DE69928040T2

DE69928040T2 - Aktives Hedgehog-Protein-Konjugat, Verfahren zur Herstellung und Verwendung

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Publication number: DE69928040T2
Application number: DE69928040T
Authority: DE
Inventors: Angelika Esswein; Kurt Lang; Petra Rueger; Tilmann Seytter
Original assignee: Curis Inc
Current assignee: Curis Inc
Priority date: 1998-04-30
Filing date: 1999-04-23
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2019-04-24
Also published as: KR19990083621A; DK0953576T3; AU719797B2; HU9901411D0; ATE308563T1; ES2252886T3; EP1557427A2; IL129620A0; US7153836B2; CY1105683T1; AU2500999A; US20050148510A1; CN1233616A; JP2000053699A; EP0953576B1; US20070191274A1; EP0953576A1; NZ335385A; US6818623B2; MA26625A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Hedgehog-Protein-Konjugat mit erhöhter Aktivität, ein Verfahren zu seiner Herstellung und dessen therapeutische Verwendung.
Unter Hedgehog (hh)-Proteinen versteht man eine Familie von sezernierten Signalproteinen, die für die Bildung zahlreicher Strukturen bei der Embryogenese verantwortlich sind (J. C. Smith, Cell, Bd. 76 (1994), S. 193-196; N. Perrimon, Cell, Bd. 80 (1995), S. 517-520; C. Chiang et al., Nature, Bd. 83 (1996), S. 407; M. J. Bitgood et al., Curr. Biol., Bd. 6 (1996), S. 296; A. Vortkamp et al., Science, Bd. 273 (1996), S. 613; C. J. Lai et al., Development, Bd. 121 (1995), S. 2349). Während seiner Biosynthese werden eine N-terminale 20 kD-Domäne und eine C-terminale 25 kD-Domäne nach Spaltung der Signalsequenz und autokatalytischer Spaltung erhalten. Beim natürlich auftretenden Protein wird nach Spaltung der C-terminalen Domäne die N-terminale Domäne mit Cholesterin modifiziert (J. A. Porter et al., Science, Bd. 274 (1996), S. 255-259). In höheren Lebensformen ist die hh-Familie aus mindestens drei Mitgliedern zusammengesetzt, nämlich Sonia-, Indian- und Desert-hh (shh, Ihh, Dhh; M. Fietz et al., Development (Suppl.) (1994), S. 43-51). Unterschiede in der Aktivität von Hedgehog-Proteinen, die rekombinant erzeugt worden waren, wurden nach Erzeugung in Prokaryonten und Eukaryonten festgestellt (M. Hynes et al., Neuron, Bd. 15 (1995), S. 35-44; und T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 237 (1997), S. 465-469).
Hynes et al. vergleichen die Aktivität von hh im Überstand von transformierten, humanen, embryonalen Nieren-293-Zellen (eukaryontisches hh) mit aus E. coli erzeugtem hh und stellen eine 4-fach höhere Aktivität von hh aus den Überständen der Nieren-Zelllinie fest. Als Grund für diese erhöhte Aktivität von hh wurde folgendes diskutiert: Ein möglicher zusätzlicher akzessorischer Faktor, der nur in eukaryontischen Zellen exprimiert wird, eine posttranslationale Modifikation, ein unterschiedlicher N- Terminus, da das aus E. coli isolierte hh 50 % einer hh-Form enthält, die zwei zusätzliche N-terminale Aminosäuren (Gly-Ser) trägt oder um 5-6 Aminosäuren verkürzt ist oder ein höherer Aggregationszustand (z. B. durch Bindung an Nickel-Agarose-Kügelchen).
Nakamura et al. vergleichen die Aktivität von shh im Überstand von transformierten Hühnerembryo-Fibroblasten mit einem aus E. coli isolierten shh-Fusionsprotein, das noch einen N-terminalen Polyhistidinteil aufweist. Das shh im Überstand der Fibroblasten weist eine 7-fach höhere Aktivität als das gereinigte E. coli-Protein auf, und zwar in Bezug auf die Stimulierung von alkalischer Phosphatase (AP) in C3H10T½-Zellen. Die erhöhte Aktivität wurde einem Synergismus von hh mit Molekülen, wie knochenmorphogenetische Proteine (BMPs) zugeschrieben, die nur im Überstand von eukaryontischen Zellen vorhanden sind und in Kombination mit hh die stärkere Induktion von AP hervorrufen.
Kinto et al., FEBS Letters, Bd. 404 (1997), S. 319-323, führen aus, dass Fibroblasten, die hh sezernieren, eine ektopische Knochenbildung bei einer i. m.-Implantation an Kollagen induzieren. Jedoch ist eine derartige Aktivität für ein isoliertes hh-Protein nicht bekannt.
Porter et al., Cell, Bd. 86 (1996), S. 21-34, beschreiben die Art und Weise der Autoprozessierung bei der Biogenese von hh und deren mutmaßliche Rolle bei der räumlichen Regulierung der hh-Signalgebung. Es wird nachgewiesen, dass die Autoprozessierung über ein Thioester-Zwischenprodukt unter kovalenter Modifizierung der aminoterminalen Signalgebungsdomäne abläuft, was zu einer erhöhten Hydrophobizität der Signalgebungsdomäne führt. Dieses prozessierte (hydrophobe) hh-Protein ist mit der Zellmembran assoziiert.
Aufgabe der Erfindung ist es, hh-Proteine (Polypeptide) bereitzustellen, die im Vergleich zu den bekannten Formen eine erheblich verbesserte Aktivität aufweisen.
Diese Aufgabe wird durch ein rekombinant erzeugtes Hedgehog-Protein gelöst, das künstlich lipophil gemacht worden ist. Eine derartige Lipophilisierung wird vorzugsweise durch eine chemische Modifikation erreicht. Ein derartiges Hedgehog-Konjugat enthält folgendes:

(a) ein Polypeptid, das aus 10 bis 30 hydrophoben Aminosäuren; oder aus Aminosäuren, die Tansmembran-Helices bilden und positiv geladen sind, zusammengesetzt ist; oder
(b) 1 bis 4 aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste mit einer Kettenlänge von 8 bis 24 C-Atomen und mit einer hydrophoben Wirkung; oder
(c) eine hydrophobe Thioverbindung,

