DE102014114522B4

DE102014114522B4 - Verfahren zur Charakterisierung und Selektion Hapten-spezifischer Hybridomazellen und Herstellung hochaffiner monoklonaler anti-Hapten-Antikörper

Info

Publication number: DE102014114522B4
Application number: DE102014114522.4A
Authority: DE
Inventors: Rudolf Schneider; Maren Kuhne
Original assignee: Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung BAM; Bundesministerium fuer Wirtschaft und Energie
Current assignee: Bundesanstalt fuer Materialforschung und Pruefung BAM; Bundesministerium fuer Wirtschaft und Energie
Priority date: 2014-10-07
Filing date: 2014-10-07
Publication date: 2023-08-10
Anticipated expiration: 2034-10-08
Also published as: DE102014114522A1

Abstract

Zellkonjugat zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene umfassend- eine Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern,- mindestens ein Haptenkonjugat, umfassend das Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und ein hochmolekulares Trägermolekül, wobei das mindestens eine Haptenkonjugat an einen anti-Hapten-Antikörper über das Hapten gebunden ist.

Description

Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der Herstellung hochaffiner anti-Hapten-Antikörper. Ferner befasst sich die vorliegende Erfindung mit einem Markierungsverfahren zur durchflusszytometrischen Charakterisierung und Selektion Haptenspezifischer Hybridomazellen.
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene sind sehr kosten- und zeitintensiv und führen häufig nicht zu den gewünschten hochaffinen monoklonalen Antikörpern. Haptene sind niedermolekulare Substanzen ohne immunogene Wirkung (MW < ca. 1500). Allerdings können Haptene eine Immunreaktion auszulösen, wenn sie vor der Immunisierung an größere Moleküle wie beispielsweise BSA (bovine serum albumin), KLH (keyhole limpet hemocyanin) oder OVA (Ovalbumin) gekoppelt werden. Die immunchemische Bestimmung von Haptenen hat vor allem in der Umweltanalytik (Nachweis von Hormonen und Arzneimittelwirkstoffen im Wasserkreislauf), in der Lebensmittelanalytik (Nachweis von Pilzgiften und Antibiotikaeinsatz), dem Dopingnachweis, dem Drogenscreening (roadside monitoring) sowie in der Human- und Veterinär-Diagnostik zunehmende Bedeutung erlangt. Beispielsweise lehrt die Druckschrift WO 95/ 06249 A1 die Markierung von Produkten zur Feststellung von deren Identität und Herkunft. Insbesondere wird die Markierung chemischer Substanzen, wie Pestizide, pharmazeutischer Wirkstoffe, Agro- und Industriechemikalien, Detergentien, Klebstoffe, Nahrungsergänzungsmittel und Prozesschemikalien mit einem immunchemisch nachweisbaren, zuvor nicht mit der Substanz assoziierten Hapten beschrieben. Die Herstellung monoklonaler Antikörper grundsätzlich, wie ebenfalls im Speziellen für Haptene, ist bis heute problembehaftet und erfolgt noch immer weitgehend durch die Hybridomatechnik, die von Köhler und Milstein 1975 entwickelt wurde. Bei diesem aufwendigen Verfahren wird zunächst eine weibliche Balb/c Maus mit dem spezifischen Antigen immunisiert. Die B-Zellen, die Antikörper bilden, werden der Maus entnommen und mit Myelomzellen zu Hybridomazellen, ggf. unter Benutzung der Elektrofusionstechnik, verschmolzen. Sie vereinen die Eigenschaften beider Ursprungszellen in sich: Sie können Antikörper produzieren und sich unbegrenzt teilen.
Problematisch bei der Herstellung spezifischer Hybridomazellen ist allerdings, dass nach der Fusion Zellgemische unterschiedlicher Hybridomazellen vorliegen. Für die Herstellung monoklonaler Antikörper ist jedoch das Vorliegen von monoklonalen Zellpopulationen notwendig. Zur Etablierung einer monoklonalen Zellpopulation ist daher eine Trennung der Zellgemische unterschiedlicher Hybridomazellen erforderlich, die durch eine Vereinzelung oder Klonierung der antikörperproduzierenden Zellen durchgeführt wird. Die am häufigsten angewendeten Verfahren zur Monoklonalisierung sind dabei:
- Einzelzellaussaat: Die Einzelzellaussaat (Limiting-dilution-Verfahren) ist die Standardmethode, bei der die Zellsuspension in Mikrotiterplatten mit durchschnittlich weniger als einer Zelle pro Kavität verdünnt wird. Als Nachteil dieser Methode erweist sich der Umstand, dass die Anzahl der zu screenenden Klone begrenzt ist (low throughput). Nur wenige hundert Klone können realistisch gesehen analysiert werden, obwohl mehrere tausend oder sogar zehntausende Klone notwendig wären, um den Klon mit den gewünschten Eigenschaften zu finden. Daher steigt der Verlust an guten Produzenten aufgrund der geringen Zahl gescreenter Zellen. Das Verfahren ist somit zeit- und kostenaufwendig. Es gibt keine Garantie, dass die entstandene Zelllinie von einer Einzelzelle abstammt und somit ist die Monoklonalität oft nicht gewährleistet. Zudem besteht hier sehr stark die Gefahr, dass Nicht-Produzenten die Antikörper-produzierenden Zellen überwachsen. Einzelzellaussaat ist daher für eine technische Anwendung weitestgehend ungeeignet.
- Wachstum in Weichagar: Die frisch fusionierten Hybridomazellen werden in Weichagar resuspendiert. Als Weichagar wird ein Zellkulturmedium bezeichnet, das durch einen Anteil von Agar, Agarose oder Methylcellulose einen viskosen (halbfesten) Zustand hat. Einzelzellen sind in dem viskosen Medium bewegungsunfähig, was ihnen erlaubt, sich separat zu vermehren, so dass monoklonale Kolonien entstehen. Das individuelle Picken der einzelnen Kolonien ermöglicht die Isolation einzelner monoklonaler Kolonien. Dadurch können einzelne Klonierungsschritte gespart werden. Die Methode des Klonierens in Weichagar leidet jedoch darunter, dass sie sehr mühsam ist. Ihre praktische Bedeutung ist gering, da auch die Handhabung eine Reihe technischer Schwierigkeiten mit sich bringt. Die Luftfeuchtigkeit im Brutschrank muss optimal sein, damit das viskose Medium nicht austrocknet. Das Picken der Klone und die anschließende Anzucht in Flüssigmedium sind sehr zeitintensiv, da für einen guten Antikörper mehrere hundert bis tausende Klone angezogen und analysiert werden müssen. Daher zählt auch diese Methode zum low throughput und ist für eine technische Anwendung ungeeignet.
- Durchflusszytometrie und Zellsortierung: Die Durchflusszytometrie ist eine Methode, verschiedene morphologische Eigenschaften von Einzelzellen in Suspension zu analysieren, während sie in einem Flüssigkeitsstrom transportiert jeweils einzeln einen Laser passieren. Mehrere Millionen Zellen können in kurzer Zeit analysiert werden und Zellpopulationen oder Einzelzellen können in Zellgemischen detektiert werden. Bei der Durchflusszytometrie und der damit verbundenen Zellsortierung ist es möglich, viele Klone in kurzer Zeit zu analysieren (high throughput). Durch eine Sortiereinheit am Durchflusszytometer wird die Separation von Zellen nach bestimmten Parametern bewirkt. Es ist möglich, Zellpopulationen oder Einzelzellen mit spezifischen Eigenschaften auszusortieren und zu kultivieren. Die Testung der Produktivität der Hybridomaklone kann durch Analyse der Zellkulturüberstände mittels ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) erfolgen.
Da die Selektion der „richtigen“ Klone der Flaschenhals der Hybridomatechnik ist, ist ein Verfahren wünschenswert ist, das einen hohen Durchsatz (high throughput) ermöglicht, wie beispielsweise die Durchflusszytometrie. Allgemein gilt, dass die Anzahl der antikörperproduzierenden Klone im Durchschnitt abhängig von der Anzahl der gescreenten Klone ist. Voraussetzung für eine Anwendung von Durchflusszytometrie und Zellsortierung auf Hybridomazellen ist, dass die zu untersuchenden Hybridomazellen Antikörper auf ihrer Oberfläche tragen. Für den durchflusszytometrischen Nachweis der membranständigen Antikörper auf Hybridomazellen ist eine Markierung dieser Antikörper erforderlich, für die wiederum spezifische fluorophormarkierte Antikörper und entsprechende fluorophormarkierte Antigene benötigt werden.
Bisherige durchflusszytometrische Untersuchungen von Hybridomazellen zielten darauf ab, mittels eines FITC-markierten anti-mouse-IgG lediglich grundsätzlich IgG-Antikörper nachzuweisen und zu selektionieren, ohne dass Informationen zur Spezifität des Hybridomazellklones gemacht werden können. Es ist daher lediglich möglich, eine Aussage zu treffen, ob IgG-Antikörper auf der Hybridomazelle vorhanden sind, es ist allerdings keine Aussage möglich, ob diese Antikörper spezifisch für ein Antigen, wie beispielsweise Haptene sind. Eine Aussage über die Leistungsfähigkeit der Hybridomazellen hinsichtlich der Herstellung von spezifischen hochaffinen monoklonalen Antikörpern konnte mittels Durchflusszytometrie nicht getroffen werden. Daher hat diese potentiell schnellste und industriell anwendbare Methode bisher keinen Einsatz in der Routine gefunden.
Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung hochaffiner monoklonaler Antikörper gegen Haptene bereitzustellen, das zudem einen geringen Zeit- und Kostenaufwand ermöglicht.
Vor diesem Hintergrund wird ein Zellkonjugat nach Anspruch 1 sowie die Verwendung eines Haptenkonjugats nach Anspruch 7 vorgeschlagen. Ferner wird ein Verfahren zur Markierung von Hybridomazellen nach Anspruch 10, ein Verfahren zur Charakterisierung und Selektion von Hybridomazellen nach Anspruch 13 und ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene nach Anspruch 17 vorgeschlagen. Weitere Ausführungsformen, Modifikationen und Verbesserungen ergeben sich anhand der folgenden Beschreibung und der beigefügten Ansprüche.
Es konnte ein antigenspezifischer Marker zur Verfügung gestellt werden, der es ermöglicht, spezifische Antikörper auf der Oberfläche von Hybridomazellen zu markieren, um eine Aussage über die Spezifität des Hybridomaklons geben zu können. Dies ermöglicht den Einsatz von Durchflusszytometrie und der Zellsortierung als high-throughput-Verfahren beim Screening und der Klonierung der Hybridomazellen, und erlaubt dabei die Selektion solcher Hybridomazellen, die hochaffine monoklonale Antikörper herstellen.
Es konnte ferner überraschend gezeigt werden, dass eine Anbindung eines hochmolekularen Trägermoleküls an ein Hapten notwendig ist, um eine Charakterisierung spezifischer Hybridomazellen während einer Durchflusszytometrie zu ermöglichen. Im Gegensatz dazu lässt eine direkte Markierung von Haptenen mit niedermolekularen Fluoreszenzfarbstoffen eine solche Charakterisierung nicht zu.
Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Zellkonjugat zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene umfassend

- Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern,
- mindestens ein Haptenkonjugat, umfassend ein Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und ein hochmolekulares Trägermolekül, wobei das mindestens eine Haptenkonjugat an einen anti-Hapten-Antikörper über das Hapten gebunden ist, vorgeschlagen.

Durch das vorgeschlagene Zellkonjugat ist es möglich, lebende Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern spezifisch auf diese Antikörper auf der Oberfläche der Hybridomazellen zu markieren und dadurch eine Aussage zu erhalten, ob hochaffine Antikörper auf der Oberfläche vorhanden sind. Ferner können diejenigen Zellkonjugate mit der höchsten Affinität durchflusszytometrisch charakterisiert und als Einzelzellen sortiert und weiter kultiviert werden.
Ein Hapten im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine niedermolekulare (MW < ca. 1500) Substanz ohne immunogene Wirkung, also niedermolekulare Substanzen, die selbst direkt keine Immunantwort (und damit keine Antikörperproduktion) auslösen und daher zur Immunisierung und für ein Screening an Trägerproteine angekoppelt werden müssen. Somit können Haptene eine Immunreaktion auslösen, wenn sie vor der Immunisierung an größere Moleküle wie beispielsweise BSA (bovine serum albumin), KLH (keyhole limpet hemocyanin) oder OVA (Ovalbumin) gekoppelt werden.
Beispiele für geeignete Haptene und deren Anwendungsfelder im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Steroide, insbesondere Östrogene wie Estron (E1) und Estradiol (E2), Prostaglandine, Vitamin B12, Digoxin, Digitoxin, Theophyllin, Methotrexat; Digoxigenin (DIG), Testosteron, Progesteron; Kontaminanten wie polyzyklische Aromaten (PAH), PCB (Polyzyklische Biphenyle), Dioxine; Materialinhaltsstoffe wie Phthalate (Weichmacher); Pestizide/Biozide wie Atrazin, Isoproturon, Mecoprop, Azinphosethyl; Zusatzstoffe aus Kosmetika, wie Duftstoffe wie beispielweise Moschusverbindungen; Arzneimittelwirkstoffe wie Carbamazepin, Diclofenac, Sulfamethoxazol (SMX), Ethinylestradiol; Mykotoxine wie Ochratoxin A, Zearalenon, Aflatoxin (Afla), Denivalenol; Mikrozystine; Anabole Substanzen wie Chloramphenicol; Antibiotika wie Sulfamethazin; Rauschmittel wie Kokain, inkl. des Metaboliten Benzoylecgonin , Tetrahydrocannabinol (THC). Anwendungsfelder sind zum Beispiel die Umweltanalytik, Lebensmittelanalytik, die klinische Diagnostik, Arzneimitteldiagnostik, Dopinganalytik und Drogenanalytik.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Zellkonjugats der vorliegenden Erfindung sind deutlich mehr als ein Haptenkonjugat an die Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern angebunden. Dabei kann angenommen werden, dass eine hohe Anzahl von Haptenkonjugaten auf der Oberfläche der Hybridomazelle Ausdruck dafür ist, dass zum einen eine hohe Anzahl von anti-Hapten-Antikörpern auf der Oberfläche vorhanden sind und ferner dass die anti-Hapten-Antikörper auf der Oberfläche besonders gut das entsprechende Antigen binden und daher möglichst viele, im besten Fall alle auf der Oberfläche befindlichen Antikörper eine Bindung mit dem Haptenkonjugat eingegangen sind.
Bestandteil des Zellkonjugats der vorliegenden Erfindung ist ein hochmolekulares Trägermolekül, das an das Hapten angebunden ist und zusammen mit dem Hapten ein Haptenkonjugat bildet. Als hochmolekulares Trägermolekül können Proteine, oder hochmolekulare Verbindungen mit einem Molekulargewicht von >10000 g/mol fungieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein hochmolekulares Trägermolekül vorgeschlagen, das mehr als eine Bindestelle für einen Trägermolekül-spezifischen Marker aufweist. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform wird ein hochmolekulares Trägermolekül vorgeschlagen, das >2, weiter bevorzugt > 5, noch weiter bevorzugt >10, und am meisten bevorzugt > 15 Bindestellen für einen Trägermolekül-spezifischen Marker aufweist.
Vorteile einer solchen Ausführungsform bestehen darin, dass durch Anbindung mehrerer Trägermolekül-spezifischer Marker eine Signalverstärkung während der Durchflusszytometrie erreicht werden kann, und somit eine hohe Fluoreszenzintensität beobachtet werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das hochmolekulare Trägermolekül ausgewählt aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus BSA (bovine serum albumin), KLH (keyhole limpet hemocyanin), OVA (Ovalbumin) und Meerrettichperoxidase. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das hochmolekulare Trägermolekül Meerrettichperoxidase (POD). Ferner können auch aktivierte Trägermoleküle verwendet werden wie beispielsweise maleimid-aktivierte Träger. Auch kann ein Streptavidin-Biotin-Komplex als Träger fungieren.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Zellkonjugat vorgeschlagen, das ferner einen Trägermolekül-spezifischen Marker umfasst. Ein Trägermolekül-spezifischer Marker ist ein Markermolekül, vorzugweise ein Fluoreszenzmarkermolekül, das spezifisch an das hochmolekulare Trägermolekül des Zellkonjugats der vorliegenden Erfindung bindet.
Vorteile dieser Ausführungsform bestehen darin, dass durch die Anbindung des Trägermolekül-spezifischen Markers anti-Hapten-Antikörper auf der Oberfläche der Hybridomazellen für gängige Analysemethoden mittels Fluoreszenzlichtdetektion erkennbar werden, sowie charakterisiert, detektiert und selektiert werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Trägermolekül-spezifische Marker spezifisch bindend an Meerrettichperoxidase, in einer weiter bevorzugten Ausführungsform ist der Trägermolekül-spezifische Marker ein an Meerrettichperoxidase spezifisch bindender Fluoreszenzfarbstoff, und einer besonders bevorzugten Ausführungsform anti-Meerrettichperoxidase-AlexaFluor®488 oder anti-Meerrettichperoxidase-Fluoresceinisothiocyanat (FITC).
Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird ein Zellkonjugat vorgeschlagen, das einen zweiten Marker mit unterschiedlichem Fluoreszenzbereich zum Trägermolekül-spezifischen Marker aufweist. Vorzugsweise ist der zweite Marker ein IgG-spezifischer Marker, der freudig an membranständige IgG-Antikörper bindet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der zweite Marker ein anti-mouse-IgG-spezifischer Marker. Geeignete Marker, die als zweiter Marker mit unterschiedlichem Fluoreszenzbereich zum Trägermolekül-spezifischen Marker fungieren können, insbesondere IgG-spezifische Marker, sind anti-mouse-IgG-AlexaFluor®647, anti-mouse-IgG-Cy5, anti-mouse-IgG-APC, anti-mouse-IgG-DyLight650 und anti-mouse-IgG-Qdot655. Die Fluoreszenzfarbstoffe für anti-Meerrettichperoxidase und dem Trägermolekül-spezifischen Marker können variieren, solange sie sich im unterschiedlichen Fluoreszenzbereich befinden.
Vorteile dieser Ausführungsform bestehen darin, dass bei Zellkonjugaten mit gebundenem Trägermolekül-spezifischem Marker und zweitem Marker Antikörper mit Subklasse IgG identifiziert werden können. Dadurch kann ferner ein Beitrag zur Beurteilung der Monoklonalität herbeigeführt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der zweite Marker mit unterschiedlichem Fluoreszenzbereich zum Trägermolekül-spezifischen Marker anti-IgG-AlexaFluor®647.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird eine Verwendung eines Haptenkonjugats zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen, wobei das Haptenkonjugat umfasst:

- ein Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und
- ein hochmolekulares Trägermolekül.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Verwendung eines Haptenkonjugats zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen, wobei das hochmolekulare Trägermolekül ein Molekulargewicht von >10000 g/mol aufweist.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine Verwendung eines Haptenkonjugats zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen, wobei das hochmolekulare Trägermolekül Meerrettichperoxidase ist.
Durch die Verwendung von Hapten-POD-Konjugaten wird die Testung der Monoklonalität und Affinität von Hybridomazellen möglich.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Verwendung eines Haptenkonjugats zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen, wobei das Hapten ein Östrogen, ein Steroid oder ein Arzneimittelwirkstoff ist. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist es möglich, auch andere Haptene in das hier vorgeschlagene Haptenkonjugat für eine Verwendung eines Haptenkonjugats zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern zu implementieren. Geeignete Haptene sind in Paragraph [0013] angeführt. Bevorzugte Beispiele für ein Hapten gemäß einer vorgeschlagenen Verwendung eines Haptenkonjugats zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern sind Digoxigenin, Estron, Estradiol und Carbamazepin .
Ferner wird die Verwendung eines hierin vorgeschlagenen Haptenkonjugats umfassend ein Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und ein hochmolekulares Trägermolekül zur Charakterisierung und Selektion von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen. Darüber hinaus wird die Verwendung eines hierin vorgeschlagenen Haptenkonjugats umfassend ein Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und ein hochmolekulares Trägermolekül zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene vorgeschlagen, insbesondere gegen Östrogene, Steroide oder Arzneimttelwirkstoffe.
Gemäß eines weiteren Aspekts wird ein Verfahren zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen umfassend die Schritte:

- Schritt a) Bereitstellung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern,
- Schritt b) Bereitstellung eines Haptenkonjugats umfassend:
- ein Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und
- ein hochmolekulares Trägermolekül,
- Schritt c) Anbindung des Haptenkonjugats an die anti-Hapten Antikörper der Hybridomazellen zur Ausbildung eines Zellkonjugats, und
- Schritt d) Umsetzen des Zellkonjugats mit einem Trägermolekül-spezifischen Marker.

