DE69916672T2 - Androsteron-Derivate, deren Verwendung zur Unterdrückung der Bindung des Aktivatorproteins AP-1 an die DNA wie der Vermehrung der glatten Muskelzellen der Atemwege - Google Patents

Androsteron-Derivate, deren Verwendung zur Unterdrückung der Bindung des Aktivatorproteins AP-1 an die DNA wie der Vermehrung der glatten Muskelzellen der Atemwege Download PDF

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Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Androsteronderivaten zur Inhibierung der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur. Besonders spezifisch betrifft diese Erfindung die Verwendung von Dehydroepiandrosteron (DHEA) und 16-fluorierten- und -bromierten Analoga zur Relaxation und Bronchodilatation der glatten Atemwegsmuskulatur und zur Prävention der Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen durch humanes Atemwegsepithel.
  • Zuvor wurde Asthma als episodische reversible Atemwegsobstruktion definiert. Siehe American Thoracic Society: Medical Section of the National Tuberculosis Association. "Chronic bronchitis, asthma, and pulmonary emphysema. A Statement by the committee on diagnostic standards for nontuberculous disease", Am. Rev. Respir. Dis., 85, 762–768 (1962). Es wird jetzt anerkannt, dass Patienten mit chronischem schwerem Asthma eine irreversible Obstruktion der Atemwege entwickeln können. Siehe z. B. J. P. Brown, W. H. Breville und K. E. Finucane, "Asthma and irreversible airflow obstruction", Thorax, 39, 131–136 (1984); und E. F. Juniper, P. A. Kline, M. A. Vanieleghem, E. H. Ramsdale, P. M. O'Byrne und F. E. Hargreave, "Effect of long-term treatment with an inhaled corticosteroid (budesonide) on airway hyperresponsiveness and clinical asthma in non-steroid dependent asthmatics", Am. Rev. Respir. Dis., 142, 832–836 (1990). Diese Komplikation entwickelt sich aus einer konstruktiven Umgestaltung der Atemwegswand, die zu einer erhöhten Masse der glatten Muskulatur führt (A. M. Bramley, R. J. Thomson, C. R. Roberts und R. R. Schellenberg, "Excessive bronchoconstriction in asthma is due to decreased airway elastance", Eur. Respir. J., 7, 337–341 (1999); und R. K. Lambert, B. R. Wiggs, K. Kuwano, J. C. Hogg und P. D. Pare, "Functional significance of increased airway smooth muscle in asthma and COPD", J. Appl. Physiol., 79, 2771–2781 (1993)) aus sowohl Hyperplasie als auch Hypertrophie (M. Ebina, T. Takahasi, T. Chiba und M. Motomiya, "Cellular hypertrophy and hyperplasia of airway smooth muscle underlying bronchial asthma", Am. Rev. Respir. Dis., 148, 720–726 (1993)), sowie aus einer Umgestaltung anderer Elemente. Es wird wiederum angenommen, dass eine Verdickung der glatten Atemwegsmuskulatur zur nicht-spezifischen bronchialen Überempfindlichkeit beiträgt, die für Asthma charakteristisch ist (A. L. James, J. C. Hogg, L. A. Dunn und P. D. Pare, "The use of internal perimeter to compare airway size and to calculate smooth muscle shortening", Am. Rev. Respir. Dis., 138, 136–139 (1988); und A. L. James, P. D. Pare, J. C. Hogg, "The mechanics of airways narrowing in asthma", Am. Rev. Respir. Dis., 139, 242–246 (1989); und P. D. Pare, B. R. Wiggs, J. C. Hogg und C. Bosken, "The comparative mechanics and morphology of airways in asthma and in chronic obstructive pulmonary disease", Am. Rev. Respir. Dis., 143, 1189–1193 (1991)). Die Umgestaltung der Atemwegswand bei Asthmatikern ist häufig klinisch refraktär gegenüber derzeitigen Bronchodilatator- und entzündungshemmenden Therapien (siehe z. B. Brown et al. (1984), oben; und Juniper et al. (1990), oben). Neue Behandlungsstrategien sind erforderlich, die das Auftreten dieses Prozesses verhindern.
  • Eine frühere Studie in Gefäßgewebe hat gezeigt, dass eine beschleunigte koronare Atherosklerose im transplantierten Herz durch Behandlung mit Dehydroepiandrosteron (DHEA) reduziert wird. Siehe D. M. Eich, J. E. Nestler, D. E. Johnson, G. H. Dworkin, D. Ko, A. S. Wechsler und M. L. Hess, "Inhibition of accelerated coronary atherosclerosis with dehydroepiandrosterone in the heterotopic rabbit model of cardiac transplantation", Circ., 87, 261–269 (1993).
  • Dehydroepiandrosteron (DHEA) und sein Sulfatkonjugat (DHEAS) sind die hauptsächlichen skretorischen steroidalen Produkte der Nebenniere, aber die physiologische Rolle von DHEA bleibt unbekannt. Siehe P. Ebeling und V. A. Kovisto, "Physiologic importance of dehydroepiandrosterone", Lancet, 343, 1479–1481 (1994). DHEA und seine synthetischen Analoga sind antiproliferativ in Tier-Tumormodellen und bösartigen Zelllinien. Siehe z. B. A. G. Schwartz, M. L. Lewbart und L. L. Pashko, "Novel dehydroepiandrosterone analogues with enhanced biological activity and reduced side effects in mice and rats", Cancer Res., 48, 4817–4822 (1988); und A. G. Schwartz und L. L. Pashko, "Mechanism of cancer preventive action of DHEA, Role of glucose-6-phosphate dehydrogenase", Ann. N. Y. Acad. Sci., 774, 180–186 (1995)). Diese Wirkung wurde durch die Inhibierung von Glucose-6-phosphatdehydrogenase mit einer anschließenden Blockade der Ribonucleosid- und Desoxyribonucleotidbildung erklärt (C. R. Dworkin, S. D. Gorman, L. L. Pashko, W. J. Cristofalo und A. G. Schwartz, "Inhibition of growth of HeLa and WI-38 cells by dehydroepiandrosterone and its reversal by ribo- and deoxyribonucleosides", Life Sci., 38, 1451–1457 (1986); R. Garcea, L. Daino, S. Frassetto, P. Cozzolino, M. E. Riggiu, M. G. Vannini, R. Pascale, L. Lenzerini, M. M. Simile, M. Puddu und F. Feo, "Reversal by ribo- and deoxyribonucleosides of dehydroepiandrosterone-induced inhibition of enzyme altered foci in the liver of rats subjected to the initiationselection process of experimental carcinogenesis", Carcinogenesis, 9, 931–938 (1988); L. L. Pashko, M. L. Lewbart und A. G. Schwartz, "Inhibition of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-promoted skin tumor formation in mice by 16α-fluoro-5-androsten-17-on and is reversal by deoxyribonucleosides", Carcinogenesis, 12, 2189–2192 (1991); Schwartz et al. (1988), oben; und Schwartz und Pashko (1995), oben), oder durch Wechselwirkung in der Mevalonsäure-Biosynthese mit einer reduzierten Proteinisoprenylierung, beeinträchtigter Lokalisierung von Ras in der Plasmamembran und Unterbrechung der Raf-Kinase-vermittelten Signaltransduktionskaskaden. Siehe S. Schulz und J. W. Nyce, "Inhibition of protein isoprenylation and p2lras membrane association by dehydroepiandrosterone in human colonic adenocarcinoma cells in vitro", Cancer Res., 51, 653–656 (1991) und S. Schulz, R. C. Klann, S. Schonfeld und J. W. Nyce, "Mechanisms of cell growth inhibition and cell cycle arrest in human colonic adenocarcinoma cells by dehydroepiandrosterone: Role of isoprenoid biosynthesis", Cancer Res., 52, 1372–1376 (1992).
  • Verwiesen wird ebenfalls auf US-A-5,660,835 (Nyce) und EP 1 033 989 A1 , die die Verwendung von Dehydroepiandrosteron-(DHEA)-Derivaten zur Behandlung asthmatischer Symptome offenbaren, im letzteren Fall zur Vermittlung allergischer Mastzellreaktionen. EP 1 033 989 A1 wurde nach dem Anmeldetag der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Diese Anmeldung beschreibt Verfahren zur Reduzierung des Wachstums von glatter Atemwegsmuskulatur, deren Hyperplasie zu fester Atemwegsobstruktion und gesteigerter Atemwegsüberempfindlichkeit bei schwerem chronischem Asthma führen kann.
  • Diese Anmeldung beschreibt ebenfalls Verfahren zur Relaxation und Bronchodilatation der glatten Atemwegsmuskulatur.
  • Diese Anmeldung beschreibt ebenfalls Verfahren zur Reduzierung der Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen durch das Atemwegsepithel.
  • Diese Anmeldung beschreibt ferner ein Verfahren zur Behandlung von asthmatischer Atemwegsumgestaltung im Menschen. Es wurde festgestellt, dass das adrenale Steroid Dehydroepiandrosteron (DHEA) und bestimmte Analoga davon das Wachstum unsterblich gemachter und bösartiger Zelllinien reduzieren. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass die Wirkungen der gegenständlichen Verbindungen, Dehydroepiandrosteron und sein wirksames Analogon 16α-Bromepiandrosteron (16α-BrEA), dramatisch die Proliferation in Primärkulturen aus trachealer glatter Muskulatur der Ratte, stimuliert mit fötalem Rinderserum (FBS) oder aus Blutplättchen stammendem Wachstumsfaktor (PDGF), reduzierten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung mit der folgenden Formel:
    Figure 00040001
    worin
    X Halogen, Hydroxy oder Wasserstoff ist;
    Y Wasserstoff ist;
    Z Wasserstoff ist;
    in der Herstellung eines Medikaments, das eine pharmazeutisch wirksame Menge der Verbindung umfasst, zur Inhibierung der DNA-Bindung von AP-1 und der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur, in der Behandlung von Asthma von Tieren.
  • Die bevorzugten Steroide zur Verwendung in dieser Erfindung schließen ein:
    16α-Brom-5-androsten-17-on,
    16β-Brom-5-androsten-17-on,
    16α-Fluor-5-androsten-17-on,
    16β-Fluor-5-androsten-17-on,
    16α-Brom-5-androstan-17-on,
    16β-Brom-5-androstan-17-on,
    16α-Fluor-5-androstan-17-on,
    16β-Fluor-5-androstan-17-on.
  • Die vorliegende Erfindung sieht die Behandlung von Asthma vor, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge der gegenständlichen Verbindung an einen Wirt, z. B. Säugetiere. Da DHEA weniger wirksam als 16α-BrEA oder andere 16-fluorierte oder -bromierte Analoga ist, ist die wirksame Dosis für DHEA höher.
  • Es wurde überraschend festgestellt, dass die Wachstumsinhibierung dosisabhängig ist und nicht abhängig von Wechselwirkung mit Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Aktivität oder Cholesterinstoffwechsel für unsterblich gemachte oder bösartige Zelllinien ist. Die Expression des früheren Response-Gens c-fos bleibt intakt, aber DHEA und 16α-BrEA verringerten die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors Aktivatorprotein-1 (AP-1), eine spätere Reaktion, die wichtig zur Expression von Genen ist, die die DNA-Synthese und den Zellzyklusfortschritt vermitteln.
  • Es wurde ebenfalls festgestellt, dass DHEA und seine Analoga die Aktivierung von Response-Genen des sekundären Wachstums in einer Weise beeinträchtigen können, die analog zu der für Glukokortikoide berichteten ist, und sich als nützlich zur Behandlung der asthmatischen Atemwegsumgestaltung im Menschen erweisen können.
  • Außerdem wurde festgestellt, dass DHEA die glatte Atemwegsmuskulatur relaxieren kann, die durch KCl oder durch den endogenen, vagal freigesetzten Bronchokonstriktormediator Acetylcholin kontrahiert ist, und sich als nützlich als direkter Bronchodilatator oder eine verbundene Behandlung zur Potenzierung von β-agonistischen Bronchodilatatoren in der Behandlung von akutem Asthma im Menschen erweisen können.