Das zusätzliche Polypeptid enthält insbesondere 2 bis 12 Lysinreste und/oder Argininreste, aber keinen Polyhistidinteil, der zur Reinigung des Konjugats an einer Ni-Chelatsäule geeignet wäre.
Das Protein wird durch derartige lipophilisierende Reste hydrophobisiert, was die Wechselwirkung mit Lipidmembranen von eukaryontischen Zellen, insbesondere von Säugetierzellen, verbessert.
Infolgedessen wird unter einem erfindungsgemäß 1ipophilisierten Protein ein hydrophobisiertes Protein verstanden, das im Vergleich zu einem unmodifizierten Protein eine erhöhte Oberflächenhydrophobizität aufweist, was dessen Affinität für apolare Moleküle oder Amphiphile erhöht. Die Zunahme des Lipophilizitätsgrads des Proteins kann durch den Integrationsgrad in einer Lipidschicht gemessen werden, z. B. gemäß Z. Haque et al., J. Agric. Food Chem., Bd. 30 (1982), S. 481. Verfahren zur hydrophoben (lipophilisierenden) Modifikation von Proteinen werden beispielsweise beschrieben von Z. Haque et al., J. Agric. Food Chem., Bd. 31 (1983), S. 1225-1230; R. J. Webb et al., Biochemistry, Bd. 37 (1998), S. 673-689; J. F. Hancock, Cell, Bd. 63 (1990), S. 133-139; und A Practical Guide to Membrane Protein Purification, Hrsg. G. v. Jagow, Hermann Schägger, (1994), (Kapitel 16, S. 535-554).
Es hat sich überraschenderweise herausgestellt, dass derart lipophilisierte Hedgehog-Proteine (nachstehend auch als Hedgehog-Konjugate (hh-Konjugate) bezeichnet) eine drastisch erhöhte Aktivität aufweisen, die im Vergleich zu nicht-modifizierten Hedgehog-Proteinen (z.B. nach zytoplasmatischer Expression in E. coli) vorzugsweise das mindestens 10-fache und insbesondere das 10³- bis 10⁵-fache beträgt, insbesondere in einer pharmazeutischen Zubereitung und in vitro. Ferner ist es besonders überraschend, dass derartige erfindungsgemäße Hedgehog-Konjugate in besonders vorteilhafter Weise für eine lokale Therapie verwendet werden können, vorzugsweise an Knochen, Knorpeln oder Nervenzellen (bei Nervenläsionen oder neurodegenerativen Krankheiten) oder in Muskelgewebe.
Aus Yang et al., Development, Bd. 124 (1997), S. 4393-4404, ist es bekannt, dass für eine pharmazeutisch wirksame in vivo-Aktivität hohe lokale Hedgehog-Konzentrationen über einen Zeitraum von mindestens 16 h an der Wirkungsstelle im Körper vorliegen müssen. Das Trägersystem hierfür, das von Yang et al. beschrieben wird, d. h. das mit Hedgehog beladene Chromatographiemedium Affigel CM, die von Marti et al. in Nature, Bd. 375 (1995), S. 322-325 beschriebene Ni-Agarose oder das von Lopez-Martinez et al. in Curr. Biol., Bd. 5 (1995), S. 791-796, beschriebene Affigel-Blau oder die Heparin-Agarose-Teilchen, die von diesen Autoren verwendet wurden, eignen sich für eine pharmazeutische Anwendung weniger gut, da sie immunogen sind und entzündliche Reaktionen hervorrufen können.
Die erfindungsgemäßen Konjugate dienen als neue aktive Substanzen für die Erzeugung pharmazeutischer Verabreichungsformen. Insgesamt führt die Kupplung zu einem verbesserten pharmakokinetischen Profil des Hedgehog-Proteins. Der hydrophobe Kohlenwasserstoffrest führt zu einer Lokalisierung des Hedgehog-Proteins an der Membran der Zielzellen, was zusätzlich zur Erleichterung der Integration in das Zellinnere vor allem zu einer erheblich verlängerten Anwesenheit an der Zelloberfläche führt, was für die pharmakologische Wirkung optimal ist.
Die erfindungsgemäßen Konjugate müssen nicht notwendigerweise zusätzlich an einen Träger für eine langsame Freisetzung gekuppelt sein. Die erfindungsgemäßen Hedgehog- Konjugate sind auch an der Wirkungsstelle im Körper, ohne dass eine verzögerte Freisetzung von einem Träger erfolgt, über eine lange Zeitspanne (mehrere Tage) hochgradig aktiv. Trotzdem ist es zweckmäßig, eine pharmazeutische Zusammensetzung für die lokale Anwendung der erfindungsgemäßen Hedgehog-Konjugate einzusetzen, die das erfindungsgemäße Konjugat zusammen mit einer Trägermatrix enthalten. Die Trägermatrix dient im wesentlichen zur Erleichterung der lokalen Anwendung, insbesondere durch Bereitstellung einer derartigen pharmazeutischen Zusammensetzung mit einer geeigneten minimalen Viskosität für die lokale Anwendung. Die pharmazeutische Zusammensetzung ist vorzugsweise im pH-Bereich von 4 bis 9 gepuffert und enthält ein oder mehr nicht-ionogene Detergenzien, wie Detergenzien vom Polyoxysorbat- oder Polyoxyethylen-Typ (z. B. Tween^R 20, Tween^R 80, Triton^R X-100), Octylglucosid oder ionische Detergenzien, wie Natriumdesoxycholat, Natriumcholat und Natriumtaurodesoxycholat.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein hh-Protein exprimiert, das weitere 10-30 hauptsächlich hydrophobe Aminosäuren am N-Terminus enthält, da dieser ebenfalls in die Membran von Zellen eingebaut wird (Webb et al., Biochemistry, Bd. 37 (1998), S. 673-679; Skolnick et al., Biol. Membranes, (1996), S. 536-554; Hrsg. Merz und Roux). Unter hydrophoben Aminosäuren im Sinne der Erfindung sind Aminosäuren zu verstehen, die eine negative freie Energie beim Übergang aus der wässrigen Phase in eine hydrophob/organische Phase aufweisen. Ferner sind auch N-terminale und/oder C-terminale Sequenzen, von denen bekannt ist, dass sie Transmembran-Helices bilden, z. B. das M28-Peptid, oder die als eine Helix mit der Oberfläche von Membranen in Wechselwirkung treten, z. B. Maginin 2 (Skolnick et al., 1996), ebenfalls für die Erhöhung der Aktivität von hh-Proteinen geeignet.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der N-Terminus des Hedgehog-Proteins mit einem Polypeptidrest modifiziert, der 2-12 Lysinreste und/oder Argininreste enthält. In diesem Fall ist es möglich, die Modifikation mit dem Kohlenwasserstoffrest wegzulassen.
Bei einem aliphatischen, gesättigten oder ungesättigten Kohlenwasserstoffrest mit hydrophober Wirkung und einer Kettenlänge von 8-24, vorzugsweise 10-24 und insbesondere 12-18 C-Atomen handelt es sich vorzugsweise um einen gesättigten oder einfach ungesättigten bis mehrfach ungesättigten Fettsäure- oder Alkylalkoholrest, der gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder eine Carbonylgruppe unterbrochen ist. Besonders bevorzugte gesättigte Fettsäuren sind Caprinsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachidinsäure und Behensäure. Bevorzugte einfach ungesättigte Fettsäuren sind Myristinsäure, Palmitolsäure und Ölsäure. Besonders bevorzugte mehrfach ungesättigte Fettsäuren sind Linolsäure, Linolensäure und Arachidonsäure. Derartige Fettsäurereste sind vorzugsweise über eine Ester-, Säureamid, Disulfid- oder Thioesterbindung an reaktive Gruppen des Proteins gekuppelt.
Die Anzahl an hydrophoben Kohlenwasserstoffketten pro Proteinmolekül kann in geeigneter Weise durch die Reaktionsbedingungen (z. B. Verdünnung) oder durch Auswahl der zu modifizierenden Aminosäure gesteuert werden. Beispielsweise enthält shh drei Cysteinreste, von denen das N-terminale Cystein besonders reaktiv ist. In diesem Fall kann das Reaktionsverfahren dazu führen, dass das N-terminale Cystein mit einer oder mehreren hydrophoben Kohlenwasserstoffketten modifiziert wird. Ferner ist es möglich, zwei oder fast alle drei Cysteinreste statistisch zu modifizieren. Obgleich es bei Modifikation anderer Aminosäuren bevorzugt ist, definierte Aminosäuren zu modifizieren, ist es auch möglich, derivatisierte Hedgehog-Proteine für die pharmazeutische Zusammensetzung zu verwenden, bei denen eine statistische Verteilung von Kohlenwasserstoffketten-Modifikationen von etwa 1 bis etwa 4 Ketten pro Molekül vorliegt. Obgleich eine höhere Anzahl an Kohlenwasserstoffketten pro Molekül geeignet ist, nimmt die Löslichkeit in einer pharmazeutischen Zusammensetzung dadurch ab und es kann zu Störungen in der aktiven, dreidimensionalen Proteinstruktur kommen. Bei Kupplung mit langkettigen Alkylgruppen (C₁₄-C₂₄, vorzugsweise C₁₆-C₂₄) ist es bevorzugt, nur 1-2 Kohlenstoffketten zu verknüpfen, und bei Kupplung von kurzkettigen Kohlenstoffketten ist es jedoch bevorzugt, 2-3 Alkylgruppen zu kuppeln.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Derivatisierung auch die Kupplung von zwei hydrophoben Kohlenwasserstoffketten an eine Aminosäure umfassen. Dies kann beispielsweise durch Kupplung eines Fettsäurediglycerids an die Aminosäure errreicht werden.
Da Hedgehog-Proteine sehr instabil sind, wird bei einer bevorzugten Ausführungsform ein Hedgehog-Protein für die Kupplung verwendet, bei dem die SH-Gruppe des N-terminalen Cysteins geschützt ist. Ein SH-Kupplungsprodukt wird sodann durch Reduktion der geschützten SH-Gruppen unmittelbar vor oder während des Kupplungsvorgangs erhalten. Es ist bevorzugt, die SH-Gruppe dieses Cysteins zu schützen, indem man ein homologes Hedgehog-disulfid oder ein gemischtes -disulfid bildet (z. B. mit GSH oder β-Mercaptoethanol).
Thiol-Schutzgruppen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Hierzu gehören (ohne Beschränkung hierauf) Triphenylmethyl (Trityl) und s-t-Butyl, s-p-Nitrobenzyl und s-p-Methoxybenzyl (vergl. z. B. Greene und Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Auflg., John Wiley & Sons, New York (1991); und Atherton et al., The Peptides, Hrsg. Gross und Meienhofer, Academic Press, New York (1983), Bd. 19, S. 1-38). Derartige thiolgeschützte oder homodimerisierte Hedgehog-Proteine stellen wertvolle Zwischenprodukte für die Herstellung von SH-modifizierten Hedgehog-Proteinen dar und sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Hedgehog-Proteinen, bei denen die SH-Gruppe des N-terminalen Cysteins in Form von stabilen Zwischenprodukten geschützt oder homodimerisiert ist, und zwar für die Herstellung von SH-modifizierten Hedgehog-Proteinen. Bei diesem Verfahren wird die Schutzgruppe abgespalten oder das homologe Dimere wird gespalten, wonach eine Umsetzung mit dem aktivierten Derivatisierungsreagenz folgt.
Die folgenden Verfahren werden für die Kupplung von SH-geschützten Hedgehog-Proteinen bevorzugt:

I. Reduktion des Disulfids oder Spaltung der Schutzgruppe im Kupplungsgemisch, vorzugsweise wenn die Kupplung über Imidazolide oder CoA-Derivate erfolgt.
II. Reduktion des Disulfids, Isolierung der ungeschützten Monomeren in einem sauren Medium und sofortige Kupplung in einem neutralen Bereich unter Verwendung eines aktivierten Disulfids (z. B. Pyridyl-SS) als Kupplungsreagenz.

