DE69920462T2

DE69920462T2 - Verwendung von antikörper gegen aminophospholipide zur krebsbehandlung

Info

Publication number: DE69920462T2
Application number: DE69920462T
Authority: DE
Inventors: E. Philip THORPE; Sophia Ran
Original assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; University of Texas at Austin
Priority date: 1998-07-13
Filing date: 1999-07-12
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2019-07-13
Also published as: WO2000002584A3; CY1116124T1; DE69920462D1; WO2000002584A2; US20140065148A1; JP2011037900A; IL140701A; NZ508950A; ES2533255T3; ES2233065T3; US20140322134A1; CA2333147A1; EP1096955B1; EP2311490A2; AU2004202605B2; IL140701A0; AU771224B2; JP2013177445A; EP1096955A2; EP2311490A3

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Bereich der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Bereiche der Blutgefäß- und Tumorbiologie. Genauer gesagt, verkörpert sie die überraschenden Befunde, daß Aminophospholipide, wie etwa Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin, spezifische und stabile Marker von Tumorblutgefäßen sind, und daß eine Verabreichung von anti-Aminophospholipid-Antikörpern alleine ausreichend ist, um eine Trombose und Tumorregression zu induzieren. Die Erfindung macht deshalb sichere und wirksame Verfahren und Zusammensetzung zum spezifischen Anzielen („Targeting") und zur Zerstörung von Tumorblutgefäßen und zur Behandlung solider Tumoren verfügbar. Die Verwendung unkonjugierter anti-Phosphatidylserin-Antikörper ist ein besonderer Vorteil, obwohl die Erfindung verschiedene wirksame Zusammensetzungen und Kombinationen davon verfügbar macht.
2. Beschreibung des Stands der Technik
Die Resistenz von Tumorzellen gegenüber chemotherapeutischen Wirkstoffen stellt ein bedeutendes Problem in der klinischen Onkologie dar. Tatsächlich ist dies einer der Hauptgründe, weshalb viele der am weitesten verbreiteten menschlichen Krebsarten einer wirksamen chemotherapeutischen Intervention trotz gewisser Fortschritte im Bereich der Chemotherapie noch immer widerstehen.
Ein bedeutendes Problem, dem man sich im Zusammenhang mit Therapieplänen zur Tumorbehandlung zuwenden muß, ist der Wunsch nach einem "vollständigen Abtöten" der Zellen. Dies bedeutet, daß die wirksameren Behandlungspläne einem vollständigen Abtöten sogenannter "klonogener" maligner Zellen, d.h. Zellen, welche die Fähigkeit besitzen, unkontrolliert zu wachsen, näherkommen und jede Tumormasse ersetzen, die durch die Therapie entfernt werden könnte. Aufgrund des Ziels, Behandlungen zu entwickeln, die sich einem vollständigen Abtöten der Zellen nähern, haben bestimmte Tumorarten auf eine Therapie besser angesprochen als andere. Beispielsweise sind die Weichteiltumoren, z.B. Lymphome, und Tumore des Bluts und der blutbildenen Organe, z.B. Leukämien, im allgemeinen besser auf eine chemotherapeutische Therapie ansprechbar gewesen, als dies solide Tumoren, wie etwa Karzinome.
Ein Grund für die Empfindlichkeit von Weichteiltumoren und Tumoren des Bluts bzw. blutbildenden Systems gegenüber einer Chemotherapie ist die bessere Zugänglichkeit von Lymphom- und Leukämiezellen für die chemotherapeutische Intervention. Einfach ausgedrückt, für die meisten chemotherapeutischen Wirkstoffe ist es ist sehr viel schwieriger, alle Zellen einer soliden Tumormasse zu erreichen, als dies bei den Weichteiltumoren und bei Tumoren des Bluts bzw. des blutbildenden Systems der Fall ist, und deshalb ist es sehr viel schwieriger, ein vollständiges Abtöten der Zellen zu erreichen. Ein Erhöhen der Dosis von chemotherapeutischen Wirkstoffen führt ganz häufig zu toxischen Nebenwirkungen, welche die Wirksamkeit von herkömmlichen anti-Tumor-Mitteln allgemein einschränken.
Eine andere Behandlungsstrategie ist die Verwendung eines "Immuntoxins", wobei ein anti-Tumorzell-Antikörper verwendet wird, um ein Toxin an die Tumorzellen abzugeben. Gemeinsam mit den oben beschriebenen chemotherapeutischen Ansätzen jedoch leidet die Immuntoxin-Therapie ebenfalls unter erheblichen Rückschlägen. Beispielsweise können Antigen-negative oder Antigen-defiziente Zellen überleben und den Tumor neu bevölkern oder zu weiteren Metastasen führen. Auch ist bei der Behandlung solider Tumoren die Tumormasse im allgemeinen für Moleküle mit der Größe von Antikörpern und Immuntoxinen nicht permeabel. Sowohl die Strecken der physikalischen Diffusion als auch der interstitielle Druck innerhalb des Tumors sind bedeutende Einschränkungen bei diesem Typ von Therapie.
Eine neuere Strategie ist gewesen, die Vaskulatur solider Tumoren anzuzielen. Dieses Anzielen oder „Targeting" der Blutgefäße der Tumoren anstatt auf die Tumorzellen selbst abzuzielen, hat insofern bestimmte Vorteile, als es wahrscheinlich nicht zur Entwicklung resistenter Tumorzellen führt und die Zielzellen leicht zugänglich sind. Darüber hinaus führt eine Zerstörung der Blutgefäße zu einer Amplifikation der anti-Tumor-Wirkung, da viele Tumorzellen in Bezug auf ihre Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen von einem einzigen Gefäß abhängen (Denekamp, 1990). Wirksame Strategien, welche die Vaskulatur anzielen, werden in den US-Patenten 5,855,866 und 5,965,132 beschrieben, die insbesondere die zielgerichtete Abgabe von anti-Zell-Mitteln und Toxinen die Tumorvaskulatur beschreiben.
Eine andere wirksame Variante des die Vaskulatur anzielenden Ansatzes ist, einen Gerinnungsfaktor auf die Tumorvaskulatur zu richten (Huang et al., 1997; US-Patente 5,877,289, 6,004,555 und 6,093,399). Die Verwendung von Antikörpern oder anderen Targetingmitteln zum Versorgen der Tumorvaskulatur mit Koagulanzien hat die weiteren VorteileAbgabe von Koagulanzien an die Tumorvaskulatur hat die weiteren Vorteile einer reduzierten Immunogenität und sogar eines geringeren Risikos für toxische Nebenwirkungen. Wie im US-Patent 5,877,289 offenbart, ist ein bevorzugter Gerinnungsfaktor zur Verwendung bei derartigen tumorspezifischen Thrombogenen oder "Koaguliganden" eine trunkierte Variante des menschlichen gerinnungsinduzierenden Proteins Gewebefaktor (tissue factor, TF). TF ist der Hauptauslöser der Blutgerinnung (Ruf et al., 1991; Edgington et al., 1991; Ruf and Edgington, 1994). Eine Behandlung von Tumor-tragenden Mäusen mit derartigen Koaguliganden führt bei vielen Tieren zu einer deutlichen Tumornekrose und sogar zu vollständiger Tumorregression (Huang et al., 1997; US-Patente 5,877,289, 6,004,555 und 6,093,399).
Fishman et al., Int. J. Onkol., Bd. 10, S. 901-904 (1997) betrifft das mögliche Anzielen von Krebszellen unter Verwendung von Antikörpern, die während einer Autoimmunerkrankung produziert werden.
Obwohl die spezifische Abgabe therapeutischer Mittel, wie etwa anti-Zell-Mittel, Toxine und Gerinnungsfaktoren, an Tumorgefäße einen erheblichen Fortschritt in bezug auf Therapiepläne zur Tumorbehandlung darstellt, gibt es noch Bedarf an zusätzlichen oder sogar alternativen Therapien, welche die Vaskulatur anzielen. Die Identifizierung zusätzlicher Ziele, um eine spezifische Zerstörung von Tumorgefäßen in vivo zu ermöglichen, wäre naturgemäß zum Erweitern der Anzahl von Optionen zum Anzielen von Vorteil. Insbesondere, da die früher beschriebenen Konstrukte und Koaguliganden, die auf die Vaskulatur abzielen, Zweikomponenten-Systeme sind, die sich des Zielmittels und des Effektorteils bedienen, würde die Entwicklung eines Einkomponenten-Mittels zur Zerstörung der Tumorvaskulatur einen bedeutenden Vorteil darstellen. Sollte sich die Herstellung dieser Art von Mittel als möglich herausstellen, würde dies wahrscheinlich auch die Weiterentwicklung einer anti-Gefäß-Therapie hin zur klinischen Anwendung beschleunigen, angesichts der Einfachheit des neuen therapeutischen Mittels.
Die vorliegende Erfindung wendet sich den Bedürfnissen im Stand der Technik zu, indem eine neue Verwendung eines anti-Aminophospholipid-Antikörpers oder eines Antigen bindenden Fragments davon zur spezifischen Tumorzerstörung verfügbar gemacht wird. Die Erfindung beruht teilweise auf dem Befund, daß Aminophospholipide, wie etwa Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin, zugängliche und stabil anzielbare Marker der Tumorvaskulatur sind. Spezieller verkörpert die Erfindung die überraschende Entdeckung, daß nackte Antikörper gegen Aminophospholipid Bestandteile in der Lage sind, eine Zerstörung von Tumorblutgefäßen und eine Tumornekrose in vivo spezifisch zu induzieren.
Unter einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Zusammensetzung verfügbar gemacht, die eine biologisch wirksame Menge an einem anti-Aminophospholipid-Antikörper oder einer Antigen-bindenden Region davon umfaßt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs, indem Endothelzellen der Tumorvaskulatur eines vaskularisierten Tumors abgetötet werden.
Ein zugrunde liegendes, überraschendes Merkmal der Erfindung ist, daß eine Translokation von Aminophospholipiden, wie etwa PS, auf die Oberfläche von Endothelzellen der Tumorvaskulatur, mindestens zu einem beträchtlichen Teil unabhängig von einer Zellschädigung und einer Apoptose oder anderen Zelltod-Mechanismen auftritt. Die PS-Oberflächenexpression in der Tumorumgebung ist deshalb keine Konsequenz von Zelltod und Zerstörung und löst diese auch nicht aus, sie tritt statt dessen auf morphologisch intakten Gefäßendothelzellen. Dies bedeutet, daß eine PS-Expression nicht transient auftritt, sondern statt dessen stabil genug ist, um ein Ziel für eine therapeutische Intervention verfügbar zu machen.
Bestimmte bevorzugte Aspekte der Erfindung wurden ausgehend von der Entdeckung, daß Antikörper gegen das Aminophospholipid Phosphatidylserin (PS), die spezifisch an die Vaskulatur solider Tumoren gelangen, und sogar noch überraschender eine Tumor zerstörende Wirkung in Abwesenheit einer Konjugation mit Effektormolekülen, wie etwa Toxinen oder Koagulanzien, zeigen, entwickelt worden. Einzelne therapeutische Bestandteile, die gegen Aminophospholipide gerichtet sind, stellen deshalb einen Durchbruch beim Anzielen von Vaskulatur dar und machen sichere und wirksame Verfahren zur Behandlung solider Tumoren verfügbar.
Die Verwendungen der Erfindung machen ein Abtöten oder ein spezifisches Abtöten von Endothelzellen der Tumorvaskulatur verfügbar und umfassen ein Verabreichen von mindestens einer Dosis einer biologisch wirksamen Menge von mindestens einer ersten pharmazeutischen Zusammensetzung, die einen nackten oder unkonjugierten Antikörper oder eine Antigenbindende Region davon umfaßt, der an mindestens ein erstes Aminophospholipid, daß auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen der Tumorvaskulatur exprimiert ist, umfaßt, an ein Tier oder einen Patienten mit einem vaskularisierten Tumor. Die „biologisch wirksame Menge" ist eine Menge des nackten oder unkonjugierten Antikörpers, die wirksam ist, um mindestens einen Teil, und vorzugsweise einem beträchtlichen Teil der Endothelzellen der Tumorvaskulatur im Gegensatz zu Endothelzellen in normalen Gefäßen nach Bindung an ein Aminophospholipid, das auf der luminalen Oberfläche der Endothelzellen der Tumorvaskulatur exprimiert ist, spezifisch abzutöten. Als solche ist sie eine „Endothelzellen abtötende Menge" oder eine „Endothelzellen der Tumorvaskulatur abtötende Menge" eines nackten oder unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörpers oder einer Antigen-bindenden Region davon.
Wie durchgängig in der ganzen Anmeldung verwendet, werden die Ausdrücke "ein" und "eine" in dem Sinne verwendet, daß sie "mindestens eine)", "mindestens ein erster/eine erste", "ein(e) oder mehrere" oder "eine Vielzahl" von Bestandteilen, auf die Bezug genommen wird, bedeuten, außer bei Beispielen, bei denen nachfolgend eine obere Grenze speziell angegeben wird. Deshalb bedeutet „ein anti-Aminophospholipid-Antikörper" „mindestens ein erster Anti-Aminophospholipid-Antikörper". Die funktionsfähigen Grenzen und Parameter von Kombinationen, ebenso wie die Mengen eines einzelnen Mittels werden Fachleuten angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt sein.
Die Ausdrücke "ein" und "eine" werden auch verwendet, um "mindestens eine)", "mindestens ein erster/eine erste", "ein(e) oder mehrere" oder "eine Vielzahl" von Schritten in den aufgeführten Verfahren zu bezeichnen, es sei denn, es wird speziell angegeben. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Verabreichungsschritte der Behandlungsverfahren. Folglich können nicht nur verschiedene Dosen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, sondern es kann eine unterschiedliche Anzahl von Dosen, z.B. Injektionen, bis zu und einschließlich multipler Injektionen, verwendet werden.
Ein "Aminophospholipid", wie der Begriff hier gebraucht wird, bedeutet ein Phospholipid, das in seiner Struktur mindestens eine erste primäre Aminogruppe beinhaltet. Vorzugsweise wird der Begriff "Aminophospholipid" verwendet, um ein Phospholipid, das eine primäre Aminogruppe enthält, zu bezeichnen, das natürlicherweise in Zellmembranen von Säugetieren auftritt. Allerdings ist dies keine Einschränkung der Bedeutung des Begriffs "Aminophospho lipid", da sich dieser Begriff auch auf nicht natürlicherweise vorkommende oder synthetische Aminophospholipide erstreckt, die nichtdestotrotz Verwendung in der Erfindung finden, z.B. als ein Immunogen bei der Herstellung von anti-Aminophospholipid-Antikörpern ("kreuzreaktive Antikörper"), die an Aminophospholipide von Säugetier-Plasmamembranen binden. Die Aminophospholipide im US-Patent 5,767,298 sind geeignete Beispiele.
Die prominenten Aminosphopholipide, die in biologischen Systemen von Säugetieren gefunden werden, sind das negativ-geladene Phosphatidylserin ("PS") und das neutrale oder zwitterionische Phophatidylethanolamin ("PE"), die deshalb von der vorliegenden Erfindung bevorzugte Aminophospholipide zum Anzielen sind. Allerdings ist die Erfindung keinesfalls auf Phosphatidylserine und Phosphatidylethanolamine als Ziele beschränkt, und jedes andere Aminophospholipid-Ziel kann eingesetzt werden (White et al., 1978), solange es auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen der Tumorvaskulatur exprimiert, zugänglich oder komplexiert ist.
Alle Bestandteile, die auf einem Aminophospholipid, auf Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin beruhen, sind als Ziele der Erfindung umfaßt, unabhängig vom Typ der beteiligten Fettsäureketten, einschließlich jener mit kurz-, mittel- oder langkettigen Fettsäuren und jenen mit gesättigten, ungesättigten und mehrfach ungesättigten Fettsäuren. Bevorzugte Zusammensetzungen zur Erzeugung von Antikörpern zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können Aminophospholipide mit Fettsäuren aus C18 sein, wobei C18:1 am stärksten bevorzugt ist (Levy et al., 1990). In dem Umfang, in dem sie auf Endothelzellen der Tumorvaskulatur zugänglich sind, können Aminophospholipid-Abbauprodukte mit nur einer Fettsäure (Lyso-Derivate) anstelle von zwei ebenfalls ein Ziel sein (Qamar et al., 1990).
Eine andere Gruppe potentieller Aminophospholipid-Ziele schließen beispielsweise Phosphatidal-Derivate (Plasmalogene), wie etwa Phosphatidalserin und Phosphatidalethanolamin ein (diese weisen eine Etherbindung auf, die zu einer Alkenylgruppe führt, anstelle einer Ester-Bindung, die zu einer Acyl-Gruppe führt). Tatsächlich schließen die Ziele zur therapeutischen Internvention durch die vorliegende Erfindung jedes Aminophospholipid ein, das vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder in sonstiger Weise komplexiert in einer anzielbaren Form auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen der Tumorvaskulatur ist. Lipide, die kein Glycerin enthalten, können ebenfalls geeignete Ziele bilden, wie etwa die auf Sphingosin und Derivaten beruhenden Sphingolipide.
Die biologische Grundlage, einen Bereich von Lipiden in die Gruppe von anzielbaren Bestandteilen einzuschließen, liegt teilweise in dem beobachteten biologischen Phänomen begründet, daß Lipide und Proteine sich in membranösen Umgebungen zusammentun, um einzigartige Lipid-Protein-Komplexe zu bilden. Derartige Lipid-Protein-Komplexe erstrecken sich auf antigene und immunogene Formen von Lipiden, wie etwa Phosphatidylserin und Phosphatidyethanolamin mit, z.B. Proteinen, wie etwa β₂-Glycoprotein I, Prothrombin, Kininogene und Präkallikrein.
Die Verfahren der Erfindung bringen auch den Blutfluß zum Stillstand oder bringen spezifisch den Blutfluß in der Tumorvaskulatur zum Stillstand. Dies wird erreicht durch Verabreichen von mindestens einer Dosis von mindestens einer ersten pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine gerinnungsinduzierende Menge oder eine gefäßverschließende Menge von mindestens einem ersten nackten oder unkonjugierten Antikörpers oder einer Antigenbindenden Region davon, der bzw. die an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, das auf die luminale Oberfläche von Tumorvaskulatur tranloziert ist, bindet, an ein Tier oder einen Patienten mit einem vaskularisierten Tumor.
Eine "gerinnungsinduzierende Menge" oder "gefäßverschließende Menge" ist eine Menge an dem nackten oder unkonjugierten Antikörper, die wirksam ist, um die Gerinnung in mindestens einem Teil und vorzugsweise einem erheblichen Teil von Blutgefäßen eines Tumorvaskulatur im Gegensatz zu normalen Blutgefäßen nach Bindung an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, das auf die luminale Oberfläche von Tumorblutgefäßen transloziert ist, spezifisch zu induzieren oder zu fördern und damit die Gefäße zu verschließen. Die "gefäßverschließende Menge" ist deshalb eine funktionell wirksame Menge, und sie ist keine physikalische Masse eines Antikörpers, die ausreicht, die Breite eines Gefäßes zu überspannen.
Verfahren zum Zerstören oder spezifischen Zerstören von Tumorvaskulatur werden offenbart, die ein Verabreichen von einer oder mehreren Dosen von mindestens einer ersten pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Tumor-zerstörende Menge an mindestens einem ersten nackten oder unkonjugierten Antikörper oder einer Antigen-bindenden Region davon umfas sen, der bzw. die an ein Aminophospholipid bindet, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, das auf der luminalen Oberfläche der Vaskulatur eines Tumors präsentiert wird, an ein Tier oder einen Patienten mit einem vaskularisierten Tumor. Die "Tumor-zerstörende Menge" ist eine Menge an dem nackten oder unkonjugierten Antikörpers, die wirksam ist, um mindestens einen Teil und vorzugsweise einen erheblichen Teil von Blutgefäßen eines Tumors im Gegensatz zu normalen Blutgefäßen nach Bindung an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, das auf der luminalen Oberfläche der vaskulären Endothelzellen der Blutgefäße eines Tumors präsentiert wird, spezifisch zu zerstören oder zu verschließen.
Es werden Verfahren zur Behandlung von Krebs und soliden Tumoren offenbart, die ein Verabreichen einer Tumornekrose-induzierende Menge oder von Mengen von mindestens einer ersten pharmazeutischen Zusammensetzung, die mindestens einen ersten nackten oder unkonjugierten Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, der/das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, das auf der luminalen Oberfläche von Blutgefäßen des vaskularisierten Tumors bindet, an ein Tier oder einen Patienten mit einem vaskularisierten Tumor umfaßt. Die "Tumornekrose-induzierende Menge" ist eine Menge an nackten dem oder unkonjugierten Antikörper, die wirksam ist, um spezifisch eine hämorrhagische Nekrose in mindestens einem Teil und vorzugsweise einem erheblichen Teil des Tumors nach Bindung an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, das auf der luminalen Oberfläche der vaskulären Endothelzellen der Blutgefäße eines Tumors komplexiert ist, spezifisch zu induzieren, während sie geringe nachteilige Nebenwirkungen auf normale, gesunde Gewebe ausübt.
Die hier offenbarten Verfahren können daher zusammengefaßt werden als Verfahren zum Behandeln eines Tieres oder Patienten mit einem vaskularisierten Tumor, die ein Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge von mindestens einer ersten Dosis einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die mindestens einen ersten nackten oder unkonjugierten Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon umfaßt, der an ein Aminophospholipid (vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin), das auf der luminalen Oberfläche von Blut transportierenden Gefäßen des vaskularisierten Tumors vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert ist, bindet, an das Tier oder den Patienten umfassen.
Das Wesentliche der Erfindung kann auch definiert werden als eine Zusammensetzung, die mindestens einen ersten nackten oder unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörper, vorzugsweise einen anti-Phosphatidylserin- oder anti-Phosphatidylethanolamin-Antikörper, oder ein Antigen-bindendes Fragment davon umfaßt zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zur Zerstörung von Tumorvaskulatur und zur Behandlung menschlicher Tumoren. Diese kann auch definiert sein als eine Zusammensetzung, die mindestens einen ersten nackten oder unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörper, vorzugsweise einen anti-PS- oder anti-PE-Antikörper, oder ein Antigen-bindendes Fragment davon umfaßt zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zu Verwendung bei der Bindung an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, das auf der luminalen Oberfläche von Blut transportierenden Gefäßen eines vaskularisierten Tumors vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert ist, und zur Verwendung beim Induzieren einer Zerstörung von Tumorvaskulatur und zur Behandlung menschlicher Tumoren.
Was die Medikamente und Verwendungen der vorliegenden Erfindung betrifft, beruht einer der Vorteile auf der Tatsache, daß die Bereitstellung einer einfachen Zusammensetzung aus nackten oder unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörpern, vorzugsweise anti-Phosphatidylserin oder anti-Phosphatidylethanolamin, in die systemische Zirkulation eines Tieres oder Patienten zu der bevorzugten oder spezifischen Zerstörung der Tumorvaskulatur und der Induktion einer Tumornekrose führt. Die Erfindung löst deshalb das Problem der komplexen Herstellungsverfahren der Multikomponenten-anti-Gefäß-Mittel im Stand der Technik.
Die Begriffe „nackter" und „unkonjugierter" Antikörper wie hier verwendet, soll einen Antikörper bezeichnen, der nicht-konjugiert, funktionsfähig verbunden oder auf andere Weise physikalisch oder funktionell mit einer Effektorgruppe, wie etwa einem zytotoxischen oder gerinnungsfördernden Mittel, assoziiert ist. Es wird verstanden werden, daß die Begriffe „nackter" und „unkonjugierter" Antikörper Antikörper-Konstrukte, die stabilisiert, multimerisiert, humanisiert oder auf jede andere Weise als durch das Anfügen einer Effektorgruppe manipuliert worden sind, nicht ausschließen.
Dementsprechend sind alle post-translational-modifizierten nackten oder unkonjugierten Antikörper hiermit eingeschlossen, einschließlich der, bei denen die Modifikationen in der natürlichen Umgebung einer Antikörper-produzierenden Zelle, durch eine rekombinante Antikörperproduzierenden Zelle hergestellt worden sind und per Hand nach anfänglicher Antikörper-Herstellung eingeführt worden sind. Selbstverständlich schließt der Ausdruck „nackter" Antikörper die Fähigkeit des Antikörpers, funktionelle Assoziationen mit Effektorzellen und/oder Molekülen nach Verabreichung an den Körper einzugehen nicht aus, da einige derartiger Interaktionen notwendig sind, um eine biologische Wirkung auszuüben. Das Fehlen einer assoziierten Effektorgruppe wird deshalb auf die Definition des nackten Antikörpers, in vitro nicht in vivo, angewendet.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff "ein vaskularisierter Tumor" besonders bevorzugt einen vaskularisierten, malignen Tumor, einen soliden Tumor oder "Krebs". Die Erfindung ist besonders vorteilhaft beim Behandeln vaskularisierter Tumoren von mindestens ungefähr mittlerer Größe und beim Behandeln großer vaskularisierter Tumoren, obwohl dies in keiner Weise eine Einschränkung der Erfindung bedeutet. Die Erfindung kann deshalb bei der Behandlung jedes Tumors, der Aminophospholipid-positive Blutgefäße, vorzugsweise Phosphatidylserin- und/oder Phosphatidylethanolamin-positive Blutgefäße, aufweist, verwendet werden.
In bevorzugten Ausführungen werden die Tumoren, die durch die vorliegende Erfindung behandelt werden sollen, eine wirksame Anzahl wirksam abgetöteter Aminophospholipid-positiver Blutgefäße aufweisen. "Eine Anzahl wirksam abgetöteter Aminophospholipid-positiver Blutgefäßen", wie die Bezeichnung hier verwendet wird, bedeutet, daß mindestens ungefähr 3% der Gesamtanzahl von Blutgefäßen in dem Tumor positiv sind hinsichtlich einer Aminophospholipid-Expression, vorzugsweise einer Phosphatidylserin- und/oder Phosphatidylethanolamin-Expression. Vorzugsweise sollen mindestens ungefähr 5%, mindestens ungefähr 8% oder mindestens ungefähr 10%, oder in diesem Bereich, der Gesamtanzahl von Blutgefäßen innerhalb des Tumors positiv hinsichtlich einer Aminophospholipid-Expression sein. In Anbetracht der Aminophospholipid-negativen, insbesondere PS-negativen, Beschaffenheit der Blutgefäße innerhalb von normalen Geweben, werden die Tumorgefäße als Sammelbecken für die verabreichten Antikörper fungieren. Da weiterhin eine Zerstörung von nur einer minimalen Anzahl von Tumorgefäßen eine großflächige Thrombose, Nekrose und eine Lawine von Tumorzelltoden auslösen kann, ist eine Antikörper-Lokalisierung an allen oder selbst einer überwiegenden Mehrheit von Tumorgefäßen für eine wirksame therapeutische Intervention nicht erforderlich.
Nichtsdestotrotz werden in stärker bevorzugten Ausführungen Tumoren, die durch diese Erfindung behandelt werden sollen, eine erhebliche Anzahl an Aminophosphorlipid-positiven Blutgefäßen aufweisen. "Eine signifikante Anzahl an Aminophospholipid-positiven Blutgefäßen", wie der Begriff hier verwendet wird, bedeutet, daß mindestens ungefähr 10% bis 12% der Gesamtanzahl an Blutgefäßen innerhalb des Tumors positiv hinsichtlich einer Aminophospholipid-Expression, vorzugsweise einer Phosphatidylserin- und/oder Phosphatidylethanolamin-Expression, sein werden. Noch stärker bevorzugt ist, daß der Prozentsatz an Aminophospholipid-exprimierenden Tumorgefäßen mindestens ungefähr 15%, mindestens ungefähr 20%, mindestens ungefähr 30%, mindestens ungefähr 40%, mindestens ungefähr 50%, mindestens ungefähr 60%, mindestens ungefähr 70% oder mindestens ungefähr 80%, oder in diesem Bereich, der Gesamtanzahl an Blutgefäßen innerhalb des Tumors sein wird, bis zu und einschließlich sogar mindestens ungefähr 90% oder 95% der Gefäße.
Die "therapeutisch wirksamen Mengen" zur Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung sind Mengen an nackten oder unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörpern, vorzugsweise anti-PS- oder anti-PE-Antikörpern, die wirksam sind, um mindestens einen Teil der Endothelzellen der Tumorvaskulatur spezifisch abzutöten, um die Gerinnung in mindestens einem Teil der Blutgefäße eines Tumors spezifisch zu fördern, um mindestens einen Teil der Blut transportierenden Gefäße des Tumors spezifisch zu verschließen oder zu zerstören, um in mindestens einem Teil eines Tumors eine Nekrose spezifisch zu induzieren und/oder um nach Verabreichung an ausgewählte Tiere oder Patienten eine Tumorregression oder Tumorremission zu induzieren. Derartige Effekte werden erreicht, während eine geringe oder keine Bindung an vaskuläre Endothelzellen in normalen, gesunden Geweben auftritt, oder ein geringes oder kein Abtöten von vaskulären Endothelzellen in normalen, gesunden Geweben auftritt, geringe oder keine Gerinnung in, Okklusion oder Zerstörung von Blutgefäßen in gesunden, normalen Geweben auftritt und während vernachlässigbare oder kontrollierbare nachteilige Nebenwirkungen auf normale, gesunde Gewebe des Tieres oder Patienten ausgeübt werden.
Die Begriffe "vorzugsweise" und "spezifisch", wie sie hier im Zusammenhang mit einem Fördern der Gerinnung in oder einem Zerstören von Tumorvaskulatur und/oder im Zusam menhang mit einem Verursachen einer Tumornekrose verwendet werden, bedeuten also, daß die anti-Aminophospholipid-Antikörper wirken, um eine Gerinnung, Zerstörung und/oder Tumornekrose erreichen, die im wesentlichen auf die Tumorvaskulatur und auf die Stelle des Tumors begrenzt ist und die sich im wesentlichen nicht auf das Verursachen einer Gerinnung, Zerstörung und/oder Gewebenekrose in normalen, gesunden Geweben des Tieres oder Patienten ausdehnt. Die Struktur und Funktion von gesunden Zellen und Geweben wird deshalb durch die Anwendung der Erfindung im wesentlichen unbeeinträchtigt bleiben.
Therapeutische Nutzen können verwirklicht werden, indem mindestens zwei, drei oder mehrere nackte oder unkonjugierte anti-Aminophospholipid-Antikörper, bispezifische Antikörper, chimere Antikörper und/oder dimere, trimere oder multimere Antikörper verabreicht werden. Die anti-Aminophospholipid-Antikörper können auch mit anderen Therapien kombiniert werden, um kombinierte therapeutische wirksame Mengen verfügbar zu machen, wie hier offenbart.
Obwohl ein Verständnis des Wirkungsmechanismus nicht notwendig ist, um die vorliegende Erfindung einer anti-Aminophospholipid-Antikörper-Behandlung auszuführen, können die Verfahren wirken, um eine zellvermittelte Zytotoxizität, eine Komplement-vermittelte Lyse und/oder Apoptose zu induzieren. Die zytotoxischen Verfahren können auch auf einer Antikörper-induzierten Zell-Signalübertragung (direkte Signalübertragung) oder einem Nachahmen oder Ändern von Signaltranstruktionspfaden (indirekte Signalübertragung) beruhen. Die Fähigkeit der anti-Aminophospholipid-Antikörper, an einen Bestandteil der Membran zu gelangen und daran zu binden, kann auch selbst von Bedeutung sein, im Gegensatz zu früheren Therapien, die im allgemeinen auf eine Bindung an einen Proteinbestandteil oder -komplex, der sterisch unterschiedlich oder entfernt von der Membranoberfläche selbst ist, gerichtet sind.
Die hier offenbarten Behandlungsverfahren schließen also ein Verabreichen von mindestens einer ersten pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Menge von mindestens einem ersten Antikörper-Konstrukt, daß wirksam ist, um eine zellvermittelte Toxizität von mindestens einem Teil der Entothelzellen der Tumorvaskulatur zu induzieren oder spezifisch zu induzieren an ein Tier oder einen Patienten mit einem vaskularisierten Tumor ein. Wie hier verwendet, ist das erste Antikörper-Konstrukt ein nackter oder unkonjugierter Antikörper oder ein wirksames Fragment davon, der/das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen der Tumorvaskulatur, bindet, und der/das eine zellvermittelte Zytotoxizität von mindestens einem Teil der Endothelzellen der Tumorvaskulatur im Gegensatz zu Endothelzellen in normalen Gefäßen induziert. Wie hier verwendet, schließt "zellvermittelte Zytotoxizität oder Zerstörung" ein Abtöten von Zellen mittels ADCC (antibody-dependent, cell-mediated cytotoxicity, Antikörper-abhängige, zellvermittelte Zytotoxizität) und NK-(natural killer)-Zellen ein.
Die offenbarten Verfahren beinhalten weiterhin ein Verabreichen von mindestens einer ersten pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Menge an mindestens einem ersten Antikörper-Konstrukt umfaßt, die wirksam ist, eine Komplement-vermittelte Lyse von mindestens einem Teil der Endothelzellen der Tumorvaskulatur zu induzieren oder spezifisch zu induzieren, an ein Tier oder einen Patienten mit einem vaskularisierten Tumor. Wie hier verwendet, ist das erste Antikörper-Konstrukt ein nackter oder unkonjugierter Antikörper oder ein wirksames Fragment davon, das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidyserin und Phosphatidylethanolamin, vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen der Tumorvaskulatur, und induziert eine Komplement-vermittelte Lyse von mindestens einem Teil der Endothelzellen von Tumorvaskulatur im Gegensatz zu Endothelzellen in normalen Gefäßen. Wie hier verwendet, bezeichnet "Komplement-vermittelte oder Komplement-abhängige Lyse oder Zytotoxizität" den Prozeß, durch den die Komplement-abhängige Gerinnungskaskade aktiviert wird, Multikomponenten-Komplexe zusammengesetzt werden, wodurch schließlich ein lytischer Komplex erzeugt wird, der eine direkte lytische Wirkung entfaltet, wodurch eine Zellpermeabilisierung verursacht wird. Anti-Aminophospholipid-Antikörper zur Verwendung beim Induzieren von Komplement-vermittelter Lyse werden im allgemeinen einen Antikörper-Fc-Teil einschließen.
Die auf Komplement beruhenden Mechanismen, durch welche die vorliegende Erfindung funktionieren kann, schließen weiterhin "Komplement-aktivierte ADCC" ein. Unter derartigen Aspekten binden die verabreichten nackten oder unkonjugierten Antikörper oder Fragmente davon an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen von Tumorvaskulatur, und induzieren eine Komplement-aktivierte ADCC bei mindestens einem Teil der Endothelzellen der Tumorvaskulatur im Gegensatz zu Endothelzellen in normalen Gefäßen. "Komplement-aktivierte ADCC" wird verwendet, um den Prozeß zu bezeichnen, durch den Komplement, nicht ein Antikörper-Fc-Teil per se, einen Multikomponenten-Komplex zusammenhält und in welchem Zellen, wie etwa Neutrophile, die Zielzelle lysieren.
Bei anderen Ausführungen schließen die offenbarten Verfahren ein Verabreichen von mindestens einer ersten pharmazeutischen Zusammensetzung, die eine Menge an mindestens einem ersten Antikörper-Konstrukt umfaßt, die wirksam ist, um in mindestens einem Teil der Endothelzellen der Tumorvaskulatur eine Apoptose zu induzieren oder spezifisch zu induzieren, an ein Tier oder einen Patienten mit einem vaskularisierten Tumorein. Wie hier verwendet, ist das erste Antikörper-Konstrukt ein nackter oder unkonjugierter Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, der/das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen von Tumorvaskulatur, und der/das in mindestens einem Teil der Endothelzellen von Tumorvaskulatur im Gegensatz zu Endothelzellen in normalen Gefäßen eine Apoptose induziert. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck "induziert Apoptose" den Prozeß des programmierten Zelltods, der in den Anfangsphasen die Integrität der Zellmembran aufrecht erhält, die Zelltod-induzierenden Signale jedoch in die Zelle überträgt. Dies steht im Gegensatz zu den Mechanismen einer Zellnekrose, in deren Verlauf die Zellmembran ihre Integrität verliert und zu Beginn des Prozesses durchlässig wird.
Die Verfahren der anti-Aminophospholipid-Antikörper-Behandlung werden im allgemeinen die Verabreichung von mindestens einer Dosis der pharmazeutisch wirksamen Zusammensetzung an das Tier systemisch, wie etwa durch intravenöse Injektion, einschließen. Allerdings wird jeder Weg einer Verabreichung, der es dem Antikörper ermöglicht, zu den Entothelzellen der Tumorvaskulatur zu gelangen und eine zellvermittelte Zytotoxizität, Komplement-vermittelte Lyse und/oder Apoptose der Zellen zu induzieren, annehmbar sein.
"Verabreichung", wie der Begriff hier verwendet wird, bedeutet deshalb die Bereitstellung oder Abgabe von anti-Aminophospholipid-Antikörpern in einer Menge/in Mengen und für einen Zeitraum/für Zeiträume, die/der wirksam sind, eine Bindung an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert auf der luminalen Oberfläche von Blut transportierenden Gefäßen des vaskularisierten Tumors, zu erlauben, und eine zerstörende Wirkung auf die Tumorvaskulatur und eine tumorregressive Wirkung auszuüben. Die passive Verabreichung von proteinösen Antikörpern wird im allgemeinen bevorzugt, teilweise aufgrund ihrer Einfachheit und Reproduzierbarkeit.
Die Bezeichnung "Verabreichung" wird hier allerdings verwendet, um jedes und alle Mittel zu bezeichnen, durch die anti-Aminophospholipid-Antikörper abgegeben oder der Tumorvaskulatur auf andere Weise zur Verfügung gestellt werden. "Verabreichung" schließt deshalb die Versorgung von Zellen, wie etwa Hybridome, welche die anti-Aminophospholipid-Antikörper auf eine Weise produzieren, die wirksam ist, um zu der Abgabe der anti-Aminophospholipid-Antikörper an die Tumorvaskulatur zu führen und/oder dazu, daß diese an derartige Vaskulatur zu gelangen, ein. Bei solchen Ausführungen kann es wünschenswert sein, die Antikörper-produzierenden Zellen in einer selektiv permeablen Membran, Struktur oder einer implantierbaren Vorrichtung, im allgemeinen eine, die entfernt werden kann, um die Therapie zu beenden, zu formulieren oder zu verpacken.
Der Begriff „Antikörper-Verabreichung", wie hier verwendet, erstreckt sich auch auf alle Verfahren, durch die anti-Aminophospholipid-Antikörper in einem Patienten erzeugt werden („endogene Antikörper"), die es ihnen ermöglichen, in der Zirkulation aufzutreten und zur Tumorvaskulatur zu gelangen. Deshalb schließt „Verabreichung" die aktive Immunisierung eines Patienten mit einer immunogen wirksamen Menge an einer Aminophospholipid-Probe, einem Antigen oder Immunogen ein. Alle Verfahren zur Immunisierung eines Menschen sind geeignet zur Verwendung in derartigen Ausführungen, wie veranschaulicht durch jene, die unten im Zusammenhang mit der Erzeugung einer anti-Aminophospholipid-Antikörper-Antwort in einem Tier beschrieben werden, um den Antikörper davon zu erhalten. Eine exogene Antikörper-Verabreichung wird im allgemeinen gegenüber einer Abgabe auf der Grundlage von Zellen oder einer Immunisierung noch bevorzugt werden, da diese ein weniger invasives Verfahren darstellt, das ermöglicht, die Dosis genau zu überwachen und zu steuern.
Die "Verfahren zur Verabreichung von Antikörpern" dieser Erfindung erstrecken sich auch auf die Bereitstellung von Nukleinsäuren, welche die anti-Aminophospholipid-Antikörper auf eine Weise kodieren, die wirksam ist, um zur Expression der anti-Aminophospholipid-Antikörper in der Umgebung der Tumorvaskulatur und/oder zur Expression von anti-Aminophospholipid-Antikörpern, die zu der Tumorvaskulatur gelangen können, zu führen. Jede Gentherapie-Technik kann eingesetzt werden, wie etwa die Abgabe von nackter DNA, rekombinanten Genen und Vektoren, eine auf Zellen beruhende Abgabe, einschließlich einer Manipulation von Zellen eines Patienten ex vivo und derartigem.
Einer der Nutzen der vorliegenden Erfindung ist, daß Aminophospholipide, insbesondere Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin, im allgemeinen in den gesamten Tumorgefäßen exprimiert oder verfügbar sind. Eine Aminophospholipid-Expression bei bestehenden Blutgefäßen des Tumorinneren ist vorteilhaft, da ein Anzielen auf und ein Zerstören solcher Gefäße rasch zu anti-Tumor-Wirkungen führen wird. Solange jedoch die verabreichten anti-Aminophospholipid-Antikörper an mindestens einen Teil der Blut transportierenden Gefäße binden, werden signifikante anti-Tumor-Wirkungen die Folge sein. Dies wird nicht problematisch sein, da Aminophospholipide, wie etwa Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin, auf großen, zentralen Gefäßen, und auch auf Venen, Venolen, Arterien, Arteriolen und Blut transportierenden Kapillaren in allen Bereichen des Tumors exprimiert werden.
Auf alle Fälle bedeutet die Fähigkeit der anti-Aminophospholipid-Antikörper, die Tumorvaskulatur zu zerstören, daß eine Tumorregression und nicht nur ein Tumorstillstand erreicht werden kann. Ein Tumorstillstand ist häufig das Ergebnis antiangiogener Therapien, die lediglich die einsprossenden Gefäße in der Peripherie eines soliden Tumors erreichen und die Gefäßproliferation stoppen. Selbst wenn die vorliegende Erfindung bei bestimmten Tumorarten eher die peripheren Bereiche des Tumors erreicht, wovon gegenwärtig nicht ausgegangen wird, würde die Zerstörung der Blut transportierenden Gefäße in solchen Bereichen noch immer zu großflächiger Thrombose und Tumornekrose führen.
Bei jedem der zuvor genannten Verfahren bezeichnen die Begriffe „anti-Aminophospholipid-Antikörper, nackter Antikörper und unkonjugierter Antikörper", wie hier verwendet, allgemein jedes immunologische Bindungsmittel, wie etwa polyklonale und monoklonale IgG-, IgM-, IgA-, IgD- und IgE-Antikörper. Im allgemeinen sind IgG und/oder IgM bevorzugt, da sie die unter physiologischen Bedingungen am häufigsten vorkommenden Antikörper darstellen und da sie unter Laborbedingungen am einfachsten herzustellen sind.
Polyklonale anti-Aminophospholipid-Antikörper, gewonnen aus Antiseren, können im Zusammenhang mit der Erfindung eingesetzt werden. Die Verwendung von monoklonalen anti-Aminophospholipid-Antikörpern (Mabs) wird jedoch im allgemeinen bevorzugt werden. Es ist anerkannt, daß MAbs bestimmte Vorteile aufweisen, z.B. Reproduzierbarkeit und Her stellbarkeit im Großmaßstab, das sie für die klinische Behandlung geeignet machen. Die Erfindung macht daher monoklonale Antikörper aus der Maus, dem Menschen, dem Affen, der Ratte, dem Hamster, dem Kaninchen und sogar dem Frosch oder Huhn verfügbar. Aufgrund der Einfachheit der Herstellung und der leichten Verfügbarkeit von ReMittel, werden monoklonale Antikörper der Maus bei bestimmten Ausführungen verwendet werden.
Diejenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, werden verstehen, daß sich die immunologischen BindungsreMittel, die von dem Begriff "anti-Aminophospholipid-Antikörper" umfaßt sind, auf alle nackten und unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörper aus allen Spezies und auf Antigen-bindende Fragmente davon, einschließlich dimeren, trimeren und multimeren Antikörpern, bispezifischen Antikörpern, chimären Antikörpern, menschlichen und humanisierten Antikörpern, rekombinanten und konstruierten Antikörpern und Fragmenten davon, erstrecken.
Der Begriff "anti-Aminophospholipid-Antikörper" wird folglich verwendet, um jedes anti-Aminophospholipid-Antikörper-ähnliche Molekül zu bezeichnen, das eine Antigen-bindende Region aufweist und Antikörperfragmente, wie etwa Fab', Fab, F(ab)'₂, Antikörper mit einer einzelnen Domäne (single domain antibodies, DABs), Fv, scFv (single chain Fv, Fv aus einer Einzelkette) und derartiges, einschließt. Die Techniken zum Herstellen und Verwenden verschiedener, auf Antikörpern beruhender Konstrukte und Fragmente sind im Stand der Technik bestens bekannt.
Bei bestimmten Ausführungen sollen die eingesetzten Antikörper "humanisierte" oder menschliche Antikörper sein. "Humanisierte" Antikörper sind im allgemeinen chimäre monoklonale Antikörper aus der Maus, Ratte oder anderen nicht-menschlichen Spezies, die Domänen einer menschlichen konstanten und/oder variablen Region tragen ("teilmenschliche chimäre Antikörper"). Zumeist werden humanisierte monoklonale Antikörper zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung chimäre Antikörper sein, wobei mindestens eine erste Antigen-bindende Region oder komplementäre Determinierungssregion (complementary determining region, CDR) einer Maus, einer Ratte oder ein anderer nicht-menschlicher monoklonaler anti-Aminophospholipid-Antikörper funktionsfähig angehängt an oder "aufgepfropft" auf eine menschliche konstante Region eines Antikörpers oder ein "Gerüst" ("framework") ist.
"Humanisierte" monoklonale Antikörper zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können auch monoklonale anti-Aminophospholipid-Antikörper aus nicht-menschlichen Spezies sein, wobei eine oder mehrere ausgewählte Aminosäuren gegen Aminosäuren ausgetauscht worden sind, die in menschlichen Antikörpern häufiger beobachtet werden. Dies kann leicht durch die Anwendung routinemäßiger rekombinanter Technologie, insbesondere der ortspezifischen Mutagenese (site-specific mutagenesis), erreicht werden.
Vollständig menschliche, anstelle von "humanisierten" anti-Aminophospholipid-Antikörpern können ebenfalls hergestellt und im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Derartige menschliche Antikörper können polyklonale Antikörper sein, wie sie von menschlichen Patienten, die eine oder mehrere einer Vielfalt von Erkrankungen, Störungen oder klinischen Beschwerden, die mit der Produktion von anti-Aminophospholipid-Antikörpern zusammenhängen, aufweisen, erhalten werden. Derartige Antikörper können zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung konzentriert, teilweise gereinigt oder beträchtlich gereinigt werden.
Eine Auswahl von Techniken zum Herstellen menschlicher monoklonaler Antikörper ist ebenfalls verfügbar. Da es menschliche Patienten mit anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Erkrankungen gibt, können die anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Zellen von solchen Patienten gewonnen und in vitro manipuliert werden, um einen menschlichen monoklonalen Antikörper verfügbar zu machen. Die Manipulationen oder Techniken in vitro schließen ein Fusionieren ein, um ein monoklonale Antikörper-produzierendes Hybridom herzustellen, und/oder ein Klonieren des Gens/der Gene, welches) den anti-Aminophospholipid-Antikörper kodiert/kodieren, aus den Zellen ("rekombinante menschliche Antikörper").
Menschliche anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierende Zellen können auch von menschlichen Individuen ohne eine Erkrankung, die mit anti-Aminophospholipid-Antikörpern einhergeht, d.h. "gesunde Versuchsperson", im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, erhalten werden. Um dies zu erreichen, würde man einfach eine Population gemischter Lymphozyten aus dem peripheren Blut eines menschlichen Individuums, einschließlich Antigen-präsentierende und Antikörper-produzierende Zellen, gewinnen, und die Zellpopulation in vitro durch Vermischen mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipid-Probe stimulieren. Auch in diesem Fall könnten die menschlichen anti- Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Zellen, nachdem sie erhalten wurden, zur Produktion von Hybridomen und/oder rekombinanten Antikörpern verwendet werden.
Weitere Techniken zur Produktion menschlicher monoklonaler Antikörper schließen ein Immunisieren eines transgenen Tieres, vorzugsweise einer transgenen Maus, ein, die eine menschliche Antikörper-Bibliothek mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipid-Probe umfaßt. Dies erzeugt auch menschliche anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierende Zellen zur weiteren Manipulation bei der Produktion von Hybridomen und/oder rekombinanten Antikörpern mit dem Vorteil, daß Milzzellen anstelle peripherer Blutzellen leicht aus dem transgenen Tier oder der transgenen Maus gewonnen werden können.
Wie hier verwendet, wird der Begriff „anti-Aminophospholipid-Antikörper" ebenso wie „nackte und unkonjugierte" umfangreich benutzt, um anti-Aminophospholipid-Antikörper und Antigen-bindende Fragmente davon, die nicht konjugiert oder funktionell assoziiert sind mit einem Effektormolekül, wie etwa einem zytotoxischen Mittel oder Koagulanz, zu bezeichnen. Zusätzlich zu nicht-Effektor-Modifikationen des Antikörpers und Interaktionen in vivo-Aktionen schließt der Begriff „nackt" keinesfalls Kombinationen aus dem Antikörper mit anderen therapeutischen Mitteln, wie hier genauer offenbart, aus.
Im Gegensatz dazu werden anti-Aminophospholipid-Antikörper, bispezifische Antikörper und Antigen-bindende Fragmente davon, die konjugiert oder funktionell assoziiert sind mit zytotoxischen oder anti-Zell-Mitteln, hier als „anti-Aminophospholipid-Immuntoxine" bezeichnet. Ähnlich werden anti-Aminophospholipid-Antikörper, bispezifische Antikörper und Antigenbindende Fragmente davon, die konjugiert oder funktionell assoziiert sind mit Gerinnungsfaktoren hier als „anti-Aminophospholipid-Koaguliganden" bezeichnet. Die Verwendung von anti-Aminophospholipid-Immuntoxinen und anti-Aminophospholipid-Koaguliganden bei der Tumorbehandlung wird auch durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen und wird offenbart und beansprucht in der PCT-Offenlegungsschrift WO-A-00/02587.
Bevorzugte anti-Aminophospholipid-Antikörper zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung sind anti-Phosphatidylserin (anti-PS) und anti-Phosphatidylethanolamin (anti-PE)-Antikörper. Anti-PS-Antikörper werden im allgemeinen PS-Moleküle, die auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen der Tumorvaskulatur vor handen, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert sind, erkennen, daran binden oder Immunspezifität dagegen aufweisen. Geeignete Antikörper werden folglich an Phosphatidyl-L-Serin binden (Umeda et al., 1989). Anti-PE-Antikörper werden im allgemeinen das PE-Molekül, das auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen der Tumorvaskulatur vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert ist, erkennen, daran binden oder Immunspezifität dagegen aufweisen.
Ein Verabreichen von anti-Aminophospholipid-Antikörpern an ein Tier mit einem Tumor wird zur spezifischen Bindung des Antikörpers an die Aminophospholipid-Moleküle, vorhanden, exprimiert oder transloziert auf der luminalen Oberfläche der Tumorblutgefäße, führen, d.h. die Antikörper werden an die Aminophospholipid-Moleküle in einer natürlichen, biologischen Umgebung binden. Deshalb wird keine besondere Manipulation notwendig sein, um eine Antikörper-Bindung sicherzustellen.
Allerdings ist es von wissenschaftlicher Bedeutung, zur Kenntnis zu nehmen, daß Aminophospholipide am häufigsten durch anti-Aminophospholipid-Antikörper erkannt oder gebunden werden, wenn die Aminophospholipid-Moleküle mit einem oder mehreren Proteinen oder anderen biologischen Nicht-Lipid-Bausteinen assoziiert sind. Beispielsweise wird von anti-PS-Antikörpern, die als eine Untergruppe von anti-Phospholipid (anti-PL)-Antikörpern bei Patienten mit bestimmten Erkrankungen und Störungen auftreten, jetzt angenommen, daß sie an PS in Kombination mit Proteinen, wie etwa β₂-Glycoprotein I (β₂-GPI oder Apolipoprotein H, apoH) und Prothrombin binden (US-Patent 5,344,758; Rote, 1996) binden. Ähnlich wird von anti-PE-Antikörpern, die bei Erkrankungszuständen auftreten, jetzt angenommen, daß sie an PE in Kombination mit Proteinen, wie etwa niedrig- und hochmolekularem Kininogen (HK), Präkallikrein und sogar Faktor XI binden (Sugi and McIntyre, 1995; 1996a; 1996b).
Dies ist die Bedeutung der Begriffe "präsentiert" und "komplexiert" auf der luminalen Oberfläche von Tumorblutgefäßen, wie sie hier verwendet werden, welche bedeuten, daß die Aminophospholipid-Moleküle auf der Oberfläche von Tumorblutgefäßen in einem zur Bindung von Antikörpern kompetenten Zustand vorhanden sind, unabhängig von der molekularen Definition dieses speziellen Zustands. PS kann sogar als Komplex mit Faktor II/IIa, VII/VIIa, IX/IXa und X/Xa angezielt werden. Darüber hinaus kann sich die An des Aminophospholipid-Ziels verändern, während die Erfindung ausgeführt wird, da die anfängliche Ami nophospholipid-Antikörper-Bindung, anti-Endothelzell- und anti-Tumor-Wirkungen zu biologischen Änderungen führen können, welche die Anzahl, Konformation und/oder den Typ des Aminophospholipid-Zielepitops/der Zielepitope verändern.
Der Begriff "anti-Aminophospholipid-Antikörper", wie er im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet wird, bezeichnet deshalb jeden nackten oder unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörper, ein immunologisches Bindungsmittel oder Antiseren, einen monoklonalen, menschlichen, humanisierten, dimeren, trimeren, multimeren, chimären, bispezifischen, rekombinanten oder konstruierten Antikörper oder ein Fab', Fab, F(ab')₂, DABs, Fv oder scFv-Antigen bindendes Fragment davon, der/das mindestens an einen, ein Lipid und eine Aminogruppe enthaltenden Komplex oder an ein Aminophospholipid-Ziel bindet, vorzugsweise ein Ziel auf der Grundlage von Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin.
Die Anforderung, daß der Antikörper "mindestens an ein Aminophospholipid-Ziel bindet", wird durch den Antikörper, der an jede und/oder alle physiologisch relevanten Formen von Aminophospholipiden, einschließlich sogenanntem "hexagonalen" und "hexagonalen Phase II" PS und PE (HexII PS und HexII PE) (Rauch et al., 1986; Rauch and Janoff 1990; Berard et al., 1993), sowie PS und PE in Kombination mit jedem anderen Protein, Lipid, Membranbaustein, Plasma- oder Serum-Bestandteil oder jeder Kombination davon, bindet, erfüllt. Folglich ist ein "anti-Aminophospholipid-Antikörper" ein Antikörper, der an ein Aminophospholipid in den Tumorblutgefäßen bindet, ungeachtet der Tatsache, daß Doppelschicht- oder Mizellen-Aminophospholipide als immunogen neutral betrachtet werden können.
Die anti-Aminophospholipid-Antikörper können Aminophospholipid-Moleküle oder einen immunogenen Komplex davon (einschließlich hexagonaler Aminophospholipide und Proteinkombinationen) erkennen, daran binden oder Immunspezifität dafür aufweisen bis hin zum Ausschluß anderer Phospholipide oder Lipide. Derartige Antikörper können als "Aminophospholipid-spezifische oder auf Aminophospholipid beschränkte Antikörper" bezeichnet werden, und ihre Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung wird häufig bevorzugt sein. Bei bestimmten Ausführungen werden "Aminophospholipid-spezifische oder auf Aminophospholipid beschränkte Antikörper" im allgemeinen eine erhebliche Bindung an Aminophospholipide aufweisen, während sie wenig oder keine signifikante Bindung an andere Lipidbausteine, wie etwa Phosphatidylinositol (PI), Phosphatidylglycerin (PG) und sogar Phosphatidylcholin (PC) aufweisen.
"PS-spezifische oder auf PS beschränkte Antikörper" werden im allgemeinen eine erhebliche Bindung an PS aufweisen, während sie wenig oder keine bedeutende Bindung an Lipidbausteine, wie etwa Phosphatidylethanolamin und Cardiolipin (CL), ebenso wie PC, PI und PG zeigen. "PE-spezifische oder auf PE beschränkte Antikörper" werden im allgemeinen eine erhebliche Bindung an PE zeigen, während sie wenig oder keine bedeutende Bindung an Lipidbausteine, wie etwa Phosphatidylserin und Cardiolipin, ebenso wie PC, PI und PG zeigen. Die Herstellung spezifischer anti-Aminophospholipid-Antikörper wird leicht erreicht, wie z.B. durch Rauch et al. (1986), Umeda et al., (1989); Rauch und Janoff (1990) und Rote et al. (1993) offenbart.
"Kreuzreaktive anti-Aminophospholipid-Antikörper", die ein Aminophospholipid-Molekül oder einen immunogenen Komplex davon (einschließlich hexagonaler Aminophospholipide und Proteinkombinationen) erkennen, daran binden oder Immunspezifität dafür aufweisen, die zusätzlich eine geringere, aber nachweisbare Bindung an andere Phospholipid- oder Lipidbausteine zeigen, werden keinesfalls von einer erfindungsgemäßen Anwendung ausgeschlossen. Derartige "kreuzreaktive anti-Aminophospholipidantikörper" können eingesetzt werden, solange sie an ein Aminophospholipid binden, das auf der luminalen Oberfläche von Endothelzellen der Tumovaskulatur vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert ist, und eine Antitumor-Wirkung nach Verabreichung in vivo ausüben.
Weitere geeignete Aminophospholipid-spezifische oder auf Aminophospholipid beschränkte Antikörper sind jene anti-Aminophospholipid-Antikörper, die sowohl an PS als auch an PE binden. Während sie eindeutig spezifisch sind für oder beschränkt sind auf Aminophospholipide, im Gegensatz zu anderen Lipidbausteinen sind, gibt es Antikörper, die an jedes der bevorzugten Ziele der vorliegenden Erfindung binden. Beispiele derartiger Antikörper zur Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung schließen folgende ein, ohne darauf beschränkt zu sein: PS3A, PSF6, PSF7, PSB4, PS3H1 und PS3E10 (Igarashi et al., 1991).
Weitere beispielhafte anti-PS-Antikörper zur Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung schließen folgende ein, ohne darauf beschränkt zu sein: BA3BSC4, PS4A7, PS1G3 und 3SB9b, wobei PS4A7, PS1G3 und 3SB9b im allgemeinen bevorzugt werden. Monoklonale Antikörper, humanisierte Antikörper und/oder Antigen-bindende Fragmente, die auf dem 3SB9b-Antikörper beruhen (Rote et al., 1993), werden gegenwärtig am stärksten bevorzugt.
Obwohl von Aminophospholipiden, wie etwa PS und PE, berichtet wurde, daß sie in Form einer Doppelschicht oder Mizelle nicht oder schwach antigen oder nicht oder schwach immunogen sind, gibt es in der wissenschaftlichen Literatur keine Berichte über Schwierigkeiten beim Erzeugen von anti-Aminophospholipid-Antikörpern, wie etwa anti-PS- und anti-PE-Antikörpern. Anti-Aminophospholipid-Antikörper oder monoklonale Antikörper können deshalb leicht durch präparative Verfahren und Methoden hergestellt werden, die folgendes umfassen:

(a) Herstellen einer anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Zelle; und
(b) Gewinnen eines anti-Aminophospholipid-Antikörpers oder monoklonalen Antikörpers aus der Antikörper-produzierende Zelle.