  • Zusätzlich wurde festgestellt, dass Analoga von DHEA die Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen durch das humane Atemwegsepithel verhindern können und sich als nützlich zur Reduzierung der Entzündung innerhalb der asthmatischen Atemwege erweisen können.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die MTT-Reduzierung als ein genaues Maß der mit dem Hämozytometer gezählten Zellzahlen;
  • 2A zeigt die Wirkung von Mitogenen auf das Zellwachstum der glatten Atemwegsmuskulatur der Ratte (fötales Rinderserum);
  • 2B zeigt die Wirkung von Mitogenen auf das Zellwachstum der glatten Atemwegsmuskulatur der Ratte (aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor);
  • 3A zeigt die Wirkung von Dehydroepiandrosteron (DHEA) und Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS) auf das FBS-stimulierte Wachstum von glatten Atemwegsmuskelzellen;
  • 3B zeigt die Wirkung von Dehydroepiandrosteron auf die durch PDGF stimulierte Proliferation von glatten Atemwegsmuskelzellen;
  • 3C zeigt die Wirkung von 16α-Bromepiandrosteron auf die FBS-stimulierte Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur;
  • 3D zeigt die wachstumshemmende Wirkung von 16α-Bromepiandrosteron im Vergleich mit derjenigen von Dexamethason;
  • 4A zeigt, dass die wachstumshemmenden Wirkungen von Dehydroepiandrosteron und 16α-Bromepiandrosteron keine Messartefakte darstellen;
  • 4B zeigt, dass die Lactatdehydrogenase-(LDH)-Aktivität in Zellüberständen nicht durch 16α-Bromepiandrosteron erhöht wird;
  • 5A–5D zeigen, dass die Inhibierung der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur durch DHEA oder 16α-Bromepiandrosteron nicht durch ergänzende Ribonucleoside und Desoxyribonucleoside, die zum Kulturmedium gegeben werden, umgekehrt wird;
  • 6A zeigt, dass die Störung des Cholesterinstoffwechsels nicht die Inhibierung des Wachstums der glatten Atemwegsmuskulatur durch 16α-Bromepiandrosteron erklärt;
  • 6B ist ein Immunoblot, der zeigt, dass die Behandlung von Monolayern mit 16α-Bromepiandrosteron nicht p2lras aus Membranen abreichert;
  • 7A ist ein repräsentativer Immunoblot von c-fos-Protein aus Kontroll-Monolayern, die mit FBS behandelt wurden, und von denen einige mit DMSO, 16α-Bromepiandrosteron und A431-Zelllysat vorbehandelt wurden;
  • 7B zeigt, dass die Vorbehandlung für 2 Stunden mit DMSO-Träger oder 10 μM 16α-Bromepiandrosteron nicht die normale Zunahme von c-fos-mRNA verhinderte;
  • 7C ist eine Zusammenfassung der in 7B gezeigten Experimente;
  • 8A–8B veranschaulichen, dass die Behandlung der glatten Atemwegsmuskulatur mit Dehydroepiandrosteron und 16α-Bromepiandrosteron die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors AP-1 inhibiert;
  • 9 veranschaulicht die Konzentrations-Wirkungs-Kurve gegenüber DHEA und gegenüber Träger allein (DMSO) in mit 3 × 10–2 M KCl partiell kontrahierten Hauptbronchien im Meerschweinchen;
  • 10 veranschaulicht die Konzentrations-Wirkungs-Kurve gegenüber DHEA und gegenüber Träger allein (DMSO) in mit 1 × 10–5 M Acetylcholin (ACh) partiell kontrahierten Hauptbronchien im Meerschweinchen;
  • 11 veranschaulicht die Konzentrations-Wirkungs-Kurve gegenüber ACh in Gegenwart und in Abwesenheit von 10–4 M DHEA in den Hauptbronchien im Meerschweinchen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend vollständiger unter Verweis auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben, in denen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung gezeigt sind. Diese Erfindung kann jedoch in vielen unterschiedlichen Formen verkörpert werden und sollte nicht als auf die nachfolgend dargestellten Ausführungsformen beschränkt aufgefasst werden; vielmehr werden diese Ausführungsformen bereitgestellt, so dass diese Offenbarung gründlich und vollständig sein wird und den Fachleuten den Umfang der Erfindung vollständig vermitteln wird.
  • Die vorliegende Erfindung sieht die Verwendung einer Verbindung der folgenden Formel vor:
    Figure 00070001
    worin
    X Halogen, Hydroxy oder Wasserstoff ist;
    Y Wasserstoff ist;
    Z Wasserstoff ist;
    in der Herstellung eines Medikaments, das eine pharmazeutisch wirksame Menge der Verbindung umfasst, geeignet zur Inhibierung der DNA-Bindung von AP-1 und der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur, z. B. in der Behandlung von Asthma in einem Tier, insbesondere im Menschen.
  • Spezifische illustrative Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung schließen ein:
    16α-Brom-5-androsten-17-on,
    16β-Brom-5-androsten-17-on,
    16α-Fluor-5-androsten-17-on,
    16β-Fluor-5-androsten-17-on,
    16α-Brom-5-androstan-17-on,
    16β-Brom-5-androstan-17-on,
    16α-Fluor-5-androstan-17-on,
    16β-Fluor-5-androstan-17-on.
  • Da DHEA weniger wirksam als die 16-Brom- und 16-Fluor-Analoga ist, ist die wirksame Dosis für DHEA höher. Zum Beispiel beträgt eine bevorzugte Dosierung für DHEA 2 bis 10 mg/kg/Tag. Eine bevorzugte Dosierungsrate für die oben beschriebenen 16-Brom- und -Fluor-substituierten Analoga wäre von 0,2 bis 2 mg/kg/Tag.
  • Das Medikament kann oral verabreicht werden, und das Steroid kann in einem pharmazeutischen Träger eingeschlossen werden. Alternativ kann das Medikament durch Inhalation in einem pharmazeutischen Träger verabreicht werden, wie z. B. unter Verwendung herkömmlicher Dosierinhalatorsysteme, formuliert als mikrokristalline Suspension aus Medikament (mikronisiert auf eine Größe von weniger als 4 μm) in einer Mischung aus Chlorfluorkohlenstofftreibmitteln, wie Trichlorfluormethan und Dichlordifluormethan, mit Lecithin, so dass jede Inhalation zwischen 25 und 250 μg Wirkstoff überträgt.
  • Zur Inhalation kann das Medikament ebenfalls als mikrokristallines trockenes Pulver zur Übertragung durch handelsübliche Trockenpulverinhalationssysteme formuliert werden, wie das Spiros-Trockenpulverinhalationssystem, erhältlich von Dura Pharmaceuticals, San Diego, CA, oder das Inspire-Inhalationssystem, erhältlich von Inspire, Inc., Palo Alto, CA.
  • Ebenfalls kann das Medikamant als eine Komponente von multilamellaren, negativ geladenen Liposomen formuliert werden, wie durch das Verfahren von Fidler (I. J. Fidler, A. Raz, W. E. Fogler, R. Kirsh, P. Bugelski und
    G. Poste, "Design of liposomes to improve delivery of macrophage-augmenting agents to alveolar macrophages", Cancer Res., 40: 4460–4466, 1980), welches die Verwendung einer Mischung aus Ei-Phosphatidylcholin und Hirn-Phosphatidylserin (Avanti Polar Lipids, Inc., Birmingham, AL) in einem Molverhältnis von 7 : 3 und die Formulierung von wirkstoffhaltigen Liposomen wie von Padmanabhan beschrieben umfasst (R. V. Padmanabhan, R. Gudapata, I. E. Liener, B. A. Schwartz und J. R. Hoidal, "Protection against pulmonary oxygen toxicity in rats by the intratracheal administration of liposomeencapsulated superoxide dismutase or catalase", Am. Rev. Respir. Dis., 132: 164–167, 1985). Ein liposomenhaltiges Medikament kann zweckmäßig an den Atemwegsbaum durch Inhalation unter Verwendung handelsüblicher Strahl-Aerosolvernebler oder Ultraschall-Vernebler-Vorrichtungen verabreicht werden, wie das Medicaid Ventstream, Pari-LC Jet, Omron UltraAir, DeVilbiss Aerosonic or Circulair. Bei direkter Verabreichung in die Lunge durch Inhalation ist nur 1/10 der gewöhnlichen oralen Dosis erforderlich, ein bis dreimal täglich zur Behandlung des asthmatischen Zustands zu verabreichen.
  • Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Steroide können gemäß herkömmlichen organischen Synthesen hergestellt werden. Zum Beispiel können die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Steroide aus Steroiden, die bekannt oder leicht erhältlich sind, wie Dehydroepiandrosteron (DHEA), durch fachbekannte Verfahren aus Alkylierungs-, Halogenierungs-, Hydroxylierungs- oder Substitutions-Reaktionen hergestellt werden. Verfahren zur Synthese einer Anzahl von Steroiden, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden ausführlich beschrieben in: A. G. Schwartz, M. L. Lewbart und L. L. Pashko, "Novel dehydroepiandrosterone analogues with enhanced biological activity and reduced side effects in mice and rats", Cancer Res., 48: 4817–4822, 1988.
  • Experimenteller Teil
  • Untersuchungen wurden durchgeführt um zu zeigen, dass das adrenale Steroiddehydroepiandrosteron (DHEA) und seine Analoga das Wachstum von unsterblich gemachten und bösartigen Zelllinien reduzieren.
  • Materialien
  • Männliche ausgewachsene Sprague-Dawley-Ratten wurden von Charles River (Raleigh, NC) erworben. Proteaseinhibitoren und Guanidinthiocyanat wurden von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) erhalten. Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM), gepufferte Salzlösung nach Hank (HBSS), N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), Antibiotikum-Antimykotikum (10.000 E Penicillin, 10.000 E Streptomycin und 25 μg Amphotericin B/ml) und Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure-(EDTA)-Lösung wurden von GIBCO (Grand Island, NY) erworben.
  • Fötales Rinderserum (FBS) wurde von HyClone (Logan, UT) erworben. Rekombinanter humaner aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor AA (PDGF-AA) wurde von R&D Systems, Minneapolis, MN erhalten. Dehydroepiandrosteron (DHEA), 16α-Bromepiandrosteron (16α-BrEA), Mifepriston (RU486), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) und Antikörper für α-Actin aus glatter Muskulatur wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erworben.
  • Antikörper für die Proteine p21ras (pan-ras, Ab-3, Maus monoklonal) und c-fos (Ab-2, Kaninchen polyklonal), Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziege-anti-Maus-IgG und A431-Zelllysatstandard waren von Calbiochem (San Diego, CA).
  • Polyklonales Meerrettichperoxidase-anti-Kaninchen-IgG war von Transduction Laboratories (Lexington, KY). M-MLV reverse Transkriptase war von Life Technologies (Gaithersburg, MD). Alle anderen Materialien wurden von Sigma erhalten, wenn nicht anders angegeben.
  • Messung der kultivierten glatten Atemwegsmuskulatur
  • Proliferation
  • Tracheale glatte Muskulatur der Ratte wurde durch Töten von Ratten mit Pentobarbitalüberdosis und Entfernung ihrer Luftröhren kultiviert. Die hintere Luftröhrenmembran wurde isoliert, zerhackt und zweimal für 30 Minuten bei 37°C in HBSS verdaut, das 0,2% Typ IV Collagenase und 0,05% Typ IV Elastase enthielt. Jeder Enzymverdau wurde aufgefangen und für 5 Minuten mit 500 g bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und das Pellet in DMEM resuspendiert, das mit 10% FBS, nicht-essentiellen Aminosäuren, Penicillin (100 E/ml), Streptomycin (100 μg/ml) und Amphotericin (250 ng/ml) ergänzt war. Zellen wurden in diesem Medium in 25 cm2-Kolben mit 2 × 103 Zellen pro Kolben geimpft und in einer angefeuchteten Atmosphäre aus 5% CO2/95% Luft bei 37°C inkubiert. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit 0,25% Trypsin/0,002% EDTA-Lösung zum Passagieren abgelöst.
