JP2000016939A - Ａｐ―１のｄｎａ結合及び気道平滑筋増殖を阻害するアンドステロン誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、気道平滑筋の増殖を阻害するため
のアンドロステロン誘導体の使用に関する発明である。 【解決手段】 本発明は、副腎ステロイドデヒドロエピ
アンドロステロンとそのいくつかの類似物質たる16α-
ブロモ-5-アンドロステン-17-オン、16β-ブロモ-5-ア
ンドロステン-17-オン、16α-フルオロ-5-アンドロステ
ン-17-オン、16β-フルオロ-5-アンドロステン-17-オ
ン、16α-ブロモ-5-アンドロスタン-17-オン、16β-ブ
ロモ-5-アンドロスタン-17-オン、16α-フルオロ-5-ア
ンドロスタン-17-オン及び16β-フルオロ-5-アンドロス
タン-17-オンを第二期の成長反応遺伝子の活性化を阻害
し、ヒトにおける喘息の気道リモデリングの治療に用い
る治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、気道平滑筋の増殖
を阻害するためのアンドステロン誘導体類の使用に関す
る。特に、本発明は、気道平滑筋の弛緩と気管支拡張の
ため、さらにヒト気道上皮からの炎症性サイトカインの
分泌を阻害するためのデヒドロエピアンドロステロン
（DHEA : dehydroepiandrosterone）と16−フッ素化と
臭素化類似物質の使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】これまで、喘息は、一過性の可逆性気道
閉塞と規定されていた。Am. Rev. Respir. Dis.、85、7
62-768 (1962)に記載のAmerican Thoracic SocietyのNa
tionalTuberculosis Associationの医学部門による「慢
性気管支炎、喘息及び肺気腫：非結核性疾患診断基準委
員会の声明」を参照のこと。現在では、慢性の重症喘息
患者は、不可逆性の気道閉塞を示すと考えられている。
例えば、次の文献を参照のこと。Thorax, 39, 131-136,
1984に記載のBrown、J.P.、Breville、W.H.、Finucan
e、K.E.による「喘息及び不可逆性気道閉塞」とAm. Re
v. Respir. Dis.,142, 832-836 (1990)に記載のJunipe
r、E.F.、Kline、P.A.、Vanieleghem、M.A.、Ramsdal
e、E.H.、O'Byrne、P.M.とHargreave、F.E.による「吸
入コルチコステロイド（budesonide）による長期間の治
療が非ステロイド依存性喘息患者における気道過敏反応
及び臨床的喘息に与える影響」。

【０００３】この合併症は、他の部分のリモデリングと
同様に、気道の構造的なリモデリングから起こり、細胞
の過形成と肥大（Am. Rev. Respir. Dis., 148, 720-72
6 (1993)に記載のEbina, M., Takahasi, T., Chiba, T.
とMotomiya, M.による“気管支喘息の原因である気管平
滑筋の細胞過形成及び肥大”）からの平滑筋塊の増加と
なって顕われる（Eur. Respir. J., 7, 337-341(1994)
に記載のBramley, A.M., Thomson, R.J., Roberts, C.
R.とSchellenberg, R.R.による“喘息における過度の気
管支収縮は気道のエラスタンスの減少による”とJ. App
l. Physiol., 74,2771-2781(1993)に記載のLambert, R.
K., Wiggs, B.R., Kuwano, K., Hogg, J.C.とPare, P.
D.による“喘息及び慢性閉塞性肺疾患COPDにおける増加
気道平滑筋の機能的意義”）。

【０００４】気道の平滑筋の肥厚は、ひいては、喘息の
特徴である非特異的気管支過敏反応の原因となると考え
られる（Am. Rev. Respir .Dis., 138, 136-139(1989)
に記載のJames, A.L., Hogg, J.C., Dunn, L.A,及びPar
e, P.D.による“気道のサイズを比較し、平滑筋の収縮
を計算するための内部視野計の使用”、Am. Rev. Respi
r. Dis., 139, 242-246 (1989)に記載のJames, A.L., P
are, P.D.とHogg, J.C.による“喘息における気道狭窄
の力学”とAm. Rev. Respir. Dis., 143, 1189-1193 (1
991)に記載のPare, P.D., Wiggs, B.R., Hogg, J.C.とB
osken, C.による“喘息及び慢性閉塞性肺疾患における
気道の比較力学及び形態学”）。喘息患者における気道
のリモデリングは、現在の気管支拡張及び抗炎症治療で
はしばしば臨床的に治りにくい（例えば、前述のBrown
他の文献(1984)とJuniper他の文献(1990)を参照のこ
と）。このプロセスが起きるのを妨げるような新しい治
療方法が必要とされている。

【０００５】以前に行われた血管組織における研究によ
ると、移植された心臓でのアテローム性冠状動脈硬化症
の亢進は、デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)による
治療により減少する。Circ., 87, 261-269 (1993)に記
載のEich, D.M., Nestler, J.E., Johnson, D.E., Dwor
kin, G.H., Ko, D., Wechsler, A.S.とHess, M.L.によ
る“心臓移植した異所性ウサギモデルにおいてデヒドロ
エピアンドロステロンを用いたアテローム性冠状動脈硬
化症の亢進の阻害”を参照のこと。

【０００６】デヒドロエピアンドロステロン(DHEA)とそ
の表面複合物(DHEAs)は主として副腎皮質から分泌され
るステロイド生成物であるが、DHEAの生理学的役割につ
いてはまだ知られていない。Lancet, 343, 1479-1481
(1994)記載のEbeling, P.とKovisto, V.A.による“デヒ
ドロエピアンドロステロンの生理学的重要性”を参照の
こと。DEHAとその合成類似物質は、動物の腫瘍モデルと
悪性の細胞系では抗増殖的である。例えば、Cancer Re
s., 48, 4817-4822(1988)に記載のSchwartz, A.G., Lew
bart, M.L.とPashko, L.L.による“マウス及びラットに
おいて生物活性が増加し副作用が減少した新規デヒドロ
エピアンドロステロン類似物質類”とAnn. N.Y. Acad.
Sci., 774, 180-186 (1995)に記載のSchwartz, A.G.とP
ashko, L.L.による“DHEAの癌阻害作用のメカニズム：
グルコース-6-りん酸脱水素酵素の役割”を参照のこ
と。

