ES2221297T3 - Utilizacion de derivados de androsterona para inhibir la union del adn de ap-1 y la proliferacion de musculo liso traqueobronquial. - Google Patents
Utilizacion de derivados de androsterona para inhibir la union del adn de ap-1 y la proliferacion de musculo liso traqueobronquial.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA EL USO DEL ESTEROIDE SUPRARRENAL CONOCIDO COMO DESHIDROEPIANDROSTERONA, Y ALGUNOS DE SUS ANALOGOS, PARA REDUCIR EL CRECIMIENTO DE LAS CELULAS DE LAS LINEAS CELULARES INMORTALIZADAS Y MALIGNAS, DE ACUERDO CON LA FORMULA SIGUIENTE: Y CARACTERIZADO PORQUE X ES HALOGENO, HIDROXI, HIDROGENO, ALQUILO INFERIOR O ALCOXI INFERIOR; Y ES HIDROGENO O HIDROXI; Z ES ALQUILO INFERIOR O HIDROGENO. LA DESHIDROEPIANDROSTERONA Y SUS POTENTES ANALOGOS, 16 AL BROMO - 5 - ANDROSTEN - 17 - ONA, 16 BE - BROMO - 5 ANDROSTEN - 17 - ONA, 16AL - FLUOR - 5 - ANDROSTEN - 17 - ONA, 16 BE - FLUOR - 5 ANDROSTEN - 17 - ONA, 16 AL - BROMO - 5 ANDROSTAN - 17 - ONA, 16 BE - BROMO - 5 - ANDROSTAN - 17 - ONA, 16 AL - FLUOR - 5 - ANDROSTAN - 17 - ONA Y 16 BE - FLUOR - 5 -ANDROSTAN - 17 ONA AFECTAN A LA ACTIVACION DE LOS GENES DE RESPUESTA SECUNDARIA AL CRECIMIENTO, RESULTANDO, PUES, UTILES PARA LA PREPARACION DE MEDICAMENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE LA REMODELACION DE LAS VIAS AEREAS ASMATICAS EN EL HOMBRE.
Description
Utilización de derivados de androsterona para
inhibir la unión del ADN de AP-1 y la proliferación
de músculo liso traqueobronquial.
La presente invención se refiere a la utilización
de derivados de androsterona para inhibir la proliferación de
músculo liso tráqueobronquial. Más específicamente, la presente
invención se refiere a la utilización de dehidroepiandrosterona
(DHEA) y análogos 16-fluorados y bromados para la
relajación y broncodilatación de músculo liso traqueobronquial y a
la prevención de la secreción de citoquinas proinflamatorias por el
epitelio traqueobronquial en el hombre.
Anteriormente, el asma se definía como la
obstrucción episódica y reversible de las vías respiratorias. Ver
Chronic bronchitis, asthma, and pulmonary emphysema. A statement
by the committee on diagnostic standards for
non-tuberculous disease, Am. Rev. Respir.
Dis. 85:762-768 (1962), de la American Thoracic
Society: Medical Section of the National Tuberculosis Association.
En la actualidad se acepta que los pacientes con asma crónica
severa pueden desarrollar una obstrucción irreversible de las vías
respiratorias. Por ejemplo, ver Brown, J.P., Breville, W.H. y
Finucane, K.E., Asthma and irreversible airflow obstruction,
Thorax 39:131-136 (1984); y Juniper, E.F.,
Kline, P.A., Vanieleghem, M.A., Ramsdale, E.H., O'Byrne, P.M. y
Hargreave, F.E., Effect of long-term treatment
with an inhaled corticosteroid (budesonide) on airway
hyperresponsiveness and clinical asthma in
non-steroid dependent asthmatics, Am. Rev.
Respir. Dis. 142:832-836 (1990). Esta
complicación deriva del remodelado estructural de la pared de las
vías respiratorias, resultando en una mayor masa de músculo liso
(Bramley, A.M., Thomson, R.J., Roberts, C.R. y Schellenberg, R.R.,
Excessive bronchoconstriction in asthma is due to decreased
airway elastance, Eur. Respir., J.
7:337-341 (1994); y Lambert, R.K., Wiggs, B.R.,
Kuwano, K., Hogg, J.C. y Pare, P.D., Functional significance of
increased airway smooth muscle in asthma and COPD, J. Appl.
Physiol. 74:2771-2781 (1993) resultante de
tanto la hiperplasia como de la hipertrofia (Ebina, M., Takahasi,
T., Chiba, T. y Motomiya, M., Cellular hypertrophy and
hyperplasia of airway smooth muscle underlying bronchial
asthma, Am. Rev. Respir. Dis. 148:720-726
(1993)), así como el remodelado de otros elementos. El engrosamiento
del músculo liso traqueobronquial, a su vez, se cree que contribuye
a la hipersensibilidad bronquial no específica características del
asma (James, A.L., Hogg, J.C., Dunn, L.A. y Pare, P.D., The use
of internal perimeter to compare airway size and to calculate smooth
muscle shortening, Am. Rev. Respir. Dis.
138:136-139 (1988), y James, A.L., Pare, P.D. y
Hogg, J.C., The mechanics of airway narrowing in asthma,
Am. Rev. Respir. Dis. 139:242-246 (1989); y
Pare, P.D., Wiggs, B.R., Hogg, J.C. y Bosken, C., The comparative
mechanics and morphology of airways in asthma and in chronic
obstructive pulmonary disease, Am. Rev. Respir. Dis.
143:1189-1193 (1991)). El remodelado de la
pared de las vías respiratorias en los asmáticos con frecuencia es
refractario clínicamente a las terapias actuales broncodilatadoras
y antiinflamatorias (ver, por ejemplo, Brown et al. (1984),
supra; y Juniper et al. (1990), supra. Se
requieren nuevas estrategias de tratamiento para prevenir la
incidencia de este proceso.
Un estudio anterior del tejido vascular ha
demostrado que se reduce la aterosclerosis coronaria acelerada en
el corazón trasplantado mediante el tratamiento con
dehidroepiandrosterona (DHEA). Ver Eich, D.M., Nestler, J.E.,
Johnson, D.E., Dworkin, G.H., Ko, D., Wechsler, A.S. y Hess, M.L.,
Inhibition of accelerated coronary atherosclerosis with
dehydroepiandrosterone in the heterotopic rabbit model of cardiac
transplantation, Circ. 87:261-269 (1993).
La dehidroepiandrosterona (DHEA) y su conjugado
sulfato (DHEAS) son los productos esteroideos de secreción más
importantes de la glándula adrenal aunque el papel fisiológico de
la DHEA sigue sin conocerse. Ver Ebeling, P. y Kovisto, V.A.,
Physiologic importance of dehydroepiandrosterone,
Lancet 343:1479-1481 (1994). La DHEA y sus
análogos sintéticos presentan acción antiproliferativa en los
modelos de tumor animal y en líneas celulares tumorales. Por
ejemplo, ver Schwartz, A.G., Lewbart, M.L. y Pashko, L.L., Novel
dehydroepiandrosterone analogues with enhanced biological activity
and reduced side effects in mice and rats, Cancer Res.
48:4817-4822 (1988); y Schwartz, A.G. y Pashko,
L.L., Mechanism of cancer preventive action of DHEA. Role of
glucose-6-phosphate
dehydrogenase, Ann. N.Y. Acad. Sci.
774:180-186 (1995). Esta actividad se ha explicado
mediante la inhibición de la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa,
con posterior bloqueo de la formación de ribonucleósidos y
desoxirribonucleótidos (Dworkin, C.R., Gorman, S.D., Pashko, L.L.,
Cristofalo, W.J. y Schwartz, A.G., Inhibition of growth of HeLa
and WI-38 cells by dehydroepiandrosterone and its
reversal by ribo- and deoxyribonucleosides, Life Sci.
38:1451-1457 (1986); Garcea, R., Daino, L.,
Frassetto, S., Cozzolino, P., Ruggiu, M.E., Vannini, M.G., Pascale,
R., Lenzerini, L., Simile, M.M., Puddu, M. y Feo, F., Reversal
by ribo- and deoxyribonucleosides
dehydroepiandrosterone-induced inhibition of enzyme
altered foci in the liver of rats subjected to the
initiation-selection process of experimental
carcinogenesis, Carcinogenesis 9:931-938
(1988); Pashko, L.L., Lewbart, M.L. y Schwartz, A.G., Inhibition
of
12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-promoted
skin tumor formation in mice by
16\alpha-fluoro-5-anderosten-17-one
and its reversal by deoxyribonucleosides, Carcinogenesis
12:2189-2192 (1991); Schwartz et al. (1988),
supra; y Schwartz y Pashko (1995), supra), o mediante
interferencia en la biosíntesis del ácido mevalónico, con menor
isoprenilación de proteínas, alteración de la localización de Ras
en la membrana plasmática e interrupción de las cascadas de
transducción de señales mediadas por Raf-quinasa. Ver Schulz,
S. y Nyce, J.W., Inhibition of protein isoprenylation and
p21^{ras} membrana association by dehydroepiandrosterone in human
colonic adenocarcinoma cells in vitro, Cancer Res.
51:653-656 (1991), y Schulz, s., Klann, R.C.,
Schonfeld, S. y Nyce, J.W., Mechanisms of cell growth inhibition
and cell cycle arrest in human colonic adrenocarcinoma cells by
dehydroepiandrosterone: Role of isoprenoid biosynthesis,
Cancer Res. 52:1372-1376 (1992).
También se hace referencia a la patente U.S. nº
A-5.660.835 (Nyce) y a la patente EP nº 1 033 989
A1, que dan a conocer la utilización de derivados de
dehidroepiandrosterona (DHEA) para tratar los síntomas del asma, en
el segundo caso para mediar en las reacciones alérgicas de los
mastocitos. La patente EP nº 1 033 989 A1 se publicó con
posterioridad a la fecha de presentación de la presente
solicitud.
La presente solicitud describe métodos para
reducir el crecimiento del músculo liso traqueobronquial, la
hiperplasia del cual puede llevar a la obstrucción fija de las vías
respiratorias y a una mayor hipersensibilidad de éstas en el asma
crónica severa.
La presente solicitud también describe métodos
para relajar y broncodilatar el músculo liso traqueobronquial.
La presente solicitud también describe métodos
para reducir la secreción de citoquinas proinflamatorias por el
epitelio traqueobronquial.
La presente solicitud describe adicionalmente un
método para tratar el remodelado asmático de las vías respiratorias
en el hombre. Se ha descubierto que el esteroide adrenal
dehidroepiandrosterona (DHEA) y algunos de sus análogos reducen el
crecimiento de líneas células inmortalizadas y malignas. También se
ha descubierto que los efectos de los compuestos indicados,
dehidroepiandrosterona y su potente análogo
16\alpha-bromoepiandrosterona
(16\alpha-BrEA) reducen radicalmente la
proliferación en cultivos primarios de músculo liso traqueal de
rata estimulado con suero de feto bovino (FBS) o con factor de
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF).
La presente invención se refiere a la utilización
de un compuesto que presenta la fórmula siguiente:
en la
que
X es halógeno, hidroxi o hidrógeno;
Y es hidrógeno;
Z es hidrógeno,
en la preparación de un medicamento que comprende
una cantidad farmacéuticamente efectiva de dicho compuesto para
inhibir la unión al ADN del AP-1 y la proliferación
del músculo liso traqueobronquial en el tratamiento del asma
crónica severa en animales.