  • Immunanfärbung wurde unter Verwendung eines polyklonalen Antikörpers gegen α-Actin der glatten Muskulatur durchgeführt und unter Verwendung einer Avidin-Biotin-Immunoperoxidase-Technik visualisiert. Kulturen der glatten Muskulatur zeigten das typische "Berg und Tal"-Erscheinungsbild bei Phasenkontrastmikroskopie und färbten stark an für α-Actin aus glatter Muskulatur. Vorläufige Untersuchungen zeigten, dass die Kultur von Zellen in Gegenwart von 10% FBS zu einer linearen Wachstumsphase bis zu 120 Stunden führte. Kulturen aus den Passagen 2–9 wurden für die anschließenden Experimente verwendet.
  • Die Proliferation von kultivierter glatter Atemwegsmuskulatur wurde unter Verwendung einer Modifikation eines zuvor angegebenen kolorimetrischen Verfahrens durchgeführt, beruhend auf der Stoffwechselreduktion des löslichen gelben Tetrazoliumfarbstoffs 3-[4,5-Dimethylthiazol]-2-yl-2,5-diphenyl-tetrazoliumbromid (MTT) zu seinem unlöslichen violetteten Formazan durch die Wirkung von mitochondrialer Succinyldehydrogenase. Siehe S. J. Hirst, P. J. Barnes und C. H. C. Twort, "Quantifying proliferation of cultured human und rabbit airway smooth muscle in response to serum and platelet derived growth factor", Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 7, 574–581 (1992). Dieser Test unterscheidet empirisch zwischen toten und lebenden Zellen. Für Proliferationsuntersuchungen wurden Zellen in unbeschichtete Kunststoffplatten mit 24 Vertiefungen mit 15.000–50.000 Zellen pro Vertiefung geimpft und mit DMEM und Mitogenen kultiviert. Nach 24–96 Stunden wurde das Medium gegen 1 ml/Vertiefung von frischem DMEM ausgetauscht, das 100 μg/ml MTT und 0,5% FBS enthielt, und die Platten wurden eine weitere Stunde inkubiert. MTT-haltiges Medium wurde entfernt, die Zellen wurden zweimal mit 1 ml steriler modifizierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco ohne Ca2+ oder Mg2+ (DPBS) gewaschen, 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben, und die Extinktion des solubilisierten violetten Formazanfarbstoffs wurde bei 540 nm an einem Shimadzu UV160U-Spektrophotometer gemessen. Insgesamt 4–6 Vertiefungen wurden bei jedem Behandlungszustand untersucht.
  • Vorläufige Untersuchungen wurden mit 50–200 μg/ml MTT durchgeführt, inkubiert für 15 Minuten bis 3 Stunden, um die optimale Konzentration und Inkubationszeit zu bestimmen, bei der die Umwandlungsgeschwindigkeit linear und proportional zur Anzahl der vorhandenen Zellen war. Zur Bestätigung, dass die 3-[9,5-Dimethylthiazol]-2-yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid-(MTT)-Reduktion eine verlässliche lineare Messung der Zellanzahl war, wurden frisch abgelöste Zellen aus der glatten Atemwegsmuskulatur für 1 Stunde in DMEM inkubiert, das 10% FBS und 100 μg/ml MTT enthielt. Die Zellen wurden mit 1.000 g für 10 min zentrifugiert, zweimal mit Dulbeccos modifizierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung ohne Ca2+ oder Mg2+ (DPBS) gewaschen, mit 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) extrahiert, und die Konzentration von Formazan wurde wie oben beschrieben gemessen.
  • Die optimale Konzentration von FBS zur Verwendung als mitogener Reiz wurde durch Inkubieren von 15.000 Zellen pro Vertiefung mit DMEM bestimmt, das 0,25, 1,0, 5,0 oder 10,0% FBS enthielt, und die MTT-Reduktion wurde nach 24, 48, 72 oder 96 Stunden bestimmt. Schließlich wurden zur Bestätigung, dass Mitogene stimulierend waren und Inhibitoren die tatsächlichen Zellzahlen verringerten, 15.000 Zellen mit DMEM inkubiert, das 10% FBS mit oder ohne verschiedene Inhibitoren oder Träger enthielt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen zweimal mit DPBS gewaschen, fixiert und durch zwei aufeinanderfolgende 5-minütige Kontakte mit eiskaltem Methanol permeabilisiert, mit Giemsa-modifiziertem Wright-Anfärbemittel für 3 Minuten angefärbt und mit DPBS gewaschen. Zellzählungen wurden an 10 statistischen Felder mit Leistung 40 unter Verwendung eines Gesichtsfelds von 0,01 cm2 durchgeführt.
  • Zellkulturbehandlungen zur Messung der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur
  • Die Wirkung von Dehydroepiandrosteron (DHEA) und 16α-Bromepiandrosteron (16α-BrEA) auf die zelluläre Proliferation wurde in Kulturen untersucht, die mit 0,5–10% FBS oder 1–50 ng/ml rekombinantem humanem, aus Blutplättchen stammendem Wachstumsfaktor (PDGF-AA) stimuliert wurden. In einigen Experimenten wurde das Glukokortikoid und Progesteron-Antihormon RU486 individuell oder mit Dehydroepiandrosteron (DHEA) oder 16α-Bromepiandrosteron (16α-BrEA) in äquimolaren Mengen hinzugegeben, in einer Anstrengung zur Bestimmung, ob inhibitorische Wirkungen durch die Bindung von DHEA oder 16α-BrEA an den Glukokortikoidproteinrezeptor vermittelt wurden. Siehe z. B. das Verfahren von Y. Y. Lee und R. B. Xu, "The molecular mechanism of the action of the parmacological doses of glucocorticoids. Studies on the low-affinity glucocorticoid receptor", Receptor, 5, 63–69 (1995). In anderen Untersuchungen wurden die wachstumshemmenden Wirkungen von DHEA oder 16α-BrEA mit denjenigen der Glukokortikoide Dexamethason oder Methylprednisolon verglichen.
  • Zur Bestimmung, ob DHEA und 16α-Bromepiandrosteron die zelluläre Proliferation durch Inhibierung von Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G6PDH) reduzierten, wurden konfluente 80 cm–2-Kolben mit DHEA, 16α-BrEA oder 50 μl DMSO-Träger inkubiert. Nach 1 Stunde wurden die Zellen lysiert, und die G6PDH-Aktivität wurde wie nachfolgend beschrieben getestet. In anderen Experimente wurde die G6PDH-Aktivität in Zelllysaten gemessen, die aus unbehandelten konfluenten Kulturen hergestellt und in vitro mit DHEA oder 16α-BrEA behandelt wurden, hinzugegeben zur Reaktionsmischung in 5 μl DMSO. Zur Bestimmung, ob die Blockade der Hexosemonophosphat-Nebenschlussproduktion von Ribosezuckern verantwortlich für die Wachstumsinhibierung der glatten Atemwegsmuskulatur durch DHEA oder 16α-BrEA war, wurden die Zellen für 24 Stunden in 0,5% FBS wachstumssynchronisiert (15.000 Zellen/Vertiefung in Platten mit 24 Vertiefungen), dann in DMEM und 10% FBS in Gegenwart oder Abwesenheit von DHEA oder 16α-BrEA und 200 μM Ribonucleosiden (Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uridin) oder Desoxyribonucleosiden (Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxycytidin und Thymidin) inkubiert. Ribonucleoside oder Desoxyribonucleoside wurden in 0,5 ml von 1 N HCl gelöst und zu DMEM hinzugegeben. Der pH des Mediums wurde auf 7,1 durch Titration mit 1 N NaOH eingestellt, und das Medium wurde dann durch Hindurchleiten durch ein 0,2 μm-Filter sterilisiert. Das Wachstum wurde durch MTT-Reduktion nach 24, 48 und 96 Stunden gemessen.
  • Zur Bestimmung, ob 16α-Bromepiandrosteron die zelluläre Proliferation durch Wechselwirkung mit der Mevalonsäuresynthese reduzierte, wurden Zellen mit FBS stimuliert und in Gegenwart oder Abwesenheit von 16α-BrEA mit oder ohne Zugabe von 6 mM DL-Mevalonsäurelacton zum Wachstumsmedium gezüchtet. Nach 36 Stunden wurde das Wachstum durch MTT-Reduktion gemessen. Zur Auswertung, ob die Isoprenylierung und Membranlokalisierung von Ras beeinträchtigt wurde, wurden konfluente Zellen auf 75 cm2-Petrischalen für 24 Stunden in 0,5% FBS und DMEM mit und ohne 16α-BrEA oder DMSO-Träger im Wachstum angehalten. Einige Schalen wurden dann 30 Minuten lang mit 10% FBS in DMEM stimuliert. Die Zellen wurden lysiert, Membranen wurden isoliert, und das Immunoblotting wurde wie nachfolgend beschrieben durchgeführt um zu bestimmen, ob die Behandlung mit DHEA und 16α-BrEA p21ras abreicherte.
  • Zur Bestimmung, ob 16α-BrEA die Expression von frühen Response-Genen beeinträchtigte, die wichtig zur zellulären Proliferation sind, wurden konfluente 75 cm2-Petrischalen mit Zellen der glatten Atemwegsmuskulatur durch Inkubation für 24 Stunden in DMEM mit 0,5% FBS im Wachstum angehalten. Monolayer wurden 2 Stunden mit 10 μM 16α-BrEA oder DMSO-Träger vorbehandelt und durch Kontakt mit DMEM mit 10% FBS für 30 Minuten stimuliert. Die Zellen wurden dann lysiert, und c-fos-mRNA wurde durch die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion wie nachfolgend beschrieben gemessen. Zur Untersuchung, ob die Gehalte von c-fos-Protein beeinflusst wurden, wurden konfluente Monolayer auf Platten mit 6 Vertiefungen für 24 Stunden in DMEM mit 0,5% FBS im Wachstum angehalten. Die Zellen wurden dann 2 Stunden mit 16α-BrEA oder DMSO-Träger vorbehandelt und mit 10% FBS in DMEM für 15, 30 und 60 Minuten stimuliert. Die Zellen wurden dann lysiert, und c-fos-Protein wurde durch Immunoblotting wie nachfolgend beschrieben getestet.
  • Zur Untersuchung der Wirkung von DHEA und 16α-BrEA auf die Aktivierung von AP-1, einer Sekundärreaktion, die wichtig im zellulären Wachstum und in der Proliferation ist (Angel und Karin (1991), oben), wurden konfluente Monolayer aus glatter Atemwegsmuskulator in 75 cm2-Petrischalen für 24 Stunden in 0,5% FBS und DMEM im Wachstum angehalten und 2 Stunden mit DHEA, 16α-BrEA oder DMSO-Träger vorhandelt. Die Zellen wurden dann mit 10% FBS in DMEM für 6 Stunden stimuliert, Kernprotein wurde geerntet, und Gelretardationstests wurden wie nachfolgend beschrieben zur Bestimmung durchgeführt, ob die Behandlung mit DHEA und 16α-BrEA die DNA-Bindung von AP-1 beeinträchtigte.
  • Messung von Cytotoxizität und Apoptose
  • Zur Bewertung auf Cytotoxizität wurden DHEA und 16α-BrEA zu Vertiefungen mit Zellen aus glatter Atemwegsmuskulatur gegeben, die zuvor zur Konfluenz in DMEM und 10% FBS gezüchtet worden waren. Nach 24 Stunden wurde das Medium für 5 Minuten mikrozentrifugiert, und Überstand wurde auf Lactatdehydrogenase-Aktivität unter Verwendung eines handelsüblichen Tests (DG-1340K von Sigma) getestet. Die Zellen wurden zweimal in DPBS gewaschen und mit Trypanblau-Farbstoff (0,04% in gepufferter Salzlösung nach Hank) in Kontakt gebracht. Die Zellzählungen wurden in 5 statistischen Feldern unter Verwendung eines 0,01 cm2-Gesichtsfelds durchgeführt, um die Durchschnittsanzahl von beschädigten oder toten Zellen zu quantifizieren, die Farbstoff anreicherten.