【０００７】この作用は、グルコース-6-りん酸脱水素
酵素の阻害とそれに続くリボヌクレオシドの遮断とデオ
キシリボヌクレオチドの形成（Life Sci., 38,1451-145
7 (1986)に記載のDworkin, C.R., Gorman, S.D., Pashk
o, L.L., Cristofalo, W.J.とSchwartz, A.G.による
“デヒドロエピアンドロステロンによるHeLaとWI-38細
胞の成長の阻害とリボ及びデオキシリボヌクレオシドに
よるその逆の作用”、Carcinogenesis, 9, 931-938 (19
88)に記載のGarcea, R., Diano, L., Frassetto, S.,
Cozzolino, P., Ruggiu, M.E., Vannini, M.G., Pascal
e, R., Lenzerini, L., Simile, M.M., Puddu, M.とFe
o, F.による“実験的発癌性のイニシエーション選択法
に付したラットの肝臓における酵素変換病巣のデヒドロ
エピアンドロステロン誘発による阻害のリボ及びデオキ
シリボヌクレオシドによる逆転”、Carcinogenesis, 1
2, 2189-2192 (1991)に記載のPashko, L.L., Lewbart,
M.L.とSchwartz, A.G.による“12-O-テトラデカノイル
フォルボル-13-酢酸塩により促進されたマウスの皮膚癌
形成の16α-フルオロ-5-アンデロステン-17-オンによる
阻害及びデオキシリボヌクレオシドによるその逆転”、
前述のSchwartz他の文献(1988)と前述のSchwartzとPash
koの文献(1995)）、或いは、タンパク質のイソプレニル
化の減少、血漿膜へのRasの局部化の阻害及びRaf-キナ
ーゼ-仲介シグナル導入カスケードの妨害を伴うメバロ
ン酸生合成における妨害により説明されている。

【０００８】Cancer Res., 51, 653-656 (1991)に記載
のSchulz, S.とNyce, J.W.による“試験管内のヒト結腸
腺癌細胞におけるタンパク質のイソプレニル化及びP21
^ras膜結合のデヒドロエピアンドロステロンによる阻
害”と、Cancer Res., 52, 1372-1376 (1992)に記載のS
chulz, S., Klann, R.C., Schonfeld, S.とNyce, J.W.
による“ヒト結腸腺癌細胞におけるデヒドロエピアンド
ロステロンの細胞成長阻害及び細胞サイクル停止のメカ
ニズム：イソプレノイド生合成の役割”を参照のこと。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、気道
平滑筋の過形成が重症の慢性喘息において、気道閉塞を
固定し、気道の過敏反応性を増大する可能性があるの
で、該気道平滑筋の成長を抑える方法を提供することに
ある。さらに本発明の目的は、気道平滑筋を弛緩させ、
気管支拡張する方法を提供することにある。さらに本発
明の目的は、気道の上皮からの炎症性サイトカインの分
泌を減らす方法を提供することにある。

【００１０】

【課題を解決する手段】本発明は、ヒトにおける喘息患
者の気道のリモデリングを治療する方法を提供する。副
腎ステロイドのデヒドロエピアンドロステロン(DHEA)と
その類似物質の幾つかは、不朽化した悪性の細胞系の成
長を抑えることが発見されている。更に、本発明の化合
物であるデヒドロエピアンドロステロンとその強力な類
似物質である16α-ブロモエピアンドロステロン（16α-
BrEA）の効果により、ウシ胎仔血清（FBS）又は血小板
由来成長因子（PDGF）で刺激したラットの気管平滑筋の
初代培養において増殖が劇的に減少したことも発見され
ている。

【００１１】本発明の方法は、次の化２で表されるステ
ロイドを使用する。

【化２】 式中、Xはハロゲン、水酸基、水素、低級アルキル基又
は低級アルコキシ基を表し、Yは水素又は水酸基を表
し、Zは低級アルキル基又は水素を表す。

【００１２】本発明の方法で用いられる好ましいステロ
イドとしては、16α-ブロモ-5-アンドロステン-17-オ
ン、16β-ブロモ-5-アンドロステン-17-オン、16α-フ
ルオロ-5-アンドロステン-17-オン、16β-フルオロ-5-
アンドロステン-17-オン、16α-ブロモ-5-アンドロスタ
ン-17-オン、16β-ブロモ-5-アンドロスタン-17-オン、
16α-フルオロ-5-アンドロスタン-17-オンと16β-フル
オロ-5-アンドロスタン-17-オンが挙げられる。

【００１３】本発明は、例えば哺乳動物のようなホスト
に治療上有効な量の本発明のステロイドを投与すること
からなることを特徴とする、喘息治療方法を提供する。
DHEAは、16α-BrEAや他の16-フッ素化又は臭素化類似物
質よりも効力において劣っているので、DHEAの有効量が
より多く投与することとなる。本発明によると成長阻害
は、驚いたことに投与量により決まり、グルコース-6-
りん酸脱水素酵素の活性の妨害又は不朽化又は悪性の細
胞系のためのコレステロール代謝妨害によるものではな
いことがわかった。初期反応遺伝子c-fosの発現は、そ
のまま残るが、DHEAと16α-BrEAは、DNA合成と細胞サイ
クルの進行を伝達する遺伝子の発現にとって重要な後期
反応遺伝子である転写因子活性化タンパク質−１(AP−
１)のDNA結合を減少させた。

【００１４】さらに、DHEAとその類似物質は、グルココ
ルチコイド(glucocorticoid)で報告されているのと同様
の方法で、第二次の成長反応遺伝子の活性化を損ない、
ヒトにおける喘息患者の気道リモデリングの治療に有用
であることがわかった。さらに、DEHAは、KCl又は内因
性の迷走神経性弛緩気管支収縮伝達物質であるアセチル
コリンによって収縮する気道平滑筋を弛緩することが可
能であり、ヒト急性喘息の治療において、直接の気管支
拡張薬として又はベータアゴニスト気管支拡張薬を活性
化するための佐薬による治療として有用であることが判
明した。さらに、DHEAの類似物質は、ヒト気道上皮から
の炎症性サイトカインの分泌を阻害し、喘息患者の気道
の炎症を減らすのに有用であることも判明した。

【００１５】次に、本発明の好ましい態様を示した添付
の図面を参照して、本発明をさらに詳しく説明する。し
かし、本発明がこれらの態様に限定されず、色々な変形
や修正により実現されることができる一方、本発明にお
いて挙げる態様は、満足のいく完璧なものであるため、
同業者に対して本発明の範囲を十分に伝えるものとして
提供された。

【００１６】本発明の方法は、次の化３で表されるステ
ロイドを用いる。

【化３】 式中、Xはハロゲン、水酸基、水素、低級アルキル基又
は低級アルコキシ基を表し、Yは水素又は水酸基を表
し、Zは低級アルキル基又は水素を表す。

【００１７】本発明の方法で用いられる、具体的に好ま
しいステロイドとしては、16α-ブロモ-5-アンドロステ
ン-17-オン、16β-ブロモ-5-アンドロステン-17-オン、
16α-フルオロ-5-アンドロステン-17-オン、16β-フル
オロ-5-アンドロステン-17-オン、16α-ブロモ-5-アン
ドロスタン-17-オン、16β-ブロモ-5-アンドロスタン-1
7-オン、16α-フルオロ-5-アンドロスタン-17-オンと16
β-フルオロ-5-アンドロスタン-17-オンが挙げられる。

【００１８】本発明は、哺乳動物等のホストに治療上効
果的な量の前記のステロイドを投与することからなる喘
息治療の方法を提供する。DHEAは、16-ブロモと16-フル
オロ類似物質よりも強力ではないので、DHEAの有効量は
これらより多く用いられる。例えばDHEAの好ましい投与
量は、2から10mg/kg／日である。上述の16-ブロモとフ
ルオロ置換類似物質の好ましい投与量は、約0.2から2mg
/kg／日であろう。