Los esteroides preferentes de utilización en la
presente invención incluyen los siguientes:
16\alpha-bromo-5-androsten-17-ona;
16\beta-bromo-5-androsten-17-ona;
16\alpha-fluoro-5-androsten-17-ona;
16\beta-fluoro-5-androsten-17-ona;
16\alpha-bromo-5-androstan-17-ona;
16\beta-bromo-5-androstan-17-ona;
16\alpha-fluoro-5-androstan-17-ona;
16\beta-fluoro-5-androstan-17-ona;
La presente invención proporciona un tratamiento
del asma que comprende administrar a un huésped, por ejemplo, un
mamífero, una cantidad terapéuticamente efectiva de los compuestos
de la invención. Debido a que DHEA es menos potente que
16\alpha-BrEA u otros análogos
16-fluorados o bromados, la dosis efectiva de DHEA
es superior.
Sorprendentemente se ha descubierto que la
inhibición del crecimiento es dosis-dependiente y
no se debe a la interferencia con la actividad de la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o
al metabolismo del colesterol de las líneas celulares
inmortalizadas o malignas. La expresión del gen de respuesta
temprana c-fos permanece intacta, pero DHEA
y 16\alpha-BrEA reducen la unión al ADN del
activador del factor transcripcional proteína-1
(AP-1), una respuesta tardía importante para la
expresión de genes que median en la síntesis del ADN y la
progresión del ciclo celular.
También se ha descubierto que DHEA y sus análogos
pueden alterar la activación de genes secundarios de respuesta de
crecimiento de una manera análoga a la dada a conocer para los
glucocorticoides y han demostrado ser útiles para tratar el
remodelado asmático de las vías respiratorias en el hombre.
Además, se ha descubierto que DHEA puede relajar
el músculo liso traqueobronquial que es contraído por KCl o por el
mediador broncoconstrictor de liberación endógena inducida
vagalmente acetilcolina, y ha demostrado ser útil como
broncodilatador directo o como tratamiento conjunto para potenciar
la acción broncodilatadora de los beta-agonistas en
el tratamiento del asma aguda en el hombre.
Además, se ha descubierto que los análogos de la
DHEA pueden prevenir la secreción de citoquinas proinflamatorias
por parte del epitelio traqueobronquial en el hombre, y han
demostrado ser útiles en la reducción de la inflamación dentro de
las vías respiratorias asmáticas.
La figura 1 muestra que la reducción de MTT es
una medida precisa del número de células, según se obtiene con un
hemocitómetro;
La figura 2A muestra el efecto de mitógenos sobre
el crecimiento celular del músculo liso traqueobronquial de rata
(suero de feto bovino);
La figura 2B muestra el efecto de mitógenos sobre
el crecimiento celular del músculo liso traqueobronquial de rata
(factor de crecimiento derivado de plaquetas);
La figura 3A muestra el efecto de la
dehidroepiandrosterona (DHEA) y del sulfato de
dehidroepiandrosterona (DHEAS) sobre el crecimiento celular
estimulado por FBS del músculo liso traqueobronquial;
La figura 3B muestra el efecto de la
dehidroepiandrosterona sobre la proliferación celular estimulada
por PDGF del músculo liso traqueobronquial;
La figura 3C muestra el efecto de la
16\alpha-bromoepiandrosterona sobre la
proliferación estimulada por FBS del músculo liso
traqueobronquial;
La figura 3D muestra el efecto inhibitorio sobre
el crecimiento que presenta la
16\alpha-bromoepiandrosterona en comparación con
el de la dexametasona;
La figura 4A muestra que los efectos inhibitorios
del crecimiento de la dehidroepiandrosterona y de la
16\alpha-bromoepiandrosterona no son artefactos
de medición;
La figura 4B muestra que la
16\alpha-bromoepiandrosterona no incrementa la
actividad de la lactato deshidrogenasa (LDH) en sobrenadantes
celulares;
La figura 5A-5D muestra que la
inhibición de la proliferación del músculo liso traqueobronquial
por la DHEA y 16\alpha-bromoepiandrosterona no se
ve revertida por la suplementación del medio de cultivo con
ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos.
La figura 6A muestra que la alteración del
metabolismo del colesterol no explica la inhibición del crecimiento
del músculo liso traqueobronquial con
16\alpha-bromoepiandrosterona;
La figura 6B es un inmunoblot que muestra que el
tratamiento de monocapas con
16\alpha-bromoepiandrosterona no agota el
p21^{ras} presente en las membranas;
La figura 7A es un inmunoblot representativo de
la proteína c-fos de monocapas de control
tratadas con FBS y de algunas pretratadas con DMSO,
16\alpha-bromoepiandrosterona y lisado de células
A431;
La figura 7B muestra que el pretratamiento
durante 2 horas con vehículo DMSO o con
16\alpha-bromoepiandrosterona 10 \muM no evitó
el incremento normal de ARNm c-fos;
La figura 7C es un resumen de los experimentos
que se muestran en la figura 7B;
Las figuras 8A-8B ilustran que el
tratamiento del músculo liso traqueobronquial con
dehidroepiandrosterona y
16\alpha-bromoepiandrosterona inhibe la unión al
ADN del factor transcripcional AP-1;
La figura 9 ilustra la curva
concentración-efecto de DHEA y del vehículo solo
(DMSO) en bronquios principales de conejillos de indias parcialmente
contraídos con 3 x 10^{-2} MKCL;
La figura 10 ilustra la curva de efecto de
concentraciones crecientes de DHEA y del vehículo solo (DMSO) en
bronquios principales de conejillos de indias parcialmente
contraídos con 1x10^{-5} M de acetilcolina (Ach); y
La figura 11 ilustra la curva de respuesta a
concentraciones crecientes de Ach en presencia y en ausencia de
10^{-4}M de DHEA en bronquios principales de conejillos de
indias.
A continuación, la presente invención se describe
más completamente con referencia a los dibujos adjuntos, en los que
se muestran unas realizaciones preferentes de la invención. La
presente invención puede, sin embargo, realizarse de muchas formas
diferentes y no debe interpretarse como limitada a las
realizaciones descritas en el presente documento; más bien, dichas
realizaciones se proporcionan con el fin de que la descripción sea
exhaustiva y completa y transmita de manera más completa el alcance
de la invención a los expertos en la materia.
La presente invención proporciona la utilización
de un compuesto que presenta la fórmula siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
en la
que
X es halógeno, hidroxi o hidrógeno;
Y es hidrógeno;
Z es hidrógeno,
en la preparación de un medicamento que comprende
una cantidad farmacéuticamente efectiva de dicho compuesto, adecuado
para inhibir la unión al ADN de AP-1 y la
proliferación del músculo liso traqueobronquial, por ejemplo en el
tratamiento del asma en un animal o particularmente en el
hombre.
Los compuestos específicos ilustrativos de
acuerdo con la presente invención incluyen los siguientes:
16\alpha-bromo-5-androsten-17-ona;
16\beta-bromo-5-androsten-17-ona;
16\alpha-fluoro-5-androsten-17-ona;
16\beta-fluoro-5-androsten-17-ona;
16\alpha-bromo-5-androstan-17-ona;
16\beta-bromo-5-androstan-17-ona;
16\alpha-fluoro-5-androstan-17-ona;
y
16\beta-fluoro-5-androstan-17-ona.
Debido a que DHEA es menos potente que los
análogos 16-bromo y 16-fluoro, la
dosis efectiva de DHEA es más elevada. Por ejemplo, una dosis
preferente de DHEA se encuentra comprendida entre 2 y 10 mg/kg/día.
Una tasa preferente de dosificación para los análogos
16-bromo y fluoro sustituidos que se han descrito
anteriormente estaría comprendida entre 0,2 y 2 mg/kg/día.
El medicamento puede administrarse oralmente y el
esteroide puede incluirse en un portador farmacéutico.
Alternativamente, el medicamento puede administrarse mediante
inhalación en un portador farmacéutico, tal como mediante sistemas
inhaladores convencionales de dosis medidas, formulado como
suspensión microcristalina del medicamento (micronizado a menos de
4 micrómetros de tamaño) en una mezcla de propelentes de
clorofluorocarbono, tal como triclorofluorometano y
diclorodifluorometano con lecitina, de manera que cada inhalación
administre entre 25 y 250 \mug de fármaco activo.
Para la inhalación, el medicamento también puede
formularse como polvo seco microcristalino a administrar mediante
sistemas inhaladores convencionales disponibles de polvo seco,
tales como el sistema inhalador de polvo seco Spiros, disponible en
Dura Pharmaceuticals, San Diego, CA, o el sistema inhalador
Inspire, disponible en Inspire, Inc., Palo Alto, CA.
Además, el medicamento puede formularse como un
componente de liposomas multilamelares cargados negativamente, tal
como mediante el procedimiento de Fidler (Fidler, I.J, Raz, A.,
Fogler, W.E., Kirsh, R., Bugelski, P., y Poste, G., Design of
liposomes to improve delivery of
macrophage-augmenting agents to alveolar
macrophages, Cancer Res. 40:4460-4466,
1980), que implica la utilización de una mezcla de fosfatidilcolina
de huevo y fosfatidilserina cerebral (Avanti Polar Lipids, Inc.,
Birmingham, AL) en una proporción molar de 7:3 y de la formulación
de liposomas que contienen fármacos, según describe Padmanabhan
(Padmanabhan, R.V., Gudapata, R., Liener, I.E., Schwartz, B.A. y
Hoidal, J.R., Protection against pulmonary oxygen toxicity in
rats by the intratracheal administration of
liposome-encapsulated superoxide dismutase or
catalase, Am. Rev. Respir. Dis.
132:164-167, 1985). Puede administrarse
convenientemente un medicamento que contenga liposomas al árbol
respiratorio mediante inhalación utilizando nebulizadores de
aerosol convencionalmente disponibles o dispositivos nebulizadores
ultrasónicos, tal como Medicaid Ventstream, Pari-LC
Jet, Omron UltraAir, DeVilbiss Aerosonic o Circulair. Cuando se
administran directamente en el pulmón mediante inhalación, sólo
resulta necesario un décimo de la dosis oral habitual, a
administrar de una a tres veces diarias, para el tratamiento de la
condición asmática.
Los esteroides utilizados en la presente
invención pueden prepararse de acuerdo con síntesis orgánicas
convencionales. Por ejemplo, los esteroides utilizados en la
presente invención pueden prepararse a partir de esteroides
conocidos o fácilmente disponibles, tal como dehidroepiandrosterona
(DHEA), mediante métodos de reacción de alquilación, halogenación,
hidroxilación o sustitución conocidos en la técnica. Los métodos de
síntesis de una serie de esteroides utilizados en la presente
invención se describen en detalle en: Schwartz, A.G., M.L. Lewbart y
L.L. Pashko, Novel dehydroepiandrosterone analogues with
enhanced biological activity and reduced side effects in mice and
rats, Cancer Res. 48:4817-4822, 1988.
Se llevaron a cabo estudios con el fin de
demostrar que el esteroide adrenal dehidroepiandrosterona (DHEA) y
sus análogos reducen el crecimiento de líneas celulares
inmortalizadas y malignas.
Materiales. Se adquirieron ratas macho
adultas de la cepa Sprague-Dawley en Charles River
(Raleigh, NC). Se obtuvieron inhibidores de proteasa y tiocianato
de guanidina en Boehringer Mannhein (Indianapolis, IN). Se
adquirieron medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), solución
salina equilibrada de Hank (HBSS), ácido
N-2-hidroxietilpiperacina-N'-2-etanosulfónico
(HEPES), antibiótico-antimicótico (10.000 U de
penicilina, 10.000 U de estreptomicina y 25 \mug de anfotericina
B/ml) y solución de
tripsina-etilendiaminatetraacético en GIBCO (Grand
Island, NY).