Es hat sich herausgestellt, dass eine doppelte Acylierung am N-terminalen Cystein vorwiegend bei der Kupplung über Imidazolid- oder CoA-Derivate (60-70 %) erfolgt, wobei dann die gekuppelte hydrophobe Verbindung im einen Fall als Säureamid und im anderen Fall als Thioester gebunden ist. Eine selektive Spaltung der hydrophoben Verbindung, die als Thioester gebunden ist, ermöglicht die Synthese eines monohydrophobisierten Hedgehog-Proteins. Eine derartige selektive Spaltung wird mit einem Reduktionsmittel, wie DTE oder Hydroxylamin, durchgeführt.
Eine Kupplung über ein aktiviertes Disulfid, z. B. über Pyridyl-SS-Derivate führt zu einer Monoalkylierung. Das beschriebene erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es, dass zahlreiche hydrophobe Substanzen, wie Steroide, Kohlenstoffketten (z. B. Fettsäuren) mit einem Gehalt an Thiolgruppen, an Hedgehog-Proteine gekuppelt werden.
Infolgedessen besteht ein weiterer Gegenstand der Erfindung in einem Verfahren zur Herstellung eines SH-modifizierten Hedgehog-Proteins oder eines N-terminalen Fragments davon, vorzugsweise eines Fragments, das im wesentlichen die N-terminale Domäne enthält, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die Thiolgruppe des N-terminalen Cysteins des Hedgehog-Proteins geschützt wird, das auf diese Weise geschützte Protein isoliert wird und nach Abspaltung der Schutzgruppe das Hedgehog-Protein am N-terminalen Cystein derivatisisert wird, vorzugsweise durch kovalente Kupplung einer hydrophoben Verbindung, wie einer Fettsäure oder eines Steroids, mit der SH-Gruppe. Eine derartige Kupplung ist vorzugsweise reversibel und kann durch physiologische Bedingungen, die in einer Säugetierzelle herschen, umgekehrt werden, was zur in vivo-Bildung eines nicht hydrophobisierten Hedgehog-Proteins führt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Kupplung von hydrophoben Verbindungen mit Hedgehog-Proteinen oder Fragmenten davon über eine SH-Gruppe des N-terminalen Cysteins, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass die Thiolgruppe des N-terminalen Cysteins geschützt wird, die geschützte SH-Gruppe reduziert wird und das Hedgehog-Protein mit einem aktivierten Derivat der hydrophoben Verbindung unter Bildung einer Thiolbindung zwischen dem Hedgehog-Protein und der hydrophoben Verbindung umgesetzt wird. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein weiteres Molekül der hydrophoben Verbindung an das Hedgehog-Protein mittels einer Amidbindung gekuppelt werden.
Imidazolid- und CoA-Derivate von hydrophoben Verbindungen sind beispielsweise als aktivierte hydrophobe Verbindungen geeignet. Derartige aktivierte Verbindungen werden vorzugsweise im Verfahren I (vergl. oben) verwendet.
Pyridyldisulfid-Derivate von hydrophoben Verbindungen sind ebenfalls als aktivierte hydrophobe Verbindungen geeignet. Derartige aktivierte Verbindungen werden vorzugsweise im Verfahren II (vergl. oben) verwendet.
Natürliche oder unnatürliche, gesättigte oder einfach ungesättigte oder mehrfach ungesättigte Fettsäuren und insbesondere gesättigte Fettsäuren mit einer Kettenlänge von 4-18 und vorzugsweise 8-18 C-Atomen oder Steroide werden vorzugsweise zur Acylierung von Hedgehog-Proteinen durch das Imidazolid-Verfahren verwendet, wobei Konjugate erhalten werden, bei denen die Kohlenwasserstoffreste eine Kettenlänge von 8-24 C-Atomen aufweisen.
Um hydrophobe Verbindungen mit Hedgehog-Proteinen durch das Pyridyldisulfid-Verfahren zu verknüpfen, ist es bevorzugt, natürliche oder unnatürliche, gesättigte oder einfach ungesättigte oder mehrfach ungesättigte Mercaptoalkane und insbesondere gesättigte Kohlenwasserstoffketten mit einer Thiolgruppe mit einer Kettenlänge von 8-24 C-Atomen, Mercaptosteroide und insbesondere Thiocholesterin zu verwenden.
Beim erfindungsgemäßen Verfahren ist es bevorzugt, das Hedgehog-Protein in einer Konzentration von 0,01-10 mg/ml und insbesondere von 3 mg/ml zu verwenden. Die Salzkonzentration beträgt vorzugsweise 0-2 Mol/Liter. Vorzugsweise wird Natriumchlorid verwendet. Das Molverhältnis des Kupplungsreagenz zum Protein beträgt vorteilhafterweise 1:2 bis 20:1. Bevorzugte Puffer sind Hepes-Puffer, Phosphatpuffer und MES-Puffer. Die Kupplungsreaktionen werden vorzugsweise im pH-Bereich von 4,5 bis 8,5 und vorzugsweise von 6,5-7,5 durchgeführt. Die Reaktionszeit hängt von den verwendeten Bedingungen ab und beträgt zweckmäßigerweise 5 Minuten bis 5 Tage für die Herstellung von dipalmitoyliertem shh. Die Umsetzung wird vorzugsweise in einem Temperaturbereich von 0-40 °C durchgeführt. Der Anteil an Nebenprodukten ist bei niederen Temperaturen gering, vorzugsweise bei Temperaturen unter 10 °C, z. B. 4 °C.
Die Zugabe von Detergenzien ist für das erfindungsgemäße Verfahren besonders vorteilhaft. Bei derartigen Reagenzien kann es sich beispielsweise um ionische oder nicht-ionogene Detergenzien handeln. Zwitterionische Detergenzien werden bevorzugt. Bevorzugte Konzentrationen betragen etwa 0,5-3 (Vol/Vol).
Die Kohlenwasserstoffkette oder die Kohlenwasserstoffketten oder Steroide werden zweckmäßigerweise an reaktive Gruppen des Proteins gekuppelt, beispielsweise an freie Hydroxy-, Mercapto-, Carboxy- oder Aminogruppen über eine Amid-, Ester-, Disulfid- oder Thioesterbindung. Derartige Verfahren sind dem Fachmann geläufig und beispielsweise bei S. S. Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press, Boca Raton, FL, USA, 1993, beschrieben. Beispielsweise können Fettsäuren als Thioester mit Coenzym A (z. B. Palmitoylcoenzym A) über eine Succinimidester- oder N-Maleinimid-Kupplung (z. B. Palmitinsäure-N-hydroxysuccinimidester) über ein Fettsäureanhydrid, Fettsäureimidazolid oder Säurechlorid gekuppelt werden.
Kupplungsverfahren für Palmitoyl CoA, Stearoyl-CoA oder Myristoyl-CoA werden beispielsweise von Ross et al., J. Neurosci. Res., Bd. 21 (1988), S. 35-44; Bizzozero et al., J. Biol. Chem., Bd. 262 (1987), S. 2138-2145, oder für Tubulin von J. Ozols et al., Molec. Biol. of the Cell, Bd. 8 (1997), S. 637-645, beschrieben. Eine Derivatisierung mit Fettsäureanhydriden wurde beispielsweise für Ovalbumin (A. Segawa et al., Int. Archs Allergy Appl. Immun., Bd. 66 (1981) S. 189-199) oder für Peptide (S. P. Yadav et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 205 (1994), S. 1688-1695), beschrieben. Es gibt auch zahlreiche Beispiele für eine Acylierung mit Fettsäuresuccinimidestern, z. B. für Casein (Z. Haque et al., J. Agric. Food Chem., Bd. 31 (1983), S. 1225-1230); (Z. Haque et al., Agric. Biol. Chem., Bd. 46 (1982), S. 597-599). Eine N-terminale Kupplung an Cystein kann auch über eine Aldehydgruppe am Fusionspartner erfolgen (z. B. Palmitoyl-Cys-CHO) (Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91 (1994), S. 6584-6588). Eine N-terminale Kupplung an Serin kann durch Umwandlung in eine Aldehydgruppe, Reaktion mit Hydrazid (z. B. Palmitoyl-Cys-hydrazid) und Stabilisierung des Hydrazons, das gebildet worden ist (z. B. durch Reduktion mit NaBH₃CN), erfolgen (Gaertner et al., Bioconjugate Chem., Bd. 3 (1992), S. 262-268).
Die hydrophobe Kohlenwasserstoffkette wird je nach der chemischen Kupplung beispielsweise in Form eines Ethers, Thioethers, Esters, Thioesters, Disulfids oder Amids an die Seitengruppen der reaktiven Aminosäuren Serin, Threonin, Glutaminsäure, Asparaginsäure, Cystein, Arginin oder Lysin gebunden. Verfahren zur spezifischen Kupplung an bestimmte Aminosäuren werden von S. S. Wong in Chemistry of Protein Conjugation and Cross Linking, CRC Press Inc., Boca Raton, FL, USA, (1993) und von Lundblad in Techniques in Protein Modification (1995) beschrieben.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die hydrophoben Verbindungen in einem organischen Lösungsmittel oder in einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel und Wasser, das vorzugsweise mehr als 10 (Vol./Vol.) organisches Lösungsmittel enthält, in Lösung gebracht. Bei derartigen organischen Lösungsmitteln handelt es sich vorzugsweise um Dioxan, Tetrahydrofuran oder Isopropanol. Für die Kupplung der hydrophoben Verbindung und des Hedgehog-Proteins werden derartige Lösungen der hydrophoben Verbindungen mit einer ein Detergens enthaltenden Lösung des Hedgehog-Proteins, vorzugsweise in dessen geschützter Form, so vereinigt, dass das Gemisch 10 % oder weniger organisches Lösungsmittel enthält. Es wurde festgestellt, dass Hedgehog-Protein-Lösungen mit einem Gehalt an mehr als 10 % an organischem Lösungsmittel zur Fällung und/oder Denaturierung des Hedgehog-Proteins führen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird Thiocholesterin an die Thiolgruppe insbesondere des N-terminalen Cysteins mittels einer oxidativ gebildeten Disulfidbrücke in Gegenwart von solubilisierenden Detergenzien, insbesondere von Natriumdesoxycholat, Natriumcholat, Natriumtaurodesoxycholat, Octylglucosid oder Triton^R X-100, gekuppelt. Im Gegensatz zum N-terminalen hh-Fragment, das von Natur aus am C-Terminus durch Cholesterin modifiziert ist, wird bei diesem Verfahren eine hh-Form gebildet, die ein Thiocholesterin am N-Terminus enthält. Diese Form weist eine ähnlich erhöhte Aktivität wie die natürliche Form auf, kann aber wesentlich einfacher und in größeren Mengen hergestellt werden. Aufgrund der zytoplasmatischen Labilität von Disulfidbrücken weist diese hh-Form kein oder nur ein geringes immunogenes Potential auf.