【００１９】治療薬は、経口投与可能であり、一方、ス
テロイドは、医薬担体に含有させてもよい。又、薬物を
トリクロロフルオロメタン、ジクロロジフルオロメタン
等のクロロフルオロカーボン噴射剤とレシチンの混合物
に懸濁させた微結晶懸濁液（4ミクロン未満に小さくし
て）として処方し、各吸入薬が25から250μgの薬効成分
を分配するようにした従来の計量投与吸入システムなど
の、医薬担体に含有させた吸入薬として投与してもよ
い。

【００２０】吸入には、例えばカリフォルニア州サンデ
ィエゴのDura Pharmaceuticalsが販売しているSpiros乾
燥粉末吸入システム、カリフォルニア州Palo AltoのIns
pire社が販売しているInspire吸入システムなどの従来
から使用されている乾燥粉末吸入システムによって分配
される微結晶乾燥粉末として処方することも可能であ
る。

【００２１】また、薬物は、例えばFidlerの方法（Canc
er Res., 40, 4460-4466 (1980)に記載のFidler, I.J.,
Raz, A., Fogler, W.E., Kirsh, R., Bugelski, P.とP
oste, G.による“肺胞マクロファージへのマクロファー
ジ増加剤の分配を改善するためのリポゾームのデザイ
ン”）により多層の陰電荷リポゾームの一成分として処
方することも可能である。この方法は、卵フォスファチ
ジルコリン及び脳フォスファチジルセリン（アラバマ州
バーミンガムのAvanti Polar Lipids社）のモル比7:3の
混合物を用い、Padmanabhanが述べているように（Am. R
ev. Respir. Dis. 132, 164-167 (1885)に記載のPadman
abhan, R.V., Gudapata, R., Liener,I.E., Schwartz,
B.A.とHoidal, J.R.による“リポゾームカプセル化した
スーパーオキシドジスムターゼ或いはカタラーゼを気管
内投与することによるラットの肺酸素毒性に対する防
御”）薬物含有リポゾームを処方することからなる。リ
ポゾームを含有する薬物は、従来からあるMedicaid Ven
tstreatm, Pari-LC Jet, Omron UltraAir, Devilbiss A
erosonic or Circulatirなどの噴射エアロゾル噴霧器又
は超音波噴霧器装置を用いた吸入により手軽に呼吸器官
に投与することが可能である。吸入により直接肺に投与
する場合、通常の経口投与量の10分の1しか必要でな
く、それを喘息状態の治療には一日一回から三回まで投
与する。

【００２２】本発明で用いられるステロイドは、従来の
有機合成法により生成される。例えば、本発明で用いら
れるステロイドは、公知のステロイドから生成可能であ
るし又たとえばデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）
のようにアルキル化、ハロゲン化、ヒドロキシル化、置
換反応などの公知の方法により容易に得られる。本発明
で用いられる数多くのステロイドの合成方法の詳細につ
いては、次の文献を参照のこと。Cancer Res. 48, 4817
-1822 (1988)に記載のSchwartz, A.G., M.L. Lewbartと
L.L. Pashkoによる“マウス及びラットにおける、生物
活性を高め副作用を減らした新規デヒドロエピアンドロ
ステロン類似物質”。

【００２３】

【実施例】副腎ステロイドやデヒドロエピアンドロステ
ロン（DHEA）と、その類似物質が不朽化した悪性の細胞
系の成長を抑えることを示すために研究を行った。

【００２４】材料：大人の雄のSpraque-Dawleyラットを
Charles River社（ノースキャロライナ州Raleigh）から
購入した。プロテアーゼ阻害剤とグアニジンチオシアネ
ート(guanidine thiocyanate)は、ベーリンガーマンハ
イム社（インジアナ州インジアナポリス）から購入し
た。ダルベッコの変性イーグル培地（DMEM : Dulbecco'
s modified Eagle's medium）、ハンクスのバランス塩
溶液（HBSS : Hanks' balancedsalt solution）、N-2-
ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルフォン酸
（HEPES : N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesu
lfonic acid）、抗菌-抗真菌剤（ペニシリン10,000U、
ストレプトマイシン10,000Uと25μgのアムフォテリシン
(amphotericin) B/ml）とトリプシン-エチレンジアミン
四酢酸（EDTA）溶液は、GIBCO（ニューヨーク州、Grand
Island）から購入した。

【００２５】ウシ胎仔血清（FBS）は、Hyclone社（ユタ
州、Logan）から購入した。ヒト組換え血小板由来成長
因子-AA（PDGF-AA）は、ミネソタ州ミネアポリスのR&D
システム社から得た。デヒドロエピアンドロステロン
（DHEA）、16α-ブロモエピアンドロステロン（16α-Br
EA）、ミフェプリストン（RU486）、トリス（ヒドロキ
シメチル）アミノメタン（Tris）とα-平滑筋アクチン
の抗体は、シグマ化学社（モンタナ州、セントルイス）
から購入した。

【００２６】P21^rasの抗体（pan-ras、Ab-3、マウスモ
ノクロナール）とc-fos（Ab-2、ウサギポリクロナー
ル）タンパク質、ワサビペルオキシダーゼ標識山羊抗マ
ウスIgGと標準A431細胞可溶物は、Calbiochem社（カリ
フォルニア州サンディエゴ）から購入した。ポリクロナ
ールワサビペルオキシダーゼ標識抗ウサギIgGは、Trans
duction Laboratories社（ケンタッキー州レキシント
ン）、M-MLV逆転写酵素は、Life Technologies社（メリ
ーランド州Gaithersburg）から購入した。その他の材料
は、特記しない限りシグマ社から得た。

【００２７】気道平滑筋増殖の培養による測定：過剰量
のペントバルビタールでラットを致死させ、気道を除去
して、ラットの気道平滑筋を培養した。後部気道膜を単
離し、細かくし、0.2%のIV型コラゲナーゼと0.05%のIV
型エラスターゼを含有するHBSS中で37℃で30分間二回消
化した。各酵素消化物を回収し、500gで5分間室温で遠
心した。上清を除去し、得られたペレットを10%のFBS、
非必須アミノ酸、ペニシリン（100U/ml）、ストレプト
マイシン（100μg/ml）とアンフォテリシン（250ng/m
l）を加えたDMEMに再懸濁した。25cm²のフラスコ内の培
地にフラスコ1本あたり2×10⁵個の細胞を接種し、5%CO₂
／95%空気の湿潤雰囲気下、37℃で培養した。コンフル
エント(confluent)状態に達した際、細胞を0.25%トリプ
シン-0.002%EDTA溶液を通過させて分離した。

【００２８】α-平滑筋アクチンのポリクロナール抗体
を用いて免疫染色を行い、アビジン-ビオチン免疫ペル
オキシダーゼ法を用いて視覚化した。平滑筋培養液は、
位相差顕微鏡で典型的な“山と谷”様相を呈し、α-平
滑筋アクチンが強く染色されていた。予備研究による
と、10%FBSの存在下での細胞培養は120時間まで直線的
な成長相を示した。2〜9通過の培養液を次の実験に用い
た。