  • Zur Bestimmung, ob DHEA oder seine Analoga den programmierten Zelltod induzierten, wurden konfluente Kulturen in Kunststoffplatten mit 6 Vertiefungen mit 50 oder 250 μM DHEA, 10 oder 50 μM 16α-BrEA oder Träger (25 μl DMSO) behandelt. Nach 2 Stunden wurden die Zellen zweimal mit DPBS gewaschen und auf Eis in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen geschabt und für 5 Minuten bei 4°C mit 250 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde vorsichtig in 30 μl DPBS resuspendiert und durch Zugabe von 30 μl Lysepuffer (80 mM EDTA, 1,6% (Gew./Vol.) Natriumlaurylsarcosinat und 5 mg/ml Proteinase K in 200 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0) lysiert. Das Lysat wurde bei 50°C für 1,5 Stunden inkubiert. RNAse A (0,2 mg/ml) wurde hinzugegeben, und das Lysat wurde für weitere 30 Minuten bei 37°C inkubiert. DNA-Banden wurden neben einem DNA-Ladder-Standard auf einem 1%-igen Agarosegel mit 60 V für 1 Stunde getrennt, mit Ethidiumbromid interkaliert und unter UV-Licht visualisiert und fotografiert.
  • Messung von Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Aktivität
  • Kulturen wurden dreimal mit kaltem DPBS auf Eis gewaschen, in eiskalten Puffer (10 mM MgCl2 in 50 mM Tris, pH 8,0) geschabt und auf Eis ultraschallbehandelt. Die G6PDH-Aktivität wurde dann durch das Verfahren von Jones und Andrews (J. T. Jones und S. G. Andrews, "Glucose-6-phosphate dehydrogenase activity in somatic and germinal cells of the mouse testis", J. Reproduc. Fertility, 54, 357–362 (1978)) in einer Reaktionsmischung getestet, die 50–200 μl Zelllysat, 20 μl von 10 mM β-Nicotinamidadenindinucleotidphosphat (NADP) und 20 μl von 10 mM D-Glucose-6-phosphat (G6P) in einem Gesamtvolumen von 1 ml Puffer (10 mM MgCl2 in 50 mM Tris, pH 8,0) enthielt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von G6P gestartet. Die lineare Abnahme der Extinktion bei 340 nm wurde bei 25°C für 300 Sekunden überwacht. Die Aktivität wurde als Einheiten/mg Protein ausgedrückt, wobei 1,0 Einheiten 1,0 μmol G6P zu 6-Phospho-D-gluconat pro Minute in Gegenwart von NADP oxidieren werden. Das Protein wurde unter Verwendung des BCA-Proteintests (Rockford, IL) gemessen.
  • Immunoblot-Test auf p2lras_ und c-fos-Proteine
  • Zur Messung von p2lras wurden die Zellen zweimal mit kaltem DPBS gewaschen und auf Eis für 15 Minuten mit 500 μl kaltem Lysepuffer (10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 μM Pepstatin, 2 μg/ml Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid) gequollen. Siehe Schulz und Nyce (1991), oben. Die Zellen wurden dann in 1,5 ml-Polypropylenröhrchen geschabt, homogenisiert und durch Zentrifugieren mit 3.000 g für 1 Minute bei 4°C geklärt. Der postnukleäre Überstand wurde mit 100.000 g für 30 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Überstände wurden aufgefangen, und pelletisierte Membranen wurden in Detergenspuffer (1% Triton X-100, 1% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS, 150 mM NaCl, 1 μM Pepstatin, 2 μg/ml Aprotinin und 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid in 25 mM Tris, pH 7,4) resuspendiert. Teilmengen von Überstand und Membranfraktionen wurden zur Proteinbestimmung unter Verwendung des BCA-Proteintests entfernt. Bromphenolblau und β-Mercaptoethanol wurden zur verbleibenden Probe auf eine Endkonzentration von 0,002% (Gew/Vol) bzw. 5% (Vol/Vol) hinzugegeben. Lysate wurden dann für 5 Minuten bei 100°C gekocht und bei –80°C gelagert, bis das Immunoblotting durchgeführt wurde.
  • Zur Messung von c-fos-Protein wurden Monolayer auf Eis gegeben, zweimal mit kaltem DPBS gewaschen, in 0,5 ml siedenden Puffer geschabt (10% [Vol/Vol] Glycerin und 2% [Gew/Vol] Natriumdodecylsulfat [SDS] in 83 mM Tris, pH 6,8) und ultraschallbehandelt. Teilmengen wurden zur Proteinbestimmung entfernt, Bromphenolblau und β-Mercaptoethanol wurden hinzugegeben, und die Lysate wurden wie oben umrissen gekocht und gelagert.
  • Proteine in aufgetauten Proben wurden durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese an 10%igen Polyacrylamidgelen für c-fos und 15%igen Gelen für p2lras (15 μg Protein/Bahn) unter Verwendung von O'Farrell-Laemmli-Puffer (0,025 M Tris, 0,192 M Glycin und 0,1% [Gew/Vol] SDS; pH 8,3) getrennt. Siehe Verfahren von B. J. Buckley und A. R. Whorton, "Ca2+-independent arachidonic acid release by vascular endothelium requires Protein synthesis de novo", Biochem. J., 300, 445–449 (1994). Zweifache Gele wurden mit Coomassieblau (Coomassieblau-Färbemittel R-250 von Sigma in 40% Methanol und 7% Essigsäure) angefärbt, um die relative Menge von Protein auszuwerten, die in jeder Bahn aufgeladen war. Die Proteine wurden auf Nitrocellulose durch das nasse Transblot-Verfahren in Transferpuffer (0,025 M Tris, 0,192 M Glycin, 2,6 mM SDS und 20% [Vol/Vol] Methanol; pH 8,8) mit 200 mAmp für 3 Stunden übertragen. Die Blots wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 10 mM Tris (pH 7,5) blockiert, das 100 mM NaCl, 0,01% (Vol/Vol) Tween 20 und 5% fettfreie Trockenmilch enthielt. Die Blots wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 2,5 μg/ml von entweder pan-ras- oder c-fos-Antikörpern in Blockierungspuffer inkubiert. Nach 5-maligem Spülen für 5 Minuten jeweils in Spülpuffer (10 mM Tris [pH 7,5], das 100 mM NaCl und 0,01% [Vol/Vol] Tween 20 enthielt) wurden die Blots für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem Enzymkonjugat anti-Maus Immunglobulin G (IgG)-Meerrettichperoxidase (HRP; pan-ras MAb) oder anti-Kaninchen IgG/HPR (c-fos PAb) inkubiert, verdünnt 1 : 2.000 in Blockierungspuffer als sekundärer Antikörper. Die Immunoblots wurden erneut fünfmal für jeweils 5 Minuten in Spülpuffer gespült und über ein verstärktes Chemilumineszenzverfahren immunodetektiert (ECL Western Blotting-Detektionssystem, Amersham Life Science, Buckinghamshire, England). Abschätzungen des Molekulargewichts beruhten auf Vergleichen mit vorangefärbten Molekulargewichtsmarkern (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), die auf Nitrocellulose übertragen wurden. Autoradiographischer Film (X-OMAT AR, Eastman Kodak, Rochester, NY) wurde für 10, 15 oder 60 Sekunden mit den Immunoblots belichtet.
  • Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
  • Monolayer wurden zweimal mit DPBS gewaschen, und Zellen wurden mit 4 M Guanidinthiocyanat, 50 mM Natriumcitrat, 0,05% Sarkosyl und 0,01 M Dithiothreit lysiert. Nach dem Abschaben wurden die Lysate mit vier Durchleitungen durch eine 22 gauge-Nadel geschert. RNA wurde durch Ultrazentrifugieren durch 5,7 M Cäsiumchlorid und 0,1 M EDTA pelletisiert. Siehe Verfahren von S. Becker, H. S. Koren und D. C. Henke, "Interleukin-8 expression in normal nasal epithelium and its modulation by infection with respiratory syncytial virus and cytokines tumor necrosis factor, interleukin-1, and interleukin-6", Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 820–27 (1993).
  • RNA (100 ng) wurde unter Verwendung von M-MLV reverser Transkriptase revers transkribiert. Die resultierende cDNA wurde für 29 und 36 Zyklen für β-Actin bzw. c-fos PCR-amplifiziert, wobei genspezifische sense- und antisense-Primer aus der Ratte auf Basis von Sequenzen verwendet wurden, die aus GenBank bestimmt wurden und veröffentlicht sind in: R. Dashtaki, A. R. Whorton, T. M. Murphy, W. Reed und T. P. Kennedy, "Dehydroepiandrosterone und analogs inhibit DNA Bindung of AP-1 and airway smooth muscle proliferation", J. Pharmacol. Exper. Ther. 1998, im Druck. PCR-amplifizierte DNA wurde an 2%igem denaturierendem Agarosegel, interkaliert mit Ethidiumbromid, getrennt und unter UV-Licht visualisiert und fotografiert. Das resultierende Polaroidnegativ wurde unter Verwendung eines Bio Image Analyzer (Bio Image, Ann Arbor, MI) quantifiziert. Die Intensität der β-Actin-cDNA-Banden (ein konstitutives Gen, das von Stimulation mit FBS unbeeinflusst ist) für jede Probe wurde dann verwendet, um Unterschiede zwischen den Proben zu normalisieren.
  • Gelretardationstest (EMSA).
  • Monolayer wurden zweimal in kaltem DPBS gewaschen und 10 Minuten auf Eis mit 0,7 ml von kaltem cytoplasmatischem Extraktionspuffer (CEB) (10 mM Tris, pH 7,9, 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 1 mM Dithiothreit) mit Proteaseinhibitoren (PI) (1 mM Pefabloc, 50 μg/ml Antipain, 1 μg/ml Leupeptin, 1 μg/ml Pepstatin, 40 μg/ml Bestatin, 3 μg/ml E-64 und 100 μg/ml Chymostatin) äquilibriert. Das Detergens Nonidet P-40 (NP-40) wurde auf eine Endkonzentration von 0,1% hinzugegeben, und die Zellen wurden mit einem Zellschaber abgelöst. Kerne wurden durch Zentrifugieren pelletisiert und mit CEB/PI gewaschen. Die Kerne wurden dann für 10 Minuten auf Eis in einem Kernextraktionspuffer (NEB) (20 mM Tris, pH 8,0, 400 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1,5 mM EDTA, 1 mM Dithiothreit und 25% Glycerin) mit PI inkubiert, kurz zentrifugiert, um Trümmer zu klären, und bei –80°C bis zur Durchführung der Gelretardationstests gelagert. Die EMSAs setzten consensus-Sequenzen vom Wildtyp (5'-TTCCGGCTGACTCATCAAGCG 3' und 3' AAGGCCGACTGAGTAGTTCGC 5') für AP-1 ein (Lee et al. (1987), oben), endmarkiert durch Phosphorylierung mit [γ32P]-ATP und T4-Polynucleotidkinase.
  • DNA-Proteinbindungsreaktionen wurden mit 2 μg von Kernprotein (gemäß Bestimmung durch das Bradford-Farbstoffbindungsverfahren) und 0,3 ng von 32P-endmarkierter doppelsträngiger DNA-Sonde durchgeführt, inkubiert für 10 Minuten bei Raumtemperatur in 10 mM Tris, pH 7,9, 50 mM NaCl, 2,5 mM EDTA, 1 mM Dithiothreit, 5 μg Rinderserumalbumin, 0,1 μg Poly-dI-dC und 4% Ficoll. Konkurrenzexperimente wurden mit 10× unmarkierten Oligonucleotidsequenzen vom Wildtyp durchgeführt. Die Proben wurden an einem 5%igen nicht-denaturierenden Polyacrylamidgel in Tris-Glycin-EDTA-Puffer (TGE, 120 mM Glycin und 1 mM EDTA in 25 mM Tris, pH 8,5) der Elektrophorese unterzogen. Die Gele wurden getrocknet und durch Kontakt mit einem Phosphorimaging-Schirm analysiert (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).
  • Wirkung auf Kontraktion der bronchialen glatten Muskulatur in vitro.