Se adquirió suero de feto bovino (FBS) en HyClone
(Logan, UT). Se obtuvo factor AA recombinante de crecimiento
derivado de plaquetas humanas (PDGF-AA) en R&D
Systems, Minneapolis, MN. Se adquirieron dehidroepiandrosterona
(DHEA), 16\alpha-bromoepiandrosterona
(16\alpha-BrEA), mifepristona (RU486),
tris(hidroximetil)aminometano (Tris) y anticuerpo para
\alpha-actina de músculo liso en Sigma Chemical
Co. (St. Louis, MO).
Los anticuerpos para p21^{ras}
(pan-ras, Ab-3 monoclonal de ratón)
y c-fos (Ab-2, policlonal de
conejo), proteínas, IgG de cabra anti-ratón
conjugada con peroxidasa de rábano picante y lisado estándar de
células A431 en Calbiochem (San Diego, CA).
La IgG policlonal anti-conejo
conjugada con peroxidasa de rábano picante era de Transduction
Laboratories (Lexington, KY). La transcriptasa inversa
M-MLV procedía de Life Technologies (Gaithersburg,
MD). El resto de materiales se obtuvo en Sigma a menos que se
especifique otra procedencia.
Medición de la proliferación de cultivo de
músculo liso de vías respiratorias. Se cultivó músculo liso
traqueal de rata sacrificando ratas mediante sobredosis de
pentobarbital y extrayendo las tráqueas. Se aisló la membrana
traqueal posterior, se trituró y se digirió dos veces durante 30
minutos a 37ºC en HBSS que contenía 0,2% de colagenasa de tipo IV y
0,05% de elastasa de tipo IV. Cada digerido de enzima se recogió y
centrifugó durante 5 minutos a 500 g a temperatura ambiente.
Se separó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en DMEM
suplementado con 10% de FBS, aminoácidos no esenciales, penicilina
(100 U/ml), estreptomicina (100 \mug/ml) y anfotericina (250
ng/ml). Se sembraron estas células en dicho medio, en matraces de 25
cm^{2} a 2x10^{5} células por matraz, y se incubaron en una
atmósfera humidificada a 37ºC de 5% CO_{2}/95% aire. Al confluir,
las células se separaron con solución de 0,25%
tripsina-0,002% EDTA para su cultivo.
La inmunotinción se llevó a cabo utilizando un
anticuerpo policlonal contra \alpha-actina de
músculo liso y se visualizó utilizando una técnica de
avidina-biotina-inmunoperoxidasa.
Los cultivos de músculo liso mostraron el típico aspecto de "pico
y valle" bajo microscopía de contraste de fases y se tiñeron
intensamente por la \alpha-actina de músculo liso.
Los estudios preliminares demostraron que el cultivo de células en
presencia de 10% de FBS resultaba en una fase de crecimiento lineal
de hasta 120 horas. Los cultivos procedentes de los pasajes 2 a 9
se utilizaron para los experimentos posteriores.
Se cuantificó la proliferación del cultivo de
músculo liso traqueobronquial utilizando una modificación de un
método colorimétrico anterior basado en la reducción metabólica del
pigmento amarillo soluble tetrazolio, bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol]-2-il-2,5-difenil
tetrazolio (MTT), a un pigmento de formazán insoluble de color
violeta debido a la acción de la succinil deshidrogenasa
mitocondrial. Ver Hirst, S.J., Barnes, P.J. y Twort, C.H.C.,
Quantifying proliferation of cultured human and rabbit airway
smooth muscle in response to serum and platelet derived growth
factor, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.,
7:574-581 (1992). Este ensayo distingue
empíricamente entre células muertas y vivas. Para los estudios de
proliferación, se sembraron células en placas de plástico no
recubiertas de 24 pocillos a 15.000-50.000 células
por pocillo y se cultivaron con DMEM y mitógenos. Tras 24 a 96
horas, se sustituyó el medio con 1 ml/pocillo de DMEM fresco que
contenía 100 \mug/ml de MTT y 0,5% de FBS y se incubaron las
placas durante una hora más. Se extrajo el medio que contenía MTT,
se lavaron las células dos veces con 1 ml de solución salina
estéril de Dulbecco modificada tamponada con fosfato sin Ca^{2-}
ni Mg^{2-} (DPBS), se añadieron 0,5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO)
a cada pocillo y se midió a 540 nm la absorbancia del pigmento de
formazán solubilizado de color violeta en un espectrofotómetro
Shimadzu UV160U. Se estudiaron un total de 4 a 6 pocillos para cada
tratamiento.
Se llevaron a cabo estudios preliminares con 50 a
200 \mug/ml de MTT incubado durante 15 minutos a 3 horas con el
fin de determinar la concentración óptima y tiempo de incubación al
cual la tasa de conversión era lineal y proporcional al número de
células presentes. Con el fin de confirmar que la reducción del
bromuro de
3-[4,5-dimetiltiazol]-2-il-2,5-difenil
tetrazolio (MTT) era una medida lineal fiable del número de
células, se incubaron células de músculo liso traqueobronquial
recién separadas durante 1 hora en DMEM que contenía 10% de FBS y
100 \mug/ml de MTT. Las células se centrifugaron a 1.000 g
durante 10 minutos, se lavaron dos veces con solución salina de
Dulbecco modificada tamponada con fosfato sin Ca^{2-} ni Mg^{2}
(DPBS), se extrajeron con 0,5 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y se
midió la concentración de formazán tal como se ha descrito
anteriormente.
Se determinó la concentración óptima de FBS para
su utilización como estímulo mitogénico incubando 15.000 células
por pocillo con DMEM que contenía 0,25, 1,0, 5,0 ó 10,0% de FBS y
se determinó la reducción de MTT tras 24, 48, 72 ó 96 horas.
Finalmente, con el fin de confirmar que los mitógenos estimulaban y
los inhibidores reducían el número de células observado, se
incubaron 15.000 células con DMEM que contenía 10% de FBS con o sin
diversos inhibidores o vehículo. Tras 24 horas, se lavaron las
células dos veces con DPBS, se fijaron y se permeabilizaron
mediante dos exposiciones secuenciales de 5 minutos a metanol
helado, se tiñeron con pigmento de Wright modificado por Giemsa
durante 3 minutos y se lavaron con DPBS. Se llevaron a cabo los
conteos celulares en 10 campos aleatorios a magnificación 40X
utilizando un ocular con rejilla graduada cada 0,01 cm^{2}.
Tratamientos de los cultivos celulares para la
medición de la proliferación del músculo liso traqueobronquial.
Se estudió el efecto de la dehidroepiandrosterona (DHEA) y de la
16\alpha-bromoepiandrosterona
(16\alpha-BrEA) sobre la proliferación celular en
cultivos estimulados con 0,5 a 10% de FBS o 1 a 50 ng/ml de factor
recombinante de crecimiento derivado de plaquetas humanas
(PDGF-AA). En algunos experimentos, se añadió
glucocorticoide y anti-hormona progesterona RU486
individualmente o con dehidroepiandrosterona (DHEA) o con
16\alpha-bromoepiandrosterona
(16\alpha-BrEA) en cantidades equimolares en un
intento por determinar si los efectos inhibitorios estaban mediados
por la unión de DHEA o 16\alpha-BrEA al receptor
proteína glucocorticoide. Ver, por ejemplo, el método de Le, Y.Y. y
Xu, R.B., The molecular mechanism of the action of the
pharmacological doses of glucocorticoids. Studies on the
low-affinity glucocorticoid receptor,
Receptor 5:63-69 (1995). En otros estudios,
se compararon los efectos inhibitorios del crecimiento provocados
por DHEA o por 16\alpha-BrEA a los efectos de los
glucocorticoides dexametaxona o metilprednisolona.
Con el fin de determinar si DHEA y
16\alpha-bromoepiandrosterona reducían la
proliferación celular mediante la inhibición de la
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(G6PDH), se incubaron matraces confluyentes de 80 cm^{2} con
DHEA, 16\alpha-BrEA o 50 \mul de vehículo DMSO.
Tras 1 hora, se lisaron las células y se ensayó la actividad de
G6PDH tal como se describe posteriormente. En otros experimentos,
se midió la actividad de G6PDH en lisados celulares preparados a
partir de cultivos confluyentes y tratados in vitro con
adición de DHEA o de 16\alpha-BrEA a la mezcla de
reacción en 5 \mul de DMSO. Con el fin de determinar si el
bloqueo de la producción de ribosas por la ruta de las hexosas
monofosfato era responsable de la inhibición del crecimiento del
músculo liso traqueobronquial por DHEA o
16\alpha-BrEA, se sincronizó el crecimiento de
las células durante 24 horas en 0,5% de FBS (15.000 células/pocillo
en placas de 24 pocillos), después se cultivaron en DMEM y 10% de
FBS en presencia o ausencia de DHEA o de
16\alpha-BrEA y con 200 \muM de ribonucleósidos
(adenosina, guanosina, citidina y uridina) o desoxirribonucleósidos
(desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina y timidina). Los
ribonucleósidos o desoxirribonucleósidos se disolvieron en 0,5 ml de
HCl 1N y se añadieron al DMEM. El pH del medio se ajustó a 7,1
mediante titración con NaOH 1N y después se esterilizó el medio
mediante filtración a través de un filtro de 0,2 \muM. Se midió
el crecimiento mediante reducción del MTT tras 24, 48 y 96
horas.
Con el fin de determinar si
16\alpha-bromoepiandrosterona reducía la
proliferación celular mediante la interferencia con la síntesis del
ácido mevalónico, se estimularon células con FBS y se cultivaron en
presencia o ausencia de 16\alpha-BrEA, con o sin
adición al medio de crecimiento de 6 mM de lactona de ácido
DL-mevalónico. Tras 36 horas de crecimiento, se
midió la reducción del MTT. Con el fin de evaluar si la
isoprenilación y localización membranal de Ras había sido
alterada, se inhibió el crecimiento de células confluyentes en
placas de Petri de 75 cm^{2} durante 24 horas en 0,5% de FBS y
DMEM con y sin 16\alpha-BrEA o vehículo DMSO. A
continuación se estimularon algunas placas durante 30 minutos con
10% de FBS en DMEM. Las células se lisaron, se aislaron las
membranas y se llevaron a cabo inmunoblots tal como se describe
posteriormente con el fin de determinar si el tratamiento con DHEA
y 16\alpha-BrEA consumía p21^{ras}.
Con el fin de determinar si
16\alpha-BrEA alteraba la expresión de genes de
respuesta temprana importantes para la proliferación celular, se
inhibió el crecimiento de células de músculo liso en placas de
Petri confluyentes de 75 cm^{2} mediante incubación durante 24
horas en DMEM con 0,5% de FBS. Previamente se trataron las
monocapas con 10 \muM de 16\alpha-BrEA o
vehículo DMSO durante 2 horas y se estimularon mediante exposición a
DMEM con 10% de FBS durante 30 minutos. A continuación se lisaron
las células y se midió el contenido de ARNm de
c-fos mediante reacción en cadena de la
polimerasa con transcripción inversa, tal como se describe
posteriormente. Con el fin de estudiar si se veían afectados los
niveles de proteína c-fos, se inhibió el
crecimiento de las monocapas confluyentes en placas de 6 pocillos
durante 24 horas utilizando DMEM con 0,5% de FBS. A continuación se
pretrataron las células con 16\alpha-BrEA o
vehículo DMSO durante 2 horas y se estimularon con 10% de FBS en
DMEM durante 15, 30 y 60 minutos. A continuación se lisaron las
células y se ensayó la proteína c-fos
mediante inmunoblots, tal como se describe posteriormente.