Die Verfahren zum Herstellen anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierender Zellen und Gewinnen von anti-Aminophospholipid-Antikörpern daraus können in situ in einem bestimmten Patienten durchgeführt werden. Das heißt, ein einfaches Versorgen eines Patienten mit einer immunogen wirksamen Menge an einer immunogenen Aminophospholipid-Probe wird zu einer anti-Aminophospholipid-Antikörper-Bildung führen. Demnach wird der anti-Aminophospholipid-Antikörper noch von der Antikörper-produzierenden Zelle "gewonnen", aber er muß nicht aus dem Wirt heraus isoliert und anschließend an einen Patienten verabreicht werden, wobei er in der Lage ist, spontan an die Tumorvaskulatur zu gelangen und seine biologischen anti-Tumor-Wirkungen auszuüben.
Wie hier offenbart, können aus menschlichen Patienten mit anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Erkrankungen anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierende Zellen erhalten und anschließend Antikörper isoliert und/oder gereinigt werden, indem periphere Blutlymphozyten mit Aminophospholipiden in vitro stimuliert werden und auch durch Immunisierungsverfahren und -methoden. Letztere umfassen im allgemeinen:

(a) Immunisieren eines Tieres durch Verabreichen von mindestens einer Dosis und wahlweise mehr als einer Dosis einer immunogen wirksamen Menge an einer immunogenen Aminophospholipid-Probe (wie etwa einem hexagonalen Aminophospholipid oder einer hexagonale Phase II-Form eines Aminophospholipids), vorzugsweise einer immunogenen PS- oder PE-Probe, an das Tier; und
(b) Gewinnen einer anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Zelle aus dem immunisierten Tier.

Die immunogen wirksame Menge der Aminophospholipid-Probe(n) kann eine Salmonellabeschichtete Aminophospholipid-Probe (Umeda et al., 1989), eine Probe einer Aminophospholipid-Mizelle, eines Liposoms, eines Lipid-Komplexes oder einer Lipid-Formulierung oder eine mit SDS hergestellte Aminophospholipid-Probe sein. Jede derartige Aminophospholipid-Probe kann in Kombination mit jedem geeigneten Adjuvans, wie etwa Freund'schem komplettem Adjuvans (Rote et al., 1993), verabreicht werden. Jede empirische Technik oder Variation kann eingesetzt werden, um die Immunogenität zu steigern, und/oder hexagonale oder hexagonale Phase II-Formen der Aminophospholipide können verabreicht werden.
Die Immunisierung kann auf einer oder mehreren Injektionen einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipid-Probe in die Milz beruhen (Umeda et al., 1989).
Unabhängig von der Art des Immunisierungsverfahrens oder der Art des immunisierten Tieres werden aus dem immunisierten Tier anti-Aminophospholipid-produzierende Zellen gewonnen und vorzugsweise von menschlicher Hand manipuliert. "Ein immunisiertes Tier", wie der Begriff hier verwendet wird, ist ein nicht-menschliches Tier, es sei denn, anderes wird ausdrücklich festgestellt. Obwohl jede Antikörper-produzierende Zelle verwendet werden kann, wird am stärksten bevorzugt, Milzzellen als Quelle für die Antikörper-produzierenden Zellen zu verwenden. Die anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Zellen können in einem präparativen Verfahren verwendet werden, das folgendes umfaßt:

(a) Fusionieren einer anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Zelle mit einer immortalen Zelle, um ein Hybridom herzustellen, das einen monoklonalen anti-Aminophospholipid-Antikörper produziert; und
(b) Gewinnen eines monoklonalen anti-Aminophospholipid-Antikörpers aus dem Hybridom.

Präparative Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers auf der Grundlage eines Hybridoms schließen daher jene Verfahren ein, die folgendes umfassen:

(a) Immunisieren eines Tieres durch Verabreichen von mindestens einer Dosis und wahlweise mehr als einer Dosis einer immunogen wirksamen Menge an einer immunogenen Aminophospholipid-Probe (wie etwa einem hexagonalen Aminophospholipid oder einer hexagonale Phase II-Form eines Aminophospholipids), vorzugsweise einer immunogenen PS- oder PE-Probe, an das Tier;
(b) Herstellen einer Kollektion von monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomen aus dem immunisierten Tier;
(c) Auswählen aus der Kollektion von mindestens einem ersten Hybridom, das mindestens einen ersten monoklonalen anti-Aminophospholipid-Antikörper und vorzugsweise mindestens einen ersten Aminophospholipid-spezifischen monoklonalen Antikörper produziert; und
(d) Kultivieren von mindestens einem ersten anti-Aminophospholipid-produzierenden oder Aminophospholipid-spezifischen Hybridom, um mindestens einen ersten monoklonalen anti-Aminophospholipid-Antikörper oder monoklonalen Aminophospholipid-spezifischen Antikörper verfügbar zu machen; und vorzugsweise
(e) Gewinnen von mindestens einem ersten monoklonalen anti-Aminophospholipid-Antikörper oder monoklonalen Aminophospholipid-spezifischen Antikörper aus dem mindestens ersten kultivierten Hybridom.

Da nicht-menschliche Tiere zur Immunisierung verwendet werden, werden die monoklonalen anti-Aminophospholipid-Antikörper, die von einem derartigen Hybridom gewonnen werden, häufig nicht-menschliche Eigenschaften aufweisen. Solche Antikörper können wahlweise einem Humanisierungsprozeß, einer Aufpfropfung oder Mutation unterzogen werden, was Fachleuten bekannt ist und hier außerdem offenbart wird. Alternativ können transgene Tiere, wie etwa Mäuse, die eine menschlichen Antikörper-Genbibliothek umfassen, verwendet werden. Eine Immunisierung derartiger Tiere wird deshalb direkt zur Erzeugung menschlicher anti-Aminophospholipid-Antikörper führen.
Nach der Produktion einer geeigneten Antikörper-produzierenden Zelle, am stärksten bevorzugt ist ein Hybridom, die entweder menschliche oder nicht-menschliche Antikörper produziert, können die den monoklonalen Antikörper kodierenden Nukleinsäuren kloniert werden, um einen "rekombinanten" monoklonalen Antikörper herzustellen. Jede rekombinante Klonierungstechnik kann verwendet werden, einschließlich der Verwendung von PCR, um die Synthese von Antikörper-kodierenden Nukleinsäuresequenzen vorzubereiten. Deshalb schließen noch weitere geeignete präparative Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers jene ein, welche die Verwendung der anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Zellen umfassen, wie folgt:

(a) Gewinnen von mindestens einem ersten anti-Aminophospholipid-Antikörper-kodierenden Nukleinsäuremolekül oder -segment aus einer anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Zelle, vorzugsweise einem Hybridom; und
(b) Exprimieren des Nukleinsäuremoleküls oder -segments in einer rekombinanten Wirtszelle, um einen rekombinanten monoklonalen anti-Aminophospholipid-Antikörper zu erhalten.

Allerdings sind andere leistungsfähige rekombinante Techniken verfügbar, die für die Herstellung rekombinanter monoklonaler Antikörper ideal geeignet sind. Derartige rekombinante Techniken schließen die präparativen Verfahren zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers auf der Grundlage einer Phagen-Bibliothek ein, die folgendes umfassen:

(a) Immunisieren eines Tieres durch Verabreichen von mindestens einer Dosis und wahlweise mehr als einer Dosis einer immunogen wirksamen Menge an einer immunogenen Aminophospholipid-Probe (wie etwa einem hexagonalen Ami nophospholipid oder einer hexagonale Phase II-Form eines Aminophospholipids), vorzugsweise einer immunogenen PS- oder PE-Probe, an das Tier;
(b) Herstellen einer kombinatorischen Immunglobulin-Phagen-Bibliothek, die RNA, isoliert aus den Antikörper-produzierenden Zellen, exprimiert, vorzugsweise aus der Milz des immunisierten Tieres;
(c) Auswählen aus der Phagen-Bibliothek von mindestens einem ersten Klon, der mindestens einen ersten anti-Aminophospholipid-Antikörper und vorzugsweise mindestens einen ersten Aminophospholipid-spezifischen Antikörper exprimiert;
(d) Gewinnen von anti-Aminophospholipid-Antikörper-kodierenden Nukleinsäuren aus mindestens einem ersten ausgewählten Klon und Exprimieren der Nukleinsäuren in einer rekombinanten Wirtszelle, um mindestens einen ersten anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Aminophospholipid-spezifischen Antikörper verfügbar zu machen; und vorzugsweise
(e) Gewinnen von mindestens einem ersten anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Aminophospholipid-spezifischen Antikörper, der durch die Nukleinsäuren, die aus dem mindestens ersten ausgewählten Klon erhalten wurden, exprimiert wird.

Wieder können bei solchen Techniken, die auf Phagen-Bibliotheken beruhen, transgene Tiere, die Genbibliotheken menschlicher Antikörper tragen, eingesetzt werden, wodurch rekombinante menschliche monoklonale Antikörper hervorgebracht werden.
Unabhängig von der Art der Herstellung eines ersten anti-Aminophospholipid-Antikörper-Nukleinsäuresegments können geeignete anti-Aminophospholipid-Antikörper-Nukleinsäuresegmente weiter leicht durch standardmäßige molekularbiologische Techniken hergestellt werden. Um zu bestätigen, daß jede Variante, Mutante oder zweite Generation eines anti-Aminophospholipid-Antikörper-Nukleinsäuresegments zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung geeignet ist, wird das Nukleinsäuresegment getestet werden, um die Expression eines Antikörpers, der an ein Aminophospholipid bindet, zu bestätigen. Vorzugsweise sollen die Variante, Mutante oder zweite Generation eines anti-Aminophospholipid-Antikörper-Nukleinsäuresegments auch getestet werden, um eine Hybridisierung an ein anti-Aminophospholipid-Antikörper-Nukleinsäuresegment unter Standardbedingungen, stärker bevorzugt unter stringenten Hybridisierungsstandardbedingungen zu bestätigen. Beispielhaft geeignete Hybridisierungsbedingungen schließen eine Hybridisierung in ungefähr 7% Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate, SDS), ungefähr 0,5 M NaPO₄, ungefähr 1 mM EDTA bei ungefähr 50°C und Waschen mit ungefähr 1% SDS bei ungefähr 42°C ein.
Da eine Vielfalt rekombinanter monoklonaler Antikörper, entweder menschlichen oder nicht-menschlichen Ursprungs, leicht hergestellt werden kann, können die Behandlungsverfahren der Erfindung durchgeführt werden, indem dem Tier oder Patienten mindestens ein erstes Nukleinsäuresegment, das eine biologisch wirksame Menge von mindestens einem ersten anti-Aminophospholipid-Antikörper in dem Patienten exponiert, zur Verfügung gestellt wird. Das "Nukleinsäuresegment, das einen anti-Aminophospholipid-Antikörper exprimiert", wird im allgemeinen in Form von mindestens einem Expressionskonstrukt vorliegen und kann in Form eines Expressionskonstrukts, das von einem Virus oder einer rekombinanten Wirtszelle umfaßt wird, vorliegen. Bevorzugte Gentherapie-Vektoren der vorliegenden Erfindung werden im allgemeinen virale Vektoren, wie etwa von einem rekombinaten Retrovirus, Herpes simplex-Virus (HSV), Adenovirus, Adeno-assoziierten Virus (AAV), Cytomegalovirus (CMV) und derartigem umfaßt, sein.
Bei bestimmten Ausführungen kann die Vaskulatur des vaskularisierten Tumors des zu behandelnden Tieres oder Patienten zunächst bildlich dargestellt werden. Im allgemeinen wird dies erreicht, indem zunächst eine diagnostisch wirksame Menge von mindestens einer ersten pharmazeutischen Zusammensetzung, die mindestens ein erstes nachweisbar markiertes Aminophospholipid-bindendes Konstrukt umfaßt, wie etwa ein Konstrukt aus anti-Aminophospholipid-Antikörper und nachweisbarem Mittel, das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, vorhanden, exprimiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert auf der luminalen Oberfläche von Blutgefäßen des vaskularisierten Tumors, bindet oder dieses identifiziert, an das Tier oder den Patienten verabreicht wird. Die Erfindung macht damit weiterhin Zusammensetzungen zur Verwendung und Verfahren zum Unterscheiden zwischen Blutgefäßen eines Tumors und/oder Tumorinneren und normalen Blutgefäßen verfügbar. Das "Unterscheiden" wird durch Verabreichen eines oder mehrerer der beschriebenen nachweisbar markierten Aminophospholipid-bindenden Konstrukte erreicht.
Das nachweisbar markierte Aminophospholipid-bindende Konstrukt oder das Konstrukt aus anti-Aminophospholipid-Antikörper und nachweisbarem Mittel kann eine, durch Röntgenstrahlen nachweisbare Verbindung, wie etwa Wismut (III), Gold (III), Lanthan (III) oder Blei (II); ein radioaktives Ion, wie etwa Kupfer⁶⁷, Gallium⁶⁷, Gallium⁶⁸, Indium¹¹¹, Indium¹¹³, Jod¹²³, Jod¹²⁵, Jod¹³¹, Quecksilber¹⁹⁷, Quecksilber²⁰³, Rhenium¹⁸⁶, Rhenium¹⁸⁸, Rubidium⁹⁷, Rubidium¹⁰³, Technetium^99m oder Yttrium⁹⁰; ein NMR (nuclear magnetic spin-resonance)-Isotop, wie etwa Kobalt (II), Kupfer (II), Chrom (III), Dysprosium (III), Erbium (III), Gadolinium (III), Holmium (III), Eisen (II), Eisen (III), Mangan (II), Neodymium (III), Nickel (II), Samarium (III), Terbium (III), Vanadium (II) oder Ytterbium (III); oder Rhodamin oder Fluorescein, umfassen.
Eine vorherige Bilddarstellung vor einer Tumorbehandlung ("pre-imaging") kann demnach wie folgt durchgeführt werden:

(a) Verabreichen an das Tier oder den Patienten einer diagnostisch wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die ein erstes nachweisbar markiertes Aminophospholipid-bindendes Konstrukt umfaßt, das ein diagnostisches Mittel umfaßt, das funktionsfähig an einen Antikörper, ein Bindungsprotein oder einen Liganden angehängt ist, oder ein Aminophospholipid-bindendes Fragment davon, das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, vorhanden, exponiert, transloziert, präsentiert oder komplexiert auf der luminalen Oberfläche von Blutgefäßen oder Blutgefäßen im Inneren eines vaskularisierten Tumors, bindet; und
(b) anschließendes Nachweisen des nachweisbar markierten Aminophospholipid-bindenden Konstruktes, das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin auf der luminalen Oberfläche von Blutgefäßen eines Tumors oder im Tumorinneren gebunden ist, wodurch eine bildlicher Darstellung der Tumorvaskulatur erhalten wird.

Eine Krebsbehandlung kann auch wie folgt durchgeführt werden:

(a) Erzeugen eines Bildes eines vaskularisierten Tumors durch Verabreichen einer diagnostisch minimalen Menge von mindestens einem ersten nachweisbar markierten Aminophospholipid-bindenden Konstrukt, das ein diagnostisches Mittel umfaßt, welches funktionsfähig an einen Antikörper, ein Bindungsprotein oder einen Liganden angehängt ist, oder ein Aminophospholipid-bindendes Fragment davon, das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phophatidylserin oder Phosphatidylethanolamin auf der luminalen Oberfläche von Tumor-Blutgefäßen oder Blutgefäßen im Tumorinneren des vaskularisierten Tumors bindet, an ein Tier oder einen Patienten mit einem vaskularisierten Tumor, wodurch ein nachweisbares Bild der Tumorvaskulatur erzeugt wird; und
(b) anschließendes Verabreichen an dasselbe Tier oder denselben Patienten einer therapeutisch optimierten Menge von mindestens einem ersten nackten Antikörper oder Antigen-bindenden Fragment davon, das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin auf der luminalen Oberfläche von Tumorblutgefäßen bindet, wodurch die Tumorvaskulatur zerstört wird.

Zusammensetzungen oder Medikamente zur bildlichen Darstellung und Behandlung werden demnach verfügbar gemacht, die im allgemeinen folgendes umfassen:

(a) eine erste pharmazeutische Zusammensetzung, die eine diagnostisch wirksame Menge eines nachweisbar markierten Aminophospholipid-bindenden Konstrukts umfaßt, das ein nachweisbares Mittel umfaßt, das funktionsfähig an einen Antikörper, ein Bindungsprotein oder einen Liganden angehängt ist, oder ein Aminophospholipid-bindendes Fragment davon, das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin auf der luminalen Oberfläche von Blutgefäßen eines Tumors oder im Tumorinneren des vaskularisierten Tumors bindet; und
(b) eine zweite pharmazeutische Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem zweiten, unkonjugierten anti- Aminophospholipid-Antikörper, vorzugsweise anti-Phosphatidylserin oder anti-Phosphatidylethanolamin oder einem Antigen-bindenden Fragment davon, umfaßt.