  • Zur Untersuchung der Wirkung von DHEA auf die bronchiale glatte Muskulator in vitro wurden männliche Hartley-Meerschweinchen (Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) mit Natriumpentobarbital anästhesiert (Pentobarbitalnatrium (Abbott Laboratories), 200 mg/kg intraperitoneal). Dann wurden Luftröhre und Lungen schnell entfernt und in Sauerstoff gesättigte Krebs-Henseleit-Lösung (K-H) getaucht, die enthielt (mM): 115 NaCl, 25 NaHCO3, 1,38 NaH2PO4, 2,5 KCl, 2,46 MgSO4, 1,9 CaCl2 und 5,56 Dextrose, belüftet mit 95% O2 und 5% CO2.
  • Die Hauptbronchen wurden von losem Bindegewebe unter einem Stereomikroskop (Olympus SZH10) freiseziert, und Bronchialringe wurden erhalten und in doppelwandigen Organbädern fixiert, die mit K-H bei 37°C gefüllt waren und kontinuierlich mit einer Gasmischung aus 95% O2 und 5% CO2 belüftet wurden, was einen pH von 7,4 erzeugte. Die Bronchialringe wurden mit Kraftaufnehmern (Grass FT03) zur kontinuierlichen Aufzeichnung der isometrischen Spannung auf einem Papierpolygraphen (Gould RS3800) verbunden und für 90 Minuten äquilibrieren gelassen. Nach dem Äquilibrierungszeitraum wurde 1 mM Acetylcholin verabreicht und die Reaktion überwacht. Zubereitungen, die nicht auf Acetylcholin reagierten, wurden zurückgewiesen, die Bronchialringe mit frischem K-H gespült und die Experimente fortgesetzt.
  • Bronchialringe wurden partiell mit 3 × 10–2 M KCl oder 10–5 M Acetylcholin (ACh) kontrahiert, dann wurde die Wirkung von DHEA durch kumulative Erhöhung seiner Konzentration in logarithmischen Intervallen von 10–8 auf 10–4 M und durch Messung der als aktive Spannung erzeugten Veränderungen untersucht.
  • Eine Konzentration von 3 × 10–2 M KCl wurde auf der Basis von vorläufigen Experimenten gewählt, in denen sie aus Konzentrations-Reaktions-Kurven auf KCl (10–2 – 10–1 M) als die Konzentration von KCl bestimmt wurde, die 50% der maximalen Reaktion (KCl-EC50) im experimentellen Aufbau hervorruft. Die maximale Reaktion auf KCl wurde bei einer Konzentration von 6,2 × 10–2 M (geometrischer Mittelwert, GSEM = 1,21) erhalten, während KCl-EC50 2,8 × 10–2 M betrug (geometrischer Mittelwert, GSEM = 1,28). In ähnlicher Weise wurde 10–5 M Acetylcholin (ACh) als die ACh-Konzentration gewählt, die 50% der maximalen Reaktion hervorruft.
  • Die Verabreichung von 3 × 10–2 M KCl erzeugte eine kontraktile Reaktion, die langsam nach 9 Stunden abfiel, d. h. (die zur Vervollständigung der Konzentrations-Wirkungs-Kurve für DHEA erforderliche Zeit) 22,12 ± 6,07% (n = 3) niedriger als die anfänglich aktive Kraft. Keine Abnahme der kontraktilen Reaktion wurde nach Verabreichung von 10–5 M Acetylcholin beobachtet.
  • Da DHEA in Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst war, wurden vier zusätzliche Ringe mit 3 × 10–2 M KCl (n = 5) oder 10–5 M ACh (n = 5) zur Bestimmung kontrahiert, ob dieser Träger eine mögliche Veränderung der aktiven Kraft erzeugte. Die gleiche Menge von DMSO, die in den DHEA-Experimenten verwendet wurde, wurde verabreicht, und es wurde festgestellt, dass nach 4 Stunden die als Reaktion auf 3 × 10–2 KCl erzeugte aktive Spannung um 31,13 ± 7,21% reduziert war, was hauptsächlich durch den oben beschriebenen Zeiteffekt verursacht wird. Keine Wirkung von DMSO wurde auf die als Reaktion auf 10–5 M ACh erzeugte aktive Spannung beobachtet. Die maximale Endkonzentration von DMSO im Organbad betrug 0,15%.
  • Drei der zur Untersuchung von DHEA verwendeten Streifen wurden mit frischem K-H am Ende des Experiments gespült, mit 1 mM Acetylcholin behandelt und die Reaktion überwacht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Funktionalität der glatten Muskulatur durch DHEA nicht verändert war.
  • In einem zweiten Satz von Experimenten wurde entweder eine Einzeldosis von 10–5 M ACh verabreicht, oder eine Konzentrations-Reaktions-Kurve auf ACh wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von 10–4 M DHEA (verabreicht 15 Minuten vor ACh) durchgeführt. Die Einzeldosis von ACh wurde zur Messung der Geschwindigkeit der Spannungsentwicklung verwendet, während die Konzentrations-Reaktions-Untersuchung zur Auswertung verwendet wurde, ob DHEA die Empfindlichkeit gegenüber ACh beeinflusste.
  • Wirkung auf Cytokinsekretion durch humanes Atemwegsepithel in vitro
  • Die Wirkung von 16α-BrEA auf die Cytokinsekretion durch kultiviertes humanes Epithel wurde in BEAS-2B-Zellen untersucht, einer SV-40 unsterblich gemachten humanen Atemwegsepithel-Zelllinie, die zuvor als Modell dafür untersucht worden ist, wie das humane Atemwegsepithel proinflammatorische Cytokine als Reaktion auf Viren und Luftverunreinigungen sekretiert (M. C. Subasuste, D. B. Jacoby, S. M. Richards und D. Proud, "Infection of a human respiratory epithelial cell line with rhinovirus. Induction of cytokine release and modulation of susceptibility to infection by cytokine exposure", J. Clin. Invest. 967: 549–557, 1995; T. L. Noah und S. Becker, "Respiratory syncytial virus-induced cytokine production by a human bronchial epithelial cell line", Am. J. Physiol. 265: L472–L478, 1993; R. B. Devlin, K. P. McKinnon, T. Noah, S. Becker und H. S. Koren, "Ozoneinduced release of cytokines and fibronectin by alveolar macrophages and airway epithelial cells", Am. J. Physiol. 266 (Lung Cell. Mol. Physiol. 10): L612–L619, 1994). BEAS-2B-Zellen wurden zur Konfluenz in Kunststoffplatten mit 12 Vertiefungen gezüchtet und für 1 Stunde mit 16α-Bromepiandrosteron (BrEA) in den angegebenen Konzentrationen oder Dimethylsulfoxidträger (5 μl) vorbehandelt. Die Zellen wurden dann stimuliert mit Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα, 40 ng/ml) oder Residual Oil Fly Ash (ROFA, der Restölflugasche, 50 μg/ml), einer teilchenförmigen Luftverschmutzung, die dafür bekannt ist, die Cytokinsekretion durch Inhibierung von Membranphosphatasen zu stimulieren (J. M. Samet, J. Stonehuerner, W. Reed, R. B. Devlin, L. A. Dailey, T. P. Kennedy, P. A. Bromberg und A. J. Ghio, "Disruption of protein tyrosine phosphate homeostasis in human bronchial epithelial cells exposed to residual oil fly ash", Am. J. Physiol. 272 (Lung Cell. Mol. Physiol. 16): L426–L432, 1997). Nach 29 h (für TNF-stimulierte Zellen) oder 6 h (für ROFA-stimulierte Zellen) wurden die Medien aufgefangen und zur Entfernung von Trümmern zentrifugiert. Die Konzentration von Interleukin-8 (IL-8) wurde durch kommerzielles ELISA (A&D Systems) getestet.
  • Statistische Analyse. Die Daten werden als Mittelwerte ± Standardfehler (SEM) ausgedrückt, ausgenommen wenn anders angegeben. Die minimale Anzahl von Wiederholungen für Messungen in Untersuchungen der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur betrug 9, wenn nichts anderes angegeben ist. Wiederholungen von 4–6 Experimenten pro Behandlungsgruppe wurden untersucht, ausgenommen wenn angegeben. Unterschiede zwischen multiplen Gruppen wurden unter Verwendung einer einfachen Varianzanalyse für wiederholte Messungen verglichen. Der verwendete Logiktest war der multiple Newman-Keuls-Vergleichstest. Unterschiede zwischen zwei Gruppen wurden unter Verwendung des zweiseitigen Student-t-Test gemessen. Die Signifikanz wurde zu p < 0,05 angenommen.
  • Tabelle I Prozentuale Inhibierung von Glucose-6-phosphatdehydrogenase-Aktivität durch DHEA und 16α-BrEA
    Figure 00210001
  • Aktivität wird als prozentuale Inhibierung von DMSO-Trägerbehandelten Kontrollen durch 16α-Bromepiandrosteron (BrEA) oder Dehydroepiandrosteron (DHEA) ausgedrückt. DMSO allein verursachte keine Reduktion der G6PDH-Aktivität unter den Testbedingungen. Jeder Balken stellt den Mittelwert von wenigstens 3 Experimenten dar. Die Verfahren werden im Text beschrieben. Untersuchungen von Glucose-6-phosphatdehydrogenase aus humanem Erythrozyten (G6PDH) wurden mit 0,01 E/ml von Typ XXVI G6PDH aus humanen Erythrozyten (Sigma) mit hinzugegebenen Inhibitoren durchgeführt. Untersuchungen von G6PDH in Zelllysaten aus glatter Atemwegsmuskulatur wurden an 100 μl von Zelllysat durchgeführt, zu dem keine Inhibitoren zugegeben wurden. Monolayer aus intakter glatter Atemwegsmuskulatur wurden mit Inhibitoren 1 Stunde vor dem Ernten der Zellen und dem Test von G6PDH unter Verwendung von 100 μl Zelllysat vorbehandelt. Alle Untersuchungen wurden dreifach durchgeführt. Tabelle II Wirkung von 16α-Bromepiandrosteron auf die Interleukin-8-Sekretion durch kultiviertes humanes Atemwegsepithel
    TNF-stimulierte BEAS-Zellen IL-8 (pg/ml)
    Kontrollmedium 34 ± 4
    TNF 141 ± 29
    TNF + DMSO 93 ± 14
    TNF + BrEA 2 μM 104 ± 31
    TNF + BrEA 10 μM 52 ± 18
    TNF + BrEA 50 μM 27 ± 2
    ROFA-stimulierte BEAS-Zellen
    Kontrollmedium 36 ± 1
    ROFA 889 ± 150
    ROFA + DMSO 410 ± 18
    ROFA + BrEA 25 μM 123 ± 5
  • BEAS-2B-Zellen, eine SV-40 unsterblich gemachte humane Atemwegsepithel-Zelllinie, wurden zur Konfluenz in Kunststoffplatten mit 12 Vertiefungen gezüchtet und für 1 h mit 16α-Bromepiandrosteron (BrEA) in den angegebenen Konzentrationen oder mit Dimethylsulfoxidträger (5 μl) vorbehandelt. Die Zellen wurden dann stimuliert mit Tumornekrosefaktoralpha (TNFα, 40 ng/ml) oder Residual Oil Fly Ash (ROFA, 50 μg/ml), einer teilchenförmigen Luftverschmutzung, die dafür bekannt ist, die Cytokinsekretion durch Inhibierung von Membranphosphatasen zu stimulieren. Nach 24 Stunden (für TNF-stimulierte Zellen) oder 6 Stunden (für ROFA-stimulierte Zellen) wurden die Medien aufgefangen und zur Entfernung von Trümmern zentrifugiert. Die Konzentration von Interleukin-8 (IL-8) wurde durch ein kommerzielles ELISA (R&D Systems) getestet. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± Standardfehler von 4–6 Experimenten pro Behandlungsgruppe. DMSO-Träger als Antioxidans reduziert die IL-8-Sekretion (eine bekannte Wirkung), aber BrEA inhibiert sehr viel betonter.