Con el fin de estudiar el efecto de DHEA y
16\alpha-BrEA sobre la activación de
AP-1, una respuesta secundaria importante en el
crecimiento y proliferación celulares (Angel y Karin, (1991),
supra), se inhibió el crecimiento de monocapas confluyentes
de músculo liso traqueobronquial en placas de Petri de 75 cm^{2}
con 0,5% de FBS y DMEM durante 24 horas y se pretrataron con DHEA,
16\alpha-BrEA o vehículo DMSO durante 2 horas. A
continuación se estimularon las células con 10% de FBS en DMEM
durante 6 horas, se recogió la proteína nuclear y se llevaron a
cabo ensayos de movilidad electroforética tal como se describe
posteriormente, con el fin de determinar si el tratamiento con DHEA
y 16\alpha-BrEA había alterado la unión al ADN de
AP-1.
Medición de citotoxicidad y apoptosis. Con
el fin de evaluar la citotoxicidad, se añadió DHEA o
16\alpha-BrEA a pocillos con células de músculo
liso traqueobronquial cultivadas previamente hasta confluencia en
DMEM y 10% de FBS. Tras 24 horas, se microcentrifugaron los medios
durante 5 minutos y se ensayó el sobrenadante para actividad de
lactato deshidrogenasa utilizando un kit de ensayo comercialmente
disponible (DG-1340K de Sigma). Las células se
lavaron dos veces en DPBS y se expusieron a pigmento de azul tripán
(0,04% en solución salina equilibrada de Hank). Los conteos
celulares se llevaron a cabo en cinco campos aleatorios utilizando
un ocular con rejilla graduada cada 0,01 cm^{2} para cuantificar
el número medio de células dañadas o muertas que acumulaban
pigmento.
Con el fin de determinar si DHEA o sus análogos
inducían la muerte celular programada, se trataron cultivos
confluyentes en placas de plástico de 6 pocillos con 50 ó 250
\muM de DHEA, 10 ó 50 \muM de 16\alpha-BrEA o
vehículo (25 \mul de DMSO). Tras 2 horas, se lavaron las células
dos veces con DPBS y se rasparon introduciéndolas en tubos de
microcentrifugación de 1,5 ml y se centrifugaron a 250 g
durante 5 minutos a 4ºC. El pellet celular se resuspendió
suavemente en 30 \mul de DPBS y se lisaron las células mediante la
adición de 30 \mul de tampón de lisis (EDTA 80 mM, 1,6%
[peso/vol.] de lauril sarcosinato sódico y 5 mg/ml de proteinasa K
en tampón Tris-HCl 200 mM, pH 8,0). El lisado se
incubó a 50ºC durante 1,5 horas. Se añadió ARNasa A (0,2 mg/ml) y
el lisado se incubó durante 30 minutos más a 37ºC. Se separaron las
bandas de ADN junto a una escalera de patrones estándar de ADN en un
gel de agarosa al 1% pasando 60 V durante 1 hora, intercalando con
bromuro de etidio, y se visualizaron y fotografiaron bajo luz
ultravioleta.
Medición de la actividad de
glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa. Los cultivos se lavaron tres veces con DPBS
frió sobre hielo, se rasparon introduciéndolas en tampón helado
(MgCl_{2} 10 mM en Tris 50 mM, pH 8,0) y se sonicaron en un baño
de hielo. A continuación, se ensayó la actividad de G6PDH mediante
el método de Jones y Andrews (Jones, J.T. y Andrews, S.G.,
Glucose-6-phosphate
dehydrogenase activity in somatic and germinal cells of the mouse
testis, J. Reproduc. Fertility
54:357-362 (1978)) en una mezcla de reacción que
contenía 50 a 200 \mul de lisado celular, 20 \mul de
\beta-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
(NADP) 10 mM y 20 \mul de
D-glucosa-6-fosfato
(G6P) 10 mM en un volumen total de 1 ml de tampón (MgCl_{2} 10 mM
en Tris 50 mM, pH 8,0). La reacción se inició mediante la adición de
G6P. Se llevó a cabo el seguimiento del incremento lineal de
absorbancia a 340 nm durante 300 segundos a 25ºC. La actividad se
expresó como unidades/mg proteína, donde 1,0 unidad oxida 1,0
\mumol de G6P a
6-fosfo-D-gluconato
por minuto en presencia de NADP. Se midió el nivel de proteínas
utilizando el ensayo BCA para proteínas (Rockford, IL).
Ensayo inmunoblot para las proteínas
p21^{ras} y c-fos . Para medir el nivel
de proteína p21^{ras}, las células se lavaron dos veces con DPBS
frío y se hincharon en hielo durante 15 minutos con 500 \mul de
tampón de lisis frío (HEPES 10 mM, MgCl_{2} 1 mM, EDTA 1 mM,
pepstatina 1 \muM, 2 \mug/ml de aprotinina y fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1 mM). Ver Schulz y Nyce (1991), supra.
A continuación, se rasparon las células introduciéndolas en tubos de
polipropileno de 1,5 ml, se homogeneizaron y clarificaron mediante
centrifugación a 3.000 g durante 1 minuto a 4ºC. El
sobrenadante postnuclear se centrifugó a 100.000 g durante
30 minutos a 4ºC. Los sobrenadantes se recogieron y el pellet de
membranas se resuspendió en tampón detergente (1% de Triton
X-100, 1% de desoxicolato sódico, 0,1% de SDS, NaCl
150 mM, pepstatina 1 \muM, 2 \mug/ml de aprotinina y fluoruro
de fenilmetilsulfonilo 1 mM en Tris 25 mM, pH 7,4). Se retiraron
alícuotas de las fracciones de sobrenadante y del pellet de
membranas para determinar el nivel de proteínas mediante ensayo BCA.
Se añadieron azul bromofenol y
\beta-mercaptoetanol a la muestra restante hasta
una concentración final de 0,002% (peso/vol.) y 5% (vol./vol.),
respectivamente. Después, se hirvieron los lisados durante 5 minutos
a 100ºC y se almacenaron a -80ºC hasta el momento de llevar a cabo
los inmunoblots.
Para medir el nivel de proteína
c-fos, se introdujeron las monocapas en
hielo, se lavaron dos veces con DPBS frío, se rasparon e
introdujeron en 0,5 ml de tampón en ebullición (10% [vol./vol.] de
glicerol y 2% [peso/vol.] de dodecil sulfato sódico [SDS] en Tris
83 mM, pH 6,8) y se sonicaron. Se retiraron alícuotas para la
determinación del nivel de proteínas, se añadieron azul bromofenol
y \beta-mercaptoetanol y los lisados se hirvieron
y almacenaron como se ha indicado anteriormente.
Las proteínas en las muestras descongeladas se
separaron mediante electroforesis en gel de
SDS-poliacrilamida en geles de poliacrilamida al 10%
para c-fos y geles al 15% para p21^{ras}
(15 \mug de proteína/carril) con la utilización de tampón de
O'Farrell-Laemmli (Tris 0,025 M, glicina 0,192 M y
0,1% [peso/vol.] de SDS, pH 8,3). Ver método de Buckley, B.J. y
Whorton, A.R., Ca^{2-}-independent arachidonic
acid release by vascular endothelium requires protein synthesis de
novo, Biochem. J. 300:445-449 (1994). Se
tiñeron geles duplicados con azul de Coomassie (pigmento azul de
Coomassie R-250 de Sigma en 40% de metanol y 7% de
ácido acético) con el fin de evaluar la cantidad relativa de
proteína cargada en cada carril. Las proteínas se transfirieron a
nitrocelulosa mediante el método transblot húmedo en tampón de
transferencia (Tris 0,025 M, glicina 0,192 M, SDS 2,6 mM y 20%
[vol./vol] de metanol, pH 8,8) pasando 200 mAmp durante 3 horas.
Los blots se bloquearon durante 1 hora a temperatura ambiente en
Tris 10 mM (pH 7,5) que contenía NaCl 100 mM, 0,01% (vol./vol.) de
Tween 20 y 5% de leche sin grasa seca. Los blots se incubaron
durante 1 hora a temperatura ambiente con 2,5 \mug/ml de
anticuerpos pan-ras o c-fos
en tampón de bloqueo. Tras enjuagar 5 veces durante 5 minutos cada
vez en tampón de enjuagado (Tris 10 mM [pH 7,5] que contenía NaCl
100 mM y 0,01% [vol./vol.] de Tween 20), los blots se incubaron
durante 1 hora a temperatura ambiente con el enzima conjugado
inmunoglobulina G (IgG)
anti-ratón-peroxidasa de rábano
picante (HRP; pan-ras MAb) o IgG
anti-conejo/HRP (c-fos PAb)
diluido 1:2.000 en tampón de bloqueo como anticuerpo secundario.
Los inmunoblots se enjuagaron nuevamente 5 veces durante 5 minutos
cada vez en tampón de enjuagado y se sometieron a inmunodetección a
través de un método mejorado de quimioluminiscencia (sistema de
detección ECL en Western blotting, Amersham Life Science,
Buckinghamshire, Inglaterra). Las estimaciones de peso molecular se
basaron en comparaciones con marcadores de peso molecular
preteñidos (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)
transferidos a nitrocelulosa. Se expuso película autorradiográfica
(X-OMAT AR, Eastman Kodak, Rochester, NY) a los
inmunoblots durante 10, 15 ó 60 segundos.
Reacción en cadena de la polimerasa con
transcripción inversa (RT-PCR). Se lavaron las
monocapas dos veces con DPBS y las células se lisaron con tiocianato
de guanidina 4 M, citrato sódico 50 mM, 0,05% de Sarcosil y
ditiotreitol 0,01 M. Tras el raspado, los lisados se homogeneizaron
mediante cuatro pasadas a través de una aguja de calibre 22. Se
peletizó el ARN mediante ultracentrifugación a través de cloruro de
cesio 5,7 M y EDTA 0,1 M. Ver el método de Becker, S., Koren, H.S.
y Henke, D.C., Interleukin-8 expression in normal
nasal epithelium and its modulation by infection with respiratory
syncytial virus and cytokines tumor necrosis factor,
interleukin-1, and
interleukin-6, Am. J. Respir. Cell Mol.
Biol., 820-827 (1993).
Se llevó a cabo la transcripción inversa del ARN
(100 ng) utilizando transcriptasa inversa M-MLV. El
ADNc resultante se amplificó por PCR en 29 y 36 ciclos para la
\beta-actina y c-fos,
respectivamente, utilizando cebadores sentido y antisentido de rata
específicos para los genes basados en las secuencias determinadas
por GenBank y publicadas en: Dashtaki, R., Whorton, A.R., Murphy,
T.M., Reed, W. y Kennedy, T.P., Dehydroepiandrostserone and
analogs inhibit DNA binding of AP-1 and airway
smooth muscle proliferation, J. Pharmacol. Exper. Ther.
1998, en prensa. El ADN amplificado mediante PCR se separó en un
gel desnaturalizante de agarosa al 2%, intercalado con bromuro de
etidio, y se visualizó y fotografió bajo luz ultravioleta. El
negativo polaroid resultante se cuantificó utilizando un analizador
Bio Image (Bio Image, Ann Arbor, MI). La intensidad de las bandas
de ADNc de \beta-actina (un gen de mantenimiento
no afectado por la estimulación con FBS) para cada muestra después
se utilizó para normalizar las diferencias entre muestras.
