mit dem Aptamer oder dem Erkennungselement vor der Hybridisierung mit den Chips, den Beads oder der Wellplatte stattfinden.
In einer Ausführungsform erfolgt die Detektion über molekulare Beacon Sonden. Diese Sonden bestehen aus einer Nukleotid-Sequenz, deren Enden zueinander komplementär sind. An dem einen Ende befindet sich ein Fluorophor, beispielsweise EDANS, während das andere Ende an einen Quencher, beispielsweise DABCYL, gebunden ist, der das Fluoreszenz-Signal unterdrückt. Der Mittelteil besteht aus einer / 57
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-26Sequenz, die komplementär zu einem beliebigen Teil der Analytsonde ist. Im Normalzustand liegt diese Sequenz als Haarnadelstruktur vor, wobei die beiden komplementären Enden einen Stamm bilden und der Mittelteil einen Ring ausbildet. Ein Fluoreszenz-Signal wird so durch den Quencher unterdrückt. Die Analytsonde mit einem ersten Erkennungselement wird vom Molekül abgelöst.
In damit verbundenen oder anderen Ausführungsformen kann es mit Bestandteilen der ursprünglichen Sonde weiterhin verbunden sein. Nach Ablösen der Analytsonde mit einem ersten Erkennungselement, wird diese zu den molekularen Beacon Sonden transferiert. Das Erkennungselement bindet an die OligonukleotidSequenz der molekulare Beacon und verhindert die Formierung der Haarnadelstruktur. Die Folge ist ein Fluoreszenz-Signal, da der Quencher das Fluoreszenz-Signal nicht mehr unterdrücken kann. In einer weiteren Ausführungsform erfolgt die oben erwähnte Detektion während oder nach einer PCR Amplifikation der abgelösten Analytsonde oder des Erkennungselements.
In einer Ausführungsform werden die Erkennungselemente nach dem Abtrennen mittels qPCR gemessen und quantitativ bestimmt. qPCR bedeutet, dass die PCR Reaktion unter kontrollierten Bedingungen stattfindet, sodass eine Konzentrationsbestimmung der Moleküle möglich ist.
In einer Ausführungsform erfolgt die Konzentrationsbestimmung mittels TaqMan PCR. Eine TaqMan Sonde basiert auf der komplementären Sequenz des ersten Erkennungselements, z.B. basierend auf dem Aptamer oder dem Erkennungselement selbst, und beinhaltet ein Fluorophor am 5‘-Ende, wie zum Beispiel 6Carboxyfluorescin, sowie einen Quencher am 3‘-Ende, 6Carboxytetramethylfluorescin. Die TaqMan Sonde bindet an das Erkennungselement und im Zuge der PCR wird das Signal erzeugt. Hierbei kopiert die Polymerase, die Sequenz des ersten Erkennungselements, wobei die 5‘-3‘ Exonuklease Aktivität das Fluorophor freisetzt und der Quencher das Signal nicht mehr unterdrücken kann. Mit zunehmender Amplifikationsrunde steigert sich das Signal, wobei das PCR Produkt abhängig ist von der Anzahl der Zyklen und der Konzentration des Ausgangsmaterials.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Messung der Konzentration durch den Einbau eines interkalierenden Fluoreszenz-Farbstoffes während der Amplifikation erfolgen. Der Farbstoff, beispielsweise SYBR Green, erzeugt ein stärkeres Fluoreszenz-Signal in Anwesenheit von doppelsträngiger DNA als in Anwesenheit von Einzelstrang DNA. Während der PCR wird doppelsträngige DNA gebildet, was / 57
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-27wiederum das Signal des Farbstoffes verstärkt. Die Stärke des Signals ist abhängig von der Anzahl der Zyklen und von der Konzentration des Ausgangsmaterials.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Messung der Konzentration durch den Einbau eines fluoreszenz-markierten Nukleotides während der Amplifikation stattfinden. Der Fluoreszenz Farbstoff, beispielsweise Fluorescin, ist dabei an ein Uracil gekoppelt, das während der Amplifikation eingebaut wird. Die Stärke des Signals ist abhängig von der Anzahl der Zyklen und der Konzentration des markierten Uracils und somit der Konzentration des Ausgangsmaterials.