【００２９】ミトコンドリアのスクシニルデヒドロゲナ
ーゼの作用によって起こる溶解性黄色テトラゾリウム染
料、3-[4,5-ジメチルチアゾール]-2イル-2,5-ジフェニ
ルテトラゾリウム臭化物(MTT)のその不溶性紫色ホルマ
ザンへの代謝還元に基づく方法で、既に報告されている
比色分析法を修正して用い、培養した気道平滑筋の増殖
を定量した。Am. J. Respir. Cell Mol. Biol.,7, 574-
581 (1882)に記載のHirst, S.J., Barnes, P.J.とTwor
t, C.H.C.による“血清及び血小板由来成長因子に反応
して起きた、ヒトとウサギの培養した気道平滑筋の増殖
の定量化”を参照のこと。この分析は、死んだ細胞と生
きている細胞を実験的に区別する。増殖を調べるため
に、細胞を24穴の非被覆プラスチックプレートにウェル
1個当たり15,000-50,000個接種し、DMEMとマイトジェン
で培養した。24〜96時間後、培地を100μg/mlのMTTと0.
5%FBSを含有するウェルの一穴当たり1mlの新鮮なDMEMと
交換し、プレートを更に１時間培養した。MTT含有培地
を除去し、1mlのCa²⁺又はMg²⁺を含有しない無菌ダルベ
ッコ変性りん酸塩緩衝食塩水(DPBS)で細胞を2回洗浄
し、0.5mlのジメチルスルフォキシド(DMSO)を各ウェル
に添加して、可溶化した紫のホルマザン染料をシマズUV
160U分光光度計を用いて540nmで測定した。4〜6ウェル
の合計を各処理条件で調べた。

【００３０】変換率が直線的で、存在する細胞の数に比
例する最適濃度と培養時間を求めるために15分から3時
間培養した50〜200μg/mlのMTTを用いて予備研究を行っ
た。3-[4,5-ジメチルチアゾール]-2イル-2,5-ジフェニ
ルテトラゾリウム臭化物（MTT）の還元が細胞数の信頼
できる直線的測定であることを確認するために、分離し
たばかりの気道平滑筋細胞を10%FBSと100μg/mlのMTTを
含有するDMEM中で一時間培養した。細胞を10分間1000ｇ
で遠心し、Ca²⁺又はMg²⁺を含有しない無菌ダルベッコ変
性りん酸塩緩衝食塩水（DPBS）で2回洗浄し、0.5mlのジ
メチルスルフォキシド(DMSO)で抽出し、ホルマザンの濃
度を上述のように測定した。

【００３１】マイトジェン刺激として用いるFBSの最適
濃度は、0.25、1.0、5.0又は10.0%のFBSを含有するDMEM
で一ウェル当たり15,000個の細胞を培養して求め、MTT
還元は、24、48、72又は96時間後に求めた。最後に、マ
イトジェンが刺激しており、阻害剤が実際の細胞数を減
らしていることを確認するために、15000個の細胞を、
種々の阻害剤や賦形剤を用いて又は用いずに10%FBSを含
有するDMEMで培養した。24時間後、細胞を二回DPBSで洗
浄し、固定し2回続けて5分間氷冷メタノールに曝して浸
透させ、ライト−ギムザ染色(Giemsa-modified Wright'
s stain)を3分間行いDPBSで洗浄した。細胞数の測定
は、0.01-cm²のオキュラーグリッドを用いて40倍で任意
の10区域で行った。

【００３２】気道平滑筋増殖測定のための細胞培養処理 細胞の増殖に対するデヒドロエピアンドロステロン（DH
EA）と16α-ブロモエピアンドロステロン（16α-BrEA）
の効果を0.5-10%のFBS又は1-50ng/mlのヒト組換え血小
板由来成長因子（PDGF-AA）で刺激した培養液中で調べ
た。幾つかの実験においては、グルココルチコイドとプ
ロジェステロンアンチホルモンRU486 (progesterone an
tihormone RU486)をそれぞれ加えるか或いは、デヒドロ
エピアンドロステロン（DHEA）又は16α-ブロモエピア
ンドロステロン（16α-BrEA）を等モル量加えて、グル
ココルチコイドタンパク質受容体にDHEA又は16α-BrEA
が結合することにより阻害効果が伝達されたかどうかを
調べようとした。例えば、Receptor, 5, 63-69(1995)に
記載のLe, Y.Y.とXu, R.B.による“薬理学的投与量のグ
ルココルチコイドの作用の分子メカニズム：低親和性グ
ルココルチコイド受容体について”の方法を参照のこ
と。また、DHEA又は16α-BrEAの成長阻害効果をグルコ
コルチコイドデキサメタゾン又はメチルプレドニゾロン
の阻害効果と比較した研究もある。

【００３３】DHEAと16α-ブロモエピアンドロステロン
（16α-BrEA）がグルコース-6-りん酸脱水素酵素（G6PD
H）を阻害することにより細胞の増殖を減少させるかど
うか調べるために、80-cm²のコフルエントフラスコをDH
EA、16α-BrEA又は50μlのDMSO賦形剤で培養した。1時
間後、細胞は溶解し、G6PDH活性を下記のように分析し
た。他の実験においては、未処理コンフルエント培養液
から生成し、5μlのDMSOの反応混合物溶液に加えたDHEA
又は16α-BrEAを試験管中で処理した細胞溶解物のG6PDH
活性を測定した。

【００３４】DHEA又は16α-BrEAによる気道平滑筋の成
長阻害にリボース糖のヘキソース一りん酸経路生成の遮
断がかかわっているかどうか調べるために、細胞の成長
を24時間0.5%FBS（24穴のプレートで、ウェル当たり15,
000個の細胞）中で同時に行い、次にDHEA又は16α-BrEA
と200μMのリボヌクレオシド（アデノシン、グアノシ
ン、サイチジン、及びサイミジン）又はデオキシリボヌ
クレオシド（デオキシアデノシン、デオキシグアノシ
ン、デオキシサイチジン、及びサイミジン）の存在下又
は非存在下でDMEMと10%FBSで培養した。リボヌクレオシ
ド又はデオキシリボヌクレオシドは、0.5mlの1NのHClに
溶解し、DMEMに添加した。培地のpHは、1NのNaOHを滴定
して7.1に調節し、次に培地を0.2μMのフィルターを通
して滅菌した。成長は24、48と96時間後にMTTの還元に
より測定した。

【００３５】16α-ブロモエピアンドロステロンがメバ
ロン酸合成を妨害して細胞の増殖を抑えたかどうか調べ
るために、細胞をFBSで刺激し、16α-BrEAの存在又は非
存在下で成長培地に6mMのDL-メバロン酸ラクトンを加え
るか加えずに成長させた。36時間後、成長をMTTの還元
で測定した。Rasのイソプレニル化と膜局在が損なわれ
ているかどうかを評価するために、75cm²のぺトリ皿の
コンフルエント細胞の成長を、24時間0.5%のFBSとDMEM
中で16α-BrEA又はDMSO賦形剤を添加するか添加せずに
阻止した。ペトリ皿の幾つかを30分間 DMEM中10%FBSで
刺激した。細胞を溶解し、膜を分離し、DHEAと16α-BrE
Aによる処理がp21^rasを使い尽くしたかどうか調べるた
めに免疫ブロット法を下記のように行った。