Ensayo de movilidad electroforética
(EMSA). Se lavaron las monocapas dos veces en DPBS frío y se
equilibraron durante 10 minutos en hielo con 0,7 ml de tampón de
extracción citoplasmática (CEB) (Tris 10 mM, pH 7,9, KCl 60 mM, EDTA
1 mM, ditiotreitol 1 mM) con inhibidores de proteasa (PI) (Pefabloc
1 mM, 50 \mug/ml de antipaína, 1 \mug/ml de leupeptina,
1\mug/ml de pepstatina, 40 \mug/ml de bestatina, 3 \mug/ml de
E-64 y 100 \mug/ml de quimostatina). El
detergente Nonidet P-40 (NP-40) se
añadió hasta una concentración final del 0,1% y las células se
extrajeron con un raspador de células. Los núcleos se peletizaron
mediante centrifugación y se lavaron con CEB/PI. A continuación, se
incubaron durante 10 minutos sobre hielo en tampón de extracción
nuclear (NEB) (Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 400 mM, MgCl_{2} 1,5 mM,
EDTA 1,5 mM, ditiotreitol 1 mM y 25% de glicerol) con PI, se
centrifugaron brevemente para retirar restos y se almacenaron a
-80ºC hasta la realización de los ensayos de movilidad
electroforética. Los EMSA hicieron uso de secuencias de consenso de
tipo salvaje (5'-TTCCGGCTGACTCATCAAGCG 3' y
3'-AAGGCCGACTGAGTAGTTCGC-5') para
AP-1 (Lee et al. (1987), supra),
marcadas en los extremos por fosforilación con
[\gamma^{32}P]-ATP y T4 polinucleótido
quinasa.
Las reacción de unión
ADN-proteína se llevaron a cabo con 2 \mug de
proteína nuclear (según se determinó por el método de unión del
pigmento Bradford) y 0,3 ng de sonda de ADN de doble hebra marcada
en los extremos con ^{32}P se incubaron durante 10 minutos a
temperatura ambiente en Tris 10 mM, pH 7,9, NaCl 50 mM, EDTA 2,5
mM, ditiotreitol 1 mM, 5 \mug de albúmina de suero bovina, 0,1
\mug de poli dI-dC y 4% de Ficoll. Los
experimentos de competición se llevaron a cabo con secuencias
oligonucleotídicas 10X de tipo silvestre no marcadas. Las muestras
se sometieron a electroforesis en un gel no desnaturalizante de
poliacrilamida al 5% en tampón
Tris-glicina-EDTA (TGE, glicina 120
mM y EDTA 1 mM en Tris 25 mM, pH 8,5). Los geles se secaron y
analizaron por exposición a una pantalla de fósforo (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA).
Efecto sobre la contracción in vitro
del músculo liso bronquial. Con el fin de estudiar el efecto de
DHEA in vitro sobre el músculo liso bronquial, se
anestesiaron conejillos de indias macho de cepa Hartley (Charles
River Laboratories, Inc., Wilmington, MA) con pentobarbital sódico
(pentobarbital sódico (Abbott Laboratories) (200 mg/kg
intraperitoneales). Después, se extirparon rápidamente las tráqueas
y pulmones y se sumergieron en solución de
Krebs-Henseleit (K-H) oxigenada que
contenía (mM): 115 NaCl, 25 NaHCO_{3}, 1,38 NaH_{2}PO_{4},
2,5 KCl, 2,46 MgSO_{4}, 1,9 CaCl_{2} y 5,56 dextrosa, aireada
con 95% de O_{2} y 5% de CO_{2}.
Se diseccionaron los bronquios principales
separándolos de tejido conectivo suelto bajo la lupa binocular
(Olympus SZH10) y se extirparon los anillos bronquiales y se
montaron en baños de órganos de doble pared llenos con
K-H a 37ºC y aireados continuamente con una mezcla
de gases de 95% O_{2} y 5% CO_{2}, lo que resultó en un pH de
7,4. Los anillos bronquiales se conectaron a transductores de
fuerza-desplazamiento (Grass FT03) para el registro
continuo de la tensión isométrica sobre papel poligráfico (Gould
RS3800) y se dejó que se equilibrasen durante 90 minutos. Después
del periodo de equilibración, se administró acetilcolina 1 mM y se
realizó el seguimiento de la respuesta. Las preparaciones que no
respondían a acetilcolina se rechazaban, se enjuagaban los anillos
bronquiales con K-H fresco reanudándose después los
experimentos.
Los anillos bronquiales se contrajeron
parcialmente con KCl 3 x 10^{-2} M o acetilcolina 10^{-5} M
(ACh), después se examinó el efecto de DHEA incrementando
acumulativamente su concentración a intervalos del registrador
automático de 10^{-3} a 10^{-4} M y midiendo los cambios
producidos en la tensión activa.
Se eligió una concentración de KCl de 3 x
10^{-2} M a partir de los experimentos preliminares, en los que,
a partir de las curvas de concentración-respuesta al
KCl (10^{-2} a 10^{-1} M) se determinó que la concentración de
KCl que inducía el 50% de la respuesta máxima
(KCl-EC_{50}) en el montaje experimental. La
respuesta máxima a KCl se obtuvo a una concentración de 6,2 x
10^{-2} M (media geométrica, GSEM=1,21), mientras que la
KCl-EC_{50} fue de 2,8 x 10^{-2} M (media
geométrica, GSEM=1,28). De manera similar, se escogió 10^{-5} M
como la concentración de acetilcolina (ACh) que inducía el 50% de
la respuesta máxima.
La administración de KCl 3 x 10^{-2} M produjo
una respuesta contráctil que se redujo ligeramente tras cuatro
horas, es decir, (el tiempo necesario para completar la curva de
concentración-efecto de la DHEA) 22,12 \pm 6,07%
(n=3) menor que la fuerza activa inicial. No se observó reducción
de la respuesta contráctil tras la administración de 10^{-5} de
acetilcolina.
Debido a que se disolvió DHEA en dimetilsulfóxido
(DMSO), se contrajeron cuatro anillos adicionales con KCl 3 x
10^{-2}M (n=5) o ACh 10^{-5} M (n=5) con el fin de determinar
si dicho vehículo producía alguna alteración en la fuerza activa.
Se administró la misma cantidad de DMSO utilizada en los
experimentos con DHEA y se encontró que, tras cuatro horas, la
tensión activa producida en respuesta al KCl 3 x 10^{-2} M se
había reducido en 31,13 \pm 7,21%, lo que se explica
principalmente por el efecto temporal descrito anteriormente. No se
observó efecto del DMSO sobre la tensión activa producida en
respuesta a la ACh 10^{-5} M. La concentración máxima final de
DMSO en el baño de órganos fue del 0,15%.
Tres de las tiras utilizadas para estudiar la
DHEA se enjuagaron con K-H fresco al final del
experimento, se trataron con acetilcolina 1 mM y se realizó un
seguimiento de la respuesta. Los resultados demostraron que la
funcionalidad del músculo liso no se veía alterada por la DHEA.
En un segundo conjunto de experimentos se
administró una dosis única de ACh 10^{-5} M o se llevó a cabo una
curva de concentración-respuesta a ACh en presencia
o ausencia de DHEA 10^{-4} M (administrada 15 minutos antes de la
ACh). La dosis única de ACh se utilizó para medir la tasa de
desarrollo de tensión, mientras que el estudio de
concentración-respuesta se utilizó para evaluar si
la DHEA afectaba a la sensibilidad frente a la ACh.
Efecto sobre la secreción de citoquinas in
vitro por el epitelio traqueobronquial en el hombre. El
efecto de la 16\alpha-BrEA sobre la secreción de
citoquinas por cultivos de epitelio humano se estudio en células
BEAS-2B, las células BEAS-2B, una
línea de células epiteliales respiratorias humanas inmortalizadas
por SV-40 estudiada anteriormente como modelo de
cómo el epitelio traqueobronquial humano secreta citoquinas
proinflamatorias en respuesta a virus y contaminantes atmosféricos
(Subasuste, M.C., Jacoby, D.B., Richards, S.M. y Proud, D.,
Infection of a human respiratory epithelial cell line with
rhinovirus. Induction of cytokine release and modulation of
susceptibility to infection by cytokine exposure, J. Clin.
Invest. 967:549-557, 1995; Noah, T.L. y Becker,
S., Respiratory syncytial virus-induced cytokine
production by a human bronchial epithelial cell line, Am. J.
Physiol. 265:L472-L478, 1993; Devlin, R.B.,
McKinnon, K.P., Noah, T., Becker, S. y Koren, S.H.,
Ozone-induced release of cytokines and
fibronectin by alveolar macrophages and airway epithelial
cells, Am. J. Physiol. 266 (Lung Cell. Mol.
Physiol. 10):L612-L619, 1994) se cultivaron
hasta la confluencia en placas de plástico de 12 pocillos y se
pretrataron durante 1 hora con
16\alpha-bromoepiandrosterona (BrEA) a las
concentraciones indicas o con vehículo dimetilsulfóxido (5 \mul).
Después, se estimularon las células con factor de necrosis tumoral
alfa (TNF \alpha, 40 ng/ml) o ceniza volante de
fuel-oil (ROFA, 50 \mug/ml), un material
particulado contaminante de la atmósfera que se conoce que estimula
la secreción de citoquinas mediante la inhibición de las fosfatasas
membranales (Samet, J.M:, Stonehuerner, J., Reed, W., Devlin, R.B.,
Dailey, L.A., Kennedy, T.P., Bromberg, P.A. y Ghio, A.J.,
Disruption of protein tyrosine phosphate homeostasis in human
bronchial epithelial cells exposed to residual oil fly ash,
Am. J. Physiol. 272 (Lung Cell. Mol. Physiol.
16):L426-L432, 1997). Tras 24 horas (para las
células estimuladas con TNF) o 6 horas (para células estimuladas
con ROFA), se recogieron los medios y se centrifugaron para
eliminar los restos. Se ensayó la concentración de
interleuquina-8 (IL-8) mediante
ELISA comercial (R&D Systems).
Análisis estadístico. Los datos se han
expresado como valores medios \pm error estándar (SEM), excepto
cuando se especifique de manera diferente. El número medio de
réplicas para las mediciones en estudios de la proliferación de
músculo liso traqueobronquial era de cuatro, a menos que se indique
otro número. Se estudiaron las réplicas de 4 a 6 experimentos por
grupo de tratamiento, excepto donde se indique otra cosa. Se
compararon las diferencias entre grupos múltiples utilizando
análisis de varianza unidireccional con medidas repetidas. La
prueba post-hoc utilizada fue la de comparaciones
múltiples de Newman-Keuls. Las diferencias entre
pares de grupos se midieron utilizando la prueba t de Student de
dos colas. El nivel de significancia adoptado fue de p<0,05.
Se expresó la actividad como % de inhibición de
controles tratados con vehículo DMSO provocada por
16\alpha-bromoepiandrosterona (BrEA) o por
dehidroepiandrosterona (DHEA). El DMSO por sí solo no causó
reducción alguna en la actividad de G6PDH bajo las condiciones
experimentales. Cada barra representa la media de por lo menos 3
experimentos. Se describen los métodos en el texto. Se llevaron a
cabo ensayos de glucosa-6-fosfato
deshidrogenasa (G6PDH) de eritrocitos humanos con 0,01 U/ml de
G6PDH de tipo XXVI procedente de eritrocitos humanos (Sigma) con
adición de inhibidores.
Los ensayos de G6PDH en lisados celulares de
músculo liso traqueobronquial se llevaron a cabo en 100 \mul de
lisado celular, al que se añadieron inhibidores. Se pretrataron
monocapas de músculo liso traqueobronquial intacto con inhibidores
1 hora antes de la recolección de las células y del ensayo de G6PDH
con 100 \mul de lisado celular. Todos los ensayos se llevaron a
cabo por triplicado.
Las células BEAS-2B, una línea de
células epiteliales humanas inmortalizadas por
SV-40, se cultivaron hasta la confluencia en placas
de plástico de 12 pocillos y se pretrataron durante 1 hora con
16\alpha-bromoepiandrosterona (BrEA) en las
concentraciones indicadas o con vehículo dimetilsulfóxido (5
\mul). Después, las células se estimularon con factor de necrosis
tumoral alfa (TNF\alpha, 40 ng/ml) o con ceniza volante de
fuel-oil (ROFA, 50 \mug/ml), un material
particulado contaminante de la atmósfera que se conoce que estimula
la secreción de citoquinas al inhibir las fosfatasas membranales.