Durch ein Verfahren gemäß dem obigen Vorschlag können Zellkonjugate gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellt werden, die zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern geeignet sind und die es ermöglichen, leistungsstarke Hybridomazellen durchflusszytometrisch zu charakterisieren. Ferner können durch das vorgeschlagene Verfahren Zellkonjugate zur Verfügung gestellt werden, die es ermöglichen Hybridomazellen zu detektieren und zu selektieren, die hochaffine anti-Hapten-Antikörper auf der Oberfläche tragen. Im Speziellen bedeutet das, dass durch die Markierung mit Hapten-POD-Konjugaten Hybridomazellen (Klone, Fusionsgemische oder Einzelzellen) hinsichtlich der Produktivität und Affinität ihrer Antikörper mittels Durchflusszytometrie charakterisiert werden können. Es ermöglicht eine Unterscheidung von Hybridomazellen (Populationen oder Einzelzellen), die höher- oder niedrig-affine anti-Hapten-Antikörper produzieren.
Gemäß einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern ferner umfassend den Schritt:

- Schritt e) Umsetzen des Zellkonjugats mit einem zweiten Marker mit unterschiedlichem Fluoreszenzbereich zum Trägermolekül-spezifischen Marker.

In einer Ausführungsform ist der zweite Marker mit unterschiedlichem Fluoreszenzbereich zum Trägermolekül-spezifischen Marker ein IgG-spezifischer Marker. Gemäß dem vorgeschlagenen Verfahren umfassend Schritt e) können Zellkonjugate zur Verfügung gestellt werden, die zwei verschiedene Markierungsmoleküle tragen; zum einen Trägermolekül-spezifischen Marker und zum anderen einen zweiten Marker mit unterschiedlichem Fluoreszenzbereich zum Trägermolekül-spezifischen Marker, insbesondere einen IgG-spezifischen Marker. Durch das Anbringen unterschiedlicher Markierungsmoleküle können besonders leistungsfähige Hybridomazellen durchflusszytometrisch charakterisiert, und im Folgenden detektiert und selektiert werden.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Schritte d) und e) gleichzeitig durchgeführt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen, wobei der Trägermolekül-spezifische Marker anti-Meerrettichperoxidase-AlexaFluor®488 ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Verfahren zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen, wobei der zweite Marker ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend oder bestehend aus anti-mouse-IgG-AlexaFluor®647, anti-mouse-IgG-Cy5, anti-mouse-IgG-APC, anti-mouse-IgG-DyLight650 und anti-mouse-IgG-Qdot655.
Mittels dieser bevorzugten Markierungsmoleküle wird es gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht, antigenspezifische und hochaffine anti-Hapten-Antikörper auf der Oberfläche von Hybridomazellen zu charakterisieren, detektieren und ferner leistungsstarke und hochspezifische Hybridomazellen mittels Durchflusszytometrie und Zellsortierung zu selektieren. Die Markierung der lebenden Hybridomazellen mittels Hapten-Meerrettichperoxidase-Konjugaten ermöglicht deren Selektion in Verbindung mit dem high-throughput-fähigen Verfahren der Durchflusszytometrie und ferner die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene.
Gemäß eines weiteren Aspekts wird ein Verfahren zur Charakterisierung und Selektion von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen umfassend die Schritte

- Schritt a) Herstellung von Zellkonjugaten gemäß der vorliegenden Erfindung umfassend Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern, mindestens ein Haptenkonjugat umfassend ein Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und ein hochmolekulares Trägermolekül, einen Trägermolekül-spezifischen Marker und einen IgG-spezifischen Marker;
- Schritt b) Durchführung von Durchflusszytometrie mit den Zellkonjugaten,
- Schritt c) Selektion von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern mittels Zellsortierung.

Durch das vorgeschlagene Verfahren zur Charakterisierung und Selektion von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern können leistungsstarke und hochspezifische Hybridomazellen durch Durchflusszytometrie detektiert und anschließend durch Einzelauswahl selektiert werden. Eine Selektion ermöglicht in vorteilhafter Weise eine Monoklonalisierung der zu produzierenden Antikörper, im Speziellen von anti-Hapten-Antikörpern. Ferner ist durch die vorliegende Erfindung die Möglichkeit der technischen Erschließung der Durchflusszytometrie für Selektion von Hybridomazellen, im Speziellen für lebende Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern gegeben, wodurch nun ein Selektionsverfahren angewendet werden kann, das einen hohen Durchsatz (high throughput) von Zellen ermöglicht. Dadurch wird ein Verfahren zur Charakterisierung und Selektion von lebenden Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern vorgeschlagen, das einen geringen Zeit- und Kostenaufwand ermöglicht.
Weitere Möglichkeiten zur Selektion der markierten Hybridomazellen wären magnetische Zellseparation und Zellisolierung.
In einer Ausführungsform des Verfahrens zur Charakterisierung und Selektion von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern wird vorgeschlagen, dass die Selektion markierter Hybridomazellen mittels durchflusszytometrischer Zellsortierung geschieht, im Speziellen mittels Fluorescence-activated Cell Sorting (FACS). Vorteile ergeben sich insbesondere durch die Möglichkeit, viele Klone in kurzer Zeit analysieren zu können (high throughput). In einer weitern Ausführungsform wird die Selektion in Schritt c) durch Erkennung von doppelt-markierten Zellen und/oder durch Fluoreszenzintensität durchgeführt. Insbesondere kann der Zusammenhang erstellt werden, dass eine hohe Fluoreszenzintensität auch eine hohe Affinität bedingt.
Durch diese Ausführungsform können Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern detektiert werden, die eine besonders hohe Dichte an anti-Hapten-Antikörpern auf der Oberfläche tragen.
Gemäß eines weiteren Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene vorgeschlagen umfassend die Schritte:

- Durchführung eines Verfahrens zur Charakterisierung und Selektion von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern gemäß der hierin beschriebenen, vorliegenden Erfindung ,
- Herstellung monoklonaler Antikörper aus charakterisierten und selektierten Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern.

Vorteile ergeben sich dahingehend, dass durch das Charakterisierungs- und Selektionsverfahren besonders leistungsstarke und hochspezifische Hybridomazellen detektiert und anschließend durch Einzelauswahl mit hohem Durchsatz (high throughput) selektiert werden können. Dies ermöglicht die Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene mittels besonders gut geeigneten Hybridomazellen, die im Speziellen besonders geeignet sind, hochaffine Antikörper gegen Haptene zu produzieren. Somit wird ein Verfahren vorgeschlagen, durch das besonders hochaffine Antikörper gegen Haptene hergestellt werden können.
In einer Ausführungsform wird ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene vorgeschlagen, durch das monoklonale Antikörper gegen Östrogene wie Estron und Estradiol , gegen Steroide wie Digoxigenin und Arzneimittelwirkstoffe wie Carbamazepin hergestellt werden können. Es konnte ferner überraschend gezeigt werden, dass FITC (MW 650)-gekoppelte Haptene aufgrund ihrer geringen Größe unterhalb der durchflusszytometrischen Nachweisgrenze liegen. Dieses Ergebnis würde verlangen, dass jedes zu untersuchende Hapten an einen hochmolekularen Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden muss. Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde diese Notwendigkeit elegant umgangen, indem ein Hapten-Protein-Komplex ausgewählt wurde, um den Nachweis zu ermöglichen. Im vorliegenden Fall wurde ein Trägermolekül ausgewählt, das für die späteren ELISA-Analysen ebenfalls verwendet werden kann.
Die Synthese der Hapten-POD-Konjugate erfolgte beispielhaft für die Östrogene Estron (E1) und Estradiol (E2) mittels Carbodiimid-Methode (Munro 1984).
Die beiliegende Zeichnung veranschaulicht eine beispielhafte Ausführungsform und dient zusammen mit der Beschreibung der Erläuterung der Prinzipien der Erfindung. Die Elemente der Zeichnung sind relativ zueinander und nicht notwendigerweise maßstabsgetreu. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen entsprechend ähnliche Teile.