In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Detektion über eine Kapillar-GelElektrophorese. Dabei wird an das erste Erkennungselement ein einzigartiger MassenTag mit einem Fluorophor angehängt. Das markierte erste Erkennungselement wird danach in das Instrument überführt, wobei dieses aufgrund des Massen-Tags identifiziert und über das Fluoreszenz-Signal quantifiziert werden kann.
In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Detektion über ein Massenspektrometer. Z.B. über Enzyme können spezielle Massen-Tags an das erste Erkennungselement angebunden werden. Die Unterscheidung erfolgt aufgrund der Masse, da die Tags unterschiedlich schwer sind. Die Methode erfordert keine Farbstoff-Markierung.
In einer anderen Ausführungsform erfolgt die Detektion über Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie (HPLC=high performance liquid chromatography). Diese Methode ermöglicht einerseits die Trennung von Zielmolekülen und kann andererseits, durch Messung eines Standards, Zielmoleküle identifizieren und quantitativ messen. Dabei wird die zu untersuchende Substanz mit einem Laufmittel (mobile Phase) vermischt und über eine Trennsäule (stationäre Phase) gepumpt.
Die vorliegende Erfindung kann insbesondere auch als Kit mit allen bzw. einer Anzahl an Teilen der angeführten Bestandteile angeboten werden.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben, ohne auf diese konkreten Ausführungsformen der Erfindung notwendigerweise limitiert zu sein.
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-28Beispiel 1: Aufbau von Analytsonden
Wie in Fig. 1 gezeigt können Analytsonden aus folgenden Teilen bestehen:
1. von links - Ein Aptamer (1a) als Einzelstrang kann eine oder zwei Erkennungselemente als Erkennungssequenzen (3a, 5a) enthalten.
2. von links - hier als Einzelstrang gezeigt. Diese Erkennungssequenzen können 5‘ oder 3‘ vom Aptamer angebracht sein. Zwischen Aptamer und Erkennungssequenz kann ein Verbindungselement (2a) (RNA oder DNA) vorgesehen werden. Das Verbindungselement kann einzelsträngig (2. von links, 2a) oder doppelsträngig (3. von links, 2a und 2b) sein.
3. von links - 2b zeigt einen zum Strang 2a komplementären Strang des Verbindungselements. In der doppelsträngigen Ausführungsform kann das Erkennungselement und das Detektionselement auf unterschiedlichen Strängen vorhanden sein oder auf denselben Strängen. Doppelsträngigkeit erlaubt die Nutzung von Doppelstrang-spezifischen Restriktionsenzymen zur Spaltung des Verbindungselements. Weiters kann eine qPCR-Erkennungssequenz vorgesehen werden, (qPCR-tag - 4a).
4. von links - Optional ist ein weiteres Verbindungselement (6) mit einer Peptidsequenz oder einem chemischen Crosslinker.
5. von links - Ebenfalls möglich ist ein Aptamer mit einem Erkennungselement als induzierbar signalgebende Einheit (7), wie einem Enzym das durch Substrateinfluss ein Signal liefern kann. Enzyme sind beispielsweise Luciferase, Peroxidase, alkal. Phosphatase. 2b/3b/4b/5b bezeichnen zu 2a, 3a, 4a, 5a komplementäre Stränge (DNA oder RNA). Die kammartigen Strukturen zeigen hybridisierbare Nukleinsäuren an bzw. hybridisierte Nukleinsäuren sofern ein Gegenstück gezeigt ist.
Tabelle 1 enthält eine Auflistung der in Figur 1 gezeigten beispielhaften Elemente erfindungsgemäßer Analytsonden.
1a Zellspezifisches Aptamer optional mit qPCR-Tag (Detektionselement optional mit direkt verbundenem Erkennungselement)
2a Verbindungstag (DNA oder RNA)
2b Komplementär Strang zum Verbindungstag (DNA oder RNA)
3a-5a Primerstelle
4a pPCR-Tag (weiteres Erkennungselement)
6 Verbindungstag: Peptidsequenz oder chemischer Cross-Linker
7 Enzyme: zum Beispiel Luciferase, Peroxidase, alkal. Phosphatase
2b, 3b, 4b, 5b Jeweils komplementärer Strang zu 2a, 3a, 4a oder 5a
Tabelle 1: Elemente der Analytsonden in Figur 1 / 57
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-29In den beispielhaften Ausführungsformen der Analytsonde ist gemäß Figur 2 statt dem Aptamer ein Antikörper (9) vorgesehen.