Tras 24 horas (para las células estimuladas con TNF) o 6 horas
(para las células estimuladas con ROFA), se recogieron los medios y
se centrifugaron para eliminar los restos. Se ensayó la
concentración de interleuquina-8
(IL-8) mediante ELISA comercial (R&D Systems).
Los resultados son medias \pm errores estándar de
4-6 experimentos por grupo de tratamiento. El
vehículo DMSO, como antioxidante, reduce la secreción de
IL-8 (un efecto conocido) pero la BrEA tiene un
efecto inhibitorio mucho más profundo.
Efecto sobre la proliferación de músculo liso
traqueobronquial. Tal como se muestra en la figura 1, la
estimación del número de células mediante la reducción de MTT se
correlaciona estrechamente con el número real de células contado
utilizando un hemocitómetro. La proliferación de músculo liso
traqueobronquial en cultivo se cuantificó utilizando la reducción
metabólica del pigmento soluble de color amarillo bromuro de
tetrazolio
3-[4,5-dimetiltiazol]-2-il-2,5-difenil
tetrazolio (MTT), al pigmento formazán insoluble de color violeta
por la acción de la succinil deshidrogenasa mitocondrial. Ver Hirst
et al. (1992), supra. Se incubaron células de músculo
liso traqueobronquial recién raspadas durante 1 hora en DMEM que
contenía 100 \mug/ml de MTT y 10% de FBS. Las células se
centrifugaron a 1.000 g durante 10 minutos, se lavaron dos
veces con solución salina estéril de Dulbecco modificada tamponada
con fosfato sin Ca^{2+} ni Mg^{2+} (DPBS), se extrajeron con 0,5
ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y se midió a 540 nm la absorbancia
del pigmento solubilizado de color violeta formazán. Se llevó a
cabo un total de 6 experimentos a cada concentración celular. La
absorbancia del producto de reducción de MTT a formazán (A_{540})
se correlacionaba con el número de células según conteos efectuados
con hemocitómetro, con un R^{2}=0,9851.
Para los estudios de proliferación, se sembraron
células en placas de plástico no recubierto de 24 pocillos y se
cultivaron con DMEM y mitógenos. Tras 24 a 96 horas, se sustituyó
el medio con 1 m/pocillo de DMEM fresco que contenía 100 \mug/ml
de MTT y 0,5% de FBS y las placas se incubaron durante una hora
más. Se extrajo el medio que contenía MTT, las células se lavaron
dos veces con 1 ml de DPBS, se añadieron 0,5 ml de DMSO a cada
pocillo, y se determinó el número de células mediante la
absorbancia del formazán solubilizado de color violeta medida a 540
nm. El FBS promovió el crecimiento celular del músculo liso
traqueobronquial de una manera dosis-dependiente,
con el mayor estímulo siendo proporcionado por 10% de FBS.
Los resultados en la figura 2A muestran que el
suero de feto bovino (FBS) promovió el crecimiento
dosis-dependiente entre las 24 y 96 horas. Cada
observación representa la media de 6 experimentos con 15.000 células
por pocillo.
Tal como se muestra en la figura 2B, el factor de
crecimiento AA recombinante humano derivado de plaquetas (PDGF a 50
ng/ml) también estimuló el crecimiento celular aunque no era tan
potente como el FBS. Cada observación representa la media de 6
experimentos con 50.000 células por pocillo.
En el siguiente experimento, DHEA y sus análogos
inhibieron la proliferación estimulada por mitógenos del músculo
liso traqueobronquial. Las células se cultivaron y se cuantificó su
número tal como se ha descrito anteriormente y en la figura 2.
Excepto donde se indique de otra manera, las células se cultivaron
con 10% de FBS o 50 ng/ml de PDGF, 10% de FBS o 50 ng/ml de PDGF +
5 \mul de vehículo DMSO y 10% de FBS o 50 ng/ml PDGF + inhibidores
en DMSO añadidos a cada pocillo. La figura 3A muestra el efecto de
DHEA y de DHEA-sulfato sobre el crecimiento
estimulado por 10% de FBS tras el cultivo durante 92 horas. Cada
barra representa la absorbancia MTT-formazán media
en 6-12 experimentos producidos por 15.000
células/pocillo cultivados durante 92 horas. Se observaron
resultados similares en los experimentos de duración 72 horas. La
DHEA fue más activa que la DHEA-sulfato a las
concentraciones elevadas.
Tal como se muestra en la figura 3B, la DHEA
también inhibió la proliferación celular estimulada por PDGF. Cada
barra representa la media de 4 experimentos con 50.000
células/pocillo cultivadas durante 72 horas.
Tal como se muestra en la figura 3C, la
16\alpha-bromoepiandrosterona
(16\alpha-BrEA) era un inhibidor incluso más
potente de la proliferación celular inducida por FBS que la DHEA.
Cada barra representa la media de 4 experimentos con 15.000
células/pocillo cultivadas durante 96 horas. También se muestra un
control negativo incubado con 0,5% de FBS como comparación. Se
observaron resultados similares en los experimentos de duración 48
horas.
Tal como se muestra en la figura 3D, la
16\alpha-BrEA también es más potente que el
glucocorticoide dexametasona (concentración inhibitoria del 50% =
7,5 \muM para la 16\alpha-BrEA frente a los 10
\muM de la dexametasona), especialmente a las concentraciones más
elevadas. Cada barra representa la media de 6 a 18 experimentos con
50.000 células/pocillo cultivadas en 10% de FBS durante 48 horas.
Se observaron resultados similares en los experimentos llevados a
cabo con metilprednisolona.
Tal como se muestra en la figura 4A, la
inhibición del crecimiento celular por la dehidroepiandrosterona
(DHEA) y por 16\alpha-bromoepiandrosterona (BrEA)
queda confirmada por los conteos celulares. Las células se
cultivaron y el número de células se cuantificó tal como se ha
descrito anteriormente y en la figura 2. Cada barra representa el
conteo visual directo medio de células teñidas en 6 experimentos
producidos por 15.000 células/pocillo cultivados durante 24
horas.
La figura 4B muestra que la
16\alpha-bromoepiandrosterona (BrEA) no
incrementa la actividad de LDH en el sobrenadante a las 24 horas. En
este ejemplo se cultivaron células de músculo liso traqueobronquial
hasta su confluencia y se incubaron con 5 \mul/pocillo de
vehículo DMSO o con 16\alpha-BrEA en vehículo
durante 24 horas antes de la medición de la actividad de LDH en el
sobrenadante, en la que 1,0 unidad reduce 1,0 \mumol de piruvato
a L-lactato por minuto a pH 7,5 y 37ºC. Cada barra
representa la media de 6 experimentos. Se observaron resultados
similares tras incubación de 2 horas con inhibidor. No se
observaron diferencias significativas entre las células tratadas
con 16\alpha-BrEA y las tratadas solo con vehículo
DMSO.
La DHEA y la 16\alpha-BrEA
inhiben la actividad de G6PDH purificada de eritrocitos humanos y
la actividad de G6PDH al añadirlos directamente a lisados celulares
de músculo liso traqueobronquial, tal como se muestra en la Tabla I.
Sin embargo, al tratar previamente las monocapas con diferentes
concentraciones de DHEA o de 16\alpha-BrEA que
inhibían la proliferación celular, después no se observaron
reducciones significativas de actividad de G6PDH en los lisados
celulares (Tabla I).
Además, en contraste con los resultados obtenidos
en líneas celulares malignas e inmortalizadas, la adición de
ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos al medio de cultivo no
eliminó la inhibición del crecimiento inducida por DHEA o por
16\alpha-BrEA (figuras 5A a 5D). Conjuntamente
estos datos sugieren que la DHEA y la
16\alpha-BrEA no alteran la proliferación de las
células de músculo liso traqueobronquial mediante la alteración de
la formación de ribosas y desoxirribosas dependiente de la ruta de
las hexosas monofosfato y que es necesaria para la síntesis de ARN y
ADN. En este ejemplo se cultivaron células y se cuantificaron tal
como se ha descrito anteriormente. Cada barra representa la
absorbancia MTT-formazán media en 4 experimentos
con 50.000 células/pocillo cultivadas durante 24 horas (figuras 5A
y 5C) o durante 48 horas (figuras 5B y 5D) en DMEM y 10% de FBS en
presencia o en ausencia de DHEA o de
16\alpha-BrEA y con 200 \muM de ribonucleósidos
(R, adenosina, guanosina, citidina y uridina) o
desoxirribonucleósidos (D, desoxiadenosina, desoxiguanosina,
desoxicitidina y timidina).
Tal como se muestra en la figura 6A, la
suplementación del medio con ácido mevalónico no consiguió eliminar
la inhibición del crecimiento de las monocapas de músculo liso
traqueobronquial inducida por 16\alpha-BrEA. En
este ejemplo las células se cultivaron y cuantificaron tal como se
ha descrito anteriormente. Cada barra representa la absorbancia
MTT-formazán media de 6 experimentos con 50.000
células/pocillo cultivadas durante 36 horas en 0,5% de FBS, 10% de
FBS, 10% de FBS + 5 \mul de vehículo DMSO y 10% de FBS +
inhibidores en DMSO añadidos a cada pocillo, en presencia o en
ausencia de 6 mM de mevalonato en DMEM. Se observaron resultados
similares con la DHEA.
En la figura 6B se muestra que el tratamiento con
16\alpha-BrEA no consume p21^{ras} en membranas
de células cultivadas de músculo liso traqueobronquial. El gel
mostrado es un inmunoblot representativo de la proteína Ras
de 21 kd de cantidades iguales de fracción de proteína membranal
procedente de monocapas confluyentes tratadas durante 24 horas con
0,5% de FBS (carril 1), con 10% de FBS (carril 3), con 10% de FBS +
vehículo DMSO (carril 5) y con 10% de FBS + 10 \muM de
16\alpha-BrEA (carril 7), respectivamente. Los
carriles 2, 4, 6 y 8 son inmunoblots de las fracciones sobrenadantes
correspondientes. El carril 9 representa un inmunoblot de lisado de
células A431.
Finalmente, la interferencia con la transducción
de señales mediada por Ras/Raf se preveía que alterase la
expresión de los genes de respuesta temprana, tales como
c-fos. Sin embargo, la
16\alpha-BrEA no redujo la estimulación de la
proteína c-fos (figura 7A) o del ARNm (figura
7B y 7C) observada normalmente en respuesta a la adición de 10% de
FBS. Estos resultados sugieren que la DHEA y sus análogos no
alteran sucesos de transducción temprana de señales que son
importantes para las respuestas proliferativas del músculo liso. La
figura 7A es un inmunoblot representativo de la proteína
c-fos de monocapas de control tratadas con
0,5% de FBS (carril 2) o con 10% de FBS a los 15 minutos (pistas 3
a 6), 30 minutos (pistas 6 a 8) y 60 minutos (pistas 9 a 11)
después de la estimulación. Las células en los carriles 4, 7 y 10 se
pretrataron con vehículo DMSO 2 horas antes de la estimulación. Las
células en los carriles 5, 8 y 11 se pretrataron con 10 \muM de
16\alpha-BrEA. El carril 1 es un inmunoblot de
lisado de células A431. En la figura 7B, los geles de los PCR de
los experimentos fueron los siguientes: pistas 1 a 3, control de
0,5% de FBS; pistas 4 a 6, control de 10% de FBS; pistas 7 a 9, 10%
de FBS pretratado con 10 \muM de 16\alpha-BrEA;
pistas 10 a 12, 10% de FBS pretratado con vehículo DMSO. En la
figura 7C se muestra un resumen de los experimentos que se muestran
en la figura 7B. La expresión del ARNm de
c-fos se ha normalizado respecto al gen de
mantenimiento de la \beta-actina. En la figura 7C
se ha normalizado la expresión del ARNm de
c-fos respecto al gen de mantenimiento
\beta-actina.