  • Ergebnisse
  • Wirkung auf die Proliferation von glatter Atemwegsmuskulatur
  • Wie in 1 gezeigt wird, korreliert die Abschätzung der Zellzahlen durch MTT-Reduktion eng mit den tatsächlichen Zellzahlen, die unter Verwendung eines Hämozytometers gezählt werden. Die Proliferation von kultivierter glatter Atemwegsmuskulatur wurde unter Verwendung der Stoffwechselreduktion des löslichen gelben Tetrazolium-Farbstoffs 3-[4,5-Dimethylthiazol]-2-yl-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) zu seinem unlöslichen violetten Formazan durch die Wirkung von mitrochondrialer Succinyldehydrogenase quantifiziert. Siehe Hirst et al. (1992), oben. Frisch abgelöste Zellen aus glatter Atemwegsmuskulatur wurden für 1 Stunde in DMEM inkubiert, das 100 μg/ml MTT und 10% FBS enthielt. Die Zellen wurden mit 1.000 g für 10 Minuten zentrifugiert, zweimal mit steriler modifizierter phosphatgepufferter Kochsalzlösung nach Dulbecco ohne Ca2+ oder Mg2+ (DPBS) gewaschen, mit 0,5 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) extrahiert, und die Extinktion des solubilisierten violetten Formazan-Farbstoffs wurde bei 540 nm gemessen. Insgesamt 6 Experimente wurden bei jeder Zellkonzentration durchgeführt. Die Extinktion des MTT-Formazan-Reduktionsprodukts (A540) korrelierte gegenüber den durch das Hämozytometer gezählten Zellzahlen mit R2 = 0,9851.
  • Für Proliferationsuntersuchungen wurden die Zellen in unbeschichtete Kunststoffplatten mit 24 Vertiefungen geimpft und mit DMEM und Mitogenen kultiviert. Nach 24–96 Stunden wurde das Medium gegen 1 ml/Vertiefung von frischem DMEM ausgetauscht, das 100 μg/ml MTT und 0,5% FBS enthielt, und die Platten wurden eine weitere Stunde inkubiert. MTT-haltiges Medium wurde entfernt, die Zellen wurden zweimal mit 1 ml DPBS gewaschen, 0,5 ml DMSO wurde zu jeder Vertiefung hinzugegeben, und die Zellanzahl wurde durch die Extinktion des solubilisierten violetten Formazans bestimmt, gemessen bei 540 nm. FBS förderte das Zellwachstum der glatten Atemwegsmuskulatur in einer dosisabhängigen Weise, wobei der größte Reiz durch 10% FBS geliefert wurde.
  • Die Ergebnisse in 2A zeigen, dass fötales Rinderserum (FBS) ein dosisabhängiges Wachstum von 24 bis 96 Stunden förderte. Jede Beobachtung stellt den Mittelwert von 6 Experimenten mit 15.000 Zellen/Vertiefung dar.
  • Wie in 2B gezeigt wird, stimulierte auch rekombinanter humaner, aus Blutplättchen stammender Wachstumsfaktor-AA (PDGF mit 50 ng/ml) das Zellwachstum, aber war nicht so wirksam wie FBS. Jede Beobachtung stellt den Mittelwert von 6 Experimenten mit 50.000 Zellen/Vertiefung dar.
  • Im nächsten Experiment hemmten DHEA und seine Analoga die Mitogenstimulierte Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur. Die Zellen wurden kultiviert, und Zellanzahlen wurden wie oben und in 2 beschrieben quantifiziert. Ausgenommen wenn angegeben, wurden die Zellen mit entweder 10% FBS oder 50 ng/ml PDGF, 10% FBS oder 50 ng/ml PDGF + 5 μl DMSO-Träger und 10% FBS oder 50 ng/ml PDGF + Inhibitoren in DMSO kultiviert, hinzugegeben zu jeder Vertiefung. 3A zeigt die Wirkung von DHEA und DHEA-Sulfat auf durch 10% FBS stimuliertes Wachstum nach Kultur für 92 Stunden. Jeder Balken stellt die mittlere MTT-Formazan-Extinktion in 6–12 Experimenten dar, erzeugt durch 15.000 Zellen/Vertiefung, die für 92 Stunden kultiviert wurden. Ähnliche Ergebnisse wurden in Experimenten mit 72 Stunden festgestellt. DHEA war aktiver als DHEA-Sulfat bei hohen Konzentrationen.
  • Wie in 3B gezeigt wird, inhibiert DHEA ebenfalls die durch PDGF stimulierte Zellproliferation. Jeder Balken stellt den Mittelwert von 4 Experimenten mit 50.000 Zellen/Vertiefung dar, kultiviert für 72 Stunden.
  • Wie in 3C gezeigt wird, war 16α-Bromepiandrosteron (16α-BrEA) ein noch wirksamerer Inhibitor der FBS-induzierten Zellproliferation als DHEA. Jeder Balken stellt den Mittelwert von 4 Experimenten mit 15.000 Zellen/Vertiefung dar, kultiviert für 96 Stunden. Eine Negativkontrolle, inkubiert mit 0,5% FBS, ist ebenfalls zum Vergleich gezeigt. Ähnliche Ergebnisse wurden in den Experimenten bei 48 Stunden festgestellt.
  • Wie in 3D gezeigt wird, ist 16α-BrEA ebenfalls wirksamer als das Glukokortikoid Dexamethason (50%ige inhibitorische Konzentration = 7,5 μM für 16α-BrEA gegenüber 10 μM für Dexamethanson), speziell bei höheren Konzentrationen. Jeder Balken stellt den Mittelwert von 6–18 Experimenten mit 50.000 Zellen/Vertiefung dar, kultiviert in 10% FBS für 48 Stunden. Ähnliche Ergebnisse wurden in Experimenten beobachtet, die mit Methylprednisolon durchgeführt wurden.
  • Wie in 4A gezeigt wird, wird die Wachstumshemmung von Zellen durch Dehydroepiandrosteron (DHEA) und 16α-Bromepiandrosteron (BrEA) durch Zellzählungen bestätigt. Die Zellen wurden kultiviert, und die Zellzahlen wurden wie oben und in 2 beschrieben quantifiziert. Jeder Balken stellt die mittlere direkte visuelle Zählung von angefärbten Zellen in 6 Experimenten dar, erzeugt durch 15.000 Zellen/Vertiefung, die für 24 Stunden kultiviert wurden.
  • 4B zeigt, dass 16α-Bromepiandrosteron (BrEA) nicht die LDH-Aktivität im Überstand bei 24 Stunden erhöht. In diesem Beispiel wurden Zellen der glatten Atemwegsmuskulatur zur Konfluenz gezüchtet und mit 5 μl/Vertiefung von DMSO-Träger oder 16α-BrEA in Träger für 24 Stunden vor der Messung von LDH-Aktivität im Überstand inkubiert, wobei 1,0 Einheiten 1,0 μmol Pyruvat zu L-Lactat pro Minute bei pH 7,5 bei 37°C reduzieren werden. Jeder Balken stellt den Mittelwert von 6 Experimenten dar. Ähnliche Ergebnisse wurden nach 2 Stunden Inkubation mit Inhibitor beobachtet. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen Zellen, die mit 16α-BrEA behandelt wurden, und denjenigen, die mit DMSO-Träger allein behandelt wurden.
  • DHEA und 16α-BrEA inhibieren die Aktivität von gereinigtem G6PDH aus humanen Erythrozyten und die G6PDH-Aktivität, wenn sie direkt zu Lysaten aus Zellen aus glatter Atemwegsmuskulator gegeben werden, wie in Tabelle 1 gezeigt. Wenn jedoch Monolayer mit Konzentrationen von DHEA oder 16α-BrEA vorbehandelt wurden, die die Zellproliferation inhibierten, war die G6PDH-Aktivität von anschließenden Zelllysaten nicht signifikant reduziert (Tabelle I).
  • Ebenfalls führte die Zugabe von Ribonucleosiden und Desoxyribonucleosiden zu Kulturmedium, im Gegensatz zu den Befunden in bösartigen und unsterblich gemachten Zelllinien, nicht zu einer Umkehr der Wachstumshemmung aus DHEA oder 16α-BrEA (5A–D). Zusammen genommen legen diese Daten nahe, dass DHEA und 16α-BrEA nicht die Proliferation von Zellen der glatten Atemwegsmuskulatur durch Unterbrechung der Hexosemonophosphatnebenschlussabhängigen Bildung von Ribose- und Desoxyribosezuckern beeinträchtigen, die für die RNA- und DNA-Synthese benötigt werden. In diesem Beispiel wurden Zellen wie zuvor kultiviert und quantifiziert. Jeder Balken stellt die mittlere MTT-Formazan-Extinktion in 4 Experimenten mit 50.000 Zellen/Vertiefung dar, kultiviert für 24 Stunden (5A und 5C) oder 48 Stunden (5B und 5D) in DMEM und 10% FBS in Gegenwart oder Abwesenheit von DHEA oder 16α-BrEA und 200 μM Ribonucleosiden (R, Adenosin, Guanosin, Cytidin und Uridin) oder Desoxyribonucleosiden (D, Desoxyadenosin, Desoxyguanosin, Desoxycytidin und Thymidin).
  • Wie in 6A gezeigt wird, konnte die Ergänzung von Medium mit Mevalonsäure nicht die Wachstumsinhibierung von Monolayer aus glatter Atemwegsmuskulatur durch 16α-BrEA ausräumen. In diesem Beispiel wurden Zellen wie zuvor kultiviert und quantifiziert. Jeder Balken stellt die mittlere MTT-Formazan-Extinktion von 6 Experimenten aus 50.000 Zellen/Vertiefung dar, kultiviert für 36 Stunden mit entweder 0,5% FBS, 10% FBS, 10% FBS + 5 μl DMSO-Träger oder 10% FBS + Inhibitoren in DMSO, hinzugegeben zu jeder Vertiefung, in Gegenwart oder Abwesenheit von 6 mM Mevalonat in DMEM. Ähnliche Ergebnisse wurden mit DHEA beobachtet.
  • In 6B wird gezeigt, dass die Behandlung mit 16α-BrEA p21ras in Membranen von kultivierten Zellen aus glatter Atemwegsmuskulatur nicht abreichert. Das gezeigte Gel ist ein repräsentativer Immunoblot von 21 kD Ras-Protein in gleichen Mengen von Membranproteinfraktion aus konfluenten Monolayern, behandelt für 24 Stunden mit 0,5% FBS (Bahn 1), 10% FBS (Bahn 3), 10% FBS + DMSO-Träger (Bahn 5) bzw. 10% FBS + 10 μM 16α-BrEA (Bahn 7). Die Bahnen 2, 4, 6 und 8 sind Immunoblots der entsprechenden Überstandfraktionen. Bahn 9 stellt einen Immunoblot von A431-Zelllysat dar.
  • Schließlich würde erwartet, dass die Wechselwirkung mit der Ras/Raf-vermittelten Signalleitung die Expression von frühen Response-Genen wie c-fos beeinträchtigen würde. Jedoch reduzierte 16α-BrEA nicht die Stimulation von c-fos-Protein (7A) oder -mRNA (7B und 7C), die normalerweise als Reaktion auf 10% FBS beobachtet wird. Diese Ergebnisse legen nahe, dass DHEA und seine Analoga frühe Signalleitungsereignisse nicht beeinträchtigen, die wichtig in der glatten Atemwegsmuskulatur für proliferative Reaktionen sind. 7A ist ein repräsentativer Immunoblot von c-fos-Protein aus Kontroll-Monolayern, die mit 0,5% FBS (Bahn 2) oder 15 Minuten (Bahnen 3–6), 30 Minuten (Bahn 6–8) und 60 Minuten (Bahnen 9–11) nach Stimulation mit 10% FBS behandelt wurden. Zellen in den Bahnen 4, 7 und 10 wurden mit DMSO-Träger 2 h vor der Stimulation vorbehandelt. Zellen in den Bahnen 5, 8 und 11 wurden mit 10 μM 16α-BrEA vorbehandelt. Bahn 1 ist ein Immunoblot von A431-Zelllysat. In 7B waren die PCR-Gele der Experimente wie folgt: Bahnen 1–3, 0,5% FBS, Kontrolle; Bahnen 4–6, 10% FBS, Kontrolle; Bahnen 7–9, 10% FBS, vorbehandelt mit 10 μM 16α-BrEA; Bahnen 10–12, 10% FBS, vorbehandelt mit DMSO-Träger. In 7C gibt es eine Zusammenfassung der in 7B gezeigten Experimente. Die Expression von c-fos-mRNA ist auf das konstitutive Gen β-Actin normalisiert. In 7C ist die Expression von c-fos-mRNA auf das konstitutive Gen β-Actin normalisiert.