1 zeigt schematisch das Zellkonjugat zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene. Das Haptenkonjugat, bestehend aus Hapten und hochmolekularem Trägermolekül, bindet an entsprechende anti-Hapten-Antikörper auf der Oberfläche von lebenden Hybridomazellen. Durch einen Trägermolekül-spezifischen Marker können diese visualisiert werden. Zusätzlich erfolgt eine Markierung des anti-Hapten-Antikörpers mittels IgG-spezifischem Marker.
2 zeigt die Ermittlung Antigen-spezifischer Antikörperproduzierender Hybridomazellen mittels Durchflusszytometrie. Hierfür wurden Formalin-fixierte Hybridomazellen spezifisch für Digoxigenin (Klon DIG-DA5) mit DIG-FITC (A) oder DIG-POD / anti-POD-AlexaFluor®488 inkubiert und doppeltmarkiert mit anti-mouse-IgG-AlexaFluor®647. Unfixierte lebende Zellen (Klon DIG-DA5) wurden entsprechend der oberen Beschreibung gefärbt: (C) DIG-FITC und (D) DIG-POD / anti-POD-AlexaFluor®488 und inkubiert mit anti-mouse-IgG-AlexaFluor®647. Die unteren Abbildungen stammen von einer Kontrolle (E, F). Färbung des Oberflächengebundenen Antigens wurde mittels Durchflusszytometrie analysiert. Prozentzahlen der Zellen im entsprechenden Gate sind angegeben.
3 zeigt Antigen-spezifisches IgG auf der Oberfläche von lebenden Hybridomazellen bestimmt durch durchflusszytometrische Analyse. Durchflusszytometrische Analyse von drei verschiedenen unfixierten Hybridomazellklonen spezifisch für Digoxigenin (DIG-DA5), Estradiol (E2-BF1) oder Estron (E1-BH5-E10-D10). Zellen wurden doppelt markiert mit entsprechendem DIG-POD-Konjugat (A), E2-POD (B) oder E1-POD (C) und anti-POD-AlexaFluor®488 plus anti-mouse-IgG-AlexaFluor®647. Untere Abbildungen sind Kontrollen. Prozentzahlen der Zellen im entsprechenden Gate sind angegeben.
4 zeigt die Anwendung des Antigen-POD-Konjugates bei der fluoreszenzbasierten Zellsortierung in Form einer durchflusszytometrischen Sortierung von lebenden E1-Hybridomazellen, also die fluoreszenzbasierte Zellsortierung frisch fusionierter Hybridomazellen spezifisch für Estron. Unfixierte Zellen wurden doppelt markiert mit E1-POD und anti-POD-AlexaFluor^®488 plus anti-mouse-IgG-AlexaFluor^®. Prozentzahlen der Zellen im entsprechenden Gate sind angegeben. (A) E1 Hybridomazellen vor der Sortierung und (B) E1-Hybridomazellen nach Sortierprozess. Aussortierte Zellen wurden bei 37°C unter CO₂-Atmosphäre kultiviert.

Die Figuren wurden in der obigen Figurenbeschreibung bereits näher dargelegt, weitere Details, wenn notwendig erachtet, werden zusätzlich dazu weiter unten verdeutlicht.
Insbesondere verdeutlicht 2, dass die antigenspezifische Markierung von lebenden Zellen nur mit dem DIG-POD-Konjugat möglich ist und nicht mit einem DIG-Fluorophor-Konjugat allein. Es muss also „hochmolekular“ sein, wie es für das „Träger-Protein“ POD zutrifft. Die Anfärbung von lebenden Zellen ist aber wichtig für die durchflusszytometrische Sortierung und anschließende Weiterkultivierung der Antikörperproduzierenden Hybridomazellen.
Insbesondere verdeutlicht 3, dass die Markierung von lebenden Hybridomazellen mittels POD-Konjugat für alle getesteten Haptene (DIG, E2 und E1) funktioniert.
Insbesondere verdeutlicht 4 die erfolgreiche Sortierung doppelt gefärbter Zellen, die die Grundlage für eine erfolgreiche Antikörperproduktion darstellen.
Wenngleich hierin spezifische Ausführungsformen dargestellt und beschrieben worden sind, liegt es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die gezeigten Ausführungsformen geeignet zu modifizieren, ohne vom Schutzbereich der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Die nachfolgenden Ansprüche stellen einen ersten, nicht bindenden Versuch dar, die Erfindung allgemein zu definieren.
Beispiele
A) Generische Beschreibung:
Die antigenspezifische Markierung erfolgt durch eine 2-stufige Färbeprozedur. Um die Zellen zu differenzieren, werden sie zum einen mit fluorophormarkiertem anti-Maus-IgG inkubiert, um die membranständigen Antikörper zu identifizieren. Parallel dazu werden die spezifischen Hybridomazellen mit einem Konjugat aus Meerrettichperoxidase (POD) und Hapten und zur anschließenden Visualisierung mit anti-POD-Antikörper gefärbt, der mit einem anderen Fluorophor gelabelt ist. Die in der Durchflusszytometrie als doppelt-positiv identifizierten Zellen werden über eine Sortiereinheit als Einzelzellen steril separiert und weiter kultiviert.
Färbeprotokoll:

- Hybridomazellen aus der Kulturflasche ablösen
- Zentrifugation (1000 U min-1, 5 min)
- Zellpellet in 5 ml PBS resuspendieren und Zellen zählen
- 1 Mio. Hybridomazellen pro Färbung, mit PBS waschen
- Zellpellet + Hapten-POD-Konjugat (10 µg/ml)
- 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren
- 1 ml PBS zugeben, waschen
- Zellpellet + anti-POD-Alexa488 (20 µg/ml) und anti-IgG-Alexa647 (10 µg/ml)
- 30 min auf Eis im Dunkeln inkubieren
- 1 ml PBS zugeben und durchflusszytometrisch analysieren.