1. von links - Der Antikörper ist über einen Linker (8) mit der restlichen Analytsonde verbunden. Die weiteren Elemente sind wie in Fig. 1 dargestellt möglich.
2. von links - Alternativ kann der Antikörper über ein Aptamer (9a) gebunden werden, welches spezifisch den Antikörper bindet, z.B. den Fc-Teil des Antikörpers.
3. von links - In der Ausführungsform in Fig. 2 rechts wird ein Antikörper über ein Verbindungselement 2a, 2b an ein enzymatisches Erkennungselement (13) gebunden. Geeignete Enzyme sind beispielsweise Luciferase, Peroxidase, alkalische Phosphatase oder andere.
Tabelle 2 enthält eine Auflistung der in Figur 2 gezeigten beispielhaften Elemente erfindungsgemäßer Analytsonden.
2a Verbindungstag
2b Komplementär Strang zum Verbindungstag
3a-5a Primerstelle
4a qPCRtag (Erkennungselement)
8 Crosslinker
9 Zellspezifischer Antikörper (Detektionselement)
9a Aptamer, spezifisch gegen Fc Teil eines Antikörpers
10 Enzyme: zum Beispiel Luciferase, Peroxidase, alkal. Phosphatase
Tabelle 2: Elemente der Analytsonden in Figur 2
Beispiel 2: Verfahrensablauf
Fig. 3 und 4 zeigen schematisch Abläufe erfindungsgemäßer Verfahren. Von oben nach unten, von links nach rechts, den Pfeilen folgend: Zellen werden in 2D oder 3D kultiviert. Analytsonden (in Fig. 3 mit Antikörper-Detektionselement; in Fig. 4 als Aptamer) binden über das Detektionselement an die Zellen. Das Erkennungselement wird abgelöst - in Fig. 3 durch Änderung der Pufferbedingungen und somit Unterbrechung der Bindung an die Zellen, in Fig. 4 über eine Endonuklease. Die Zellen können nachfolgend weiter kultiviert werden (links unten). Das Erkennungselement wird nun von den Zellen separiert und in ein anderes Behältnis überführt und der Analyse zugeführt, z.B. über PCR und Bestimmung der Amplifikate, kolorimetrisch, durch Hybridisierung mit einer Markierungssonde, Kapillarelektrophorese, massen-spektrometrischer Bestimmung, HPLC, NGS. Fig. 5 zeigt einen Verfahrensablauf bei Verwendung einer Analytsonde mit einem Aptamer / 57
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-301a, welche als Detektionselement ein Zelloberflächenmolekül (15) bindet. Die Sonde hat weiters Primerbindungsstellen (3a und 5a) als Erkennungselemente. Die Analytsonde wird durch Ändern des Puffers (pH und/oder lonenstärke) von dem Zelloberflächenmolekül gelöst. Die von dem Zelloberflächenmolekül abgelösten Analytsonden werden in ein neues Behältnis transferiert und die Sonde wird durch PCR detektiert. Hierbei werden Vorwärtsprimer 3a* und Rückwärtsprimer 5b, welcher an die Primerstelle 5a bindet und das Amplifikat erster Generation (und jede weitere) eine Stelle 3b enthält, die vom Vorwärtsprimer 3a* für weitere Reaktionen gebunden werden. Die Polymerase ist gezeigt (18). Eine Markierungssonde 1a* bindet an eine dem Aptamer entsprechende Stelle am PCR-Produkt, wodurch das Aptamer und somit indirekt die ursprünglich gebundenen Aptamere bestimmt werden - durch qPCR auch quantitativ.