  • 8 zeigt elektrophoretische Gelretardationstests von Kernprotein aus Zellen der glatten ΑRtemwegsmuskulator, vorbehandelt mit DHEA oder 16α-BrEA für 2 Stunden vor Stimulation mit 10% FBS. Kernprotein wurde nach 6 Stunden isoliert, und die Gelretardationstests (EMSAs) wurden durchgeführt. Die 8A–8B zeigen repräsentative Gele aus Experimenten, die wenigstens dreimal mit jedem Inhibitor durchgeführt wurden. In 8A, EMSA von Zellen, die mit DHEA vorbehandelt wurden: Bahn 1, 0,5% FBS; Bahn 2, 10% FBS; Bahn 3, 10% FBS + 50 μM DHEA; Bahn 4, 10% FBS + DMSO-Träger. In 8B, EMSA von Zellen, die mit 16α-BrEA vorbehandelt wurden: Bahn 1, 0, 5% FBS; Bahn 2, 10% FBS; Bahn 3, 10% FBS + DMSO-Träger; Bahn 4, 10% FBS + 2 μM 16α-BrEA; Bahn 5, 10% FBS + 10 μM 16α-BrEA (8C). EMSA von Zellen, die mit 10% FBS stimuliert wurden. Die Bindungsreaktion in Bahn 2 wurde mit einer identischen Menge von Kernprotein wie in Bahn 1 durchgeführt, aber in Gegenwart von Konkurrenz aus 10× unmarkierter Oligonucleotidsequenz vom Wildtyp für AP-1. Die Ergebnisse zeigen, dass DHEA (8A) und 16α-BrEA (8B) die DNA-Bindung von AP-1 inhibieren.
  • Wirkung auf die Kontraktion der bronchialen glatten Muskulatur in vitro
  • 9 zeigt die Konzentrations-Wirkungs-Kurve auf DHEA an isolierten Hauptbronchien des Meerschweinchens, die partiell mit 3 × 10–2 M KCl kontrahiert sind. Im Vergleich zu seinem Träger wurde es als statistisch unterschiedlich festgestellt (P < 0,01). Die maximale Konzentration von DHEA verursachte 76,28 ± 6,96% Relaxation der KCl-induzierten Kontraktion (Wert erhalten nach Subtraktion der Reduktion der Kraft aufgrund von Zeit-Träger). Die Konzentration von DHEA, die 50 Relaxation der KCl-induzierten Kontraktion erzeugte, betrug 2,16 × 10–5 M (GSEM = 1,11). In 9 stellen leere Kreise Experimente mit DHEA dar, und leere Quadrate sind mit DMSO-Träger allein. Jeder Punkt ist ein Mittelwert ± SEM. n = 6 für DHEA, n = 5 für DMSO-Träger.
  • 10 zeigt die Wirkung von DHEA auf Bronchien, die teilweise mit 10–5 M ACh kontrahiert sind. 10–4 M DHEA verursachte 37,98 ± 4,76% Relaxation der ACh-induzierten Kontraktion (P < 0,01 im Vergleich mit seinem Träger). In 10 stellen leere Kreise Experimente mit DHEA dar, und leere Quadrate sind mit Träger allein. Jeder Punkt ist ein Mittelwert ± Standardwert und n = 5.
  • Die Konzentrations-Reaktions-Kurve für ACh wurde durch die Gegenwart von 10–4 M DHEA nach rechts verschoben (11). Die ACh-EC50-Werte betrugen 1,4 × 10–5 M (geometrischer Mittelwert GSEM = 1,2) bzw. 8,4 × 10–6 M (geometrischer Mittelwert GSEM = 1,3) in Gegenwart und Abwesenheit von 10–4 M DHEA (P < 0,05). In 11 stellen leere Kreise die Gegenwart und leere Quadrate die Abwesenheit von 10–4 M DHEA dar. Jeder Punkt ist ein Mittelwert ± SEM und n = 5.
  • Schließlich reduzierte 10–4 M DHEA die Geschwindigkeit der Spannungsentwicklung als Reaktion auf 10–5 ACh von 2,27 ± 0,82 auf 1,85 ± 0,85 (P < 0,05 gemäß t-Test für verbundene Stichproben).
  • Wirkung auf Interleukin-8-Sekretion durch humanes Atemwegsepithel in vitro
  • Wie in Tabelle II gezeigt wird, verursachte 16α-BrEA eine dosisabhängige Inhibierung der Interleukin-8-(IL-8)-Sekretion als Reaktion auf die Stimulation von BEAS-Zellen mit entweder TNF, einem wirksamen proinflammatorischen Cytokin, das in vielen akuten Lungenkrankheiten vorhanden ist, einschließlich Asthma, oder teilchenförmiger Luftverunreinigung. DMSO-Träger als Antioxidans reduziert die IL-8-Sekretion (eine bekannte Wirkung), aber BrEA inhibiert sie viel stärker betont.
  • Es wurde gezeigt, dass die Proliferation von Zellen der glatten Atemwegsmuskulatur aus der Ratte substantiell durch Behandlung mit pharmakologischen Konzentrationen von DHEA und 16α-Bromepiandrosteron reduziert wird (3). Diese Inhibierung wurde sowohl durch einen Stoffwechseltest in Bezug auf die Zellanzahl als auch durch eine Reduktion der direkt vorgenommenen visuellen Zellzählungen gezeigt (4A).
  • Zusätzlich inhibieren DHEA und 16α-BrEA die G6PD-Aktivität, wenn sie direkt zu einer Reaktionsmischung gegeben werden, die gereinigtes Enzym oder Zelllysat enthält (Tabelle I). Jedoch inhibierten DHEA und 16α-BrEA nicht die G6PD-Aktivität, wenn Zell-Monolayer selbst vor der Enzymernte behandelt wurden (Tabelle I). Ebenfalls war DHEA wirksamer als 16α-BrEA als Inhibitor der G6PD-Aktivität in Zelllysat, aber das genaue Gegenteil galt für die zwei Mittel als Inhibitoren der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur (3). Zusätzlich wird angenommen, dass die G6PD-Inhibierung das Zellwachstum durch Wechselwirkung mit der Produktion von Ribose- und Desoxyribosezuckern beeinträchtigt, die für die RNA- und DNA-Synthese benötigt werden, aber die exogene Bereitstellung dieser Faktoren durch Addition von Ribo- und Desoxyribonucleosiden zum Wachstumsmedium verhinderte die Ausräumung der Inhibierung des Wachstums durch DHEA und 16α-BrEA. Daher ist der Mechanismus der Inhibierung der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur durch DHEA und 16α-BrEA wahrscheinlich keine Wechselwirkung mit der G6PD-Aktivität.
  • Die Addition von Mevalonat zu Kulturmedium räumte die wachstumshemmenden Wirkungen von 16α-BrEA nicht aus (6A), noch reicherte die 16α-BrEA-Behandlung von Zellen das Ras-Protein aus Zellmembranen ab (6B). Ebenfalls ließ die Behandlung von Monolayern mit wachstumshemmenden Konzentrationen von 16α-BrEA die normale Expression des frühen Response-Gens c-fos intakt (8), was einen weiteren Hinweis liefert, dass DHEA und seine Analoga nicht die wichtigen Ras-vermittelten Signalleitungsereignisse beeinträchtigten oder die Funktion des MAP-Kinase-Reaktionsweges unterbrachen. Diese Daten legen nahe, dass DHEA und seine Analoga nicht das Wachstum der glatten Atemwegsmuskulatur durch Wechselwirkung mit der Cholesterin-Biosynthese und, sekundär, die Ras-Anhaftung an Zellmembranen und die Ras-vermittelte Signalleitung, die für das Wachstum notwendig ist, inhibieren.
  • DHEA und 16α-BrEA verringern die DNA-Bindung des Transkriptionsfaktors AP-1 in Gelretardationstests, die mit Kernprotein aus behandelten Zellen durchgeführt werden (9). Die Transaktivierung von sekundären Response-Genen durch Aktivatorprotein-1 (AP-1) ist ein wichtiger Punkt der Konvergenz von multiplen Reaktionswegen, durch die viele Wachstumsfaktoren die Zellproliferation stimulieren (P. Angel und M. Karin, "The role of Jun, Fos and the AP-1 complex in cell-Proliferation and transformation", Biochim. Biophys. Acta 1072: 129–157, 1991). Es wurde gezeigt, dass die Transrepression von AP-1 zu den antiproliferativen Wirkungen von Glukokortikoiden beiträgt (S. Heck, M. Kullmann, Al. Gast, H. Ponta, H. J. Rhamsdorf, Pl. Herrlich und A. C. B. Cata, "A distinct modulating domain in glucocorticoid receptor monomers in the repression of activity of the transcription factor AP-1", EMBO J. 17: 4087–4095, 1999). Obwohl DHEA kein Glukokortikoid ist, wurde auch von ihm berichtet, dass es mit cytoplasmatischen Steroidrezeptoren wechselwirkt (A. W. Meikel, R. W. Dorchuck, B. A. Araneo, J. D. Stringham, T. G. Evans, S. L. Spruance und R. A. Daynes, "The presence of a dehydroepiandrosterone-specific receptor binding complex in murine T cells", J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 42: 293–304, 1992). Daher ist es wahrscheinlich, dass DHEA und seine Analoga ebenfalls mit der DNA-Bindung von AP-1 wechselwirken, wodurch AP-1-vermittelte Signalleitungsprozesse unterbrochen und proliferative Reaktionen auf eine große Vielzahl von Mitogenen, einschließlich PDGF und denjenigen, die in fötalem Rinderserum gefunden werden, inhibiert werden. Die Unterbrechung von AP-1-Reaktionen liefert daher die beste Erklärung dafür, wie DHEA und Analoga die Proliferation der glatten Muskulatur beeinträchtigen.
  • Zusätzlich zur Verhinderung der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur und zur Umgestaltung können DHEA und seine Analoga andere potentielle therapeutische Vorzüge bei Asthma aufweisen könnten.
  • Zuerst könnten DHEA und seine Analoga nützlich als Glukokortikoidsparende Mittel sein. Es wurde angenommen, dass erworbene Glukokortikoidresistenz zum Teil durch eine Cytokin-induzierte Überexpression von AP-1-Komplexen auftritt, die den aktivierten Glukokortikoidrezeptorkomplex binden und transreprimieren (Adcock, Lane et al. (1995), oben). Der DHEA- oder Analogon/Rezeptor-Komplex könnte stattdessen als Aufopferung AP-1 binden, wodurch aktivierte Glukokortikoidrezeptoren zur Anbindung an GREs freigesetzt werden, wodurch die relative Glukokortikoidresistenz des Entzündungszustands ausgeräumt wird.
  • Zweitens können DHEA oder seine Analoga eine antiinflammatorische Aktivität als solche aufweisen. Viele immunregulatorische Gene enthalten AP-1-Promotorstellen, und die Inhibierung von AP-1 könnte negativ die Expression von proinflammatorischen Cytokinen beeinflussen. Ebenfalls wurde berichtet, dass DHEA die Aktivierung des Transkriptionsfaktors Kernfaktor κB (NF-κB) reduziert (Y. U. Yang, A. Schwartz und E. E. Henderson, "Inhibition of HIV-1 latency reactivation by dehydroepiandrosterone (DHEA) and an analog of DHEA", AIDS Res. Hum. Retroviruses, 9, 747–754 (1993)). Es wurde ebenfalls festgestellt, dass 16α-BrEA die Tumornekrosefaktor- und durch teilchenförmige Luftverunreinigung stimulierte Sekretion von Interleukin-8 durch kultiviertes humanes Atemwegsepithel reduziert (Tabelle II). Man würde erwarten, dass die Reduktion der Sekretion von proinflammatorischen Cytokinen die gesamten inflammatorischen Reaktionen innerhalb der asthmatischen Atemwege reduziert.