【００３６】細胞の成長にとって重要な初期反応遺伝子
の発現を16α-BrEAが害したかどうか調べるために、0.5
%FBSを添加したDMEM中で24時間培養することにより、75
-cm ²ペトリ皿のコンフルエント状態の気道平滑筋細胞の
成長を阻止した。単一層を10μMの16α-BrEA又はDMSO賦
形剤を加えて2時間前処理し、10%のFBSを加えたDMEMに
暴露して30分刺激した。次に細胞を溶解し、c-fos mRNA
を下記のように、逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応に
より測定した。C-fosタンパク質の濃度に影響が出てい
るかどうか調べるために、0.5%のFBSを添加したDMEM中
で、６穴プレート上のコンフルエント状態の単一層の成
長を24時間阻止した。次に細胞を16α-BrEA又はDMSO賦
形剤で2時間前処理し、10%FBSを加えたDMEM中で、15、3
0及び60分刺激した。細胞を次に溶解し、c-fosタンパク
質を下記のように免疫ブロッティングすることで測定し
た。

【００３７】DHEAと16α-BrEAのAP−１の活性化、即
ち、細胞成長と増殖において重要な第二次の反応（上述
の文献、AngelとKarin(1991)）に対する効果を調べるた
めに、75cm²のペトリ皿上の気道平滑筋の単一層の成長
を0.5%のFBSとDMEM中で24時間阻止し、DHEA、16α-BrEA
又はDMSO賦形剤を加えて2時間前処理した。次に細胞を1
0%FBSを加えたDMEM中で6時間刺激し、核タンパク質を回
収し、下記のように電気泳動モービリティシフト法によ
り、DHEAと16α-BrEAで処理がAP−１のDNA結合を阻害し
たかどうかについて調べた。

【００３８】細胞毒性とアポトーシスの測定：細胞毒性
を測定するために、あらかじめDMEMと10%FBSでコンフル
エント状態に成長させた気道平滑筋細胞のウェルにDHEA
又は16α-BrEAを加えた。24時間後、培地を5分間マイク
ルフュージし、上清の乳酸デヒドロゲナーゼ活性を、市
販の分析薬（シグマ社のDG-1340K）を用いて測定した。
細胞をDPBSで2回洗浄し、トリパンブルー染料に曝した
（ハンクスの塩平衡溶液中に0.04%）。染料を蓄積した
壊れた或いは死んだ細胞の平均数を測るために、0.01cm
²のオキュラーグリッドを用いて任意の5セクションの細
胞数を測定した。

【００３９】DHEA又はその類似物質がプログラムされた
細胞死を引き起こしているかどうか調べるために6個の
プラスチックのウェルに入れたコンフルエント培養液を
50又は250μMのDHEA、10又は50μMの16α-BrEA又は賦形
剤（25μlのDMSO）で処理した。2時間後細胞をDPBSで2
回洗浄して氷上で剥がしミクロフュージ管内に入れて、
4℃で5分間250ｇで遠心した。細胞のペレットを静かに3
0μlのDPBSに再懸濁し、30μlの溶菌緩衝液（80mMのEDT
A、1.6%［重量／容量］のラウリルサルコシン酸ナトリ
ウムと5mg/mlのタンパク分解酵素Kを加えた200mMのトリ
ス塩酸塩緩衝液、pH 8.0）を加えて溶解した。可溶物を
50℃で1.5時間培養した。RNAse A（0.2mg/ml）を添加し
て、可溶物を更に30分間37℃で培養した。DNAバンドを6
0Vで一時間、1%アガロースゲル上でDNAラダースタンダ
ードと共に分離し、エチジウムブロマイドを挿入し、紫
外光の下で視覚化して撮影した。

【００４０】グルコース-6-りん酸脱水素酵素活性の測
定：氷上で、冷DPBSを用いて培養液を3回洗浄し、氷冷
緩衝液（50mMのトリスと10mMのMgCl₂の混合液、pH 8.
0）に剥がしていれ、氷上で超音波処理した。次にG6PDH
活性をJonesとAndrewsの方法（J. Reproduc. Fertilit
y, 54, 357-362 (1987)に記載のJones, J.T.とAndrews,
S.G.による“マウス睾丸の体性細胞及び胚細胞におけ
るグルコース-6-りん酸脱水素酵素の活性”）を用い
て、50から200μlの細胞可溶物、10mMのβ-ニコチンア
ミドアデニンジヌクレオチドりん酸塩（NADP）を20μl
と、10mMのD-グルコ−ス-6-りん酸塩(G6P)を20μlを合
計1mlの緩衝液（10mMのMgCl₂含有する50mMのトリス溶
液、pH 8.0）に加えた反応混合物中で測定した。反応は
G6Pを加えて開始した。340nmにおける吸収度の直線的な
増加を25℃で300秒間観察した。活性は1mgのタンパク質
当たりの単位で示されたが、1.0単位は、NADPの存在下
で1.0μモルのG6Pを1分間で6-ホスホ-D-グルコン酸塩に
酵素酸化する量を示す。タンパク質はBCAタンパク質分
析法（イリノイ州、ロックフォード）を用いて測定し
た。

【００４１】免疫ブロット法によるP21^rasとc-fosタン
パク質の分析： P21^rasを測定するために、細胞を冷DPBSで2回洗浄し、5
00μlの冷溶菌緩衝液（10mMのHEPES、1mMのMgCl₂、1mM
のEDTA、1μMのペプスタチン、2μg/mlのアプロチニン
及び1mMのフッ化フェニルメチルスルフォニル）を用い
て15分間氷上で膨潤させた。前述のShulzとNyce（199
1）の文献を参照のこと。次に細胞を剥がして1.5mlのポ
リプロピレン管に入れ、ホモジナイズし、４℃で1分間
3,000gで遠心して透明にした。ポスト核上清を4℃で30
分間100,000gで遠心した。上清を回収し、ペレット化し
た膜を洗浄緩衝液（1%のトリプトンX-100、1%のデオキ
シコール酸ナトリウム、0.1%のSDS、150mMのNaCl、1μM
のペプスタチン、2μg/mlのアプロチニンと1mMのフッ化
フェニルメチルスルフォニルを含有する25mMのトリス溶
液、pH 7.4）に再懸濁した。上清と膜部分を除去してBC
Aタンパク質分析によりタンパク質を測定した。ブロモ
フェノールブルーとβ-メルカプトエタノールを残査に
添加して最終濃度をそれぞれ0.002%（重量／容量）と5%
（重量／容量）にした。可溶物を次に100℃で5分間ボイ
ルして免疫ブロットが行われるまで-80℃で保存した。

【００４２】c-fosタンパク質の測定の場合は、単一層
を氷上に置いて、冷DPBSで2回洗浄し、0.5mlの沸騰緩衝
液（10%[容量／容量]のグリセロールと2%[重量／容量]
のドデシル硫酸ナトリウム[SDS]含有の83mMのトリス溶
液、pH6.8）中に剥がしいれ、超音波処理した。タンパ
ク質測定のために一定量を除去し、ブロモフェノールブ
ルーとβ-メルカプトエタノールを残査に添加し、可溶
物を沸騰させ、前述の様に保存した。