In Figur 6 wird eine Analytsonde gezeigt mit einem Antikörper (9) als Detektionselement, welcher über eine Linkergruppe an ein Verbindungselement (2a, 2b) gebunden ist, welches wiederum an ein Erkennungselement (3a), z.B. eine Vorwärtsprimersequenz, ein qPCRtag (4a) und eine Bindungsstelle für einen Rückwärtsprimer (5a) gebunden ist (bei der Detektion kann über die beiden Primerbindungsstellen mittels PCR der qPCRtag amplifiziert und detektiert werden). Die Analytsonde bindet an ein Zelleoberflächenmolekül (15). Durch Endonukleaseeinwirkung wird das Erkennungselement (Primer und PCRtag) abgespalten, in ein anderes Behältnis transferiert und über qPCR bestimmt. Hierbei werden die Primer 5b (Rückwärtsprimer) und 3a* (Vorwärtsprimer) zur PCR mit einer Polymerase (18) eingesetzt. Durch eine Markierungssonde 4a* (eine Fluoreszenzmarkierte qPCR Sonde) kann das abgespaltene Erkennungselement und damit indirekt die Analytsonde-gebundenen Zellen in einem ersten Schritt bestimmt werden.
Beispiel 3: Aptamerentwicklung
Für die Selektion entsprechender Aptamere als Detektionselement wurde eine DNA-Aptamerbibliothek (Trilink Biotechnologies) bestehend aus einer randomisierten 40 Basensequenz und flankierten definierten Primern gewählt. Die ersten zwei SELEX-Runden wurden direkt an Adipozytären abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (adMSCs/Thermofischer) durchgeführt, gefolgt von 10x SELEX-Runden an His-Tagged CD105 Protein (SinoBiological). Vor der ersten Runde an Zellen wurde die Aptamerbibliothek mittels PCR (Biomers For Primer/biotRevPrimer, Solis BioDyne
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-31Hot-Start FIREpol DNA-Polymerase) vervielfältigt und nachfolgend mit Streptavidin Beads (Promega) inkubiert. Nach Inkubation wurde der Doppelstrang mittels 0,1M NaOH 5min denaturiert, in ein neues Eppendorf Gefäß überführt und mit 0,1M HCL auf pH-Wert 7 gebracht.
Für die erste SELEX-Runde wurden adMSCs (P3) in einer T-75 Flask (Biogreiner) mit 5ml Alpha-Mem (SigmaAldrich) ohne FCS gewaschen. Die Aptamerbibliothek wurde in 3ml Alpha-Mem ohne FCS verdünnt, zu den Zellen transferiert und bei 30min 37°C inkubiert. Danach wurden die Zellen 3x mit 5ml AlphaMem ohne FCS gewaschen und zur Herablösung der nicht weggewaschenen Aptamere diese 10min bei 37°C mit DMEM (ROTH) + 500mM NaCl (SigmaAldrich) inkubiert. Das Eluat wurde in ein 15ml Falcon transferiert und das Volumen mittels 3k Amicon Ultrazentrifugationssäulen (Merck) nach Herstellerangaben reduziert. Das Eluat wurde mittels PCR vervielfältigt und die zweite SELEX-Runde entsprechend oben ebenfalls an Zellen durchgeführt. Für die Runden 3-12 wurden die Zellen durch HIS-tagged CD105 Protein ersetzt. CD105 Protein wurde vor der SELEX-Runde an magnetischen Anti-HIS-Beads (Promega) gekoppelt. In den ersten 6 Runden, sowie in Runde 12 wurde vor der Inkubation eine Negativ-Selektion durchgeführt. Hierbei wurde die Aptamerbibliothek in alpha-Mem ohne FCS mit „leeren HIS-Beads“ für 20min am Rotator inkubiert und nachfolgend magnetisch voneinander getrennt. Der Überstand (nicht gebundene Aptamere) wurde nachfolgend mit HIS-CD105, gekoppelt an Anti-His-Beads, für 30min bei Raumtemperatur am Rotator inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Konstrukt 3x mit Alpha-mem ohne FCS gewaschen und die Aptamere mit DMEM+500mM NaCl 10min eluiert. Das Aptamer-Eluat wurde mittels 3k Amicon Ultrazentrifugationssäulen aufkonzentriert und nachfolgend für die PCR verwendet. Die SELEX-Runden 3-8 wurden mit 2pg CD105-Protein (32pmol), die Runden 9-12 mit 1pg CD105-Protein (16pmol) durchgeführt. Als Kontrolle für SELEX wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten eine 30 und 40minütige AgaroseElektrophorese bei 80V durchgeführt. In einem 3% Agarosegel (50ml TAE (Sigma) +1g Agarose (Lonza) wurden die PCR-Produkte aufgetrennt und mittels PEQGreen (Peqlab) in einem Illuminator sichtbar gemacht. Nach der zwölften SELEX Runde wurde eine finale PCR durchgeführt und die erhaltene Aptamerfraktion für die Zellkulturexperimente aufbereitet.