B) Detaillierte Beschreibungen zur Versuchsdurchführung
Material und Methoden
1) Chemikalien
Alle Lösemittel und Chemikalien wurden von Merck KGaA (Darmstadt, Deutschland), Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland), oder Steraloids (Newport, RI, USA) bezogen und waren von höchstmöglicher Qualität. Meerrettichperoxidase (POD, EIA-Güteklasse) wurde von Roche (Mannheim, Deutschland) erworben. Rinderserumalbumin (BSA) wurde von Protea Biosciences (Morgantown, WV, USA) bezogen. Alle Puffer und Lösungen wurden mit Reinstwasser aus einem Synthesis A10 Milli-Q® Wasserreinigungssystem hergestellt.
2) Ausstattung
Sterile Sicherheitswerkbank:

Microflow - Biological safety cabinet (Astec Microwflow, Andover, Großbritannien)
Autoklav: Laboklav 25-V (SHP Steriltechnik, Detzel, Deutschland), FVG (TSC-09) (Integra Biosciences GmbH, Fernwald, Deutschland)
CO₂ Inkubator: Innova CO-170 (New Brunswick Scientific, Enfield, USA), NU-5510E (Integra Biosciences GmbH, Fernwald, Deutschland)
Zentrifuge: Eppendorf 5810R (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland)
Stickstofftank: Locator 8plus (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)
Durchflusszytometer: CyFlow^® space flow cytometer (Partec, Münster, Deutschland)
BD FACSAria™II (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) als externer Benutzer im Berlin-Brandenburg Zentrum für Regenerative Therapien (BCRT)
Mikroskope: Binokular Visiscope BL124 (VWR International GmbH, Darmstadt, Deutschland), Konfokales Laserscanningmikroskop Olympus FluoView™ FV1000 (Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland), Olympus IX71 (Olympus Deutschland GmbH, Hamburg, Deutschland), Inverses Mikroskop AE2000 (Motic, Wetzlar, Deutschland)

3) Methoden
3.1 Herstellung von Hybridomazellen, an denen das Markierungsverfahren etabliert wurde
Für die Herstellung der monoklonalen Hapten-spezifischen Antikörper wurde die Hybridomatechnologie angewendet. Weibliche BALB/c Mäuse wurden mit 100 µg des entsprechenden Immunogens in komplettem Freund's Adjuvans (Difco, Lawrence, KS, USA) immunisiert. Die Tiere wurden regelmäßig alle 4-6 Wochen mit 50 µg des Immunogens in PBS reimmunisiert.
Verwendete Immunogene:

E1-BSA (Konjugatsynthese 0063-0065)
E2-BSA (Steraloids, Newport (Rhode Island), USA)
DIG-BSA (Roche, Grenzach-Wyhlen, Deutschland)
CBZ-BSA (Konjugatsynthese vgl. 0066-0068)