La figura 8 muestra ensayos de movilidad
electroforética de proteína nuclear procedente de células de
músculo liso traqueobronquial pretratadas con DHEA o con
16\alpha-BrEA durante 2 horas previamente a la
estimulación con 10% de FBS. Se aisló la proteína nuclear después
de 6 horas y a continuación se llevaron a cabo los ensayos de
movilidad electroforética (EMSA). Las figuras 8A-8B
muestran geles representativos de experimentos llevados a cabo por
lo menos 3 veces con cada inhibidor. En la figura 8A, EMSA de
células pretratadas con DHEA: carril 1, 0,5% de FBS, carril 2, 10%
de FBS, carril 3, 10% de FBS + 50 \muM de DHEA; carril 4, 10% de
FBS + vehículo DMSO. En la figura 8B, EMSA de células pretratadas
con 16\alpha-BrEA: Carril 1, 0,5% de FBS; carril
2, 10% de FBS; carril 3; 10% de FBS + vehículo DMSO; carril 4, 10%
de FBS + 2 \muM de 16\alpha-BrEA; carril 5, 10%
de FBS + 10 \muM de 16\alpha-BrEA (figura 8C).
EMSA de células estimuladas con 10% de FBS. La reacción de unión en
el carril 2 se llevó a cabo con una cantidad idéntica de proteína
nuclear a la del carril 1 pero en presencia de competición por
parte de la secuencia oligonucleotídica de tipo silvestre sin
marcar 10X para AP-1. Los resultados muestran que
la DHEA (figura 8A) y la 16\alpha-BrEA (figura 8B)
inhiben la unión al ADN de AP-1.
Efecto in vitro sobre la contracción de
músculo liso bronquial. La figura 9 muestra la curva de
concentración-efecto de la DHEA sobre bronquios
principales aislados de conejillos de indias parcialmente contraídos
con KCl 3 x 10^{-2} M. En comparación con su vehículo se encontró
que el efecto era estadísticamente significativo (P<0,01). La
concentración máxima de DHEA causó una relajación del 76,28 \pm
6,96% en la contracción inducida por KCl (valor obtenido después de
sustraer la reducción de fuerza debida al
tiempo-vehículo). La concentración de DHEA que
producía una relajación del 50% de la contracción inducida por KCl
era de 2,16 x 10^{-5} M (GSEM=1,11). En la figura 9, los círculos
blancos representan experimentos con DHEA y los cuadrados blancos
son experimentos con vehículo DMSO solo. Cada punto es una media
\pm SEM. n=6 para la DHEA, n=5 para el vehículo DMSO.
La figura 10 muestra el efecto de DHEA sobre los
bronquios parcialmente contraídos con ACh 10^{-5} M. La DHEA
10^{-4} M causó una relajación del 37,98 \pm 4,76% de la
contracción inducida por ACh (P<0,01 en comparación con su
vehículo). En la figura 10, los círculos blancos representan
experimentos con DHEA y los cuadrados blancos son experimentos con
sólo vehículo. Cada punto es una media \pm SEM y n=5.
La curva de
concentración-respuesta a ACh fue desplazada a la
derecha por la presencia de DHEA 10^{-4} M (figura 11). Los
valores de ACh-EC_{50} fueron de 1,4 x 10^{-5}
M (media geométrica GSEM=1,2) y de 8,4 x 10^{-6} M (media
geométrica GSEM=1,3), respectivamente, en presencia y en ausencia de
DHEA 10^{-4} M (P<0,05). En la figura 11, los círculos blancos
representan en presencia y los cuadrados blancos en ausencia de
DHEA 10^{-4} M. Cada punto es una media \pm SEM y n=5.
Finalmente, DHEA 10^{-4} M redujo la tasa de
desarrollo de tensión en respuesta a ACh 10^{-5} M de 2,27 \pm
0,82 a 1,85 \pm 0,85 (P<0,05 mediante prueba t para muestras
apareadas.
Efecto in vitro sobre la secreción de
interleuquina-8 por el epitelio traqueobronquial en
el hombre. Tal como se muestra en la Tabla II, la
16\alpha-BrEA causó una inhibición
dosis-dependiente de la secreción de
interleuquina-8 (IL-8) en respuesta
a la estimulación de las células BEAS con TNF, una potente
citoquina proinflamatoria presente en muchas enfermedades
pulmonares agudas, incluyendo el asma, y a materiales particulados
contaminantes del aire. El vehículo DMSO, al ser un antioxidante
reduce la secreción de IL-8 (un efecto conocido),
aunque la BrEA la inhibe de manera mucho más profunda.
Se ha demostrado que la proliferación de células
de músculo liso traqueobronquial de rata se reduce sustancialmente
mediante tratamiento con concentraciones farmacológicas de DHEA y
de 16\alpha-bromoepiandrosterona (figura 3). Esta
inhibición se ha demostrado mediante ensayos metabólicos
relacionado con el número de células y mediante reducciones en
conteos visuales de células realizados directamente (figura
4A).
Además, la DHEA y 16\alpha-BrEA
inhiben la actividad G6PD cuando se añaden directamente a la mezcla
de reacción que contiene enzima purificado o lisado celular (Tabla
I). Sin embargo, la DHEA y 16\alpha-BrEA no
inhibieron la actividad G6PD cuando las monocapas celulares mismas
se trataron previamente a la recolección de enzima (Tabla I).
Además, DHEA era más potente que 16\alpha-BrEA
como inhibidor de la actividad G6PD en lisados celulares, aunque
exactamente lo contrario era cierto para los dos agentes como
inhibidores de la proliferación de músculo liso traqueobronquial
(figura 3). Además, la inhibición de G6PD se cree que altera el
crecimiento celular a través de la interferencia con la producción
de los azúcares ribosa y desoxirribosa, necesarios para la síntesis
de ARN y ADN, aunque el suministro exógeno de estos factores
mediante adición de ribonucleósidos y desoxirribonucleósidos al
medio de crecimiento no consiguió eliminar la inhibición del
crecimiento celular debida a DHEA y
16\alpha-BrEA. De esta manera, el mecanismo de
inhibición de la proliferación del músculo liso traqueobronquial
por DHEA y 16\alpha-BrEA es improbable que
interfiera con la actividad G6PD.
La adición de mevalonato al medio de cultura no
eliminó los efectos inhibitorios del crecimiento de la
16\alpha-BrEA (figura 6A), como tampoco se
consumió proteína Ras de las membranas celulares con el tratamiento
con 16\alpha-BrEA (figura 6B). Además, el
tratamiento de monocapas con concentraciones inhibitorias del
crecimiento de 16\alpha-BrEA dejó intacta la
expresión normal del gen de respuesta temprana
c-fos (figura 8), proporcionando evidencia
adicional de que la DHEA y sus análogos no alteraron sucesos
importantes de transducción de señales mediadas por Ras ni alteraron
la función de la ruta de la MAP-quinasa. Estos
datos sugieren que la DHEA y sus análogos no inhibieron el
crecimiento del músculo liso traqueobronquial por interferencia con
la biosíntesis del colesterol ni, de manera secundaria, con la
unión de Ras a las membranas celulares y con la transducción
de señales mediada por Ras necesaria para el
crecimiento.
DHEA y 16\alpha-BrEA reducen la
unión al ADN del factor transcripcional AP-1 en
ensayos de movilidad electroforética llevados a cabo con proteína
nuclear procedente de células tratadas (figura 9). La
transactivación de genes de respuesta secundaria por el activador
de la proteína-1 (AP-1) es un punto
importante de convergencia de múltiples rutas a través de las que
muchos factores de crecimiento estimulan la proliferación celular
(Angel, P. y Karin, M., The role of Jun, Fos and the
AP-1 complex in cell proliferation and
transformation, Biochim. Biophys. Acta
1072:129-157, 1991). La transrepresión de
AP-1 se ha demostrado que explica los efectos
antiproliferativos de los glucocorticoides (Heck, S., Kullmann, M.,
Gast, Al, Ponta, H., Rahmsdorf, H.J., Herrlich, Pl. y Cata, A.C.B.,
A distinct modulating domain in glucocorticoid receptor monomers
in the repression of activity of the transcription factor
AP-1, EMBO J.
17:4087-4095, 1994). Aunque la DHEA no es un
glucocorticoide, también se ha dado a conocer que interacciona con
receptores esteroides del citoplasma (Meikel, A.W., Dorchuck, R.W.,
Araneo, B.A., Stringham, J.D., Evans, T.G., Spruance, S.L. y Daynes,
R.A., The presence of
dehydroepiandrosterone-specific receptor binding
complex in murine T cells, J. Steroid Biochem. Molec.
Biol. 42:293-304, 1992). De esta manera, es
probable que la DHEA y sus análogos también interfieran con la
unión al ADN de la AP-1, interrumpiendo de esta
manera los procesos de transducción de señales mediados por
AP-1 e inhibiendo respuestas proliferativas frente a
una amplia variedad de mitógenos, incluyendo PDGF y los que se
encuentran en el suero de feto bovino. La interrupción de las
respuestas frente a AP-1, por lo tanto,
proporcionan la mejor explicación de cómo DHEA y sus análogos
alteran la proliferación del músculo liso.
Además de prevenir la proliferación y remodelado
del músculo liso traqueobronquial, la DHEA y sus análogos podrían
tener otros potenciales efectos terapéuticos sobre el asma.
En primer lugar, la DHEA y sus análogos podrían
utilizarse como agentes para evitar la utilización de los
glucocorticoides. Se ha planteado la hipótesis de que la
resistencia adquirida a los glucocorticoides podría deberse en parte
a la sobreexpresión inducida por citoquinas de complejos
AP-1 que se unen y transreprimen el complejo
receptor activado de glucocorticoides (Adcock, Lane et al.
(1995), supra). La DHEA o complejo análogo/receptor, podría,
en su lugar, unirse de manera irreversible a AP-1,
liberando receptores activados de glucocorticoides que podrían
unirse a elementos sensibles a los glucocorticoides (GRE),
venciendo de esta manera la relativa resistencia a los
glucocorticoides del estado inflamatorio.
En segundo lugar, la DHEA y sus análogos podrían
presentar actividad antiinflamatoria por derecho propio. Muchos
genes inmunoreguladores contienen sitios promotores de
AP-1 y la inhibición de AP-1 podría
impactar negativamente sobre la expresión de las citoquinas
proinflamatorias. Además, se ha dado a conocer que la DHEA reduce
la activación del factor nuclear de transcripción \kappaB
(NF-\kappaB) (Yang, Y.U., Schwartz, A. y
Henderson, E.E., Inhibition of HIV-1 latency
reactivation by dehydroepiandrosterone (DHEA) and an analog of
DHEA, AIDS Re. Hum. Retroviruses
9:747-754 (1993). También se ha descubierto que la
16\alpha-BrEA reduce la secreción de
interleuquina-8 estimulada por factor de necrosis
tumoral y por contaminantes particulados del aire en cultivos de
epitelio respiratorio humano (Tabla II). La reducción de la
secreción de citoquinas proinflamatorias se prevé que reduzca las
respuestas inflamatorias globales dentro de las vías respiratorias
asmáticas.