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-32Beispiel 4: Detektion von CD105 in zweidimensionaler Zellkultur mit
Aptameren in unterschiedlicher Konzentration
Adipozytäre derived mesenchymale Stammzellen (adMSC) wurden CO2-frei in Tx175 Flasks in Alpha-Mem (Sigma) +10% FCS (Sigma) + HEPES12mM (Sigma) + MOPS 12mM (Sigma) + NaBi 5mM (Sigma) +0,5%PenStrep (Sigma) bei 37°C im Inkubator kultiviert. Während der Kultivierungsdauer wurde das Medium in der Zellkultur alle 2-3 Tage durch neues ersetzt. Bei 75-80% Konfluenz wurden die Zellen passagiert und in neuen Tx175 Flasks überführt. adMSCs wurden in P2 passagiert und mit einer Zellzahl von ~10000C in Wells einer 96-Wellplate ausgesät. Als NegativKontrolle (unspezifische Bindungen) wurden separate Vertiefungen ohne Zellen, jedoch mit Medium inkubiert.
Nach einer Woche mit 2 Medienwechseln wurde ein Zelltest mit in Beispiel 3 hergestellten Analytsonden durchgeführt. Die eingesetzten Analytsonden enthalten die in Beispiel 3 selektierten Aptamere welche CD105 spezifisch binden (Detektionselement) und einen qPCRtag als Erkennungselement.
Die aufbereitenden Aptamere wurden in einer Verdünnungsreihe in Alpha-Mem ohne FCS mit den Verdünnungen 1:250, 1:500, 1:1000, 1:5000, 1:10000 (Figur 7) vorbereitet. Als nächstes wurden die Verdünnungen 2 min auf 95°C erhitzt, gefolgt von 5min auf 4°C. Am Ende der 5min wurde diese auf Raumtemperatur gestellt. Die Zellen wurden mit 200pl Alpha-mem ohne FCS gewaschen und je 50pl der Aptamerverdünnungen in Triplikaten zu den Zellen bzw. jeweils einem leeren Well (Neg. Kontrolle/Unspezifische Bindungen) hinzugefügt. Die Platte wurde 30min bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Kulturen 2x mit 150pl Alpha-Mem ohne FCS gewaschen und mit 50pl/Well DMEM+500mM NaCl 10min inkubiert. Der Überstand wurde in eine Mikrotiterplatte zur Lagerung transferiert, mit einer Folie versiegelt und bei 4°C bis zur qPCR-Messung gelagert. Die qPCR wurde mit 25pl Ansätzen, besteht aus 5pl SybrGreen 2xMastermix (Sigma), 1pl FrPrimer (10pmol/pl), 1pl RevPrimer (10pmol/pl), 17pl ddH2O, 1pl Eluat durchgeführt. Nach einer 10 minütigen Initiation bei 95°C, erfolgte ein zyklisches Programm (40x) mit 95°C 15 Sekunden, 48°C 1 Minute, 72°C 30 Sekunden, sowie einer Schmelzkurvenanalyse mit 95°C 1 Minute, 48°C 30 Sekunden und 95°C 30 Sekunden (Fig.7).
Die Schmelzkurvenanalysen („Dissociation Curve“) zeigen Peaks für das gewünschte PCR Produkt (die CD105-Aptamere), jedoch finden sich ab einer 1:5000 / 57
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-33Verdünnung vermehrt ungewünschte DNA Fragmente, weswegen das Eluat der 1:500 Verdünnung für die Experimente gewählt wurde.
Nach den Ergebnissen aus der PCR wurde für die weiteren Experimente als Analytsonde das Eluat der 1:500 Verdünnung mittels PCR (FrPrimer/biotRevPrimer) vervielfältigt und mit Streptavidin Beads für weitere Messungen aufbereitet.