Vier Tage nach der letzten Immunisierung wurden die Milzzellen der Mäuse mit X63-Ag8.653 Myelomzellen mittels Elektrofusionstechnik (Schenk et al., 2004) fusioniert. Dafür wurden die Milz- und Myelomazellen in einem Verhältnis von 2 : 1 in 10% PEG 8000 gelöst und durch einen Elektroimpuls von 3000 -3500 V/cm fusioniert. Anschließend wurden die fusionierten Zellen in zehn 96-well Platten (Nunc, Wiesbaden, Deutschland) pro Maus ausgesät und in HAT-Medium mit 10% fetalem Kälberserum kultiviert. Die Hybridomazellen wurden nach herkömmlichen Methoden kloniert, rekloniert und in flüssigem Stickstoff konserviert.
3.2 Kultivierung von Hybridomazellen
Zellkulturmedien, Reagenzien und Zellkultur-Plastik wurden von Biochrom (Berlin, Deutschland) erworben. Hybridomazellen wuchsen in Hybridomamedium, bestehend aus RPMI 1640 mit 10% fötalem Kälberserum, 1% Glutamin, 0,1% β-Mercaptoethanol und 1% ZellShield™. Zellen wurden bei 37 °C in befeuchteter 5% CO₂-Atmosphäre kultiviert und regelmäßig alle zwei Tage passagiert.
3.3 Hybridomaklone
Für die dargestellten Experimente wurden die Hybridomaklone DIG-DA5, E2-BF1 und E1-BH5-E10-D10 verwendet, die monoklonale Antikörper der Subklasse IgG1 produzierten. Die Bestimmung der Subklassen erfolgte nach Schenk et al. (2004). Als Kontrollzellen wurden die Hybridomaklone SMX-HF3 oder Afla-GE9 genutzt.
3.4 Durchflusszytometrie
Um die Antikörperexpression auf der Zelloberfläche zu untersuchen, wurden zunächst 1 × 10⁶ Hybridomazellen in PBS gewaschen. Die Zellen wurden mit POD-markiertem Antigen 30 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurden die Zellen gleichzeitig mit anti-POD-AlexaFluor^®-488 (Dianova GmbH, Hamburg, Deutschland) und anti-mouse-IgG-AlexaFluor^®-647 (BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland) für 30 Minuten im Dunkeln auf Eis inkubiert. Die Antikörperexpression wurde mittels Durchflusszytometrie unter Nutzung eines CyFlow^® space Durchflusszytometers (Partec, Münster, Deutschland) bestimmt. Anregungswellenlängen lagen bei 488 nm und 638 nm und Fluoreszenzdetektion fand bei 520 nm und 682 nm statt, mit einer Durchflussrate von ~ 700 Zellen pro Sekunde. Die Daten wurden mit der Partec FlowMax 2.70 software analysiert. SheathFluid (Partec, Münster, Deutschland) mit 0,01% Natriumazid wurde genutzt. Für die Analyse wurden alle Proben auf ein Volumen von 1 ml aufgefüllt. 50000 Zellen wurden von jeder Probe analysiert.
3.5 Konjugatsynthese
3.5.1.1 Immunogensynthese (E1-BSA Konjugate)
Das Immunogen für die Immunisierung von Estron (E1) wurde in unserem Labor durch die Kopplung von E1 an BSA synthetisiert. Die Kopplung von E1-6-CMO (1,3,5(10)-estratrien-3-ol-6,17-dione-6-O-carboxymethyloxime) an BSA erfolgte nach der Carbodiimid-Methode (Schneider und Hammock 1992). Zunächst wurde für die Aktivierung die Säuregruppe des Haptens mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) verestert. Anschließend fand die Kopplung des reaktiven Esters an BSA statt. Zur Aktivierung wurden 10 µmol des E1-6-CMO (3,6 mg) gelöst in 430 µl wasserfreiem N,N-Dimethylformamid und 12 µmol des N-Hydroxysuccinimid (24 µl aus einer 0,5 M Stammlösung) in ein Vial pipettiert. Anschließend wurden zu der Lösung 12 µmol Dicyclohexylcarbodiimid (24 µl aus einer 0,5 M Stammlösung) unter Schutzgas zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht (18h) bei Raumtemperatur gerührt. Am nächsten Tag wurde die Lösung 10 min bei 14.000 U min^-1 und bei 20°C zentrifugiert. Der klare Überstand wurde gesammelt. Das molare Verhältnis von BSA zum aktivierten Ester betrug 1:50. In der Zwischenzeit wurden 13,4 mg BSA in 4,8 ml Carbonatpuffer (0,13 M NaHCO₃) gelöst. In diese Lösung wurden 480 µL des Überstandes des aktivierten Esters tropfenweise hinzugegeben und das Gemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der Ansatz vollständig auf eine mit 1/10 PBS-Puffer (10 mM Natriumdihydrogenphosphat, 70 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 145 mM Natriumchlorid, pH 7,6) konditionierte Sephadex G-25 Säule (GE Healthcare, München, Deutschland) gegeben. Zur Elution wurde der gleiche 1/10 PBS-Puffer verwendet. Die Fraktionen wurden in einer Mikrotiterplatte (UV star, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) gesammelt und deren Absorption bei 280 nm photometrisch bestimmt.
Die Kopplungsdichte wurde mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (MALDI-TOF/MS) (Autoflex III, Bruker Daltonics, Bremen, Germany) bestimmt. Probenvorbereitung, Messung und Datenanalyse wurden wie bei Bahlmann et al. (2009) beschrieben, durchgeführt. Die Kopplungsrate des E1-BSA-Konjugates lag bei 20 (± 6,6) E1-Molekülen pro BSA-Molekül. Die Konzentration von E1-BSA wurde photometrisch bestimmt bei den Wellenlängen 280 nm und 620 nm unter Nutzung einer BSA-Kalibrierkurve. Die Konzentration von E1-BSA lag bei 7,3 mg/ml.
3.5.1.2 Immunogensynthese (CBZ-BSA Konjugate)
Das Immunogen für die Immunisierung von Carbamazepin (CBZ) wurde durch Kopplung von CBZ an BSA synthetisiert. Die Kopplung von CBZ-Triglycin an BSA erfolgte nach der Carbodiimid-Methode. Zunächst wurde für die Aktivierung die Säuregruppe des Haptens mit N-Hydroxysuccinimid (NHS) verestert. Anschließend fand die Kopplung des reaktiven Esters an BSA statt. Zur Aktivierung wurden 6,8 µmol des CBZ-Triglycin (2,8 mg) in 50 µl N,N-Dimethylformamid unter Schutzgas gelöst. Anschließend wurden 8,1 µmol des N-Hydroxysuccinimid (20 µl aus einer 0,4 M Stammlösung) und 8,1 µmol des Dicyclohexylcarbodiimid (20 µl aus einer 0,4 M Stammlösung) in ein Vial pipettiert. Die Lösung wurde über Nacht (18h) bei Raumtemperatur gerührt. Am nächsten Tag wurde die Lösung 10 min bei 14.000 U min^-1 und bei 20°C zentrifugiert. Der klare Überstand wurde gesammelt. Das molare Verhältnis von BSA zum aktivierten Ester betrug 1:50. In der Zwischenzeit wurden 6,0 mg BSA in 0,6 ml Carbonatpuffer (0,27 M NaHCO₃) gelöst. In diese Lösung wurden 60 µL des Überstandes des aktivierten Esters tropfenweise hinzugegeben und das Gemisch 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde der Ansatz vollständig auf eine mit 1/10 PBS-Puffer (10 mM Natriumdihydrogenphosphat, 70 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 145 mM Natriumchlorid, pH 7,6) konditionierte Sephadex G-25 Säule (GE Healthcare, München, Deutschland) gegeben. Zur Elution wurde der gleiche 1/10 PBS-Puffer verwendet. Die Fraktionen wurden in einer Mikrotiterplatte (UV star, Greiner Bio-One, Frickenhausen, Deutschland) gesammelt und deren Konzentration über die Absorption bei 280 nm photometrisch bestimmt.