Bei derartigen Medikamenten werden Vorteile verwirklicht werden, wobei die ersten und zweiten pharmazeutischen Zusammensetzungen dieselben zielgerichteten Mittel, d.h. anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Fragmente davon aus derselben Antikörper-Präparation oder vorzugsweise von demselben Antikörper-produzierenden Hybridom umfassen.
Hinsichtlich der Aspekte der Erfindung, welche die bildliche Darstellung der Vaskulatur betreffen, wird anerkannt, daß das verabreichte nachweisbar markierte Aminophospholipid-bindende Konstrukt oder das nachweisbare Mittel in Verbindung mit einem anti-Aminophospholipid-Antikörper selbst eine therapeutische Wirkung haben können. Während dies von der Erfindung nicht ausgeschlossen wäre, würden die Mengen an den zu verabreichenden nachweisbar markierten Konstrukten im allgemeinen als "diagnostisch wirksame Mengen" ausgewählt werden, welche typischerweise geringer sind als die Mengen, die für einen therapeutischen Nutzen erforderlich sind.
Bei den die bildliche Darstellung betreffenden Ausführungen kann das zielgerichtete Mittel entweder auf einem Antikörper oder einem Bindungsliganden oder einem bindenden Protein beruhen. Obwohl zuvor nicht mit Tumoren oder der Tumorvaskulatur in Zusammenhang gebracht, sind Zusammensetzungen mit nachweisbar markierten Aminophospholipid-bindenden Liganden im Stand der Technik bekannt und können jetzt angesichts dieser Motivation und der vorliegenden Offenbarung unter den Gesichtspunkten der Kombination der vorliegenden Erfindung von bildlicher Darstellung und Behandlung benutzt werden. Die nachweisbar markierten Annexine der US-Patente 5,627,036, WO 95/19791, WO 95/27903, WO 95/34315, WO 96/17618 und WO 98/04294 können entsprechend eingesetzt werden.
Die zuvor beschriebenen Zusammensetzungen und Medikamente zur bildlichen Darstellung und Behandlung können auch weiterhin ein oder mehrere anti-Krebs-Mittel umfassen. Dies bedeutet, daß die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen und Medikamente zur bildlichen Darstellung und Kombinationsbehandlung umfaßt, die im allgemeinen (a) diagnostisch wirksame Mengen an nachweisbar markierten Aminophospholipid-bindenden Konstrukten; (b) therapeutisch wirksame Mengen an unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörpern, vorzugsweise anti-Phosphotidylserin oder anti-Phosphatidylethanolamin oder Antigenbindenden Fragmenten davon; und (c) therapeutisch wirksame Mengen an mindestens einem anderen/anderen anti-Krebs-Mittel(n) umfaßt.
In noch weiteren Ausführungen werden die, durch die vorliegende Erfindung zu behandelnden Tiere oder Patienten weiter einer Operation oder Radiotherapie unterzogen oder werden mit einer therapeutisch wirksamen Menge von mindestens einem ersten anti-Krebs-Mittel versorgt. Der Begriff "ein mindestens erstes anti-Krebs-Mittel" bedeutet in diesem Zusammenhang "mindestens ein erstes anti-Krebs-Mittel zusätzlich zu dem nackten anti-Aminophospholipid-Antikörper (vorzugsweise anti-Phosphatidylserin oder anti-Phosphatidylethanolamin). Der Begriff "ein mindestens erstes anti-Krebs-Mittel" kann deshalb als "mindestens ein zweites anti-Krebs-Mittel" gelten, wenn der nackte anti-Aminophospholipid-Antikörper ein erstes anti-Krebs-Mittel ist. Dies allerdings ist es schlichtweg eine Frage von Semantik, und die praktische Bedeutung wird für die Fachleute eindeutig sein.
Das ein mindestens erste anti-Krebs-Mittel kann dem Tier oder dem Patienten im wesentlichen gleichzeitig mit dem anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Antigen-bindenden Fragment davon verabreicht werden, wie etwa aus einer einzigen pharmazeutischen Zusammensetzung oder aus zwei pharmazeutischen Zusammensetzungen, die im engen Bezug zueinander verabreicht werden.
Alternativ kann das mindestens erste anti-Krebs-Mittel dem Tier oder Patienten zu einer Zeit verabreicht werden, welche auf die Verabreichung von dem mindestens ersten anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Antigen-bindenden Fragment davon folgt. "Zu einer Zeit, die (...) folgt", wie hier verwendet, bedeutet "gestaffelt", derart, daß das mindestens erste anti-Krebs-Mittel an das Tier oder dem Patienten zu einer Zeit verabreicht wird, die sich von der Verabreichung des mindestens ersten anti-Aminophospholipid-Antikörpers unterscheidet. Im allgemeinen werden die beiden Mittel zu Zeiten, die wirksam voneinander getrennt sind, verabreicht, um den beiden Mitteln zu ermöglichen, ihre jeweiligen therapeutischen Wirkungen zu entfalten, d.h. sie werden zu "biologisch wirksamen Zeitintervallen" verabreicht.
Das mindestens erste anti-Krebs-Mittel kann dem Tier oder dem Patienten zu einer biologisch wirksamen Zeit vor dem anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Fragment davon oder zu einer biologisch wirksamen Zeit im Anschluß an das anti-Aminophospholipid-Antikörper-Fragment verabreicht werden. Eine Verabreichung eines oder mehrerer anti-Krebs-Mittel, das/die nicht Aminophospholipid anzielen, zu einer therapeutisch wirksamen Zeit im Anschluß an den anti-Aminophospholipid-Antikörper kann besonders gewünscht sein, wobei das anti-Krebs-Mittel ein anti-Tumorzell-Immuntoxin ist, entwickelt, um Tumorzellen am äußersten Rand des Tumors abzutöten und/oder wobei das anti-Krebs-Mittel ein antiangiogenes Mittel ist, entwickelt, um eine Mikrometastase von irgendwelchen verbleibenden Tumorzellen zu verhüten. Derartige Überlegungen werden den Fachleuten bekannt sein.
Eine Verabreichung von einem oder mehreren, nicht Aminophospholipid anzielenden anti-Krebs-Mitteln zu einer therapeutisch wirksamen Zeit vor einem anti-Aminophospholipid-Antikörper kann insbesondere eingesetzt werden, wenn das anti-Krebs-Mittel entwickelt wurde, um eine Aminophospholipid-Expression zu steigern. Dies kann durch Verwendung von anti-Krebs-Mitteln, welche das Tumor-Endothel verletzen oder darin Apoptose induzieren, erreicht werden. Beispielhafte anti-Krebs-Mittel schließen z.B. Taxol, Vincristin, Vinblastin, Neomycin, Combretastatin(e), Podophyllotoxin(e), TNF-α, Angiostatin, Endostatin, Vasculostatin, α_vβ₃-Antagonisten, Kalzium-Ionophore, Kalzium-Einstrom-induzierende Mittel, jedes Derivat oder jede Vorstufe davon, ein.
Das eine oder die mehreren zusätzlichen anti-Krebs-Mittel können chemotherapeutische Mittel, radiotherapeutische Mittel, Cytokine, antiangiogene Mittel, Apoptose-induzierende Mittel oder anti-Krebs-Immuntoxine oder Koaguliganden sein. "Chemotherapeutische Mittel", wie hier verwendet, bezeichnen klassische chemotherapeutische Mittel oder Wirkstoffe, die bei der Behandlung von malignen Erkrankungen verwendet werden. Diese Bezeichnung wird zugunsten der Einfachheit verwendet, ungeachtet der Tatsache, daß andere Verbindungen technisch als chemotherapeutische Mittel insofern beschrieben werden, als sie eine anti-Krebs-Wirkung ausüben. "Chemotherapeutikum" hat jedoch eine eindeutige Bedeutung im Stand der Technik gewonnen und wird gemäß dieser Standardbedeutung verwendet.
Eine Reihe beispielhafter chemotherapeutischer Mittel werden hier beschrieben. Fachleute, die sich im Stand der Technik auskennen, werden die Verwendungen und geeigneten Dosen von chemotherapeutischen Mitteln leicht verstehen, obwohl die Dosen gut reduziert werden können, wenn sie in Kombination mit der vorliegenden Erfindung angewendet werden. Eine neue Klasse von Wirkstoffen, die ebenfalls als "chemotherapeutische Mittel" bezeichnet wer den können, sind Mittel, die eine Apoptose induzieren. Jeder oder mehrere derartiger Wirkstoffe, einschließlich Genen, Vektoren und Antisense-Konstrukten können, wenn dies angebracht ist, in Verbindung mit der vorliegenden Erfindungen angewendet werden.
Anti-Krebs-Immuntoxine oder Koaguliganden sind weitere geeignete anti-Krebs-Mittel. "Anti-Krebs-Immuntoxine oder Koaguliganden" oder therapeutisches-Mittel-zielgerichtetes-Mittel-Konstrukte beruhen auf zielgerichteten Mitteln, einschließlich Antikörpern oder Antigen-bindenden Fragmenten davon, welche an einen anzielbaren Bestandteil einer Tumorzelle, von Tumorvaskulatur oder Tumorstroma binden, und die funktionsfähig an ein therapeutisches Mittel, im allgemeinen ein cytotoxisches Agens (Immuntoxin) oder ein Gerinnungsfaktor (Koaguligand), angehängt sind. Ein "anzielbarer Bestandteil" einer Tumorzelle, von Tumorvaskulatur oder Tumorstroma ist vorzugsweise ein Oberflächen-exponierter, Oberflächen-zugänglicher oder Oberflächen-lokalisierter Bestandteil, obwohl Bestandteile, die von nekrotischen oder anderweitig beschädigten Tumorzellen oder vaskulären Endothelzellen freigesetzt werden, ebenfalls Ziele sein können, einschließlich cytosolischer und/oder nuklearer Tumorzell-Antigene.
Zielgerichtete Mittel auf der Grundlage von sowohl Antikörpern als auch nicht-Antikörpern können verwendet werden, einschließlich Wachstumsfaktoren, wie etwa VEGF und FGF, das Tripeptid R-G-D enthaltende Peptide, die spezifisch an die Tumorvaskulatur binden, und andere zielgerichtete Bestandteile, wie etwa Annexine und verwandte Liganden.
Anti-Tumorzell-Immuntoxine oder Koaguliganden können Antikörper umfassen, welche durch die Gruppe, bestehend aus B3 (ATCC HB 10573), 260F9 (ATCC HB 8488), D612 (ATCC HB 9796) und KS1/4, veranschaulicht sind, wobei genannter KS1/4-Antikörper von einer Zelle erhalten wurde, welche den Vektor pGKC23020 (NRRL B-18356) oder den Vektor pG2A52 (NRRL B-18357) umfaßt.
Anti-Tumorstroma-Immuntoxine oder Koaguliganden werden im allgemeinen Antikörper umfassen, welche an einen Bestandteil des konnektiven Gewebes, einen Basalmembran-Bestandteil oder einen Bestandteil aktivierter Plättchen bindet, wie beispielhaft dargestellt durch die Bindung von Fibrin, RIBS oder LIBS.
Anti-Tumorvaskulatur-Immuntoxine oder Koaguliganden können Liganden, Antikörper oder Fragmente davon umfassen, die an einen Oberflächen-exprimieren, Oberflächen-zugänglichen oder Oberflächen-lokalisierten Bestandteil der Blut-transportierenden Gefäße, vorzugsweise der Blutgefäße im Tumorinneren eines vaskularisierten Tumors, binden. Derartige Antikörper schließen jene ein, die an Oberflächen-exprimierte Bestandteile von Blutgefäßen im Tumorinneren eines vaskularisierten Tumors, einschließlich Aminophospholipiden selbst, und an Oberflächenrezeptoren der Vaskulatur im Tumorinneren binden, wie etwa Endoglin (TEC-4- und TEC-11-Antikörper), einen TGFβ-Rezeptor, E-Selectin, P-Selectin, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, einen VEGF/VPF-Rezeptor, einen FGF-Rezeptor, ein TIE, α_vβ₃-Integrin, Pleiotropin, Endosialin und MHC Klasse II-Proteine. Die Antikörper können auch an Cytokin-induzierbare oder Koagulanz-induzierbare Bestandteile von Blutgefäßen im Tumorinneren binden.
Andere anti-Tumorvaskulatur-Immuntoxine oder Koaguliganden können Antikörper oder Fragmente davon umfassen, die an einen Liganden oder Wachstumsfaktor binden, der an einen Zelloberflächenrezeptor der Vaskulatur im Tumorinneren bindet. Derartige Antikörper schließen jene ein, die an VEGF/VPF (GV39- und GV97-Antikörper), FGF, TGFβ binden, einen Liganden, der an ein TIE bindet, eine Tumor-assoziierte Fibronektin-Isoform, einen Hepatocyten-Wachstumsfaktor (scatter factor/hepatocyte growth factor, HGF), Plättchenfaktor 4 (PF4), PDGF und TIMP. Die Antikörper oder Fragmente davon können auch an einen Ligand-Rezeptor-Komplex oder einen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Komplex binden, nicht jedoch an den Liganden oder Wachstumsfaktor oder an den Rezeptor, wenn der Ligand oder Wachstumsfaktor oder der Rezeptor nicht in dem Ligand-Rezeptor- oder Wachstumsfaktor-Rezeptor-Komplex vorliegt.
Konstrukte aus anti-Tumorzell-, anti-Tumorstroma- oder anti-Tumorvaskulatur-Antikörpern und einem therapeutischen Mittel könne cytotoxische Mittel, wie etwa von Pflanzen, Pilzen oder Bakterien abgeleitete Toxine (Immuntoxine) umfassen. Ricin A-Kette und deglycosylierte Ricin A-Kette werden häufig bevorzugt werden, und Gelonin und Angiopoetine werden ebenfalls berücksichtigt. Konstrukte aus anti-Tumorzell-, anti-Tumorstroma- oder anti-Tumorvaskulatur-Antikörpern und einem therapeutischen Mittel können Gerinnungsfaktoren oder sekundäre Antikörper-bindende Regionen umfassen, die an Gerinnungsfaktoren binden (Koaguliganden). Die funktionsfähige Verknüpfung mit Gewebefaktor oder Gewebefaktor-Derivaten, wie etwa trunkiertem Gewebefaktor, wird häufig bevorzugt werden.
Die vorliegende Erfindung offenbart noch weiter eine Serie von neuen therapeutischen Kits, Medikamenten und/oder Cocktails zur Verwendung in Verbindung mit der Erfindung. Die Kits, Medikamente und/oder Cocktails umfassen im allgemeinen eine kombinierte wirksame Menge an einem anti-Krebs-Mittel und einem Antikörper oder einem Antigen-bindenden Fragment davon, der/das an ein Aminophospholipid, vorzugsweise Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin, bindet.
Wenn der vorrangige Zweck eines derartigen Kits die Kombinationstherapie ist, kann das Kit nichtsdestotrotz noch weiter einen Bestandteil zur bildlichen Darstellung umfassen, im allgemeinen eine diagnostisch wirksame Menge eines nachweisbar markierten Aminophospholipid-bindenden Konstrukts, wie etwa einem markierten anti-Aminophospholipid-Antikörper oder einem Antigen-bindenden Fragment davon.
Die Kits und Medikamente werden, vorzugsweise in geeigneten Behältervorrichtungen, eine biologisch wirksame Menge an mindestens einem ersten Antikörper oder Antigen-bindenden Fragment davon, der/das an ein Aminophospholipid bindet, vorzugsweise an Phosphatidylserin oder Phosphatidylethanolamin bindet, in Kombination mit einer biologisch wirksamen Menge an mindestens einem ersten anti-Krebs-Mittel, umfassen. Die Bestandteile der Kits und Medikamente können in einem einzelnen Behälter oder einer Behältervorrichtung enthalten sein oder innerhalb unterschiedlicher Behälter oder Behältervorrichtungen enthalten sein. Die Cocktails werden im allgemeinen zur kombinierten Anwendung zusammengemischt werden.
Der gesamte Bereich von anti-Aminophospholipid-Antikörpern, wie oben beschrieben, kann in den Kits, Medikamenten und/oder Cocktails eingesetzt werden, wobei anti-PS, anti-PE, menschliche, humanisierte und monoklonale Antikörper oder Fragmente davon bevorzugt sind. Die anti-Krebs-Mittel sind ebenfalls solche, wie oben beschrieben, einschließlich chemotherapeutischer Mittel, radiotherapeutischer Mittel, antiangiogener Mittel, Apoptose-Mitteln, Immuntoxinen und Koaguliganden. Mittel, die zur intravenösen Verabreichung formuliert wurden, werden häufig bevorzugt werden.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die folgenden Zeichnungen sind Bestandteil der vorliegenden Beschreibung und sind eingeschlossen, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung weiter aufzuzeigen. Die Erfindung kann unter Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der genauen Beschreibung hier dargestellter spezifischer Ausführungen besser verstanden werden.
1A und 1B: Aktivität von zellgebundenem anti-VCAM-1·tTF in vitro. 1A: Bindung von anti-VCAM-1·tTF-Koaguligand an unstimulierte (Kontrolle) und IL-1α-aktivierte bEnd.3-Zellen. 1B: Herstellung von Faktor Xa durch zellgebundenen anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden.
2: Wachstumsverzögerung von L540-Tumoren in mit anti-VCAM-1·tTF behandelten Mäusen. L540-Tumor-tragenden Mäusen wurden Injektionen i.v. von entweder Kochsalzlösung, 20 μg anti-VCAM-1·tTF, 4 μg unkonjugierter tTF oder 20 μg Kontroll-IgG·tTF verabreicht. Die Injektionen wurden am Tag 4 und 8 nach der ersten Behandlung wiederholt. Die Tumoren wurden täglich ausgemessen. Gezeigt wird das mittlere Tumorvolumen ± SD von 8 Mäusen pro Gruppe.
3: Annexin V blockiert eine Koaguligand-Aktivierung von Faktor X in vitro. IL-1α-stimulierte bEnd.3-Zellen wurden mit anti-VCAM-1·tTF-Koaguligand in 96-Well-Mikrotiterplatten inkubiert, wie in Beispiel V beschrieben. Annexin V wurde in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 10 μg/ml (wie dargestellt) zugegeben, und die Zellen wurden 30 Min. vor Zugabe von verdünntem Proplex T inkubiert. Die Menge an Faktor Xa, die in Gegenwart von oder ohne Annexin V erzeugt wurde, wurde unter Verwendung eines chromogenen Substrats bestimmt, wie in Beispiel V beschrieben.
4A und 5B: Anti-Tumor-Wirkungen von nackten anti-PS-Antikörpern in Tieren mit syngenen und xenogenen Tumoren. 1 × 10⁷ Zellen der kolorektalen Mäusekarzinomzellinie Colo 26 (4A) oder der menschlichen Morbus Hodgkin-Lymphom-Zellinie L540 (4B) wurden subkutan in die rechte Flanke von Balb/c-Mäusen (4A) bzw. CB17-SCID-Mäusemännchen (4B) injiziert. Die Tumoren wurden bis zu einer Größe von ungefähr 0,6-0,9 cm³ wachsen gelassen, und dann wurden den Mäusen (4 Tiere pro Gruppe) i.p. 20 μg nackter anti-PS-Antikörper (offene Quadrate) oder Kochsalzlösung (offene Kreise) verabreicht (Kontroll-Maus-IgM lieferte ähnliche Ergebnisse wie die Kochsalzlösung). Die Behandlung wurde dreimal mit einem 48-stündigen Intervall wiederholt. Die Tiere wurden täglich in Bezug auf die Tumorabmessungen und das Körpergewicht überwacht. Das Tumorvolumen wurde wie in Beispiel VII beschrieben berechnet. Die Mäuse wurden getötet, wenn die Tumoren 2 cm³ erreicht hatten, oder früher, wenn die Tumoren Anzeichen einer Nekrose oder Ulzeration zeigten.
Beschreibung von veranschaulichenden Ausführungen
A. Tumorzerstörung unter Verwendung von VCAM-1-Koaguliganden
Solide Tumoren und Karzinome machen mehr als 90% aller Krebsarten beim Menschen aus. Obwohl die Anwendung von monoklonalen Antikörpern und Immuntoxinen in der Therapie von Lymphomen und Leukämien untersucht worden ist (Vitetta et al., 1991), haben sich diese Mittel in klinischen Versuchen als enttäuschend unwirksam gegenüber Karzinomen und anderen soliden Tumoren gezeigt (Abrams and Oldham, 1985). Eine grundsätzliche Ursache für die Unwirksamkeit von Behandlungen auf der Grundlage von Antikörpern ist, daß Makromoleküle nicht leicht in solide Tumoren transportiert werden. Selbst nachdem sie sich einmal innerhalb der Tumormasse befinden, verteilen sich diese Moleküle nicht gleichmäßig aufgrund des Vorhandenseins von tight junctions zwischen Tumorzellen, fibrösem Stroma, interstitiellen Druckgradienten und Bindungsstellen-Barrieren (Dvorak et al., 1991).
Zur Entwicklung neuer Strategien zur Behandlung solider Tumoren bieten die Verfahren, welche ein Anzielen der Vaskulatur des Tumors anstelle der Tumorzellen beinhalten, deutliche Vorteile. Eine wirksame Zerstörung oder Blockade der Tumorgefäße stoppt den Blutfluß durch den Tumor und führt zu einer Tumorzelltod-Lawine. Antikörper-Toxin- und Antikörper-Koagulanz-Konstrukte sind bereits höchst wirksam zum spezifischen Anzielen und Zerstören von Tumorgefäßen, was zur Tumornekrose führt, verwendet worden (Burrows et al., 1992; Burrows and Thorpe, 1993; WO 93/17715, WO 96/01653; Huang et al., 1997).
Die Tumorvaskulatur anzielende cytotoxische Mittel werden in den folgenden Patenten beschrieben: US-Patente 5,855,866, 5,776,427, 5,863,538, 5,660,827, 6,004,554, 5,965,132 und 6,051,230. Den Tumor anzielende Koagulanzien werden in den folgenden Patenten beschrieben: US-Patente 5,855,566, 5,877,289, 5,965,132, 6,004,555, 6,036,955 und 6,093,399.
Wenn Antikörper, Wachstumsfaktoren oder andere bindende Liganden verwendet werden, um ein Koagulanz spezifisch an die Tumorvaskulatur abzugeben, werden solche Mittel als "Koaguliganden" bezeichnet. Ein gegenwärtig bevorzugtes Koagulanz für die Verwendung in Koaguliganden ist trunkierter Gewebefaktor (tTF) (Huang et al., 1997; WO 96/01653; US-Patent 5,877,289). TF ist der Hauptauslöser der Blutgerinnung (Ruf et al., 1991). An Stellen einer Verletzung kommt Faktor VII/VIIa im Blut in Kontakt mit TF auf Zellen in den perivaskulären Geweben und bindet daran. Der TF-VIIa-Komplex aktiviert in Gegenwart der Phospholipid-Oberfläche die Faktoren IX und X. Dies wiederum führt zur Bildung von Thrombin und Fibrin und schließlich eines Blutgerinnsels (Ruf and Edgington, 1994).
Die rekombinante, trunkierte Form von Gewebefaktor (tTF), der die zytosolischen und transmembranären Domänen fehlen, ist ein lösliches Protein, das eine um etwa fünf Größenordnungen geringere Fähigkeit zum Induzieren der Blutgerinnung aufweist als nativer TF (Stone et al., 1995; Huang et al., 1997). Aus diesem Grund muß TF mit Phospholipiden für den Komplex mit VIIa assoziiert sein, um IXa oder Xa wirksam zu aktivieren. Wenn allerdings tTF an das Tumorgefäßendothel mittels eines zielgerichteten Antikörpers oder Mittels abgegeben wird, wird er in die Nähe einer Lipidoberfläche zurückgebracht und gewinnt thrombogene Aktivität zurück (Huang et al., 1997; US-Patente 5,877,289, 6,004,555 und 6,093,399). Damit wird ein Koaguligand geschaffen, der selektiv Thrombosen in Tumorvaskulatur auslöst.
Trunkierter TF hat mehrere Vorteile, die seine Verwendung in, die Vaskulatur anzielenden Koaguliganden empfiehlt: menschlicher tTF ist leicht verfügbar, und das menschliche Protein wird vernachlässigbare oder geringe Immunogenität im Menschen haben; menschlicher tTF ist voll funktionsfähig in Versuchstieren, einschließlich Mäusen; undzielgerichteter tTF ist hoch potent, da er die Aktivierung einer Kaskade von Gerinnungsproteinen auslöst, woraus sich eine stark amplifizierte Wirkung ergibt (US-Patente 5,877,289, 6,004,555 und 6,093,399).
Eine Reihe geeigneter Zielmoleküle, die an Tumorendothel verfügbar sind, an normalem Endothel jedoch fehlen, ist beschrieben worden. Beispielsweise können exprimierte Ziele, wie etwa Endoglin, E-Selektin, P-Selektin, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, ein TIE, ein Ligand, der mit LAM-I reagiert, ein VEGF/VPF-Rezeptor, ein FGF-Rezeptor, α_vβ₃-Integrin, Pleiotropin oder Endosialin, verwendet werden (US-Patente 5,855,866, 5,877,289; Burrows et al., 1992; Burrows and Thorpe, 1993; Huang et al., 1997; Liu et al., 1997; Ohizumi et al., 1997).
Adsorbierte Ziele sind eine andere geeignete Gruppe, wie etwa VEGF, FGF, TGFβ, HGF, PF4, PDGF, TIMP, ein Ligand, der an ein TIE bindet oder eine Tumor-assoziierte Fibronektin-Isoform (US-Patente 5,877,289, 5,965,132 und 6,004,555). Fibronektin-Isoformen sind Liganden, welche an die Rezeptorfamilie der Integrine bindet. Tumor-assoziierte Fibronektin-Isoformen sind anzielbare Bestandteile sowohl der Tumorvaskulatur als auch des Tumorstromas. Der monoklonale Antikörper BC-1 (Carnemolla et al., 1989) bindet spezifisch an Tumor-assoziierte Fibronektin-Isoformen.
Andere Ziele, die durch die natürliche Tumorumgebung oder als Folge einer Intervention durch den Menschen induzierbar sind, sind ebenfalls anzielbare Einheiten, wie in den US-Patenten 5,776,427, 5,863,538 und 6,036,955 beschrieben. Wenn sie in Verbindung mit einer vorangehenden Suppression in normalen Geweben und einer Induktion in der Tumorvaskulatur verwendet werden, können auch MHC Klasse II-Antigene als Ziele eingesetzt werden (US-Patente 5,776,427, 5,863,538, 6,004,554 und 6,036,955).
Ein gegenwärtig bevorzugtes Ziel für klinische Anwendungen ist das vaskuläre endotheliale Adhäsionsmolekül-1 (vascular endothelial adhesion molecule-1, VCAM-1) (US-Patente 5,855,866, 5,877,289, 6,004,555 und 6,093,399). VCAM-1 ist ein Zelladhäsionsmolekül, das durch inflammatorische Zytokine IL-Iα, IL-4 (Thornhill et al., 1990) und TNFα (Munro, 1993) induziert wird, und dessen Rolle in vivo darin besteht, Leukozyten an Stellen von akuter Entzündung zu rekrutieren (Bevilacqua, 1993).
VCAM-1 ist auf vaskulären Endothelzellen bei einer Reihe menschlicher maligner Tumoren, einschließlich Neuroblastom (Patey et al., 1996), Nierenkarzinom (Droz et al., 1994), nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom (Staal-van den Brekel et al., 1996), Morbus Hodgkin (Patey et al., 1996) und Angiosarkom (Kuzu et al., 1993), ebenso wie in benignen Tumoren, wie etwa Angiom (Patey et al., 1996) und Hämangiom (Kuzu et al., 1993) vorhanden. Eine konstitutive Expression von VCAM-1 beim Menschen ist auf wenige Gefäße in der Schilddrüse, dem Thymus und der Niere (Kuzu et al., 1993; Bruijn and Dinklo, 1993) und bei der Maus auf Gefäße in Herz und Lunge (Fries et al., 1993) beschränkt.
Bestimmte der hier vorgestellten Ergebnisse unterstützen sogar jene, die durch die US-Patente 5,855,855, 5,877,289 und 6,004,555 vorgelegt werden, weiter und zeigen die selektive Induktion von Thrombose und Tumorinfarkt, die auf eine Verabreichung eines anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden zurückzuführen ist. Die vorgestellten Ergebnisse wurden durch Verwendung von Mäusen, welche menschliches Hodgkin-Lymphom L540 trugen, erzeugt. Wenn dieser Tumor als ein Xenograft in SCID-Mäusen gewachsen sind, zeigt er eine große Ähnlichkeit zu der menschlichen Erkrankung im Hinblick auf die Expression inflammatorischer Zytokine (Diehl et al., 1985) und das Vorhandensein von VCAM-1 und anderen Endothelzell-Aktivierungsmolekülen in seiner Vaskulatur.
Unter Verwendung eines kovalent gebundenen anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden, in dem tTF direkt mit dem anti-VCAM-1-Antikörper verbunden war, wird hier gezeigt, daß der Koaguligand selektiv zu Tumorgefäßen gelangt, in diesen Gefäßen eine Thrombose induziert, eine Nekrose verursacht, die sich im gesamten Tumor entwickelt, und das Tumorwachstum in Mäusen, die solide L540 Hodgkin-Tumoren tragen, verzögert. Tumoren müssen im allgemeinen eine Größe von mindestens ungefähr 0,3 cm im Durchschnitt aufweisen, um auf den Koaguliganden anzusprechen, da VCAM-1 in kleineren Tumoren fehlt. Vermutlich sind die Spiegel von Zytokinen, die durch Tumorzellen oder Wirtszellen, welche den Tumor infiltrieren, sezerniert werden, in kleinen Tumoren zu niedrig für eine VCAM-1-Induktion. Dies stimmt überein mit den Studien in den US-Patenten 5,855,866, 5,877,289, 5,776,427, 6,004,555 und 6,036,955, in denen gezeigt wird, daß die Erfindungen für größere solide Tumoren möglich sind.
Obwohl eine VCAM-1-Färbung zunächst eher in der Peripherie des Tumors beobachtet wurde, band der Koaguligand offensichtlich an Blut transportierende Gefäße und verschloß diese, da er in der Lage war, den Blutfluß in allen Tumorregionen abzuschneiden. Weiterhin zieht einer der Erfinder in Betracht, daß die Thrombinbildung, verursacht durch die anfängliche Verabreichung des Koaguliganden, wahrscheinlich zu weiterer VCAM-1-Induktion in zentralen Gefäßen führt (Sluiter et al., 1993), was zu einem amplifizierten Signal und offensichtlicher Zerstörung der Region im Tumorinneren führt. Diese Art von Koagulanz-induzierter Expression weiterer anzielbarer Marker und folglich eine Signal-Amplifikation wird ebenfalls in dem US-Patent 6,004,555 offenbart.
B. Mechanismus von VCAM-1-anzielender Tumorzerstörung
Obwohl, wie hier gezeigt, eine Lokalisierung an VCAM-1-exprimierenden Gefäßen im Herzen und in den Lungen von Mäusen nach Verabreichung eines anti-VCAM-1-Koaguliganden beobachtet wurde, induzierte dieses Konstrukt keine Thrombose an solchen nicht-Tumor-Stellen. Weiterhin war der anti-VCAM-1-Koaguligand für die Mäuse nicht stärker toxisch als dies eine Kontroll-Koaguligand von irrelevanter Spezifität war, was wieder darauf hinweist, daß die konstitutive Expression von VCAM-1 bei Herz- und Lungengefäßen nicht zu Toxizität führte. Dieses Ergebnis ist wichtig für den unverzüglichen klinischen Fortschritt der Koaguligand-Therapie, angesichts dessen, daß VCAM-1 ein natürlich vorkommender Marker des Tumorgefäßendothels beim Menschen ist. Allerdings bietet dieses Phänomen den Erfindern auch einen einzigartigen Einblick, der zu einem vollkommen anderen Ansatz für eine Zerstörung von Tumorvaskulatur führt.
Die Erfinder strebten danach, den Mechanismus hinter der Fähigkeit des anti-VCAM-1-Koaguliganden, an das in Blutgefäßen im Herzen und in den Lungen konstitutiv exprimierte VCAM-1 zu binden und trotzdem in diesen Gefäßen keine Thrombose zu verursachen, zu verstehen. Es gibt eine Vielzahl wissenschaftlicher Möglichkeiten für diese empirische Beobachtung, im allgemeinen verbunden mit der prothrombotischen Natur der Tumorumgebung, jeder fibrinolytischen Prädisposition im Herzen und in den Lungen.
Im allgemeinen herrscht ein biologisches Gleichgewicht zwischen dem Gerinnungssystem (Fibrinablagerung) und dem fibrinolytischen System (Abbau von Fibrin durch Enzyme). Bei einer malignen Erkrankung, insbesondere bei Karzinomen, entgleist dieses Gleichgewicht jedoch unterbrochen, was zu der abnormalen Aktivierung der Gerinnung führt (Hyperkoagulabilität oder das "prothrombotische Stadium"). Hinweise deuten auch darauf hin, daß verschiedene Bestandteile dieser Stoffwechselwege zu den in Unordnung geratenen Charakteristika einer Malignität, wie etwa Proliferation, Invasion und Metastase beitragen können (Zacharski et al., 1993).
Donati (1995) diskutiert zusammenfassund das komplexe Zusammenspiel zwischen den ursprünglichen klinischen Beobachtungen von thrombotischen Komplikationen maligner Erkrankungen und dem anschließenden Fortschritt in der Zellbiologie und Biochemie von Tumorzell-Aktivitäten. Trotz umfangreicher Forschung konnte jedoch eine eindeutige molekula re Erklärung für die prothrombotische Natur der Tumorumgebung nicht vorgelegt werden (Donati, 1995). Donati betonte jedoch die Rolle von Tumorzellen in diesem Prozeß. Erklärt wurde, daß Tumorzellen Prokoagulanz-Aktivitäten exprimieren, wie etwa Gewebe-Thromboplastin und Krebs-Prokoagulanz (cancer procoagulant, CP) (Donati, 1995). Die Offenlegungsschrift WO 91/07187 berichtet ebenfalls von einer Prokoagulanz-Aktivität von Tumorzellen.
Zahlreiche andere Studien haben ebenfalls die Tumorzellen selbst als verantwortlich für das prothrombotische Zustand innerhalb eines Tumors identifiziert. Beispielsweise berichteten Nawroth et al. (1988), daß ein Faktor/Faktoren, ausgearbeitet an Sarkomzellen, die Prokoagulanz-Antwort durch nahegelegenes Endothel auf TNF steigert. Diese Autoren berichteten, daß eine Fibrinbildung im gesamten Bett der Tumorvaskulatur 30 Minuten nach TNF-Infusion auftrat, Fibrinablagerung und Plättchenaggregate wurden jedoch in normaler Vaskulatur nicht beobachtet (Nawroth et al., 1988). Für TNF wurde später gezeigt, daß er die Expression von Gewebefaktor auf der Oberflächen von Endothelzellen erhöht (Murray et al., 1991). Dies wurde vorgeschlagen, um frühere Studien, die zeigten, daß kultivierte Endothelzellen, inkubiert mit rekombinantem TNF, eine erhöhte Prokoagulanz-Aktivität, vermehrten Gewebefaktor und damit einhergehend eine verstärkte Suppression des Protein C-Stoffwechselwegs, einem anti-thrombotischen Mechanismus, der auf der Oberfläche von ruhenden Endothelzellen wirkt, zu erklären (Nawroth et al., 1985; Nawroth and Stern, 1986).
Ergebnisse von Sugimura et al. (1994) deuteten ebenfalls Tumorzellen als Schlüsselbestandteile der Prokoagulanz-Aktivität des Tumors an. Berichtet wurde, daß vier Tumorzellinien in der Lage waren, verschiedene Stadien des extrinsischen Gerinnungswegs zu fördern (Sugimura et al., 1994). Eine andere Studie berichtete, daß eine menschliche Ovarial-Karzinomzellinie, OC-2008, oberflächen-membranäre Gewebefaktor-Aktivität konstitutiv exprimierte und Zelloberflächen-abhängige Prothrombinase-Komplex-Aktivität zeigte (Rao et al., 1992). Connor et al. (1989) schlugen weiterhin vor, daß es die pathologischen Zellen seien, welche eine Gerinnung kontrollieren. Deren Ergebnisse wiesen darauf hin, daß tumorigene, undifferenzierte Erythroleukämiezellen der Maus eine sieben- bis achtfache Steigerung der Wirksamkeit ihrer Prokoagulanz-Aktivität zeigten (Connor et al., 1989).
Zacharski et al. (1993) fokussierten ebenfalls auf Tumorzellen und suchten den Interaktionsmodus zwischen Ovarialkarzinomzellen und den Gerinnungs-(Prokoagulanz-initiiert) und Fibrinolyse (initiiert durch Urokinase-Typ Plasminogen-Aktivator, u-PA)-Stoffwechselwegen zu definieren. Sie berichteten, daß Tumorzellen Gewebefaktor und Zwischenprodukte des Gerinnungswegs exprimierten, was zu lokaler Thrombinbildung führte, wie durch die Umwandlung von Fibrinogen, vorhanden in Konnektivgewebe des Tumors, zu Fibrin, von dem gefunden wurde, das sich an den Oberflächen von Tumorknötchen und individuellen Tumorzellen festhält, nachgewiesen wurde. Nachgewiesenes Fibrin konnte dafür auf der Grundlage von Nekrose oder einem lokalen Infiltrat von Entzündungszellen nicht verantwortlich gemacht werden (Zacharski et al., 1993). Diese Autoren schlußfolgerten, daß es einen vorherrschenden Tumorzell-assoziierten Prokoagulanz-Stoffwechselweg gibt, der zu Thrombinbildung und Hyperkoagulabilität führt.
Andere Hypothesen haben vorgeschlagen, daß es Änderungen in den Tumorblutgefäßen sind, welche diese Gefäße besser in die Lage versetzen, die Bildung vom Thromben zu fördern und/oder weniger gut in die Lage zu versetzen, Fibrin aufzulösen. Beispielsweise wurde von Tumorgefäßen berichtet, daß sie eine Aufregulation von Gewebefaktor, eine Abregulation von Plasminogen-Aktivatoren und/oder eine Aufregulation des Inhibitors von Plasminogenaktivatoren, PAI-1, zeigen (Nawroth and Stern, 1986; Nawroth et al., 1988). Von solchen Wirkungen wird angenomnen, daß sie durch aus Tumoren stammenden Faktoren (Murray et al., möglicherweise VEGF, verstärkt werden. (1991; Ogawa et al., 1990).
Beispielsweise berichteten Ogawa et al. (1990), daß eine Hypoxie die Koagulanzeigenschaften der Endothelzelloberfläche zu einer Verschiebung veranlaßt, um eine Aktivierung der Gerinnung zu fördern. Dies wurde begleitet durch Suppression des Antikoagulanz-Cofaktors Thrombomodulin und Induktion eines Aktivators von Faktor X, entfernt von den klassischen extrinsischen und intrinsischen Systemen (Ogawa et al., 1990). Auch könnte es einen Anstieg der lokalen Konzentration der Faktoren VIIa, IXa, Xa oder anderer Moleküle, die mit TF interagieren, innerhalb der Tumorgefäße geben, wodurch eine Thrombose gefördert wird.
Zusätzlich sind Plättchen ein Hauptbestandteil jedes Prokoagulanzzustands. Kürzlich wurde eine Verbindung hergestellt zwischen dem prokoagulierenden Potential von Plättchen und ihrer Fähigkeit, prokoagulierende Mikropartikel von der Plasmamembran abzustoßen (Zwaal et al., 1989; 1992; Dachary-Prigent et al., 1996). Es ist vorgeschlagen worden, daß ein vergrößerter Anteil an zirkulierenden Mikropartikeln, Vesikeln oder Membranfragmenten von Plättchen zu „präthrombotischen" (prothrombotischen) Zuständen unter verschiedenen patho logischen Bedingungen beitragen (Zwaal et al., 1989; 1992; Dachary-Prigent et al., 1996, S. 159). McNeil et al., (1990) haben auch berichtet, daß β₂-GPI eine Vielzahl inhibitorischer Wirkungen auf die Gerinnung und Plättchenaggregation ausübt. Die Plättchenbiologie im Zusammenhang mit Tumoren könnte daher die Wirksamkeit des anti-VCAM-1-Koaguliganden erklären.
Weitere vertretbare Erklärungen schließen die einfache Möglichkeit ein, daß VCAM-1 in Tumorgefäßen in höheren Konzentrationen exprimiert wird als in Blutgefäßen in Herz und Lungen, wahrscheinlich aufgrund einer Induktion durch aus Tumoren stammenden Zytokinen, und daß ein Binden an die gesunden Gefäße das Gleichgewicht nicht in Richtung einer verlängerten Thrombose kippen kann. Auch die fibrinolytischen Mechanismen könnten im Herzen aufreguliert sein, wie durch erhöhten Gewebefaktor-Stoffwechselweg-Inhibitor (tissue factor pathway inhibitor, TFPI), erhöhte Plasminogen-Aktivatoren und/oder verminderte Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren verdeutlicht. Sollte sich die fibrinolytische Physiologie der Herz- und Lungengefäße als Hauptursache erweisen, die den tumorspezifischen Wirkungen des anti-VCAM-1-Koaguliganden unterliegt, würde dies allgemein die Entwicklung zusätzlicher Antitumortherapien, die auf einzigartige Aspekte der Tumorbiologie abzielen, ausschließen.
Trotz all der möglichen Optionen gehen die Erfinder davon aus, daß das Scheitern des anti-VCAM-1-Koaguliganden, Thrombose in Gefäßen von normalen Geweben auszulösen, auf die Abwesenheit des Aminophospholipids Phosphatidylserin (PS) auf der luminalen Oberfläche solcher Gefäße zurückzuführen ist. Um diese Theorie zu vervollständigen, würde für Phosphatidylserin deshalb nicht nur gezeigt werden müssen, daß es in diesen normalen Gefäßen fehlt, sondern auch sein Vorhandensein auf der luminalen Seite von tumorassoziierten Gefäßen würde überzeugend demonstriert werden müssen.
Die Erfinder verwendeten deshalb immunhistochemische Färbung, um die Verteilung eines Tumor-tragenden Mäusen intravenös injizierten monoklonalen anti-Phosphatidylserin-Antikörpers (anti-PS) zu beurteilen. Diese Studien ergaben, daß den VCAM-1-exprimierenden Gefäßen in Herzen und in Lunge PS fehlt, während die VCAM-1-exprimierenden Gefäße im Tumor PS exprimierten. Auf die Notwendigkeit einer PS-Oberflächen-Expression zur Koaguliganden-Aktivität weist weiter der Befund der Erfinder hin, daß Annexin V, das an PS bindet, die anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden-Aktivität sowohl in vitro als auch in vivo blockiert.
Das Fehlen einer thrombotischen Wirkung des anti-VCAM-1-Koaguliganden auf normale Herz- und Lungengefäße kann demnach mindestens teilweise folgendermaßen erklärt werden: Das Fehlen des Aminophospholipids, Phosphatidylserin bedeutet, daß den normalen Gefäßen eine prokoagulierend wirkende fehlt, auf der sich Koagulationskomplexe zusammensetzten können. In Abwesenheit von Oberflächen-PS bindet anti-VCAM-1·tTF an VCAM-1-exprimierende Herz- und Lungengefäße, ohne eine Thrombose induzieren zu können. Im Gegensatz dazu zeigen VCAM-1-exprimierende Gefäße im Tumor eine gleichzeitige Expression von Oberflächen-PS. Der Koaguligand bindet demnach an Tumorgefäße und aktiviert lokal Gerinnungsfaktoren, einen verschließenden Thrombus zu bilden.
Zusätzlich zum Aufzeigen der Tumor-spezifischen thrombotischen Wirkungen von anti-VCAM-1-Koaguliganden erlaubte die spezifische Expression des Aminophospholipids Phosphatidylserin auf der luminalen Oberfläche von Tumorblutgefäßen in früheren Studien den Erfindern auch, den beobachteten, jedoch nicht verstandenen prothrombotischen Phenotyp zu erklären (Zacharski et al., 1993; Donate, 1995). Die Untersuchungen der Erfinder zeigen, daß es die PS-Expression ist, die eine bedeutende Rolle für den prothtombotischen Zustand der Tumorvaskulatur führt, anstatt vorrangig auf Tumorzellen oder komplizierte Faktoren, Plättchen, proagulierende Mikropartikel oder Membranfragmente zurückzuführen zu sein, oder auf Ungleichgewichte bei Thromboplastin, Thrombomodulin, Krebs-Prokoagulanz, Gewebefaktor, Protein C-Stoffwechselweg, Plaminogen-Aktivatoren oder Plasminogen-Aktivator-Inhibitoren (z.B. PAI-1) zurückzuführen zu sein.
C. Aminophospholipide als Marker der Tumorvaskulatur
Nach ihrer Entdeckung, daß das typische Aminophospholipid Phosphatidylserin spezifisch auf der luminalen Oberfläche von Tumorblutgefäßen, nicht jedoch in normalen Blutgefäßen exprimiert wurde, waren die Erfinder davon überzeugt, daß Aminophospholipide ein Potential als Ziele zur therapeutischen Intervention aufwiesen. Die vorliegende Erfindung umfaßt deshalb ein Anzielen der Aminophospholipid-Bestandteile, insbesondere Phosphatidylserin (PS) und Phosphatidylethanolamin (PE) in der Tumorbehandlung. Obwohl Antitumorwirkungen durch ein Anzielen von Aminophospholipiden unter Einsatz etablierter Tiermodelle aufge zeigt werden, konnte die Fähigkeit von Aminophospholipiden als sichere und wirksame anzielbare Marker der Tumorvaskulatur nicht aufgrund früherer Studien vorhergesagt werden.
Obwohl beispielsweise Tumorgefäße im Gegensatz zu anderen Blutgefäßen im allgemeinen von Natur aus prothrombotisch sind, ist es eine dem Tumor innewohnende Eigenschaft, ein Netzwerk von Blutgefäßen zu erhalten, um Sauerstoff und Nährstoffe an die Tumorzellen abzugeben. Offensichtlich können tumorassoziierte Blutgefäße gegenüber einer Thrombose nicht derart prädisponiert sein, daß sie spontan und leicht eine Gerinnung unterstützen, da solch eine Gerinnung notwendigerweise den Tumor zur Selbstzerstörung führen würde. Demnach ist unerwartet, daß für jeden Thrombose-assoziierten Tumorgefäßmarker, wie etwa das jetzt identifizierte Phosphatidylserin, entdeckt werden könnte, daß es in Mengen exprimiert wird, die ausreichen, um eine wirksame therapeutische Intervention durch Anzielen zu erlauben, und trotzdem in Konzentrationen exprimiert wird, die niedrig genug sind, um den Blutfluß durch den Tumor gewöhnlich aufrechtzuerhalten.
Die vorliegende Identifizierung von Aminophospholipiden als sichere und wirksame Tumorvaskulatur-Ziele ist sogar noch überraschender angesichts (1) der früheren Spekulationen hinsichtlich der Rolle anderer Zelltypen und/oder verschiedener Faktoren, Aktivatoren und Inhibitoren, die dem komplexen prothrombotischen Zustand des Tumors (wie oben diskutiert) zugrunde liegen, und (2) des verwirrenden und widersprüchlichen Stands der Technik der die Aminophospholipid-Biologie sowohl in Bezug auf die Expression als auch die Funktion in verschiedenen Zelltypen betrifft.
Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin sind normalerweise bei verschiedenen Zellen auf die innere Oberfläche der Plasmamembran-Doppelschicht beschränkt (Gaffet et al., 1995; Julien et al., 1995). Im Gegensatz dazu ist das äußere Blatt der Membrandoppelschicht reich an Phosphatidylcholin-Analoga (Zwaal et al., 1989; Gaffet et al., 1995). Diese Lipidtrennung schafft eine asymmetrische Transdoppelschicht. Obwohl die Existenz einer Membranasymmetrie gelegentlich diskutiert worden ist, werden die Ursache für ihre Existenz und die Mechanismen ihrer Entstehung und Kontrolle wenig verstanden (Williamson and Schlegel, 1994), insbesondere bei anderen Zellen als Plättchen.
Es gibt sogar eine Vielzahl widersprüchlicher Berichte bezüglich des Vorhandenseins oder des Fehlens von PS und PE in verschiedenen Zellen und Geweben, erst recht bezüglich der wahrscheinlichen Rolle, die diese Aminophospholipide spielen können. Beispielsweise haben die vielen Studien zu PS, durchgeführt mit Plättchen, den Schlüsselbestandteilen in der Blutgerinnung (Dachary-Prigent et al., 1996), höchst wechselhafte Ergebnisse geliefert. Brevers et al. (1982) maß die Prothrombin-umsetzende Plättchenaktivität von nicht-aktivierten Plättchen nach Behandlung mit verschiedenen Phospholipasen oder proteolytischen Enzymen. Sie schlußfolgerten, daß negativ geladenes Phosphatidylserin und möglicherweise Phosphatidylinositol an der Prothrombin-umsetzenden Aktivität von nicht-aktivierten Plättchen beteiligt sind (Bevers et al., 1982).
Bevers et al. (1983) berichteten dann von einer erhöhten Exposition von Phosphatidylserin und einer verminderten Exposition von Sphingomyelinase in aktivierten Plättchen. Diese Änderungen waren jedoch in viel geringerem Maße offensichtlich bei Plättchen, die entweder nur durch Thrombin oder durch Kollagen aktiviert wurden, im Gegensatz zu Kollagen plus Thrombin, Diamid oder einem Kalzium-Ionophor (Bevers et al., 1983). Die Oberflächenexpression von PS als Antwort auf Diamid stand im Widerspruch zu Studien an Erythrozyten, die keine Diamid-stimulierte PS-Exposition zeigten (de Jong et al., 1997). Während sie ihre früheren Ergebnisse wiederholten, berichteten Bevers und Kollegen später, daß Veränderungen in der Plasmamembran-Zytoskelett-Interaktion, insbesondere ein gesteigerter Abbau von Zytoskelett-Aktin-bindendem Protein, für Veränderungen der Plättchenoberfläche wichtig waren (Brevers et al., 1985, S. 368-369).
Maneta-Peyret et al., (1989) berichteten ebenfalls von dem Nachweis von PS auf menschlichen Plättchen. Diese Autoren stellten fest, daß die prokoagulierende Plättchenoberfläche durch negativ geladene Phospholipide, wie etwa Phosphatidylserin, und Phosphatidylethanolamin (im allgemeinen neutral und zwitterionisch) oder beiden gebildet werden konnte. Die Rolle von Phosphatidylserin im Gerinnungsprozeß ist zugunsten von Phosphatidylethanolamin in Frage gestellt worden (Maneta-Peyret et al., 1989; Schick et al., 1976; 1978). Beispielsweise haben Studien berichtet, daß 18% von Phosphatidylethanolamin nach 2 Stunden auf der Oberfläche zugänglich werden im Gegensatz zu 0% Phosphatidylserin (Schick et al., 1976).
Von laufenden Studien mit Plättchen, die einen weiteren Anstieg von 16% der Phosphatidylethanolamin-Exposition nach Thrombinbehandlung ohne Anstieg der Phosphatidylserin-Spiegel zeigen, wurde ebenfalls berichtet (Schick et al., 1976). Deshalb wurde von PS be hauptet, kein Bestandteil der funktionellen Oberfläche der Plättchen-Plasmamembran zu sein (Schick et al., 1976; 1978). Nichtsdestotrotz scheinen gegenwärtige Hinweise durchaus darauf hinzudeuten, daß sowohl PS als auch PE an der, in der äußeren Membran von Plättchen und Erythrozyten beobachteten Phospholipid-Asymmetrie beteiligt sind, und daß PS an der Prokoagulanz-Aktivität von Plättchen beteiligt ist (Gaffet et al., 1995; de Jong et al., 1997; US-Patent 5,627,036).
Die Mechanismen zum Erreichen und Aufrechterhalten einer differentiellen Aminophospholipid-Verteilung, erst recht die funktionelle Bedeutung dieses Vorgehens, ist lange Gegenstand kontroverser Spekulationen gewesen. Beim Besprechen der Regulation von Transdoppelschicht-Phospholipidbewegung gaben Williamson und Schlegel (1994) zu verstehen, daß ein Erhöhen des intrazellulären Ca²⁺ den Hauptklassen von Phospholipiden erlaubt, sich frei durch die Doppelschicht zu bewegen, wobei sie die Lipide durcheinanderbringen und die Asymmetrie auflösen. De Jong et al., (1997) berichteten auch, daß ein Anstieg von intrazellulärem Kalzium zu einem raschen Durcheinanderbringen der Lipiddoppelschicht und zu der Exposition von PS führt, was teilweise durch zelluläre Oxidation gehemmt werden konnte. Die Interaktion von Aminophospholipiden mit Zytoskelettproteinen ist ebenfalls als ein Mechanismus zur Regulierung der Membranphospholipid-Asymmetrie vorgeschlagen worden (Zwaal et al., 1989).
Gaffet et al., (1995) stellten fest, daß die transversale Umverteilung von Phospholipiden während der Aktivierung menschlicher Plättchen durch einen vektoriellen Ausstrom von Aminophospholipiden erreicht wird, der nicht durch einen raschen reziproken Einstrom von Phospholipiden mit Cholin-Kopfgruppen ausgeglichen wird, d.h. kein Durcheinander auftritt. Sie schlugen vor, daß der spezifische vektorielle Ausstrom von Aminophospholipiden katalysiert sein könnte durch eine "reverse Aminophospholipid-Translokase"-Aktivität (Gaffet et al., 1995). Eine alternative Hypothese wäre, daß die Aktivität einer nach innen gerichteten Translokase gehemmt wurde. Zwaal et al. (1989) schlugen die Beteiligung einer Phospholipid-Translokase, die sowohl die nach außen als auch nach innen gerichtete Bewegung von Aminophospholipiden katalysiert, vor.
Das Vorhandensein einer Energie- und Protein-abhängigen Aminophospholipid-Translokase-Aktivität, die Phosphatidylethanolamin von dem äußeren zum inneren Blatt der Lipiddoppelschicht transportiert, wurde durch Julien et al. (1993) berichtet. Sie zeigten dann, daß die Aminophospholipid-Translokase-Aktivität auch Phosphatidylserin transferieren konnte, und daß die Aktivität in Abhängigkeit von den Bedingungen der Zellinkubation aufrechterhalten, supprimiert und wiederhergestellt (Julien et al., 1993) und durch den Tumorpromotor 12-O-Tetradekanoylphorbol-13-Acetat (TPA) inhibiert werden konnte (Julien et al., 1997).
Eine 35 kD-Phospholipid-Scramblase, welche die Ca²⁺-abhängige bidirektionale Bewegung von Phosphatidylserin oder anderen Phospholipiden fördert, wurde kürzlich aus einer cDNA-Bibliothek kloniert (Zhou et al., 1997). Dieses "PL-Scamblase"-Protein ist ein Protein-reiches Typ II-Plasmamembranprotein mit einem einzelnen transmembranären Segment in der Nähe des C-Terminus. Anschließende Studien bestätigten, daß dieses Protein für die rasche Bewegung von Phospholipiden von den inneren zu den äußeren Plasmamembranblättern in Zellen, die erhöhten zytosolischen Kalziumkonzentrationen ausgesetzt waren, verantwortlich war (Zhao et al., 1998).
Die Aminophospholipid-Translokase-Aktivität, von der Julien et al. (1993; 1997) berichten, welche PS und PE von dem äußeren zum inneren Blatt transportiert, unterscheidet sich von der Ca²⁺-abhängigen bidirektionalen Scramblase (Zhou et al., 1997; Zhao et al., 1998). Die Scramblase wird durch Ca²⁺ aktiviert und bewegt meistens PS vom inneren zum äußeren Blatt als Antwort auf erhöhte Ca²⁺-Spiegel. Jetzt wird allgemein angenommen, daß die Aminophospholipid-Translokase die Membran-Asymmetrie unter normalen Bedingungen aufrechterhält, daß jedoch die Scramblase durch Ca²⁺-Einstrom aktiviert wird, wodurch die Translokase und die zufällige Aminophospholipid-Verteilung aufgehoben wird.
Die normale Aufteilung von PS und PE auf die innere Oberfläche der Plasmamembran wird daher jetzt allgemein akzeptiert, und bestimmte, an dem asymmetrischen Prozeß beteiligte Membranbestandteile sind identifiziert worden. Allerdings bestehen Zweifel an den Bedingungen, Mechanismen und Zelltypen, die in der Lage sind, Aminophospholipide in das äußere Blatt der Membran zu verlegen, und an den biologischen Auswirkungen derartiger Vorgänge.
Widersprüchliche Berichte hinsichtlich einer Aminophospholipid-Expression sind nicht auf Studien an Plättchen begrenzt. Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin machen im allgemeinen ungefähr 7% bzw. ungefähr 10% der Phospholipid-Zusammensetzung kultivierter menschlicher Endothelzellen aus der menschlichen Arterie, der Stammvene und Nabel schnurvene (7,1% bzw. 10,2%) aus (Murphy et al., 1992). Allerdings betrifft ein wichtiges Beispiel für die Widersprüche in der Literatur die Fähigkeit von anti-PS-Antikörpern, an Endothelzellen zu binden (Lin et al., 1995).
Von den anti-PS-Antikörpern, die bei wiederholten Fehlgeburten auftreten (Rote et al., 1995; Rote, 1996; Vogt et al., 1996; 1997), wird angenommen, daß sie die Endothelzellfunktion modulieren, ohne Beweis auf ein Binden an Endothelzellen. In einem Versuch, diese Diskrepanz zu erklären, versuchten Lin et al. (1995) eine anti-PS-Antikörper-Bindung an ruhende Endothelzellen zu zeigen, scheiterten jedoch. Sie schlußfolgerten, daß PS-antigene Determinanten auf der Oberfläche ruhender Endothelzellen nicht exprimiert werden, obwohl eine PS-abhängige antigene Determinante mit Zytoskelett-artigen Bestandteilen in Aceton-fixierten Zellen assoziiert wrar (Lin et al., 1995).
Van Heerde et al. (1994) berichteten, daß vaskuläre Endothelzellen in vitro die Bildung von Thrombin durch die Expression von Bindungsstellen, an denen sich Prokoagulanz-Komplexe zusammensetzen können, katalysieren können. Im Gegensatz zu anderen Studien mit aktivierten Plättchen (Bevers et al., 1982; 1983; 1985; Maneta-Peyret et al., 1989; Schick et al., 1976; 1978) zeigten stimulierte HUVEC-Endothelzellen keinen Anstieg der PS-Bindungsstellen im Vergleich zu ruhenden Zellen (Van Heerde et al., 1994). Von Phosphatidylserin wurde berichtet, das es zur Faktor Xa-Bildung über den extrinsischen ebenso wie den intrinsischen Weg nötig ist (Van Heerde et al., 1994). Nichtsdestotrotz veröffentlichten Brinkman et al. (1994) entgegengesetzte Ergebnisse, die zeigen, daß andere Membranbestandteile neben negativ geladenen Phospholipiden an einer Endothelzell-vermittelten intrinsischen Aktivierung von Faktor X beteiligt sind.
Ravanat et al. (1992) studierten ebenfalls das katalytische Potential von Phospholipiden in Pro- und Antikoagulanz-Reaktionen in gereinigten Systemen und auf der Oberfläche von Endothelzellen in Kultur nach einer Stimulation. Ihre scheinbar widersprüchlichen Ergebnisse haben nahegelegt, eine Rolle für Phospholipid-abhängige Mechanismen sowohl bei der Proagulanz-Gewebefaktor-Aktivität als auch bei Antikogulanzaktivitäten (Aktivierung von Protein C durch den Thrombin-Thrombomodulin-Komplex und durch Faktor Xa) zu bestätigen (Ravanat et al., 1992). Von den Ergebnissen von Ravanat et al. (1992) wurde auch behauptet, Beweise einer Phospholipid-Exposition während der Aktivierung humaner Endothelzellen zu erbringen, was durch Van Heerde et al. (1994) oder Brinkman et al. (1994) nicht beobachtet wurde. Allerdings merkten sie an, daß anionische Phospholipide von beschränkter Zugänglichkeit in der Nähe von zellulärem Gewebefaktor sind. Die Situation wird weiter dadurch kompliziert, daß, selbst nach Gewebefaktor-Induktion, andere Vorgänge für eine Gerinnung wahrscheinlich notwendig sind, da der Gewebefaktor zugänglich bleibt.
Ravanat et al. (1992) fuhren fort, nahezulegen, daß dasunterschiedliche Ausmaß der Hemmung von Gewebefaktor- und Thrombomodulin-Aktivitäten bei stimulierten Endothelzellen bedeutet, daß die Cofaktor-Umgebungen sich für eine optimalen Expression dieser gegensätzlichen zellulären Aktivitäten unterscheiden. Allerdings eröffneten die zuerkannten Schwierigkeiten beim Versuchen, die exakten zellulären Phospholipid-Umgebungen zu reproduzieren (Ravanat et al., 1992), die Möglichkeit von Artfakten aus diesen in vitro-Studien. Unabhängig von den Ergebnissen von Ravanat et al. (1992) wird tatsächlich im allgemeinen anerkannt, daß eine aussagekräftige Information bezüglich der Tumorbiologie, und insbesondere einer therapeutischen Intervention nur von in vitro-Studien an Tumor-tragenden Tieren in Erfahrung gebracht werden kann, wie etwa jenen, die durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden.
Zusätzlich zu den Diskrepanzen hinsichtlich einer Aminophospholipid-Expression, wie oben diskutiert, gibt es sich widersprechende Berichte auch bezüglich der Funktion von Aminophospholipiden in verschiedenen Zelltypen. Obwohl jetzt allgemein anerkannt ist, daß eine PS-Expression durch aktivierte Plättchen mit der prokoagulierend-wirkenden Oberfläche verbunden ist, haben Zwaal et al. (1989) in einer Diskussion über die physiologische Bedeutung der Membranphospholipid-Asymmetrie in Plättchen und roten Blutzellen andere wichtige Funktionen hervor. Darüber hinaus stellten Toti et al. (1996) fest, daß die physiologischen Auswirkungen eines Verlusts an asymmetrischer Phospholipid-Verteilung bei anderen Zelltypen als Blutzellen wenig verstanden sind.
Zwaal et al. (1989) stellen fest, daß die Membranphospholipid-Asymmetrie bei Plättchen und roten Blutzellen zunichte gemacht wird, wenn die Zellen auf verschiedene Arten aktiviert werden, wahrscheinlich vermittelt durch gesteigerte Transdoppelschicht-Bewegung von Phospholipiden. Es wurde erklärt, daß diese Veränderungen, gekoppelt mit der Freitsetzung von abgestoßenen Mikropartikeln, eine Rolle bei lokalen Blutverklumpungsreaktionen spielen. Von einem ähnlichen Phänomen wurde beschreiben, das in sichelförmigen roten Blutzellen auftritt: Phospholipid-Vesikel, die von reversibel sichelförmigen Zellen abbrechen, tragen zur intravaskulären Blutgerinnung in der kritischen Phase einer Sichelzellanämie bei (Zwaal et al., 1989).
Sowohl Zwaal et al. (1989) als auch Williamson und Schlegel (1994) haben angegeben, daß die physiologische Bedeutung von Phospholipid-Oberflächenänderungen nicht auf die Hämostase begrenzt ist. Tatsächlich wurde von der Oberflächenexposition von PS durch Blutzellen behauptet, daß sie ihre Erkennung durch das retikuloendotheliale System erheblich verändert, und daß sie wahrscheinlich mindestens einen Teil der homöostatischen Mechanismen zur Klärung von Blutzellen aus der Zirkulation repräsentiert (Zwaal et al., 1989). Demnach fungiert PS als ein Signal für die Eliminierung aktivierter Plättchen, nachdem die Blutung aufgehört hat. Eine Erkennung von PS, das auf Sichelzellen und von Malaria-infizierten Zellen exponiert wurde, durch Phagozyten und Makrophagen erklärt deren pathophysiologischen Gegenwirkungen (Zwaal et al., 1989). Weiterhin markiert eine PS-abhängige Phygozytose viral infizierte Zellen für eine phagozytische Aufnahme (WO 97/17084). Die Oberflächenexpression von Aminophospholipiden könnte einer Zelle auch eine "Fusionskompetenz" verleihen (Williamson and Schlegel, 1994).
Williamson und Schlegel (1994) spekulierten auch, daß es eine mehr allgemeine raison d'être für eine Lipid-Asymmetrie gibt. Obwohl beispielsweise die verschiedenen Kopfgruppen die meiste Aufmerksamkeit erhalten haben, könnte gut sein, daß eine Fettsäure-Asymmetrie der wichtige Faktor ist (Williamson and Schlegel, 1994). Eine weitere Hypothese ist, daß die asymmetrische Verteilung von Transdoppelschicht-Phospholipiden keine Funktion in sich selbst hat, daß es jedoch der dynamische Prozeß einer Lipidbewegung ist, der für biologische Systeme wichtig ist (Williamson and Schlegel, 1994).
Viele Gruppen haben berichtet, daß Tumorzellen für die Prothrombinase-Aktivität des Tumors verantwortlich sind (Connor et al., 1989; Rao et al., 1992; Zacharski et al., 1993; Sugimura et al., 1994; Donati, 1995). Es könnte geschlußfolgert worden sein, daß die auf PS zurückzuführen ist (WO 91/07187). Die Ergebnisse von Sugimura et al. (1994) argumentieren jedoch dagegen: sie berichteten, daß, obwohl sowohl die Prothrombinase-Aktivität als auch die Proagulanz-Gesamtaktivität der tumorigenen Zellen HepG2 und MKN-28 bei Erreichen von Konfluenz abfielen, die PS-Spiegel konstant blieben.
Anstelle einer Rolle für Tumorzell-PS bei der Prothrombinase-Aktivität zu unterstützen, schlugen Connor et al. (1989) vor, daß die gesteigerte Expression von PS in tumorigenen Zellen für ihre Fähigkeit, von Makrophagen erkannt und gebunden zu werden, bedeutsam ist. Utsugi et al. (1991) schlugen gleichermaßen vor, daß die Anwesenheit von PS in der äußeren Membran von menschlichen Tumorzellen ihre Erkennung durch Monozyten erklärt.
Jamasbi et al. (1994) schlugen eine völlig andere Rolle der Lipidbestandteile in tumorigenen Zellen vor, wobei sie vorschlugen, daß die Lipide mit einer Tumorantigen-Zugänglichkeit interferieren. Demnach würden Tumorzellipide wirken, um das Tumorzell-Oberflächenantigen(e) zu modifizieren, wodurch die Tumorzellen vor einer immunen Zerstörung durch den Wirt geschützt werden (Jamasbi et al., 1994). Diese Hypothese ist nicht unwahrscheinlicher als die in Bezug auf Endothelzellen von Qu et al. (1996) vorgeschlagene. Diese Autoren zeigten, daß T-Zellen an Thrombin-behandelte menschliche Nabelschnurendothelzellen aufgrund einer Bindung an PS adhärieren (Qu et al., 1996).
Deshalb wurde vorgeschlagen, daß eine PS-vermittelte T-Zell-Adhäsion an Endothelzellen in vivo sowohl für die Immunüberwachung als auch für die Erkrankungprozesse einer Adherosklerose wichtig ist (Qu et al, 1996; Moldovan et al., 1994). Bombeli et al. (1997) und Flynn et al. (1997) haben auch vorgeschlagen, daß Zellen innerhalb Atherosklerotischer Plaques zum Fortschreiten der Erkrankung beitragen können, indem PS exponiert wird, obwohl dies ausschließlich auf in vitro-Studien beruhte. Qu et al. (1996) und Moldovan et al. (1994) deuteten sogar einen Ansatz an, der dem der vorliegenden Erfindung entgegengesetzt ist, d.h. die Manipulation von Phosphatidylserin-Interaktionen als einem Antikoagulanz-Ansatz. Die US-Patente 5,658,877 und 5,296,467 haben Annexin (oder „Annexine") zur Verwendung als anti-Endotoxine und Antikoagulanzien vorgeschlagen. Das US-Patent 5,632,986 schlägt die Verwendung des Phosphatidylserin-bindenden Liganden Annexin V als ein Konjugat mit einem Bestandteil, wie etwa Urokinase, das Thromben lysiert, vor.
Toti et al. (1996) schlugen vor, daß das Scott-Syndrom, eine erbliche Gerinnungsstörung, die Deletion oder Mutation einer putativen äußeren Phosphatidylserin-Translokase oder "Scramblase" widerspiegeln könnte. Obwohl dies eine interessante Auffassung ist, isolierten Stout et al.(1997) später ein Membranprotein aus Scott-Erythrozyten, das normale PL-Scramblase-Aktivität zeigte, wenn es in Vesikeln mit exogenen PLs rekonstituiert wurde. Vorgeschlagen wurde, daß der Defekt beim Scott-Syndrom mit einer veränderten Interaktion von Ca²⁺ mit PL-Scramblase auf der nach innen gewandten Oberfläche der Zellmembran zusammenhängt, was entweder auf eine intrinsische Behinderung des Proteins, welche eine Interaktion mit Ca²⁺ in situ verhütet, zurückzuführen ist oder auf einen nicht identifizierten Inhibitor oder Cofaktor in der Scott-Zelle, der durch Detergenz dissoziiert wird, zurückzuführen ist (Stout et al., 1997).
Wechselhafte Ergebnisse wurden in Verbindung mit der möglichen Rolle von PS bei Apoptose berichtet. Williamson und Schlegel (1994) diskutierten das Thema PS als einen Marker des programmierten Zelltods (programmed cell death, PCD oder Apoptose). Allgemein akzeptiert ist, daß der programmierte Zelltod wenigstens im hämatopoetischen System die phagozytische Aussonderung der apoptotischen Zellen vor dem Verlust der Membranintegrität oder einem "Zerreißen" erfordert. Der Verlust der Membran-Asymmetrie in apoptotischen Zellen und insbesondere das Auftreten von PS im äußeren Blatt wurde als der Auslöser für ihre Erkennung durch phagozytische Makrophagen vorgeschlagen (Williamson and Schlegel, 1994).
Martin et al. (1995) berichteten weiterhin, daß eine PS-Externalisierung ein frühes und weit verbreitetes Ereignis während der Apoptose von verschiedenen Zelltypen des Menschen und der Maus sei, ohne Rücksicht auf den auslösenden Stimulus. Sie deuteten auch an, daß unter Bedingungen, unter denen morphologische Kennzeichen einer Apoptose unterbunden waren (makromolekulare Synthesehemmung, Überexpression von Bcl-2 oder Abl), das Auftreten von PS auf dem äußeren Blatt der Plasmamembran in ähnlicher Weise verhütet wurde (Martin et al., 1995).
Andere Analysen (Vermes et al., 1995) dagegen argumentieren zum Teil gegen die Vorschläge von Williamson und Schlegel (1994) und Martin et al. (1995). Obwohl diese Autoren angeben, daß die Translokation von PS auf die äußere Membranoberfläche ein Apoptosemarker sei, schlußfolgern sie, daß dies für die Apoptose nicht einzigartig sei, sondern auch während einer Zellnekrose auftritt. Der Unterschied zwischen diesen beiden Formen von Zelltod ist der, daß während der anfänglichen Stadien einer Apoptose die Zellmembran intakt bleibt, während genau zu dem Zeitpunkt, zu dem eine Nekrose auftritt, die Zellmembran ihre Integrität verliert und durchlässig wird. Gemäß dieser Schlußfolgerung zeigt eine PS-Expression auf der Zelloberfläche deshalb nicht eine Apoptose an, ohne daß ein Farbstoff Ausschlußtest durchgeführt worden ist, um die Zellmembranintegrität festzustellen (Vermes et al., 1995).
Nichtsdestotrotz scheint der Hauptteil an Literatur von vor der vorliegenden Erfindung zu zeigen, daß das Auftreten von PS auf der äußeren Oberfläche einer Zelle ein apoptotisches Signal identifiziert und einen Verdau dieser Zelle signalisiert (Hampton et al., 1996; WO 95/27903). Hampton et al. (1996) schlußfolgerten, daß während eine Erhöhung von intrazellulärem Ca²⁺ bei den untersuchten Zellen ein unwirksamer Auslöser einer Apoptose war, extrazelluläres Ca²⁺ für eine wirksame PS-Exposition während einer Apoptose erforderlich. Im Gegensatz dazu würde der Vorschlag von Martin et al. (1995), daß eine Aktivierung einer Innenseite/Außenseite-PS-Translokase ein frühzeitig weitreichendes Geschehen während einer Apoptose ist, scheinbar mindestens etwas intrazelluläres Ca²⁺ benötigen (Zhou et al., 1997; Zhao et al., 1998).
Blankenberg et al. (1998) berichteten erst kürzlich, daß Annexin V, ein endogenes menschliches Protein mit einer hohen Affinität zu PS, eingesetzt werden kann, damit es sich an Stellen eines apoptotischen Zelltod in vivo anreichert. Radioaktiv markiertes Annexin V gelangte an Stellen einer Apoptose in drei Modellen, einschließlich einer akuten Herzabstoßung vom Allograft-Typus (Blankenberg et al., 1998). Ein Anfärben von Herz-Allografts auf exogen verabreichtes Annexin V zeigte Myozyten in der Peripherie mononukleärer Infiltrate, von denen nur wenige positive apoptotische Kerne zeigten.
Schließlich ist die Transdoppelschicht-Bewegung von Phospholipiden in der Plasmamembran sogar in Spermienzellen des Schafs analysiert worden, bei denen das Auftreten einer quer verlaufenden Aufteilung von Phospholipiden mit dem Fertilisationsprozeß in Zusammenhang gebracht worden ist (Müller et al., 1994). Eine Phospholipid-Asymmetrie hat dann wachsende Aufmerksamkeit erhalten, obwohl ein eindeutiges Verständnis dieses Phänomens oder sein Bezug zu Gesundheit oder Krankheit nicht erkannt worden ist.
Unabhängig von dem verwirrenden Stand der Technik hinsichtlich der Aminophospholipid-Biologie, entdeckten die Erfinder der vorliegenden Erfindung im Rahmen kontrollierter in vivo-Studien, daß Aminophospholipide, wie etwa PS und PE, spezifische Marker von Tumorblutgefäßen waren. Dies ist überraschend unter dem Gesichtspunkt der früheren Studien einer Aminophospholipid-Funktion, insbesondere jenen, die zeigten, daß die Zelloberflächenexpression von PS durch ein Binden zirkulierender Zellen begleitet wird, wie etwa T-Zellen (Qu et al., 1996), Makrophagen (Connor et al., 1989), Monozyten (Utsugi et al., 1991) oder Phagozyten (Zwaal et al., 1989; Williamson und Schlegel, 1994), und daß sie ein Marker für apoptotische Zellen ist (Hampton et al., 1996; Martin et al., 1995; Zhou et al., 1997; Zhao et al., 1998).
Vor dieser Erfindung wäre die Möglichkeit, Aminophospholipide als anzielbare Marker bei irgendeiner Erkrankung, abgesehen von Tumorvaskulatur, zu verwenden aufgrund der wahrgenommenen Maskierung dieser Moleküle durch die Bindung einer oder mehrerer Zelltypen oder deren transiente Expression vor einem Apoptosetod, wahrscheinlich nicht berücksichtigt worden. Tatsächlich haben spekulative Vorschläge die Zerstörung von PS-Zellinteraktionen, wie etwa beim Unterbinden einer Leukozytenbindung, einem anfänglichen Ereignis bei der Atherosklerose betroffen (Qu et al., 1996).
Andere überraschende Aspekte dieser Entdeckung sind in einem Vergleich mit einer früheren Arbeit, welche das Abstoßen prokoagulierender Mikropartikel von Plasmamembranen und die Ausgrenzung von Zellen zur Phagozytose betraf (WO 97/17084), offensichtlich. Zwaal et al. (1989; 1992) und Dachary-Prigent et al. (1996) erklärten, daß eine PS-Translokation an die Plasmamembran gefolgt wird durch eine Freisetzung von Mikropartikeln, Mikrovesikeln oder Mikrosphären durch die Zellen. Zwaal et al. (1989) und Williamson und Schlegel (1994) gaben an, daß eine PS-Oberflächenexpression eine Klärung durch das Retikuloendotheliale System veranlaßt. Angesichts dieser Schicksale von PS-exprimierenden Zellen und den verschiedenen dokumentierten Doppelschicht-Translokaseaktivitäten (Julien et al., 1995; Zhou et al., 1997; Zhao et al., 1998) ist überraschend, daß Zelloberflächen-Aminophospholipide, wie etwa PS und PE, statische und ausreichende stabile Marker bilden, um eine Antikörper-Lokalisierung und -Bindung zu ermöglichen.
Vor der vorliegenden Erfindung gab es zunehmende Hinweise, daß Oberlächen-PS als Teil des apoptotischen Prozesses auftritt, wodurch die Zellen zur raschen Zerstörung markiert werden (Hampton et al., 1996; Martin et al., 1995). Obwohl für eine Verwendung als ein diagnostischer Marker für bestimmte Erkrankungsstadien, wie etwa eine Transplantatabstoßung (Blankenberg et al., 1998) vernünftig, würde die offensichtlich beschränkte Lebensdauer von Oberfläche-PS vor dessen Verwendung als ein realisierbarer Marker zum Anzielen bei einer therapeutischen Intervention warnen.
Nichtsdestotrotz entdeckte die vorliegende Studie tatsächlich, daß Aminophospholipide Marker von Endothelzellen der Tumorvaskulatur sind, die zum Anzielen geeignet sind. Nach dem Postulieren, daß eine PS-Expression für eine VCAM-Koaguliganden-Aktivität notwendig war, wurde das Auftreten von PS in Tumorblutgefäßen, jedoch nicht in normalen Gefäßen, in vivo demonstriert. Die Beobachtungen in vivo erlaubten den Erfindern, die Sicherheit und Wirksamkeit der anti-VCAM-Koaguliganden zu erklären. Dies ist zurückzuführen auf das Erfordernis einer gleichzeitig auftretenden Expression eines angezielten Markers (z.B. VCAM) und von PS auf dem Tumorendothel. Selbst wenn das Zielmolekül auf Endothel unter normalen oder pathologischen Bedingungen vorhanden ist, wird eine Thrombose nicht die Folge sein, wenn eine Oberflächen-PS-Expression fehlt.
Der Wert der vorliegenden Erfindung ist weder auf ein Erklären einer Koaguliganden-Wirkung beschränkt, noch auf die überraschende Entwicklung von Therapien mit nackten Antikörpern Diese Entdeckungen haben es den Erfindern ermöglicht, erstmals zu zeigen, daß eine PS-Translokation bei Endothelzellen ohne signifikante Zellschädigung oder Zelltod auftreten kann (Beispiel XIV). In dem Modell der Erfinder tritt die Translokation von PS auf die Oberfläche von Endothelzellen von Tumorblutgefäßen mindestens zu einem erheblichen Teil unabhängig von Mechanismen einer Apoptose oder anderen Arten von Zelltod auf. Folglich ist eine PS-Oberflächenexpression in der Tumorumgebung weder die Folge eines Zelltods, noch löst sie die sofortige Zellzerstörung aus. Dies ist von fundamentaler Bedeutung und verkörpert einen Durchbruch des wissenschaftlichen Verständnisses der PS-Biologie, der Membrantranslokation, der Zell-Signalübertragung und von Apoptose-Pfanden.
Die Trennung zwischen PS-Translokation und Apoptose in Endothelzellen (Beispiel XIV) ist auch wesentlich für Verfahren einer therapeutischen Intervention, die auf PS-Oberflächenexpression beruht. Sollte eine PS-Translokation zur äußeren Membran in Endothelzellen der Tumorvaskulatur nur in sterbenden Zellen auftreten, oder sollte sie unvermeidlicherweise einen Zelltod auslösen, dann wäre der PS-Marker wahrscheinlich nicht ausreichend verfügbar, um als eine anzielbare Einheit für eine erfolgreiche Therapie (unter Verwendung von entweder nackten Antikörpern oder therapeutischen Konjugaten) zu dienen. Das heißt nicht, daß eine PS-Expression auf bestimmten Endozellen der Tumorvaskulatur nicht transient ist, und daß ein Umsatz und ein Zelltod in dieser Endothelzellpopulation nicht auftritt, der Befund jedoch, daß eine beträchtliche stabile PS-Expression ohne Zelltod erreicht werden kann, ist eine Meilenstein-Entdeckung, die wichtig ist für verschiedene Bereiche der Biologie und für neue Therapien.
D. Nackte Antikörper gegen Aminophospholipide zur Tumorbehandlung
Die vorliegenden Studien zur Aminophospholipid-Expression in Tumorvaskulatur stützen weiter die Verwendung von Koaguliganden, die gegen bekannte Tumorvaskulatur-Marker als selektive thrombotische Mittel, gerichtet sind, zur Behandlung solider Tumoren. Die vorliegenden Beobachtungen veranlaßten die Erfinder auch, weitere Verfahren zur Tumorbehandlung zu entwickeln. Beispielsweise wird die Verwendung von anti-Aminophospholipid-Immuntoxinen und anti-Aminophospholipid-Koaguliganden bei der Tumorbehandlung in der PCT-Offenlegungsschrift WO-A-00/02587 offenbart und beansprucht, die hier durch Zitat speziell aufgenommen wurde. Die überraschende Entdeckung einer stabilen PS-Expression auf intakten tumorassoziierten Endothelzellen, die keinem Zelltod unterliegen, machen derartige Verfahren sowohl durchführbar als auch überraschend (angesichts dessen, daß angenommen wurde, daß eine PS-Expression nur mit einer Zellzerstörung im Zusammenhang steht).
Allerdings wurden dann sogar noch unerwartetere Verfahren einer Tumorbehandlung entdeckt. Beim Untersuchen der potentiellen Verwendung des Anzielens von Aminophospholipiden im Zusammenhang mit einer späteren Abgabe eines Toxins oder Koagulanz an die tumorvaskulatur entdeckten die Erfinder glücklicherweise, daß nackte anti-PS-Antikörper eine zerstörende Wirkung auf Tumorvaskulatur in vivo aufweisen, und zwar bei vollständiger Abwesenheit von jeder zusätzlichen Effektorgruppe.
Einer der Erfinder der vorliegenden Erfindung hat zeitweise anti-Tumorvaskulatur-Immuntoxine und Koaguliganden zur therapeutischen Verwendung entwickelt (siehe beispielsweise US-Patente 5,855,866, 5,877,289, 5,965,132, 6,004,555 und 6,093,399). Im normalen Verlauf dieser Studien sind verschiedene Antikörper, einschließlich anti-Klasse II, anti-Endoglin, anti-VCAM-1 und anti-VEGF, Tumor-tragenden Mäusen verabreicht worden, und es wurde gezeigt, daß sie spezifisch zur Vaskulatur im Tumorinneren gelangen. Im Anschluß an diese Bestätigung wurden die Antikörper mit dem toxischen oder gerinnungsfördernden Effektor-Bereich verbunden um ein Immuntoxin oder einen Koaguliganden zu bilden, das/der dann verabreicht wurde, um eine anti-Tumor-Wirkung auszuüben.
Während derartiger Studien wurde festgestellt, daß keine nackten Antikörper eine anti-Tumor-Wirkung in sich selbst ausübten. Die Fähigkeit von anti-Aminophospholipid- Antikörpern, sowohl spezifisch zur Tumorvaskulatur zu gelangen als auch und gleichzeitig eine zerstörende Wirkung, die zu einer Tumornekrose führt, auszuüben, ist deshalb am meisten unerwartet.
Obwohl ein genaues molekulares Verständnis davon, wie genau die nackten Antikörper wirken, nicht notwendig ist, um die vorliegende Erfindung auszuführen, haben die Erfinder mehrere Mechanismen berücksichtigt, die für das beobachtete Abtöten von Endothelzellen verantwortlich sein können. Die favorisierten Mechanismen schließen Zell-vermittelte Zytotoxizität, Komplement-vermittelte Lyse und/oder Apoptose ein, obwohl eine Antikörper-induzierte Zell-Signalübertragung und/oder Störungen des Zytoskelets ebenfalls beteiligt sein können.
Da die nackten oder unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Antikörper-Fragmente an Aminophospholipide auf der Oberfläche der Gefäßendothelzellen binden, werden sie eine Antikörper-Beschichtung auf der luninalen Oberfläche bilden. Dies kann erfolgen, um Immuneffektorzellen, wie etwa zytotoxische T-Zellen und/oder NK-Zellen, anzulocken, die dann eine Zell-vermittelte zytotoxische Wirkung auf die Gefäßendothelzellen ausüben.
Eine Bindung von intakten anti-Aminophospholipid-Antikörpern an die Oberfläche der Gefäßendothelzellen wird also bedeuten, daß die Fc-Bereiche der Antikörper in das Gefäßvolumen herausragen werden. Da Antikörper-Fc-Fragmente den Komplement-Weg aktivieren, kann die beobachtete Zellzerstörung ein Ergebnis einer Komlement-gesteuerten Lyse sein. Eine Antikörperbindung aktiviert deshalb die Komplement-abhängige Gerinnungskaskade, wodurch Multikomponenten-Komplexe veranlaßt werden, sich zusammenzusetzen, und schließlich einen lytisch wirkenden Komplex zu erzeugen, der die Zielzelle permeabilisiert. Eine „Komplement-aktivierte ADCC" kann auch bei der Zerstörung wirken, bei der Komplement an die Antikörper-beschichtete Zielzelle bindet, und bei der Zellen, wie etwa Neutrophile, die Rezeptoren für Komplement aufweisen, die Zielzelle lysieren.
Eine anti-Aminophospholipid-Antikörper-Bindung kann auch eine Apoptose in den Endothelzellen der Tumorvaskulatur induzieren. Andere Gruppen haben PS als einen möglichen Marker von Apoptose identifiziert (Williamson and Schlegl, 1994). Allerdings waren diese früheren Studien verbunden mit dem Auftreten von externalisiertem PS, nachdem andere Stimuli das Apoptose-Ereignis ausgelöst haben (Martin et al., 1995), was zu dem vorliegenden Vorschlag einer Apoptose-Induktion entgegengesetzt ist. Es gibt keine bekannten Berichte über eine Antikörperbindung an PS, die tatsächlich zu einer Apoptose führt. Dennoch ziehen die Erfinder dies als einen so gut wie wahrscheinlichen Mechanismus in Betracht, da die Zell-vermittelte Zytotoxizität oder Komplement-vermittelte Lyse trotz der Tatsache, daß ein nicht zur Sache gehörender Beweis des Gegenteils plötzlich durch andere publiziert worden ist (Nakamura et al., 1998).
Nakamura et al. analysierten Antikörperfraktionen von Patienten mit Lupus-Antikoagulanz (LAC), einer Störung, die mit arterieller und venöser Thrombose, Thrombozytopenie und wiederholten Fehlgeburten einhergeht. Von Plasma mit LAC-Aktivität wurde anfänglich berichtet, daß es bei Endothelzellen eine Apoptose induziert (Nakamura et al., 1994). Von den apoptotischen Aktivitäten von LAC-Antiseren wurde dann berichtet, daß sie in einer Annexin V-bindenden Antikörperfraktion in 10/10 untersuchten Patienten vorhanden waren (Nakamura et al., 1998). Da Annexin an PS bindet, wäre die augenscheinliche Fähigkeit von anti-Annexin-Antikörpern, Apoptose zu induzieren, das Gegenteil von einem der zerstörenden Mechanismen, welchen die Erfinder der vorliegenden Erfindung vorgeschlagen haben, d.h. der Fähigkeit eines anti-PS-Antikörpers, Apoptose zu induzieren.
Weiterhin wurde berichtet, daß die Fähigkeit von LAC-Antikörperfraktionen, Apoptose zu induzieren, durch eine Vorinkubation mit Annexin V gehemmt wird (Nakamura et al., 1998). Im Gegensatz dazu hob ein Entfernen von anti-Phospholipid-Antikörpern aus den IgG-Fraktionen von Patienten mit Phospholipid-Liposomen die Apoptose-induzierenden Aktivitäten oder die Annexin V-Bindung nicht auf (Nakamura et al., 1998). Diese Ergebnisse legten vernünftigerweise nahe, daß Patienten mit LAC häufig Antikörper aufweisen, die keine Phospholipide binden und demnach für die Induktion von Apoptose in Endothelzellen verantwortlich sind (Nakamura et al., 1998).
Ohne Notwendigkeit, die LAC-Ergebnisse von Nakamura et al. (1998) mit den Beobachtungen der Erfinder aus in vivo-Studien von Tumoren und Tumorvaskulatur aufgrund der eindeutig grundverschiedenen Natur dieser klinischen Erscheinungsbilder gleichsetzen zu wollen, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung trotzdem bestimmte vereinheitlichende Theorien. Nakamura et al. (1998) versuchten, anti-Phospholipid-Antikörper aus Patienten-Antiseren unter Verwendung von Phospholipid-Liposomen zu entfernen und beobachteten, daß dies die Apoptose-induzierende Aktivität nicht aufhob. Diese Ergebnisse veranlaßten Nakamura et al. (1998), zu schlußfolgern, daß die anti-Phospholipid-Antikörper für eine apoptotische Aktivität nicht verantwortlich sein könnten. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben jedoch jetzt den Einblick, vorzuschlagen, daß die Inkubation mit Phospholipid-Liposomen die anti-Phospholipid-Antikörper aus den Antiseren nicht entfernt haben könnten, da Phospholipide in Doppelschicht- und liposomaler Form antigen neutral sind, und in großem Ausmaß Antikörper in großem Ausmaß nur in hexagonaler Form (Rauch et al., 1986; Rauch and Janoff, 1990; Berard et al., 1993) oder in Assoziation mit Membranproteinen binden. Folglich könnten anti-Phospholipid-Antikörper in den LAC-Antiseren zurückgeblieben sein und die beobachtete apoptotische Aktivität verursacht oder dazu beigetragen haben.
Es ist auch vorstellbar, daß eine anti-Aminophospholipid-Bindung an die Oberfläche von Endothelzellen der Tumorvaskulatur Störungen der Zytoskelett-Organisation der Zelle verursacht. Da das Zytoskelett eine Rolle bei der Organisation der Oberflächenmembranen spielt, und da eine anti-Aminophospholipid-Bindung die Membran stören (oder weiter stören) kann, kann eine Antikörper-Bindung Änderungen an Zytoskelett-Proteine, die mit der Doppelschicht interagieren, weiterleiten. Es ist bereits bekannt, daß die räumliche Organisation von Zytoskelett-Proteinen die Membranstabilität und Zellgestalt steuert, und es ist möglich, daß eine Störung des Zytoskelett Gleichgewichts des Zytoskeletts weitreichende Konsequenzen für die Zellintegrität hat.
Ein weiterer Mechanismus der Funktion der Erfindung kann sein, daß eine anti-Aminophospholipid-Antikörper-Bindung an die Oberfläche von Endothelzellen eine Signaltransduktion durch bisher nicht definierte Stoffwechselwege auslösen kann. Eine anti-Aminophospholipid-Antikörper-Bindung kann auch bekannte Signaltransduktionspfade, z.B. durch Ändern der Konformation und/oder der Interaktionen von Membranrezeptoren, Signaltransduktionsproteinen, Membrankanälen und derartigem, stören. Signale zur Zellzerstörung (Apoptose) können ausgelöst oder nachgeahmt und/oder erhaltende/homöostatische Signale können gehemmt werden.
Obwohl es von wissenschaftlichem Interesse ist, ist ein Bestimmen der genauen Natur der Gefäßzerstörung, die durch die nackten anti-Aminophospholipid-Antikörper erreicht wird, nicht notwendig, um die vorliegende Erfindung auszuführen. Angesichts dessen, daß hier gezeigt wird, daß die Verabreichung von anti-Aminophospholipid-Antikörpern vorteilhafterwei se zu spezifischen anti-Tumor-Wirkungen in vivo führt, kann die Erfindung ungeachtet des molekularen Mechanismus, der diesem Phänomen unterliegt, benutzt werden.
Die Verwendung nackter Antikörper der vorliegenden Erfindung stellt damit einen beträchtlichen Fortschritt in der Tumortherapie dar. Obwohl Koaguliganden vorteilhaft sind für die Tumortherapie, muß der zielgerichtete Antikörper noch konjugiert werden an oder funktionell assoziiert werden mit dem Effektorkoagulanz, wie etwa Gewebefaktor. Deshalb ist die Ausführung der Methodik des Anzielens mit einem Koaguliganden und der Tumorzerstörung etwas arbeitsaufwendig, insofern, als sie die Herstellung geeigneter Konjugate oder koordinierter molekularer Komplexe (einschließlich bispezifischer Antikörper) erfordert. Beispielsweise muß man einen zielgerichteten Antikörper oder Liganden herstellen, der an das gewünschte Ziel-Antigen bindet, ein geeignetes Koagulanz auswählen, das Koagulanz an den zielgerichteten Antikörper oder Liganden binden oder auf andere Weise eine funktionelle Assoziation zwischen den beiden Bestandteilen bilden, um den „Koaguliganden" zu bilden, den Koagulanden von dem unkonjugierten oder unkomplexierten zielgerichteten Mittel und dem Koagulanz trennen, und dann die Behandlungsprotokolle nacharbeiten.
Obwohl Verfahren auf der Grundlage von Koaguliganden leicht und erfolgreich ausgeführt werden können, kann man die Vorteile, die aus der vorliegende Entwicklung einer Methodik, die weniger Herstellungsschritte einschließt, erkennen, und sie können deshalb auf eine kosteneffizientere Weise durchgeführt werden. Weiterhin macht die vorliegende Erfindung ein Einkomponenten-System verfügbar, das die behördlichen Zulassungsverfahren schneller durchlaufen wird, wodurch ermöglicht wird, das verbesserte Behandlungsverfahren in die klinische Anwendung, wo sie dringend benötigt werden, umgesetzt.
E. Anti-Aminophospholipid-Antikörper
E1. Polyklonale anti-Aminophospholipid-Antikörper
Mittel zum Herstellen und Charakterisieren von Antikörpern sind im Stand der Technik bestens bekannt (siehe z.B. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Um polyklonale Antiseren herzustellen, wird ein Tier mit einer immunogenen Aminophospholipd-Zusammensetzung immunisiert, und Antiseren werden von dem immunisier ten Tier gewonnen. Eine ganze Reihe von Tierspezies kann zur Produktion von Antiseren verwendet werden. Typischerweise ist das zur Produktion von Antiseren verwendete Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen oder eine Ziege. Aufgrund des relativ großen Blutvolumens von Kaninchen, ist ein Kaninchen eine bevorzugte Wahl zur Herstellung polyklonaler Antikörper.
Die Menge an Immunogen-Zusammensetzung, die zur Herstellung polyklonaler Antikörper verwendet wird, variiert in Abhängigkeit von der An des Immunogens ebenso wie dem zur Immunisierung verwendeten Tier. Eine Auswahl von Wegen kann verwendet werden, um das vorliegende Aminophospholipid-Immunogen zu verabreichen: subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös, intraperitoneal und in die Milz. Die Herstellung polyklonaler Antikörper kann durch Gewinnen von Blutproben von dem immunisierten Tier zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung überwacht werden. Eine zweite Wiederholungsinjektion (booster) kann ebenfalls verabreicht werden. Das Verfahren von Wiederholungsimpfung und Titerbestimmung wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erreicht wird. Wenn ein gewünschter Titerspiegel erreicht ist, kann das immunisierte Tier ausgeblutet und das Serum isoliert und gelagert werden. Das Tier kann auch verwendet werden, um monoklonale Antikörper zu erzeugen.
Wie im Stand der Technik bestens bekannt, kann die Immunogenität einer bestimmten Zusammensetzung durch die Verwendung von unspezifischen Stimulatoren der Immunantwort erhöht werden, bekannt als Adjuvanzien. Beispielhafte Adjuvanzien schließen komplettes Freund'sches Adjuvanz, einen unspezifischen Stimulator der Immunantwort enthaltendes abgetötetes Mycobacterium tuberculosis, inkomplettes Freund'sches Adjuvans und Aluminiumhydroxid-Adjuvanz ein.
Auch kann gewünscht sein, das Wirtsimmunsystem wiederholt zu stimulieren, was durch eine Assoziierung von Aminophospholipiden mit einem oder ein Kuppeln von Aminophospholipiden an einen Trägerstoff erreicht werden kann. Beispielhafte Träger sind das Hämozyanin der Napfschnecke (keyhole limpethemocyanin, KLH) und Rinderserumalbumin (BSA). Andere Albumine, wie etwa Ovalbumin, Serumalbumin der Maus oder von Kaninchenserumalbumin können ebenfalls als Trägerstoffe verwendet werden.
Wie im Stand der Technik ebenfalls bekannt, kann eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenität variieren. Die Herstellung von Antikörpern gegen Aminophospholipide ist allerdings nicht besonder schwierig. Beispielsweise werden hochspezifische anti-Phosphaitdylserin-Antikörper in Kaninchen erzeugt, die durch intramuskuläre Injektionen von Phosphatidylserin-enthaltenden Polyacrylamid-Gelen und mit Phosphatidylserin-Cytochrom c-Vesikeln immunisiert wurden (Maneta-Peyret et al., 1988; 1989). Die Verwendung von Acrylamid-Implantaten erhöhte die Produktion von Antikörpern (Maneta-Peyret et al., 1988; 1989). Die anti-Phosphatidylserin-Antikörper, die auf diese Weise erzeugt wurden, sind in der Lage, Phosphatidylserin in situ auf menschlichen Plättchen nachzuweisen (Maneta-Peyret et al., 1988). Die Gruppen von Inoue, Rote und Rauch haben ebenfalls anti-PS- und anti-PE-Antikörper entwickelt (siehe unten).
E2. Monoklonale anti-Aminophospholipid-Antikörper
Verschiedene Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper (MAbs) sind im Stand der Technik jetzt ebenfalls bestens bekannt. Die am meisten standardisierte Technik zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern fängt im allgemeinen genauso wie jene zum Herstellen polyklonaler Antikörper an (Antibodies: A Laboratory Manual, cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Eine polyklonale Antikörper-Antwort wird durch Immunisieren eines Tieres mit einer immunogenen Aminophospholipid-Zusammensetzung ausgelöst und wenn ein gewünschter Titer erhalten worden ist, kann das immunisierte Tier verwendet werden, um MAbs zu erzeugen.
MAbs können leicht durch Verwendung bestens bekannter Techniken, wie etwa jenen, die im US-Patent 4,196,265 erläutert werden, hergestellt werden. Typischerweise schließt diese Technik ein Immunisieren eines geeigneten Tiers mit der ausgewählten Aminophospholipid-Immunogen-Zusammensetzung ein. Die immunisierende Zusammensetzung wird auf eine Weise verabreicht, die wirksam ist, Antikörper-produzierende Zellen zu stimulieren. Nagetiere, wie etwa Mäuse und Ratten, sind bevorzugte Tiere, allerdings ist die Verwendung von Kaninchen-, Schaf- und Froschzellen ebenfalls möglich. Die Verwendung von Ratten kann bestimmte Vorteile bieten (Goding, 1986, S. 60-61), Mäuse sind jedoch bevorzugt, wobei die BALB/c-Maus am stärksten bevorzugt ist, da diese am häufigsten routinemäßig verwendet wird und im allgemeinen einen höheren Prozentsatz an stabilen Fusionen ergibt.
Nach einer Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential zum Herstellen von Aminophospholipid-Antikörpern, speziell B-Lymphozyten (B-Zellen), zur Verwendung in dem MAb-Erzeugungsprotokoll ausgewählt. Diese Zellen können von Biopsien der Milz, Mandeln oder Lymphknoten oder von einer Probe peripheren Bluts erhalten werden. Milzzellen und periphere Blutzellen werden bevorzugt, erstere aufgrund dessen, daß sie eine reiche Quelle von Antikörper-produzierenden Zellen darstellen, die sich in dem Plasmablast-Teilungsstadium befinden, und letztere, da periphere Blutzellen leicht zugänglich sind. Häufig wird eine Reihe von Tieren zu immunisieren sein, und die Milz eines Tieres mit dem höchsten Antikörpertiter wird zu entfernen und die Milzlymphozyten durch Homogenisierung der Milz mit einer Spritze zu erhalten sein. Typischerweise enthält eine Milz von einer immunisierten Maus ungefähr 5 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphozyten.
Die anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden B-Lymphozyten aus dem immunisierten Tier werden dann mit Zellen einer immortalen Myelomzelle fusioniert, im allgemeinen eine derselben Spezies wie das Tier, das immunisiert wurde. Myelom-Zellinien, die zur Verwendung in Hybridom-produzierenden Fusionsverfahren geeignet sind, sind vorzugsweise nicht Antikörper-produzierend, weisen hohe Fusionseffizienz und Enzymdefizienzen auf, die sie unfähig machen, in bestimmten Selektivmedien, welche das Wachstum von nur den gewünschten fusionierten Zellen (Hybridome) fördert, zu wachsen.
Jede einer Reihe von Myelomzellen können verwendet werden, was diejenigen, die sich auf dem Gebiet auskennen, bekannt ist (Goding, S. 65-66, 1986; Campbell, S. 75-83, 1984). Wenn beispielsweise das immunisierte Tier eine Maus ist, kann man P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653; NS1/1.Ag 4 1, Sp219-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 und S194/5XX0 Bul verwenden; für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210 oder eine der oben aufgeführten Maus-Zellinien verwenden; und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 sind nützlich in Verbindung mit Fusionen menschlicher Zellen.
Verfahren zum Erzeugen von Hybriden von Antikörper-produzierenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen gewöhnlich ein Vermischen von somatischen Zellen mit Myelomzellen in einem Verhältnis von 4:1, obwohl das Verhältnis von ungefähr 20:1 bis ungefähr 1:1 variieren kann, in Gegenwart eines Mittels oder von Mitteln (chemisch oder elektrisch), welche die Fusion von Zellmembranen fördern. Fusionsverfahren unter Verwen dung des Sendai-Virus sind durch Köhler und Milstein (1975; 1976) und jene, die Polyethylenglycol (PEG), wie etwa 37% (Vol./Vol.) PEG verwenden, durch Gefter et al. (1977) beschrieben worden. Die Verwendung von elektrisch induzierten Fusionsverfahren ist ebenfalls geeignet (Goding, S. 71-74, 1986).
Fusionsverfahren bringen lebensfähige Hybride gewöhnlich mit geringer Häufigkeit bei niedrigen Frequenzen, ungefähr 1 × 10^–6 bis 1 × 10^–8, hervor. Allerdings stellt dies kein Problem dar, da die lebensfähigen fusionierten Hybride von den parentalen, nicht fusionierten Zellen (insbesondere die nicht fusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise weiterhin unbestimmt teilen würden) durch Kultivierung in einem Selektivmedium unterschieden werden können. Das Selektivmedium ist im allgemeinen eines, das ein Mittel enthält, das die de novo-Synthese von Nukleotiden in dem Gewebekulturmedium unterbindet. Beispielhafte und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat unterbinden eine de novo-Synthese sowohl von Purinen als auch Pyrimidinen, wohingegen Azaserin nur die Purinsynthese unterbindet. Wenn Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als einer Quelle von Nukleotiden supplementiert (HAT-Medium). Wenn Azaserin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin supplementiert.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, die in der Lage sind, Nukleotid-Ausweichstoffwechselwege zu bedienen, sind in der Lage, in HAT-Medium zu überleben. Den Myelomzellen fehlen Schlüsselenzymen des Ausweichstoffwechselwegs, z.B. Hypoxanthinphosphoribosyltransferase (HPRT), und sie können nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Stoffwechselweg bedienen, haben jedoch eine begrenzte Lebensdauer in Kultur und sterben im allgemeinen innerhalb von ungefähr zwei Wochen. Deshalb sind die einzigen Zellen, die in dem Selektivmedium überleben können, jene Hybride, die aus Myelom- und B-Zellen gebildet wurden.
Dieses Kultivieren macht eine Population von Hybridomen verfügbar, aus denen spezifische Hybridomen selektiert werden können. Typischerweise wird eine Selektion von Hybridomen durchgeführt, indem die Zellen durch Einzelklon-Verdünnung in Mikrotiterplatten, gefolgt durch Austesten der einzelnen klonalen Überstände (nach ungefähr zwei bis drei Wochen) auf die gewünschte anti-Aminophospholipid-Reaktivität, kultiviert werden. Der, Test sollte sensi tiv, einfach und schnell sein, wie etwa Radioimmuntests, Enzymimmuntests, Zytotoxizitätstests, Plaque-Tests, Dot-Immunbindungstests und derartiges.
Die ausgewählten Hybridome würden dann seriell verdünnt und in individuelle anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierende Zellinien kloniert, wobei die Klone dann auf unbestimmte Zeit propagiert werden können, um MAbs zu liefern. Die Zellinien können zur MAb-Produktion auf zwei grundlegenden Wegen ausgenutzt werden. Eine Probe des Hybridoms kann einem histokompatiblen Tier von der Art, die verwendet wurde, um die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion verfügbar zu machen, injiziert werden (häufig in die Peritonealhöhle). Das Tier, das die Injektion erhalten hat, entwickelt Tumoren, welche den spezifischen monoklonalen Antikörper sezernieren, der durch das fusionierte Zellhybrid produziert wird. Die Körperflüssigkeiten des Tiers, wie etwa Serum oder Acitesflüssigkeit können dann angezapft werden, um MAbs in hoher Konzentration verfügbar zu machen. Die individuellen Zellinien könnten auch in vitro kultiviert werden, wobei die MAbs natürlicherweise in das Kulturmedium sezerniert werden, aus welchem sie dann leicht in hohen Konzentrationen erhalten werden können.
MAbs, die durch jedes Mittel hergestellt wurden, werden im allgemeinen weiter gereinigt werden, z.B. unter Verwendung von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen chromatographischen Verfahren, wie etwa HPLC oder Affinitätschromatographie, wobei alle diese Reinigungstechniken denjenigen, die sich auf dem Gebiet auskennen, bestens bekannt sind. Diese Reinigungstechniken umfassen jeweils eine Fraktionierung, um den gewünschten Antikörper von anderen Bestandteilen eines Gemischs zu trennen. Analytische Verfahren, die zur Präparation von Antikörpern besonders geeignet sind, schließen beispielsweise Protein A-Sepharose- und/oder Protein G-Sepharose-Chromatographie ein.
Umeda et al. (1989) berichteten über die wirksame Produktion von monoklonalen Antikörpern, die stereospezifische Epitope von Phosphatidylserin erkennen. Das System von Umeda beruht auf der direkten Verabreichung von Phosphatidylserin in Mäusemilz unter Verwendung einer Salmonella-beschichteten Aminophospholipid-Probe (Umeda et al., 1989). Das Protokoll von Umeda liefert eine hohe Häufigkeit von anti-PS-MAbs, welche drei distinkte Reaktivitätsprofile im Bereich von hochspezifisch bis breite Kreuzreaktivität aufweisen. Umeda wird deshalb hier ebenfalls durch Zitat zum Zweck eines weiteren Beschreibens von Durchmusterungstests (screening asays), zum Identifizieren von MAbs, die spezifisch an PS binden, d.h. und nicht an Phosphatidylcholin binden, aufgenommen.
Jedes der durch Umeda erzeugten 61 Hybridome könnten potentiell in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Beispiele sind PSC8, PSF11, PSG3, PSD11, PSF10, PS1B, PS3D12, PS2C11; PS3A, PSF6, PSF7, PSB4, PS3H1; PS4A7 und PS1G3. Stärker bevorzugt sind PS3A, PSF6, PSF7, PSB4 und PS3H1, da sie nur an Phosphatidylserin und Phophatidylethanolamin binden. Bevorzugte anti-PS-Antikörper sind PS4A7 (IgM) und PS1G3 (IgG₃), da sie hochspezifisch für PS sind und keine Kreuzreaktion mit anderen Phospholipiden zeigen. PS4A7 erkennt die stereospezifische Konfiguration des Serinrests in PS (1 in Umeda et al., 1989).
Igarashi et al. (1991) berichteten auch die wirksame Induktion von anti-PS-Antikörpern vom IgG-Isotyp durch Verabreichung in die Milz. Nur ein geringer Anstieg des Titers wurde beobachtet, wenn das Antigen intravenös injiziert wurde. Eine große Häufigkeit von anti-PS-MAbs vom IgG-Isotyp wurde auch beobachtet, selbst wenn MAbs 10 Tage nach der Verabreichung an die Milz produziert wurden. Diese Antikörper wurden auch durch Schuurmans Stekhoven et al. (1994) eingesetzt.
Die andere bedeutende anti-PS-Antikörper-Produktion ist durch Rote und Kollegen erfolgt. Rote et al. (1993) setzten insbesondere PS-Mizellen in Kombination mit Freund'schem kompletten Adjuvanz ein, um spezifische anti-PS-Antikörper zu erzeugen. Rote et al. (1993) erzeugten auch monoklonale Antikörper, die zwischen Cardiolipin (CL) und PS unterschieden. Rote et al. (1993) wird deshalb auch durch Zitat hier aufgenommen zum Zweck eines weiteren Beschreibens von Durchmusterungstests, zum Identifizieren von MAbs, die spezifisch an PS binden, indem gegen ruhende und Thrombin-aktivierte Plättchen unter Verwendung von Durchflußzytometrie getestet wird.
Der durch Rote et al. (1993) produzierte Antikörper-3SB9b reagierte nur mit PS und ist ein bevorzugter Antikörper zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung. BA3BSC4 kann ebenfalls verwendet werden, da er sowohl mit PS als auch CL reagiert. Diese Antikörper werden auch in Lin et al. (1995), Obringer et al. (1995) und Katsuragawa et al. (1997) beschrieben.
E3. Anti-Aminophospholipid-Antikörper aus Phasenbibliotheken
Die rekombinante Technologie erlaubt jetzt die Herstellung von Antikörpern mit der gewünschten Spezifität aus rekombinanten Genen, die eine Reihe von Antikörpern kodieren (Van Dijk et al., 1989). Bestimmte rekombinante Techniken umfassen die Isolierung der Antikörpergene durch immunologisches Durchmustern kombinatorischer Immunglobulin-Expressions-Phagenbibliotheken, die aus RNA hergestellt wurden, die aus der Milz eines immunisierten Tieres isoliert wurde (Morrison et al., 1986; Winter and Milstein, 1991).
Für derartige Verfahren werden kombinatorische Immunglobulin-Phagenbanken aus RNA hergestellt, die aus der Milz des immunisierten Tieres isoliert wurden, und Phagen, welche die passenden aNtikörper exprimieren, werden durch Waschen unter Verwendung von Zellen, die das Antigen exprimieren und Kontrollzellen selektiert. Die Vorteile dieses Ansatzes gegenüber konventionellen Hybridom-Techniken sind, daß ungefähr 10⁴-mal so viele Antikörper produziert und in einem einzelnen Durchgang durchgemustert werden können, und daß neue Spezifitäten durch eine Komination von H- und L-Kette erzeugt werden können, welche den Prozentsatz der erzeugten passenden Antikörper weiter steigert.
Ein Verfahren zur Herstellung eines großen Repertoires verschiedenartiger Antikörpermoleküle in Bakterien verwendet den Bakteriophagen Lambda als Vektor (Huse et al., 1989). Eine Produktion von Antikörpern unter Verwendung des Lambda-Vektors, schließt das Klonieren von schwere und leichte Kette-Populationen von DNA-Sequenzen in getrennte Ausgangsvektoren ein. Die Vektoren werden anschließend nach dem Zufallsprinzip kombiniert, um einen einzelnen Vektor zu bilden, der die Co-Expression von schweren und leichten Ketten dirigiert, um Antikörperfragmente zu bilden. Die schwere und leichte Kette-DNA-Sequenzen werden durch Ampifikation, vorzugsweise durch PCR^TM oder eine verwandte Amplifikationstechnik, von mRNA, die aus Milzzellen (oder Hybridomen davon) aus einem Tier isoliert wurde, das mit dem ausgewählten Antigen immunisiert worden ist, erhalten. Die schwere und leichte Kette-Sequenzen werden typischerweise amplifiziert unter Verwendung von Primern, die Restriktionsstellen an den Enden des amplifizierten DNA-Segments eingebaut haben, um ein Klonieren der schwere und leichte Kette-Segmente in die Ausgangsvektoren zu erleichtern.
Ein anderes Verfahren zum Herstellen und Durchmustern großer Bibliotheken von vollständig oder teilweise synthetischen Antikörper-Kombinationsstellen oder Paratopen verwendet Display-Vektoren, die von einem filamentösen Phagen, wie etwa M13, fl oder fd, abgeleitet sind. Diese Display-Vektoren von filamentösen Phagen, bezeichnet als "Phagemide", erbringen große Bibliotheken von monoklonalen Antikörpern mit verschiedenartigen und neuen Immunspezifitäten. Die Technologie verwendet eine Membran-Anker-Domäne eines Hüllproteins von einem filamentösen Phagen als Mittel, um Genprodukt und Gen während des Stadiums des Zusammensetzens während der Replikation des filamentösen Phagens zu verbinden und ist zur Klonierung und Expression von Antikörpern aus kombinatorischen Bibliotheken verwendet worden (Kang et al., 1991; Barbas et al., 1991).
Diese allgemeine Technik für ein Phagendisplay von einem filamentösen Phagen wird im US-Patent 5,658,727 beschrieben. In einem mehr allgemeinen Sinn macht das Verfahren ein System für das gleichzeitige Klonieren und Durchmustern von vorselektierten Ligand-Bindungsspezifitäten von Antikörper-Gen-Repertoires unter Verwendung eines einzelnen Vektorsystems verfügbar. Ein Durchmustern isolierter Mitglieder der Bibliothek auf eine vorselektierte Ligand-Bindungskapazität erlaubt die Korrelation der Bindungskapazität von einem exprimierten Antikörpermolekül mit einem zweckmäßigen Mittel, um das Gen, welches das Mitglied kodiert, aus der Bibliothek zu isolieren.
Die Verknüpfung von Expression und Durchmustern wird durch die Kombination von Anzielen eine Fusionspolypeptids in das Periplasma einer Bakterienzelle erreicht, um ein Zusammensetzen eines funktionellen Antikörpers zu erlauben, und dem Anzielen eines Fusionspolypeptids auf die Hülle eines filamentösen Phagenpartikels während des Zusammensetzens des Phagen, um ein zweckmäßiges Durchmustern der Bibliothek nach dem interessierenden Mitglied zu erlauben. Periplasmatische Targeting wird durch das Vorhandensein einer Sekretionssignal-Domäne in einem Fusionspolypeptid verfügbar gemacht. Abzielen auf einen Phagenpartikel wird durch das Vorhandensein einer Membran-Anker-Domäne eines Kühlproteins von einem filamentösen Phagen (d.h. einer cpII oder cpVII abgeleiteten membran-Anker-Domäne) in einem Fusionspolypeptid verfügbar gemacht.
Die Verschiedenartigkeit einer kombinatorischen Antikörper-Bibliothek auf der Grundlage eines filamentösen Phagen kann durch Durcheinandermischen der schwere und leichte Kette-Gene, durch Verändern einer oder mehrerer der die Komplementarität bestimmenden Regio nen der klonierten schwere Kette-Gene der Bibliothek oder durch Einführen zufälliger Mutationen in die Bibliothek durch fehleranfällige (error-prone) Polymerasekettenreaktionen erhöht werden. Zusätzliche Verfahren zum Durchmustern von Phagen-Bibliotheken werden in den US-Patenten 5,580,717, 5,427,908, 5,403,484 und 5,223,409 beschrieben.
Ein anderes Verfahren zum Durchmustern großer kombinatorischer Antikörper-Bibliotheken ist entwickelt worden, wobei eine Expression von Populationen verschiedenartiger schwere und leichte Kette-Sequenzen auf der Oberfläche eines filamentösen bakteriophagen, wie etwa M13, fl oder fd angewendet wurde (US-Patent 5,698,426). Zwei Populationen verschiedenartiger schwere (heavy chain, Hc) und leichte (light chain, Lc) Kette-Sequenzen werden durch Polymerasekettenreaktion (PCR^TM) synthetisiert. Diese Populationen werden in getrennte Vektoren auf der Grundlage von M13, die Elemente enthalten, die für die Expression notwendig sind, kloniert. Der schwere Kette-Vektor enthält eine Gen VIII (gVIII)-Hüllprotein-Sequenz, so daß eine Translation der schwere Kette-Sequenzen gVIII-Hc-Fusionsproteine hervorbringt. Die Populationen zweier Vektoren werden zufällig kombiniert, so daß nur die Vektoranteile, welche die Hc- und Lc-Sequenzen enthalten, mit einem einzelnen zirkulären Vektor verbunden werden.
Der kombinierte Vektor dirigiert die Co-Expression sowohl der Hc- als auch der Lc-Sequenzen zum Zusammensetzen der beiden Polypeptide und die Oberflächenexpression auf M13 (US-Patent 5,698,426). Der Kombinierungsschritt bringt verschiedene Hc und Lc kodierende Sequenzen innerhalb zweier verschiedenartiger Populationen in einem einzelnen Vektor zufällig zusammen. Die Vektorsequenzen, die von jedem unabhängigen Vektor gespendet werden, sind notwendig zur Produktion eines lebensfähigen Phagen. Da auch die pseudo-gVII-Sequenzen in nur einem der zwei Ausgangsvektoren enthalten sind, kann eine Co-Expression von funktionellen Antikörperfragmenten, wie Lc-assoziierten gVIII-Hc-Fusionsproteinen, auf der Phagenoberfläche nicht erreicht werden, bis die Vektorsequenzen in den einzelnen Vektor eingebunden sind.
Eine Oberflächenexpression der Antikörper-Bibliothek wird in einem Amber-Suppressor-Stamm durchgeführt. Ein Amber-Stopkodon zwischen der Hc-Sequenz und der gVIII-Sequenz trennt die beiden Bestandteile in einem nicht-Suppressor-Stamm. Ein Isolieren des Phagens, der von dem nicht-Suppressor-Stamm produziert wurde, und Infizieren eines Suppressor-Stamms wird die Hc-Sequenzen während einer Expression mit der gVIII-Sequenz verknüpfen. Ein Kultivieren des Suppressor-Stamms nach Infektion erlaubt die Co-Expression auf der Oberfläche von M13 aller Antikörperspezies innerhalb der Bibliothek als gVIII-Fusionsproteine (gVIII-Fab-Fusionsproteine). Alternativ kann die DNA aus dem nicht-Suppressor-Stamm isoliert und dann in einen Suppressor-Stamm eingeführt werden, um den gleichen Effekt zu erreichen.