Um die Löslichkeit von lipophil modifizierten hh-Proteinen zu erhöhen, ist es zusätzlich bevorzugt, die Derivatisierung und/oder anschließende Reinigung oder pharmazeutische Zubereitung in Gegenwart von löslichen, anionischen Polysacchariden, wie Suramin und Heparin, durchzuführen.
Unter Aktivität im Sinne der Erfindung ist die Aktivität von alkalischer Phosphatase zu verstehen, die das Polypeptid in Säugetierzellen induzieren kann (Aktivität beim alkalischen Phosphatase-Test). Bei diesem Verfahren wird eine Mäuse-Fibroblasten-Zelllinie in einem Medium gezüchtet, das fötales Kälberserum enthält. Anschließend wird eine steril filtrierte Probe zugegeben, die Zellen werden nach etwa 5 Tagen lysiert und alkalische Phosphatase wird im Zelllysat mittels der Spaltung eines chromogenen Substrats (pNP, p-Nitrophenol) bestimmt (J. Asahina, Exp. Cell. Res., Bd. 222 (1996), S. 38-47, und T. Nakamura (1997)).
Unter einem erfindungsgemäßen Hedgehog-Protein ist ein sezerniertes Signalprotein (terminale signalgebende Domäne mit 19 kD) zu verstehen, das für die Bildung von zahlreichen Strukturen bei der Embryogenese verantwortlich ist. Sonic-, Indian- oder Desert-hh werden in besonders bevorzugter weise verwendet (M. Fietz et al., Development (Suppl.) (1994), S. 43-51). Ein hh-Protein mit einer Sequenz gemäß den Angaben in der EMBL-Datenbank unter der Nummer L38518 wird vorzugsweise verwendet. Proteine der Hedgehog-Familie weisen eine ausgeprägte Homologie in ihrer Aminosäuresequenz auf, was der Grund ist, dass es ferner bevorzugt ist, solche Nucleinsäuren zu exprimieren, die für Hedgehog-Proteine kodieren, die zu 80 % oder mehr homolog mit der vorerwähnten Sequenz von Sonic-Hedgehog-Protein (shh) ist. Die Proteinhomologie kann mit Hilfe der Computerprogramme Gap oder BestFit (University of Wisconsin; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., Bd. 48 (1970), S. 443-453; Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., Bd. 2 (1981), S. 482-489) bestimmt werden.
Das humane Sonic-Hedgehog-Vorläuferprotein ist aus den Aminosäuren 1-462 der in der EMBL-Databank unter der Nummer L38518 beschriebenen Sequenz zusammengesetzt. Die Aminosäuren 1-23 repräsentieren das Signalpeptid, die Aminosäuren 24-197 repräsentieren die reife Signaldomäne, die Aminosäuren 32-197 repräsentieren die Signaldomäne, die um 8 Aminosäuren verkürzt ist, und die Aminosäuren 198-462 repräsentieren die C-terminale Autoprozessierungsdomäne nach autoproteolytischer Spaltung. Demzufolge werden unter dem N-Terminus des hh-Proteins, wo die Kupplung vorzugsweise stattfindet, erfindungsgemäß die ersten Aminosäuren (N-Terminus) der N-terminalen signalgebenden Domänen 24-197 verstanden. Es ist bevorzugt, eine Kupplung an eine oder mehrere Aminosäuren der ersten 10 Aminosäuren vorzunehmen. Insbesondere ist es bevorzugt, eine Kupplung an die erste oder zweite Aminosäure des N-Terminus der N-terminalen Domäne (AA 24 oder 25) vorzunehmen. Bei den erfindungsgemäßen Hedgehog-Konjugaten sind lipophile Gruppen oder eine oder mehrere Kohlenwasserstoffketten an die N-Terminus-Domäne eines hh-Proteins gekuppelt und beim Kupplungsprodukt handelt es sich insbesondere um einen Thioester oder ein Amid des N-terminalen Cysteins in Position 24 mit Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Palmitolsäure, Stearinsäure oder Ölsäure oder einem Steroid oder es handelt sich um ein hh-Protein, an das ein Thiocholesterin oder ein Mercaptoalkan/-alken über eine Disulfidbrücke gebunden ist. Die Herstellung eines unmodifizierten hh-Proteins wird vorzugsweise auf rekombinante Weise unter Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, durchgeführt, vorzugsweise in einem prokaryontischen (z. B. E. coli) Expressionssystem. Das Hedgehog-Protein wird vorzugsweise auf rekombinantem Wege als ein Fusionsprotein in einer löslichen Art und Weise erzeugt und aus dem Überstand der Zellkultur isoliert oder nach Lysis der Wirtszellen wird der (vorzugsweise N-terminale) Fusionsteil (z. B. polyHis, Streptavidin und dergl.) durch eine sequenzspezifische Protease, wie Enterokinase, gespalten und die freie Thiolgruppe des N-terminalen Systems wird entweder durch Umsetzung mit einem Thiol-Schutzmittel oder durch Dimerisierung des Hedgehog-Proteins über eine Disulfid-Brückenbildung an diesem Cystein geschützt.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält eine pharmakologisch wirksame Dosis des hh-Konjugats und kann vorzugsweise lokal verabreicht werden. Es ist bevorzugt, die erfindungsgemäßen Konjugate in Kombination mit anderen Proteinen der Hedgehog-Familie oder Knochenwachstumsfaktoren, wie knochenmorphogenetische Poteine (BMPs) (Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993), Academic Press Inc., S. 131-167) oder Parathyroidhormonen (Karablis et al., Genes and Development, Bd. 8 (1994), S. 277-289) oder insulinartigen Wachstumsfaktoren (IGF-I oder II) oder transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF-β) zu verwenden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird eine pharmazeutische Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Hedgehog-Konjugats mit einem Gehalt an Suramin bevorzugt. Diese Zusammensetzung kann in vorteilhafter Weise verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung das Hedgehog-Konjugat in einer Konzentration von 0,01-10 mg/ml und insbesondere von 0,01 bis 1 mg/ml.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform enthält die pharmazeutische Zusammensetzung zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Puffer, der vorzugsweise in einem pH-Bereich von 4 bis 10, insbesondere in einem pH-Bereich von 6 bis 9 und insbesondere bei einem pH-Wert von etwa 7 biologisch verträglich ist. Der pH-Wert der pharmazeutischen Zusammensetzung soll zweckmäßigerweise über 4 liegen, um eine Denaturierung der gefalteten Struktur und eine Loslösung des im Hedgehog-Protein komplexierten Zinks zu verhindern. Die Konzentration des Puffers beträgt vorzugsweise 1-500 mmol/Liter und insbesondere 10-100 mmol/Liter. Somit wird gemäß einer geeigneten Ausführungsform 20 mmol/Liter-Kaliumphosphatpuffer vom pH-Wert 7,2 als Puffer verwendet.
Ferner ist es für die Herstellung der pharmazeutischen Zusammensetzung bevorzugt, Hilfssubstanzen zuzusetzen, z. B. Zucker (Mannit, Saccharose, Lactose, Glucose, Saccharose, Trehalose, vorzugsweise 20-100 mg/ml) oder eine Aminosäure, wie Glycin oder Arginin, sowie Antioxidationsmittel, wie EDTA, Citrat, Polyethylenglykol (1-10 Gew.-%), Ascorbinsäure, Tocopherol, Detergenzien, vorzugsweise nicht-ionogene Detergenzien (vorzugsweise 0,005-1 Gew.-%), wie Detergenzien vom Polysorbat- oder Polyoxyethylen-Typ (z. B.Tween^R 20, Tween^R 80) oder Polyoxyethylene oder ionische Detergenzien, wie Natriumcholat, Natriumdesoxycholat oder Natriumtaurodesoxycholat, entzündungshemmende Mittel, Lokalanästhetika, Antibiotika und/oder Stabilisatoren, wie Lipide, Fettsäuren und Glycerin.
Das erfindungsgemäße Konjugat kann in vorteilhafter Weise verwendet werden, um Chondrozyten und Osteozyten in einer osteoinduktiven pharmazeutischen Zusammensetzung zu induzieren oder zu stimulierren oder auch um Muskel- und Nervenzellen zu induzieren. Osteoinduktive pharmazeutische Zusammensetzungen sind beispielsweise aus US-Patent 5 364 839, WO-97/35607 und WO-95/16035 bekannt.
Die Aktivität der erfindungsgemäßen Hedgehog-Konjugate kann in vivo bewertet werden und zwar gemäß H. L. Glansbeek et al., Laboratory Investigation, Bd. 78 (1998), S. 133-142; US-Patent 5 270 300; D. M. Toriumi et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., Bd. 117 (1991), S. 1101-1112; S. D. Cook et al., J. Bone and Joint Surgery, Bd. 76-A (1994), S. 827-837; und E. H. Riley et al., Clin. Orthopaed. and Related Research, Bd. 324 (1996), S. 39-46.