Die Kopplungsdichte wurde mittels Matrix-unterstützter Laser-Desorption/Ionisation Massenspektrometrie mit Flugzeitanalysator (MALDI-TOF/MS) (Autoflex III, Bruker Daltonics, Bremen, Germany) bestimmt. Probenvorbereitung, Messung und Datenanalyse wurden wie bei Bahlmann et al. (2009) beschrieben, durchgeführt. Die Kopplungsrate des CBZ-BSA-Konjugates lag bei 26 CBZ-Molekülen pro BSA-Molekül. Die Konzentration von CBZ-BSA wurde photometrisch bestimmt bei den Wellenlängen 280 nm und 620 nm unter Nutzung einer BSA-Kalibrierungskurve. Die Konzentration von E1-BSA lag bei 3,2 mg/ml.
3.5.2 Enzymtracer-Synthese (Hapten-POD Konjugate)
Es wurden verschiedene Konjugate mit dem Enzym Meerrettichperoxidase (POD) synthetisiert. Die Kopplung von E1-6-CMO an POD erfolgte in Analogie zu einer von Munro et al. (1984) publizierten Synthese für entsprechende Konjugate des Progesterons. E1-6-CMO (5 µmol) wurde in Gegenwart von 1 µL N-Methylmorpholin in 100 µL N,N-Dimethylformamid gelöst und mit 1 µl Chlorameisensäureisobutylester bei -21°C unter Schutzgas aktiviert. Das molare Verhältnis von POD zum aktivierten Ester lag bei 1:50. Nach dreißigminütigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die Lösung tropfenweise zu 4 mg POD gelöst in 50 µL Wasser und 30 µL DMF bei ebenfalls -21 °C pipettiert. Die Lösung wurde über eine Stunde gerührt (-21°C) und langsam auf 0 °C erwärmt, das Rühren wurde bei 0 °C für zwei weitere Stunden fortgesetzt. Anschließend wurde der Ansatz vollständig auf eine mit 1/10 PBS-Puffer (10 mM Natriumdihydrogenphosphat, 70 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 145 mM Natriumchlorid, pH 7,6) konditionierte Sephadex G-25 Säule gegeben. Zur Elution wurde der gleiche 1/10 PBS-Puffer verwendet. Die Synthese von E2-POD aus E2-6-CMO (1,3,5(10)-estratrien-3,17β-diol-6-one-6-carboxylmethyloxim) und POD erfolgte analog zur E1-POD-Synthese.
Die Kopplung von Digoxigenin (DIG) an POD erfolgte nach der oben beschriebenen Carbodiimid-Methode. Der aktivierte DIG-NHS-Ester (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) war in THF gelöst und wurde tropfenweise zu 4 mg POD gelöst in 600 µL Carbonatpuffer (0,13 mol/l NaHCO₃, M = 84,01 g/mol) dazugegeben. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend über eine mit 1/10 PBSkonditionierte Sephadex G-25 Säule aufgereinigt.
Die Kopplungsdichte der POD-Konjugate wurde analog zum E1-BSA-Konjugat mittels MALDI-TOF/MS bestimmt. Die Kopplungsrate des E1-POD-Konjugates lag bei 0,7 E1-Molekülen pro POD-Molekül. Bei E2-POD betrug das Verhältnis 2,2 E2-Moleküle je POD-Molekül und bei DIG-POD lag die Kopplung bei 1,9 DIG-Molekülen pro POD-Molekül. Die Konzentration der POD-Konjugate wurde photometrisch bestimmt bei den Wellenlängen 405 nm und 620 nm unter Nutzung einer POD-Kalibrierungskurve. Folgende Konzentrationen wurden bestimmt: E1-POD 2,7 mg/ml, E2-POD 2,8 mg/ml und DIG-POD 1,1 mg/ml.
3.5.3. Fluoresceinisothiocyanat(FITC) -Konjugat-Synthese
Die Kopplung von E1-6-CMO an FITC erfolgte nach der Carbodiimid-Methode, die unter 3.5.1. beschrieben wurde.
Zur Aktivierung wurden 2,5 µmol (0,9 mg) des Haptens E1-6-CMO in 2,5 mmol (108 µl) wasserfreiem Tetrahydrofuran bei einer Temperatur von 30°C gelöst. 3,0 µmol (0,4 mg) N-Hydroxysuccinimid (6 µl aus einer 0,5 M Stammlösung) wurden dazu pipettiert. Anschließend wurden zu der Lösung 3,0 µmol (0,6 mg) Dicyclohexylcarbodiimid (6 µl aus einer 0,5 M Stammlösung) unter Schutzgas zugegeben. Die Lösung wurde über Nacht (18h) bei Raumtemperatur gerührt. Am nächsten Tag wurde die Lösung 10 min bei 14.000 U min^-1 und bei 20°C zentrifugiert und der klare Überstand wurde gesammelt. Das molare Verhältnis von FITC zu aktiviertem Ester betrug 1:1,5. 60 µl des gesammelten Überstandes wurden tropfenweise zu 1,7 µmol (0,7 mg) Fluoreszein gelöst in 600 µL Carbonatpuffer (0,27 M NaHCO₃) zugegeben und das Gemisch 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Die Synthese von E2-FITC aus E2-6-CMO und FITC wurde analog zur E1-FITC-Synthese durchgeführt. Die Synthese von DIG-FITC erfolgte ebenfalls nach der Carbodiimid-Methode, ausgehend von einem aktivierten DIG-NHS-Ester (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
Alle Konjugate wurden mittels präparativer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (Series 1200, AgilentTechnologies, Waldbronn, Deutschland) aufgereinigt. Benutzte Modifikationen/Bedingungen: eine Agilent 1200 quaternäre Pumpe, eine Phen RP-18 analytische Säule (250x3 mm + 10x3 mm pre-column; Sepserv, Berlin, Deutschland), ein Agilent 1200 Säulenthermostat bei 40 °C und ein Agilent 1200 Diodenarray-Detektor. Die Flussrate betrug 0,4 ml/min und der Druck war auf 300 bar gesetzt. Lösemittel waren (A) UReinstwasser mit 10 mM Ammoniumacetat und 0,1 Essigsäure und (B) Methanol mit 10 mM Ammoniumacetat und 0,1% Essigsäure. Zu Beginn wurden 80% Lösemittel (A) benutzt. Nach 3 min, wurde der prozentuale Anteil von Lösemittel (B) linear auf 95% innerhalb von 20 min erhöht. Nach 28 Minuten wurde der Anteil von Lösemittel (B) innerhalb von 1 min auf 20% herabgesetzt. Dieses Mischungsverhältnis wurde bis zum Ende des Laufes (40 min) beibehalten. Die Fraktion mit dem Hauptpeak wurde gesammelt und unter Stickstoff verdampft. Der Rückstand wurde in PBS gelöst und für die durchflusszytometrische Analyse genutzt.
Die Ausführungsbeispiele zeigen die reproduzierbare Synthese der Zellkonjugate aus Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern und einem Haptenkonjugat, umfassend ein Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und einem hochmolekularen Trägermolekül. Aus den 2, 3 und 4 ist zu ersehen, dass die antigenspezifische Markierung von lebenden Zellen nur mit dem DIG-POD-Konjugat möglich ist und nicht, mit einem DIG-Fluorophor-Konjugat allein (2) und dass die Markierung von lebenden Hybridomazellen mittels POD-Konjugat für alle getesteten Haptene und damit für einen weiten Bereich von Verbindungen funktioniert (3). Ferner konnte gezeigt werden, dass eine erfolgreiche Sortierung doppelt gefärbter Zellen möglich ist, die Grundlage für die Produktion hochspezifischer und reiner Antikörper darstellt. Es konnte damit ein hocheffizienter Weg unter Verwendung von high-throughput Techniken aufgezeigt werden, der die Synthese besonders geeigneter Hybridomazellen vorsieht, die die Produktion hochspezifischer und reiner Antikörper gegen Haptene ermöglichen.
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Claims