Die Oberflächenexpressionsbibliothek wird auf spezifische Fab-Fragmente, die an vorselektierte Moleküle binden, durch Affinitätsisolierung-Standardverfahren durchgemustert. Solche Verfahren schließen beispielsweise Aussieben (Parmley and Smith, 1988), Affinitätschromatographie und Festphase-Blotting-Verfahren ein. Aussieben wird bevorzugt, da hohe Phagentiter leicht, schnell und in kleinen Volumina durchgemustert werden können. Weiterhin kann dieses Verfahren untergeordnete Fab-Fragment-Spezies innerhalb der Population selektieren, die ansonsten nicht nachweisbar geblieben wären, und zu im wesentlichen homogenen Populationen amplifizieren. Die ausgewählten Fab-Fragmente können durch Sequenzieren der Nukleinsäuren, welche die Polypeptide nach Amplifikation der Phagen-Population kodieren, charakterisiert werden.
Ein anderes Verfahren zum Herstellen verschiedenartiger Bibliotheken von Antikörpern und zum Durchmustern nach gewünschten Bindungsspezifitäten wird im US-Patent 5,667,988 und im US-Patent 5,759,817 beschrieben. Das Verfahren umfaßt die Herstellung von Bibliotheken aus heterodimeren Immunglobulin-Molekülen in Form von Phagen-Bibliotheken unter Verwendung degenerierter Oligonukleotide und Primerverlängerungs(primer extension)-Reaktionen, um die Degenerationen in die CDR-Regionen der variablen Domänen der variablen schweren und leichten Ketten eines Immunglobulins einzuführen, und eine Darstellung der mutagenisierten Polypeptide auf der Oberfläche des Phagen. Danach wird das Display-Protein nach der Fähigkeit, an ein vorausgewähltes Antigen zu binden, durchgemustert.
Das Verfahren zum Herstellen eines heterodimeren Immunglobulin-Moleküls umfaßt allgemein (1) Einführen eines interessierenden schwere oder leichte Kette-V-Region-kodierenden Gens in den Phagen-Display-Vektor; (2) Einführen einer zufälligen Bindungsstelle in den Phagen-Display-Protein-Vektor durch Primerverlängerung mit einem Oligonukleotid, das Regionen, die zu einem CDR des Antikörper-V-Region-Gens homolog sind, enthält, und Regionen, die degeneriert sind, enthält, zum Produzieren zufälliger kodierender Sequenzen, um eine große Population von Display-Vektoren zu bilden, von denen jeder fähig ist, verschiede ne putative Bindungsstellen, die auf einem Phagen-Oberflächen-Display-Protein dargestellt werden, zu exprimieren; (3) Exprimieren des Display-Proteins und der Bindungsstelle auf der Oberfläche eines filamentösen Phagenpartikels; und (4) Isolieren (Durchmustern) des Oberflächen-exprimierten Phagenpartikels unter Verwendung von Affinitätstechniken, wie etwa Aussieben von Phagenpartikeln gegen ein vorselektiertes Antigen, wodurch eine oder mehrere Phagenspezies, die ein Display-Protein enthalten, welches eine Bindungsstelle enthält, die an ein selektiertes Antigen bindet, isoliert werden.
Eine weitere Abwandlung dieses Verfahrens zum Herstellen verschienartiger Bibliotheken von Antikörpern und zum Durchmustern nach gewünschten Bindungsspezifitäten wird im US-Patent 5,702,892 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden nur schwere Kette-Sequenzen eingesetzt, die schwere Ketten-Sequenzen werden in allen Nukleotidpositionen, die entweder die CDRI- oder CDRIII-hypervariable Region kodieren, zufällig angeordnet, und die genetische Variabilität in den CDRs wird unabhängig von jedem biologischen Prozeß hervorgerufen.
Bei dem Verfahren werden zwei Bibliotheken konstruiert, um Oligonukleotid-Motive innerhalb des Bezugsystems der schwere Kette-Gen-Struktur genetisch durcheinanderzumischen. Durch Zufallsmutation von entweder CDRI oder CDRIII werden die hypervariablen Regionen des schwere Kette-Gens rekonstruiert, um zu einer Sammlung hochgradig verschiedenartiger Sequenzen zu führen. Die schwere Kette-Proteine, welche durch die Sammlung mutierter Gensequenzen kodiert werden, besaßen das Potential, alle Bindungscharakteristika eines Immunglobulins aufzuweisen, während nur eine der zwei Immunglobulin-Ketten erforderlich waren.
Speziell wird das Verfahren in Abwesenheit des Immunglobulin-leichte Kette-Proteins ausgeführt. Eine Bibliothek von Phagen, die modifizierte schwere Kette-Proteine darstellen, wird mit einem immobilisierten Liganden inkubiert, um Klone zu selektieren, die rekombinante Proteine kodieren, die spezifisch an den immobilisierten Liganden binden. Der gebundene Phage wird dann von dem immobilisierten Liganden dissoziiert und durch Wachstum in bakteriellen Wirtszellen amplifiziert. Einzelne virale Plaques, wobei jede ein anderes rekombinantes Protein exprimiert, werden expandiert und individuelle Klone werden dann auf Bindungaktivität untersucht.
E4. Anti-Aminophospholipid-Antikörper von menschlichen Patienten
Antikörper gegen Aminophospholipide, insbesondere Phosphatidylserin und Phosphtidylethanolamin, treten in der menschlichen Population auf, wo sie mit bestimmten Krankheitszuständen verbunden sind. Anti-Aminophospholipid-Antikörper sind Teil der heterogenen anti-Phospholipid-Antikörper (aPL), von denen beobachtet wurde, daß sie Familien mit verschiedenen Spezifitäten und Klassen aufweisen. Ein primäres anti-Phospholipid-Syndrom (APS) ist von anderen Formen einer Autoimmunerkrankung, die mit anti-Phospholipid-Antikörperproduktion einhergeht, unterschieden worden.
Anti-PS-Antikörper stehen insbesondere mit wiederholten Fehlgeburten (Rote et al., 1995; Rote, 1996; Vogt et al., 1996; Vogt et al., 1997) und mit der Autoimmunerkrankung systemischer Lupus-Eerythematosus (SLE oder "Lupus") (Brauch et al., 1987) im Zusammenhang. Von anti-PE-Antikörpern wurde ebenfalls bei menschlichen Patienten berichtet, insbesondere solchen mit Autoimmunerkrankungen (Staub et al., 1989). Branch et al. (1987) berichteten, daß 80% der Patienten mit Lupus-Antikoagulanz (LA oder LAC) Autoantikörper aufwiesen, die PE erkannten, wobei Drouvalakis und Buchanan (1998) diese Anzahl auf 95% PE-positive ausAutoimmun-LAC-Seren erhöhten.
Anti-Phospholipid-Antikörper sollten nicht verwechselt werden mit anti-Endothelzell-Antikörpern (AECA), obwohl sie in demselben Patienten aufgefunden werden können. Das Vorhandensein von AECA ist bei verschiedenen klinischen Bildern, die mit Vaskulitis einhergehen, wie etwa systemischer Sklerose (SS), dokumentiert worden. Um AECA zu studieren, werden Antikörper aus Patienten gewonnen, die keine anti-Phospholipid-Antikörper aufweisen (aPL-negative Seren).
Die pathogene Rolle von AECA bleibt unklar, obwohl Bordron et al. (1998) erst kürzlich vorgeschlagen haben, daß AECA eine Apoptose in Endothelzellen auslösen kann, dem ein PS-Transfer auf die äußere Oberfläche der Membran folgen würde. Sie schlugen vor, daß dies für die nachfolgende Erzeugung die anti-Phospholipid-Antikörper verantwortlich wäre, die manchmal in Verbindung mit AECA bei Patienten mit Hautläsionen oder Erkrankungen des konnektiven Gewebes beobachtet werden (Bordron et al., 1998). Obwohl jedoch eine Bindung von AECA an ein Apoptose-induzierendes Antigen postuliert wurde, führten diese Studien nicht zu einer weiteren Charakterisierung von AECA, von denen noch immer gesagt wurde, daß sie eine extrem heterogene Familie von Antikörpern, die mit verschiedenen (nicht-Lipid) Strukturen auf Endothelzellen reagieren, repräsentieren (Bordron et al., 1998).
Anti-Phosphatidylserin-Antikörper stehen in engen Zusammenhang mit einer Fehlgeburt, Schwangerschafts-induziertem Bluthochdruck und intrauteriner Wachstumsverzögerung. Von einem Phosphatidylserin-abhängigen Antigen ist gezeigt worden, daß es auf der Oberfläche eines Chorionkarzinom-Modells (BeWo) von differenzierenden Cytotrophoblasten-Zellen exprimiert werden, was zeigt, daß es in vivo für anti-Phosphatidylserin-Antikörper in der Zirkulation zugänglich sein sollte (Rote et al., 1995). Tatsächlich zeigten Vogt et al. (1996), daß der monoklonale Antikörper 3SB9b, der mit Phosphatidylserin, jedoch nicht mit Cardiolipin reagiert, eine signifikante Reduktion sowohl des fötalen als auch des plazentalen Gewichts in einem Maus-Modell für das anti-Phospholipid-Antikörper-Syndrom induziert.
Diese Autoren entwickelten ein Modell, um Fehlgeburten, die mit anti-Phospholipid-Antikörpern einhergehen, zu erklären: ein anti-Phospatidylserin-Antikörper bringt Prothrombin-Bindungsstellen auf der Oberfläche des Trophoblasten zum Vorschein, wahrscheinlich durch Entfernen von Annexin V (Vogt et al., 1997). Die Differenzierung des Trophoblasten geht mit einer Externalisierung von Phosphatidylserin von der inneren zur äußeren Oberfläche der Plasmamembran einher. Normalerweise erfolgt die Externalisierung von Phosphatidylserin gemeinsam mit der Bindung von Annexin V, welche die Phosphatidylserin-reiche Oberfläche davon abhält, als Aktivierungsstelle der Gerinnung zu wirken. Wenn also anti-Phospholipid-Antikörper vorhanden sind, verhüten sie eine Annexin V-Bindung und führen zu einem Prokoagulanz-Zustand (Vogt et al., 1997).
Anti-PE-Antikörper gehen häufig mit Lupus-Antikoagulantien (LAC-Seren) einher. Die Rolle von PE und anti-PE bei LAC ist extrem komplex, siehe z.B. Smirnov et al. (1995), worin verschiedene Hypothesen erläutert werden. Smirnov et al. (1995) berichten, daß in Gegenwart von aktiviertem Protein C und PE LAC-Plasma schneller gerinnt als normales Plasma. Rauch et al. (1986) charakterisieren LAC-anti-Phospholipid-Antikörper dahingehend, daß sie die Gerinnungszeit in in vitro-Gerinnungstests verlängern.
Vlachoyiannopoulos et al (1993) testeten SLE- und APS-Seren durch ELISA auf Antikörper gegen Phosphatidylethanolamin und Cardiolipin im Vergleich zu gesunden Blutspendern. Sowohl von SLE- als auch APS-Patienten wurde berichtet, daß sie einen höheren Titer von IgM-anti-PE-Antikörpern aufwiesen als normale Versuchspersonen, während die IgG- und IgA-anti-PE-Reaktivität sich dem Bericht zufolge nicht unterschied. Vorgeschlagen wurde, daß IgA- und IgG-anti-PE-Antikörper in niedrigen Titern als natürliche Autoantikörper bei normalen Versuchspersonen auftreten können (Vlachoyiannopoulos et al, 1993).
Rauch et al. (1986) stellten Hybridome her, indem sie Lymphozyten von 13 Patienten mit systemischem Lupus erythematosus mit einer Lymphoblastenlinie fusionierten. Sie zeigten, daß die Autoantikörper, welche die Gerinnungszeit verlängerten, an hexagonale Phase-Phospholipide, einschließlich natürlicher und synthetischer Formen von Phsophatidylethanolamin, banden (Rauch et al, 1986). Im Gegensatz dazu übten lamellare Phospholipide, wie etwa Phosphatidylcholin, und synthetische lamellare Formen von Phosphatidylethanolamin keine Wirkung auf die gerinnungshemmende Aktivität aus (Rauch et al, 1986).
Rauch und Janoff (1990) fuhren fort zu zeigen, daß eine Immunisierung von Mäusen mit Phosphatidylethanolamin in der hexagonalen II-Phase, jedoch nicht in der Doppelschicht-Phase, zu der Induktion von anti-Phospholipid-Antikörpern führte. Diese Antikörper waren hochreaktiv mit Phosphatidylethanolamin und wiesen funktionelle Lupus-Antikoagulanz-Aktivität auf, die für Autoantikörper von Patienten mit einer Autoimmunerkrankung charakteristisch ist (Rauch und Janoff, 1990).
Die hexagonale II-Phase-Form von Aminophospholipiden sollten daher vorteilhafterweise verwendet werden, um Antikörper zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Tatsächlich berichtete Trudell, daß Antikörper, die gegen TFA(Trifluoracetyl)-Proteinaddukte erzeugt wurden, an TFA-Phosphatidylethanolamin in hexagonale Phase-Phospholipid-Micellen binden, nicht jedoch in lamellaren Liposomen (Trudell et al., 1991a). Die Autoren legten nahe, daß TFA-Phosphatidylethanolamin-Addukte, die sich in nicht-lamellaren Domänen auf der Hepatozytenoberfläche befinden, Erkennungsstellen für anti-TFA-Addukt-Antikörper sein könnten und potentiell an immun-vermittelter Halothan-Hepatotoxizität beteiligt sind (Trudell et al., 1991a). Später wurde gezeigt, daß diese selben Antikörper mit TFA-Dioleoylphosphatidylethanolamin kreuzreagieren, wenn dieses Addukt in die Oberfläche von Hepatozyten aufgenommen wird (Trudell et al., 1991b), wodurch diese Hypothese unterstützt wird.
Berard erklärten die hexagonale II-Phase-form von Aminophospholipiden, wie etwa PE, weiter (Berard et al., 1993). In Doppelschichten nehmen Phospholipide im allgemeinen eine Gelstruktur, ein Kristallgitter oder einen lamellaren Zustand an (Berard et al., 1993). Phospholipide können jedoch in Abhängigkeit vom Cholesteringehalt, dem Protein und ionischen Umgebungen leicht die Zustände wechseln, wodurch sie eine hexagonale II-Phase annehmen (Berard et al, 1993). Diese hexagonale II-Phase von Aminophospholipiden ist es, von der angenommen wird, daß sie immunogen ist, wie anfänglich für eine Autoantikörpererzeugung in krankhaften Situationen vorgeschlagen wurde (Berard et al, 1993).
Qamar et al (1990) haben eine Abwandlung des Themas der hexagonalen Aminophospholipid-Erkennung entwickelt. Unter Verwendung von Phosphatidylethanolamin als ein Modell berichteten diese Autoren, daß anti-PE-Antikörper von aPL-positiven SLE-Seren nicht an PE binden, tatsächlich jedoch gegen Lysophosphatidylethanolamin (IPE), einem natürlichen PE-Abbauprodukt und einer wahrscheinlichen Kontamination der am meisen PE-Präparationen, gerichtet sind (Qamar et al, 1990).
Andere neue Ergebnisse zeigen, daß die meisten anti-Phospholipid-Antikörper Phospholipid im Zusammenhang von nahe gelegenen Proteinen erkennen (Rote, 1996; Chamley et al., 1991). In Plasmamembranen scheint der Hauptanteil der Phospholipide natürlicherweise in nicht-antigener bilaminarer Form vorzuliegen (Rote, 1996). Akzessorische Moleküle können helfen, den Übergang zu hexagonalen antigenen Formen zu erleichtern und deren Expression zu stabilisieren (Galli et al., 1993). Beispielsweise wurde zunächst berichtet, daß natürlicherweise vorkommende anti-Phospolipid-Antikörper Komplexe von Cardiolipin oder Phosphatidylserin mit β₂-Glycoprotein I (β₂-GPI oder Apolipoprotein H, apoH) erkennen (Galli et al., 1990; 1993). Von β₂-GPI wird angenommen, Phospholipide in antigenen Konformationen zu stabilisieren, die bei reinen Phospholipiden nicht existieren (McNeil et al, 1990; US-Patent 5,344,758; Chamley et al., 1991; Matsuura et al., 1994). Prothrombin ist ebenfalls mit dem Phospholipid-Stabilisierungsprozeß in Verbindung gebracht worden (Bevers et al., 1991).
Phospholipid-bindende Plasmaproteine sind im allgemeinen notwendig zur Antikörper-Erkennung des elektrisch neutralen oder zwitterionischen Phospholipids Phosphatidylethanolamin. Sugi und McIntyre (1995) identifizierten zwei vorherrschende PE-bindende Plasmaproteine als hoch-molekulares Kininogen (high molecular weight kininogen, HMWK oder HK) und niedrig-molekulares Kininogen (low molecular weight kininogen, LMWK oder LK).
Für anti-PE-Antikörper aus Patienten mit SLE und/oder wiederkehrenden spontanten Aborten wurde gezeigt, daß sie PE, HMWK oder LMWK nicht erkennen, wenn sie unabhängig als einzelne Antigene auf ELISA-Platten präsentiert wurden (Sugi and McIntyre, 1995). Für andere anti-PE-positive Seren, die nicht mit PE-HMWK oder PE-LMWK reagierten, wurde vorgeschlagen, daß sie Faktor XI oder Präkallikrein womit normalerweise keine Bindung an HMWK erfolgt, erkennen (Sugi and McIntyre, 1995).
Die Validität dieser Ergebnisse wurde bestätigt, indem gezeigt wurde, daß intaktes HMWK an verschiedene Phospholipide, wie etwa Cardiolipin, Phosphatidylserin, Phosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin, bindet, daß jedoch anti-PE-Antikörper nur einen Kininogen-PE-Komplex erkennen und keine Kininogene erkennen, die mit anderen Phospholipid-Substraten präsentiert werden (Sugi and McIntyre, 1996a). Dies zeigt, daß PE einzigartige antigene Konformationsänderungen der Kininogene induziert, die nicht induziert werden, wenn die Kininogene an andere Phospholipide binden (Sugi and McIntyre, 1996a).
Weiter wurde vorgeschlagen, daß Kininogene an Plättchen aufgrund von exponiertem PE in der Plättchenmembran binden (Sugi and McIntyre, 1996b). Für exogen zugesetzten Kininogen-abhängigen anti-PE-Antikörper wurde gezeigt, daß er Thrombin-induzierte Plättchenaggregation in vitro steigert, nicht jedoch die ADP-induzierte Aggregation verändert (Sugi and McIntyre, 1996b). Im Gegensatz dazu wurde von Kininogen-unabhängigem anti-PE-Antikörper, der PE per se erkennt, berichtet, daß er die Thrombin-induzierte Plättchenaggregation nicht erhöht. Deshalb wurde vorgeschlagen, daß Kininogen-abhängiger anti-PE-Antikörper die normalen anti-thrombotischen Wirkungen von Kininogen unterbinden könnte (Sugi and McIntyre, 1996b).
Anti-Aminophospholipid-Antikörper aus menschlichen Patienten sind deshalb ein Gemisch von Antikörpern, die im allgemeinen Aminophospholipide erkennen, die durch Protein-Interaktionen stabilisiert sind (Rote, 1996). Die Antikörper können binden, um Phospholipid-Epitope zu stabilisieren oder können an ein Epitop, das aus der Interaktion des Phospholipids mit Aminosäuren an dem stabilisierenden Protein gebildet wird, binden (Rote, 1996). So oder so, derartige Antikörper erkennen eindeutig Aminophospholipide in natürlichen Membranen im menschlichen Körper, wahrscheinlich im Zusammenhang mit Plasmaproteinen (McNeil et al., 1990; Bevers et al., 1991). Diese Antikörper würden deshalb als Ausgangsmaterial zum Erzeugen eines Antikörpers zur Verwendung in im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung geeignet sein.
Um einen anti-Aminophospholipid-Antikörper aus einem menschlichen Patienten herzustellen, würde man einfach menschliche Lymphozyten aus einer Versuchsperson mit anti-Aminophospholipid-Antikörpern gewinnen, z.B. aus menschlichem peripherem Blut, Milz, Lymphknoten, Mandeln und derartigem, wobei Techniken verwendet werden, die denjenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, bestens bekannt sind. Die Verwendung peripherer Blutlymphozyten wird häufig bevorzugt.
Menschliche monoklonale Antikörper können aus den menschlichen Lymphozyten erhalten werden, welche die gewünschten anti-Aminophospholipid-Antikörper produzieren, indem die menschlichen Lymphozyten immortalisiert werden, im allgemeinen auf die gleiche Weise wie oben für das Erzeugen jedes monoklonalen Antikörpers beschrieben. Die Reaktivitäten der Antikörper in den Kulturüberständen werden im allgemeinen zunächst überprüft, wobei eines oder mehrere ausgewählte Aminophospholipid-Antigene) eingesetzt werden, und die Lymphozyten, die eine hohe Reaktivität zeigen, werden wachsen gelassen. Die resultierenden Lymphozyten werden dann mit einer parenteralen Zellinie, die aus Mensch oder Maus stammt, fusioniert, und weitere Selektionen ergibt optimale Klone.
Die Wiedergewinnung monoklonaler Antikörper aus den immortalisierten Zellen kann durch jede Methode, die im allgemeinen bei der Produktion monoklonaler Antikörper eingesetzt werden, erreicht werden. Beispielsweise kann der gewünschte monoklonale Antikörper durch Klonieren der immortalisierten Lymphozyten durch die limiting dilution-Methode oder derartiges, Auswählen der Zelle, die den gewünschten Antikörper produziert, Wachsen lassen der ausgewählten Zellen in einem Medium oder der Abdominalhöhle eines Tieres und Wiedergewinnen des gewünschten monoklonalen Antikörpers aus dem Kulturüberstand oder der Ascites-Flüssigkeit erhalten werden.
Derartige Techniken sind verwendet worden, beispielsweise, um menschliche monoklonale Antikörper gegen Pseudomonas aeruginosa-Epitope (US-Patente 5,196,337 und 5,252,480), Polyribosylribitolphosphat-Kapselpolysaccharide (US-Patent 4,954,449), das Rh(D)-Antigen (US-Patent 5,665,356) und Viren, wie etwa das menschliche Immundefizienz-Virus, respira tory syncytial-Virus, Herpex simplex-Virus, Varicella zoster-Virus und Zytomegalovirus (US-Patente 5,652,138, 5,762,905 und 4,950,595) zu isolieren.
Die Anwendbarkeit der zuvor genannten Techniken auf die Erzeugung menschlicher anti-Aminophospholipid-Antikörper ist eindeutig. Rauch et al. (1986) verwendeten solche Verfahren im allgemeinen, um Hybridome durch Fusionieren von Lymphozyten aus SLE-Patienten mit einer Lymphoblastenlinie zu fusionieren. Dies produzierte menschliche Antikörper, die an hexagonale Phase-Phospholipide, einschließlich natürlicher und synthetischer Formen von Phosphatidylethanolamin, banden (Rauch et al., 1986).
Zusätzlich können die im US-Patent 5,648,077 beschriebenen Verfahren verwendet werden, um ein Triom oder ein Quadrom zu bilden, das einen menschlichen Antikörper gegen ein ausgewähltes Aminophospholipid produziert. In einem allgemeinen Sinn wird eine Hybridom-Zellinie, die eine elterliche immortalisierende Nagetierzelle, wie etwa eine Maus-Myelomzelle, z.B. SP-2, umfaßt, mit einer menschlichen Partnerzelle fusioniert, was zu einer immortalisierenden xenogenen Hybridomzelle führt. Diese xenogene Hybridomzelle wird mit einer Zelle, die fähig ist, einen menschlichen anti-Aminophospholipid-Antikörper herzustellen, fusioniert, was zu einer Triom-Zellinie führt, die fähig ist, einen menschlichen Antikörper zu erzeugen, der gegen ein solches Antigen in einem Menschen wirksam ist. Alternativ, wenn größere Stabilität gewünscht wird, wird eine Triom-Zellinie, die vorzugsweise die Fähigkeit zum Produzieren ihres eigenen Antikörpers nicht länger besitzt, hergestellt und dieses Triom wird dann mit einer weiteren Zelle fusioniert, die fähig ist, einen Antikörper, der gegen das Aminophospholipid-Antigen nützlich ist, um ein noch stabileres Hybridom (Quadrom) zu erhalten, das einen Antikörper gegen das Antigen produziert.
E5. Anti-Aminophospholipid-Antikörper aus menschlichen Lymphozyten
Eine in vitro-Immunisierung oder Antigen-Stimulation kann auch verwendet werden, um einen menschlichen anti-Aminophospholipid-Antikörper zu erzeugen. Solche Techniken können verwendet werden, um periphere Blutlymphozyten sowohl von anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden menschlichen Patienten als auch von normalen, gesunden Versuchspersonen zu stimulieren. Tatsächlich haben Vlachoyiannopoulos et al. (1993) berichtet, daß bei normalen Versuchspersonen ein niedriger Titer von anti-Aminophospholipid-Antikörpern vorkommt. Selbst wenn dies nicht der Fall war, konnten anti-Aminophopholipid- Antikörper aus gesunden menschlichen Individuen hergestellt werden, indem einfach Antikörperproduzierende Zellen mit Aminophospholipiden in vitro stimuliert wurden.
Eine derartige "in vitro-Immunisierung" umfaßt eine Antigen-spezifische Aktivierung von nicht-immunisierten B-Lymphozyten, im allgemeinen innerhalb einer gemischten Population von Lymphozyten (gemischte Lymphozytenkulturen, mixed lymphocyte cultures, MLC). In vitro-Immunisierungen können auch durch B-Zell-Wachstum und Differenzierungsfaktoren und Lymphokine unterstützt werden. Die durch diese Verfahren hergestellten Antikörper sind häufig IgM-Antikörper (Borrebaeck et al., 1986).
Ein anderes Verfahren ist beschrieben worden (US-Patent 5,681,729), bei dem menschliche Lympozyten, die hauptsächliche IgG- (oder IgA-)Antikörper produzieren, erhalten werden können. Dieses Verfahren umfaßt in einem allgemeinen Sinn ein Transplantieren menschlicher Lymphozyten in ein immundefizientes Tier, so daß die menschlichen Lymphozyten den Tierkörper "überlisten"; Immunisieren des Tiers mit einem gewünschten Antigen, um menschliche Lymphozyten zu erzeugen, die einen gegen das Antigen gerichteten Antikörper produzieren; und Wiedergewinnen der menschlichen Lymphozyten, die den Antikörper produzieren, aus dem Tier. Die auf diese Weise produzierten menschlichen Lymphozyten können verwendet werden, um einen monoklonalen Antikörper durch Immortalisieren der menschlichen Lymphozyten, die den Antikörper produzieren, Klonieren der erhaltenen immortalisierten, aus dem Menschen stammenden Lymphozyten, die den Antikörper produzieren, und Wiedergewinnen eines monoklonalen Antikörpers, der für das gewünschte Antigen spezifisch ist, aus den klonierten immortalisierten, aus dem Menschen stammenden Lymphozyten, zu produzieren.
Die immundefizienen Tiere, die bei dieser Technik eingesetzt werden können, sind jene, die keine Abstoßung zeigen, wenn den Tieren menschliche Lymphozyten transplantiert werden. Solche Tiere können künstlich durch physikalische, chemische oder biologische Behandlungen erzeugt werden. Jedes immundefiziente Tier kann eingesetzt werden. Die menschlichen Lymphozyten können aus menschlichem peripherem Blut, Milz, Lymphknoten, Mandeln oder derartigem gewonnen werden.
Das "Überlisten" der transplantierten menschlichen Lymphozyten in die Tiere kann erreicht werden, indem die menschlichen Lymphozyten den Tieren lediglich verabreicht werden. Der Verabreichungsweg ist nicht begrenzt und kann beispielsweise subkutan, intravenös oder intraperitoneal sein. Die Dosis der menschlichen Lymphozyten ist nicht beschränkt und kann gewöhnlich 10⁶ bis 10⁸ Lymphozyten pro Tier betragen. Das immundefiziente Tier wird dann mit dem gewünschten Aminophospholipid-Antigen immunisiert.
Nach der Immunisierung werden menschliche Lymphozyten aus dem Blut, der Milz, den Lymphknoten oder anderen lymphatischen Geweben durch jede herkömmliche Methode gewonnen. Beispielsweise können mononukleäre Zellen durch die Ficoll-Hypaque (spezifische Dichte: 1,077)-Zentrifugationsmethode separiert und die Monozyten durch die Kunststoff schalen-Adsorptionsmethode entfernt werden. Die kontaminierenden Zellen, die aus dem Immundefizienten Tier stammen, können unter Verwendung eines Antiserums, das für die Tierzellen spezifisch ist, entfernt werden. Das Antiserum kann beispielsweise durch Immunisieren eines zweiten, anderen Tieres mit den Milzzellen des Immundefizienten Tiers und Gewinnen von Serum aus dem anderen immunisierten Tier erhalten werden. Die Behandlung mit dem Antiserum kann in jedem Stadium durchgeführt werden. Die menschlichen Lymphozyten können auch durch ein immunologisches Verfahren gewonnen werden, bei dem ein menschliches Immunglobulin, das auf der Zelloberfläche exprimiert ist, als ein Marker eingesetzt wird.
Durch diese Verfahren können menschliche Lymphozyten, die hauptsächlich IgG- und IgA-Antikörper, die für ein ausgewähltes Aminophospholipid oder mehrere ausgewählte Aminophospholipide spezifisch sind, produzieren, erhalten werden. Monoklonale Antikörper werden dann aus den menschlichen Lymphozyten durch Immortalisierung, Selektion, Zellwachstum und Antikörper-Produktion erhalten.
E6. Transgene Mäuse, die menschliche Antikörper-Bibliotheken enthalten
Die rekombinante Technologie ist jetzt für die Präparation von Antikörpern verfügbar. Zusätzlich zu den oben offenbarten kombinatorischen Immunglobulin-Expression-Phagenbanken wird ein anderer molekularer Klonierungsansatz, zum Herstellen von Antikörpern aus transgenen Mäusen, die menschliche Antikörper-Bibliotheken enthalten offenbart. Derartige Techniken werden im US-Patent 5,545,807, beschrieben.
In einem allgemeineren Sinne umfassen diese Verfahren die Erzeugung eines transgenen Tieres, das in seiner Keimbahn genetisches Material eingefügt hat, das für mindestens einen Teil eines Immunglobulins menschlichen Ursprungs kodiert oder das sich reorganisieren kann, um ein Repertoire von Immunglobulinen zu kodieren. Das eingefügt genetische Material kann von einer menschlichen Quelle produziert sein oder kann synthetisch produziert worden sein. Das Material kann mindestens teilweise für ein bekanntes Immunglobulin kodieren oder kann modifiziert sein, um mindestens teilweise für ein verändertes Immunglobulin zu kodieren.
Das eingefügte genetische Material wird in dem transgenen Tier exprimieren, was zur Produktion eines Immunglobulins führt, das sich mindestens teilweise von dem eingefügten menschlichen genetischen Immunglobulin-Material ableitet. Es wurde festgestellt, daß sich genetisches Material in dem transgenen Tier reorganisiert, so daß ein Repertoire von Immunglobulinen mit einem Teil oder Teilen, die sich von dem eingefügten genetischen Material ableiten, produziert werden können, selbst wenn das eingefügte genetische Material in die Keimbahn in der falschen Position oder mit der falschen Geometrie aufgenommen wurde.
Das eingefügte genetische Material kann in Form von DNA, die in prokaryotische Vektoren, wie etwa Plasmide und/oder Cosmide, kloniert worden ist, vorliegen. Größere DNA-Fragmente werden unter Verwendung künstlicher Hefe-Chromosomen-Vektoren eingefügt (Burke et al., 1987) oder durch Einführen von Chromosomenfragmenten (Richer and Lo, 1989). Das eingefügte genetische Material kann in den Wirt auf herkömmliche Weise eingeführt werden, beispielsweise durch Injektion oder andere Verfahren in befruchtete Eier embryonale Prionenstammzellen.
Unter bevorzugten Aspekten wird ein Wirtstier, das ursprünglich kein genetisches Material, das Immunglobulin-konstante Regioinen kodiert, getragen hat, verwendet, so daß das sich ergebende transgene Tier nur das eingefügte menschliche genetische Material zur Produktion von Immunglobulinen verwenden wird. Dies kann erreicht werden entweder durch Verwenden eines natürlicherweise vorkommenden mutierten Wirts, dem das relevante genetische Material fehlt, oder durch künstliches Herstellen von Mutanten, z.B. in Zellinien, um schließlich einen Wirt, aus dem das relevante genetische Material entfernt worden ist, zu erzeugen.
Wenn das Wirtstier genetisches Material, das Immunglobulin-konstante Regionen kodiert, trägt, wird das transgene Tier, das natürlicherweise vorkommende genetische Material und das eingefügte genetische Material tragen und wird Immunglobuline, die sich von dem natürlicherweise vorkommenden genetischen Material ableiten, das eingefügte genetische Material und Gemische von beiden Typen von genetischem Material produzieren. In diesem Fall kann das gewünschte Immunglobulin durch Durchmustern von Hybridomen, die sich von dem transgenen Tier ableiten, erhalten werden, z.B. durch Ausnutzen des Phänomens des allelen Ausschlusses einer Antikörper-Genexpression oder differenziellen Chromosomenverlusts.
Nachdem ein geeignetes transgenes Tier erzeugt worden ist, wird das Tier einfach mit dem gewünschten Immunogen immunisiert. In Abhängigkeit von der Art des eingefügten Materials kann das Tier ein chimäres Immunglobulin, z.B. von gemischtem Maus/Mensch-Ursprung, wobei das genetische Material fremden Ursprungs produzieren, nur einen Teil des Immunglobulins kodiert, oder das Tier kann ein vollständig fremdes Immunglobulin produzieren z.B. von gänzlich menschlichem Ursprung, wobei das genetische Material fremden Ursprungs ein vollständiges Immunglobulin kodiert.
Polyklonale Antiseren können nach Immunisierung durch das transgene Tier produziert werden. Immunglobulin produzierende Zellen können aus dem Tier entfernt werden, um das interessierende Immunglobulin zu produzieren. Vorzugsweise werden durch das transgene Tier monoklonale Antikörper produziert, z.B. durch Fusionieren von Milzzellen des Tiers mit Myelomzellen und Durchmustern der resultierenden Hybridome, um jene auszuwählen, die den gewünschten Antikörper produzieren. Geeignete Techniken für derartige Verfahren werden hier beschrieben.
In einem alternativen Ansatz kann das genetische Material in das Tier auf solch eine Weise aufgenommen werden, daß der gewünschte Antikörper in Körperflüssigkeiten, wie etwas Serum oder externalen Sekretionen des Tiers, wie etwa Milch, Kolostrum oder Speichel, produziert wird. Beispielsweise kann durch Einfügen von genetischem Material in vitro, das mindestens teilweise für ein menschliches Immunglobulin kodiert, in ein Gen eines Säugetiers, das für ein Milchprotein kodiert, und dann Einfügen des Gens in ein befruchtetes Ei des Säugetiers, z.B. durch Injektion, das Ei sich zu einem erwachsenen Säugetierweibchen entwickeln, das Milch produziert, die das Immunglobulin enthält, das sich mindestens teilweise von dem eingefügten menschlichen genetischen Immunglobulin-Material ableitet, entwickeln. Der gewünschte Antikörper kann dann das aus der Milch geerntet werden. Geeignete Techniken, um derartige Verfahren auszuführen, sind denjenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, bekannt.
Die zuvor genannten transgenen Tiere werden gewöhnlich eingesetzt, um menschliche Antikörper eines einzelnen Isotyps, spezieller eines Isotyps, der für die B-Zell-Reifung essentiell ist, wie etwa IgM und möglicherweise IgD, zu produzieren. Ein anderes bevorzugtes Verfahren zum Produzieren menschlicher anti-Aminophospholipid-Antikörper wird in den US-Patenten 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016 und 5,770,429 beschrieben, worin transgene Tiere beschrieben werden, die in der Lage sind, von einem Isotyp, der für die B-Zell-Entwicklung benötigt wird, zu anderen Isotypen zu wechseln.
Während der Entwicklung eines B-Lymphozyten produziert die Zelle anfänglich IgM mit einer Bindungspezifität, welche durch die effizient reorganisierte V_H- und V_L-Regionen bestimmt wird. Anschließend synthetisiert jede B-Zelle und ihre Nachkommen Antikörper mit denselben L- und H-Kette-V-Regionen, sie können jedoch den Isotyp der H-Kette wechseln. Die Verwendung von konstanten mu- oder delta-Regionen wird weitgehend durch alternatives Splicing bestimmt, was IgM und IgD erlaubt, in einer einzelnen Zelle coexpremiert zu werden. Die anderen schwere Kette-Isotypen (gamma, alpha und epsylon) werden nativ nur exprimiert, nachdem ein Gen-Reorganisationsereignis die C-mu- und C-delta-Exons deletiert hat. Dieser Gen-Reorganisationsprozeß, als Isotyp-Switching bezeichnet, tritt typischerweise durch Rekombination zwischen sogenannten Switch-Segmenten, die unmittelbar stromaufwärts auf jedem schwere Kette-Gen (mit Ausnahme von delta) lokalisiert sind, auf. Die einzelnen Switsch-Segmente weisen Längen zwischen 2 und 10 kb auf und bestehen hauptsächlich aus kurzen wiederholten Sequenzen.
Aus diesem Grund ist zu bevorzugen, daß transgene Tiere transkriptionsregulatorische Sequenzen im Bereich von ungefähr 1 bis 2 kb stromaufwärts von jeder Switch-Region, die zum Isotyp-Switching verwendet werden soll, einbauen. Diese transkriptionsregulatorischen Sequenzen beinhalten vorzugsweise einen Promotor und ein Verstärker-Element, und enthalten stärker bevorzugt die 5'-flankierende (d.h. stromaufwärts gelegene) Region, die natürlicherweise mit einer Switch-Region assoziiert ist (d.h. in Keimbahn-Konfiguration vorkommt). Obwohl eine 5'-flankierende Sequenz von einer Switch-Region mit einer anderen Switch-Region zur transgenen Konstruktion funktionsfähig verknüpft werden kann, ist bei manchen Ausführungen bevorzugt, daß jede Switch-Region, die in das transgene Konstrukt eingebaut wird, die 5'-flankierende Region, die unmittelbar stromaufwärts in der natürlicherweise vorkommenden Keimbahn-Konfiguration auftritt, aufweist. Sequenzinformationen, die Immunglobulin-Switchregion-Sequenzen betreffen, sind bekannt (Mills et al., 1990; Sideras et al., 1989).
Bei den in den US-Patenten 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016 und 5,770,429 beschriebenen Verfahren funktionieren die menschlichen Immunglobulin-Transgene, die in dem transgenen Tier enthalten sind, im Verlauf des gesamten Weges der B-Zell-Entwicklung korrekt, was zu einem Isotyp-Switching führt. Dementsprechend werden in diesem Verfahren diese Transgene konstruiert, um ein Isotyp-Switching hervorzurufen und eines oder mehrere der folgenden Aufzählungen: (1) Expression im hohen Ausmaß (high level expression) und Zelltyp-spezifische Expression, (2) funktionelle Gen-Reorganisation, (3) Aktivierung von und Antwort auf allelen Ausschluß, (4) Expression eines ausreichenden primären Repertoires, (5) Signaltransduktion, (6) somatische Hypermutation, und (7) Vorherrschaft des transgenen Antikörpers-Lokus während der Immunantwort.
Eine wichtige Anforderung an die transgene Funktion ist die Erzeugung eines primären Antikörper-Repertoires, das vielfältig genug ist, um eine sekundäre Immunantwort auf eine breiten Bereich von Antikörpern auszulösen. Das reorganisierte schwere Kette-Gen besteht aus einem Signalpeptid-Exon, einem variable Region-Exon und einem Tandem-Array von Multidomain-konstante Region-Regionen, von denen jedes durch mehrere Exons kodiert wird. Jedes der konstante Region-Gene kodiert den konstanten Teil einer anderen Klasse von Immunglobulinen. Während der B-Zell-Entwicklung werden V-Regionen proximate konstante Regionen deletiert, was zur Expression der neuen schwere Kette-Klassen führt. Für jede schwere Kette-Klasse verursachen alternative Muster eines RNA-Splicings sowohl Transmembran- als auch sezernierte Immunglobuline.
Der menschliche schwere Kette-Lokus besteht aus ungefähr 200 V-Gensegmenten, die zwei Mb überspannen, ungefähr 30 D-Gensegmenten, die ungefähr 40 kb überspannen, 6 J-Segmente, die innerhalb einer 3 kb-Spanne angehäuft sind, und 9 konstante Region-Gensegmente, die sich über ungefähr 300 kb erstrecken. Der ganze Lokus überspannt ungefähr 2,5 Mb des distalen Teils des langen Arms von Chromosom 14. Transgene schwere Kette-Fragmente, die Mitglieder von allen sechs der bekannten V_H-Familien, die D- und J-Gensegmente ebenso wie die mu-, delta-, gamma 3-, gamma 1- und alpha 1- konstanten Re gionen enthalten, sind bekannt (Berman et al., 1988). Genomische Fragmente, die alle notwendigen Gensegmente und regulatorischen Sequenzen eines menschlichen leichte Kette-Lokus enthalten, werden auf ähnliche Weise konstruiert.
Die Expression von erfolgreich reorganisierten transgenen schweren und leichten Immunglobulinen hat gewöhnlich einen dominanten Effekt, indem die Reorganisation der endogenen Immunglobulin-Gene in dem transgenen nicht-menschlichen Tier supprimiert wird. In bestimmten Ausführungen jedoch ist es wünschenswert, eine komplette Inaktivierung der endogenen Ig-Loki zu bewirken, damit Hybrid-Immunglobulinketten, die eine menschliche variable Region und eine nicht-menschliche (z.B. aus der Maus) konstante Region umfassen, nicht gebildet werden können, beispielsweise durch Trans-Switching zwischen den transgenen und endogenen Ig-Sequenzen. Unter Verwendung der Embryonenstammzell-Technologie und von homologer Rekombination kann das endogene Immunglobulin-Repertoire leicht eliminiert werden. Zusätzlich kann eine Suppression von endogenen Ig-Genen unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken, wie etwa der Antisense-Technologie, erreicht werden.
Unter anderen Aspekten der Erfindung kann es wünschenswert sein, einen Trans-Switch-Immunglobulin zu produzieren. Antikörper, die derartige chimäre Immunglobuline, die ein Trans-Switch erfahren haben, umfassen, können für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, bei denen es wünschenswert ist, eine nicht-menschliche (z.B. von der Maus) konstante Region zu haben, z.B. zur Beibehaltung von Effektorfunktionen im Wirt. Das Vorhandensein einer konstanten Region der Maus kann Vorteile gegenüber einer menschlichen konstanten Region bieten, beispielsweise um Effektorfunktionen der Maus verfügbar zu machen (z.B. ADCC, Komplementfixation der Maus), so daß ein derartiger chimärer Antikörper in einem Mausmodell für eine Krankheit getestet werden kann. Anschließend an das Testen eines Tiers kann die Sequenz, welche die menschliche variable Region kodiert, isoliert werden, z.B. durch PCR-Amplifikationen oder cDNA-Klonierung aus der Quelle (Hybridom-Klon), und zu einer Sequenz, die eine gewünschte menschliche konstante Region kodiert, gespliced werden, um einen Antikörper einer menschlichen zu kodieren, der zur therapeutischen Verwendung am Menschen besser geeignet ist.
E7. Humanisierte anti-Aminophospholipid-Antikörper
Menschliche Antikörper weisen im allgemeinen mindestens drei potentielle Vorteile für die Verwendung bei einer Therapie am Menschen auf. Erstens, da der Effektorteil menschlich ist, kann er besser mit den anderen Teilen des menschlichen Immunsystems interagieren, z.B. um Zielzellen wirksamer durch die Komplement-abhängige Zytotoxizität (komplement dependent cytotoxicity, CDC) oder Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) zu zerstören. Zweitens, das menschliche Immunsystem sollte den Antikörper nicht als fremd erkennen. Drittens, die Halbwertszeit in der Zirkulation des Menschen wird der von natürlicherweise vorkommenden menschlichen Antikörpern ähnlich sein, was kleinere und weniger häufig zu verabreichende Dosen ermöglicht.
Verschiedene Verfahren zum Herstellen menschlicher anti-Aminophospholipide werden hier verfügbar gemacht. Zusätzlich zu menschlichen Antikörpern haben "humanisiere" Antikörper Vorteile. "Humanisierte" Antikörper sind im allgemeinen chimäre oder mutante monoklonale Antikörper aus der Maus, Ratte, dem Hamster, Kaninchen oder einer anderen Spezies, die menschliche konstante und/oder variable Region-Domänen oder spezifische Änderungen tragen. Techniken zum Erzeugen eines sogenannten "humanisieren" anti-Aminophospholipid-Antikörpers sind denjenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, bestens bekannt.
Humanisierte Antikörper teilen auch die nachfolgend dargestellten Vorteile. Erstens, der Effektorteil ist noch menschlich. Zweitens, das menschliche Immunsystem sollte den Rahmen oder die konstante Region nicht als fremd erkennen, und deshalb sollte die Antikörper-Antwort gegen einen solchen injizieren Antikörper geringer sein als gegen einen komplett fremden Maus-Antikörper. Drittens, injizierte humanisierte Antikörper, im Gegensatz zu injizierten Mäuse-Antikörpern, werden wahrscheinlich eine Halbwertzeit aufweisen, die der von natürlicherweise vorkommenden menschlichen Antikörpern ähnlich ist, was auch geringere und weniger häufig zu verabreichende Dosen erlaubt.
Eine Reihe von Verfahren ist beschrieben worden, um humanisierte Antikörper zu produzieren. Eine kontrollierte Reorganisation von Antikörper-Domänen, die durch Protein-Disulfidbindungen verbunden werden, um neue, artifizielle Proteinmoleküle oder "chimäre" Antikörper zu bilden, kann verwendet werden (Konieczny et al., 1981). Die rekombinante DNA-Technologie kann ebenfalls verwendet werden, um Gen-Fusionen zwischen DNA-Sequenzen, welche variable leichte und schwere Kette-Domänen eines Mäuseantikörpers und menschliche leichte- und schwere Kette-konstante Domäne-Antikörper kodieren, zu konstruieren (Morrison et al., 1984).
DNA-Sequenzen, welche die Antigen-bindenden Bereiche oder die Komplementarität-bestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDR's) monoklonaler Antikörper der Maus kodieren, können durch molekulare Mittel in die DNA-Sequenzen eingepflanzt werden, welche die Gerüste von schweren und leichten Ketten eines menschlichen Antikörpers kodieren (Jones et al., 1986; Riechmann, 1988). Die exprimierten rekombinanten Produkte werden "umgebildete" oder humanisierte Antikörper genannt und umfassen das Gerüst einer leichten oder schweren Kette eines menschlichen Antikörpers und die Antigen-Erkennungsbereiche, CDR's, eines monoklonalen Maus-Antikörpers.
Ein anderes Verfahren zum Herstellen humanisierter Antikörper wird im US-Patent 5,639,641 beschrieben. Das Verfahren macht mittels Wiederauftauchen humanisierter Nagetier-Antikörper verfügbar, die aufgrund der Präsentation einer menschlichen Oberfläche in der variablen Region eine verbesserte therapeutische Wirksamkeit aufweisen. In dem Verfahren: (1) Positionsübereinstimmungen eines Pools von schwere und leichte Kette variable Regionen eines Antikörpers wird erzeugt, um einen Satz von schwere und leichte Kette variable Region Gerüst Oberfläche exponierte Positionen zu ergeben, wobei die Positionsübereinstimmungen für alle variablen Regionen mindestens ungefähr 98%ige Identität aufweisen; (2) ein Satz von schwere und leichte Kette variable Region Gerüst Oberfläche exponierte Aminosäurereste wird für einen Nagetier-Antikörper (oder ein Fragment davon) definiert; (3) ein Satz von schwere und leichte Kette variable Region Gerüst Oberfläche exponierte Aminosäurereste, der mit dem Satz von Oberflächen-exponierten Nagetier-Aminosäureresten am stärksten übereinstimmt, wird identifiziert; (4) der Satz von schwere und leichte Kette variable Region Gerüst Oberfläche exponierten Aminosäureresten, definiert in Schritt (3), wird durch den Satz von schwere und leichte Kette variable Region Gerüst Oberfläche exponierten Aminosäureresten, identifiziert in Schritt (3) substituiert, mit Ausnahme jener Aminosäurereste, die innerhalb von 5Å von jedem Atom von jedem Rest der Komplementarität-bestimmenden Regionen des Nagetier-Antikörpers liegen; und (5) der humanisierte Nagetier-Antikörper mit Bindungsspezifität wird produziert.
Ein ähnliches Verfahren für die Herstellung humanisierter Antikörper wird in den US-Patenten 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 und 5,530,101 beschrieben. Diese Verfahren umfassen ein Produzieren humanisierter Immunglobuline mit einer oder mehreren Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDR's) und mögliche zusätzliche Aminosäuren von einem Donor-Immunglobulin und einer Gerüstregion von einem menschlichen Akzeptor-Immunglobulin. Jede humanisierte Immunglobulin-Kette umfaßt gewöhnlich zusätzlich zu den CDR's Aminosäuren von dem Donor-Immunglobulingerüst, das in der Lage ist, mit den CDR's zu interagieren, um Bindungsaffinität zu bewirken, wie etwa eine oder mehrere Aminosäuren, die unmittelbar an ein CDR in dem Donor-Immunglobulin angrenzen oder jene innerhalb von ungefähr 3Å, wie durch Molekülsimulation (molecular modelling) vorhergesagt. Die schweren und leichten Ketten können jeweils unter Verwendung von jedem, von jeder Kombination oder von allen der verschiedenen Kriterien für die Position, die in den US-Patenten 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089 und 5,530,101 beschrieben wurden, entworfen werden. Die humanisierten Immunglobuline werden, wenn sie in einem intakten Antikörper kombiniert werden, sind im Menschen im wesentlichen nicht-immunogen und behalten im wesentlichen dieselbe Affinität wie das Donor-Immunglobulin gegenüber dem ursprünglichen Antigen.
Ein zusätzliches Verfahren zum Herstellen humanisierter Antikörper wird in den US-Patenten 5,565,332 und 5,733,743 beschrieben. Dieses Verfahren kombiniert das Konzept eines Humanisierens von Antikörpern mit den Phagen-Bibliotheken, die hier ebenfalls ausführlich beschrieben werden. In einem allgemeinen Sinn verwendet das Verfahren Sequenzen aus der Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers oder einer Population von Antikörpern, die gegen ein interessierendes Antigen gerichtet sind. Für einen einzelnen Nagetier-Antikörper können deshalb Sequenzen, die einen Teil der Antigen-Bindungsstelle des Antikörpers umfassen, mit verschiedenen Repertoires von Sequenzen von menschlichen Antikörpern kombiniert werden, die, in Kombination, eine komplette Antigen-Bindungsstelle erzeugen können.
Die Antigen-Bindungsstellen, die durch dieses Verfahren erzeugt werden, unterscheiden sich von jenen, die durch CDR-Aufpfropfung erzeugt werden, darin, daß wahrscheinlich nur der Teil einer Sequenz des ursprünglichen Nagetier-Antikörpers Kontakte mit einem Antigen auf eine ähnliche Weise herstellt. Die ausgewählten menschlichen Sequenzen unterscheiden sich wahrscheinlich hinsichtlich ihrer Sequenz und stellen alternative Kontakte mit dem Antigen zu jenen der ursprünglichen Bindungsstelle her. Die Einschränkungen allerdings, die von ei nem Binden des Teils einer ursprünglichen Sequenz an ein Antigen und den Formen des Antigens und seinen Antigen-Bindungsstellen ausgehen, werden wahrscheinlich die neuen Kontakte der menschlichen Sequenzen an dieselbe Region oder dasselbe Epitop des Antigens antreiben. Dieser Prozeß ist deshalb als "Epitop-geprägte Selektion" ("epitope imprinted selection", EIS) bezeichnet worden.
Beginnend mit einem Antikörper eines Tieres führt ein Verfahren zu der Selektion von Antikörpern, die zum Teil menschliche Antikörper sind. Derartige Antikörper können hinsichtlich der Sequenz menschlichen Antikörpern ausreichend ähnlich sein, um direkt oder nach Veränderung einiger Schlüsselreste zur Therapie verwendet zu werden. Sequenzunterschiede zwischen dem Nagetier-Bestandteil des ausgewählten Antikörpers und menschlichen Sequenzen können minimiert werden, indem jene Reste, die sich von den Resten der menschlichen Sequenzen unterschieden, ersetzt werden, beispielsweise durch artspezifische Mutagenese (site directed mutagenesis) einzelner Reste oder durch CDR-Aufpfropfung von ganzen Schleifen. Allerdings können auch Antikörper mit vollständig menschlichen Sequenzen erzeugt werden. EIS bietet deshalb ein Verfahren zum Herstellen teilweise menschlicher oder vollständig menschlicher Antikörper, die an dasselbe Epitop wie Antikörper eines Tieres bzw. teilweise menschliche Antikörper binden. Bei EIS können Repertoires von Antikörperfragmenten auf der Oberfläche eines filamentösen Phagen dargestellt, und die Gene, die Fragmente mit Antigen-bindenden Aktivitäten kodieren, durch Bindung des Phagen an das Antigen selektiert werden.
Zusätzliche Verfahren zum Humanisieren von Antikörpern, die im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung zur Verwendung berücksichtigt werden, werden in den US-Patenten 5,750,078, 5,502,16, 5,705,15, 5,770,40, 5,698,41, 5,693,49, 5,558,86, 4,935,496 und 4,816,567 beschrieben.
E8. Mutagenese durch PCR
Die ortspezifische Mutagenese (site directed mutagenesis) ist eine Technik, die zur Herstellung individueller Antikörper durch spezifische Mutagenese der zugrundeliegenden DNA nützlich ist. Die Technik macht weiterhin eine gebrauchsfertige Möglichkeit verfügbar, um Sequenz-Varianten herzustellen und zu testen, wobei sie eine oder mehrere der nachfolgenden Berücksichtigungen einbezieht, ob humanisierend oder nicht, indem eine oder mehrere Nukleotid-Sequenzänderungen in die DNA eingeführt werden.
Obwohl viele Verfahren geeignet sind zur Verwendung bei der Mutagenese, wird die Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR^TM) jetzt im allgemeinen bevorzugt. Diese Technologie bietet eine schnelle und effiziente Methode, gewünschte Mutationen in eine vorgegebene DNA-Sequenz einzuführen. Der folgende Text beschreibt insbesondere die Verwendung von PCR^TM, um Punktmutationen in eine Sequenz einzuführen, was verwendet werden kann, um die Aminosäure, die durch eine vorgegebene Sequenz kodiert wird, zu ändern. Adaptationen dieses Verfahrens sind ebenfalls geeignet, um Restriktionsenzym-Schnittstellen in ein DNA-Molekül einzuführen.
Bei diesem Verfahren werden synthetische Oligonukleotide entworfen, um eine Punktmutation an einem Ende eines amplifizierten Segments einzubauen. Nach PCR^TM werden die Enden der amplifizierten Fragmente durch Behandlung mit Klenow-Fragmenten stumpf gemacht (blunt-ended), und die stumpfen Fragmente werden dann ligiert und in einen Vektor subkloniert, um eine Sequenzanalyse zu erleichtern.
Um die Matrizen-DNA herzustellen, die man zu mutagenisieren wünscht, wird die DNA in einen Sektor mit hoher Kopierzahl (high copy number vector), wie etwas pUC19, subkloniert, wobei Restriktionsstellen, die den zu mutierenden Bereich flankieren, verwendet werden. Matrizen-DNA wird dann unter Verwendung eines "Plasmid-Miniprep" hergestellt. Passende Oligonukleotid-Primer, die auf der elterlichen Sequenz beruhen, jedoch nicht die gewünschte Punktmutation enthalten, und welche an dem 5'-Ende durch eine Restriktionsenzym-Schnittstelle flankiert werden, werden unter Verwendung eines Syntheseautomaten synthetisiert. Im allgemeinen ist erforderlich, daß die Primer zu ungefähr 15 Basen oder so der Matrizen-DNA homolog sind. Primer können durch denaturierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese gereinigt werden, obwohl dies zur Verwendung bei der PCR^TM nicht absolut notwendig ist. Das 5'-Ende der Oligonukleotide sollte dann phosphoryliert werden.
Die Matrizen-DNA sollte durch PCR^TM amplifiziert werden, wobei die Oligonukleotid-Primer, welche die gewünschten Punktmutationen enthalten, verwendet werden. Die Konzentration von MgCl₂ in dem Amplifikationspuffer wird im allgemeinen ungefähr 15 mM betragen wird. Im allgemeinen sollten ungefähr 20 bis 25 PCR^TM-Zyklen wie folgt durchgeführt werden: Denaturierung, 35 Sek. bei 95°C; Hybridisierung, 2 Min. bei 50°C; und Verlängerung, 2 Min. bei 72°C. Die PCR^TM wird im allgemeinen einen letzten Verlängerungszyklus von ungefähr 10 Min bei 72°C einschließen. Nach dem letzten Verlängerungsschritt sollten ungefähr 5 Units Klenow-Fragmente der Reaktionsmischung zugesetzt und diese für weitere 15 Min. bei ungefähr 30°C inkubiert werden. Die Exonuclease-Aktivität der Klenow-Fragmente ist erforderlich, um die Enden stumpf und zum Klonieren der stumpfen Enden geeignet zu machen.
Die resultierende Reaktionsmischung sollte im allgemeinen durch nicht-denaturierende Agarosegel- oder Acrylamidgel-Elektrophorese analysiert werden, um zu verifizieren, daß die Amplifikation das vorausgesagte Produkt hervorgebracht hat. Man würde dann die Reaktionsmischung durch Entfernen des meisten Mineralöls, Extrahieren mit Chloroform, um das verbliebene Öl zu entfernen, Extrahieren mit gepuffertem Phenol und dann konzentrieren durch Präzipitation mit 100% Ethanol aufarbeiten. Als nächstes sollte man ungefähr die Hälfte der amplifizierten Fragmente mit einem Restriktionsenzym verdauen, das an den flankierenden Sequenzen, die in den Oligonukleotiden verwendet wurden, schneidet. Die verdauten Fragmente werden auf einem Gel aus niedrigen Temperatur gelierender/schmelzender Agarose gereinigt.
Um die Fragmente zu subklonieren und die Punktmutation zu überprüfen, würde man die beiden amplifizierten Fragmente in einen entsprechend verdauten Vektor durch Ligation der stumpfen Enden subklonieren. Dies würde verwendet werden, um E. coli zu transformieren, aus denen Plasmid-DNA anschließend unter Verwendung eines "Minipreps" hergestellt werden könnte. Der amplifizierte Teil der Plasmid-DNA würde dann durch DNA-Sequenzanalyse analysiert, um zu bestätigen, daß die richtige Punktmutation erzeugt wurde. Dies ist wichtig, da Taq-DNA-Polymerase zusätzliche Mutationen in DNA-Fragmente einführen kann.
Die Einführung einer Punktmutation kann auch unter Verwendung von aufeinander folgenden PCR^TM-Schritten bewirkt werden. Bei diesem Verfahren werden die beiden Fragmente, welche die Mutation beinhalten, einander angelagert und durch beiderseitig geprimte Synthese verlängert. Dieses Fragment wird dann durch einen zweiten PCR^TM-Schritt amplifiziert, wodurch die Ligation der stumpfen Enden, die in dem oben beschriebenen Protokoll erforderlich ist, vermieden wird. Bei diesem Verfahren werden die Präparation der Matrizen-DNA, die Erzeugung der Oligonukleotid-Primer und die erste PCR^TM-Amplifikation wie oben beschrie ben durchgeführt. Bei dieser Vorgehensweise sollten die ausgewählten Oligonukleotide allerdings über eine Strecke zwischen ungefähr 15 und ungefähr 20 Basen zu den Basen der Matrizen-DNA homolog sein und ungefähr 10 Basen oder mehr müssen auch einander überlappen.
Bei der zweiten PCR^TM-Amplifikation würde man jedes amplifizierte Fragment und jeden flankierenden Sequenz-Primer verwenden und eine PCR^TM mit zwischen ungefähr 20 und ungefähr 25 Zyklen durchführen, wobei die oben beschriebenen Bedingungen eingesetzt würden. Man würde wieder die Fragmente subklonieren und unter Verwendung der oben erläuterten Schritte überprüfen, daß die Punktmutation korrekt ist.
Beim Verwenden einer der oben beschriebenen Verfahren wird im allgemeinen bevorzugt, die Mutation durch Amplifizieren eines Fragments das so klein wie möglich ist, einzuführen. Selbstverständlich sollten auch Parameter, wie etwa die Schmelztemperatur des Oligonukleotids, die im allgemeinen durch den GC-Gehalt beeinflußt wird, und die Länge des Oligonukleotids sorgfältig berücksichtigt werden. Die Durchführung dieser Verfahren und deren Optimierung, falls notwendig, werden denjenigen, die sich auf dem Fachgebiet auskennen, bekannt sein und werden weiterhin in verschiedenen Publikationen, wie etwa Current Protocols in Molecular Biology, 1995, beschrieben.
Zum Durchführen einer ortspezifischen Mutagenese kann Tabelle A als eine Referenz eingesetzt werden.
TABELLE A
E9. Rekombinate Expression und Abgabe
Angesichts dessen, daß viele Verfahren verfügbar sind, um Antikörper zu klonieren, können anti-Aminophospholipid-Antikörper durch Routineverfahren der rekombinanten Expression hergestellt werden. Der Begriff „Expressionskonstrukt" soll jede Art von genetischem Konstrukt mit einschließen, das eine Nukleinsäure enthält, die für ein Genprodukt kodiert, in dem ein Teil oder die gesamte kodierende Nukleinsäuresequenz transkribiert werden kann. Das Transkript wird im allgemeinen in ein Protein translatiert. Deshalb wird hier beabsichtigt, daß schließt Expression vorzugsweise sowohl eine Transkription eines anti-Aminophospholipid- Antikörper-Gens oder einer -DNA als auch eine Translation der mRNA in ein anti-Aminophospholipid-Antikörper-Proteinprodukt einschließt.
Wenn für die Expression eines anti-Aminophospholipid-Antikörpers ersteinmal ein geeigneter Klon oder geeignete Klone, entweder auf cDNA oder genomischer DNA beruhend, erhalten worden ist/sind, kann man fortfahren, ein Expressionssystem oder „Konstrukt" zur Produktion eines rekombinanten Antikörpers herzustellen. Das Konstruieren eines DNA-Segments oder von DNA-Segmenten zur Expression in einem prokaryotischen oder eukaryotischen System wird durch Techniken durchgeführt werden, die demjenigen, die sich auf dem Gebiet der rekombinanten Antikörperexpression auskennen, allgemein bekannt sind (Sambrook et al., 1989). Damit das Konstrukt die Expression eines anti-Aminophospholipid-Antikörper-Transkripts bewirkt, wird das Polynukleotid, das den Antikörper kodiert, vorzugsweise unter der transkriptionellen Kontrolle eines Promotors stehen, der die Expression in der ausgewählten Wirtszelle fördert.
Rekombinant hergestellte Antikörper können gereinigt und zur Verabreichung an den Menschen formuliert werden. Alternativ können Nukleinsäuren, die anti-Aminophospholipid-Antikörper kodieren, mittels Gentherapie abgegeben werden. Obwohl nackte rekombinante DNA oder Plasmide eingesetzt werden könne, ist die Verwendung von Liposomen oder Vektoren bevorzugt. Die Fähigkeit bestimmter Viren, mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in Zellen einzudringen und sich in das Wirtszellgenom zu integrieren und virale Gene stabil und effizient zu exprimieren, haben sie zu attraktiven Kandidaten für den Transfer fremder Gene in Säugetierzellen gemacht. Bevorzugte Gentherapie-Vektoren zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden im allgemeinen virale Vektoren sein.
Retroviren sind vielversprechend als Vektoren zur Abgabe von Genen aufgrund ihrer Fähigkeit, ihre Gene in das Wirtsgenom zu integrieren, wobei eine große Menge an fremdem genetischen Material transferiert, ein breites Spektrum von Spezies und Zelltypen infiziert wird und in spezielle Zellinien verpackt werden. Andere Viren, wie etwa Adenovirus, Herpes simplex-Viren (HSV), Cytomegalo-Virus (CMV) und Adeno-assoziierter Virus (AAV), wie etwa die, durch das US-Patent 5,139,941 beschrieben, können ebenfalls konstruiert werden, um als Vektoren zum Gentransfer zu dienen.
Obwohl einige Viren, die fremdes genetisches Material akzeptieren können, im Hinblick auf die Anzahl an Nukleotiden die sie aufnehmen können, und in dem Bereich von Zellen, die sie infizieren beschränkt sind, ist für diese Viren gezeigt worden, daß sie eine erfolgreiche Genexpression bewirken. Adenoviren allerdings integrieren ihr genetisches Material nicht in das Wirtsgenom und benötigen deshalb keine Wirtsreplikation zur Genexpression, was sie idealerweise, zur raschen, effizienten, heterologen Genexpression geeignet macht. Techniken zum Herstellen replikationsdefizienter infektiöser Viren sind im Stand der Technik bestens bekannt.
Bei bestimmten weiteren Ausführungen wird der Gentherapie-Vektor HSV sein. Ein Faktor, der HSV zu einem attraktiven Vektor macht, ist die Größe und Organisation des Genoms. Da HSV groß ist, ist ein Einbauen einer Vielzahl von Genen oder Expressionskassetten weniger problematisch als in anderen kleineren viralen Systemen. Zusätzlich macht die Verfügbarkeit von verschiedenen viralen Kontrollsequenzen mit unterschiedlicher Leistungsfähigkeit (z.B. temporär, Stärke) es möglich, die Expression in einem größeren Umfang als in anderen Systemen zu steuern. Auch ist von Vorteil, daß das Virus relativ wenig gesplicete Informationen aufweist, was genetische Manipulationen weiter vereinfacht. HSV ist auch relativ einfach zu manipulieren und kann mit hohen Titern angezogen werden.
Natürlich wird man unter Verwendung viraler Abgabesysteme wünschen, das Virion ausreichend zu reinigen, um es im wesentlichen frei von unerwünschten Kontaminationen, wie etwa defizienten interferierenden viralen Partikeln oder Endotoxinen und anderen Pyrogenen, zu machen, derart, daß es keinerlei unerwünschte Reaktionen in der Zelle, dem Tier oder einer Versuchsperson, welches) das Vektorkonstrukt erhält, verursacht. Ein bevorzugtes Mittel zum Reinigen des Vektors umfaßt die Verwendung von ansteigenden Dichtegradienten, wie etwa Cäsiumchlorid-Gradienten-Zentrifugation.
E10. Antikörper-Fragmente
Unabhängig von der Quelle des ursprünglichen anti-Aminophospholipid-Antikörpers kann entweder der intakte Antikörper, Antikörper-Multimere oder jeder einer Vielzahl von funktionellen Antigen-bindenden Regionen des Antikörpers im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Beispielhafte funktionelle Regionen schließen scFV-, Fv-, Fab'-, Fab- und F(ab')₂-Fragmente der anti-Aminophospholipid-Antikörper ein. Techniken zum Herstellen solcher Konstrukte sind denjenigen, die sich auf dem Gebiet auskennen, bestens bekannt und werden hier weiter erläutert.
Die Wahl eines Antikörper-Konstrukts kann durch verschiedene Faktoren beeinflußt werden Beispielsweise kann eine verlängerte Halbwertszeit aus der aktiven Readsorption intakter Antikörper innerhalb der Niere, eine Eigenschaft des Fc-Stücks eines Immunglobulins, herrühren. Von Antikörpern auf der Grundlage von IgG wird deshalb erwartet, daß sie langsamer aus dem Blut entfernt werden als ihre Fab'-Gegenspieler. Zusammensetzungen auf der Grundlage des Fab'-Fragments werden allerdings im allgemeinen eine bessere Fähigkeit zum Eindringen in Gewebe zeigen.
Fab-Fragmente können durch Proteolyse des ganzen Immunglobulins durch die nichtspezifische Thiolprotease Papain erhalten werden. Papain muß zunächst durch Reduzieren der Sulphhydrilgruppe im aktiven Zentrum mit Cystein, 2-Mercaptoethanol oder Dithiothreitol aktiviert werden. Schwermetalle im Stamm-Enzym sollten durch Chelatierung mit EDTA (2 mM) entfernt werden, um maximale Enzymaktivität sicherzustellen. Enzym und Substrat werden normalerweise im Verhältnis von 1:100 (Gew./Gew.) miteinander gemischt. Nach Inkubation kann die Reaktion durch irreversible Alkylierung der Thiolgruppe mit Iodacetamid oder einfach durch Dialyse abgestoppt werden. Die Vollständigkeit des Verdaus sollte durch SDS-PAGE überwacht und die verschiedenen Fraktionen durch Protein A-Sepharose oder Ionenaustausch-Chromatographie getrennt werden.
Das gewöhnliche Vorgehen zur Herstellung von F(ab')₂-Fragmenten von IgG menschlichen Ursprungs oder aus Kaninchen ist die limitierte Proteolyse durch das Enzym Pepsin. Die Bedingungen, nämlich 100-facher Antikörper-Überschuß (Gew./Gew.) in Acetatpuffer bei pH 4,5, 37°C, legen nahe, daß der Antikörper am C-terminalen Ende der Disulfidbindung zwischen schweren Ketten gespalten wird. Verdauungsraten von Maus-IgG können je nach Subklasse variieren, und es kann schwierig sein, hohe Ausbeuten von aktiven F(ab')₂-Fragmenten ohne etwas unverdautes oder komplett abgebautes IgG zu erhalten. Insbesondere IgG_2b is gegenüber einem vollständigen Abbau hoch anfällig. Die anderen Subklassen erfordern verschiedene Inkubationsbedingungen, um optimale Ergebnisse hervorzubringen, von denen alle im Stand der Technik bekannt sind.
Verdau von Ratten-IgG durch Pepsin erfordert Bedingungen, einschließlich einer Dialyse in 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,5, und dann 4 Stunden Inkubation mit 1% Gew./Gew. Pepsin. Der IgG₁- und IgG_2a-Verdau wird verbessert, wenn zunächst gegen 0,1 M Aminosäure-Puffer, pH 2,8, bei 4°C 16 Stunden, gefolgt durch Essigsäure-Puffer dialysiert wird. IgG 2_b liefert einheitlichere Ergebnisse bei einer Inkubation mit Stapylococcus V8-Protease (3% Gew./Gew.) in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,8, für 4 Stunden bei 37°C.
Die nachfolgenden Patente und Patentanmeldungen sind hier spezifisch unter Bezugnahme zu Zwecken, die die Lehre der vorliegenden Erfindung im Hinblick auf die Herstellung und Verwendung funktioneller, Antigen-bindender Regionen von Antikörpern, einschließlich scFv-, Fv-, Fab'-, Fab- und F(ab')₂-Fragmenten der anti-Aminophospholipid-Antikörper zu ergänzen: US-Patente 5,855,866, 5,965,132, 6,004,555, 6,093,399 und 5,877,289.
F. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die meisten grundlegenden pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung werden im allgemeinen eine wirksame Menge von mindestens einem ersten nackten anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Antigen-bindenden Fragment davon, gelöst oder dispergiert in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder einem wäßrigen Medium, umfassen. Kombinierte Therapeutika werden ebenfalls in Betracht gezogen und derselbe Typ von zugrundeliegenden pharmazeutischen Zusammensetzungen kann sowohl für einzelne als auch kombinierte Medikamente eingesetzt werden.
Die Ausdrücke "pharmazeutisch oder pharmokoligisch akzeptabel" bezeichnen molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die keine nachteilige, allergische oder anderweitig ungünstige Reaktion hervorrufen, wenn sie einem Tier oder einem Menschen je nachdem verabreicht werden. Wie hier verwendet schließt ein "pharmazeutisch akzeptabler Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle Mittel, Pilzbekämpfungsmittel, isotonische und absorptionsverzögernde Mittel und dergleichen ein. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutisch aktive Substanzen ist im Stand der Technik bestens bekannt. Außer insoweit, als jedes herkömmliche Medium oder Mittel mit dem aktiven Inhaltsstoff inkompatibel ist, wird seine Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Zur Verabreichung an Menschen sollten Präparationen die Standards von Sterilität, Pyrogenität, allgemeiner Sicherheit und Reinheit erfüllen, wie durch das FDA Office of Biologics Standards gefordert wird. Ergänzende aktive Inhaltsstoffe können ebenfalls in die Zusammensetzungen aufgenommen werden.
F1. Parenterale Formulierungen
Die anti-Aminophospholipid-Antikörper der vorliegenden Erfindung werden am häufigsten für die parenterale Verabreichung, z.B. formuliert für eine Injektion über die intravenösen, intramuskulären, subkutanen, transdermalen oder anderen derartigen Wegen, formuliert werden, einschließlich peristaltischer Verabreichung und direkter Einflößung in einen Tumor oder an einer Erkrankungsstelle (Intrakavität-Verabreichung). Die Präparation einer wäßrigen Zusammensetzung, die einen anti-Aminophospholipid-Antikörper als einen aktiven Inhaltsstoff enthält, wird denjenigen, die sich auf dem Gebiet auskennen, im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Typischerweise können derartige Zusammensetzungen als Injektionen, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt werden; fest Formen, die geeignet sind, um zum Herstellen von Lösungen oder Suspensionen nach der Zugabe einer Flüssigkeit vor einer Injektion verwendet zu werden, können ebenfalls hergestellt werden; und die Präparationen können auch emulgiert werden.
Die pharmazeutischen Formen, die für eine injizierbare Verwendung geeignet sind, schließen sterile wäßrige Lösungen oder Dispersionen, Formulierungen, die Sesamöl, Erdnußöl oder wäßriges Propylenglykol enthalten, und sterile Pulver für die unvorbereitete Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen oder Dispersionen ein. In allen Fällen sollte die Form steril und zu ausreichend flüssig sein, damit eine Eignung zur Verwendung in Spritzen vorliegt. Sie sollte unter den Bedingungen der Herstellung und Lagerung stabil sein und sollte gegen die kontaminierende Wirkung von Mikroorganismen, wie etwa Bakterien und Pilzen, konserviert sein.
Die anti-Aminophospholipid-Antikörper-Zusammensetzungen können in einer sterilen wäßrigen Zusammensetzung in einer neutralen oder in Form des Salzes formuliert sein. Lösungen der anti-Aminophospholipid-Antikörper als freie Base oder pharmakologisch akzeptables Salz können in Wasser, geeigneterweise gemischt mit einem Detergenz, wie etwa Hydroxypropylzellulose, hergestellt werden. Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen die Säure-Zugabesalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Proteins) ein und jene, die mit anorganischen Säuren, wie etwa Salz- oder Phosphorsäuren, oder solchen organischen Säuren, wie Essig-, Trifluoressig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und derartigen, gebildet werden. Salze, die mit den freien Carboxygruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen, wie etwa beispielsweise Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Kalzium- oder Eisenhydroxiden und solchen organischen Basen, wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und derartigem, abgeleitet sein.
Geeignete Träger schließen Lösungsmittel und Dispersionsmedien, die beispielsweise Wasser, Ethanol, Polyol (z.B. Glyzerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und derartiges), geeignete Mischungen davon und Pflanzenöle enthalten, ein. In vielen Fällen wird zu bevorzugen sein, isotonische Mittel einzuschließen, beispielsweise Zucker oder Natriumchlorid. Die richtige Fluidität kann beispielsweise durch Verwendung einer Beschichtung, wie etwa Lecithin beibehalten werden, indem die erforderliche Partikelgröße im Fall einer Dispersion und/oder durch die Anwendung von Detergenzien beibehalten wird.
Unter gewöhnlichen Bedingungen von Lagerung und Verwendung sollten alle derartigen Präparationen ein Konservierungsmittel enthalten, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhüten. Die Verhütung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene anit-bakterielle Mittel und anti-Pilzmittel, z.B. Parabene, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosale und derartiges, herbeigeführt werden. Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln in den Zusammensetzungen herbeigeführt werden, welche eine Absorption verzögern, beispielsweise Aluminiummonostearat und Gelatine.
Vor oder nach einer Formulierung sollten die anti-Aminophospholipid-Antikörper ausführlich dialysiert werden, um ungewünschte Moleküle mit kleinem Molekulargewicht zu entfernen, und/oder lyophilisiert werden, für eine mehr gebrauchsfertige Formulierung in einem gewünschten Lösungsmittel, je nachdem. Sterile injizierbare Lösungen werden hergestellt, indem die aktiven anti-Aminophospholipid-Antikörper in der erforderlichen Menge in dem geeigneten Lösungsmittel mit verschiedenen der anderen Inhaltsstoffe, die oben aufgelistet sind, wie gewünscht, aufgenommen werden, gefolgt von Sterilfiltration. Im allgemeinen werden Dispersionen hergestellt, indem die verschiedenen sterilisierten aktiven Inhaltsstoffe in einem sterilen Lösungsmittel aufgenommen werden, welches das grundlegende Dispersioinsmedium und die erforderlichen anderen Inhaltsstoffe der oben aufgelisteten enthält.
Im Fall von sterilen Pulvern zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrockungstechniken, die ein Pulver des aktiven anti-Aminophospholipid-Antikörper-Inhaltsstoffs plus jeden zusätzlichen gewünschten Inhaltsstoff aus einer zuvor steril filtrierten Lösung davon liefern.
Geeignete pharmazeutische Zusammensetzungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden im allgemeinen eine Menge des anti-Aminophospholipid-Antikörpers, gemischt mit einem akzeptablen pharmazeutischen Verdünnungsmittel oder Arzneiträger, wie etwa einer sterilen wäßrigen Lösung, einschließen, um einen Bereich von Endkonzentrationen zu ergeben, die von der beabsichtigten Verwendung abhängen. Die Herstellungstechniken sind im allgemeinen im Stand der Technik bestens bekannt, wie durch Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Auflg., Mack Publishing Company, 1980, erläutert. Es sollte bewußt sein, daß eine Endotoxin-Kontamination minimal bei einer sicheren Konzentration gehalten werden sollte, beispielsweise weniger als 0,5 ng/mg Protein. Darüber hinaus sollten Präparationen zur Verabreichung an den Menschen die Standards von Sterilität, Pyrogenität, allgemeiner Sicherheit und Reinheit erfüllen, wie durch das FDA Office of Biological Standards gefordert.
Nach der Formulierung werden anti-Aminophospholipid-Antikörper-Lösungen in einer Weise verabreicht werden, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist und in einer solchen Menge, wie sie therapeutisch wirksam ist. Formulierungen werden leicht in einer Vielzahl von Dosierungsformen verabreicht, wie etwa dem oben beschriebenen Typ von injizierbaren Lösungen, andere pharmazeutisch akzeptable Formen werden jedoch auch in Betracht gezogen, z.B. Tabletten, Pillen, Kapseln oder andere Feststoffe zur oralen Verabreichung, Zäpfchen, Pessare, nasale Lösungen oder Sprays, Aerosole, Inhalationsmittel, liposomale Formen und derartiges. Pharmazeutische Kapseln oder Zusammensetzungen mit "langsamer Freisetzung" (slow release)können ebenfalls verwendet werden. Formulierungen mit langsamer Freisetzung werden im allgemeinen entworfen, um einen konstanten Wirkstoffspiegel über eine ausgedehnte Zeitdauer zu ergeben und können verwendet werden, um anti-Aminophospholipid-Antikörper im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung abzugeben.
F2. Liposomen und Nanokapseln
Bei bestimmten Ausführungen können auch Liposomen und/oder Nanopartikel mit den anti-Aminophospholipid-Antikörpern eingesetzt werden. Die Bildung und Verwendung von Liposomen ist denjenigen, die sich auf dem Gebiet auskennen, im allgemeinen bekannt, wie unten zusammengefaßt.
Liposomen werden aus Phospholipiden gebildet, die in einem wäßrigen Medium dispergiert werden und spontan multilamellare konzentrische Doppelschicht-Vesikel (auch als multilamellare Vesikel, multilamellar vesicles MLVs bezeichnet) bilden. MLVs weisen im allgemeinen Durchmesser von 25 nm bis 4 μm auf. Eine Ultraschallbehandlung von MLVs führt zur Bildung von kleinen unilamellaren Vesikeln (small unilamellar vesicles, SUVs) mit Durchmessern im Bereich von 200 bis 500 Å, welche in dem Kern eine wäßrige Lösung enthalten.
Phospholipide können eine Vielfalt von anderen Strukturen als Liposomen bilden, wenn sie in Wasser dispergiert werden, was von dem molaren Verhältnis von Lipid zu Wasser abhängt. Bei niedrigen Verhältnissen ist das Liposom die bevorzugte Struktur. Die physikalischen Charakteristika von Liposomen hängen ab vom pH-Wert, der Ionenstärke und dem Vorhandensein divalenter Kationen. Liposomen können gegenüber ionischen und polaren Substanzen eine niedrige Permeabilität zeigen, bei erhöhten Temperaturen jedoch einem Übergang in einen anderen Zustand unterliegen, welche ihre Permeabilität spürbar verändert. Diese Phasenumwandlung umfaßt eine Veränderung von einer enggepackten, geordneten Struktur, bekannt als der Gelzustand, in einer locker gepackte, weniger stark geordnete Struktur, bekannt als der Fluidzustand. Dies tritt bei einer charakteristischen Phasenübergangstemperatur auf und führt zu einer Zunahme der Permeabilität für Ionen, Zucker und Wirkstoffe.
Liposomen interagieren mit Zellen mittels vier verschiedener Mechanismen: Endozytose durch phagozytische Zellen des retikuloendothelialen Systems, wie etwa Makrophagen und Neutrophilen, Adsorption an die Zelloberfläche, entweder durch unspezifische schwache hydrophobe oder elektrostatische Kräfte oder durch spezifische Wechselwirkungen mit Zelloberflächenbestandteilen, Fusion mit der Zellplasmamembran durch Insertion der Lipid-Doppelschicht des Liposoms in die Plasmamembran, wobei gleichzeitig Inhalte der Liposomen in das Zytoplasma freigesetzt werden, und durch Transfer liposomaler Lipide zu zellulären oder subzellulären Membranen oder, vice versa, ohne jede Assoziation der Liposomenin halte. Ein Variieren der Liposomenformulierung kann zeigen, welcher Mechanismus zweckmäßig ist, obwohl mehr als einer zur selben Zeit funktionieren kann.
Nanokapseln können im allgemeinen Verbindungen in einer stabilen und reproduzierbaren Weise einschließen. Um Nebenwirkungen aufgrund intrazellulärer Polymer-Überladung zu vermeiden, sollten solche utrafeinen Partikel (mit Größen von ungefähr 0,1 μm) unter Verwendung von Polymeren, welche die Eigenschaft aufweisen, in vivo abgebaut zu werden, entworfen werden. Biodegradierbare Polyalkylcyanoacrylat-Nanopartikel, welche diese Anforderungen erfüllen, werden zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen, und solche Partikel können leicht hergestellt werden.
G. Therapeutische Kits
Es werden auch therapeutische Kits offenbart, die anti-Aminophospholipid-Antikörper zur Verwendung bei den vorliegenden Behandlungsverfahren umfassen. Derartige Kits werden im allgemeinen eine pharmazeutisch akzeptable Formulierung von mindestens einem anti-Aminophospholipid-Antikörper in einer geeigneten Behältervorrichtung enthalten. Die Kits können auch andere pharmazeutisch akzeptable Formulierungen enthalten, entweder zur Diagnose/zur bildlichen Darstellung oder zur kombinierten Therapie. Beispielsweise können derartige Kits jedes oder mehrerer eines Bereichs chemotherapeutischer oder radiotherapeutischer Wirkstoffe, anti-angiogener Mittel, anti-Tumorzell-Antikörper und/oder anti-Tumorgefäß-, oder anti-Tumorstroma-Immuntoxine oder Koaguliganden enthalten.
Die Kits können einen einzelnen Behälter (Behältervorrichtung) aufweisen, der anti-Aminophospholipid-Antikörper mit oder ohne jeden zusätzlichen Bestandteil enthält, oder sie können unterschiedliche Behälter für jedes gewünschte Mittel aufweisen. Wenn kombinierte Therapeutika verfügbar gemacht werden, kann eine einzelne Lösung vorgemischt werden, entweder in einer molar äquivalenten Kombination oder mit einem Bestandteil im Überschuß gegenüber dem anderen. Alternativ kann jeder der anti-Aminophospholipid-Antikörper und anderen anti-Krebs-Mittel-Bestandteile des Kits innerhalb verschiedener Behälter vor Verabreichung an einen Patienten aufbewahrt werden.
Wenn die Bestandteile des Kits in einer oder mehreren flüssigen Lösungen verfügbar gemacht werden, ist die flüssige Lösung vorzugsweise eine wäßrige Lösung, wobei eine sterile wäßri ge Lösung besonders bevorzugt ist. Allerdings können die Bestandteile des Kits als getrocknete(r) Pulver verfügbar gemacht werden. Wenn Reagenzien oder Bestandteile als ein trockenes Pulver verfügbar gemacht werden, kann das Pulver durch Zugabe eines geeigneten Lösungsmittels rekonstituiert werden. Es wird sich vorgestellt, daß das Lösungsmittel ebenfalls in einem anderen Behälter verfügbar gemacht wird.
Die Behälter des Kits werden im allgemeinen mindestens eine Phiole (ein Vial), ein Reagenzglas, einen Kolben, eine Flasche, eine Spritze oder eine andere Behältervorrichtung einschließen, in welche der anti-Aminophospholipid-Antikörper und jedes andere gewünschte Mittel hineingetan und vorzugsweise geeignet aliquotiert werden kann. Wenn getrennte Bestandteile eingeschlossen sind, wird das Kit im allgemeinen auch eine zweite Phiole oder einen anderen Behälter, in welchen dieser getan wird, enthalten, wodurch eine Verabreichung von getrennten entworfenen Dosen ermöglicht wird. Die Kits können auch eine zweite/dritte Behältervorrichtung zum Enthalten eines sterilen, pharmazeutisch akzeptablen Puffers oder eines anderen Verdünnungsmittels umfassen.
Die Kits können auch Vorrichtungen enthalten, durch welche das der anti-Aminophospholipid-Antikörper an ein Tier oder einen Patienten verabreicht wird, z.B. eine oder mehrere Nadeln oder Spritzen oder sogar eine Augentropfenvorrichtung, Pipette oder andere derartige Apparate, aus denen die Zusammensetzung in das Tier in injiziert oder an einen erkrankten Bereich des Körpers verabreicht werden kann. Die Kits der vorliegenden Erfindung werden auch typischerweise eine Vorrichtung zum Aufnehmen der Phiolen oder derartiges und andere Bestandteile, die im engen Zusammenhang mit kommerziellem Verkauf stehen, enthalten, wie etwa z.B. Einspritz- oder blasgeformte Kunststoffbehälter, in welche die gewünschten Phiolen oder andere Apparate gestellt und darin gehalten werden.
H. Tumorbehandlung
Die wichtigste Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung vaskularisierter maligner Tumoren, wobei die Behandlung benigner Tumore, wie etwa BPH, ebenfalls in Betracht gezogen wird. Die Erfindung kann auch bei der Therapie anderer Erkrankungen und Störungen mit pro-thrombotischen Blutgefäßen als einem Bestandteil der Erkrankung angewendet werden. Derartige, mit der Vaskulatur in Zusammenhang stehende Erkrankungen schließen eine diabetische Retinopathie, Makuladegeneration, vaskuläre Restenose, ein schließlich einer Restenose im Anschluß an eine Angioplastie, arteriovenöse Mißbildungen (arteriovenous malformations, AVM), ein Meningiom, Hämangiom, neovaskuläres Glaukom und Psoriasis, und auch ein Angiofibrom, Arthritis, rheumatoide Arthritis, atherosklerotische Plaques, korneale Transplantat-Neovaskularisierung, hämophile Gelenke, hypertrophe Narben, ein Osler-Weber-Syndrom, pyogene retrolentale Granulomfibroplasie, Scleroderm, Trachom, vaskuläre Adhäsion, Synovitis, Dermatitis, verschiedene andere entzündliche Erkrankungen und Störungen und sogar eine Endometriose ein.
Die anti-Aminophospholipid-Antikörper-Behandlung der Erfindung wird am stärksten bevorzugt für die Behandlung solider Tumoren genutzt. Solche Anwendungen können anti-Aminophospholipid-Antikörper allein oder in Kombination mit chemotherapeutischen, radiotherapeutischen, Apoptose-, anti-angiogenen Mitteln und/oder Immuntoxinen oder Koaguliganden einsetzen. Die anti-Aminophospholipid-Antikörper-Verfahren, die durch diese Erfindung verfügbar gemacht werden, sind breit auf die Behandlung jedes malignen Tumors mit einer vaskulären Komponente anwendbar. Typische vaskularisierte Tumoren sind die soliden Tumoren, insbesondere Karzinome, welche einen vaskulären Bestandteil für die Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen erfordern. Beispielhafte solide Tumoren, die unter Verwendung der Erfindung behandelt werden können, schließen Karzinome von Lunge, Brust, Ovar, Magen, Pancreas, Larynx, Ösophagus, Hoden, Leber, Parotis, Gallengang, Kolon, Rektum, Zervix, Uterus, Endometrium, Niere, Blase, Prostata, Schilddrüse, Schwammzellkarzinome, Adenokarzinome, kleinzellige Karzinome, Melanome, Gliome, Neuroblastome und derartiges ein, ohne darauf beschränkt zu sein.
Die vorliegende Erfindung wird in Betracht gezogen zur Verwendung zur Behandlung jedes Patienten, der sich mit einem soliden Tumor vorstellt. Da jedoch diese Erfindung bei der Behandlung solider Tumoren von gemäßigtem oder ausgedehntem Umfang besonders erfolgreich ist, werden Patienten in diesen Kategorien wahrscheinlich mehr signifikante Vorteile von einer Behandlung in Übereinstimmung mit den hier verfügbar gemachten Verfahren und Zusammensetzungen erfahren.
Deshalb kann die Erfindung allgemein verwendet werden, um Tumoren vom ungefähr 0,3 bis 0,5 cm und aufwärts zu behandeln, obwohl eine bessere Verwendung der Erfindung ist, Tumoren von einem Ausmaß größer als 0,5 cm zu behandeln. Aufgrund der Studien, die in annehmbaren Tiermodellen bereits durchgeführt wurden, wird angenommen, daß Patienten, die sich mit Tumoren von einer Größe zwischen ungefähr 1,0 und ungefähr 2,0 cm vorstellen, in der bevorzugten Behandlungsgruppe von Patienten für eine anti-Aminophospholipid-Antikörper-Therapie sein werden, obwohl Tumoren bis zu und einschließlich den größten Tumoren, die beim Menschen gefunden werden, ebenfalls behandelt werden können.
Obwohl die die vorliegende Erfindung nicht allgemein zur Verwendung bei einer präventiven oder prophylaktischen Behandlung beabsichtigt ist, ist eine Verwendung der Erfindung sicher nicht auf die Behandlung von Patienten mit Tumoren von nur mittelmäßigem oder großem Umfang beschränkt. Es gibt viele Gründe, die diesen Aspekt des Umfangs der Erfindung zugrunde liegen. Beispielsweise kann ein Patient, der sich mit einem primären Tumor von mittlerer Größe oder darüber vorstellt, auch verschiedene andere metastasierende Tumoren aufweisen, die als klein oder sogar in den früheren Stadien einer metastatischen Tumorzellstreuung gelten. Angesichts dessen, daß die anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Kombinationen der Erfindung im allgemeinen in die systematische Zirkulation eines Patienten verabreicht werden, werden sie natürlich Wirkungen auf die sekundären, kleineren und metastatischen Tumoren ausüben, obwohl dies nicht die vorrangige Absicht der Behandlung sein muß. Weiterhin, sogar in Situationen, in denen die Tumormasse als ein Ganzes ein einzelner kleiner Tumor ist, werden bestimmte vorteilhafte anti-Tumor-Wirkungen aus der Verwendung der vorliegenden anti-Aminophospholipid-Antikörper-Behandlung resultieren.
Die Anleitung, die hier im Hinblick auf die am besten geeigneten Patienten zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verfügbar gemacht wird, ist als Lehre beabsichtigt, daß bestimmte Patientenprofile bei der Auswahl von Patienten für eine Behandlung durch die vorliegende Erfindung helfen können. Die Vorauswahl bestimmter Patienten oder Kategorien von Patienten verneint keinesfalls die grundsätzliche Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung im Zusammenhang mit der Behandlung aller Patienten mit einem vaskularisierten Tumor. Eine weitere Überlegung ist die Tatsache, daß der Angriff auf den Tumor, der durch die anti-Aminophospholipid-Antikörpe-Therapie der Erfindung verfügbar gemacht wird, den Tumor gegenüber weiterer therapeutischer Behandlung prädisponieren kann, derart, daß die anschließende Behandlung zu einer umfassenden synergistischen Wirkung führt oder sogar zu einer totalen Remission oder Heilung führt.
Es wird nicht angenommen, daß irgendein besonderer Typ von Tumor von einer Behandlung unter Verwendung der vorliegenden Erfindung ausgeschlossen werden sollte. Der Typ von Tumorzellen kann jedoch für die Verwendung der Erfindung in Kombination mit sekundären therapeutischen Mitteln, insbesondere Chemotherapeutika und Anti-Tumorzell-Immuntoxinen, von Bedeutung sein. Da die Wirkung der vorgelegten Therapie darin liegt, die Tumorvaskulatur zu zerstören, und da die Vaskulatur im wesentlichen oder vollkommen dieselbe in allen soliden Tumoren ist, wird verstanden werden, daß die vorliegende anti-Aminophospholipid-Antikörper-Methodik weithin oder vollständig auf die Behandlung aller soliden Tumoren anwendbar ist, unabhängig von dem besonderen Phenotyp oder Genotyp der Tumorzellen selbst. Die hier vorgelegten Ergebnisse sind bestechend, da sie beeindruckende Ergebnisse in einem Tumormodell zeigen, das einer Nekrose widersteht.
Therapeutisch wirksame Dosen von anti-Aminophospholipid-Antikörpern sind leicht zu bestimmen, indem Ergebnisse eines Tiermodells verwendet werden, wie in den hier ausführlich beschriebenen Studien gezeigt wird. Versuchstiere, die solide Tumoren tragen, werden häufig verwendet, um geeignete therapeutische Dosen vor dem Übertragen auf eine klinische Umgebung zu optimieren. Von derartigen Modellen ist bekannt, daß sie sehr zuverlässig im Vorhersagen wirksamer Anti-Krebs-Strategien sind. Beispielsweise ist die Verwendung von soliden Tumoren tragenden Mäusen, wie etwa in den Beispielen verwendet, in präklinischen Tests weit verbreitet. Die Erfinder haben solche auf dem betreffenden Fachgebiet anerkannte Mäusemodelle verwendet, um Arbeitsbereiche von nackten anti-Aminophospholipid-Antikörpern zu bestimmen, die vorteilhafte anti-Tumor-Wirkungen mit minimaler Toxizität ergeben.
Wie im Stand der Technik bekannt, gibt es realistische Richtwerte, die als eine Anleitung in Verbindung mit einem präklinischen Austesten verwendet werden können, bevor man zur klinischen Behandlung übergeht. Aufgrund der Sicherheit allerdings, die in anerkannten Modellen bereits demonstriert wurde, wird ein präklinisches Austesten der vorliegenden Erfindung eher Gegenstand einer Optimierung sein, anstatt die Wirksamkeit zu bestätigen. Präklinische Tests können daher eingesetzt werden, um die an meisten vorteilhaften anti-Aminophospholipid-Antikörper, Dosen oder Kombinationen auszuwählen.
Jede anti-Aminophospholipid-Antikörper-Dosis oder jedeskombinierte Medikament, das/die zu irgendeiner einheitlich nachweisbaren Zerstörung der Tumorvaskulatur, Thrombose und zu anti-Tumor-Wirkungen führt, wird noch eine nützliche Erfindung definieren. Destruktive, thrombotische und nekrotische Wirkungen sollten bei zwischen ungefähr 10% und ungefähr 40% bis 50% der Tumorblutgefäße und Tumorgewebe beobachtet werden, wobei bis zu zwischen ungefähr 50% und ungefähr 99% solcher Wirkungen beobachtet werden. Die vorliegende Erfindung kann auch gegen Gefäße stromabwärts von dem Tumor wirksam sein, d.h. auf mindestens ein Subset der ableitenden Gefäße abzielen, insbesondere da Zytokine, die aus dem Tumor freigesetzt werden, an diesen Gefäßen wirken werden, wodurch deren antigenes Profil verändert wird.
Es soll ebenfalls verstanden werden, daß selbst unter solchen Umständen, unter denen die anti-Tumor-Wirkungen der anti-Aminophospholipid-Antikörper-Dosis oder einer kombinierten Therapie eher bei den niedrigen Werten dieses Bereichs liegen, es sein kann, daß diese Therapie noch gleichwirkend oder sogar wirksamer ist, als andere bekannte Therapien im Zusammenhang mit den speziellen Tumorzielen. Unglücklicherweise ist für einen Kliniker offensichtlich, daß bestimmte Tumoren mittelfristig oder langfristig nicht wirksam behandelt werden können, was jedoch die Nützlichkeit der vorliegenden Therapie nicht verneint, insbesondere wenn sie mindestens ungefähr so wirksam ist wie andere im allgemeinen vorgeschlagene Strategien.
Beim Entwerfen geeigneter Dosen von anti-Aminophospholipid-Antikörpern oder kombinierten Therapeutika zur Behandlung vaskularisierter Tumore kann man leicht, von den hier beschriebenen Tierexperimenten ausgehend extrapolieren, um zur klinischen Verabreichung geeigneten Dosen zu gelangen. Um diese Umsetzung zu erreichen, würde man die Menge an Mittel, die pro Einheit Masse des Versuchstiers verabreicht wurde, berücksichtigen, und vorzugsweise die Unterschiede hinsichtlich der Körperoberfläche zwischen dem Versuchstier und dem menschlichen Patienten berücksichtigen. Alle derartigen Berechnungen sind denjenigen, die sich auf dem Gebiet auskennen, bestens bekannt und Routine.
Wenn man beispielsweise die erfolgreichen Dosen von 20μg Antikörper/Maus (Gesamtgewicht von ungefähr 20g) nimmt und Standardberechnungen auf der Grundlage von Masse und Oberfläche anwendet, würden wirksame Dosen zur Verwendung bei menschlichen Patienten zwischen ungefähr 1 mg und ungefähr 500 mg Antikörper pro Patient und vorzugsweise zwischen ungefähr10 mg und ungefähr 100 mg Antikörper pro Patient betragen. Zusätzlich zu allen variierbaren klinischen und therapeutischen Parametern ist diese Abwandlung auch für die vorliegenden Tumornekrose-Daten verantwortlich, die unter Verwendung eines Tumor modells, das einer Nekrose widersteht, erzeugt worden sind, und bei dem weniger Färbung von Tumorgefäßen als in anderen Modellen beobachtet wurde.
Unter Verwendung dieser Information ziehen die Erfinder dementsprechend in Erwägung, daß nutzbringend niedrige Dosen von nackten anti-Aminophospholipid-Antikörpern zur Verabreichung an Menschen ungefähr 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 oder ungefähr 30 mg oder so pro Patient betragen werden, und daß nutzbringend hohe Dosen von nackten anti-Aminophospholipid-Antikörpern zur Verabreichung an Menschen ungefähr 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475 oder ungefähr 500 mg oder so pro Patient betragen werden. Für nutzbringende mittlere Dosen von nackten anti-Aminophospholipid-Antikörpern zur Verabreichung am Menschen werden ungefähr 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 oder ungefähr 225 mg oder so pro Patient in Betracht gezogen. Jeder bestimmte Bereich unter Verwendung einer jeden der zuvor aufgeführten exemplarischen Dosen oder jeder Wert, der sich zwischen den besonders angegebenen Bereichen befindet, wird in Betracht gezogen.
Im allgemeinen werden Dosierungsbereiche von zwischen ungefähr 5 bis 100 mg, ungefähr 10 bis 80 mg, ungefähr 20 bis 70 mg, ungefähr 25 bis 60 mg oder ungefähr 30 bis 50 mg oder so anti-Aminophospholipid-Antikörper pro Patient bevorzugt sein. Ungeachtet dieser angegebenen Bereiche, wird verstanden werden, daß angesichts der hier dargestellten Parameter und detaillierten Anleitung weitere Abwandlungen der aktiven oder optimalen Bereiche von der vorliegenden Erfindung umfaßt werden. Obwohl Dosen in und um ungefähr 5 oder 10 bis ungefähr 70, 80, 90 oder 100 mg pro Patient gegenwärtig bevorzugt werden, wird verstanden werden, daß niedrigere Dosen in Kombination mit anderen Mitteln geeigneter sein können, und daß hohe Dosen noch toleriert werden können, insbesondere angesichts der erhöhten Sicherheit der unkonjugierten anti-Aminophospholipid-Antikörper zur Verwendung im Zusammenhang mit der Erfindung. Die Verwendung menschlicher oder humanisierter nackter anti-Aminophospholipid-Antikörper oder Bindungsproteine macht die vorliegende Erfindung sogar sicherer für eine klinische Verwendung, wobei das Risiko von erheblicher Toxizität oder erheblichen Nebenwirkungen in gesunden Geweben reduziert wird.
Die Absicht der Therapiepläne unter Verwendung der vorliegenden Erfindung ist im allgemeinen, signifikante Anti-Tumor-Wirkungen hervorzurufen, während die Dosis noch unterhalb der Konzentrationen, die mit unannehmbar Toxizität einhergehen, gehalten wird. Zusätzlich zum Abwandeln der Dosis selbst kann der Verabreichungsplan auch angepaßt werden, um die Behandlungsstrategie zu optimieren. Eine gegenwärtig bevorzugte Verabreichungsstrategie ist, zwischen ungefähr 1 bis 500 mg und vorzugsweise zwischen ungefähr 10 bis 100 mg des anti-Aminophospholipid-Antikörpers oder einen therapeutischen Cocktail, der solche enthält, ungefähr drei Mal innerhalb einer ungefähr siebentägigen Zeitdauer zu verabreichen. Beispielsweise würden Dosen ungefähr am Tag 1, Tag 3 oder 4 und Tag 6 oder 7 gegeben werden.
Beim Verabreichen der speziellen Dosen selbst würde man dem Patienten vorzugsweise eine pharmazeutisch akzeptable Zusammensetzung (gemäß der FDA-Standards von Sterilität, Pyrogenität, Reinheit und allgemeiner Sicherheit) systemisch verabreichen. Eine intravenöse Injektion wird allgemein bevorzugt, und das am stärksten bevorzugte Verfahren ist, eine kontinuierliche Infusion über eine Zeitdauer von ungefähr 1 oder 2 Stunde oder so einzusetzen. Obwohl es nicht erforderlich ist, derartige Parameter vor einer Behandlung unter Verwendung der vorliegenden Erfindung zu bestimmen, sollte zur Kenntnis genommen werden, daß die hier ausführlich beschriebenen Studien mindestens zu etwas Thrombose führt, was spezifisch in den Blutgefäßen eines soliden Tumors innerhalb von ungefähr 12 bis 24 Stunden nach einer Injektion beobachtet wird, und daß die Tumorzellen selbst beginnen, innerhalb von 24 bis 72 Stunden abzusterben. Eine umfassende Tumornekrose wird im allgemeinen während der nächsten ungefähr 48 bis 96 Stunden beobachtet, wobei bis zu und einschließlich mehr als 60% Nekrose beobachtet wird.
Natürlich werden vor einer breiten Anwendung klinische Studien durchgeführt werden. Die verschiedenen Elemente des Durchführens einer klinischen Studie, einschließlich Patientenbehandlung und -überwachung, wird denjenigen, die sich auf dem Gebiet auskennen, im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung bekannt sein. Die folgende Information wird als eine allgemeine Anleitung zur Verwendung beim Etablieren derartiger Studien dargestellt.
Patienten, die für Studien zu einer ersten Behandlung mit einem anti-Aminophospholipid-Antikörper ausgewählt werden, werden auf mindestens einen Durchgang einer konventionellen Therapie keine Antwort gezeigt haben und werden eine objektiv meßbare Erkrankung aufweisen, wie durch physikalische Untersuchung, Labortechniken und/oder radiographische Verfahren bestimmt. Jede Chemotherapie sollte mindestens zwei Wochen vor Eintritt in die Studie beendet sein. Wenn monoklonale Maus-Antikörper oder Teile der Antikörper einge setzt werden, sollte die Krankengeschichte der Patienten keine Allergie gegen Mäuseimmunglobulin aufweisen.
Bestimmte Vorteile werden bei der Verwendung eines zentralen venösen Dauerkateters mit einem Dreiwegeharn gefunden werden. Die anti-Aminophospholipid-Antikörper sollten filtriert, beispielsweise unter Verwendung eines 0,22 μ Filters, und geeignet auf ein Endvolumen von 100 ml, etwa mit Kochsalzlösung, verdünnt werden. Vor der Anwendung sollte die zu untersuchende Probe ebenfalls auf eine ähnliche Weise filtriert und ihre Konzentration vor und nach Filtration durch Bestimmen der A₂₈₀ abgeschätzt werden. Die erwartete Wiederfindung sollte im Bereich von 87% bis 99% liegen, und Korrekturen eines Proteinverlusts können dann einbezogen werden.
Diese anti-Aminophospholipid-Antikörper können über eine Zeitdauer von ungefähr 4 bis 24 Stunden verabreicht werden, wobei jeder Patient zwei bis vier Infusionen in zwei- bis siebentägigen Intervallen erhält. Eine Verabreichung kann auch durch eine Dauerinfusion über eine Dauer von sieben Tagen durchgeführt werden. Die Infusion, die bei jeder Dosis gegeben wird, sollte von jeder beobachteten Toxizität abhängen. Wenn daher eine Grad II-Toxizität nach irgendeiner einzelnen Infusion oder bei einer bestimmten Zeitdauer im Fall einer Dauerinfusion erreicht wird, sollten weitere Dosen zurückgehalten oder die Dauerinfusion abgebrochen werden, bis die Toxizität verbessert ist. Steigende Dosen von anti-Aminophospholipid-Antikörpern sollen an Gruppen von Patienten verabreicht werden, bis ungefähr 60% der Patienten eine unannehmbare Grad III- oder IV-Toxizität in jeder Kategorie zeigen. Dosen, die 2/3 dieses Werts ausmachen, werden als sichere Dosis definiert.
Eine physikalische Untersuchung, Tumormessungen und Labortests sollten selbstverständlich vor einer Behandlung und in Intervallen bis zu einem Monat später durchgeführt werden. Labortests sollten ein vollständiges Blutbild, Serumkreatinin, Kreatininkinase, Elektrolyte, Harnstoff, Stickstoff, SGOT, Bilirubin, Albumin und Serumgesamtprotein einschließen. Serumproben, die bis zu 60 Tagen nach der Behandlung gewonnen wurden, sollten durch einen Radioimmuntest auf das Vorhandensein der verabreichten anti-Aminophospholipid-Antikörper und Antikörper gegen jede Teile davon überprüft werden. Immunologische Analysen von Seren unter Verwendung eines jeden Standardtests, wie etwa beispielsweise einem ELISA oder RIA, werden ermöglichen, die Pharmakokinetiken des therapeutischen anti-Aminophospholipid-Mittels und seine Entfernung aus der Zirkulation zu überprüfen.
Um die anti-Tumor-Antworten zu bewerten, sollten die Patienten 48 Stunden bis 1 Woche und wieder 30 Tage nach der letzten Infusion untersucht werden. Wenn eine tastbare Erkrankung vorhanden war, sollten zwei perpendikuläre Durchmesser von allen Massen täglich während der Behandlung, innerhalb einer Woche nach Beendigung der Therapie und nach 30 Tagen gemessen werden. Um eine nicht tastbare Erkrankung zu messen, könnten serielle CT-Scans in 1-cm-Intervallen im gesamten Brustkorb, Abdomen und Becken 48 Stunden bis 1 Woche und wieder nach 30 Tagen durchgeführt werden. Gewebeproben sollten auch histologisch und/oder durch Durchflußzytometrie bewertet werden, wobei Biopsien von den Erkrankungsstellen oder sogar Blut- oder Flüssigkeitsproben verwendet werden, wenn dies angebracht ist.
Klinische Antworten können durch eine akzeptable Messung definiert werden. Beispielsweise kann eine vollständige Antwort durch das Verschwinden aller meßbaren Tumoren einen Monat nach Behandlung definiert werden. Eine Teilantwort kann durch eine 50%-ige oder größere Reduktion der Summe der Produkte der perpendikulären Durchmesser aller auswertbaren Tumorknoten einen Monat nach der Behandlung, definiert werden, wobei keine Stellen im Tumor eine Vergrößerung zeigen. Auf ähnliche Weise kann eine gemischte Antwort durch eine Reduktion des Produkts der perpendikulären Durchmesser aller meßbaren Läsionen um 50% oder mehr einen Monat nach der Behandlung mit einer Progression an einer oder mehreren Stellen definiert werden.
Angesichts von Ergebnissen aus klinischen Studien, wie etwa jenen, die oben beschrieben wurden, kann sogar ein noch präziserer Behandlungsplan formuliert werden. Selbst dann kann etwas Abwandlung bei der Dosierung in Abhängigkeit vom Zustand der zu behandelnden Versuchsperson später notwendig sein. Der Arzt, der für die Verabreichung verantwortlich ist, wird angesichts der vorliegenden Offenbarung in der Lage sein, die passende Dosis für die individuelle Versuchsperson zu bestimmen. Eine derartige Optimierung und Einstellung wird im Stand der Technik routinemäßig ausgeführt und spiegelt in keiner Weise ein unangemessenes Ausmaß eines Experimentierens wider.
I. Tumordarstellung durch bildgebende Verfahren
Weiterhin macht die vorliegende Erfindung kombinierte Tumorbehandlungs- und bildgebende Verfahren verfügbar, die auf anti-Aminophospholipid-bindenden Liganden beruhen. Anti-Aminophospholipid-bindende Proteine oder Antikörper, die mit einem oder mehreren nachweisbaren Mitteln verknüpft sind, werden zur Verwendung bei bildlicher Vor-Darstellung (pre-imaging) des Tumors vorgesehen, wobei ein zuverlässiges Bild vor der Behandlung erzeugt wird, welches selbst auf die Aminophospholipid-Marker abzielt. Zusätzlich zu Antikörpern wird die Verwendung von nachweisbar markierten Annexinen oder anderen Aminophospholipid-bindenden Liganden in Betracht gezogen, wie in der PCT-Offenlegungsschrift WO-A-00/02587 offenbart und beansprucht.
Die anti-Aminophospholipid-bildgebenden Liganden oder Antikörper oder Konjugate davon werden im allgemeinen einen anti-Aminophospholipid-Antikörper oder -bindenden Liganden, der funktionsfähig an eine nachweisbare Markierung angehängt oder damit konjugiert ist, umfassen. "Nachweisbare Markierungen" sind Verbindungen oder Elemente, die aufgrund ihrer spezifischen funktionellen Eigenschaften oder chemischen Charakteristika nachgewiesen werden können, wobei deren Verwendung ermöglicht, den Bestandteil, an den sie angehängt sind, nachzuweisen und weiter zu quantifizieren, falls gewünscht. Vorzugsweise sind die nachweisbaren Markierungen jene, die in vivo unter Verwendung nicht-invasiver Verfahren nachweisbar sind.
Antikörper und Bindungsprotein-Konjugate zur Verwendung als diagnostisches Mittel fallen im allgemeinen in zwei Klassen, jene zur Verwendung bei diagnostischen in vitro-Verfahren, wie etwa bei einer Vielzahl von Immuntests, und jene zur Verwendung diagnostischer Protokolle in vivo. Es sind die bildgebenden in vivo-Verfahren, deren Verwendung im Zusammenhang mit dieser Erfindung besonders beabsichtigt ist.
Viele passende bildgebende darstellbare Mittel sind im Stand der Technik bekannt, ebenso wie die Verfahren für deren Anfügen an Antikörper und bindende Liganden (siehe z.B. die US-Patente 5,021,236 und 4,472,509). Bestimmte Verfahren zum Anfügen umfassen die Verwendung eines Metallchelatkomplexes, wobei beispielsweise ein organisches chelatierendes Mittel, wie etwa ein DTPA, angehängt an den Antikörper, eingesetzt wird (US-Patent 4,472,509). Monoklonale Antikörper können auch mit einem Enzym in Gegenwart eines Kupplungsmittels, wie etwa Glutaraldehyd oder Perjodat, zur Reaktion gebracht werden. Konjugate mit Fluorescein-Markern werden in Gegenwart dieser Kupplungsmittel oder durch Reaktion mit einem Isothiocyanat hergestellt.
Ein Beispiel für nachweisbare Markierungen sind die paramagnetische Ionen. In diesem Fall beinhalten geeignete Ionen Chrom (III), Mangan (II), Eisen (III), Eisen (II), Kobalt (II), Nickel (II), Kupfer (II), Neodymium (III), Samarium (III), Ytterbium (III), Gadolinium (III), Vanadium (II), Terbium (III), Dysprosium (III), Holmium (III) und Erbium (III), wobei Gadolinium besonders bevorzugt wird.
Ionen, die in anderen Zusammenhängen nützlich sind, wie etwa zur Röntgendarstellung, schließen Lanthan (III), Gold (III), Blei (II) und insbesondere Wismut (III) ein, ohne darauf beschränkt zu sein. Fluoreszenzmarkierungen schließen Rhodamin, Fluorescein, und Renographin ein. Rhodamin und Fluorescein werden häufig über ein Isothiocyanat-Zwischenprodukt verknüpft.