【００４３】解凍したサンプルのタンパク質をSDS−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動により分離したが、この
際、c-fosは10%のポリアクリルアミドゲルで、P21
^ras（レーン当たり15μgのタンパク質）は、15%のゲル
でO'Farrell-Laemmli緩衝液（0.025Mのトリス、0.192M
のグリシン及び0.1%［重量／容量］のSDS、pH 8.3）を
用いて分離を行った。Biochem. J., 300, 445-449 (199
4)に記載のBuckeley, B.J.とWhorton, A.R.による“血
管内皮からのCa²⁺非依存アラキドン酸の遊離はデノボタ
ンパク質合成を必要とする”の方法を参照のこと。二つ
のゲルを、クマシーブルー（シグマ社のクマシーブルー
染料R-250を40%メタノールと7%酢酸に加えた）で染色
し、各レーンにロードされたタンパク質の相対量を評価
した。移動緩衝液（0.025Mのトリス、0.192Mのグリシ
ン、2.6mMのSDSと20%［容量／容量］のメタノール、pH
8.8）中、ウェットトランスブロット法を用いてこれら
タンパク質をニトロセルロースに移した。100mMのNaC
l、0.01%（容量／容量）のツイーン20と5%無脂肪ドライ
ミルクを含有する10mMのトリス（pH 7.5）中、室温で1
時間ブロットをブロックした。2.5μg/mlのpan-ras又は
c-fos抗体をブロック用緩衝液に加えて室温で１時間培
養した。

【００４４】リンス用緩衝液（100mMのNaCl及び0.01%
［容量／容量］のツイーン20を含有する10mMのトリス
［pH 7.5］）で5分間にわたり5回リンスした後、酵素標
識抗マウス免疫グロブリンG（IgG）−ワサビペルオキシ
ダーゼ（HRP、pan-ras Mab）又は抗ウサギIgG/HRP (c-f
os Pab)を第二抗体としてブロック用緩衝液で2000倍に
希釈して、ブロットを室温で一時間培養した。免疫ブロ
ットはリンス用緩衝液で5分間にわたり、5回リンスし、
改良された化学ルミネッセンス法（イギリス、バッキン
ガムシャー州、アマーシャム生命科学社のＥＣＬウエス
タンブロット検出法）により免疫検出を行った。分子量
の評価は、前もって染色した分子量マーカー（カリフォ
ルニア州、Hercules、Bio-rad研究所）をニトロセルロ
ースに移したものとの比較に基づいて行った。オートラ
ジオグラフィー用フィルム（ニューヨーク州、ロチェス
ター、イーストマンコダック社のX-OMAT AR）を10、15
又は60秒免疫ブロットに曝した。

【００４５】逆転写酵素-ポリメラーゼ連鎖反応（RTR-P
CR） 単一層をDPBSで2回洗浄して細胞を4Mのグアニジンチオ
シアネート、50mMのクエン酸ナトリウム、0.05%のサル
コシルと0.01Mのジチオトレイトールで溶解した。細胞
を剥がした後、可溶物をゲージ22の針を4回通過させ削
りとった。RNAを5.7Mの塩化セシウムと0.1MのEDTAを用
いて超遠心しペレット化した。Am. J. Respir. Cell Mo
l. Biol., 820-27 (1993)に記載のBecker, S., Koren,
H.S.とHenke,D.C.による“正常な鼻の内皮におけるイン
ターロイキン−８の発現、RSウィルスの感染によるその
モジュレーション及びサイトカイン、腫瘍壊死因子、イ
ンターロイキン−１とインターロイキン−６”の方法を
参照のこと。

【００４６】RNA（100ng）をM-MLV逆転写酵素を用いて
逆転写した。得られたcDNAを、GenBankで測定され次の
文献：J. Pharmacol. Exper. Ther.（1988）に記載のDa
shtaki, R., Whorton, A.R., Murphy, T.M., Reed, W.
とKennedy, T.P.による“デヒドロエピアンドロステロ
ンとその類似物質はAP−１のDNA結合と気道平滑筋の増
殖を阻害する”で公開された配列に基づいたラット遺伝
子特異的センスプライマー及びアンチセンスプライマ―
を用いてβ-アクチンの場合は、29サイクルc-fosの場合
は36サイクルにそれぞれPCR増幅した。PCR増幅DNAは2%
変性アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムを挿入
し、視覚化して紫外光の下で撮影した。得られたポラロ
イドのネガをバイオイメージアナライザー（ミネソタ州
AnnArborのBioImage社）を用いて定量化した。各サンプ
ルのβ-アクチンcDNAバンド（FBSの刺激に影響されない
ハウスキーピング遺伝子）の強度をサンプル間の差異を
標準化するために用いた。

【００４７】電気泳動モービリティシフト分析法(EMSA) 単一層を冷DPBSで2回洗浄し氷上で0.7mlの冷細胞質抽出
緩衝液（CEB：10mMのトリス、pH7.9、60mMのKCl、1mMの
EDTA、1mMのジチオトレイトール）をプロテアーゼ阻害
剤（PI：1mMのPefabloc、50μg/mlのアンチパイン、1μ
g/mlのロイペプチン、1μg/mlのペプスタチン、40μg/m
lのベスタチン、3μg/mlのE-64及び100μg/mlのキモス
タチン）と共に用いて10分間平衡化した。洗浄剤Nonide
tP-40（NP-40）を最終濃度が0.1%となるように添加し、
細胞を細胞スクレーパーで剥離させた。

【００４８】核を遠心によりペレット化し、CEB/PIで洗
浄した。次に核を、PIを加えた核抽出緩衝液（NEB：20m
Mのトリス、pH 8.0、400mMのNaCl、1.5mMのMgCl₂、1.5m
MのEDTA、1mMのジチオトレイトール及び25%のグリセロ
ール）中、氷上で10分間培養して、短時間回転させて破
片を取り除き、電気泳動モービリティシフト分析を行う
まで−80℃で保存した。EMSAsでは、AP−１（前述の文
献、Lee他(1987)）として親株（5'-TTCCGGCTGACTCATCAA
GCG 3' と3' AAGGCCGACTGAGTAGTTCGC 5'）共通配列を、
［γ３²P］−ATPとT4ポリヌクレオチドキナーゼでリン
酸化することにより末端標識して用いた。

【００４９】DNA-タンパク質結合反応は、2μgの核タン
パク質（ブラッドフォードの染料結合法により測定）
と、10mMのトリス、pH 7.9、50mMのNaCl、2.5mMのEDT
A、1mMのジチオトレイトール、5μgの牛血清アルブミ
ン、0.1μgのポリdI-dCと4%のFicoll中、室温で10分間
培養した0.3ngの³²P末端標識二本鎖DNAプローブを用い
て行った。競合試験は10Xの未標識親株オリゴヌクレオ
チド配列を用いて行った。サンプルはトリス−グリシン
−EDTA（TGE、120mMのグリシンと1mMのEDTAを含有する2
5mMのトリス溶液、pH8.5）中、5%の非変性オリアクリル
アミドゲル上で電気泳動した。ゲルを乾燥し、phosphor
imagingスクリーン（カリフォルニア州Sunnyvale, Mole
cular Dynamics社）に暴露して分析した。