En tercer lugar, la DHEA podría funcionar como
abridor del canal de K^{+} activado por Ca^{2+} (K_{Ca})
(Peng, W., Hoidal, J.R. y Farrukh, I.S., Dehydroepiandrosterone,
a novel Ca^{2+}-activated K^{+} channel
opener, Am. Rev. Respir. Crit. Care Med., 155, A790
(1997, resumen), relajando vasos arteriales sistémicos (Barbagallo,
M., Shan, J., Pang, P.K.T. y Resnick, L.M., Effects of
dehydroepiandrosterone sulfate on cellular calcium responsiveness
and vascular contractility, Hypertension
26:1065-1069 (1995) y pulmonares (Farrukh, I.S.,
Peng, W., Orlinska, U. y Hoidal, J.R.,
Dehydroepiandrosterone-mediated pulmonary
vasodilation of hypoxic ferret lungs: a novel mechanism, Am.
J. Respir. Crit. Care Med. 153:A586 (1996, resumen) contraídos
mediante una diversidad de agonistas, e invirtiendo la contracción
inducida por KCl del músculo liso traqueal del conejillo de indias.
De esta manera, la DHEA presentaría actividad broncodilatadora
directa sobre el músculo liso traqueobronquial. Además, la DHEA y
sus análogos podrían actuar sinérgicamente con broncodilatadores
beta-adrenérgicos en la relajación del músculo liso
traqueobronquial. Se han relacionado los canales K_{Ca} con
proteínas diana importantes para la relajación inducida por
agonistas de los adrenoceptores beta-2 (Kume, H.,
Takail, A., Tokuno, H. y Tomita, T., Regulation of
Ca^{2+}-dependent K^{+}-channel
activity in tracheal myocytes by phosphorylation, Nature
341:152 (1989); Jones, T.R., Charette, L., Garcia, M.L. y
Kaczorowski, G.J., Selective inhibition of relaxation of
guinea-pig trachea by charybdotoxin, a potent
Ca^{++}-activated K^{+} channel inhibitor,
J. Pharmacol. Exp. Ther. 255:697 (1990); Miura, M., Belvisi,
M.G., Stretton, C.D., Yacoub, M.H. y Barnes, P.J., Role of
potassium channels in bronchodilator responses in human
airways, Am. Rev. Respir. Dis. 146:132, 1992; Kume, H.
Grazizno, M.P. y Kotlikoff, M.I., Stimulatory and inhibitory
regulation of calcium-activated potassium channels
by guanine nucleotide-binding proteins,
Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 89:110551 (1992). Estos
canales se encuentran densamente distribuidos en las membranas
celulares del músculo liso traqueobronquial en el hombre (Snetkov,
V.A., Hirst, S.J., Twort, C.H.C. y Ward, J.P.T., Potassium
currents in human freshly isolated bronchial smooth muscle
cells, Br. J. Pharmacol. 115:1117 (1995).
Los agonistas beta abren canales Kca mediante el
incremento de la concentración intracelular de AMPc, activando de
esta manera a la proteína quinasa A, que a su vez fosforila el
canal K_{Ca} (Kume, H., Takail, A., Tokuno, H. y Tomita, T.,
Regulation of Ca^{2+}-dependent
K^{+}-channel activity in tracheal myocytes by
phosphorylation, Nature 341:152 (1989), o los agonistas
beta estimulan la actividad del canal K_{Ca} mediante un
mecanismo dependiente de la proteína G e independiente de la
proteína quinasa A (Yatani, A., Codina, J., Imoto, Y., Reeves,
J.P., Birnbaumer, L. y Brown, A.M., A G protein directly
regulates mammalian cardiac calcium channels, Science
238:1288 (1987); Yatanni, A., Imoto, Y., Codina, J., Hamilton, S.L.,
Brown, A.M. y Birnbaumer, L., The stimulatory G protein of
adenylylcyclose, Gs also stimulates
dihydropyridine-sensitive Ca^{2+} channels.
Evidence of direct regulation independent of phosphorylation by
cAMP-dependent protein kinase or stimulation by a
dihydropyridine agonist, J. Biol. Chem. 263:9987 (1988).
Ambos mecanismos dependientes de agonistas beta son susceptibles de
inhibición por fenómenos tales como la desensibilización frente a
receptores beta, un problema común en las vías respiratorias
inflamadas de los asmáticos. La DHEA ofrecería un enfoque "de
desvío" al activar los canales K_{Ca} directamente, sin tener
que pasar por las interacciones entre agonista beta y receptor. Esto
podría ser especialmente útil para el asmático agudo, quien ya es
relativamente insensible a la relajación bronquial mediante
agonistas beta.
La hiperreactividad de las vías respiratorias
inducida vagalmente en el asma está causada por el no
funcionamiento del receptor neuronal muscarínico M_{2} situado en
el nervio vago. Estos receptores normalmente funcionan inhibiendo
la liberación de acetilcolina inducida por el nervio vago, limitando
de esta manera la broncoconstricción inducida por éste. Los
receptores neuronales muscarínicos M_{2} no funcionan en el
asmático (Ayala, L.E. y Ahmed, T., Is there loss of a protective
muscarinic receptor in asthma?, Chest
96:1285-1291 (1989); Minette, P. y Barnes, P.J.,
Prejunctional inhibitory muscarinic receptors in cholinergic
nerve terminales in human and guinea-pig
airways, J. Appl. Physiol. 64:2532-2537
(1988), causando que cualquier irritante que estimule reflejos
vagales produzca una broncoconstricción exagerada en el paciente
asmático. Mediante la inhibición de la broncoconstricción inducida
por la acetilcolina, la DHEA y sus análogos podrían reducir la
hiperreactividad generalizada y mediada por el nervio vago de las
vías respiratorias en el asma y que contribuye globalmente a los
síntomas asmáticos.
Finalmente, el tratamiento in vitro con
DHEA incrementa la producción de interleuquina-2
por parte de los linfocitos (Meikle et al. (1992),
supra) planteando la posibilidad de que la DHEA o sus
análogos promuevan la reversión de los linfocitos en las vías
respiratorias asmáticas del estado TH2 al estado TH1. Ver Robinson,
D.S., Hamid, Q., Ying, S., Tsicopoulos, A., Barkans, J., Bentley,
A.M., Corrigan, C., Durham, S.R. y Kay, A.B., Predominant
TH2-like bronchoalveolar
T-lymphocyte population in atopic asthma, N.
Engl. J. Med. 326:298-304 (1992).
Se ha demostrado que, basándose en sus efectos
antiproliferativos, la DHEA y sus análogos ofrecen utilidad como
tratamiento para el remodelado del músculo liso traqueobronquial en
el hombre. Una ventaja de estos agentes sobre los glucocorticoides
es su abanico de efectos ligeramente anabólicos y
antiglucocorticoides. Ver Regelson, W. y Kalimi, M.,
Dehydroepiandrosterone (DHEA)-the
multifunctional steroide. II. Effects on the CNS, cell
proliferation, metabolic and vascular, clinical and other effects.
Mechanism of action?, Ann. N.Y. Acad. Sci.
719:564-575 (1994). De esta manera, la DHEA o sus
análogos podrían proporcionar incluso un nuevo enfoque en el
tratamiento de las enfermedades respiratorias sin las consecuencias
negativas a largo plazo de la utilización de corticoesteroides
sobre la presión sanguínea o sobre el metabolismo de la glucosa y
de los huesos.
Claims (26)
1. Utilización de un compuesto que presenta la
fórmula siguiente:
en la
que
X es halógeno, hidroxi o hidrógeno;
Y es hidrógeno;
Z es hidrógeno,
en la preparación de un medicamento que comprende
una cantidad farmacéuticamente efectiva de dicho compuesto para
tratar el asma crónica en un animal que la sufre.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho compuesto se selecciona de entre el grupo que consiste en
16\alpha-bromo-5-androsten-17-ona,
16\beta-bromo-5-androsten-17-ona,
16\alpha-fluoro-5-androsten-17-ona,
16\beta-fluoro-5-androsten-17-ona,
16\alpha-bromo-5-androstan-17-ona,
16\beta-bromo-5-androstan-17-ona,
16\alpha-fluoro-5-androstan-17-ona,
y
16\beta-fluoro-5-androstan-17-ona.
3. Utilización según la reivindicación 1, en la
que una cantidad efectiva de compuesto se encuentra comprendida
entre 2 y 10 mg/kg/día.
4. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho compuesto es 16-bromo o análogo fluorado
y dicha cantidad efectiva de compuesto se encuentra comprendida
entre 0,2 y 2 mg/kg/día.
5. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento se formula para su administración por
aerosolización.
6. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento se formula para su administración mediante
inhalador de dosis medidas.
7. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento se formula para su administración mediante
inhalador de dosis de polvos.
8. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento se formula para su administración mediante
inhalación de fármaco formulado como parte de un portador
liposómico.
9. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento se formula para la administración de dicho
compuesto de manera directa en el tracto respiratorio.
10. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento es para inhibir la broncoconstricción.
11. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento es para inhibir la secreción relacionada con
el asma de citoquinas inflamatorias por el epitelio de las vías
respiratorias.
12. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento es para inhibir la hiperactividad vagal de
las vías respiratorias mediada por acetilcolina en el asma.
13. Utilización según la reivindicación 1, en la
que dicho medicamento es para potenciar la actividad
broncodilatadora de los broncodilatadores agonistas beta.
14. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el compuesto es
16\alpha-fluoro-5-androsten-17-ona.
15. Utilización según la reivindicación 1, en la
que el compuesto es
16\alpha-fluoro-5-androstan-17-ona.
16. Utilización de un compuesto que presenta la
fórmula siguiente:
en la
que
X es halógeno, hidroxi o hidrógeno;
Y es hidrógeno;
Z es hidrógeno,
en la preparación de un medicamento que comprende
una cantidad farmacéuticamente efectiva de dicho compuesto para
inhibir la proliferación de músculo liso traqueobronquial en el
tratamiento del asma en un animal.
17. Utilización de un compuesto que presenta la
fórmula siguiente:
en la
que
X es halógeno, hidroxi o hidrógeno;
Y es hidrógeno;
Z es hidrógeno,
en la preparación de un medicamento que comprende
una cantidad farmacéuticamente efectiva de un compuesto para inhibir
la unión al ADN de AP-1 en el tratamiento del asma
en un animal.
18. Utilización según la reivindicación 17, en la
que dicho medicamento es para reducir la insensibilidad a los
glucocorticoides en el asma mediante la inhibición del
AP-1.
19. Utilización según la reivindicación 16 ó 17
en la que dicho compuesto se selecciona de entre el grupo que
consiste en
16\alpha-bromo-5-androsten-17-ona,
16\beta-bromo-5-androsten-17-ona,
16\alpha-fluoro-5-androsten-17-ona,
16\beta-fluoro-5-androsten-17-ona,
16\alpha-bromo-5-androstan-17-ona,
16\beta-bromo-5-androstan-17-ona,
16\alpha-fluoro-5-androstan-17-ona,
y
16\beta-fluoro-5-androstan-17-ona.
20. Utilización según la reivindicación 19, en la
que dicho compuesto es
16\alpha-fluoro-5-androsten-17-ona
o
16\alpha-fluoro-5-androstan-17-ona.
21. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, en la que dicho medicamento se formula
para su administración mediante aerosolización.
22. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, en la que dicho medicamento se formula
para su administración mediante inhalador de dosis medidas.
23. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, en la que dicho medicamento se formula
para su administración mediante inhalador de dosis de polvos.
24. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, en la que dicho medicamento se formula
para su administración mediante inhalación de fármaco formulado
como parte de un portador liposómico.
25. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, en la que dicho medicamento se formula
para la administración de dicho compuesto de manera directa en el
tracto respiratorio.
26. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, en la que dicho animal es el hombre.
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