Im Fall von radioaktiven Isotopen für diagnostische Anwendungen schließen geeignete Beispiele ¹⁴Kohlenstoff ⁵¹Chrom, ³⁶Chlor, ⁵⁷Kobalt, ⁵⁸Kobalt, ⁶⁷Kupfer, ¹⁵²Eu, ⁶⁷Gallium, ³Wasserstoff, ¹²³Jod, ¹²⁵Jod, ¹³¹Jod, ¹¹¹Indium, ⁵⁹Eisen, ³²Phosphor, ¹⁸⁶Rhenium, ¹⁸⁸Rhenium, ⁷⁵Selen, ³⁵Schwefel, ^99mTechnetium und ⁹⁰Yttrium ein. ¹²⁵I wird häufig zur Verwendung in bestimmten Ausführungen bevorzugt, und Technetium^99m und Indium¹¹¹ werden häufig aufgrund ihrer niedrigen Energie und Eignung für eine Breitbanddetektion bevorzugt.
Radioaktiv markierte anti-Aminophospholipid-Antikörper und bindende Liganden zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung können gemäß im Stand der Technik bestens bekannter Verfahren produziert werden. Zum Beispiel sind vermittelnde funktionelle Gruppen, die häufig verwendet werden, um radioisotope Metallionen an Antikörper zu binden, Diethylentriaminpentaessigsäure (diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA) und Ethylendiamintetraessigsäure (ethylene diaminetetracetic acid, EDTA).
Monoklonale Antikörper können auch durch Kontakt mit Natrium- oder Kaliumjodid und einem chemisch oxidierenden Mittel, wie etwa Natriumhypochlorit, oder einem enzymatisch oxidierenden Mittel, wie etwa Lactoperoxidase, jodiert werden. Anti-Aminophospholipid-Antikörper gemäß der Erfindung können mit Technetium^99m durch einen Liganden- Austausch-Prozeß markiert werden, beispielsweise durch Reduzieren von Pertechnat mit Zinnlösung, Chelatieren des reduzierten Technetiums an einer Sephadex-Säule und Aufgeben des Antikörpers auf diese Säule, oder durch direkte Markierungstechniken, z.B. durch Inkubieren von Pertechnat, einem reduzierenden Agens, wie etwa SNCl₂, einer Pufferlösung, wie etwa Natrium-Kalium-Phthalat-Lösung, und dem Antikörper.
Jede der zuvor genannten Arten von nachweisbar markierten anti-Aminophospholipid-Antikörpern und Aminophospholipid-bindenden Liganden können unter den bilddarstellenden Aspekten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Obwohl für eine Verwendung zur kombinierten bildlichen Darstellung und Behandlung von Tumoren früher nicht vorgeschlagen, können die nachweisbar markierten Annexine der US-Patente 5,627,036, WO 95/19791, WO 95/27903, WO 95/34315, WO 96/17618 und WO 98/04294 ebenfalls eingesetzt werden.
WO 95/27903 macht Annexine für eine Verwendung zum Nachweisen apoptotischer Zellen verfügbar. Jedes der Annexin-nachweisbaren Markermittel von WO 95/27903 kann hier verwendet werden, obwohl es bekannt sein wird, daß bestimmte von diesen für in vitro-Anwendungen besser geeignet sind. WO 95/27903 ist ebenfalls als eine Referenz zu Zwecken des Verfügbarmachens nachweisbarer Kits, die zu einer kombinierten Verwendung mit den Therapeutika der vorliegenden Erfindung angepaßt werden können, aufgefunden worden.
Jede der Patentanmeldungen WO 95/19791, WO 95/34315, WO 96/17618 und WO 98/04294, wurde ebenfalls aufgefunden zu Zwecken des weiteren Beschreibens von radioaktiv markierten Annexin-Konjugaten zur bildlichen Darstellung. Die Absicht jedes der zuvor genannten Dokumente ist, radioaktiv markierte Annexine für eine Anwendung zur bildlichen Darstellung vaskulärer Thrombosen, insbesondere im Herzen oder in der Nähe, wie etwa bei tiefer Venenthrombose, Lungenembolie, Myokardinfakt, Vorhofflimmern, Problemen mit prosthetischen kardiovaskulären Materialien, Schlaganfall und derartigem, verfügbar zu machen. Diese radioaktiv markierten Annexine wurden auch zur Anwendung bei einer Darstellung aktivierter Plättchen vorgeschlagen, d.h. unter Bedingungen, wie etwa Abszessen, Restenose, Entzündung von Gelenken, Blutgerinnseln in zerebralen Arterien etc.
Das US-Patent 5,627,036 betrifft allgemein auch "Annexine" (Annexin)-bindende Liganden zur Anwendung beim Analysieren von Plättchen-Phosphatidylserin. Im US-Patent 5,627,036 wird erklärt, daß hämostatische Störungen, wie etwa arterielle, koronare und venöse Throm bosen, gewöhnlich idiopathisch sind, was eine Vorhersage und Verhütung schwierig macht. Um derartige hämostatische Störungen früher zu erkennen, wird der Nachweis aktivierter Plättchen vorgeschlagen. Die nachweisbar markierten Annexin-Zusammensetzungen werden deshalb offenbart, um aktivierte Plättchen bei hämostatischen Störungen nachzuweisen (US-Patent 5,627,036).
Obwohl sie einen breiten Bereich diagnostischer Anwendungen vorschlagen, bezieht sich keine der Offenlegungsschriften WO 95/19791, WO 95/34315, WO 96/17618 oder WO 98/04294 auf eine bildliche Darstellung der Vaskulatur solider Tumoren. Auch das US-Patent 5,627,036 macht keine derartigen Vorschläge. Nichtsdestotrotz können die offenbarten nachweisbaren und radioaktiv markierten Annexin-Zusammensetzungen per se jetzt angesichts der hier offenbarten, überraschenden Entdeckungen zum Vorteil in dieser Hinsicht angewendet werden.
Insbesondere das US-Patent 5,627,036 offenbart Annexine, die nachweisbar mit Fluoresceinisothiocyanat, Radioisotopen von Halogenen, Technetium, Blei, Quecksilber, Thallium oder Indium und paramagnetischen Kontrastmitteln markiert sind.
WO 95/19791 macht Konjugate von Annexin verfügbar, die an ein N₂S₂-Chelat gebunden sind, die durch Komplexieren eines Radionukleids mit dem Chelat radioaktiv markiert werden. WO 95/34315 macht Annexin-Konjugate verfügbar, die einen oder mehrere Galaktosereste mit dem N₂S₂-Chelat umfassen. Von der Galaktosegruppe wird gesagt, daß sie die rasche Eliminierung des radioaktiv markierten Konjugats aus der Zirkulation erleichtert, wodurch ein Strahlenschäden an Nicht-Zielgeweben und ein Hintergrund-"Rauschen" reduziert werden.
WO 96/17618 wiederum macht Annexin-Konjugate verfügbar, die zur radioaktiven Markierung von diagnostischen bildgebenden Mittel geeignet sind, die ein Annexin mit einer Anhäufüng von Galaktoseresten und einem N₂S₂-Chelat umfassen. Von diesen wird berichtet, daß sie eine kürzere Halbwertszeit in der Zirkulation und eine höhere Bindungsaffinität zu Zielstellen aufweisen als die zuvor genannten radioaktiv markierten Annexin-Galactose-Konjugate.
Noch weitere radioaktiv markierte Annexin-Konjugate werden durch WO 98/04294 verfügbar gemacht. Diese Konjugate umfassen ein Annexin, das modifiziert ist, um eine zugängliche Sulphydrylgruppe verfügbar zu machen, die mit einer Hexosegruppe konjugiert ist, die durch einen Rezeptor der Säugetierleber erkannt wird. Multimere Annexin-Konjugate und chelatierende Verbindungen, die über Esterase-sensitive Bindungen konjugiert sind, werden ebenfalls verfügbar gemacht.
Jede der Offenlegungsschriften WO 95/19791, WO 95/34315, WO 96/17618 und WO 98/04294 sind aufgefunden worden zu Zwecken des Verfügbarmachens von Annexin-Konjugat-Bestandteilen zum radioaktiven Markieren, die einem Verpacken in sogenannten "kalten Kits" zugänglich sind, d.h. worin die Bestandteile in separaten Phiolen verfügbar gemacht werden. Das US-Patent 5,627,036 macht in ähnlicher Weise Kits verfügbar, die einen Träger umfassen, der kompartimentiert ist, um nachweisbar markierte Annexine aufzunehmen, die zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung adaptiert werden.
Obwohl zur Anwendung bei diagnostischen in vitro-Verfahren geeignet, sind die vorliegenden Aminophospholipid-Nachweisverfahren eher beabsichtigt, ein Bild der Tumorvaskulatur eines Patienten vor Behandlung mit therapeutisches-Mittel-zielgerichtetes-Mittel-Konstrukten zu erzeugen. Die diagnostischen oder bildgebenden in vivo-Verfahren umfassen im allgemeinen ein Verabreichen einer diagnostisch wirksamen Menge an einem anti-Aminophospholipid-Antikörper oder bindenden Liganden, der mit einem Marker konjugiert ist, der durch nicht-invasive Verfahren nachweisbar ist, an einen Patienten. Dem Antikörper- oder Bindungsligand-Marker-Konjugat wird ausreichend Zeit gegeben, zu dem Aminophospholipid, das auf der luminalen Oberfläche der Tumorvaskulatur exprimiert ist, zu gelangen und zu binden. Der Patient wird dann einer Detektionsvorrichtung ausgesetzt, um den nachweisbaren Marker zu identifizieren, wodurch ein Bild der Tumorvaskulatur erzeugt wird.
Die Magnet-Kernspin-Resonanzisotope, wie etwa Gadolinium, werden unter Verwendung einer entsprechenden Darstellungsvorrichtung nachgewiesen, und radioaktive Substanzen, wie etwa Technitium^99m oder Indium¹¹¹, werden unter Verwendung einer Gamma-Szintillationskamera oder eines -Detektors nachgewiesen. Das US-Patent 5,627,036 ist ebenfalls aufgefunden worden zu Zwecken des Verfügbarmachens von sogar einer weiteren Anleitung im Hinblick auf die sichere und wirksame Einführung derartiger markierter Konstrukte in das Blut einer Versuchsperson verfügbar und Mitteln zum extrakorporalen Bestimmen der Verteilung des nachweisbar markierten Annexins, z.B. unter Verwendung einer Gamma-Szintillationskamera oder durch Magnetresonanzmessung.
Dosierungen für Ausführungen einer bildlichen Darstellung sind im allgemeinen geringer als für die Therapie, hängen jedoch auch vom Alter und Gewicht des Patienten ab. Eine einmalige Dosis von zwischen ungefähr 0,1, 0,5 oder ungefähr 1 mg und ungefähr 9 oder 10 mg, und stärker bevorzugt von zwischen ungefähr 1 mg und ungefähr 5-10 mg anti-Aminophospholipid-Antikörper- oder Aminophospholipid-Bindungsligand-Konjugat pro Patient wird als nutzbringend erwogen. US-Patent 5,627,036 und WO 95/19791, sind ebenfalls im Hinblick auf Dosen nachweisbar markierte Annexine aufschlußreich.
J. Kombinationstherapien
Die Verfahren einer anti-Aminophospholipid-Antikörper-Behandlung unter Verwendung von Mittel der vorliegenden Erfindung können mit anderen Methoden kombiniert werden, die allgemein zur Behandlung des speziellen Tumors, der speziellen Erkrankung oder Störung, die der Patient zeigt, eingesetzt werden. Solange von einem speziellen therapeutischen Ansatz nicht bekannt ist, daß er für die Beschwerden des Patienten selbst schädlich ist, und der anti-Aminophospholipid-Antikörper-Behandlung nicht wesentlich entgegenwirkt, wird seine Kombination mit der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Im Zusammenhang mit einer Behandlung solider Tumoren kann die vorliegenden Erfindung in Kombination mit klassischen Ansätzen, wie etwa Chirurgie, Radiotherapie, Chemotherapie und derartigen verwendet werden. Die Erfindung macht deshalb kombinierte Therapien verfügbar, bei denen anti-Aminophospholipid-Antikörper gleichzeitig mit, vor oder nach Chirurgie oder Strahlenbehandlung verwendet werden, oder an einen Patienten mit, vor oder nach konventionellen chemotherapeutischen, radiotherapeutischen und anti-angiogenen Mitteln oder zielgerichteten Immuntoxinen oder Koaguliganden verabreicht werden.
Eine Kombinationstherapie für andere vaskuläre Erkrankungen wird ebenfalls in Betracht gezogen. Ein spezielles Beispiel davon ist die benigne Prostata-Hyperplasie (BPH), die mit anti-Aminophospholipid-Antikörpern in Kombination mit anderen Behandlungen, die gegenwärtig im Stand der Technik durchgeführt werden, behandelt werden kann. Beispielsweise Abzielen von Immuntoxinen auf Marker, die innerhalb einer BPH lokalisiert sind, wie etwa PSA.
Wenn eines oder mehrere Mittel in Kombination mit der anti-Aminophospholipid-Antikörper-Therapie verwendet werden, gibt es keine Notwendigkeit, daß für die kombinierten Ergebnisse die Wirkungen, die beobachtet werden, wenn jede Behandlung separat durchgeführt wird, additiv sind. Obwohl mindestens additive Wirkungen im allgemeinen wünschenswert sind, wäre jede anti-Tumor-Wirkung die gegenüber einer der Einzeltherapien verbessert ist, von Vorteil. Auch gibt es kein besonderes Erfordernis, das die kombinierte Behandlung synergistische Wirkungen zeigt, obwohl dies sicherlich möglich und vorteilhaft ist. Mittel zur Verwendung zum Erreichen potentiell synergistischer Wirkungen besonders berücksichtigt werden, sind jene, die das Tumorendothel verletzen oder dann eine Apoptose induzieren, da eine derartige Verletzung oder Apoptose die gesamte therapeutische Wirkung amplifizieren sollte.
Um eine kombinierte anti-Tumor-Therapie durchzuführen, würde man einfach an ein Tier einen anti-Aminophospholipid-Antikörper in Kombination mit einem anderen anti-Krebs-Mittel auf eine Weise, die wirksam ist, um zu deren kombinierten anti-Tumor-Wirkungen in dem Tier zu führen, verabreichen. Die Mittel würden deshalb in wirksamen Mengen und für Zeitspannen, die wirksam sind, um zu ihrer kombinierten Anwesenheit in der Tumorvaskulatur und ihren kombinierten Wirkungen in der Tumorumgebung zu führen. Um dieses Ziel zu erreichen, können die anti-Aminophospholipid-Antikörper und anti-Krebs-Mittel dem Tier simultan verabreicht werden, entweder in einer einzelnen Zusammensetzung oder als zwei verschiedene Zusammensetzungen unter Verwendung verschiedener Verabreichungswege.
Alternativ kann anti-Aminophospholipid-Antikörper-Behandlung der anti-Krebs-Mittel-Behandlung durch z.B. Intervalle, die von Minuten bis Wochen reichen, vorangehen oder sich anschließen. In bestimmten Ausführungen, in denen das anti-Krebs-Mittel und der anti-Aminophospholipid-Antikörper separat an das Tier verabreicht werden, würde man sicherstellen, daß eine wesentliche Zeitdauer die Zeit zwischen jeder Abgabe nicht überschreitet, so daß die Zusammensetzung von anti-Krebs-Mittel und anti-Aminophospholipid-Antikörper-Zusammensetzungen noch in der Lage wäre, eine vorteilhafte, kombinierte Wirkung auf den Tumor auszuüben. Bei solchen Beispielen wird in Betracht gezogen, daß man den Tumor mit beiden Mittel innerhalb von ungefähr 5 Minuten bis ungefähr eine Woche gegenseitig und, stärker bevorzugt, innerhalb von ungefähr 12 bis 72 Stunden gegenseitig in Kontakt bringt, wobei eine Verzögerungszeit von nur ungefähr 12 bis 48 Stunden am stärksten bevorzugt wird.
Beispielhafte anti-Krebs-Mittel, die vor dem anti-Aminophospholipid-Antikörper verabreicht würden, sind Mittel, welche die Expression von Aminophospholipiden innerhalb der Tumorvaskulatur induzieren. Beispielsweise werden Mittel, die eine lokale Kalziumproduktion stimulieren und/oder eine Apoptose induzieren, im allgemeinen zu einer erhöhten PS-Expression führen, die dann unter Verwendung eines nachfolgenden anti-PS-Antikörpers angezielt werden kann. Anti-Aminophospholipid-Antikörper würden zunächst in anderen Situationen verabreicht werden, um eine Tumorzerstörung zu verursachen, gefolgt durch antiangiogene Therapien oder Therapien, die auf ein Anzielen der nekrotischen Tumorzellen gerichtet sind.
Die allgemeine Verwendung von Kombinationen von Substanzen bei einer Krebsbehandlung ist bestens bekannt. Beispielsweise offenbart US-Patent 5,710,134 Verbindungen, die eine Nekrose in Tumoren in Kombination mit nicht-toxischen Substanzen oder "Pro-Wirkstoffen („prodrugs")" induzieren. Die Enzyme, die durch nekrotische Prozesse freigesetzt werden, spalten den nicht-toxischen "Pro-Wirkstoff" zu dem toxischen "Wirkstoff", welcher zum Tumorzelltod führt. Auch US-Patent 5,747,469 offenbart die kombinierte Verwendung viraler Vektoren, die p53 kodieren und DNA-schädigende Mittel. Jeder solch ähnlicher Ansätze kann im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
In einigen Situationen kann es sogar wünschenswert sein, die Behandlungsdauer erheblich zu verlängern, wobei mehrere Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7), mehrere Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) oder sogar mehrere Monate (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den entsprechenden Verabreichungen vergehen. Dies wäre unter Umständen vorteilhaft, in denen eine Behandlung beabsichtigt war, um den Tumor wesentlich zu zerstören, wie etwa die anti-Aminophospholipid-Antikörper-Behandlung, und eine andere Behandlung beabsichtigt war, um eine Mikrometastase oder ein Tumorwiederwachstum zu verhüten, wie etwa die Verabreichung eines anti-angiogenen Mittel. Von dem EN 7/44-Antikörper von Hagemeier et al. (1986) wird nicht angenommen, daß er ein wirksames anti-angiogenes Mittel ist, da ihm neben anderen Defiziten eine Fähigkeit zum Binden an ein zugängliches Oberflächenantigen fehlt.
Es wird auch in Betracht gezogen, daß es mehr als eine Verabreichung von entweder dem anti-Aminophospholipid-Antikörper oder dem anti-Krebs-Mittel angewendet werden wird. Die anti-Aminophospholipid-Antikörper und anti-Krebs-Mittel können austauschbar verabreicht werden an aufeinanderfolgenden Tagen oder Wochen, oder eine Abfolge einer anti-Aminophospholipid-Antikörper-Behandlung kann verabreicht werden, gefolgt durch eine Abfolge einer anti-Krebs-Mittel-Therapie. Um in jedem Fall eine Tumorregression unter Verwendung einer kombinierten Therapie zu erzielen, ist dies alles erforderlich, um beide Mittel in einer kombinierten Menge zu verabreichen, die wirksam ist, um eine anti-Tumor-Wirkung auszuüben, unabhängig von den Verabreichungszeiten.
Bezüglich der Chirurgie kann jede chirurgische Intervention in Kombination mit der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden. In Verbindung mit einer Radiotherapie wird jeder Mechanismus in Betracht gezogen, um lokal eine DNA-Schädigung in Tumorzellen zu induzieren, wie etwa γ-Bestrahlung, Röntgenstrahlung, UV-Bestrahlung, Mikrowellen und sogar elektronische Emissionen und derartiges. Eine direkte Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen wird ebenfalls in Betracht gezogen, und dies kann in Verbindung mit einem zielgerichteten Antikörper oder anderen zielgerichteten Mitteln verwendet werden.
Die Zytokin-Therapie hat sich ebenfalls als ein wirksamer Partner für kombinierte Therapiepläne erwiesen. Verschiedene Zytokine können in derartigen kombinierten Ansätzen eingesetzt werden. Beispiele von Zytokinen beinhalten IL-1α IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, TGF-β, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNFα, TNFβ, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-α, IFN-β, IFN-γ. Zytokine werden gemäß Standardplänen verabreicht, die mit klinischen Indikationen vereinbar sind, wie etwa der Zustand des Patienten und eine relative Toxizität des Zytokins. Uteroglobine können ebenfalls verwendet werden, um Metastasen zu verhüten oder zu hemmen (US-Patent 5,696,092).
J1. Chemotherapeutika
In bestimmten Ausführungen können die anti-Aminophospholipid-Antikörper der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem chemotherapeutischen Mittel verabreicht werden. Chemotherapeutische Wirkstoffe können proliferierende Tumorzellen abtöten, indem sie die nekrotischen Bereiche, die durch die Gesamtbehandlung erzeugt werden, vergrößern. Die Wirkstoffe können demnach die thrombotische Wirkung der anti-Aminophospholipid-Antikörper verstärken.
Durch Induzieren der Bildung von Thromben in Tumorgefäßen können die anti-Aminophospholipid-Antikörper die Wirkung der Chemotherapeutika durch Zurückhalten oder Einschließen der Wirkstoffe in dem Tumor verstärken. Die Chemotherapeutika werden deshalb in dem Tumor zurückgehalten, weil der Rest des Wirkstoffs aus dem Körper entfernt wird. Tumorzellen sind deshalb einer höheren Konzentration von Wirkstoff für eine längere Zeitdauer ausgesetzt. Dieses Einschließen von einem Wirkstoff in dem Tumor macht es möglich, die Dosis an Wirkstoff zu reduzieren, was die Behandlung ebenso sicherer wie wirksamer macht.
Unabhängig von dem/den zugrunde liegenden Mechanismus/Mechanismen, kann eine Vielfalt von chemotherapeutischen Mitteln bei den hier offenbarten kombinierten Behandlungsverfahren verwendet werden. Chemotherapeutische Mittel, die als beispielhaft in Betracht gezogen werden, beinhalten z.B. Tamoxifen, Taxol, Vincristin, Vinblastin, etoposid (VP-16), Adriamyzin, 5-Fluoruracil (5FU), Camptothecin, Actinomycin-D, Mitomycin C, Cisplatin (CDDP); Combretastatin(e) und Derivate und "Pro-Wirkstoffe" davon.
Wie von denjenigen, der sich auf dem Fachgebiet auskennt, verstanden werden wird, werden die geeigneten Dosen von chemotherapeutischen Mittel im allgemeinen um jene herum liegen, die in klinischen Therapien, bei denen die Chemotherapeutika allein oder in Kombination mit anderen Chemotherapeutika verabreicht werden, bereits eingesetzt werden. Nur anhand eines Beispiels können Mittel, wie etwa Cisplatin und andere DNA-Alkylanzien verwendet werden. Cisplatin ist weit verbreitet verwendet worden, um Krebs zu behandeln, wobei wirksame Dosen, die bei klinischen Anwendungen verwendet werden, 20 mg/m² für 5 Tage jede dritte Woche für insgesamt drei Durchgänge betragen. Cisplatin wird oral nicht absorbiert und muß deshalb mittels Injektion intravenös, subkutan, intratumoral oder intraperitoneal abgegeben werden.
Weitere nützliche Mittel schließen Verbindungen ein, die mit der DNA-Replikation, der Mitose und der Chromosomentrennung und/oder Tubulinaktivität interferieren. Solche chemotherapeutische Verbindungen schließen Adriamycin, auch als Doxorubicin bekannt, Etoposid, Verapamil, Podophyllotoxin(e), Combretastin(e) und derartiges ein. In einem weit verbreite ten klinischen Ansatz, der für die Behandlung von Neoplasmen verwendet wird, werden diese Verbindungen durch Bolus-Injektionen intravenös in Dosen im Bereich von 25-75 mg/m² in Intervallen von 21 Tagen für Adriamycin bis 35-50 mg/m² für Etoposid intravenös oder mit der doppelten intravenösen Dosis oral verabreicht.
Mittel, welche die Synthese und Genauigkeit von Polynukleotid-Vorläufermolekülen stören, können ebenfalls verwendet werden. Besonders nützlich sind Mittel, die umfangreiche Tests durchgemacht haben, und die leicht erhältlich sind. Als solche werden Mittel, wie etwa 5-Fluoruracil (5-FU) vorzugsweise durch neoplastisches Gewebe verwendet, was dieses Mittel zum Anzielen auf neoplastische Zellen besonders nützlich macht. Obwohl ziemlich toxisch, ist 5-FU in einem breiten Bereich von Trägem, einschließlich topischen, anwendbar, wobei allerdings eine intravenöse Verabreichung mit Dosen im Bereich von 3 bis 15 mg/kg/Tag allgemein verwendet wird.
Beispielhafte chemotherapeutische Mittel, die in Verbindung mit einer kombinierten Therapie nützlich sind, sind in Tabelle B aufgeführt. Jedes der dort aufgeführten Mittel ist beispielhaft und in keiner Weise beschränkend. Fachleute werden an "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15. Auflg., Kapitel 33, insbesondere S. 624-652 verwiesen. Einige Abwandlungen der Dosierung werden notwendigerweise auftreten, was von dem Zustand der zu behandelnden Versuchsperson/des Patienten abhängt. Der für die Verabreichung verantwortliche Arzt wird in der Lage sein, die passende Dosis für die individuelle Versuchsperson/den Patienten zu bestimmen.
TABELLE B Bei einer neoplastischen Erkrankung nützliche chemotherapeutische Mittel
J2. Anti-angiogene Mittel
Die Bezeichnung "Angiogenese" betrifft die Bildung neuer Blutgefäße, im allgemeinen in einem Gewebe oder Organ. Unter normalen physiologischen Bedingungen unterliegen Menschen oder Tiere einer Angiogenese nur in sehr spezifischen beschränkten Situationen. Beispielsweise wird eine Angiogenese normalerweise bei Wundheilung, bei der Entwicklung von Fötus und Embryo und bei der Bildung des Corpus luteum, des Endometriums und der Plazenta. Unkontrollierte (persistierende und/oder unregulierte) Angiogenese steht mit verschiedenen Erkrankungszuständen im Zusammenhang und tritt während des Tumorwachstums und der Metastase auf.
Sowohl von kontrollierter als auch unkontrollierter Angiogenese wird angenommen, daß sie auf eine ähnliche Weise verlaufen. Endothelzellen und Perizyten, umgeben von einer Basalmembran, bilden kapilläre Blutgefäße. Die Angiogenese beginnt mit der Erosion der Basalmembran durch Enzyme, die durch Endothelzellen und Leukozyten freigesetzt werden. Die Endothelzellen, welche das Lumen von Blutgefäßen auskleiden, strecken sich dann durch die Basalmembran. Angiogene Stimulanzien veranlassen die Endothelzellen, durch die erodierte Basalmembran zu wandern. Die wandernden Zellen bilden eine "Knospe" weg von dem elterlichen Blutgefäß, wobei die Endothelzellen eine Mitose durchmachen und proliferieren. Die endothelialen Knospen verschmelzen miteinander, um kapilläre Schleifen zu bilden, wordurch das neue Blutgefäß geschaffen wird.
Da eine persistierende, unregulierte Angiogenese während der Tumorentwicklung und Metastase auftritt, können die Behandlungsverfahren dieser Erfindung in Kombination mit jeder oder mehreren "anti-angiogenen"-Therapien verwendet werden. Beispielhafte anti-angiogene Mittel, die in Verbindung mit einer kombinierten Therapie nützlich sind, sind in Tabelle C aufgeführt. Jedes der dort aufgelisteten Mittel ist beispielhaft und keinesfalls beschränkend.
TABELLE C Inhibitoren und negative Regulatoren der Angiogenese
Ein bestimmter bevorzugter Bestandteil zur Verwendung beim Hemmen einer Angiogenese ist ein Protein, das "Angiostatin" genannt wird. Dieser Bestandteil wird in den US-Patenten 5,776,704, 5,639,725 und 5,733,876 offenbart. Angiostatin ist ein Protein mit einem Molekulargewicht zwischen ungefähr 38 kD und ungefähr 45 kD, bestimmt durch reduzierende Polyacrylamidgel-Elektrophorese, das annähernd die Kringle-Regionen 1 bis 4 eines Plasminogen-Moleküls enthält. Angiostatin weist allgemein eine Aminosäuresequenz auf, die im wesentlichen der eines Fragments von Plasminogens der Maus ähnlich ist, beginnend bei Aminosäure Nr. 98 eines intakten Maus-Plasminogen-Moleküls.
Die Aminosäuresequenz von Angiostatin variiert leicht zwischen den Arten. Beispielsweise ist die Aminosäuresequenz in menschlichem Angiostatin der Sequenz des oben beschriebenen Maus-Plasminogen-Fragments im wesentlichen ähnlich, obwohl eine aktive menschliche Angiostatinsequenz entweder bei Aminosäure Nr. 97 oder 99 einer intakten menschlichen Plasminogen-Aminosäuresequenz beginnen kann. Weiter kann menschliches Plasminogen verwendet werden, daß es ähnliche anti-angiogene Aktivität aufweist, wie in einem Mäusetumormodell gezeigt.
Für bestimmte anti-angiogenen Therapien ist bereits gezeigt worden, daß sie Tumorregressionen verursachen, und Angiostatin ist ein derartiges Mittel. Endostatin, ein 20 kDa COOH-terminales Fragment von Kollagen XVIII, das bakterielle Polysaccharid CM101 und der Antikörper LM609 haben ebenfalls angiostatische Aktivität. In Anbetracht von deren anderen Eigenschaften allerdings werden sie als anti-vaskuläre Therapie oder Tumorgefäßtoxine bezeichnet, da sie nicht nur eine Angiogenese hemmen, sondern auch die Zerstörung der Tumorgefäße durch zumeist undefinierte Mechanismen auslösen. Deren Kombination mit der vorliegenden Erfindung wird eindeutig in Betracht gezogen.
Angiostatin und Endostatin sind in den Mittelpunkt intensiver Studien gerückt, da sie die ersten Angiogenese-Inhibitoren sind, welche die Fähigkeit gezeigt haben, nicht nur Tumorwachstum zu hemmen, sondern auch Tumorregressionen bei Mäusen zu verursachen. Es gibt eine Vielzahl von Proteasen, von denen gezeigt wurde, daß sie Angiostatin aus Plasminogen, einschließlich Elastase, Makrophagen-Metalloelastase (MME), Matrilysin (MMP-7) und 92 kDa Gelatinase B/Typ IV-Kollagenase (MMP-9) herstellen.
MME kann Angiostatin aus Plasminogen in Tumoren herstellen, und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF) aufreguliert die Expression von MME durch Makrophagen, wodurch die Produktion von Angiostatin induziert wird. Die Rolle von MME bei der Angiostatin-Bildung wird durch den Befund unterstützt, daß MME tatsächlich in klinischen Proben von hepatozellulären Karzinomen von Patienten exprimieren wird. Eine andere Protease, von der angenommen wird, daß sie in der Lage ist, Angiostatin zu produzieren, ist Stromelysin-1 (MMP-3). Für MMP-3 ist gezeigt worden, daß sie Angiostatin-ähnliche Fragmente aus Plasminogen in vitro produziert.
Der Wirkungsmechanismus von Angiostatin ist gegenwärtig unklar, es wird hypothetisiert, daß es an einen nicht-identifizierten Zelloberflächenrezeptor auf Endothelzellen bindet, wodurch die Endothelzellen veranlaßt werden, in den programmierten Zelltod oder einen Mitose-Arrest einzutreten. Endostatin scheint sogar ein wirkungsvolleres anti-Angiogenese- und anti-Tumor-Mittel zu sein, obwohl seine Biologie viel weniger klar ist. Endostatin ist wirksam im Verursachen von Regressionen bei einer Reihe von Tumormodellen bei Mäusen. Die Tumoren entwickeln keine Resistenz gegenüber Endostatin, und nach einer Vielzahl von Behandlungszyklen treten die Tumoren in einen Ruhezustand ein, während dem sie nicht an Volumen zunehmen. In diesem Ruhezustand war der Prozentsatz von Tumorzellen, die eine Apoptose durchmachen, erhöht, was eine Population ergab, die im wesentlichen die gleiche Größe beibehielt. Von Endostatin wird auch angenommen, daß es an einen unidentifizierten Endothelzelloberflächenrezeptor bindet, der dessen Wirkung vermittelt.
CM 101 ist ein bakterielles Polysaccharid, das gut charakterisiert worden ist hinsichtlich seiner Fähigkeit, eine neovaskuläre Entzündung in Tumoren zu induzieren. CM101 bindet an Rezeptoren, die auf ent-differenziertem Endothel exprimiert sind und quervernetzt diese, was die Aktivierung des Komplementsystems stimuliert. Es löst auch eine Zytokin-getriebene Entzündungsantwort aus, die selektiv auf den Tumor abzielt. Es ist ein einzigartiges anti-pathoangiogenes Mittel, das die Expression von VEGF und seinen Rezeptoren abreguliert. CM101 ist gegenwärtig in klinischen Studien als ein anti-Krebs-Wirkstoff und kann hier in Kombination verwendet werden.
Thrombospondin (TSP-1) und Plättchenfaktor 4 (PF4) können ebenfalls in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese sind beides Angiogenese-Inhibitoren, die mit Heparin assoziieren und werden in den α-Granula von Plättchen gefunden werden. TSP-1 ist ein großes 450 kDa Multi-Domain-Glykoprotein, das Bestandteil der extrazellulären Matrix ist. TSP-1 bindet an viele der Proteoglycanmoleküle, die in der extrazellulären Matrix gefunden werden, einschließlich HSPGs, Fibronektin, Laminin und verschiedene Typen von Kollagen. TSP-1 hemmt die Endothelzell-Migration und -Proliferation in vitro und eine Angiogenese in vivo. TSP-1 kann auch den malignen Phänotyp und die Tumorgenese transformierter Endothelzellen supprimieren. Von dem Tumorsuppressorgen p53 ist gezeigt worden, daß es die Expression von TSP-1 direkt reguliert, derart, daß ein Verlust an p53-Aktivität eine dramatische Reduktion der TSP-1-Produktion und eine damit einhergehende Zunahme der durch einen Tumor ausgelösten Angiogenese verursacht.
PF4 ist ein Protein mit 70 Aminosäuren, das ein Mitglied der CXC ELR-Familie von Chemokinen ist, das in der Lage ist, die Endothelzell-Proliferation in vitro und eine Angiogenese in vivo wirksam zu hemmen. Intratumoral verabreichtes oder durch einen adenoviralen Vektor abgegebenes PF4 ist in der Lage, eine Hemmung des Tumorwachstums zu verursachen.
Interferone und Metalloproteinase-Inhibitoren sind zwei andere Klassen von natürlicherweise vorkommenden angiogenen Inhibitoren, die mit der vorliegenden Erfindung kombiniert werden können. Die anti-endotheliale Aktivität des Interferons ist seit den frühen 80er Jahren bekannt, der Hemmungsmechanismus ist allerdings noch unklar. Bekannt ist, daß sie eine Endothelzell-Migration hemmen können und daß sie einige anti-angiogene Aktivität in vivo aufweisen, die möglicherweise durch eine Fähigkeit, die Produktion anginogener Promotoren durch Tumorzellen zu hemmen, vermittelt wird. Vaskuläre Tumoren sind besonders empfindlich gegenüber Interferon, beispielsweise können proliferierende Hämangiome erfolgreich mit IFNα behandelt werden.
Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (tissue inhibitors of metalloproteinases, TIMPs) sind eine Familie von natürlicherweise vorkommenden Inhibitoren von Matrix-Metalloproteasen (MMPs), die auch eine Angiogenese hemmen können und die in kombinierten Behandlungsprotokollen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. MMPs spielen eine Schlüsselrolle in dem Angiogeneseprozeß, da sie die Matrix, durch welche Endothelzellen und Fibroplasten wandern, wenn sich das vaskuläre Netzwerk ausdehnt oder erneuert, abbauen. Tatsächlich wurde von einem Mitglied der MMPs, MMP-2, gezeigt, daß es mit aktiviertem Endothel durch das Integrin αvβ3 wahrscheinlich zu diesem Zweck assoziiert. Wenn diese Interaktion durch ein Fragment von MMP-2 gestört wird, dann wird die Angiogenese abreguliert und bei Tumoren wird das Wachstum gehemmt.
Es gibt eine Reihe pharmakologischer Mittel, welche die Angiogenese hemmen, jedes oder mehrere davon können in Kombination mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese schließen AGM-1470/TNP-470, Thalidomid und Carboxyamidotriazol (CAI) ein. Fumagillin erwies sich 1990 als ein wirksamer Inhibitor der Angiogenese und seitdem sind die synthetischen Analoga von Fumagillin AGM-1470 und TNP-470 entwickelt worden. Diese beiden Wirkstoffe hemmen eine Endothelzell-Proliferation in vitro und eine Angiogenese in vivo. TNP-470 ist in klinischen Studien am Menschen umfassend untersucht worden, wobei Ergebnisse nahelegen, daß eine langfristige Verabreichung optimal ist.
Thalidomid wurde ursprünglich als ein Sedativ verwendet, erwies sich jedoch als ein wirksames Teratogen und seine Verwendung wurde eingestellt. 1994 wurde festgestellt, daß Thalidomid ein Angiogeneseinhibitor ist. Thalidomid ist gegenwärtig in klinischen Studien als ein Anti-Krebs-Mittel ebenso wie zu einer Behandlung vaskulärer Augenerkrankungen.
CAI ist ein niedrig-molekularer synthetischer Inhibitor der Angiogenese, der als ein Kalziumkanal-Blocker wirkt, der die Actin-Reorganisation, Endothelzell-Migration und Ausbreitung von Kollagen IV verhütet. CAI hemmt eine Neovaskularisierung bei physiologisch erreichbaren Konzentrationen und wird oral von Krebspatienten gut vertragen. Klinische Studien mit CAI haben bei 49% von Krebspatienten, die vor der Behandlung eine fortgeschrittene Erkrankung hatten, eine Krankheitsstabilisierung ergeben.
Für Cortison in Gegenwart von Heparin oder Heparin-Fragmenten wurde gezeigt, daß es das Tumorwachstum in Mäusen durch Unterbinden der Endothelzell-Proliferation hemmt. Der Mechanismus, der an der additiven Hemmwirkung des Steroids und Heparin beteiligt ist, ist unklar, obwohl angenommen wird, daß das Heparin die Aufnahme des Steroids durch Endothelzellen erhöhen könnte. Für das Gemisch wurde gezeigt, daß es die Auflösung der Basalmembran unterhalb von neu gebildeten Kapillaren steigert, und dies ist auch eine mögliche Erklärung für die additive angiostatische Wirkung. Heparin-Cortisol-Konjugate weisen ebenfalls wirksame angiostatische und anti-Tumor-Aktivität in vivo auf.
Weitere spezifische Angiogenese-Inhibitoren, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, anti-invasiver Faktor, Retinolsäuren und Paclitaxel (US-Patent 5,716,981), AGM-1470 (Ingber et al., 1990), Haifischknorpelextrakt (US-Patent 5,618,925), anionische Polyamid- oder Polyharnstoffoligomere (US-Patent 5,593,664), Oxindolderivate (US-Patent, 5,576,330), Östradiolderivate (US-Patent 5,504,074), und Thiazolopyrimidinderivate (US-Patent 5,599,813) werden ebenfalls zur Verwendung als anti-angiogene Zusammensetzungen für die kombinierten Therapeutika der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen.
Zusammensetzungen, die einen Antagonisten eines α_vβ₃-Integrins umfassen, können ebenfalls verwendet werden, um eine Angiogenese in Kombination mit der vorliegenden Erfindung zu hemmen. Wie in dem US-Patent 5,766,591 offenbart, sind RGD-enthaltende Polypeptide und Salze davon, einschließlich zyklischer Polypeptide, geeignete Beispiele von α_vβ₃-Integrin-Antagonisten.
Der Antikörper LM609 gegen das α_vβ₃-Integrin induziert ebenfalls Tumorregressionen. Integrin α_vβ₃-Antagonisten, wie etwa LM609, induzieren eine Apoptose angiogener Endothelzellen, wobei sie die ruhenden Blutgefäße unbeeinflußt lassen. LM609 oder andere α_vβ₃-Antagonisten können auch durch eine Hemmung der Interaktion von α_vβ₃ und MMP-2, einem proteolytischen Enzym, von dem angenommen wird, daß es eine wichtige Rolle bei der Migration von Endothelzellen und Fibroblasten spielt, wirken.
Eine Apoptose des angiogenen Endothels kann in diesem Fall eine Kaskadenwirkung auf den Rest des vaskulären Netzwerks ausüben. Eine Hemmung des Tumorvaskulatur-Netzwerks, auf ein Signal des Tumors, zu expandieren, vollständig zu antworten, löst tatsächlich den teilweisen oder vollständigen Zusammenbruch des Netzwerks aus, was zum Tumorzelltot und einem Verlust an Tumorvolumen führt. Es ist möglich, daß Endostatin und Angiostatin auf ähnliche Weise funktionieren. Die Tatsache, daß LM609 ruhende Gefäße nicht beeinflußt, jedoch in der Lage ist, Tumorregressionen zu verursachen, legt stark nahe, daß nicht alle Blutgefäße in einem Tumor zur Behandlung angezielt werden müssen, um eine anti-Tumor-Wirkung zu erhalten.
Zielgerichtete und nicht-zielgerichtete Angiopoetine, vorzugsweise Angiopoetin-2, können ebenfalls in Kombination mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden (siehe Diskussion unten in Bezug auf zielgerichtete Angiopoetine). Angiopoetin-2 (SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4) ist ein Ligand für Tie2 und wirkt im allgemeinen einer Reifung/Stabilität von Blutgefäßen, die durch Angiopoetin-1 vermittelt wird, entgegen. Deshalb ist Angiopoetin-2 ein Antagonist von Angiopoetin-1 und wirkt störend auf die Kapillarstruktur. In Abwesenheit anderer angiogener Signale (wie etwa VEGF) veranlaßt Angiopoetin-2 die Gefäße zu destabilisieren und unreif zu werden (Holash et al., 1999). Ein Verfügbarmachen von zielgerichtetem oder nicht-zielgerichteten Angiopoetin-2 in Verbindung mit den Verfahren der vorliegenden Erfindung wird deshalb in Betracht gezogen, insbesondere bei Tumoren mit niedrigen VGF-Spiegeln und/oder in Kombination mit einer VEGF-Hemmung. Eine Manipulation von Angiopoetin-1 und zwei neuen Angiopoetinen, Angiopoetin-2 (Maus) und Angiopoetin-4 (Mensch), können ebenfalls in Verbindung mit dieser Erfindung verwendet werden.
Andere Verfahren einer therapeutischen Intervention, die auf einer Änderung der Signalübertragung durch den Tie2-Rezeptor beruhen, können ebenfalls hier in Kombination verwendet werden, wie etwa die Verwendung eines löslichen Tie2-Rezeptors, der in der Lage ist, eine Tie2-Aktivierung zu blockieren (Lin et al., 1998). Die Abgabe eines solchen Konstrukts unter Verwendung einer rekombinanten Adenovirus-Gentherapie hat sich als wirksam beim Behandeln von Krebs und Vermindern von Metastasen erwiesen (Lin et al., 1998).
J3. Apoptose-induzierende Mittel
Eine therapeutisches-Mittel-zielgerichtetes-Mittel-Behandlung kann auch mit Behandlungsverfahren kombiniert werden, die eine Apoptose in jeden Zellen innerhalb des Tumors induzieren, einschließlich Tumorzellen und Endothelzellen der Tumorvaskulatur. Obwohl viele Anti-Krebs-Mittel als Teil ihres Wirkungsmechanismus eine Apoptose-induzierende Wirkung haben, sind bestimmte Mittel mit diesem als einem primären Mechanismus entdeckt, entworfen oder ausgewählt worden, wie unten beschrieben.
Eine Reihe von Onkogenen sind beschrieben worden, die eine Apoptose oder einen programmierten Zelltod hemmen. Beispielhafte Onkogene in dieser Kategorie beinhalten, ohne darauf beschränkt zu sein, bcr-abl, bcl-2 (verschieden von bcl-1, Cyklin D1; GenBank-Zugang-Nr. M14745, X06487; US-Patente 5,650,491 und 5,539,094) und Familienmitglieder, einschließlich Bcl-x1, Mcl-1, Bak, A1, A20. Eine Überexpression von bcl-2 wurde zunächst in T-Zell-Lymphomen entdeckt. bcl-2 fungiert als ein Onkogen durch Binden und Inaktivieren von Bax, einem Protein im Apoptoseweg. Eine Hemmung der bcl-2-Funktion verhütet eine Inaktivierung von Bax, und ermöglicht, das Apoptosegeschehen fortzusetzen. Folglich wird eine Hemmung dieser Klasse von Onkogenen, z.B. unter Verwendung von Antisense-Nukleotidsequenzen, zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung unter Aspekten, bei denen eine Steigerung der Apoptose erwünscht ist, in Betracht gezogen (US-Patente 5,650,491; 5,539,094 und 5,583,034).
Von vielen Krebsarten gibt es Berichte über Mutationen in Tumorsuppressorgenen, wie etwa p53. Eine Inaktivierung von p53 führt zu einer Unfähigkeit, Apoptose zu fördern. Mit dieser Unfähigkeit schreiten Krebszellen in der Tumorgenese fort, anstatt für den Zelltod vorgesehen zu werden. Folglich ist auch ein Verfügbarmachen von Tumorsuppressoren zur Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, um den Zelltod zu stimulieren, ebenfalls vorgesehen. Beispielhafte Tumorsuppressoren schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, p53, Retinoblastom-Gen (Rb), Wilm's Tumor (WT1), bas alpha, Interleukin-1b-konvertierendes Enzym und Familie, MEN-1-Gen, Neurofibromatose Typ 1 (NF1), cdk-Inhibitor p16, Kolorektalkrebs-Gen (DCC), familiäres adenomatöse-Polypose-Gen (FAP), multiples Tumorsuppressor-Gen (MTS-1), BRCA1 und BRCA2.
Zur Verwendung bevorzugt sind die Gene von p53 (US-Patente 5,747,469, 5,677,178 und 5,756,455), Retinoblastom, BRAC1 (US-Patente 5,750,400, 5,654,155, 5,710,001, 5,756,294, 5,709,999, 5,693,473, 5,753,441, 5,622,829 und 5,747,282), MEN-1 (GenBank-Zugangs-Nr. U93236) und Adenovirus E1A (US-Patent 5,776,743).
Andere Zusammensetzungen, die verwendet werden können, schließen Gene ein, die den, mit dem Tumornekrosefaktor verwandten Apoptose-induzierenden Liganden, genannt TRAIL (tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand), und das TRAIL-Polypeptid kodieren (US-Patent 5,763,223), die 24 kD Apoptose-assoziierte Protease aus dem US-Patent 5,605,826, den Fas-assoziierten Faktor 1, FAF1 (US-Patent 5,750,653) kodieren. Ebenfalls zur Verwendung unter diesen Aspekten der vorliegenden Erfindung wird das Verfügbarmachen des Interleukin-1β-konvertierenden Enzyms und Familienmitgliedern in Betracht gezogen, von denen ebenfalls berichtet wurde, daß sie eine Apoptose stimulieren.
Verbindungen wie etwa Carbostyril-Derivate (US-Patente 5,672,603 und 5,464,833); verzweigte apogene Peptide (US-Patent 5,591,717); Phosphotyrosin-Inhibitoren und nicht-hydrolysierbare Phosphotyrosin-Analoga (US-Patente 5,565,491 und 5,693,627), Angonisten von RXR-Retinoid-Rezeptoren (US-Patent 5,399,586) und sogar Antioxidanzien (US-Patent 5,571,523) können ebenfalls verwendet werden. Tyrosinkinase-Inhibitoren, wie etwa Genistein, können ebenfalls mit Liganden verknüpft werden, die auf eine Zelloberflächenrezeptor gerichtet sind (US-Patent 5,587,459).
J4. Immuntoxine und Koaguliganden
Die Behandlungsverfahren der Erfindung mit nackten anti-Aminophospholipid-Antikörpern können im Kombination mit Immuntoxinen (ITs) und/oder Koaguliganden verwendet werden, bei denen der zielgerichtete Anteil, z.B. Antikörper oder Ligand, auf einen relativ spezifischen Marker der Tumorzellen, Tumorvaskulatur oder des Tumorstromas gerichtet ist. Gemeinsam mit den oben diskutierten chemotherapeutischen anti-angiogenen Mittel wird die Verwendung eines anti-Aminophospholipid-Antikörpers in Kombination mit einem zielgerichteten Toxin oder Koagulanz im allgemeinen zu den verschiedenen Mitteln führen, die gegen verschiedene Ziele innerhalb der Tumoren gerichtet sind. Dies sollte zu additiven, deutlich größer als additiven oder sogar synergistischen Anti-Tumor-Ergebnissen führen.
Allgemein gesagt, Antikörper oder Liganden zur Verwendung unter diesen zusätzlichen Aspekten werden vorzugsweise zugängliche Tumorantigene erkennen, die vorzugsweise oder spezifisch an der Tumorstelle exprimiert werden. Die Antikörper oder Liganden werden auch vorzugsweise Eigenschaften von hoher Affinität zeigen, und die Antikörper, Liganden oder Konjugate davon werden in vivo keine signifikanten Nebenwirkungen gegen lebenserhaltende normale Gewebe, wie etwa eines oder mehrere Gewebe, ausgewählt aus Herz, Niere, Hirn, Leber, Knochenmark, Kolon, Brust, Prostata, Schilddrüse, Gallenblase, Lunge, Nebennieren, Muskel, Nervenfasern, Pankreas, Haut oder einem anderen lebenserhaltenden Organ oder Gewebe des menschlichen Körpers ausüben. Der Begriff "erhebliche Nebenwirkungen", wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Antikörper, Liganden oder ein Antikörper-Konjugat, das, wenn es in vivo verabreicht wird, nur vernachlässigbare oder klinisch bewältigbare Nebenwirkungen produziert, wie etwa jene, die normalerweise während einer Chemotherapie angetroffen werden.
Mindestens eine Bindungsregion dieser sekundären Anti-Krebs-Mittel, die in Kombination mit dem anti-Aminophospholipid-Antikörpern der Erfindung eingesetzt werden, wird ein Bestandteil sein, der in der Lage ist, ein Toxin oder einen Gerinnungsfaktor an die Tumorregion abzugeben, d.h. in der Lage ist, sich innerhalb einer Tumorstelle anzureichern. Derartige zielgerichtete Mittel können gegen einen Bestandteil einer Tumorzelle, Tumorvaskulatur oder eines Tumorstromas gerichtet sein. Die zielgerichteten Mittel werden im allgemeinen an einen oberflächenexpremierten, oberflächenzugänglichen oder oberflächenlokalisierten Bestandteil einer Tumorzelle, Tumorvaskulatur oder eines Tumorstromas binden. Nachdem allerdings die Tumorvaskulatur- und Tumorzell-Zerstörung beginnt, werden interne Bestandteile freigesetzt werden, was zusätzliches Abzielen auf praktisch jeden Tumorbestandteil erlaubt.
Viele Tumorzell-Antigene sind beschrieben worden, von denen jedes als ein Ziel in Verbindung unter den kombinierten Aspekten der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden könnte. Passende Tumorzell-Antigene für zusätzliches Immuntoxin- und Koaguligand-Anzielen, schließen jene ein, die durch die Antikörper B3 (US-Patent 5,242,813; ATCC HB 10573); KSI/4 (US-Patent 4,975,369; erhalten aus einer Zelle, welche die Vektoren NRRL B-18356 und/oder NRRL B 18357 umfaßt); 260F9 (ATTC HB 8488) und D612 (US-Patent 5,183,756; ATCC HB 9796) erkannt werden. Man kann auch den ATCC-Katalog eines jeden aufeinanderfolgenden Jahres zu Rate ziehen, um andere geeignete Zellinien, die Antitumorzell-Antikörper produzieren, identifizieren.
Um Tumorvaskulatur anzuzielen wird der Zielantikörper oder -Ligand häufig an einen Marker gebunden, der durch die Blutgefäße im Inneren eines vaskularisierten Tumors exponiert, daran adsorbiert, darauf induziert oder anderweitig dort angereichert wird. Passende expremierte Zielmoleküle schließen beispielsweise Endoglin, E-Selektin, P-Selektin, VCAM-1, ICAM-1, PSMA (Liu et al., 1997), ein TIE, einen Liganden, der mit LAM-1 reagiert, einen VEGF/VPF-Rezeptor, einen FGF-Rezeptor, α_vβ₃-Integrin, Pleiotropin und Endosialin ein. Geeignete adsorbierte Ziele sind jene, wie etwa VEGF, FGF, TGFβ, HGF, PF4, FDGF, TIMP, ein Ligand, der an ein TIE und an Tumor-assoziierte Fibronektin-Isoformen bindet. Antigene, die auf natürliche Weise und artifiziell durch Zytokine und Koagulanzien induzierbar sind, können ebenfalls angezielt werden, wie etwa ELAM-1, VCAM-1, ICAM-1, ein Ligand, der mit LAM-1 reaktiv ist, Endoglin und sogar MHC Klasse II (Zytokin-induzierbar, z.B. durch IL-1, TNF-α, IFN-γ, IL-4 und/oder TNF-β) und E-Selektin, P-Selektin, PDGF und ICAM-1 (Koagulanz-induzierbar, z.B. durch Thrombin, Faktor IX/IXa, Faktor X/Xa und/oder Plasmin.
Die folgenden Patente sind aufgefunden worden, zu dem Zweck, die vorliegenden Lehren im Hinblick auf die Herstellung und Verwendung von Immuntoxinen, die gegen exprimierte, adsorbierte, induzierte oder lokalisierte Marker der Tumorvaskulatur gerichtet sind, noch weiter zu ergänzen: US-Patente 5,855,866, 5,776,427, 5,863,538, 5,660,827, 5,855,866, 5,877,289, 6,004,554, 5,965,132, 6,051,230 6,004,555, 6,036,955 und 6,093,399.
Geeignete Tumorstroma-Ziele schließen Bestandteile der extrazellulären Matrix oder des Stromas des Tumor oder Bestandteile, die darin gebunden sind, ein, einschließlich Basalmembranmarker, Kollagen Typ IV, Laminin, Heparansulfat, Proteoglykan, Fibronektine, aktivierte Plättchen, LIBS und Tenascin. Ein bevorzugtes Ziel für derartige Anwendungen ist RIBS.
Die folgenden Patente sind aufgefunden worden zu dem Zweck, um die vorliegende Lehre im Hinblick auf die Herstellung und Verwendung von auf Tumorstroma zielgerichteten Mitteln weiter zu ergänzen: US-Patente 5,877,289; 6,004,555; 6,036,955 und 6,093,399.
Bei bestimmten Anwendungen werden die sekundären anti-Krebs-Therapeutika Antikörper oder Liganden sein, die funktionsfähig an zytotoxische oder anderweitige anti-Zell-Mittel angefügt sind, welche die Fähigkeit zum Abtöten oder Supprimieren des Wachstums oder der Zellteilung von Endothelzellen aufweisen. Geeignete anti-Zell-Mittel schließen chemotherapeutische Mittel und Radioisotope ein, ebenso wie Zytotoxine. Beispielhafte chemotherapeutische Mittel schließen folgende ein: Steroide; anti-Metaboliten, wie etwa Cytosin-Arabinosid, Fluoruracil, Methotrexat oder Aminopterin, Anthrazykline, Mitomycin C, Vinca-Alkaloide, Antikörper, Demecolcin, Etoposid, Mithramycin, und akylierende anti-Tumor-Mittel, wie etwa Chlorambucil oder Melphalan.
Bei den meisten kombinierten therapeutischen Anwendungen werden Toxin-Gruppen aufgrund der sehr viel größeren Fähigkeit der meisten Toxine, eine zellabtötende Wirkung im Vergleich zu anderen potentiellen Mitteln zu entfalten, bevorzugt sein. Deshalb sind bevorzugte anti-Zell-Mittel für sekundäre Therapeutika Toxine, wie von Pflanzen, Pilzen oder Bakterien abgeleitet sind. Beispielhafte Toxine schließen Epipodophyllotoxine, bakterielles Endotoxin oder den Lipid A-Anteil bakterieller Endotoxine, Ribosomen-aktivierende Proteine, wie etwa Saporin oder Gelonin, und weiter α-Sarcin, Aspergillin, Restrictocin, Ribonukleasen, wie etwa plazentale Ribonuklease, Diphterie-Toxin und Pseudomonas-Exotoxin ein.
Bestimmte bevorzugte Toxine sind Gelonin und/oder die A-Kette-Toxine, wie etwa Ricin A-Kette. Die am stärksten bevorzugte Toxin-Gruppe ist häufig die Ricin-A-Kette, die behandelt worden ist, um Kohlenwasserstoff Reste zu modifizieren oder zu entfernen, sogenannte "deglycosylierte A-Kette" (dgA). Eine deglycosilierte Ricin-A-Kette wird aufgrund ihrer extremen Potenz und ihrer längeren Halbwertszeit bevorzugt, und da sie ökonomisch leicht in einem für den klinischen Einsatz geeigneten Reinheitsgrad und Maßstab herzustellen ist. Rekombinante und/oder trunkierte Ricin A-Kette kann ebenfalls verwendet werden.
Andere Mittel zur Verwendung mit Immun-Konjugaten zum Anzielen von Tumorvaskulatur und Tumorstroma sind die Angiopoetine. Die Angiopoetine sind, wie die Mitglieder der VEGF-Familie, Wachstumsfaktoren, die ausgesprochen spezifisch für Gefäßendothel sind (Davis and Yancopoulos, 1999, Holash et al., 1999). Die zuerst beschriebenen Angiopoetine waren ein natürlicherweise vorkommender Agonist, Angiopoetin-1 (Ang-1; SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2) und ein natürlicherweise vorkommender Antagonist Angiopoetin-2 (Ang-2; SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4), von denen beide über den Endothelzell-Tyosinkinase-Rezeptor Tie2 wirken.
Zwei neue Angiopoetine, Angiopoetin-3 (Maus) und Angiopoetin-4 (Mensch) sind ebenfalls identifiziert worden (Valenzuela et al., 1999). Angeopoetin-3 scheint als ein Antagonist zu wirken, wohingegen Angiopoetin-4 als ein Agonist zu funktionieren scheint (Vanzuela et al., 1999). Ein als Angiopoetin-3 bezeichnetes Protein wurde auch aus dem menschlichen Herzen kloniert und von diesem wurde berichtet, daß es keine mitogenen Wirkungen auf Endothelzellen ausübt (Kim et al., 1999). Fusionsproteine von Angiopoetin-1 und Angiopoetin-2 sind erzeugt worden, wie durch das stabile Ang-1-Ang-2-Fusionsprotein hier als SEQ ID NO:5 aufgenommen, veranschaulichen.
Während VEGF notwendig ist, in den frühen Stadien der Gefäßentwicklung, wird Angiopoetin-1 im allgemeinen in den späteren Stadien der Gefäßerneuerung benötigt. Angiopoietin-1 ist demnach ein Reifungs- oder Stabilisierungsfaktor, der unreife zu reifen Gefäßen umformt.
Von Angiopoetin-1 ist gezeigt worden, daß der Faktor eine Revaskularisierung in ischämischem Gewebe steigert (Shyu et al., 1998) und das Überleben von Gefäßnetzwerken, die entweder VEGF oder einer Form von aFGF ausgesetzt waren, zu erhöhen (Papapetropoulos et al., 1999). Diese Autoren zeigten auch, daß Angiopoetin-1 einen apoptotischen Tod in HUVEC, ausgelöst durch Entzug in derselben Form von aFGF verhütet (Papapetropoulos et al., 1999). Solche Ergebnisse stimmen mit der direkten Rolle von Angiopoetin-1 bei menschlichen Endothelzellen und seiner Wechselwirkung mit anderen angiogenen Molekülen, um Gefäßstrukturen zu stabilisieren, indem das Überleben differenzierter Endothelzellen gefördert wird, überein.
Angiopoetin-2 ist ein bevorzugtes Mittel zur Verwendung in der zielgerichteten Kombinationstherapie, insbesondere bei Tumoren mit niedrigen VEGF-Spiegeln und/oder in Kombination mit einer VEGF-Hemmung. Angiopoetin-2 ist auch ein Ligand für Tie2, wirkt aber im allgemeinen einer durch Angiopoetin-1-vermittelten Blutgefäßreifung/-stabilität entgegen. Er ist demnach ein Antagonist von Angiopoetin-1 und wirkt, indem er die kapillare Struktur zerstört. Da jedoch Angiopoetin-2 Endothelzellen gegenüber angiogenen Stimuli empfindlich macht, kann es eine Neovaskularisierung in Kombination mit anderen geeigneten Signalen, insbesondere VEGF einleiten (Asahara et al., 1998; Holash et al., 1999).
In Abwesenheit eines anderen angiogenen Signals veranlaßt Angiopoietin-2, Gefäße instabil und unreif zu werden. In Gegenwart eines Stimulus, wie etwa VEGF, fördert Angiopoietin-2 die Angiogenese. Tatsächlich wird angenommen, daß die angiogenen Effekte einer Vielzahl von Regulatoren mindestens teilweise durch die Regulation einer autokrinen Schleife der Angiopoetin-2-Aktivität in mikrovaskulären Endothelzellen erzielt wird (Mandriota und Pepper, 1998).
Eine Angiopoetin-2-Expression in Tumorgewebe ist beschrieben worden (Tanaka et al., 1999), wo es vermutlich in Kombination mit VEGF wirkt, um Angiogenese zur fördern (Stratmann et al., 1998; Holash et al., 1999). Da allerdings Angiopoetin-2 ein negatives Signal liefert, wenn VEGF niedrig ist oder fehlt, kann eine Bereitstellung von Angiopoietin-2 ein nützlicher therapeutischer Ansatz sein. Angiopoetin-2 kann als ein Proteintherapeutikum oder mittels Gentherapie (siehe oben) verabreicht werden oder in Tumor-angezielter Form. Fusionsproteine von Angiopoetinen sind ebenfalls zur Verwendung im Zusammenhang mit Obwohl alle Typen von angezielten Angiopoetin-2-Konstrukten zur Verwendung unter Aspekten der kombinierten Therapie der Erfindung in Betracht gezogen werden, sind gegenwärtig bevorzugte Mittel zum Anzielen des Tumors durch Angiopoetin-2 jene, die an Aminophospholipide einschließlich anti-PS-Antikörpern und Annexinen, binden.
Zum Anzielen eines Tumors und der Behandlung mit Immuntoxinen sind die folgenden Patente zu dem Zweck aufgefunden worden, die vorliegenden Lehren im Hinblick auf anti-Zell- und zytotoxische Mittel weiter zu stützen: US-Patente 5,855,866, 5,776,427, 5,863,538, 5,660,827, 6,004,554, 6,051,230, 5,965,132 und 5,961,230.
Die zweiten zielgerichteten Mittel zur fakultativen Verwendung mit dem anti-Aminophospholipid-Antikörpern der Erfindung können auch einen zielgerichteten Bestandteil umfassen, der in der Lage ist, die Gerinnung zu fördern, d.h. ein „Koaguligand". Hier kann der zielgerichtete Antikörper oder Ligand direkt oder indirekt, d.h. über einen anderen Antikörper mit einem Faktor verknüpft sein, der direkt oder indirekt die Gerinnung stimuliert.
Bevorzugte Gerinnungsfaktoren für derartige Anwendungen sind Gewebefaktor (Tissue Factor, TF) und TF-Derivate, wie etwa trunkierter TF (tTF), dimerer, trimerer, polymerer/multimerer TF und mutierter TF, dem die Fähigkeit, Faktor VII zu aktivieren, fehlt. Andere geeignete Gerinnungsfaktoren schließen Vitamin K-abhängige Koagulanzien, wie etwa Faktor II/IIa, Faktor VII/VIIa, Faktor IX/IXa und Faktor X/Xa, Vitamin K-abhängige Koagulationsfaktoren, denen die Gla-Modifikation fehlt, Russell's Viper-Gift Faktor X-Aktivator, Plättchen-aktivierende Verbindungen, wie etwa Thromboxan A₂ und Thromboxan A₂-Synthase und Inhibitoren einer Fibrinolyse, wie etwa α2-Antiplasmin, ein.
Das Abzielen auf einen Tumor und dessen Behandlung mit Koaguliganden wird in den folgenden Patenten und Patentanmeldungen beschrieben, von denen jede/jedes nützlich ist zum Zweck, die vorliegenden Lehren hinsichtlich Koaguliganden und Koagulationsfaktoren sogar weiter zu unterstützen: US-Patente 5,855,866, 5,965,132, 6,036,955, 6,093,399 und 5,877,289.
Da eine etwas weitere Verteilung eines koagulierenden Agens nicht mit schweren Nebenwirkungen verbunden sein soll, wird eine weniger strenge Anforderung an die zielgerichteten Elemente von Koaguliganden im Vergleich zu Immuntoxinen gestellt. Ein spezifisches Anzielen zu erreichen bedeutet deshalb, daß eine Gerinnung in der Tumorvaskulatur im Verhältnis zur Vaskulatur an Stellen ohne Tumor gefördert wird. Ein spezifisches Anzielen eines Koaguliganden ist deshalb ein funktioneller Begriff anstelle eines rein physikalischen Begriffs, der sich auf die biologischen Verteilungseigenschaften des zielgerichteten Mittels bezieht.
Die Herstellung von Immuntoxinen ist im Stand der Technik allgemein gut bekannt (siehe z.B. US-Patent 4,340,535). Jedes/jede der folgenden Patente und Patentanmeldungen sind nützlich zum Zweck, die vorliegende Lehre hinsichtlich Herstellung, Reinigung und Verwendung von Immuntoxinen sogar weiter zu unterstützen: US-Patente 5,855,866, 5,776,427, 5,863,538, 6,004,554, 5,965,132, 6,051,230 und 5,660,827 sowie die US-Anmeldung mit der Seriennummer 07/846,349.
Bei der Herstellung von Immuntoxinen können durch die Verwendung bestimmter Linker Vorteile erreicht werden. Beispielsweise werden Linker, die eine sterisch "gehinderte" Disulfid-Bindung enthalten, aufgrund ihrer größeren Stabilität in vivo häufig bevorzugt, wodurch vor den Bindung an die Wirkungsstelle eine Freisetzung des Toxin-Anteils verhütet wird. Im allgemeinen ist gewünscht, ein Konjugat zu haben, das unter Bedingungen, die überall im Körper angetroffen werden, intakt bleibt, außer an der beabsichtigen Wirkungsstelle, an der Punkt es wünschenswert ist, daß das Konjugat gute "Freisetzungs"-Charakteristika aufweist.
In Abhängigkeit von der verwendeten spezifischen Toxin-Verbindung kann es notwendig sein, einen Peptid-Spacer verfügbar zu machen, durch den das zielgerichtete Mittel und die Toxin-Verbindung funktionsfähig aneinander gehängt werden, wobei der Peptid-Spacer in der Lage ist, sich in eine Disulfid-gebundene Schleifenstruktur zu falten. Eine proteolytische Spaltung innerhalb der Schleife würde dann ein heterodimeres Polypeptid hervorbringen, wobei das zielgerichtete Mittel und die Toxin-Verbindung nur durch eine einzige Disulfidbindung verknüpft sind.
Wenn bestimmte andere Toxin-Verbindungen verwendet werden, kann eine nicht-spaltbarer Peptid-Spacer verfügbar gemacht werden, um das zielgerichtete Mittel und die Toxin-Verbindung aneinander zu hängen. Toxine, die in Verbindung mit nicht-spaltbaren Peptid-Spacern verwendet werden können, sind solche, die selbst durch proteolytische Spaltung in eine cytotoxische Disulfid-gebundene Form überführt werden können. Ein Beispiel einer solchen Toxin-Verbindung ist eine Pseudomonas-Exotoxin-Verbindung.
Eine Auswahl chemotherapeutischer oder anderer pharmakologischer Agenzien kann ebenfalls erfolgreich mit Aminophospholipid-Antikörpern oder zielgerichteten Liganden konjugiert werden. Beispielhafte antineoplastische Agenzien, die mit Antikörpern konjugiert wor den sind, schließen Doxorubicin, Daunomycin, Methotrexat und Vinblastin ein. Darüber hinaus ist das Anhängen anderer Agenzien, wie etwa Neocarzinostatin, Macromycin, Trenimon und α-Amanitin beschrieben worden (siehe US-Patente 5,855,866 und 5,965,132).
Angesichts einer früheren Arbeit der Erfinder der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Koaguliganden jetzt ebenfalls leicht auszuführen. Die funktionsfähige Verknüpfung von einem oder mehreren Gerinnungsfaktoren mit einem auf Aminophospholipid zielgerichteten Mittel kann eine direkte Verknüpfung sein, wie etwa jene, die oben für die Immuntoxine beschrieben wurde. Alternativ kann die funktionsfähige Verknüpfung eine indirekte Anhängung sein, wie etwa wenn das zielgerichtete Mittel funktionsfähig an eine zweite bindende Region angehängt ist, vorzugsweise an einen Antikörper oder eine Antigen-bindende Region eines Antikörpers, der an den Gerinnungsfaktor bindet. Der Gerinnungsfaktor sollte an das zielgerichtete Mittel an einer Stelle angehängt sein, die von seiner funktionellen, die Gerinnung vermittelnden Stelle entfernt liegt, insbesondere wenn eine kovalente Bindung verwendet wird, um die Moleküle zu verbinden.
Indirekt verbundene Koaguliganden beruhen häufig auf bispezifischen Antikörpern. Die Herstellung von bispezifischen Antikörpern ist im Stand der Technik bestens bekannt. Ein präparatives Verfahren betrifft die separate Herstellung von Antikörpern mit Spezifizität für den angezielten Tumorbestandteil auf der einen Seite und das koagulierende Agens auf der anderen. Peptidische F(ab'γ)₂-Fragmente von den beiden ausgewählten Antikörpern werden dann erzeugt, gefolgt von einer Reduktion eines jeden, um separate Fab'γ_SH-Fragmente verfügbar zu machen. Die SH-Gruppen in einem der beiden zu kuppelnden Partnern werden dann mit einem quervernetzenden Reagens, wie etwa o-Phenylendimaleimid, alkyliert, um dem einen Partner freie Maleimid-Gruppen zur Verfügung zu stellen. Dieser Partner kann dann mit dem anderen mit Hilfe einer Thioether-Bindung konjugiert werden, um das gewünschte F(ab'γ)₂-Heterokonjugat zu ergeben (Glennie et al., 1987; hiermit durch Zitat aufgenommen). Andere Ansätze, wie etwa eine Quervernetzung mit SPDP oder Protein A können ebenfalls durchgeführt werden.
Ein anderes Verfahren zum Produzieren bispezifischer Antikörper ist durch die Fusion von zwei Hybridomen, um ein Quadrom zu bilden. Wie hier verwendet, wird der Begriff "Quadrom" benutzt, um die produktive Fusion zweier B-Zell-Hybridome zu beschreiben. Unter Verwendung von Techniken, die jetzt Standard sind, werden zwei Antikörper-produzierende Hybridome fusioniert, um Tochterzellen hervorzubringen, und jene Zellen, welche die Expression von beiden Sets klontypischer Immunglobulin-Gene bewahrt haben, werden dann ausgewählt.
Ein bevorzugtes Verfahren, ein Quadrom zu erzeugen, beinhaltet die Auswahl einer Enzymdefizienten Mutante aus mindestens einem der parentalen Hybridome. Diese erste mutierte Hybridom-Zellinie wird dann mit Zellen eines zweiten Hybridoms, das letalen Bedingungen ausgesetzt worden ist, z.B. Iodacetamid, wodurch ein fortgesetztes Überleben ausgeschlossen wurde, fusioniert. Zellfusionen erlauben die "Rettung" des ersten Hybridoms durch Erwerben des Gens für dessen Enzym-Defizienz von dem letal behandelten Hybridom und die "Rettung" des zweiten Hybridoms durch Fusion mit dem ersten Hybridom. Bevorzugt, jedoch nicht erforderlich, ist die Fusion von Immunglobulinen mit dem selben Isotyp, jedoch einer anderen Subklasse. Ein Antikörper gemischter Subklassen erlaubt die Verwendung eines alternativen Tests zur Isolierung eines bevorzugten Quadroms.
Ausführungen mit einer Mikrotiter-Identifizierung, FACS, Immunfluoreszensfärbung, Idiotyp-spezifische Antikörper, Antigen-Kompetition-Bindungstests und andere Verfahren, die im Stand der Technik zur Antikörper-Charakterisierung gängig sind, können verwendet werden, um bevorzugte Quadrome zu identifizieren. Im Anschluß an die Isolierung des Quadroms werden die bispezifischen Antikörper von anderen Zellprodukten gereinigt. Dies kann durch eine Auswahl von Verfahren zur Antikörperisolierung, die Fachleuten im Bereich der Immunglobulin-Reinigung bekannt sind, erreicht werden (siehe z.B. "Antibodies: A Laboratory Manual", 1988). Protein A- oder Protein G-Sepharose-Säulen sind bevorzugt.
Bei der Herstellung sowohl von Immuntoxinen als auch Koaguliganden kann die rekombinante Expression eingesetzt werden. Die Nukleinsäuresequenzen, welche das ausgewählte zielgerichtete Mittel oder Toxin oder Koagulanz kodieren, werden im Leseraster ("in-frame") in einen Expressionsvektor eingefügt. Eine rekombinante Expression führt daher zur Translation der Nukleinsäuren, um die gewünschte Verbindung aus zielgerichtetem Mittel und Toxin bzw. Koagulanz hervorzubringen. Chemische Quervernetzer und Avidin-Biotin-Brücken können das/die therapeutische(n) Mittel mit dem/den zielgerichteten Mittel(n) verknüpfen.
Die folgenden Patente und Patentanmeldungen sind jeweils nützlich zum Zweck, die vorliegende Lehre hinsichtlich einer Präparation, Reinigung und Verwendung eines Koaguliganden, einschließlich bispezifische Antikörper-Koaguliganden, noch weiter zu unterstützen: US-Patente 5,855,866, 5,965,137, 6,004,555, 6,036,955, 6,039,399 und 5,877,289.
Wirksame Dosen von Immuntoxinen und Koaguliganden zur kombinierten Verwendung mit nackten anti-Aminophospholipid-Antikörpern bei der Behandlung von Krebs werden zwischen ungefähr 0,1 mg/kg und ungefähr 2 mg/kg, und vorzugsweise zwischen ungefähr 0,8 mg/kg und ungefähr 1,2 mg/kg betragen, wenn sie über die IV-Route in einer Häufigkeit von ungefähr einmal pro Woche verabreicht werden. Einige Abwandlungen in der Dosierung werden notwendigerweise auftreten, abhängig von dem Zustand der/des zu behandelnden Versuchsperson/Patienten. Der Arzt, der für die Verabreichung verantwortlich ist, wird die geeignete Dosis für die/den individuelle(n) Versuchsperson/Patienten bestimmen.
Die folgenden Beispiele werden einbezogen, um bevorzugte Ausführungen der Erfindung darzustellen. Von denjenigen, die sich auf dem Gebiet auskennen sollte anerkannt werden, daß die in den Beispielen, die folgen, offenbarten Techniken solche Techniken darstellen, die durch die Erfinder entdeckt wurden, um in der Praxis der Erfindung gut zu funktionieren und deshalb berücksichtigt werden kann, daß sie bevorzugte Formen für deren Ausführung verkörpern.
BEISPIEL 1
VCAM-1-Expression auf Tumor- und normalen Blutgefäßen
A. Material und Methoden
1. Materialien
Na¹²⁵I wurde von Amersham (Arlington Heights, IL) erhalten. Dulbecco's modified Eagle's tissue culture medium (DMEM) und Dulbecco-PBS, das Ca²⁺ und Mg ²⁺ enthielt, wurden von Gibco (Grand Island, NY) erhalten. Fötales Kälberserum wurde von Hyclone (Logan, Utah) erhalten. o-Phenylendiamin, Wasserstoffperoxid, 3-Aminopropyltriethoxysilan und sterile, Endotoxin-freie Kochsalzlösung (0,9% NaCl in 100 ml Wasser) waren von Sigma (St. Louis, MO). SMPT war von Pierce (Rockford, IL). Proplex T, enthaltend Faktor VII (74 IU/ml), Faktor X und Faktor IX (17 IU/ml) wurden von Baxter Diagnostics Inc. (McGraw Park, IL) bezogen. Chromogenes Substrat S-2765 zum Messen der proteolytischen Aktivität von Faktor Xa wurde von Chromogenix (Franklin, OH) erhalten. Gereinigter Faktor Xa wurde von American Diagnostica (Greenwich, CT) bezogen. 96- und 48-Well-Flachboden-Mikrotiterplatten wurden von Falcon (Becton Dickinson and Co., Lincoln Park, NJ) erhalten. Sepharose-Protein G-Beads und S200-Superdex wurden von Pharmacia (Piscataway, NJ) bezogen. Rekombinantes Mäuse-IL-1α wurde von R&D Systems (Minneapolis, MN) bezogen.
2. Antikörper
Das Hybridom MK2.7, das einen IgG1-Rattenantikörper gegen Mäuse-VCAM-1 sezerniert, wurde von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD; ATCC CRL 1909) erhalten. Die Charakterisierung dieses anti-VCAM-1-Antikörpers wurde durch Myake et al. (1991) beschrieben. Das Hybridom R187, das einen IgG1-Rattenantikörper gegen virales Protein p30 gag aus der Maus sezerniert, wurde von der ATCC erhalten und wurde als eine Isotyp-entsprechende Kontrolle für den anti-VCAM-1-Antikörper verwendet.
Der monoklonale Mäuseantikörper 10H10 gegen menschlichen Gewebefaktor wurde wie in Morrissey et al. (1988) beschrieben und in der US-Anmeldung mit der Serien-Nr. 08/482,369 beschrieben, hergestellt.
MECA 32, ein anti-Maus-Gefäßendothelzell-Antikörper (pan) wurde wie durch Leppink et al. (1989) beschrieben, hergestellt. MJ 7/18-Ratten-IgG, das mit Mäuse-Endoglin reaktiv ist, wurde, wie durch Ge und Butcher (1994) beschrieben, hergestellt. Die MECA-32- und MJ 7/18-Antikörper dienten als positive Kontrollen bei immunhistochemischen Untersuchungen.
Sekundäre Kaninchen-anti-Ratte- und Ratte-anti-Maus-Antikörper, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP), wurden von Dako (Carpinteria, CA) bezogen.
3. Antikörperreinigung
Anti-VCAM-1-Hybridomzellen MK 2.7 und das irrelevante Kontroll-Hybridom R187 wurden in Bioreaktoren (Heraeus, Inc., Deutschland) 12 Tage wachsen gelassen. Die Überstände wurden zentrifugiert, durch 0,22 μm Filter filtriert und auf Sepharose-Protein G-Säulen geladen. IgG wurde mit Zitronensäurepuffer, pH 3,5, eluiert, gegen PBS dialysiert und danach bei 4°C in demselben Puffer gelagert. Die Reinheit wurde durch SDS-PAGE abgeschätzt und betrug routinemäßig > 90%. Die Bindungskapazität des gereinigten anti-VCAM-1-Antikörpers wurde immunhistochemisch an Gefrierschnitten von L540-Tumoren und durch zellbasierten ELISA unter Verwendung von IL-1α-stimulierten bEnd.3-Zellen, wie hier unten beschrieben, beurteilt.
4. Tumortragende Mäuse und Immunhistochemie
CB17 SCID-Mäusemännchen (Charles River, Wilmington, MA), die annähernd 25 g wogen, wurden Injektionen mit 1 × 10⁷ L540 Hodgkin-Lymphomzellen subkutan in die rechte Flanke verabreicht. Die Tumoren wurden auf eine Größe von 0,4-0,7 cm³ wachsen gelassen. Die Tiere wurden mit Metafan anästhetisiert und ihr Blutkreislauf wurde mit heparinisierter Kochsalzlösung perfundiert, wie bei Burrows et al. (1992) beschrieben. Der Tumor und hauptsächliche Organe wurden entnommen und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Cryostatschnitte der Gewebe wurden hergestellt, mit dem anti-VCAM-1-Antikörper inkubiert und immunhistochemisch gefärbt, um VCAM-1 zu detektieren. Ratten-IgG wurde unter Verwendung eines Kaninchen-anti-Ratte-IgG, das mit HRP konjugiert war, gefolgt von einer Entwicklung mit Carbazol (Fries et al., 1993), nachgewiesen.
B. Ergebnisse
Die Blutgefäße der Hauptorgane und eines Tumors aus Mäusen, die subkutane menschliche Morbus-Hodgkin-Tumoren L540 trugen, wurden immunhistochemisch auf eine VCAM-1-Expression unter Verwendung eines anti-VCAM-1-Antikörpers untersucht. Eine VCAM-1-Expression auf Tumorblutgefäßen war eher peripher als zentral. Wie allerdings in Beispiel VI und Beispiel VII gezeigt, banden der anti-VCAM-1-Antikörper und Koaguligand offensichtlich an bluttransportierende Gefäße, wie durch die Fähigkeit des Koaguliganden, den Blutfluß in allen Tumorbereichen zu unterbrechen und eine Zerstörung der Region im Tumorinneren zu verursachen, eindeutig gezeigt wurde.
Insgesamt wurde eine VCAM-1-Expression auf 20-30% der insgesamt durch den anti-Endoglin-Antikörper MJ 7/18 gefärbten Tumorblutgefäßen beobachtet. Eine ausgedehnte VCAM-1-Färbung der Tumorgefäße wurde bei Venolen beobachtet. Die VCAM-1-Expression war in Tumoren bis zu 1500 mm³ ähnlich, größere Tumoren jedoch schienen eine verringerte Färbung aufzuweisen, wobei 5-10% von MJ 7/18-positiven Gefäßen VCAM-1-positiv waren.
Eine konstitutive vaskuläre Expression von VCAM-1 wurde in Herz und Lungen sowohl bei Tumor-tragenden als auch normalen Tieren gefunden (Tabelle 1). Im Herzen wurde eine starke Färbung bei Venolen und Venen beobachtet. Ungefähr 10% von MECA 32-positiven Gefäßen waren VCAM-1-positiv. Die Färbung im Lungenendothel war im Vergleich zu Herz und Tumor schwach und war auf wenige große Blutgefäße beschränkt. Eine starke Färbung des Stromas wurde in den Hoden beobachtet, wo eine VCAM-1-Expression strikt extravasku-lär war. Von ähnlichen Befunden hinsichtlich einer konstitutiven VCAM-1-Expression in der Nagetierlunge und den Testes wurde zuvor berichtet (Fries et al., 1993).
TABELLE 1 Expression von VCAM-1 auf dem Endothel in Geweben von L540-Tumor-tragenden Mäusen und Lokalisierung des anti-VCAM-1-Antikörpers
BEISPIEL II
Lokalisierung des anti-VCAM-1-Antikörpers in vivo
A. Methoden
CB17-SCID-Mäusemännchen (Charlesriver, Wilmington, MA), die annähernd 25 g wogen, wurden Injektionen mit 1 × 10⁷ L540 Hodgkin-Lymphomzellen subkutan in die rechte Flanke verabreicht. Die Tumoren wurden bis zu einer Größe von 0,4-0,7 cm³ wachsen gelassen.
Die Mäuse erhielten intravenöse Injektionen mit 30 μg/25 g Körpergewicht anti-VCAM-1-Antikörper, R187-Antikörper oder entsprechenden Koaguliganden in 200 μl Kochsalzlösung. Zwei Stunden später wurden die Tiere mit Metafan anesthätisiert und ihre Blutzirkulation wurde mit heparinisierter Kochsalzlösung perfundiert, wie beschrieben (Burrows et al., 1992). Der Tumor und hauptsächliche Organe wurden entfernt und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.
Cryostatschnitte der Gewebe wurden hergestellt und wurden immunhistochemisch auf das Vorhandensein von Ratten-IgG oder TF gefärbt. Ratten-IgG wurde unter Verwendung von Kaninchen-anti-Ratte-IgG, konjugiert mit HRP, gefolgt durch eine Entwicklung mit Carbazol (Fries et al. 1993) nachgewiesen. Der Koaguligand wurde unter Verwendung des 10H10-Antikörpers, der menschlichen Gewebefaktor erkennt, gefolgt durch HRP-markiertes anti-Maus-IgG nachgewiesen. Der 10H10-Antikörper kreuzreagiert nicht nachweisbar mit Maus-Gewebefaktor der Maus (Morrissey at al., 1988) oder anderen Mäuseproteinen.
B. Ergebnisse
Mäuse, die subkutane L540-Tumoren trugen, wurden intravenöse Injektionen mit anti-VCAM-1-Antikörper verabreicht, und zwei Stunden später wurden die Mäuse ausgeblutet. Der Tumor und normale Organe wurden entfernt, und Gefrierschnitte wurden hergestellt und immunhistochemisch untersucht, um die Lokalisierung des Antikörpers zu bestimmen. Serielle Schnitte der Gewebe wurden untersucht. Angereichertes Ratten-IgG wurde durch HRP-markiertes anti-Ratte-IgG nachgewiesen, und Mäuseblutgefäße wurden durch den Endothel-Antikörper (pan) MECA 32 identifiziert.
Anti-VCAM-1-Antikörper wurde auf Endothel von Tumor, Herz und Lunge nachgewiesen (Tabelle 1). Die Intensität und Anzahl gefärbter Gefäße war identisch mit denen in seriellen Schnitten derselben Gewebe, die direkt mit anti-VCAM-1-Antikörper gefärbt wurden (Tabelle 1). Die Färbung war spezifisch, da keine Färbung des Endothels bei dem Tumor und den Organen von Mäusen beobachtet wurde, die Injektionen mit einem Spezies-Isotyp-passenden Antikörper von irrelevanter Spezifität, R187, erhielten. Keine Lokalisierung von anti-VCAM-1-Antikörper wurde in den Testes oder irgendeinem normalen Organ, mit Ausnahme von Herz und Lunge, gefunden.
Beispiel III
Präparation eines anti-VCAM-1-t·TF-Koaguliganden
Ein anti-VCAM-1-t·TF-Konjugat oder "Koaguligand" wurde wie folgt präpariert. Trunkierter Gewebefaktor (tTF) mit einem zusätzlich angefügten Cystein, eingeführt am N-Terminus (US-Anmeldung mit der Seriennummer 08/482,369) wurde in E. coli exprimiert und gereinigt, wie bei Stone et al. (1995) beschrieben. Nach der Reinigung wurde die Sulfhydrylgruppe von N'-Cystein-tTF durch Reaktion mit Ellman's-Reagenz geschützt. Das tTF-Derivat wurde in kleinen Volumina bei –70°C gelagert.
Um den anti-VCAM-1-Koaguliganden herzustellen, wurden 5 ml anti-VCAM-1-Antikörper-IgG (2 mg/ml) in PBS mit 36 μl SMPT (10 mM), gelöst in wasserfreiem DMF, gemischt und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mischung wurde über eine Sephadex G25-Säule, äquibiliert in PBS, das 1 mM EDTA enthielt, filtriert. Die Fraktionen, die den SMPT-derivatisierten Antikörper enthielten, wurden durch Ultrafiltration in einer Amicon-Zelle, ausgerüstet mit einem Filter mit einer Ausschlußgrenze von 10.000 Da, auf 4 ml konzentriert. Frisch aufgetautes tTF-Derivat wurde mit 30 μl DTT (10 mM) in H₂O 10 Min. bei Raumtemperatur inkubiert und wurde über eine Sephadex G25-Säule, äquilibriert in PBS, das 1mM EDTA enthielt, filtriert. Die eluierten Fraktionen, die reduzierten tTF enthielten, wurden durch Ultrafiltration unter Stickstoff auf ein Endvolumen von 3 ml konzentriert.
Der reduzierte tTF wurde mit dem SMPT-derivatisierten Antikörper gemischt, und die Mischung wurde 24 Stunden bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Am Ende der Inkubation wurde die Reaktionsmischung durch Gelfiltration an einer Superdex S200-Säule, äquilibriert mit PBS, aufgetrennt. Fraktionen, die anti-VCAM-1·tTF mit einem M_r von 180.000 enthielten und die einem Molekül Antikörper, verknüpft mit einem Molekül tTF, entsprachen, wurden gesammelt.
Beispiel IV
Bindung von anti-VCAM-1-Koaguligand an aktivierte Endothelzellen
A. Methoden
1. Jodierung des 10H10-Antikörpers
Der anti-Mensch-Gewebefaktor-Antikörper 10H10 wurde unter Verwendung von Chloramin T, wie bei Bocci (1964) beschrieben, mit ¹²⁵J radioaktiv markiert. Die spezifische Aktivität betrug annähernd 10.000 cpm/μg, wie aus Proteinbestimmungen, gemessen durch einen Bradford-Test (Bradford, 1976), berechnet wurde.
2. Zellen
L540 Hodgkin-Zellen (L540 Cy), die aus einem Patienten im Endstadium der Erkrankung stammten, wurden wie bei Diehl et al. (1985), hergestellt, und wurden von Prof. Volker Diehl (Klinik für Innere Medizin der Universität Köln, Deutschland) erhalten. bEnd.3-Zellen (Hirn-Endotheliom der Maus) wurden wie bei Bussolino et al. (1991) und Montesano et al. (1990) beschrieben, hergestellt, und wurden von Prof. Werner Riesau (Max-Planck-Institut, Bad Nauheim, Deutschland) erhalten.
3. Gewebekultur
bEnd.3-Zellen und Hybridome wurden in DMEM, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 2 Units/ml Penicillin G und 2 μg/ml Streptomycin, kultiviert. L540-Zellen wurden in RPMI 1640, das dieselben Additive enthielt, kultiviert. Alle Zellen wurden einmal wöchentlich subkultiviert. Eine bEnd.3-Trypsinisierung wurde unter Verwendung von 0,125% Trypsin in PBS-Lösung, die 0,2% EDTA enthielt, durchgeführt. Für Bindungsstudien wurden Zellen in einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/ml in 0,5 ml Medium in 48 Well-Platten ausgesät und 48 bis 96 Stunden inkubiert. Das Medium wurde 24 Stunden vor jedem Test erneuert.
4. Bindung des Koaguliganden an aktivierte Endothelzellen
Eine Bindung des anti-VCAM-1-Antikörpers und Koaguliganden an VCAM-1 auf aktivierten bEnd.3-Zellen wurde unter Verwendung eines zellbasierten ELISA, wie durch Hahne (1993) beschrieben, bestimmt. bEnd.3-Zellen wurden mit 10 Units/ml IL-1α 4 Stunden bei 37°C in 96-Well-Mikrotiterplatten inkubiert. Am Ende dieser Inkubation wurde das Medium durch DPBS, das 2 mM Ca³⁺ und Mg²⁺ und 0,2% (Gew/Vol) Gelatine als einem Trägerprotein enthielt, ersetzt. Derselbe Puffer wurde zur Verdünnung von Antikörpern und zum Waschen von Zellmonolayern zwischen den Schritten verwendet.
Die Zellen wurden mit 4 μg/m1 anti-VCAM-1·tTF-Konjugat, anti-VCAM-1 Antikörper oder KontrollreMittel zwei Stunden inkubiert und wurden dann gewaschen und eine Stunde mit Kaninchen-anti-Ratte-IgG-HRP-Konjugat (1:500 Verdünnung) inkubiert. Alle Schritte wurden bei Raumtemperatur ausgeführt. Die HRP-Aktivität wurde durch Zugabe von o-Phenylendiamin (0,5 mg/ml) und Wasserstoffperoxid (0,03% Gew/Vol) in Citrat-Phosphat-Puffer, pH 5,5, gemessen. Nach 30 Min. wurden 100 μl Überstand in 96-Well-Platten überführt, 100 μl 0,18 M H₂SO₄ wurden zugesetzt, und die Absorption wurde bei 492 nm gemessen. Jeder Test wurde mit Doppelbstimmungen durchgeführt und mindestens zwei Mal wiederholt.
5. Nachweis von an Endothelzellen gebundene Koaguliganden
Anti-VCAM-1-Koaguligand und geeignete Kontrollen wurden mit IL-1α-stimulierten bEnd.3-Zellen in 96 Well-Mikrotiterplatten wie oben beschrieben inkubiert. Gebundene Koaguliganden wurden nachgewiesen, indem sowohl der Gewebefaktor-Bestandteil als auch der Ratten-IgG-Bestandteil, die an bEnd.3-Zellen gebunden waren, identifiziert wurden.
Nach Entfernen des Überschusses von ungebundenem Antikörper wurden die Zellen mit 100 μg/Well ¹²⁵J-markiertem 10H10-Antikörper (0,2 μg/ml) oder ¹²⁵J-markiertem Kaninchen-anti-Ratten-Ig (0,2 μg/ml) in Bindungspuffer inkubiert. Nach zwei Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen gründlich gewaschen und in 0,5 M NaOH resuspendiert. Das gesamte Volumen von 0,5 ml wurde in Kunststoffröhrchen überführt und in einem γ-Zähler gezählt. Jeder Test wurde in Doppelbstimmungen durchgeführt und mindestens zwei Mal wiederholt.
B. Ergebnisse
Die Fähigkeit von einem anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden, an IL-1α-aktivierte Mäuse-bEnd.3-Zellen zu binden, wurde durch Messen der Bindung von radiojodiertem anti-TF-Antikörper an mit dem Koaguliganden-behandelten Zellen in vitro bestimmt. Eine VCAM-1-Expression durch bEnd.3-Zellen ist durch IL-1α transient induzierbar, wobei ein Gipfel der VCAM-1-Expression vier bis sechs Stunden nach Zugabe des Zytokins erhalten wurde (Hahne et al., 1993). Es wurde eine starke Bindung des Koaguliganden an aktivierte bEnd.3-Zellen beobachtet (1A).
Am Sättigungspunkt waren 8,7 fMol anti-TF-Antikörper an die Zellen gebunden, was zu 540.000 Molekülen anti-TF-Antikörper pro Zelle äquivalent ist. Die Bindung des Koaguliganden war spezifisch; mit einem Isotyp-passenden Kontroll-Koaguliganden von irrelevanter Spezifität war keine über den Hintergrund hinausgehende Bindung nachweisbar. Eine Bindung des Koaguliganden an unstimulierte Zellen betrug ungefähr die Hälfte von der an aktivierte Zellen und ist wahrscheinlich durch eine konstitutive VCAM-1-Expression durch kultivierte Endotheliomzellen bedingt.
In weiteren Studien wurde festgestellt, daß der anti-VCAM-1·tTF-Koaguligand ebenso stark wie unkonjugierter anti-VCAM-1-Antikörper an aktivierte bEnd.3-Zellen band, wobei in dem Test der Nachweis durch Peroxidase-markiertes anti-Ratte-IgG verwendet wurde. Dies wurde sowohl mit sättigenden als auch sub-sättigenden Konzentrationen durchgeführt. Folglich verminderte die Konjugationsprozedur (Beispiel III) die Kapazität des Antikörpers, an VCAM-1 auf intakten Endothelzell-Monolayers zu binden, nicht.
Beispiel V
Faktor X-Aktivierung durch Endothelzell-gebundenen Koaguliganden
A. Methoden
Die Aktivität des anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden, gebunden an aktivierte bEnd.3-Zellen, wurde indirekt unter Verwendung eines Chromogen-Tests bestimmt, um Faktor Xa nachzuweisen (Schorer et al., 1985; Nawroth et al., 1985). IL-1α-stimulierte und unstimulierte bEnd.3-Zellen wurden mit spezifischen und Kontroll-Koaguliganden in 96-Well-Mikrotiterplatten wie oben beschrieben inkubiert. Die Zellen wurden mit PBS, das 2 mg/ml BSA enthielt, gewaschen und wurden mit 150 μl/We11 einer frisch präparierten Proplex T-Lösung, 1:20 in 50 mM Tris-HCl (pH 8,1), 150 mM NaCl, 2 mg/ml BSA (Gewebekultur-Grad, Endotoxin-frei) und 2,5 mM CaCl₂ verdünnt, inkubiert. Nach Inkubation für 60 Min. bei 37°C wurden jedem Well 100 μl entnommen, in 96-Well-Platten überführt und mit 100 μl desselben Puffers, der 12,5 mM EDTA (pH 8,1) enthielt, gemischt.
Chromogenes Substrat S2765 zum Messen der proteolytischen Aktivität von Faktor Xa wurde in 50 μl gegeben, was eine Endkonzentration von 300 μM ergab. Der Abbau des Substrats wurde durch Ablesen der Absorption bei 405 nm über eine Zeitdauer von zwei Stunden in einem Mikrotiterplatten-Lesegerät (Molecular Devices, Palo Alto, CA) bestimmt.
Die Produktion des chromogenen Produkts war vollständig vom Vorhandensein von Proplex T und bEnd.3-Zellen, vorinkubiert mit dem spezifischen Koaguliganden, abhängig. Die Hintergrundhydrolyse des Substrats durch Proplex T in Abwesenheit von Zellen betrug annähernd 10% des maximalen Werts und wurde von jeder Bestimmung subtrahiert. Freie Koaguliganden, verdünnt in Proplex T-Lösung, waren unfähig, Faktor Xa zu erzeugen. Die Menge an erzeugtem Xa wurde unter Bezugnahme auf eine Standardkurve, die mit bekannten Konzentrationen von gereinigtem Faktor Xa aufgenommen wurde, berechnet.
Am Ende der Studie wurden die Zellen mit Trypsin-EDTA abgelöst und gezählt. Die Ergebnisse werden als diejenige Menge an Faktor Xa ausgedrückt, die pro 10⁴ Zellen erzeugt wurde. Jede Studie wurde in Doppelbstimmungen durchgeführt und wurde mindestens drei Mal wiederholt.
B. Ergebnisse
1. Faktor X-Aktivierung
Anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden, gebunden IL-1α-aktivierte bEnd.3-Zellen, war in der Lage, Faktor X spezifisch zu aktivieren. Die Erzeugungsrate von Faktor Xa durch anti-VCAM-1·tTF-beschichtete Zellen betrug 3,2 ng pro 10⁴ Zellen pro Stunde, was 7 bis 10-fach höher ist als bei aktivierten Zellen, die mit einem Kontroll-Koaguliganden von irrelevanter Spezifität oder mit tTF allein behandelt wurden, beobachtet wurde (1B). Anti-VCAM-1·tTF in Abwesenheit von Zellen hatte keine nachweisbare Faktor X-aktivierende Aktivität, was bestätigt, daß die Zellbindung für die Koaguliganden-Aktivität wesentlich ist.
Anti-VCAM-1·tTF, gebunden an unstimulierte bEnd.3-Zellen, aktivierten Faktor X mit einer Rate von 1,6 ng pro 10⁴ Zellen pro Stunde. Diese Rate beträgt ungefähr die Hälfte von der, die bei den IL-1α-stimulierten Zellen beobachtet wurde, in Übereinstimmung mit der 50% geringeren Menge an Koaguligand, die an unstimulierte im Vergleich zu stimulierten Zellen bindet. Ähnliche Ergebnisse wie die in 1B gezeigten wurden in drei separaten Studien erhalten.
2. Wirkung einer Endothelzell-Permeabilisation
Eine Permeabilisation von bEnd.3-Monolayers mit Saponin nach deren Behandlung dieser mit anti-VCAM-1·tTF-Koaguligand steigerte die Fähigkeit des gebundenen Koaguliganden, Faktor X zu aktivieren, um ungefähr das 30fache (Tabelle 2). Die Rate der Faktor Xa-Erzeugung durch unstimulierte Zellen, die mit anti-VCAM-1·tTF behandelt wurden, stieg von 1,6 auf 49,2 μg pro 10⁴ Zellen pro Stunde nach Permeabilisation, während die von IL-1α-stimulierten Zellen von 3,2 auf 98,8 ng pro 10⁴ Zellen pro Stunde anstieg. Die Faktor Xa er zeugende Aktivität der permeabilisierten Zellen war auf den gebundenen Koaguliganden anstelle von endogenem TF zurückzuführen, da permeabilisierte unbehandelte Zellen oder Zellen, die mit Kontroll-Koaguligand von irrelevanter Spezifität behandelt wurden, eine niedrige Faktor Xa-erzeugende Aktivität (2 ng pro 10⁴ Zellen pro Stunde) aufwiesen.
Diese Ergebnisse zeigen, daß der Koaguligand in der Lage ist, wirksamer in der Umgebung einer permeabilisierten Zelle zu wirken. Möglicherweise exponiert die Permeabilisierung negativ geladene Phospholipide vom Inneren der Zelle, was die Bildung der Koagulations-Initiationskomplexe beschleunigt oder anderweitig die Inaktivierung solcher Komplexe durch TFPI verhütet.
TABELLE 2 Erzeugung von Faktor Xa durch anti-VCAM-1·tTF, gebunden an intakte oder permeabilisierte bEnd.3-Zellen (ng pro 10⁴ Zellen pro 60 Min.)
BEISPIEL VI
Tumor-Blutgefäß-Thrombose durch anti-VCAM-1-Koaguligand
A. Methoden
SCID-Mäuse, die L540-Tumoren (0,4-0,7 cm³) trugen, erhielten intravenöse Injektionen von 40 μg (Gesamtprotein) von anti-VCAM-1·tTF oder R187·tTF. Diese Dosis entspricht 32 μg Antikörper und 8 μg tTF. Andere Tiere erhielten äquivalente Mengen an freiem Antikörper, freiem tTF oder einer Mischung von beidem. Die Tiere wurden 4 oder 24 Stunden später anästhetisiert, und ihre Blutzirkulation wurde mit heparanisierter Kochsalzlösung perfundiert. Der Tumor und die Hauptorgane wurden entfernt und wurden in Formalin fixiert und zur Anfertigung von Cryoschnitten in Paraffin eingebettet oder schockgefroren. Die Schnitte wurden durch das Zentrum des Gewebes oder Tumors angefertigt. Die Anzahl von Blutgefäßen mit oder ohne Thrombosen wurden in 5 Querschnitten gezählt. Der Prozentsatz an Gefäßen mit Thrombosen wurde berechnet.
B. Ergebnisse
1. Thrombose von Tumorblutgefäßen
Diese Studie zeigt, daß intravenöse Verabreichung des anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden selektiv eine Thrombose von Tumorblutgefäßen, im Gegensatz zu Gefäßen in normalen Geweben, in Tumor-tragenden Mäusen induziert.
Der anti-VCAM-1·tTF-Koaguligand wurde Mäusen, die subkutane L540-Tumoren von 0,4 bis 0,6 cm Durchmesser trugen, verabreicht. Vor der Koaguligand-Injektion waren die Tumoren gesund mit einer uniformen Morphologie, die keine Bereiche einer Nekrose aufwiesen. Die Tumoren waren gut vaskularisiert und waren vollständig frei von Gefäßen mit spontanen Thrombosen oder Hämorrhagien. Innerhalb von vier Stunden nach Koaguligand-Injektion wiesen 40-70% der Blutgefäße Thrombosen auf, trotz der im Beispiel I gezeigten anfänglichen Färbung von nur 20-30% Tumorblutgefäßen. Die Gefäße mit Thrombosen enthielten verschließende Plättchenaggregate, verdichtete Erythrozyten und Fibrin. In einigen Bereichen wiesen die Blutgefäße Rupturen auf, wodurch Erythrozyten in das Tumorinterstitium strömten.
24 Stunden nach Koaguliganden-Injektion waren die Blutgefäße noch verschlossen und eine ausgedehnte Blutung hatte sich über den gesamten Tumor ausgebreitet. Die Tumorzellen hatten sich voneinander separiert, wiesen pyknotische Nuklei auf und durchliefen eine Zytolyse. Nach 72 Stunden war eine fortgeschrittene Nekrose des ganzen Tumors offensichtlich. Die Nekrose war eindeutig in der Region im Tumorinneren des Tumors, wo eine VCAM-1-Expression auf den Gefäßen ursprünglich nicht vorherrschend war, vorhanden. Die Koaguliganden-Bindung war offensichtlich wirksam, um den Blutfluß in allen Tumorregionen einzuschränken, was zu einer ausgedehnten Tumorzerstörung führte. Weiterhin ist es wahrscheinlich, daß die anfängliche Koaguliganden-induzierte Thrombin-Ablagerung zu einer gesteigerten Induktion des VCAM-1-Ziel-Antigens auf zentralen Gefäßen führt, wodurch das Targeting und die Tumorzerstörung amplifiziert wird.
Die thrombotische Wirkung von anti-VCAM-1·tTF auf Tumorgefäßen war antigen-spezifisch. Keines der Kontroll-Reagenzien, verabreicht in äquivalenten Mengen (tTF allein, anti-VCAM-1-Antikörper allein, tTF plus anti-VCAM-1-Antikörper oder der Kontroll-Koaguligand von irrelevanter Spezifität), verursachten eine Thrombose (Tabelle 3)
TABELLE 3 Anti-VCAM-1·tTF-vermittelte Thrombose in L540-Tumor-tragenden Mäusen
2. Fehlen einer Thrombose bei normalen Blutgefäßen
Zusätzlich zu der Thrombose bei Tumorblutgefäßen zeigt diese Studie auch, daß eine intravenöse Verabreichung des anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden keine Thrombose in Blutgefäßen normaler Organe induziert.
Trotz einer Expression von VCAM-1 auf Gefäßen in Herz und Lunge von normalen oder L540-Tumor-tragenden Mäusen (Tabelle 1) trat nach einer anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden-Verabreichung keine Thrombose auf. Keine Anzeichen einer Thrombose, einer Gewebeschädigung oder einer veränderten Morphologie wurden in 25 Mäusen beobachtet, die 4 oder 25 Stunden zuvor früher Injektionen mit 5 bis 45 g Koaguligand erhalten hatten. Herz und Lungen derselben Maus, die eine bedeutende Tumorthrombose aufwies, zeigten ein normales histologisches Erscheinungsbild. Alle anderen wichtigen Organe (Hirn, Leber, Niere, Milz, Pankreas, Intestinum, Testes) wiesen ebenfalls eine unveränderte Morphologie auf.
Gefrierschnitte von Organen und Tumoren von Koaguligand-behandelten Mäusen ergaben übereinstimmende Färbungsmuster, wenn sie entweder mit dem anti-TF-Antikörper 10H10 oder einem anti-Ratte-IgG-Antikörper entwickelt wurden und bestätigten, daß der Koaguligand zu Gefäßen im Herzen, der Lunge und von Tumoren gelangt war. Die Färbungsintensität entsprach der, die beobachtet wurde, wenn der Koaguligand in hohen Konzentrationen direkt auf die Schnitte appliziert wurde, gefolgt durch eine Entwicklung mit anti-TF oder anti-Ratte-IgG, was zeigt, daß eine Bindungssättigung in vivo erreicht worden war.
Diese Studien zeigen, daß eine Bindung eines Koaguligand an VCAM-1 an normale Vaskulatur im Herzen und der Lunge nicht ausreicht, um eine Thrombose zu induzieren, und daß Tumorvaskulatur zusätzliche Faktoren verfügbar macht, um eine Gerinnung zu unterstützen.
BEISPIEL VII
Tumor-Zerstörung durch anti-VCAM-1-Koaguligand in vivo
A. Methoden
CB17-SCID-Mäusemännchen wurden subkutane Injektionen mit 1 × 10⁷ L540 Zellen, wie oben beschrieben, verabreicht. Wenn die Tumoren ein Volumen von 0,4-0,6 cm³ erreicht hatten, erhielten die Mäuse intravenöse Injektionen mit entweder 20 μg anti-VCAM-1·tTF, 16 μg anti-VCAM-1-Antikörper, 4 μg tTF, einer Mischung aus 16 μg anti-VCAM-1-Antikörper und 4 μg tTF, 20 μg Kontroll-IgG·tTF oder Kochsalzlösung injiziert. In einigen Studien wurde die Behandlung dreimal am Tag 0, 4 und 8 verabreicht. Ein Minimum von 8 Tieren wurde in jeder Gruppe behandelt.
Die Tiere wurden täglich durch Messungen des Tumors und des Körpergewichts überwacht. Die Mäuse wurden getötet, wenn die Tumoren einen Durchmesser von 2 cm³ erreicht hatten oder früher, wenn die Tumoren Anzeichen einer Nekrose oder Ulzeration zeigten. Das Tumorvolumen wurde gemäß folgender Formel berechnet: π/6 × D × d², wobei D der größere Tumordurchmesser und d der kleinere Durchmesser ist. Unterschiede in den Tumorwachstumsraten wurden auf statistische Signifikanz unter Verwendung eines nicht-parametrischen Tests (Mann-Whitney rank sum-Test), der keine Vermutung zur Normalverteilung der Tumorgröße macht, getestet (Gibbons, 1976).
B. Ergebnisse
Die anti-Tumor-Aktivität des anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden wurde in SCID-Mäusen bestimmt, die L 540-Tumoren von 0,3 bis 0,4 cm³ trugen. Der Wirkstoff wurde i.v. dreimal in Intervallen von 4 Tagen verabreicht. Die vereinigten Ergebnisse von 3 separaten Studien werden in 2 und Tabelle 4 dargestellt. Das mittlere Tumorvolumen von anti-VCAM-1·tTF-behandelten Mäusen war am Tag 21 der Behandlung signifikant reduziert (P<0,001) im Vergleich zu allen anderen Gruppen. Neun von insgesamt 15 Mäusen, die mit dem spezifischen Koaguliganden behandelt wurden, zeigten eine Reduktion von mehr als 50% des Tumorvolumens. Diese Wirkung war spezifisch, da unkonjugierter tTF, Kontroll-IgG-Koaguligand und eine Mischung aus freiem anti-VCAM-1-Antikörper und tTF das Tumorwachstum nicht beeinflußten.
TABELLE 4 Hemmung des Tumorwachstums durch anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden
BEISPIEL VIII
Phosphatidylserin-Expression auf Tumorblutgefäßen
A. Methoden
1. Antikörper
Anti-Phosphatidylserin (anti-PS) und anti-Cardiolipin-Antikörper, beides monoklonale IgM-Antikörper aus der Maus wurden, wie durch Rote (Rote et al., 1993) beschrieben, hergestellt. Einzelheiten der Charakterisierung der anti-PS- und anti-Cardiolipin-Antikörper wurden ebenfalls von Rote et al. (1993) berichtet.
2. Nachweis einer PS-Expression auf Gefäßendothel
L540-Tumor-tragende Mäuse erhielten Injektionen i.v. mit 20 μg von entweder anti-PS- oder anti-Cardiolipin-IgM-Mäuseantikörper. Nach 10 Min. wurden die Mäuse anästhetisiert und ihr Blutkreislauf wurde mit heparinisierter Kochsalzlösung perfundiert. Die Tumoren und normale Gewebe wurden entnommen und schockgefroren. Serienschnitte von Organen und Tumoren wurden mit entweder HRP-markiertem anti-Maus-IgM zur Detektion von anti-PS-Antikörper oder mit anti-VCAM-1-Antikörper, gefolgt von HRP-markiertem anti-Ratte-IgG, gefärbt.
Um Membranphospholipide auf Gefrierschnitten zu bewahren, wurde das folgende Protokoll entwickelt. Die Tiere wurden mit DPBS mit 2,5 mM Ca²⁺ perfundiert. Die Gewebe wurden auf 3-Aminopropyltriethoxysilan-beschichtete Objektträger aufgezogen und wurden innerhalb von 24 Stunden gefärbt. Zum Fixieren oder Waschen der Objektträger wurden keine organischen Lösungsmittel, Formaldehyd oder Detergenzien verwendet. Die Objektträger wurden durch DPBS mit 2,5 mM Ca²⁺ und 0,2% Gelatine rehydratisiert. Dieselbe Lösung wurde auch verwendet, um Schnitte zu waschen, um den Überschuß an ReMittel zu entfernen. Die Schnitte wurden mit HRP-markiertem anti-Maus-IgM 3,5 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, um anti-PS-IgM nachzuweisen.
B. Ergebnisse
Um das Fehlen einer thrombotischen Wirkung von anti-VCAM-1·tTF auf VCAM-1-positive Vaskulatur in Herz und Lungen zu erklären, entwickelten die Erfinder ein Konzept einer differentiellen PS-Lokalisierung zwischen normalen und Tumorblutgefäßen. Speziell stellten sie die Hypothese auf, daß Endothelzellen in normalen Geweben PS auf die innere Oberfläche der Plasmamembran-Phospholipid-Doppelschicht begrenzen, wo es außer Stande ist, sich an thrombotischen Reaktionen zu beteiligen, während Endothelzellen in Tumoren PS auf die äußere Oberfläche der Plasmamembran translozieren, wo es die Gerinnungswirkung des Koaguliganden unterstützen kann. Eine PS-Expression auf der Zelloberfläche erlaubt eine Gerinnung, da sie die Anheftung von Gerinnungsfaktoren an die Membran ermöglicht und die Anordnung von Koagulation-Initiationskomplexen koordiniert (Ortel et al., 1992).
Das Modell der Erfinder einer PS-Translokation auf die Oberfläche von Tumorblutgefäß-Endothelzellen, wie hier entwickelt, ist insofern überraschend, als eine PS-Expression nicht nach dem Zelltod auftritt und ihn nicht zwangsläufig auslöst. Eine PS-Expression auf der Tumor-Endothelzell-Oberfläche ist demnach ausreichend stabil, um zu ermöglichen, daß PS als eine anzielbare Instanz für eine therapeutische Intervention dient.
Um die Hypothese zu bestätigen, daß Tumorblutgefäßendothel auf der luminalen Oberfläche der Plasmamembran PS exprimiert, setzten die Erfinder Immunhistochemie ein, um die Verteilung eines anti-PS-Antikörpers nach intravenöser Injektion in L540-Tumor-tragenden Mäusen zu bestimmen. Der anti-PS-Antikörper gelangte innerhalb von 10 Min. zu einem Großteil von Tumorblutgefäßen, einschließlich Gefäßen in der zentralen Region des Tumors, denen VCAM-1 fehlen kann. Gefäße, die VCAM-1-positiv waren, waren auch hinsichtlich PS positiv. Folglich gibt es eine koinzidente Expression von PS auf VCAM-1-exprimierenden Gefäßen in Tumoren.
Bei den in vivo-Studien zur Lokalisierung wurden keine der Gefäße in normalen Organen, einschließlich VCAM-1-positiver Vaskulatur von Herz und Lunge, angefärbt, was zeigt, daß PS auf der externen Oberfläche von Endothelzellen nicht vorhanden ist. Im Gegensatz dazu waren keine Unterschiede zwischen normalen Geweben und Tumor, Endothelzellen oder anderen Zelltypen zu sehen, wenn Schnitte von normalen Geweben und Tumoren direkt mit anti-PS-Antikörper in vitro gefärbt wurden, was zeigt, daß PS in diesen Zellen vorhanden ist, jedoch nur auf der Oberfläche von Endothelzellen in Tumoren exponiert wird.
Die Spezifität des Nachweises von PS wurde durch zwei unabhängige Studien bestätigt. Erstens fand ein monoklonaler IgM-Antikörper aus der Maus, gerichtet gegen ein anderes negativ geladenes Lipid, Cardiolipin, in vivo nicht zum Tumor oder anderen Organen. Zweitens hob eine Vorbehandlung von Gefrierschnitten mit Aceton eine Färbung mit anti-PS-Antikörper auf, vermutlich, weil dadurch die Lipide zusammen mit dem gebundenen anti-PS-Antikörper extrahiert wurden.
BEISPIEL IX
Annexin V blockiert eine Koaguligandenaktivierung von Faktor X in vitro
A. Methoden
Die Fähigkeit von Annexin V, eine Faktor Xa-Bildung, induziert durch einen Koaguliganden, zu beeinflussen, wurde durch einen Chromogen-Test, der oben in Beispiel V beschrieben wurde, bestimmt. IL-1α-stimulierte bEnd.3-Zellen wurden mit anti-VCAM-1·tTF inkubiert und durch Saponin permeabilisiert. Annexin V wurde in Konzentrationen im Bereich von 0,1 bis 10 μg/ml zugesetzt, und die Zellen wurden. vor Zugabe von verdünntem Proplex T 30 Min. inkubiert. Die Menge an Faktor Xa, die in Gegenwart oder Abwesenheit von Annexin V erzeugt wurde, wurde, wie in Beispiel V beschrieben, bestimmt. Jede Behandlung wurde mit Doppelbestimmungen durchgeführt und mindestens zweimal wiederholt.
B. Ergebnisse
Die Notwendigkeit einer PS-Oberflächenexpression bei der Koaguligandenaktivierung wird durch den Befund der Erfinder, daß Annexin V, das an PS mit hoher Affinität bindet, die Fähigkeit von an bEnd.3-Zellen gebundenem anti-VCAM-1·tTF, Faktor Xa in vitro zu erzeugen, zu blockieren, weiter gezeigt.
Annexin V, zugegeben zu permeabilisierten Zellen, die mit anti-VCAM-1·tTF vorinkubiert wurden, hemmte die Bildung von Faktor Xa auf eine dosisabhängige Weise (3). In Abwesenheit von Annexin V produzierte zellgebundener Koaguligand 95 ng Faktor Xa pro 10.000 Zellen pro 60 Min. Die Zugabe zunehmender Mengen an Annexin V (im Bereich von μg pro ml) hemmte die Faktor Xa-Produktion. Bei 10 μg pro ml hemmte Annexin V die Faktor Xa-Produktion um 58% (3). Durch einen Anstieg der Konzentration von Annexin V während des Tests wurde keine weitere Hemmung beobachtet, was zeigt, daß Annexin V alle verfügbaren Bindungsstellen bei 10 μg pro ml sättigte.
BEISPIEL X
Annexin V blockiert eine Koaguligandenaktivität in vivo
A. Methoden
Die Fähigkeit von Annexin V, eine Koaguliganden-induzierte Thrombose in vivo zu hemmen, wurde in L540 Hodgkin-tragenden SCID-Mäusen untersucht. Wie oben in Beispiel II beschrieben, wurden in Mäusen-Tumoren wachsen gelassen. Zwei Mäuse pro Gruppe (Tumorgröße 0,5 cm Durchmesser) erhielten intravenös über die Schwanzvene Injektionen mit einem der folgenden ReMittel: a) Kochsalzlösung; b) 100 μg Annexin V; c) 40 μg anti-VCAM-1·tTF; d) 100 μg Annexin V, zwei Stunden später gefolgt von 40 μg anti-VCAM-1·tTF.
Vier Stunden nach der letzten Injektion wurden die Mäuse anästhetisiert und mit Heparinenthaltender Kochsalzlösung perfundiert. Die Tumoren wurden entnommen, mit 4% Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Die Anzahl an Blutgefäßen mit und ohne Thrombosen wurde gezählt, und der Prozentsatz an Thrombosen wurde berechnet.
B. Ergebnisse
Annexin V blockierte auch die Aktivität des anti-VCAM-1·tTF-Koaguliganden in vivo. Gruppen von Tumor-tragenden Mäusen wurden mit einem der Kontroll- oder TestreMittel behandelt, wie unter Methoden beschrieben. Die Mäuse erhielten (a) Kochsalzlösung; (b) 100 μg Annexin V; (c) 49 μg anti-VCAM-1·tTF-Koaguligand; oder (d) 100 μg Annexin V, gefolgt zwei Stunden später von 40 μg anti-VCAM-1·tTF-Koaguligand. Identische Ergebnisse wurden für beide Mäuse pro Gruppe erhalten.
In Tumoren, die aus Mäusen stammten, die Kochsalzlösung injiziert bekamen, wurde keine spontane Thrombose, Hämorrhagie oder Nekrose beobachtet.
In Übereinstimmung mit anderen hier dargestellten Ergebnissen verursachten 40 μg anti-VCAM-1·tTF-Koaguligand eine Thrombose in 70% der Gesamtheit von Tumorblutgefäßen. Der Hauptanteil an Blutgefäßen war mit dicht gepackten Erethrozyten und Gerinnseln verschlossen, und die Tumorzellen waren voneinander separiert. Beide Koaguliganden-induzierten anti-Tumor-Wirkungen, d.h. intravaskuläre Thrombose und Veränderungen in der Tumorzellmorphologie, wurden durch Vorbehandeln der Mäuse mit Annexin V vollständig aufgehoben.
Diese Befunde bestätigen, daß die anti-Tumor-Wirkungen von Koaguliganden durch die Blockierung der Tumorvaskulatur vermittelt werden. Diese Ergebnisse zeigen auch, daß PS für eine Koaguliganden-induzierte Thrombose in vivo wesentlich ist.
BEISPIEL XI
Externalisiertes Phosphatidylserin ist ein allgemeiner Marker von Tumorblutgefäßen
A. Methoden
Eine PS-Exponierung auf Tumor- und normalem Gefäßendothel wurde in drei Tumor-Tiermodellen untersucht: L540, Hodgkin-Lymphom; NCI-H358, nicht-kleinzelliges Lungenkarzinom; und HT29, Kolon-Adenokarzinom (ATCC). Um die Tumoren in vivo wachsen zu lassen, wurden 2 × 10⁶ Zellen in die rechte Flanke von SCID-Mäusen injiziert, und der Tumor wurde bis zu einem Durchmesser von 0,8 bis 1,2 cm wachsen gelassen. Mäuse, die große Tumoren (mit einem Volumen von mehr als 800 mm³) trugen, erhielten intravenöse Injektionen über die Schwanzvene mit 20 μg von entweder anti-PS- oder anti-Cardiolipin-Antikörpern. Der anti-Cardiolipin-Antikörper diente als eine Kontrolle in allen Studien, da beide Antikörper gegen negativ geladene Lipide gerichtet sind und zur selben Klasse von Immunglobulinen (Maus-IgM) gehören.
Eine Stunde nach Injektion wurden die Mäuse anästhetisiert, und ihre Blutzirkulation wurde mit Heparin-enthaltender Kochsalzlösung perfundiert. Tumoren und normale Organe wurden entnommen und schockgefroren. Gefrierschnitte wurden mit einem anti-Maus-IgM- Peroxidase-Konjugat (Jackson Immunoresearch Labs) gefärbt, gefolgt von einer Entwicklung mit Carbazol.
B. Ergebnisse
Die anti-PS-Antikörper gelangten spezifisch zu der Vaskulatur aller drei Tumoren (HT 29, L540 und NCI-H358) in vivo, wie durch Nachweis des Maus-IgM gezeigt wurde. Die durchschnittlichen prozentualen Anteile von Gefäßen, die in den Tumoren gefärbt waren, betrugen 80% für HT29, 30% für L540 und 50% für NCI-H358. Gefäße in allen Bereichen des Tumors waren gefärbt und die Färbung betraf sowohl kleine Kapillaren als auch größere Gefäße.
Keine Färbung von Gefäßen wurde mit anti-PS-Antikörpern in beliebigen normalen Geweben beobachtet. In der Niere wurden Tubuli sowohl mit anti-PS als auch anti-CL gefärbt, und dies steht wahrscheinlich im Zusammenhang mit der Sekretion von IgM durch dieses Organ (Tabelle 5). Anti-Cardiolipin-Antikörper wurden in keinem Tumor und keinen normalen Geweben, mit Ausnahme der Niere, nachgewiesen.
Diese Befunde zeigen, daß nur Tumorendothel an der äußeren Seite der Plasmamembran PS exponiert.
TABELLE 5 Lokalisierung von anti-PS- und anti-Cardiolipin-Antikörpern in Gefäßen von Tumor-tragenden Mäusen*