【００５０】試験管内の気道平滑筋収縮への効果 試験管内の気道平滑筋へのDHEAの効果を調べるために、
雄のハートレーモルモット（マサチューセッツ州、Wilm
ington,チャールスリバー社）をペントバルビタールナ
トリウム（アボット社製ペントバルビタールナトリウ
ム）（200mg/kg腹腔内投与）で麻酔した。気管支と肺を
迅速に除去し、95%O₂と5%CO₂を通気した、115mMのNaC
l、25mMのNaHCO₃、1.38 mMのNaH₂PO₄、2.5mMのKCl、2.4
6mMのMgSO₄、1.9mMのCaCl₂と5.56mMのデキストロースを
含有する酸素化したクレブス−ヘンゼライト溶液(K−H)
に浸した。

【００５１】ステレオ顕微鏡（オリンパスSZH10）の下
で、弛緩した結合組織から主気管支を切り離し、気管支
のリングを取り出し、37℃でK−Hを充填したダブルジャ
ケット付organ bathに載せて、95%のO₂と5%のCO₂混合物
で継続的に通気した。それにより、pH 7.4になった。紙
ポリグラフ（Gould RS3800）上に等尺性張力を継続的に
記録するため、気管支のリングを力転位トランスデュー
サー（Grass FTO3）に接続して、90分間平衡化した。平
衡化時間を終えた後、1mMのアセチルコリンを投与し、
反応をチェックした。アセチルコリンに反応しなかった
ものを除去し、気管支リングを新たなK-Hでリンスして
実験を継続した。

【００５２】3×10^-2MのKCl、又は10^-5Mのアセチルコリ
ン（Ach）で気管支のリングを部分的に収縮させ、ログ
の間隔毎にDHEAの濃度を10^-8から10^-4Mに徐々に増やし
て活性張力に表われる変化を測定することによってDHEA
の効果を調べた。予備試験に基づいて、KClの濃度を3×
10^-2Mとし、KCl（10^-2から10^-1M）に対する濃度反応曲
線から最大反応の50%を引き出すKClの濃度を（KCL-E
C₅₀）とした。KClに対する最大反応は濃度6.2×10^-2M
（幾何学的平均、GSEM=1.21）で得られ、KCl-EC₅₀は2.8
x10^-2M（幾何学的平均、GSEM=1.28）であった。同様
に、10^-5Mのアセチルコリン（ACh）を最大反応の50%を
引き出すAChの濃度として選択した。

【００５３】3×10^-2MのKClの投与により収縮反応が起
きたが、この反応は4時間後、即ち（DHEAに対する濃度
−効果曲線の完成に必要な時間）わずかに弱まって、最
初の活性張力よりも22.12±6.07%（n=3）低かった。10
^-5Mアセチルコリンを投与した後には全く収縮反応の減
少は観察されなかった。

【００５４】ジメチルスルフォキシド（DMSO）にDHEAを
溶解してから、4つの追加のリングを3×10^-2MのKCl（n=
5）又は10^-5Mのアセチルコリンで収縮させてこの賦形剤
が活性張力に変化をもたらしたかどうか調べた。DHEAの
実験に用いたのと同量のDMSOを投与したところ、4時間
後、3×10^-2MのKClに対しての活性張力は31.13±7.21%
減少した。これは、前に述べた時間の影響によって主に
説明される。10^-5Mのアセチルコリンに反応して得られ
た活性張力に対しては全くDMSOの影響は観察されなかっ
た。Organ bathにおけるDMSOの最大最終濃度は0.15%で
あった。

【００５５】DHEAを調べるために用いた3枚のストリッ
プを実験の最後に新たなK−Hでリンスし1mMのアセチル
コリンで処理し、反応をチェックした。結果から、平滑
筋の機能性はDHEAにより変化しなかったことがわかっ
た。第二の実験では、10^-5MのAChを単体で投与するか又
は、AChに対する濃度−反応曲線を10^-4MのDHEA（AChの1
5分前に投与）の存在又は非存在下で行った。AChの単体
投与は張力の増加率を測定するために用いられ、濃度−
h反応調査はAChに対する感受性にDHEAが影響を与えるか
どうか評価するために用いられた。

【００５６】試験管内におけるヒト気道上皮からのサイ
トカイン分泌に対する効果 培養したヒト上皮からのサイトカイン分泌に対する16α
−BrEAの効果をBEAS−2B細胞、BEAS−2B細胞、ヒト気道
上皮がどのようにウィルス及び空気中の汚染物質に反応
して炎症性サイトカインを分泌するかのモデルとして以
前に調べた不朽化したヒト呼吸器上皮細胞株SV−40（J.
Clin. Invest. 967:549-557(1995)）に記載のSubasust
e, M.C., Jacoby, D.B., Richards, S.M.とProud, D.,
“ヒト呼吸器上皮細胞株のリノウィルスへの感染、サイ
トカイン遊離の誘導及びサイトカイン暴露による感染に
対する感受性の調整”、Am. J. Physiol. 265: L472-L4
78(1993)に記載のNoah, T.L.とBecker, Sによる“ヒト
気道上皮細胞株によるRSウィルス誘導サイトカイン生
成”、Am. J. Physiol. 266 (Lung Cell. Mol. Physio
l. 10)：L612-L619 (1994)に記載のDevlin, R.B., McKi
nnon, K.P., Noah,T, Becker, S.とKoren, H.S.による
“肺胞マクロファージ及び気道上皮細胞からのサイトカ
イン及びフィブロネクチンのオゾン誘導遊離”で調べ
た。

【００５７】BEAS−2B細胞を12穴プラスチックプレート
にコンフルエント状態に成長させ、記載濃度の16α−ブ
ロモエピアンドロステロン（BrEA）又はジメチルスルフ
ォキシド賦形剤(5μl)に加えたもので1時間前処理し
た。次に細胞を腫瘍壊死因子α（TNFα、40ng/ml）又は
膜フォスファターゼを阻害することによりサイトカイン
分泌を刺激することが知られている空気汚染粒子である
残油フライアッシュ（ROFA、50μlg/ml）で刺激した（A
m. J. Physiol. 272 (Lung Cell. Mol. Physiol.16): L
426-L432 (1997)に記載のSamet, J.M., Stonehuerner,
J., Reed, W., Devlin, R.B., Dailey, L.A., Kennedy,
T.P., Bromberg, P.A及びGhio, A.J.による“残油フラ
イアッシュに曝したヒト気道上皮細胞におけるタンパク
質チロシンりん酸塩ホメオスタシスの崩壊”）。24時間
（ＴＮＦ刺激細胞の場合）又は6時間後（ＲＯＦＡ刺激
細胞の場合）、培地を回収して遠心し、破片を除去し
た。インターロイキン-8（IL-8）の濃度を市販のELISA
（R&Dシステム社）により分析した。