Wenn das erfindungsgemäße Konjugat auf lokalem Wege verabreicht wird, ist es bevorzugt, es in Kombination mit einer geeigneten Matrix als Träger und/oder zusammen mit einem Maskierungsmittel zu verwenden. Eine derartige Matrix eignet sich für eine langsame Freisetzung des Proteins in vivo in einer aktiven Form, insbesondere in der Nähe von Knochen oder Knorpelgewebe. Beim Maskierungsmittel handelt es sich um eine Substanz, die die Verabreichung beispielsweise durch Injektion erleichtert und/oder die Abwanderung des erfindungsgemäßen Proteins von der Verabreichungsstelle verhindert oder zumindest verzögert.
Die erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung enthält vorzugsweise ein Polymeres (strukturelle Substanz), die eine Haftungsfunktion für Zellen aufweist. Bei einer derartigen strukturellen Substanz handelt es sich beispielsweise um Kollagen.
Ein biologisch verträgliches, abbaubares Material, z. B. auf der Basis von Kollagen, oder andere Polymere auf der Basis von Polymilchsäure, Polyglykolsäure oder Copolymeren von Milchsäure und Glykolsäure sind als Matrixmaterial besonders geeignet. Derartige polymere Matrices werden beispielsweise in WO-93/00050 beschrieben.
Bei Maskierungsmitteln handelt es sich beispielsweise um Cellulose und celluloseartige Materialien und beispielsweise um Alkylcellulose, Carboxymethylcellulose, Hyaluronsäure, Natriumalginat, Polyethylenglykol und Polyvinylalkohol, worunter Hyaluronsäure besonders bevorzugt wird, insbesondere in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die sogar ohne Trägermatrix auskommt.
Die nachstehenden Beispiele, Literaturstellen, die Sequenzliste und die Figuren dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung, deren Schutzumfang sich aus den Patentansprüchen ergibt. Die beschriebenen Verfahren sind als Beispiele zu verstehen, die den Gegenstand der Erfindung auch nach Vornahme von Modifikationen beschreiben.
Beschreibung der Figuren
1 zeigt die Aktivität von rekombinantem, humanem shh nach Derivatisierung mit Palmitoyl-CoA.
2 zeigt die Aktivität von rekombinantem, humanem shh nach Derivatisierung mit Thiocholesterin.
Beispiel 1
a) Klonierung von humanem Sonic-Hedgehog mit einem angebrachten His-6-Anker sowie einer Enterokinase-Spaltungsstellet Expression in E. coli
Das folgende Verfahren kann zur Amplifikation des reifen, N-terminalen Teils von humanem Sonic-Hedgehog (Aminosäuren 24-Cys bis 197-Gly) aus einem beliebigen erwünschten Plasmid oder der entsprechenden cDNA, die Sonic-Hedgehog enthalten, verwendet werden:
Ein Stück des shh-Gens, das sich von einer internen RsrII-Spaltungsstelle bis zur Kodierungssequenz für die Aminosäure 198 erstreckt, wird mit Hilfe von zwei Primern (344 und 345) amplifiziert und gleichzeitig können mehrere Stoppcodons sowie eine PstI-Spaltungsstelle am C-Terminus angebracht werden.
SEQ ID NO:1
SEQ ID NO:2
Ein auf diese Weise amplifiziertes DNA-Fragment kann erneut mit RsrII und PstI gespalten werden und wird bei den folgenden Stufen benötigt (Fragment 344/345).
Ein Linker wird durch Annealing von zwei weiteren Primern (346 und 347) konstruiert, mit deren Hilfe sechs Histidinreste und eine Enterokinase-Spaltungsstelle (EK) am N-Terminus eingebaut werden:
SEQ ID NO:3
SEQ ID NO.4
Adapter nach Annealing von 346 und 347:
aattc atg cat cat cac cac cac cac gat gac gac gac aaa tgc g g tac gta gta gtg gtg gtg gtg cta ctg ctg ctg ttt acg c ctg
Für die Expression wird das PCR-Fragment 344/345 zusammen mit dem Adapter 346/347 in einen mit EcoRI/PstI gespaltenen Vektor kloniert. Dies kann entweder direkt oder nach Zwischenklonierung des Fragments 344/345 in einen weiteren Vektor durchgeführt werden. Der mit EcoRI/PstI gespaltene Vektor muss einen geeigneten Promotor für die Expression in E. coli am EcoRI-Ende enthalten, vorzugsweise T5, tac, lac und dergl. Die shh-Expressionsplasmide werden in einen für die Expression geeigneten E. coli-Stamm transfiziert. Das Expressionssystem enthält ferner Nucleinsäuren, die für die Arginin-tRNA_AGA/AGG die in prokaryontischen Zellen enthalten ist, kodieren (Brinkmann et al., Gene, Bd. 85 (1989), S. 109-114).
b) Fermentation
10 Liter-Fermentation des E. coli-Expressionsklons für Hedgehog:
Vorkulturen werden aus Typkulturen (Plattenausstrich oder Ampullen, gelagert bei –20 °C), die bei 30-37 °C unter Schütteln inkubiert werden, hergestellt. Das Inokulationsvolumen in der nächsthöheren Dimension beträgt in jedem Fall 1-10 Vol.-%. Ampicillin (50-100 mg/Liter) wird zu der Vorkultur und der Hauptkultur gegeben, um eine Selektion gegen Plasmidverlust durchzuführen.
Bei den verwendbaren Nährstoffen handelt es sich um enzymatisch verdautes Protein und/oder Hefeextrakt als N- und C-Quelle sowie um Glycerin und/oder Glucose als zusätzliche C-Quelle. Das Medium ist auf den pH-Wert 7 gepuffert. Metallsalze können in physiologisch verträglichen Konzentrationen zugesetzt werden, um den Fermentationsvorgang zu stabilisieren. Die Fermentationstemperatur beträgt 25-37 °C. Das Wachstum wird durch Messen der optischen Dichte bei 528 nm bestimmt. Die Expression wird durch IPTG induziert. Nach einer Fermentationsphase von etwa 30 Stunden wird die Biomasse durch Zentrifugation bei OD-Stillstand geerntet.
Beispiel 2
a) Herstellung von dimerem, rekombinantem, humanem shh
55 g der in Beispiel 1b hergestellten Biomasse wurden mittels einer Hochdruckpresse lysiert und zentrifugiert und der Überstand wurde auf 50 ml chelatbildende Sepharose (Pharmacia Biotech), die vorher mit Zn beladen worden war, aufgesetzt. Das shh-Fusionsprotein wurde mit einem Gradienten von 0 bis 200 mM Imidazol in 50 mM Hepes, 250 mM NaCl, pH-Wert 7,4, eluiert. Fraktionen mit einem Gehalt an shh wurden mittels SDS-PAGE identifiziert, vereinigt und mit 1 Volumen 50 mM Hepes, pH-Wert 7,4, verdünnt. Während der Verdünnung auftretende Niederschläge wurden zentrifugiert. Der Überstand wurde bei 4 °C gegen 50 mM Hepes, pH-Wert 7,4, dialysiert. Enterokinase (1:500, Gew./Gew., Boehringer Mannheim GmbH) und β-ME (ad 10 mM) wurden zu 500 mg des auf diese Weise erhaltenen shh-Fusionsproteins gegeben und 16 Stunden bei 35 °C in einem Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde festes DTT in einer Konzentration von 10 mM zugegeben. Die Probe wurde auf 166 ml SP-Sepharose (Pharmacia Biotech) aufgesetzt und mit einem Gradienten von 0-800 mM NaCl in 20 mM HEPES, pH-Wert 7,4, eluiert. Nach Analyse der Peakfraktionen mittels SDS-PAGE wurden die Hauptfraktionen vereinigt, in Aliquotanteile aufgeteilt und bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C aufbewahrt. Diese Hauptfraktionen enthalten shh unter nicht-reduzierenden Bedingungen als Dimeres, das über eine reduzierbare Disulfidbrücke vernetzt ist und ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 38 kDa aufweist.
b) Modifikation durch Inkubation unter reduzierenden Bedingungen
Dimeres shh (c = 1 mg/ml) wurde mit 10 mM DTE reduziert (30 min, 25 °C) und über Nacht gegen PBS mit einem Gehalt an 0,5 mM DTT dialysiert. Das Massenspektrum des Dialysats ergab nach Entsalzen mit RP-HPLC, dass der Großteil des monomerisierten shh unter anderem (d. h. zusätzlich zu weiteren Modifikationen, die zu einer Peakverbreiterung im Massenspektrum führen und nicht weiter spezifiziert werden) Addukte von 32 ± 4 Da (eine doppelte Oxidation des N-terminalen Cysteins) und 47 ± 4 Da aufwies. Die auf diese Weise modifizierten shh-Formen konnten nicht durch Reoxidation erneut dimerisiert werden. Dies zeigte, dass die SH-Gruppe des N-terminalen Cysteins in stabiler Weise modifiziert worden war. Infolgedessen steht diese SH-Gruppe für weitere Reaktionen nicht mehr zur Verfügung, z. B. zur Bildung eines Thioesters. Die Ausbeute der Derivatisierung mit hydrophoben Verbindungen wird dadurch stark verringert. Um somit das N-terminale Cystein in vitro zu acylieren, sollen die Zeitspannen, in denen das reduzierte shh in Lösung vorliegt, so kurz wie möglich gehalten werden oder im Fall einer geeigneten Kupplungschemie soll die Reaktion in Gegenwart von Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid (TCEP·HCl) durchgeführt werden, da diese Verbindung nur Disulfidverbindungen, jedoch nicht (aktivierte) Thioester angreift.
c) Kinetik der Reoxidation von shh unter Bildung des Dimeren in Bezug auf den pH-Wert des Lösungsmittels
0,5 ml shh-Dimeres (c = 2,7 mg/ml) wurde durch Reduktion der intermolekularen Disulfidbrücke reduziert, indem man 2 mM TCEP (Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin-hydrochlorid) 15 min bei 25 °C zusetzte. Anschließend wurde die Probe erneut mittels einer PD-10-Säule (Pharmacia) in PBS, pH-Wert 7,0, oder PBS, pH-Wert 5,0, gepuffert. Die spontane Dimerisierung (bei 25 °C) wurde im Verhältnis zur Inkubationsdauer analysiert, nachdem das Reduktionsmittel durch RP-HPLC entfernt worden war.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengestellt. Tabelle 2