*Die biologische Verteilung in normalen Organen von sowohl anti-PS- als auch anti-Cardiolipin-Antikörpern war in allen drei Tumor-Tiermodellen identisch.
Anti-PS- und anti-Cardiolipin-Antikörper wurden auf Gefrierschnitten unter Verwendung eines anti-Maus-IgM-Peroxidase-Konjugats nachgewiesen. – keine; + schwache; ++ mittlere;
+++ starke Färbung; entsprechend dem Endothelmarker Meca 32 (pan).
Eine Färbung der Tubuli wurde in den Nieren von sowohl anti-PS- als auch anti-CL-Empfängern beobachtet.

Um den Zeitpunkt zu bestimmen, zu dem die Tumorvaskulatur die Fähigkeit verliert, PS auf die innere Seite der Membran zu beschränken, untersuchten die Erfinder eine anti-PS-Lokalisierung in L540-Tumoren mit einem Volumen im Bereich von 140 bis 1.600 mm³. Die Mäuse wurden nach ihrer Tumorgröße in drei Gruppen eingeteilt: 140-300, 350-800 und 800-1.600 mm³. In drei Mäusen, die kleine L540-Tumore (bis zu 300 mm³) trugen, wurde anti-PS-Antikörper nicht nachgewiesen. Anti-PS-Antikörper reicherte sich in drei Tieren von 5 in der Gruppe mit L540-Tumoren von mittlerer Größe und in allen Mäusen (4 von 4), die große L540-Tumore trugen, an (Tabelle 6). Der prozentuale Anteil von PS-positiven Blutgefäßen insgesamt (identifiziert durch den pan-Endothelmarker Meca 32) betrug 10-20% in der Gruppe mit mittleren L540-Tumoren und 20-40% in der Gruppe mit großen L540-Tumoren (Tabelle 6).
TABELLE 6 In mittelgroßen und großen Tumoren nachgewiesene PS-Externalisierung