Beispiel 5: Detektion von CD105 in zwei- und dreidimensionaler Zellkultur an aufeinander folgenden Zeitpunkten
Adipozytäre derived mesenchymale Stammzellen wurden CO2-frei in Tx175 Flasks in Alpha-mem +10% FCS + HEPES12mM + MOPS 12mM +NaBi 5mM +0,5%PenStrep bei 37°C im Inkubator kultiviert. Während der Kultivierungsdauer wurde das Medium in der Zellkultur jeden 2-3 Tag durch neues ersetzt. Bei 75-80% Konfluenz wurden die Zellen passagiert und in neuen Tx175 Flasks überführt.
Vor dem Transferieren der Zellen in ALVETEX (Reprocell Inc.) wurden die Platten nach Herstellerangaben für die Zellkultur vorbereitet. ALVETEX Platten wurden mit 100ql 70% Ethanol 5min angefeuchtet, gefolgt von 2x waschen mit 1xPBS. Als letzter Schritt wurden 100ql Alpha-Mem mit FCS in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte pipettiert und die Platte auf 37°C transferiert.
Nach Passage 4 wurden die Zellen mittels Handystep-Pipette (Brand) mit einer Zellzahl von ~10.000/Vertiefung in ALVETEX und MIMETIX überführt.
Als Negativ-Kontrolle (unspezifische Bindungen) wurden separate Vertiefungen ohne Zellen, jedoch mit Medium verwendet. Als weitere visuelle Kontrolle wurde eine 2D-Zellkultur in 96Wellplate parallel mitgeführt.
Alle 2-3 Tage erfolgte ein Mediumwechsel mit neuem Alpha-Mem +10%FCS. Messungen der dreidimensionalen Zellkultur erfolgten sequentiell an den Tagen Tag4 (T1), Tag10 (T2 Ausfall der qPCR), Tag17 (T3) und Tag24 (T4), Messungen der zweidimensionalen Zellkultur erfolgten sequentiell an den Tagen Tag4 (T1), Tag11 (T2) und Tag18 (T3). Nach jeder Messung wurden die Zellen weiter kultiviert, bis zum Ende des Experiments, Tag24 (3D) und Tag18 (2D), und darüber hinaus.
Die eingesetzten Analytsonden enthalten die in Beispiel 3 selektierten CD105Aptamere welche spezifisch CD105 binden (Detektionselement) und einen qPCRtag als Erkennungselement enthalten.
Analytsonden wurden 1:500 entsprechend mit Alpha-Mem ohne FCS verdünnt und 3min auf 95°C erhitzt, nachfolgend auf Eis 5min runtergekühlt und danach auf / 57
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-34Raumtemperatur bereit gestellt. Zellen wurden 1x mit 150μΙ Alpha-Mem ohne FCS gewaschen, 50μl Aptamerlösung pro Vertiefung transfriert und 30min bei 37°C inkubiert. Danach wurde überschüssige Aptamere 3-4x durch Waschen mit 150μl Alpha-Mem ohne FCS entfernt. Die gebundenen Aptamere wurden mit 50μl DMEM+500mM NaCl 10min eluiert und in eine Mikrotiterplatte zur Lagerung transferiert. Diese wurde mit Folie versiegelt und bei 4°C bis zur qPCR gelagert. Die qPCR wurde mit 25μl Ansätzen, besteht aus 12^l 2fach GreenMastermix LowRox (BiotechRabbit), ^l FrPrimer (10pmol^l), ^l RevPrimer (10pmol^l), 5^l ddH2O, 5μl Eluat durchgeführt. Nach einer 3 minütigen Initiation bei 95°C, erfolgte ein zyklisches Programm (40x) mit 95°C 15 Sekunden, 48°C 30 Sekunden, 72°C 30 Sekunden, sowie einer Schmelzkurvenanalyse mit 95°C 1 Minute, 48°C 30 Sekunden und 95°C 30 Sekunden (Figur 8 (zweidimensional) und Figur 9 (dreidimensional)).
Die Schmelzkurvenanalyse zeigt dass das PCR Produkt zum Aptamere CD105 an allen drei Messpunkten im zweidimensionalen Zellkultursystem (Fig. 8a) und im dreidimensionalen Zellkultursystem (Fig. 9a) konstant ist und gibt Rückschlüsse über die Reinheit des PCR-Produkts.