  • Drittens kann DHEA, da es als Ca2+-aktivierter K+-Kanal-(KCa)-Öffner funktioniert (W. Peng, J. R. Hoidal und 2.5. Farrukh, "Dehydroepiandrosterone, a novel Ca2+-activated K+ channel opener", Am. Rev. Respir. Crit. Care Med., 155, A790 (1997, Zusammenfassung)), systemisch (M. Barbagallo, J. Shan, P. K. T. Pang und L. M. Resnick, "Effects of dehydroepiandrosterone sulfate on cellular calcium responsiveness and vascular contractility", Hypertension 26, 1065–1069 (1995)) und pulmonal arteriell (I. S. Farrukh, W. Peng, U. Orlinska und J. R. Hoidal, "Dehydroepiandrosterone-mediated pulmonary vasodilation of hypoxic ferret lungs: a novel mechanism", Am. J. Respir. Crit. Care Med., 153, A586 (1996, Zusammenfassung)) Gefäße relaxieren, die durch eine Vielzahl von Agonisten kontrahiert sind, und es kehrt die KCl-induzierte Kontraktion der -trachealen glatten Muskulatur des Meerschweinchens um. Dadurch besitzt DHEA eine direkte Bronchodilatatoraktivität in der glatten Atemwegsmuskulatur. Ebenfalls können DHEA und Analoga synergistisch mit β-adrenergen Bronchodilatatoren zur Relaxation der glatten Atemwegsmuskulatur sein. KCa-Kanäle werden als wichtige Zielproteine für die β-2-Adrenozeptoragonist-induzierte Relaxation impliziert (H. Kume, A. Takail, H. Tokuno und T. Tomita, "Regulation of Ca2+-dependent K+-channel activity in tracheal myocytes by phosphorylation", Nature, 341, 152 (1989); T. R. Jones, L. Charette, M. L. Garcia und G. J. Kaczorowski, "Selective inhibition of relaxation of guinea-pig trachea by charybdotoxin, a potent Ca++-activated K+ channel inhibitor", J. Pharmacol. Exp. Ther.; 255, 697 (1990); M. Miura, M. G. Belvisi, C. D. Stretton, M. H. Yacoub und P. J. Barnes, "Role of potassium channels in bronchodilator responses in human airways", Am. Rev. Respir. Dis., 146: 132, 1992; H. Kume, M. P. Grazizno und M. I. Kotlikoff, "Stimulatory and inhibitory regulation of calcium-activated potassium channels by guanine nucleotide-binding proteins", Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 89, 110551 (1992)). Diese Kanäle sind dicht in den Zellmembranen der glatten Atemwegsmuskulatur in Menschen verteilt (V. A. Snetkov, S. J. Hirst, C. H. C. Twort und J. P. T. Ward, "Potassium currents in human freshly isolated bronchial smooth muscle cells", Br. J. Pharmacol., 115, 1117 (1995)).
  • Beta-Agonisten öffnen KCa-Kanäle entweder durch Erhöhung von intrazellulärem cAMP, wodurch Proteinkinase A aktiviert wird, was wiederum das KCa phosphoryliert (H. Kume, A. Takail, H. Tokuno und T. Tomita, "Regulation of Ca2+-dependent K+-channel activity in tracheal myocytes by phosphorylation", Nature, 341, 152 (1989)), oder beta-Agonisten stimulieren die KCa-Aktivität durch einen G-Protein-abhängigen, Proteinkinase A-unabhängigen Mechanismus (A. Yatani, J. Codina, Y. Imoto, J. P. Reeves, L. Birnbaumer und A. M. Brown, "A G protein directly regulates mammalian cardiac calcium channels", Science, 238, 1288 (1987); A. Yatanni, Y. Imoto, J. Codina, S. L. Hamilton, A. M. Brown und L. Birnbaumer, "The stimulatory G protein of adenylylcyclose, GS also stimulates dihydropyridine-sensitive Ca2+ Channels. Evidence of direct regulation independent of phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase or stimulation by a dihydropyridine agonist", J. Biol. Chem., 263, 9987 (1988)). Beide beta-Agonist-abhängigen Mechanismen sind anfällig für die Inhibierung durch Phänomene wie die beta-Rezeptor-Desensibilisierung, ein verbreitetes Problem bei entzündeten Atemwegen von Asthmatikern. DHEA würde einen "Umgehungs"-Ansatz hin zur direkten Aktivierung von KCa-Kanälen bieten, ohne dass man durch beta-Agonist-Rezeptor-Wechselwirkungen gehen muss. Dies könnte besonders nützlich bei dem akuten Asthmatiker sein, der bereits relativ unempfindlich für die bronchiale Relaxation durch beta-Agonisten ist.
  • Eine vagal induzierte Atemwegshyperreaktivität bei Asthma wird durch das Versagen der Funktion des neuronalen M2-Muskarin-Rezeptors auf die Vagusnerben verursacht. Die Rezeptoren funktionieren normalerweise unter Inhibierung der Acetylcholinfreisetzung aus dem Vagus, wodurch die vagal induzierte Bronchokonstriktion eingeschränkt wird. Bei Asthma funktionieren neuronale M2-Muskarin-Rezeptoren nicht (L. E. Ayala und T. Ahmed, "Is there loss of a protective muscarinic receptor in asthma?", Chest. 96, 1285–1291 (1989); P. Minette und P. J. Barnes, "Prejunctional inhibitory muscarinic receptors in cholinergic nerve terminals in human and guinea-pig airways", J. Appl. Physiol., 64, 2532–2537 (1988)), was dazu führt, dass etwaige reizende stimulierende vagale Reflexe eine übertriebene Bronchokonstriktion im Asthmapatienten erzeugen. Durch Inhibierung der Acetylcholin-induzierten Bronchokonstriktion könnten DHEA und seine Analoga eine generalisierte vagal vermittelte Atemwegshyperreaktivität bei Asthma reduzieren, die insgesamt zu den asthmatischen Symptomen beiträgt.
  • Schließlich steigert die DHEA-Behandlung in vitro die T-Lymphozyten-Produktion von Interleukin-2 (Meikle et al. (1992), oben, die die Möglichkeit ansprechen, dass DHEA oder Analoga die Umkehrung von asthmatischen Atemwegslymphozyten vom TH2- zurück zum TH1-Zustand fördern könnten. Siehe D. S. Robinson, Q. Hamid, S. Ying, A. Tsicopoulos, J. Barkans, A. M. Bentley, C. Corrigan, S. R. Durham und A. B. Kay, "Predominant TH2-like bronchoalveolar T-lymphocyte population in atopic asthma", N. Engl. J. Med., 326, 298–309 (1992)).
  • Es wurde gezeigt, dass auf der Basis der antiproliferativen Wirkungen DHEA und seine Analoga einen Nutzen als Behandlung zur Umgestaltung der glatten Atemwegsmuskulatur im Menschen bieten. Ein Vorteil dieser Mittel gegenüber Glukokortikoiden ist ihr schwach anaboles und anti-Glukokortikoid-Spektrum von Wirkungen. Siehe W. Regelson und M. Kalimi, "Dehydroepiandrosterone (DHEA) – the multifunctional steroid. II. Effects on the CNS, cell proliferation, metabolic and vascular, clinical and other effects. Mechanism of action?", Ann. N. Y. Acad. Sci., 719, 564–575 (1994). Daher könnten DHEA oder seine Analoga sogar vielleicht einen neuen Ansatz zur Behandlung von Atemwegskrankheiten ohne die nachteiligen Langzeitkonsequenzen der Kortikosteroid-Verwendung auf den Blutdruck oder auf den Glucose- und Knochenstoffwechsel liefern.

Claims (26)

  1. Verwendung einer Verbindung mit der folgenden Formel:
    Figure 00330001
    worin X Halogen, Hydroxy oder Wasserstoff ist; Y Wasserstoff ist; Z Wasserstoff ist; in der Herstellung eines Medikaments, das eine pharmazeutisch wirksame Menge der Verbindung umfasst, zur Behandlung von chronischem Asthma eines daran leidenden Tieres.
  2. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Verbindung aus einem Vertreter der Gruppe ausgewählt ist, die aus 16α-Brom-5-androsten-17-on, 16β-Brom-5-androsten-17-on, 16α-Fluor-5-androsten-17-on, 16β-Fluor-5-androsten-17-on, 16α-Brom-5-androstan-17-on, 16β-Brom-5-androstan-17-on, 16α-Fluor-5-androstan-17-on und 16β-Fluor-5-androstan-17-on besteht.
  3. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin eine wirksame Menge der Verbindung 2 bis 10 mg/kg/Tag beträgt.
  4. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Verbindung 16-Brom oder ein fluoriertes Analogon ist und die wirksame Menge der Verbindung 0,2 bis 2 mg/kg/Tag beträgt.
  5. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das Medikament zur Verabreichung durch Aerosolisierung formuliert ist.
  6. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das Medikament zur Verabreichung durch einen Dosierinhalator formuliert ist.
  7. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das Medikament zur Verabreichung durch einen Pulverdosisinhalator formuliert ist.
  8. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das Medikament zur Verabreichung durch Inhalation von Wirkstoff formuliert ist, der als Teil eines Liposomenträgers formuliert ist.
  9. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das Medikament zur Verabreichung der Verbindung direkt in die Atemwege formuliert ist.
  10. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das Medikament zur Unterdrückung von Bronchokonstriktion ist.
  11. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das Medikament zur Unterdrückung von Asthma-bezogener Sekretion von inflammatorischen Cytokinen durch das Atemwegsepithel ist.
  12. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das Medikament zur Unterdrückung von Acetylcholin-vermittelter vagaler Atemwegshyperaktivität bei Asthma ist.
  13. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin das Medikament zur Potenzierung der Bronchodilatatoraktivität von β-Agonist-Bronchodilatatoren ist.
  14. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Verbindung 16a-Fluor-5-androsten-17-on ist.
  15. Verwendung gemäss Anspruch 1, worin die Verbindung 16α-Fluor-5-androstan-17-on ist.
  16. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00340001
    Figure 00350001
    worin X Halogen, Hydroxy oder Wasserstoff ist; Y Wasserstoff ist; Z Wasserstoff ist; in der Herstellung eines Medikaments, das eine pharmazeutisch wirksame Menge der Verbindung umfasst, zur Inhibierung der Proliferation der glatten Atemwegsmuskulatur in der Behandlung von Asthma eines Tieres.
  17. Verwendung einer Verbindung der Formel:
    Figure 00350002
    worin X Halogen, Hydroxy oder Wasserstoff ist; Y Wasserstoff ist; Z Wasserstoff ist; in der Herstellung eines Medikaments, das eine pharmazeutisch wirksame Menge der Verbindung umfasst, zur Inhibierung der DNA-Bindung von AP-1 in der Behandlung von Asthma eines Tieres.
  18. Verwendung gemäss Anspruch 17, worin das Medikament zur Reduktion der Glukokortikoidunempfindlichkeit bei Asthma durch Inhibierung von AP-1 ist.
  19. Verwendung gemäss Anspruch 16 oder 17, worin die Verbindung aus einem Vertreter der Gruppe ausgewählt ist, die aus 16α-Brom-5-androsten-17-on, 16β-Brom-5-androsten-17-on, 16α-Fluor-5-androsten-17-on, 16β-Fluor-5-androsten-17-on, 16α-Brom-5-androstan-17-on, 16β-Brom-5-androstan-17-on, 16α-Fluor-5-androstan-17-on und 16β-Fluor-5-androstan-17-on besteht.
  20. Verwendung gemäss Anspruch 19, worin die Verbindung 16α-Fluor-5-androsten-17-on oder 16α-Fluor-5-androstan-17-on ist.
  21. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 16 bis 20, worin das Medikament zur Verabreichung durch Aerosolisierung formuliert ist.
  22. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 16 bis 20, worin das Medikament zur Verabreichung durch einen Dosierinhalator formuliert ist.
  23. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 16 bis 20, worin das Medikament zur Verabreichung durch einen Pulverdosisinhalator formuliert ist.
  24. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 16 bis 20, worin das Medikament zur Verabreichung durch Inhalation von Wirkstoff formuliert ist, der als Teil eines Liposomenträgers formuliert ist.
  25. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 16 bis 20, worin das Medikament zur Verabreichung der Verbindung direkt in die Atemwege formuliert ist.
  26. Verwendung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 25, worin das Tier der Mensch ist.
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