n.d.: = nicht bestimmt

Es ist ersichtlich, dass das shh-Monomere spontan dimerisiert. Diese Dimerisierung verläuft beim pH-Wert 7,0 sehr rasch, verläuft aber beim pH-Wert 5,0 mit einer langsameren Kinetik.
Beispiel 3
a) Herstellung von Kupplungsreagenzien für die selektive Acylierung von SH-Gruppen in Cysteinen
(I) Imidazolid-Verfahren
Die Ausgangsmaterialien (Imidazolide) werden gemäß dem allgemeinen Verfahren A, B oder C in analoger Weise zur Literatur hergestellt (J. Leksyszyn et al., Synthesis (1978), S. 478-479; H. A. Staab, Angew. Chem., Bd. 74 (1962), S. 407-423; K. E. Fahrenholtz et al., J. Med. Chem., Bd. 17 (1974), S. 337-342).
Ia) Allgemeines Verfahren A
10 mmol der entsprechenden Carbonsäure und 10 mmol 1,1'-Carbonyldiimidazole werden in absolutem Tetrahydrofuran gelöst und 30 Minuten bis 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird unter Vakuum eingedampft und ohne weitere Reinigung verwendet.
Ib) Allgemeines Verfahren B
10 mmol des entsprechenden Säurechlorids und 20 mmol Imidazol werden 1-24 Stunden unter Rückfluss in absolutem Toluol unter Feuchtigkeitsausschluss erwärmt. Das gebildete Imidazol-hydrochlorid wird filtriert und das Filtrat wird unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von Ethylacetat/Heptan oder durch Umkristallisation gereinigt.
Ic) Allgemeines Verfahren C
10 mmol der entsprechenden Carbonsäure werden 1-48 Stunden bei Raumtemperatur mit 10 mmol Dicyclohexylcarbodiimid und 10 mmol Imidazol in Dichlormethan gerührt. Nach Abkühlen auf 0 °C wird der gebildete Harnstoff durch Filtration entfernt. Das Filtrat wird mit H₂O extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet, unter Vakuum eingedampft und umkristallisiert.
Die folgenden Imidazolid-Derivate von Fettsäuren wurden erhalten:
1-Imidazol-1-yl-hexan-1-on (farbloses Öl; Ausbeute 66 %)
1-Imidazol-1-yl-octan-1-on (farblose Kristalle; Ausbeute 59 %)
1-Imidazol-1-yl-decan-1-on (farblose Kristalle; Ausbeute 79 %)
1-Imidazol-1-yl-dodecan-1-on (farblose Kristalle; Ausbeute 86 %)
1-Imidazol-1-yl-tetradecan-1-on (farblose Kristalle; Ausbeute 52 %)
1-Imidazol-1-yl-hexadecan-1-on (farblose Kristalle; Ausbeute 70 %)
17-(4-Imidazol-1-yl-1-methyl-4-oxobutyl)-10,13-dimethyldodecahydro-cyclopenta[a]phenanthren-3,7,12-trion) (farblose Kristalle; Ausbeute 56 %)
4-(10,13-Dimethyl-hexadecahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl)-1-imidazol-1-yl-pentan-1-on (farblose Kristalle; Ausbeute 71 %)
(II) Pyridyldisulfid-Verfahren
Die Ausgangsmaterialien (Pyridyldisulfide) werden gemäß dem allgemeinen Verfahren A gemäß Literaturangaben (S. Lee et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., Bd. 64 (1991), S. 2019-2021) hergestellt. 10 mmol des entsprechenden Mercaptans und 10 mmol 2,2'-Dithiodipyridin werden in 30 ml absolutem Dichlormethan gelöst und 6-24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit Diethylether versetzt und filtriert. Das Filtrat wird unter Vakuum eingedampft und durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung von Ethylacetat/Heptan gereinigt.
Die folgenden Produkte wurden erhalten:
2-Decyldisulfanylpyridin (farbloses Öl; Ausbeute 76 %)
2-Hexadecyldisulfanylpyridin (farblose Kristalle; Ausbeute 64 %)
2-{17-(1,5-Dimethylhexyl)-10,13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]-phenanthren-3-yl-disulfanyl]-pyridin (farblose Kristalle; Ausbeute 56 %)
b) Herstellung von palmitoyliertem, rekombinantem, humanem shh unter Verwendung von Palmitoylimidazolid
Dimeres, unmodifiziertes, rekombinantes, humanes shh gemäß Beispiel 2 wurde als Ausgangsmaterial verwendet. Das Protein lag in PBS-Puffer (10 mM Natriumphosphatpuffer, 150 mM NaCl, pH-Wert 7,4) in einer Konzentration von 3 mg/ml vor. Detergens, vorzugsweise 200 μl einer 10%igen Zwittergent 3-14-Lösung wurden zu 2 ml dieser Probe gegeben. Anschließend wurde Tri-(2-carboxyethyl)-phosphin (TCEP) in einer Konzentration von 2 mM zugegeben. Nach 15-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wurden 50 μl einer 60 mM Lösung von Palmitoylimidazolid (1-Imidazol-1-yl-hexadecan-1-on) in Dioxan zugegeben. Die Lösung wurde 1-3 Tage vorzugsweise bei 4 °C unter Schütteln inkubiert.
Dipalmitoyliertes shh entstand unter diesen Bedingungen als Hauptprodukt (70-75 %). Es wurde wie in Beispiel 6 durch RP-HPLC und Massenspektrometrie identifiziert. Das auf diese Weise modifizierte shh wies eine wesentlich höhere biologische Aktivität als das unmodifizierte shh auf, und zwar beim in Beispiel 7 beschriebenen Aktivitätstest. Die halbmaximale Aktivität wurde bei 70 ng/ml erreicht.
Der Typ des verwendeten Detergens weist einen starken Einfluss auf die Ausbeute an dipalmitoyliertem shh und den Grad der biologischen Aktivität auf (Tabelle 1).
Tabelle 1 Einfluss des verwendeten Detergens auf den Anteil an dipalmitoyliertem shh im Reaktionsgemisch (durchgeführt bei Raumtemperatur); Verfahren zur quantitativen Bestimmung wie in Beispiel 6
c) Herstellung von alkyliertem, rekombinantem, humanem shh unter Verwendung von 2-Hexadecyldisulfanylpyridin
Dimeres, unmodifiziertes, rekombinantes, humanes shh gemäß Beispiel 2a wurde als Ausgangsprodukt verwendet. Das Protein lag in PBS-Puffer (10 mM Natriumphosphatpuffer, 150 mM NaCl; pH-Wert 7,4) in einer Konzentration von 3 mg/ml vor. Nach Zugabe von 2 mM TCEP wurde eine 15-minütige Inkubation zur Monomerbildung durchgeführt. Anschließend wurde das TCEP mittels einer PD-10-Säule, die mit 5 mM Kaliumphosphatpuffer, 150 mM NaCl, pH-Wert 5,0 äquilibriert worden war, entfernt. 200 μl-Aliquotanteile des auf diese Weise hergestellten shh-Monomeren wurden zur Durchführung der Umsetzung mit 2-Hexadecyldisulfanylpyridin gemäß zwei verschiedenen Verfahren verwendet.

A) 20 μl 10 % Zwittergent 3-14-Lösung, 20 μl 0,5 M HEPES, pH-Wert 7,0 und ein 1- bis 20-facher molarer Überschuss an Kupplungsreagens (gelöst in Dioxan, 60 mM) wurden zum shh-Monomeren gegeben.
B) 2 μl 10 % Natriumdesoxycholat, 20 μl 1 M Kaliumphosphatpuffer, pH-wert 7,6, und ein 2-facher bis 20-facher molarer Überschuss an Kupplungsreagenz (gelöst in Methanol, 60 mM) wurden zum shh-Monomeren gegeben.

Die Umsetzung ist bei beiden Varianten nach 15 Minuten beendet.
Ein 10-facher molarer Überschuss an Kupplungsreagenz führte bei Variante A) zu einem Anteil von 43 % und bei Variante B) zu einem Anteil von 47 % an monoalkyliertem shh im Reaktionsgemisch. Bei Variante A war die biologische Aktivität im Vergleich zu unmodifiziertem shh stark erhöht und die halbmaximale Aktivität betrug 200 ng/ml shh. Ein 1-facher molarer Überschuss an 2-Hexadecyldisulfanylpyridin ergab nur geringfügig niedrigere Ausbeuten. Die Variante B führte ebenfalls zu einem Anstieg der Aktivität im Vergleich zu unmodifiziertem shh, jedoch in geringerem Umfang: mit der gleichen Menge an Protein wurden nur 30 % der biologischen Aktivität erreicht. Daher wird die Variante A bevorzugt.
d) Reinigung der alkylierten shh-Derivate
Das Kupplungsprodukt wurde in 50 mM HEPES, 0,1 % Tween^R 80, pH-Wert 7,4, 1:4 verdünnt und anschließend mit SP-Sepharose HP (Pharmacia) gereinigt.
Äquilibrationspuffer: 50 mM HEPES, 0,1 % Tween^R 80, pH-Wert 7,4; Elutionspuffer: 50 mM HEPES, 0,2 % Tween^R 80, pH-Wert 7,4, mit einem Gehalt an 0,8 M NaCl; Gradientenelution (2 × 6 Säulenvolumen) und diskontinuierliche Elution.
Im Fall von dipalmitoyliertem shh war es möglich, das überschüssige Palmitoylimidazolid abzutrennen und unmodifiziertes shh teilweise abzutrennen. Im Fall der Modifikation mit 2-Hexadecyldisulfanylpyridin ergab sich eine erhebliche Anreicherung des monopalmitylierten shh von 76 %. Das modifizierte shh kann beispielsweise mittels Heparin-Sepharose weiter gereinigt werden.
Beispiel 4
a) Herstellung von palmitoyliertem, rekombinantem humanem shh unter Verwendung von Palmitoyl-CoA:
2 ml der gereinigten dimeren shh-Probe mit einer shh-Konzentration von 0,35 mg/ml wurde mit DTE bis zu einer Endkonzentration von 20 mM vermischt, 2 h bei 37 °C inkubiert und anschließend dialysiert und zwar gegen:

a) 50 mM Tris/HCl, 1 mM DTE, 0,1 mM ZnCl₂, 0,5 % Triton^R X-100, pH-Wert 8,5,
b) 100 mM MOPS, 1 mM DTE, 0,1 % Triton^R X-100, 0,1 mg/ml Suramin, pH-Wert 7,4,
c) 100 mM MOPS, 1 mM DTE, 0,1 % Triton^R X-100, pH-Wert 7,4.