Die metabolische Aktivität der Zellen wurde während des Experiments anhand des Mediumüberstandes kontrolliert. Hierfür wurde der Mediumüberstand visuell direkt vor der ersten Messung und jeweils einen Tag nach einer Messung auf Farbumschläge des pH-Indikators im Medium begutachtet. Diese Begutachtung zeigt, dass die Zellen durch das erfindungsgemäße Verfahren in ihrer metabolischen Aktivität lediglich gering bis gar nicht beeinträchtigt wurden.
Beispiel 6: Mikrofluidik
Zellkultur
Ein Kryovial mit einer Zellkonzentration von 106 Zellen/ml vom Fett isolierten mesenchymalen Stammzellen (adMSC) wurde aus dem Stickstofftank aufgetaut und in einer T-Flask ausgesät. Die Zellen wurden bei 37°C/5% CO2 inkubiert und ein Wechsel des Mediums wurde alle 2-3 Tage vorgenommen. Nachdem etwa 50% Konfluenz erreicht waren, wurden die Zellen mittels PBS und Akutase passagiert und neu ausgesät.
Für die Experimente im Mikrofluidik System wurden Zellen in 96-Wellplatten parallel kultiviert. Hierfür wurden 50.000 Zellen/100 ql Wachstumsmedium in eine definierte Anzahl von Wells überführt. Bei mikrofluidischen Chips wurde die / 57
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-35Zellsuspension unter Verwendung des Mikroskops mit einer Spritze auf den Chip aufgebracht. Nachdem sichergestellt wurde, dass sich Zellen in dem Chip befinden, wurde dieser für eine halbe Stunde zur Anheftung inkubiert, bevor der Fluss des Wachstumsmediums durch das System gestartet wurde. In beiden Systemen wurden die Zellen konfluent gezüchtet, und das Medium wurde gegen 5% FBS enthaltendes Wachstumsmedium ausgetauscht. Für Negativkontrollen wurden Wells und Mikrofluidikkammern mit ausschließlich Wachstumsmedium plus 5% FBS und ohne Zellen verwendet.
Kontrolle: 96-Wellplate
Vor dem Start wurden die Lösungen auf Raumtemperatur vorgewärmt. Danach wurden CD105-Aptamer-Sonden 1: 500 verdünnt, für 3 Minuten auf 95 ° C erhitzt und bis zur weiteren Verarbeitung auf Eis gelegt. Die Zellen wurden mit 150 pl Bindungspuffer gewaschen, mit 50 pl der verdünnten Sonden behandelt und 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurden die Zellen sechsmal mit Bindungspuffer gewaschen und 50 pl Elutionspuffer wurden zugegeben. Nach einer 10-minütigen Inkubation bei 37°C wurden 2 pl-Aliquot als Probe für den qPCR-Test genommen.
Mikrofuidik PDMS-Chip:
Vor der Verwendung im Mikrofluidik-Chip wurden die Analytsonden wie oben beschrieben vorbereitet. Die eingesetzten Analytsonden enthalten, die in Beispiel 3 selektierten CD105-Aptamere, welche spezifisch CD105 binden (Detektionselement) und einen qPCRtag als Erkennungselement enthalten.
Die Zeitpunkte für die Zugabe der verschiedenen Lösungen waren wie folgt:
10min - Bindungspuffer
30min - verdünnte Analytsonden
60min - Bindungspuffer
10min - Elutionspuffer
50pL Eluat wurden gesammelt und 2pL wurden als Probe für den qPCR Test verwendet.
qPCR
Für die qPCR wurde ein MasterMix (siehe Tabelle 3) hergestellt, von dem 23 pl in ein Well einer qPCR-Platte transferiert wurden. Anschließend wurden die Proben / 57
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-36zugegeben und die qPCR-Platte mit Klebeband verschlossen und in die qPCRMaschine überführt. Das in Tabelle 4 beschriebene Programm wurde eingegeben und gestartet.