*L540 CY-Tumore tragende Mäuse wurden nach der Tumorgröße in drei Gruppen eingeteilt. 20 g anti-PS-Antikörper wurden i.v. injiziert und 1 Stunde in der Zirkulation gelassen. Mäuse-Antikörper wurden auf Gefrierschnitten unter Verwendung eines anti-Maus-IgM-Peroxidase-Konjugats nachgewiesen.
Die Gesamtzahl von Blutgefäßen wurde unter Verwendung des Endothel-Antikörpers Meca 32 (pan) bestimmt. PS-positive und Meca-positive Gefäße wurden in 4 Feldern pro Querschnitt eines Tumors gezählt. Gezeigt wird der Bereich von PS-positiven Gefäßen (%) innerhalb derselben Gruppe.

BEISPIEL XII
Anti-Tumor-Wirkungen unkonjugierter anti-Phosphatidylserin-Antikörper
A. Methoden
Die Wirkungen von anti-PS-Antikörpern wurden in syngenen und xenogenen Tumormodellen untersucht. Für das syngene Modell wurden 1 × 10⁷ Zellen eines kolorektalen Karzinoms der Maus, Colo 26 (erhalten von Dr. Ian Hart, ICRF, London), subkutan in die rechte Flanke von Balb/c-Mäusen injiziert. Bei dem xenogenen Modell wurde ein menschliches Hodgkin-Lymphom L540-Fremdtransplantat ("Xenograft") etabliert, indem 1 × 10⁷ Zellen subkutan in die rechte Flanke von CB17 SCID-Mäusemännchen injiziert wurden. Tumore wurden bis zu einer Größe von ungefähr 0,6 bis 0,9 cm³ vor der Behandlung wachsen gelassen.
Tumor-tragende Mäuse (4 Tiere pro Gruppe) erhielten Injektionen i.p. mit 20 μg nacktem anti-PS-Antikörper (IgM); Kontroll-Mäuse-IgM oder Kochsalzlösung. Die Behandlung wurde dreimal mit einem Intervall von 48 Stunden wiederholt. Die Tiere wurden täglich bezüglich Messungen des Tumors und Körpergewichts überwacht. Das Tumorvolumen wurde, wie in Beispiel VII beschrieben, berechnet. Die Mäuse wurden getötet, wenn die Tumoren 2 cm³ erreicht hatten oder früher, wenn die Tumoren Anzeichen einer Nekrose oder Ulzeration zeigten.
B. Ergebnisse
Das Wachstum sowohl von syngenen als auch von xenogenen Tumoren wurde durch eine Behandlung mit nackten anti-PS-Antikörpern wirksam gehemmt (4A und 4B). Anti-PS-Antikörper verursachten eine Verletzung der Tumorvaskulatur, die von einer Thrombose und Tumornekrose begleitet wurde. Das Vorhandensein von Gerinnseln und einer Desintegration von Tumormasse, welche die blockierten Blutgefäße umgab, war offensichtlich.
Quantitativ hemmte die Behandlung mit nacktem anti-PS-Antikörper das Tumorwachstum um bis zu 60% des Kontroll-Tumorvolumens in Mäusen, die große Colo 26-Tumoren (4A) und L540-Tumoren (4B) trugen. Keine Verzögerung des Tumorwachstums wurde in Mäusen gefunden, die mit Kochsalzlösung oder Kontroll-IgM behandelt wurden. Keine Toxizität wurde bei Mäusen beobachtet, die mit anti-PS-Antikörpern behandelt wurden, wobei normale Organe eine unveränderte Morphologie bewahrten, die von der bei unbehandelten oder mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen nicht zu unterscheiden war.
Die Tumorregression setzte 24 Stunden nach der ersten Behandlung ein, und die Tumoren verkleinerten ihre Größe in den nächsten 6 Tagen weiter. Dies wurde sowohl in syngenen als auch immunbeeinträchtigten Tumormodellen beobachtet, was zeigt, daß die Wirkung durch (einen) Immunstatus-unabhängige(n) Mechanismus/Mechanismen vermittelt wurde. Darüberhinaus war der Rückgang der Tumorlast mit der Zunahme der Aufmerksamkeit und einer Verbesserung der allgemeinen gesunden Erscheinung der Tiere im Vergleich zu Kontrollmäusen, die Tumoren von mehr als 1500 mm³ betrugen, verbunden. Ein Weiterwachsen der Tumore trat 7-8 Tage nach der ersten Behandlung auf.
Die Ergebnisse, die mit der anti-PS-Behandlung von L540-Tumoren erhalten wurden, sind aus folgenden Gründen weiter bestechend. Bemerkenswerterweise trat die Tumornekrose, die bei der L540-Tumorbehandlung beobachtet wurde, trotz der Tatsache auf, daß der prozentuale Anteil an Gefäßen, die PS-positiv gefärbt waren, in L540-Tumoren geringer war als in HT 29- und NCI-H358-Tumoren. Dies legt nahe, daß sogar eine schnellere Nekrose resultieren würde, wenn andere Tumorarten behandelt würden. Weiterhin werden L540-Tumoren allgemein als ein experimentelles Modell gewählt, da sie saubere histologische Schnitte verfügbar machen, und da sie tatsächlich bekannt dafür sind, Nekrose zu widerstehen.
BEISPIEL XIII
Anti-Tumor-Wirkungen von Annexin-Konjugaten
Der überraschende Befund, daß Aminophospholipide stabile Marker der Tumorvaskulatur sind, bedeutet auch, daß Antikörper-therapeutisches-Mittel-Konstrukte zur Krebsbehandlung verwendet werden können. Die Erfinder schlußfolgerten, daß zusätzlich zum Verwenden von Antikörpern als zielgerichteten Mitteln Annexine und andere Aminophospholipid-bindende Protein auch verwendet werden könnten, um therapeutische Mittel spezifisch an die Tumorvaskulatur abzugeben. Die folgenden Ergebnisse zeigen die anti-Tumor-Wirkungen, die aus der Verabreichung von Annexin-TF-Konstrukten in vivo resultieren.
A. Methoden
Ein Annexin-V-tTF-Konjugat wurde hergestellt und nu/nu-Mäusen mit soliden Tumoren verabreicht. Die Tumoren waren aus menschlichen HT29 kolorektalen Karzinom-Zellen gebildet, die Tumoren von mindestens ungefähr 1,2 cm³ Größe bildeten. Der Annexin-V-tTF-Koaguligand (10 μg) wurde intravenös verabreicht und 24 Stunden in der Zirkulation belassen. Mit Kochsalzlösung behandelte Mäuse wurden als Kontrolltiere separat gehalten. Nach der Behandlungsdauer von einem Tag wurden die Mäuse getötet und ausgeblutet, und die Tumoren und hauptsächlichen Organe wurden zur Analyse gewonnen.
B. Ergebnisse
Es zeigte sich, daß das Annexin-V-tTF-Konjugat eine Gerinnung in Tumorblutgefäßen in HT29-Tumor-tragenden Mäusen spezifisch induzierte. Annähernd 55% der Tumorblutgefäße in den mit Annexin-V-tTF-Konjugat behandelten Tieren wiesen nach einer einzelnen Injektion Thrombosen auf. Im Gegensatz dazu gab es minimale Anzeichen einer Thrombose in der Tumorvaskulatur der Kontrolltiere.
BEISPIEL XIV
Phosphatidylserin-Translokation in der Tumorumgebung
Die Entdeckung von PS als einem in vivo-Oberflächenmarker, der bei Tumorvaskulaturendothelzellen einzigartig ist, veranlaßte die Erfinder, die Wirkung einer Tumorumgebung auf die PS-Translokation und -expression auf der äußeren Membran zu untersuchen. Das vorliegende Beispiel zeigt, daß das Exponieren von Endothelzellen in vitro gegenüber bestimmten Bedingungen, die jene in einem Tumor nachahmen, die beobachtete PS-Oberflächenexpression in intakten, lebensfähigen Zellen verdoppelt.
A. Methoden
bEnd.3-Endothelzellen aus der Maus wurden mit einer anfänglichen Dichte von 50.000 Zellen/Well ausgesät. Vierundzwanzig Stunden später wurden die Zellen mit ansteigenden Konzentrationen H2O2 (von 10 μM bis 500 μM) für 1 Stunde bei 37°C inkubiert oder unbehandelt gelassen. Am Ende der Inkubation wurden die Zellen 3 mal mit PBS, das 0,2% Gelatine enthielt, gewaschen und mit 0,25% Glutaraldehyd fixiert. Die Zellen in identischen Wells wurden entweder mit anti-PS-IgM gefärbt oder trypsinisiert und auf ihre Lebensfähigkeit durch den Trypan Blau-Ausschluß-Test untersucht. Für die anti-PS-Färbung wurden die Zellen nach Blockieren mit 2% Gelatine für 10 Min. mit 2μg/ml anti-PS-Antikörper inkubiert, gefolgt von einem Nachweis mit anti-Maus-IgM-HRP-Konjugat.
Wells, in denen bEnd.3-Endothelzellen der Maus ausgesät waren, wurden ebenfalls mit verschiedenen Effektoren inkubiert und mit Kontroll-Wells mit unbehandelten Zellen nach einer Inkubation bei 37°C nach derselben Zeitdauer verglichen. Die Gruppe der getesteten Effektoren beinhaltete TNF, LPS, bFGF, IL-1α, IL-1β und Thrombin. Nach der Inkubation wurden die Zellen gewaschen und fixiert und wurden wieder entweder mit anti-PS-IgM gefärbt oder auf ihre Lebensfähigkeit unter Verwendung des Trypan Blau-Ausschluß-Tests untersucht, wie oben beschrieben.
B. Ergebnisse
1. PS-Induktion durch H₂O₂
Eine Exponierung von Endothelzellen gegenüber H₂O₂ in Konzentrationen von mehr als 100 μM verursache eine PS-Translokation in rund 90% der Zellen. Diese war allerdings begleitet von einem Ablösen der Zellen vom Substrat und einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen auf ungefähr 50-60%. Der Zusammenhang von PS-Oberflächenexpression mit abnehmender Lebensfähigkeit der Zellen ist verständlich, obwohl es noch interessant ist, zu bemerken, daß rund 90% PS-Translokation bei einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen von nur 50-60% beobachtet wurden.
Die Verwendung von H₂O₂-Konzentrationen von weniger als 100 μM führte zu einer signifikanten PS-Expression ohne nennenswerte Reduktion der Lebensfähigkeit der Zellen. Beispielsweise wurde PS auf der Zelloberfläche von ungefähr 50% der Zellen in allen Wells mit H₂O₂-behandelten Zellen nachgewiesen, wobei H₂O₂ in solch niedrigen Konzentrationen wie 20 μM verwendet wurde. Wichtig ist, anzumerken, daß bei diesen geringen H₂O₂-Konzentrationen die Zellen fest an den Kunststoff und aneinander geheftet blieben, und keine morphologischen Änderungen zeigten und keine Anzeichen einer Zytotoxizität aufwiesen. Genaue Analysen ergaben im wesentlichen 100%-igen Zell-Zell-Kontakt, Beibehaltung der richtigen Gestalt der Zelle und ein intaktes Zytoskelett.
Die 50%-ige PS-Oberflächenexpression, die durch niedrige Spiegel von H₂O₂ induziert wurde, wurde demnach bei allen Zellpopulationen beobachtet, bei denen die Lebensfähigkeit der Zellen mit der der unbehandelten Kontroll-Zellen identisch war (d.h. 95%). Die PS-Expression, die mit hohen H₂O₂-Konzentrationen verbunden war, wurde durch eine Zellschädigung begleitet, und die PS-positiven Zellen, die über 100 μM H₂O₂ ausgesetzt waren, lösten sich ab, flotierten und hatten zerstörte Zytoskelette.
Der Erhalt der Lebensfähigkeit der Zellen in Gegenwart niedriger Konzentrationen von H₂O₂ stimmt mit den Ergebnissen aus anderen Laboren überein. Beispielsweise zeigten Schorer et al (1985), daß menschliche Endothelzellen der Nabelschnurvene (human umbilical vein endothelial cells, HUVEC), die mit 15 μM H₂O₂ behandelt wurde, im Durchschnitt 90 bis 95% Lebensfähigkeit der Zellen zeigten (beschrieben als 5% bis 10% Verletzung), während jene, die 1500 μM H₂O₂ ausgesetzt waren, nur zu 0%-50% lebensfähig waren (50% bis 100% Verletzung).
Die Verwendung von H₂O₂, um die Tumorumgebung in vitro nachzuahmen, ist auch insofern geeignet, als die Tumorumgebung reich an inflammatorischen Zellen ist, wie etwa Makrophagen, PMNs und Granulozyten, die H₂O₂ und andere reaktive Sauerstoffspezies produzieren. Obwohl niemals zuvor mit stabilen Tumorvaskulatur-Markern in Verbindung gebracht, ist von Entzündungszellen bekannt, daß sie eine Endothelzellverletzung durch Mechanismen, an denen reaktive Sauerstoffspezies, welche die Anwesenheit von H₂O₂ erfordern, beteiligt sind, vermitteln (Weiss et al, 1981; Yamada et al, 1981; Schorer et al, 1985). Tatsächlich haben Studien gezeigt, daß eine Stimulation von PMNs in vitro Konzentrationen von H₂O₂ herstellen, die ausreichen, um eine subletale Endothelzellschädigung zu verursachen ohne den Zelltod (gemessen durch Chrom-Freisetzungstests) oder zelluläre Ablösung zu verursachen, und daß diese H₂O₂-Konzentrationen in vivo lokal erreichbar sind (Schorer et al, 1985).
Die vorliegenden Ergebnisse zur in vitro-Translokation korrelieren mit den früheren Ergebnissen, die zeigen, daß anti-PS-Antikörper in vivo spezifisch an Endothelzellen der Tumorvaskulatur gelangen und nicht an Zellen in normalen Geweben binden. Der Befund, daß in vivo-ähnliche Konzentrationen von H₂O₂ eine PS-Translokation auf die Endothelzelloberfläche induzieren, ohne die Zellintegrität aufzulösen, hat wichtige Auswirkungen zusätzlich zur Validierung der in vivo-Originaldaten und den therapeutischen Ansätzen der Erfinder.
Endothelzellen von Mensch, Rind und Maus sind alle dafür bekannt, daß sie unter normalen Bedingungen PS-negativ sind. Jede früher dokumentierte PS-Expression ist immer mit Zellschädigung und/oder Zelltod verbunden gewesen. Dies ist bei den vorliegenden Studien einfach nicht der Fall, bei denen eine normale Lebensfähigkeit aufrechterhalten wurde. Dies zeigt, daß eine PS-Translokation im Tumorgefäßendothel durch biochemische Mechanismen vermittelt wird, die von einer Zellschädigung entkoppelt sind. Es wird davon ausgegangen, daß dies die erste Demonstration einer PS-Oberflächenexpression in morphologisch intakten Endothelzellen ist, und der erste Hinweis, daß eine PS-Expression vom Apoptoseweg/von den Apoptosewegen abgekoppelt sein kann. Um zu der Funktionsfähigkeit der vorliegenden Erfindung zurückzukehren, diese Beobachtungen bestätigen wieder, daß PS ein dauerhafter an stelle eines transienten Markers von Tumorblutgefäßen und ein geeigneter Kandidat zur therapeutischen Intervention ist.
2. Eine PS-Expression korreliert nicht mit einer Zellaktivierung
Die Bedeutung dieser in vitro-Ergebnisse für die Tumorumgebung wird auch durch die Tatsache verstärkt, daß andere, allgemeine Zellaktivatoren ohne Wirkung auf eine PS-Translokation in Endothelzellen sind. Beispielsweise überprüften die Erfinder TNF in ähnlich kontrollierte Studien und stellten fest, daß trotz der erwarteten Zunahmen der E-Selektin- und VCAM-Expression TNF nicht in der Lage ist, eine PS-Oberflächenexpression zu induzieren. Auf ähnliche Weise waren LPS, bFGF, IL-1α und IL-1β alle ohne Wirkung auf eine PS-Expression in entsprechend kontrollierten Studien.
3. PS-Induktion durch Thrombin
Im Gegensatz zum Fehlen von Wirkungen anderer Zellaktivatoren wurde von Thrombin beobachtet, daß es eine PS-Expression steigert, obwohl nicht in demselben Ausmaß wie H₂O₂. Dieses Ergebnis ist ebenfalls ein integraler Teil des Tumor-Induktionsmodells der PS-Expression, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung entwickelt wurde (eine Thrombin-induzierte PS-Oberflächenexpression in normalen Geweben würde auch die Gerinnung fördern, da eine PS-Expression das Zusammensetzen von Koagulations-Initiationskomplexen koordiniert (Ortel et al, 1992)).
Von der Tumorumgebung ist bekannt, daß sie prothrombotisch ist, derart, daß die Tumorvaskulatur gegenüber einer Gerinnung prädisponiert ist (US-Patent 5,877,289). Da Thrombin ein Produkt der Gerinnungskaskade ist, ist es in der Tumorvaskulatur vorhanden. Tatsächlich induziert die Anwesenheit von Thrombin eine VCAM-Expression, was dazu beiträgt, daß den Erfindern ermöglicht wurde, VCAM als einen anzielbaren Marker der Tumorvaskulatur auszunutzen (US-Patente 5,855,866; 5,877,289). Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß Thrombin ebenfalls eine PS-Expression induziert, sind folglich sowohl für ein Anzielen von Aminophospholipiden mit nackten Antikörpern als auch mit therapeutischen Konjugaten von Bedeutung und erklären weiter die vorteilhaften Wirkungen des anti-VCAM-Koaguligand-enthaltenden Gewebefaktors (Beispiel VII).
Alle die hier offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren können angesichts der vorliegenden Erfindung ohne unzumutbares Experimentieren hergestellt und durchgeführt werden.
Referenzen
Die folgenden Referenzen werden hier in dem Umfang, in dem sie zusätzlich zu den hier dargestellten beispielhafte Einzelheiten des Verfahrens oder andere Einzelheiten verfügbar machen, unter Bezugnahme speziell aufgenommen.