Anschließend wurden verschiedene Volumina einer Palmitoyl-CoA-Lösung (10 mg/ml in 100 mM MOPS, 1 mM DTT, 0,2 % Triton^R X-100, pH-Wert 7,6) zu 0,5 ml-Aliquotanteilen der Proben gegeben, was zu Palmitoyl-CoA-Konzentrationen in den Gemischen von

1) 0 μM
2) 50 μM
3) 500 μM

1

b) Abhängigkeit der Acylierung von der shh-Konzentration und dem Molverhältnis zwischen shh und Palmitoyl-CoA (Pal-CoA)
Dimeres shh (in PBS) wurde mit PBS auf c = 150 μM oder 37,5 μM verdünnt und mit Tween^R 80 (Endkonzentration 0,05 %), DTE (3 mM Endkonzentration) und TCEP (1 mM Endkonzentration) versetzt. Anschließend wurde Pal-CoA (20 mM in Wasser) in den angegebenen Mengen zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei 25 °C inkubiert. Sodann wurden die Proben durch RP-HPLC analysiert oder unterschiedliche Verdünnungen wurden im Zelltest nach Verdünnung in PBS, 1 mg/ml BSA, 0,05 % Tween^R 80, pH-Wert 7,3 und Sterilfiltration analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3

*EC50 ist die Konzentration an shh, die im Zelltest zur Erzielung einer halbmaximalen Induktion von alkalischer Phosphatase zu verwenden war. Aufgrund der Unterschiede in der Passagenzahl der Zellen und somit aufgrund von Veränderungen in der Zellphysiologie kann dieser wert geringfügig zwischen den zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführten Tests variieren.

Ein mäßiger Überschuss an Kupplungsreagenz (<50-fach) führt vorwiegend zur Bildung eines shh-Derivats, das am N-terminalen Cystein doppelt acyliert ist. Mit zunehmendem Verhältnis von Pal-CoA zu shh wird shh, das mehr als 2-fach palmityliert ist, in zunehmendem Ausmaß gebildet. Eine Palmitylierung mit mehr als zwei Fettsäureresten erhöht ebenfalls die Aktivität. Bei einer shh-Konzentration von 37,5 μM ist ein 10-facher Überschuss von Pal-CoA in Bezug auf die Aktivität optimal. Bei einer shh-Konzentration von 150 μM ergibt bereits ein 3-facher Überschuss an Pal-CoA eine hohe Ausbeute an doppelt palmityliertem shh und eine hohe Aktivität.
c) Abhängigkeit der Acylierung vom Typ und der Konzentration des Detergens
Dimeres shh wurde in PBS, pH-Wert 7,4, auf eine Konzentration von 0,75 mg/ml eingestellt und in den angegebenen Mengen mit den entsprechenden Detergenzien sowie in jedem Fall mit 500 μM Pal-CoA und 3 mM DTE oder 3 mM TCEP (Endkonzentration) vermischt. Die Kupplungsgemische wurden über Nacht bei 25 °C inkubiert und anschließend durch RP-HPLC analysiert oder in verschiedenen Verdünnungen im Zelltest nach Verdünnung in PBS, 1 mg/ml BSA, 0,05 % Tween^R 80, pH-Wert 7,3, und Sterilfiltration verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengestellt. Tabelle 4

pal. = palmityliert
* Reduktion mit 3 mM TCEP anstelle von 3 mM DTE

Es stellte sich heraus, dass es möglich war, hohe Palmitylierungsraten unter Verwendung von 0,05 % Tween^R 80 oder 0,5 % Octylglycosid zu erhalten. Ferner führte eine Palmitylierung in 0,05 % Zwittergent zu einer starken Zunahme der Aktivität. Eine gleichzeitige Reduktion mit TCEP führte zu ähnlichen Ergebnissen wie die Reduktion mit DTE.
d) Acylierung von reduziertem, monomerem shh in Relation zum pH-Wert des Kupplungsgemisches
Dimeres shh (c = 0,7 mg/ml) wurde mit 10 mM DTE reduziert und über Nacht gegen PBS, 0,05 % Tween^R 80, 0,5 mM DTE dialysiert. Das Dialysat wurde auf eine Endkonzentration von c = 0,25 mg/ml und mit PBS, 0,05 % Tween^R 80, 0,5 mM DTE auf den entsprechenden Wert eingestellt und 125 μM Pal-CoA wurden zugegeben. Die Gemische wurden 2 Stunden bei 37 °C inkubiert und anschließend in einer 1:500-Verdünnung im Zelltest analysiert. Die Aktivität der Proben ist in Tabelle 5 als Stimulation der AP-Aktivität relativ zur Grundaktivität von unstimulierten C3H10T1/2-Zellen (=100 %) zusammengestellt.
Tabelle 5
Somit erfolgt die maximale Aktivierung bei einem neutralen bis geringfügig alkalischen pH-Wert.
e) Kupplung von Acyl-CoA-Derivaten mit einem Gehalt an Acylgruppen mit unterschiedlichen Längen der Kohlenstoffkette
Dimeres shh wurde auf eine Konzentration von 0,75 mg/ml in PBS, 0,05 % Tween^R 80, pH-Wert 7,4, eingestellt. 3 mM DTE und 0,5 mM des entsprechenden Acyl-CoA-Derivats wurden zugegeben. Anschließend wurde eine Inkubation über Nacht bei 25 °C durchgeführt. Die Proben wurden durch RP-HPLC analysiert oder im Zelltest bei verschiedenen Verdünnungen nach Verdünnung in PBS, 1 mg/ml BSA, 0,05 % Tween^R 80, pH-Wert 7,3, und Sterilfiltration verwendet. Die Retentionsverschiebung bei RP-HPLC sowie die Ausbeuten an diacyliertem shh und die Aktivität im Zelltest sind in Tabelle 6 zusammengestellt.
Tabelle 6
Es zeigt sich, dass Acylgruppen mit verschiedenen Kettenlängen in wirksamer Weise unter Anwendung des Verfahrens unter Einsatz von Pal-CoA-Derivaten übertragen werden können. Die Detergenskonzentration sowie der Typ des verwendeten Detergens erfordert eine Feinoptimierung in Abhängigkeit von der Kettenlänge des übertragenen Acylrestes. Eine abnehmende Kettenlänge des Acylrestes oder eine zunehmende Anzahl an ungesättigten Kohlenstoffbindungen führt zu einer Abnahme der spezifischen Aktivität des acylierten shh-Derivats.
Beispiel 5
a) Derivatisierung von rekombinantem, humanem shh mit Thiocholesterin
Um shh durch Thiocholesterin, das an das aminoterminale Cystein über eine Disulfidbrücke gebunden ist, zu modifizieren, wurde reduziertes, monomeres shh in einer Konzentration von 0,66 mg/ml in 0,5 mM DTT, pH-Wert 7,0, in einem Verhältnis von 1:3 im folgenden Reaktionspuffer verdünnt:
100 mM Ethanolamin
100 mM NaCl
50 μM CuCl₂
pH:-Wert 9,5
0,8 % (Gew./Vol.) Natriumdesoxycholat oder 0,4 (Gew./Vol.) Natriumcholat oder 1,3 % (Gew./Vol.) n-Octylglycosid oder 0,3 % Triton^R X-100.
Die Reaktion wurde durch Zugabe folgender Bestandteile (Endkonzentrationen) gestartet:
5 % (Vol./Vol.) Aceton oder 100 μM Thiocholesterin (aus einer 10 mM Lösung in Aceton) oder 500 μM Thiocholesterin (aus einer 10 mM Lösung in Aceton). Das Gemisch wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt.
Bereits vor der Sterilfiltration wurden die Proben mit 9 Volumenteilen 20 mM Natriumphosphat, 0,9 % NaCl, 0,05 Tween^R 80, 1 mg/ml, 0,1 mg/ml Suramin, pH-Wert 7,2 verdünnt und in einer zusätzlichen 1/20-Verdünnung im Zelltest analysiert.
Wie in 2 dargestellt, ergibt sich eine Aktivitätszunahme, die von der Thiocholesterin-Konzentration abhängt, das in den Proben mit einem Gehalt an anionischen Detergenzien in besonders wirksamer Weise erzeugt oder stabilisiert worden ist.
b) Derivatisierung von rekombinantem, humanem shh mit Thiocholesterin-pyridyldisulfid
Um shh mit Thiocholesterin, das an das aminoterminale Cystein über eine Disulfidbrücke gebunden ist, zu modifizieren, wurde shh-Dimeres, das über eine Disulfidbindung kovalent zwischen den N-terminalen Cysteinen vernetzt war, 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 mM TCEP reduziert und anschließend erneut in PBS-Puffer, pH-Wert 5, gepuffert, um das Reduktionsmittel durch Verwendung einer PD10-Säule (Pharmacia) abzutrennen. Für die Kupplung wurde die shh-Konzentration auf c = 1 mg/ml mit PBS, pH-Wert 5, eingestellt. Der pH-Wert wurde auf einen neutralen bis leicht alkalischen Wert (z. B. pH-Wert 7,6) eingestellt, indem eine konzentrierte Pufferlösung (z. B. 40 Vol.-% 0,4 M Naphosphat, pH-Wert 9,2) zugegeben wurde. Unmittelbar darauf wurden zunächst das Detergens und anschließend das Kupplungsreagenz (5 mM Thiocholesterin-pyridyldisulfid) in Lösung in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Methanol, 40 °C) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde mehrere Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend durch HPLC und Massenspektroskopie analysiert oder verschiedene Verdünnungen wurden im Zelltest nach Verdünnung in PBS, 1 mg/ml BSA, 0,05 % Tween^R 80, pH-Wert 7,3 und Sterilfiltration verwendet.
Die Ergebnisse einiger Beispiele der Kupplungsgemische sind in Tabelle 7 zusammengestellt.
Tabelle 7
Wie aus Tabelle 7 hervorgeht, lässt sich ein disulfidgekuppeltes Thiocholesterin-Derivat von shh unter geeigneten Bedingungen in einer Ausbeute von mehr als 50 erzeugen, das beim Zelltest mindestens 10 % der spezifischen Aktivität von dipalmityliertem shh aufweist.
Beispiel 6
Charakterisierung eines Kupplungspräparats von shh mit Thiocholesterin-pyridyldisulfid durch RP-HPLC und Massenspektrometrie
100 μl eines Kupplungspräparats, das gegen PBS, 0,05 Tween 80 mit einem Gehalt an 0,7 mg/ml shh, 1 Natriumcholat, 250 μM Thiocholesteryl-pyridyldisulfid, pH-Wert 7,6, dialysiert worden war, wurde auf eine 1 × 150 mm-Butyl-Säule (Vydac^R 214TP5115), die in 18 % Acetonitril, 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) äquilibriert worden war, aufgesetzt. Eine Elution wurde bei 25 °C in einem Gradienten von 18-90 % Acetonitril in 0,1 % TFA durchgeführt. Das Eluat wurde aufgeteilt und einerseits on-line durch Nachweis der Absorption bei 220 nm und andererseits on-line durch einen Elektrospray-Massenspektrometer (API100, Sciex, Parametereinstellungen: Startmasse (m/z) 900 Atommasseeinheiten (amu), Stoppmasse (m/z) 1 500 amu, Stufe 0,3 amu, Verweilzeit 0,5 ms, Öffnungsspannung 30 V) analysiert. Das reduzierte monomere shh und das reoxidierte dimere shh mit Massen von 19 560 Da und 39 120 Da wurden bei 18 min (42-44 % Acetonitril) eluiert. Das mit Disulfid vernetzte shh mit einem Gehalt an Thiocholesterin mit einer Masse von 19 962,7 Da wurde bei 24,5 min (48,5 % Acetonitril) eluiert.
Beispiel 7
Induktion von alkalischer Phosphatase beim Zelltest (Bestimmung der Aktivität von alkalischer Phosphatase)
5 000 Zellen der murinen, mesenchymalen, pluripotenten Linie C3H10T1/2 (ATCC CCl-226) wurden in die einzelnen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen überimpft. Die Zellen befanden sich in 100 μl DMEM, 2 mM Glutamin, 100 IU/ml Penicillin, 100 μg/ml Streptomycin und 10 % fötales Kälberserum (FCS). Am nächsten Tag wurden die zu prüfenden aktiven Substanzen in geeigneten Konzentrationen in einem Volumen von 100 μl nach Verdünnung im Kulturmedium zugegeben. Der Test wurde nach 5 Tagen gestoppt. Zu diesem Zweck wurden die Überstände verworfen und die Zellen wurden 1-mal mit PBS gewaschen. Sodann wurden die Zellen in 50 μl 0,1 % Triton^R X-100 lysiert und bei –20 °C eingefroren. Nach Auftauen wurden 25 μl für die Proteinbestimmung und 25 μl zur Bestimmung der Ativität von alkalischer Phosphatase verwendet.
Proteinbestimung gemäß den Angaben des Herstellers Pierce:
75 μl redestilliertes H₂O wurden zu dem Gemisch gegeben. Anschließend wurden 100 μl BCA-Proteinreagenz zugegeben (Pierce Micro BCA, Nr. 23225). Nach 60 min wurde die optische Dichte (OD) bei 550 nm gemessen.
Aktivität der alkalischen Phosphatase gemäß den Angaben des Herstellers Sigma:
100 μl Reaktionspuffer (Sigma 221) wurde zum Präparat gegeben. Eine Substratkapsel (Sigma 104-40) wurde in 10 ml redestilliertem H₂O gelöst. Anschließend wurden 100 μl mit einer Pipette zum Testgemisch gegeben. Die optische Dichte wurde nach Gelbfärbung bei 405 nm gemessen. Bei der Umsetzung wandelt die alkalische Phosphatase p-Nitrophenylphosphat in p-Nitrophenol um.
Die OD-Werte wurden durch Eichkurven in nmol oder μg umgewandelt. Die Bewertung erfolgte gemäß der nachstehenden Formel:
nmol PNP pro (gemessen) Minute pro mg (Zell)-Protein
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Sequenzliste