Zellkonjugat zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene umfassend - eine Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern, - mindestens ein Haptenkonjugat, umfassend das Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und ein hochmolekulares Trägermolekül, wobei das mindestens eine Haptenkonjugat an einen anti-Hapten-Antikörper über das Hapten gebunden ist.
Zellkonjugat nach Anspruch 1, wobei das hochmolekulare Trägermolekül mehr als eine Bindestelle für einen Trägermolekül-spezifischen Marker aufweist.
Zellkonjugat nach Anspruch 1, wobei das hochmolekulare Trägermolekül Meerrettichperoxidase ist.
Zellkonjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, ferner umfassend einen Trägermolekül-spezifischen Marker.
Zellkonjugat nach Anspruch 4, ferner umfassend einen IgG-spezifischen Marker.
Zellkonjugat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hybridomazellen lebend sind.
Verwendung eines Haptenkonjugats zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern, wobei das Haptenkonjugat umfasst: - ein Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und - ein hochmolekulares Trägermolekül.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei das hochmolekulare Trägermolekül Meerrettichperoxidase ist.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Hapten ein Östrogen, Steroid oder Arzneimittelwirkstoff ist.
Verfahren zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern umfassend die Schritte: - Schritt a) Bereitstellung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern, - Schritt b) Bereitstellung eines Haptenkonjugats umfassend: - ein Hapten, das als Antigen zu den anti-Hapten-Antikörpern fungiert, und - ein hochmolekulares Trägermolekül, - Schritt c) Anbindung des Haptenkonjugats an die anti-Hapten Antikörper der Hybridomazellen zur Ausbildung eines Zellkonjugats, und - Schritt d) Umsetzen des Zellkonjugats mit einem Trägermolekül-spezifischen Marker.
Verfahren zur Markierung von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern nach Anspruch 10, ferner umfassend den Schritt: - Schritt e) Umsetzen des Zellkonjugats mit einem IgG-spezifischen Marker.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Schritte d) und e) gleichzeitig durchgeführt werden.
Verfahren zur Charakterisierung und Selektion von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern umfassend die Schritte - Schritt a) Herstellung von Zellkonjugaten nach Anspruch 5, - Schritt b) Durchführung von Durchflusszytometrie mit den Zellkonjugaten, - Schritt c) Selektion von Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern mittels Zellsortierung.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Selektion in Schritt c) durch Erkennung von doppelt-markierten Zellen geschieht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 oder 14, wobei die Selektion mittels Fluoreszenzintensität geschieht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, wobei die Zellsortierung markierter Hybridomazellen mittels durchflusszytometrischer Zellsortierung geschieht.
Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen Haptene umfassend die Schritte: - Durchführung eines Verfahrens nach Ansprüchen 13 bis 16, - Herstellung monoklonaler Antikörper aus charakterisierten und selektierten Hybridomazellen mit anti-Hapten-Antikörpern.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei monoklonale Antikörpern gegen Östrogene ausgesucht aus der Gruppe umfassend Estron (E1) und Estradiol (E2), gegen Steroide oder Arzneimittelwirkstoffe hergestellt werden.