1x 15x
ddH2O 10.^L 151^L
Vorwärts Primer 100μΜ 0^L 3μL
Rückwarts Primer 100μΜ 0^L 3μL
5x Evagreen 12^L 187^L
Mastermix Gesamt 23μL 345μL
Sample 2μl
qPCR 25μl
Tabelle 3: qPCR
Schritt Temperatur Zeit
Hot Start 95°C 15 min
40 Zyklen 95°C 15 s
48°C 1 min
72°C 30 s
95°C 1 min
48°C 30s
Tabelle 4: qPCR Programm / 57
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Claims (15)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    1. In-situ-Verfahren umfassend
    a) Bestimmung eines Moleküls, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Zelloberflächenmolekülen und extrazellulären Matrixmolekülen in einem zwei- oder dreidimensionalen Zellkultursystem enthaltend lebende Zellen und Zellkulturmedium, umfassend die Schritte
    i) Bereitstellen einer Analytsonde bestehend aus einem Detektionselement, welches das Molekül bindet, und einem oder mehreren Erkennungselementen;
    ii) Binden der Analytsonde an das Molekül in dem Zellkultursystem, wobei die enthaltenen lebenden Zellen durch diesen Schritt in ihrer Wachstumsfähigkeit nicht wesentlich beeinträchtigt werden;
    iii) gegebenenfalls Entfernen ungebundener Analytsonden;
    iv) Ablösen der Analytsonde;
    v) Transfer in ein von dem Zellkultursystem unterschiedliches Behältnis;
    vi) Detektieren des oder der Erkennungselemente; und
    b) Fortsetzen der Zellkultivierung in dem Zellkultursystem.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass nach Ablauf einer bestimmten Zeitspanne, vorzugsweise 1-7 Tage, das Molekül in demselben Zellkultursystem erneut bestimmt wird.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionselement ein Aptamer ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus nukleotidbasierten und peptidbasierten Aptameren.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionselement ausgewählt ist aus einem Antikörper, einem Antikörperfragment, einem Antikörperderivat oder einem Antikörper-Aptamer Konjugat.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Analytsonde ein oder mehrere Verbindungselemente enthält.
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  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Zelloberflächenmolekül ein Membranprotein ist, beispielsweise ein Rezeptorprotein, Transporterprotein, Zell-Zell-Erkennungs-Protein, Zell-Matrix-Protein, Enzym, Signalübertragungsprotein oder andere Bestandteile einer Zellmembran oder Zellwand.
  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das extrazelluläre Matrixmolekül ein Glykoprotein ist, beispielsweise Collagen, Fibrin, Elastin oder Vitronektin oder ein Glykosaminoglykan ist, beispielsweise Hyaluronsäure, Heparansulfat, Chondroitinsulfat oder Keratansulfat.
  8. 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen in dreidimensionaler Zellkultur auf einer Oberfläche, einem festen dreidimensionalen Gerüst oder einem Hydrogel angeheftet oder fixiert sind, oder als Zellaggregat oder Sphäroid in Suspension vorliegen.
  9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Durchführung der Schritte ii) bis iv) in dem Zellkultursystem in statischer Umgebung, vorzugsweise in einem Behältnis wie einer Mikrotiterplatte oder anderem Kulturgefäß, oder unter Perfusion, vorzugweise in einem Bioreaktor-, Mikrofluidiksystem oder einer gespülten Mikrotiterplatte stattfindet.
  10. 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei in Schritt ii) die Analytsonden in Relation zum Zelloberflächenmolekül oder extrazellulären Matrixmolkül im Überschuss vorliegen.
  11. 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungselement der Analytsonde in Schritt vi) mittels PCR, vorzugsweise qPCR, RT-PCR, digitale PCR, Touchdown PCR, asymmetrische PCR, Solidphase PCR oder Nested PCR, oder indirekt durch Bindung an ein komplementäres Bindungselement detektiert wird, wobei vorzugsweise das komplementäre Bindungselement photodetektierbar ist.
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  12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungselement der Analytsonde eine Luciferase, Peroxidase, alkalische Phosphatase oder ein Enzym-Reporterelement aufweist und die Detektion in Schritt v) mittels entsprechenden Substrats, in dem von dem Zellkultursystem unterschiedlichen 5 Behältnis erfolgt.
  13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Erkennungselement der Analytsonde in Schritt v) mittels massenspektrometrischer Bestimmung, mittels Durchflusszytometrie oder mittels
    10 Sequenzierung, vorzugsweise Next Generation Sequenzierung, detektiert wird.
  14. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül durch Schritte ii) und v) abgesehen von Komplexbildung mit dem Detektionselement chemisch unverändert bleibt und weiter in dem Zellkultursystem
  15. 15 geführt werden kann.
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