Claims

Hedgehog-Konjugat, enthaltend: (a) ein Polypeptid, das aus 10 bis 30 hydrophoben Aminosäuren oder aus Aminosäuren, die Transmembran-Helices bilden und positiv geladen sind, zusammengesetzt ist; oder (b) 1 bis 4 aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste mit einer Kettenlänge von 8 bis 24 C-Atomen und mit einer hydrophoben Wirkung; oder (c) eine hydrophobe Thioverbindung, wobei einer der Bestandteile (a) bis (c) kovalent an den N-Terminus einer 19 kD N-terminalen Domäne eines Hedgehog-Proteins gebunden ist.
Hedgehog-Konjugat nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid 2 bis 12 Lysinreste und/oder Argininreste enthält.
Hedgehog-Konjugate nach Anspruch 1, wobei es sich beim Kohlenwasserstoffrest um einen Fettsäure- oder Alkylalkoholrest handelt, der als ein Ester, Thioester, Säureamid oder Disulfid gebunden ist.
Hedgehog-Konjugat nach Anspruch 3, wobei es sich bei der Fettsäure um Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachidinsäure, Behensäure, Palmitolsäure, Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure oder Arachidonsäure handelt.
Hedgehog-Konjugat nach Anspruch 1, wobei es sich bei der hydrophoben Thioverbindung um Thiocholesterin handelt.
Verfahren zur Herstellung eines Hedgehog-Konjugats nach einem der Ansprüche 1, 3 oder 4, wobei der Kohlenwasserstoffrest kovalent an eine freie Hydroxyl-, Mercapto-, Carboxy- oder Aminogruppe des Hedgehog-Proteins gebunden ist.
Verfahren zur Herstellung eines Hedgehog-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 5 durch kovalentes Kuppeln eines Kohlenwasserstoffrestes oder einer hydrophoben Thioverbindung an ein Hedgehog-Protein, wobei das kovalente Kuppeln und das Isolieren in Gegenwart von Suramin, Heparin, anionischen Polysacchariden oder eines Detergens vorgenommen werden.
Verfahren zur Herstellung eines Hedgehog-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 5 durch kovalentes Kuppeln eines Fettsäurerestes oder einer hydrophoben Thioverbindung an ein Hedgehog-Protein, wobei Palmitoyl-CoA oder Palmitoylimidazolid als Fettsäure-Kupplungsmittel und Thiocholesterin oder Kohlenstoffketten mit einem Gehalt an einer Thiolgruppe als hydrophobe Thioverbindung verwendet werden.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Hedgehog-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 in einer pharmazeutisch wirksamen Menge sowie pharmazeutische Hilfssubstanzen, Detergentien, Stabilisatoren, Matrixmaterialien, Suramin, Heparin, anionische Polysaccharide und/oder Maskierungsmittel.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wobei ein Hedgehog-Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 5 als Hauptkomponente dieser Zusammensetzung verwendet wird.
19 kD N-terminale Domäne eines Hedgehog-Proteins, wobei die Thiolgruppe des N-terminalen Cysteins an eine Thiolschutzgruppe gekuppelt ist oder es sich beim Hedgehog-Protein um ein Homodimeres handelt, bei dem die N-terminalen Cysteine über eine Disulfidbrücke gebunden sind.
Verwendung eines Hedgehog-Proteins nach Anspruch 11 bei der Herstellung eines Hedgehog-Konjugats, das folgende Bestandteile enthält (a) ein Polypeptid, das aus 10 bis 30 hydrophoben Aminosäuren oder aus Aminosäuren, die Transmembran-Helices bilden und positiv geladen sind, zusammengesetzt ist; oder (b) 1 bis 4 aliphatische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste mit einer Kettenlänge von 8 bis 24 C-Atomen und mit einer hydrophoben Wirkung; oder (c) eine hydrophobe Thioverbindung, wobei einer der Bestandteile (a) bis (c) kovalent an den N-Terminus eines Hedgehog-Proteins gebunden ist.
Verfahren zur Herstellung eines Hedgehog-Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 5 durch kovalentes Kuppeln eines Kohlenwasserstoffrestes oder einer hydrophoben Thioverbindung an ein Hedgehog-Protein, wobei das kovalente Kuppeln oder das Isolieren in Gegenwart von Suramin, Heparin, anionischen Polysacchariden oder eines Detergens vorgenommen werden.
In vitro-Verwendung einer wirksamen Menge der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 9 zur Induktion oder Stimulation von Chondrozyten, Osteozyten, Muskel- oder Nervenzellen.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren verwendet wird.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die anderen Wachstumsfaktoren unter morphogenetischen Knochenproteinen, Parathyroidhormonen, insulinartigen Wachstumsfaktoren oder transformierenden Wachstumsfaktoren ausgewählt sind.