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Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine biologisch wirksame Menge eines Anti-Aminophospholipid-Antikörpers oder einer Antigen-bindenden Region davon, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krebs durch Töten von Tumorgefäßendothelzellen eines vaskularisierten Tumors.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei besagte Zusammensetzung einen IgG- oder IgM-Anti-Aminophospholipid-Antikörper oder eine Antigen-bindende Region davon umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei besagte Zusammensetzung einen IgG-Anti-Aminophospholipid-Antikörper umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei besagte Zusammensetzung ein scFv-, Fv-, Fab'-, Fab- oder F(ab')₂-Antigen-bindendes Fragment eines Anti-Aminophospholipid-Antikörpers umfaßt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung einen monoklonalen Anti-Aminophospholipid-Antikörper oder eine Antigenbindende Region davon umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei besagter monoklonaler Anti-Aminophospholipid-Antikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon durch ein Herstellungsverfahren hergestellt wird, umfassend: a) Herstellen einer Anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierenden Zelle; und b) Erhalten eines monoklonalen Anti-Aminophospholipid-Antikörpers aus besagter Antikörper-produzierenden Zelle.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei besagte Anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierende Zelle eine Zelle eines menschlichen Patienten ist, wobei besagter Patient eine Krankheit hat, die mit der Produktion von Anti-Aminophospholipid-Antikörpern assoziiert ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei besagte Anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierende Zelle durch in-vitro-Stimulation einer gemischten Population von menschlichen peripheren Blutlymphocyten mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipidprobe erhalten wird.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei besagte Anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierende Zelle durch Immunisieren eines nicht-humanen Tieres mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipidprobe erhalten wird.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei besagte Anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierende Zelle durch Immunisieren einer transgenen Maus, die eine humane Antikörperbibliothek umfaßt, mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipidprobe erhalten wird.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei besagter Herstellungsprozeß umfaßt: a) Fusionieren besagter Anti-Aminophospholipid-Antikörper-erzeugenden Zelle mit einer unsterblichen Zelle, um ein Hybridom herzustellen, das einen monoklonalen Anti-Aminophospholipid-Antikörper produziert; und b) Erhalten besagten monoklonalen Anti-Aminophospholipid-Antikörpers aus besagtem Hybridom.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei besagter Herstellungsprozeß umfaßt: a) Immunisieren eines nicht-humanen Tieres mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipid-Probe; b) Herstellen einer Sammlung von Antikörper-produzierenden Hybridomen von dem immunisierten Tier; c) Auswählen eines Hybridoms aus der Sammlung, das einen Anti-Aminophospholipid-Antikörper produziert; und d) Kultivieren des ausgewählten Hybridoms, um besagten monoklonalen Anti-Aminophospholipid-Antikörper bereitzustellen.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das immunisierte Tier eine transgene Maus ist, die eine humane Antikörperbibliothek umfaßt, und wobei besagter monoklonaler Anti-Aminophospholipid-Antikörper ein humaner monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei besagter Herstellungsprozeß umfaßt: a) Erhalten von Anti-Aminophospholipid-Antikörper-kodierenden Nukleinsäuren aus besagter Anti-Aminophospholipid-Antikörper-produzierender Zelle; und b) Exprimieren besagter Nukleinsäuren, um einen rekombinanten, monoklonalen Anti-Aminophospholipid-Antikörper zu erhalten.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei besagter Herstellungsprozeß umfaßt: a) Immunisieren eines nicht-humanen Tieres mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipid-Probe; b) Herstellung einer kombinatorischen Immunglobulin-Phagemid-Bibliothek, die RNA exprimiert, die aus der Milz des immunisierten Tiers isoliert worden ist; c) Auswählen eines Klons aus der Phagemid-Bibliothek, der einen Anti-Aminophospholipid-Antikörper exprimiert; und d) Exprimieren einer Anti-Aminophospholipid-Antikörper-kodierenden Nukleinsäure aus besagtem ausgewähltem Klon, um einen rekombinanten monoklonalen Anti-Aminophospholipid-Antikörper bereitzustellen.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei das immunisierte Tier eine transgene Maus ist, die eine humane Antikörperbibliothek umfaßt, und wobei der rekombinante monoklonale Anti-Aminophospholipid-Antikörper ein rekombinanter humaner monoklonaler Antikörper ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung einen humanen, humanisierten oder teilweise humanen, chimären Anti-Aminophospholipid-Antikörper oder eine Antigen-bindende Region davon umfaßt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung einen Dimer, Trimer oder Multimer eines Anti-Aminophospholipid-Antikörpers oder Antigen-bindender Fragmente davon umfaßt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung einen Anti-Aminophospholipid-Antikörper oder eine Antigen-bindende Region davon umfaßt, der (die) an Phosphatidylethanolamin auf der luminalen Oberfläche von Blutgefäßen eines vaskularisierten Tumors bindet.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung einen Anti-Aminophospholipid-Antikörper oder eine Antigen-bindende Region davon umfaßt, der (die) an Phosphatidylserin auf der luminalen Oberfläche von Blutgefäßen eines vaskularisierten Tumors bindet.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung wenigstens zwei Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon umfaßt, von denen jeder (jedes) an ein unterschiedliches Aminophospholipid bindet.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung einen Anti-Aminophospholipid-Antikörper oder eine Antigen-bindende Region davon umfaßt, der (die) an Phosphatidylethanolamin, Phosphatidalserin oder Phosphatidalethanolamin bindet.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung einen Anti-Aminophospholipid-Antikörper oder eine Antigen-bindende Region davon umfaßt, hergestellt durch einen Herstellungsprozeß, umfassend: a) in-vitro-Stimulation einer gemischten Population von humanen peripheren Blutlymphocyten mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipidprobe; b) Immunisieren eines nicht-humanen Tieres mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipid-Probe; c) Immunisieren einer transgenen Maus, die eine humane Antikörperbibliothek umfaßt, mit einer immunogen wirksamen Menge einer Aminophospholipid-Probe; d) Erhalten und Exprimieren einer Anti-Aminophospholipid-Antikörper-kodierenden Nukleinsäure; oder e) Auswählen und Exprimieren einer Anti-Aminophospholipid-Antikörper-kodierenden Nukleinsäure aus einer kombinatorischen Immunglobulin-Phagemid-Bibliothek, die RNA exprimiert, die aus der Milz eines nicht-humanen Tieres isoliert ist, das mit einer wirksamen Menge einer Aminophospholipid-Probe immunisiert worden ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung zur Verwendung beim Induzieren der Coagulation in Tumorgefäßen nach Verabreichung an besagtes Tier dient.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung zur Verwendung beim Zerstören von Tumorgefäßen nach Verabreichung an besagtes Tier dient.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung formuliert ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung als eine Liposomenformulierung formuliert ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung zur Verabreichung an den Menschen vorgesehen ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung zur Verwendung in Kombination mit einer diagnostisch wirksamen Menge eines nachweisbar markierten Antikörpers oder eines Antigen-bindenden Fragments davon dient, der (das) an ein Aminophospholipid bindet.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei besagter nachweisbar markierter Antikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon die mit Röntgenstrahlung nachweisbare Verbindung Bismuth (III), Gold (III), Lanthan (III) oder Blei (II) umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei besagter nachweisbar markierter Antikörper oder besagtes Antigen-bindende Fragment davon das nachweisbare radioaktive Ion Kupfer⁶⁷, Gallium⁶⁷, Gallium⁶⁸, Indium¹¹¹, Indium¹¹³, Iod¹²³, Iod¹²⁵, Iod¹³¹, Quecksilber¹⁹⁷, Quecksilber²⁰³, Rhenium¹⁸⁶, Rhenium¹⁸⁸, Rubidium⁹⁷, Rubidium¹⁰³, Technetium^99m oder Yttrium⁹⁰ umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 29, wobei besagter nachweisbar markierter Antikörper oder besagtes Antigen-bindende Fragment davon das nachweisbare magnetische Kernspinresonanzisotop Kobalt (II), Kupfer (II), Chrom (III), Dysprosium (III), Erbium (III), Gadolinium (III), Holmium (III), Eisen (II), Eisen (III), Mangan (II), Neodymium (III), Nickel (II), Samarium (III), Terbium (III), Vanadium (II) oder Ytterbium (III) umfaßt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei besagte Zusammensetzung zur Verwendung in Kombination mit einer biologisch wirksamen Menge eines zweiten Antikrebsmittels dient.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei besagte Zusammensetzung und besagtes zweites Antikrebsmittel innerhalb einer einzelnen pharmazeutischen Zusammensetzung umfaßt sind.
Verwendung nach Anspruch 33, wobei besagte Zusammensetzung und besagtes zweites Antikrebsmittel innerhalb unterschiedlicher pharmazeutischer Zusammensetzungen umfaßt sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 33-35, wobei besagtes zweites Antikrebsmittel ein chemotherapeutisches, radiotherapeutisches, anti-angiogenes oder Apoptose-induzierendes Mittel ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 33-35, wobei besagtes zweites Antikrebsmittel ein therapeutisches Antikörpermittelkonstrukt ist, umfassend einen Zielantikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon, der (das) an einen oberflächenexprimierten, oberflächenzugänglichen oder sich auf der Oberfläche befindlichen Bestandteil einer Tumorzelle, Tumorstroma oder Tumorgefäßen bindet, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Fragment davon operativ an ein therapeutisches Mittel geknüpft ist.
Verwendung nach Anspruch 37, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon an ein Zelloberflächenantigen einer Tumorzelle bindet.
Verwendung nach Anspruch 37, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon an einen Bestandteil von Tumorstroma bindet.
Verwendung nach Anspruch 37, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon an einen oberflächenexprimierten, oberflächenzugänglichen, sich auf der Oberfläche befindlichen, Cytokin-induzierbaren oder Coagulans-induzierbaren Bestandteil von intratumoralen Blutgefäßen eines vaskularisierten Tumors bindet.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon an einen oberfächenexprimierten Bestandteil von intratumoralen Blutgefäßen bindet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Aminophospholipid, Endoglin, einem TGFβ-Rezeptor, E-Selectin, P-Selectin, VCAM-1, ICAM-1, PSMA, ein VEGF/VPF-Rezeptor, ein FGF-Rezeptor, ein TIE, α_vβ₃-Integrin, Pleiotropin, Endosialin und einem MHC-Klasse II-Protein.
Verwendung nach Anspruch 40, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon an einen sich auf der Oberfläche befindlichen Bestandteil von intratumoralen Blutgefäßen bindet, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus VEGF/VPF, FGF, TGFβ, einem Liganden, der an ein TIE bindet, einer Tumor-assoziierten Fibronectin-Isoform, Streufaktor/Hepatocyten-Wachstumsfaktor (HGF), Blutplättchenfaktor 4 (PF4), PDGF und TIMP.
Verwendung nach einem der Ansprüche 37 bis 42, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon operativ an ein cytotoxisches Mittel geknüpft ist.
Verwendung nach Anspruch 43, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon operativ an ein Pflanzen-, Pilz- oder Bakterien-abgeleitetes Toxin geknüpft ist.
Verwendung nach Anspruch 44, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon operativ an eine deglykosylierte Ricin-A-Kette geknüpft ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 37-42, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigen-bindendes Fragment davon operativ an einen Coagulationsfaktor oder an einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon geknüpft ist, das an einen Coagulationsfaktor bindet.
Verwendung nach Anspruch 46, wobei besagter Zielantikörper oder besagtes Antigenbindende Fragment davon operativ an Gewebefaktor, frankierten Gewebefaktor oder ein Derivat davon oder an einen Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment davon geknüpft ist, der (das) an Gewebefaktor, frankierten Gewebefaktor oder ein Derivat davon bindet.
Verwendung nach einem der Ansprüche 33-35, wobei besagtes zweites Antikrebsmittel ein Mittel ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Taxol, Vincristin, Vinblastin, Bleomycin, einem Combretastatin, einem Podophyllotoxin, TNF-α, Angiostatin, Endostatin, Vasculostatin und einem α_vβ₃-Antagonist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 33-35, wobei besagtes zweites Antikrebsmittel ein Mittel ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Cytokin, Interleukin-4, H₂O₂, Thrombin, einer Verbindung, die die Tubulin-Aktivität stört, einem Calcium-Flux-induzierenden Mittel oder einem Calciumionophor.