【００５８】統計的分析 別に規定した場合を除いては、データを平均値±標準誤
差(SEM)で表す。別に示していない場合は、気道平滑筋
増殖研究の測定における複製の最小数は４であった。特
記しない限り処置群あたり４から６回の同じ実験を行っ
て調べた。複数の群の差異は、繰返し行った測定の相違
（variance）をone-way分析を用いて比較した。用いた
多重比較検定はNewman-Keuls多種比較検定であった。二
つの群の差異は、両末端標識（two-tailed）のスチュー
デントの t検定を用いて測定した。有意差はp<0.05とし
た。

【００５９】DMSO賦形剤処理対照群に対する16α-ブロ
モエピアンドロステロン（16α-BrEA）又はデヒドロエ
ピアンドロステロン（DHEA）による阻害率％で活性を表
す。分析条件において、DMSOのみではG6PDH活性になん
ら減少をもたらさなかった。各々少なくとも3回の実験
の平均を示している。方法は本文中で述べた。ヒト赤血
球グルコース-6-りん酸脱水素酵素（G6PDH）の分析はヒ
ト赤血球（シグマ社）からのXXVI タイプG6PDHを0.01U/
mlを用いてそれに阻害剤を加えて行った。気道平滑筋細
胞可溶物中のG6PDHの分析は阻害剤を加えた100μlの細
胞可溶物を用いて行った。そのままの気道平滑筋単一層
については、細胞を集め、100μlの細胞可溶物を用いて
G6PDHの分析を行う1時間前に阻害剤で前処理した。これ
らの分析はすべて3回づつ行った。

【００６０】BEAS-2B細胞、SV-40不朽化ヒト呼吸器上皮
細胞株を12穴プラスチックプレートでコンフルエント状
態に成長させ、前記の濃度の16α-ブロモエピアンドロ
ステロン（16α-BrEA）又はジメチルスルフォキシド賦
形剤（5μl）で1時間、前処理した。次に細胞を腫瘍壊
死因子α（TNFα、40ng/ml）又は膜フォスファターゼを
阻害することによりサイトカイン分泌を刺激することが
知られている空気汚染粒子である残油フライアッシュ
（ROFA、50μg/ml）で刺激した。24時間後（TNF刺激細
胞の場合）又は6時間後（ROFA刺激細胞の場合）、培地
を回収し遠心して、破片を取り除いた。インターロイキ
ン-8(IL-8)の濃度は市販のELISA（R&Dシステム社）によ
り測定した。結果は処理群あたり4から6回の実験の平均
±標準誤差である。酸化防止剤としてのDMSO賦形剤はIL
-8の分泌（既知の効果）を減らすが、BrEAはそれ以上に
かなり阻害する。

【００６１】結果： 気道平滑筋増殖への効果：図1に示したように、MTTの還
元を用いた細胞数の計算は血球計を用いてカウントした
実際の細胞数と密接にかかわっている。培養した気道平
滑筋の増殖は、ミトコンドリアのスクシニルデヒドロゲ
ナーゼの作用によって可溶性黄色テトラゾリウム染料3-
［4,5-ジメチルチアゾール］-2イル-2,5-ジフェニルテ
トラゾリウム臭化物（MTT）がその不溶性紫色ホルマザ
ンへ代謝還元することを利用して定量化された。前述の
Hirst他(1992)の文献を参照のこと。はがしたばかりの
気道平滑筋細胞を１００μg/mlのMTT及び10%のFBSを含
有するDMEMで1時間培養した。得られた細胞を1,000gで1
0分間遠心し、Ca²⁺又はMg²⁺を含有しない無菌ダルベッ
コ変性りん酸塩緩衝食塩水（DPBS）で2回洗浄し、0.5ml
のジメチルスルフォキシド（DMSO）で抽出して可溶化し
た紫のホルマザン染料の吸収度を540nmで測定した。各
細胞濃度につき6回実験を行った。MTTホルマザン還元生
成物の吸収度（A_{5 40}）は血球計によりカウントされた細
胞数とR²=0.9851で相関していた。

【００６２】増殖を調べるために、細胞を24穴の非被覆
プラスチックプレートに接種し、DMEM及びマイトジェン
で培養した。24〜96時間後、培地を100μg/mlのMTT及び
0.5%FBSを含有する新鮮な1ml／ウェルのDMEMと交換し、
プレートを更に１時間培養した。MTT含有培地を除去
し、1mlのDPBSで細胞を2回洗浄し、0.5mlのDMSOを各ウ
ェルに添加して、540nmで測定した可溶化した紫のホル
マザン染料の吸収度により細胞数を求めた。FBSは投与
量に依存して気道平滑筋の細胞成長を促進し10%のFBSに
より最大の刺激が与えられた。

【００６３】図２は、ウシ胎仔血清(FBS)が24〜96時
間、投与量依存成長を促進したことを示す図である。各
ウェルの細胞数は15,000で6回の実験の平均を示したも
のである。図３に示したように、ヒト組換え血小板由来
成長因子-AA（50ng/mlのPDGF）も細胞成長を刺激したが
FBSほどではなかった。各ウェルの細胞数は50,000で6回
の実験の平均を示したものである。

【００６４】次の実験では、DHEA及びその類似物質はマ
イトジェン刺激による気道平滑筋増殖を阻害した。細胞
を培養し、細胞数を前述のように又図2のように定量化
した。特記しない限り、細胞を10%FBSか50ng/mlのPDGF,
10%FBSか50ng/mlのPDGF+5μlのDMSO賦形剤、及び10%FB
S又は50ng/mlのPDGF+阻害剤を加えたDMSOのいずれかを
各ウェルに添加して培養した。図４は92時間培養後の、
DHEA及びDHEA-硫酸塩が10%FBS刺激成長にもたらした効
果を示したものである。各棒グラフは92時間培養した1
5,000個／ウェルの細胞の、9から12回の実験の平均MTT
ホルマザン吸収度を示したものである。72時間の実験で
も同様の結果であった。高濃度においてはDHEAはDHEA硫
酸塩よりも強い活性を示した。

【００６５】図５に示したように、DHEAはPDGFにより刺
激された細胞増殖をも阻害した。各棒グラフは72時間培
養した50,000個／ウェルの細胞で4回実験した結果の平
均を示したものである。図６に示したように、16α-ブ
ロモエピアンドロステロン（16α-BrEA）はDHEAよりもF
BS-誘発細胞増殖の阻害剤としてはより強力であった。
各棒グラフは96時間培養した15,000個／ウェルの細胞で
4回実験した結果の平均を示したものである。0.5%のFBS
で培養した陰性対照群も比較のために示した。48時間で
の実験でも結果は同様であった。

【００６６】図７に示したように、16α-BrEAは特に高
濃度の場合、グルココルチコイドデキサメタゾン（50%
阻害濃度 = 16α-BrEAの場合7.5μM対デキサメタゾンの
場合10μM）よりもより強力である。各棒グラフは10%FB
S中で48時間培養した50,000個／ウェルの細胞で6回〜18
回実験した結果の平均を示したものである。メチルプレ
ドニゾロンを用いた実験でも同様の結果が観察された。

【００６７】図８に示したように、デヒドロエピアンド
ロステロン（DHEA）及び16α-ブロモエピアンドロステ
ロン（16α-BrEA）による成長阻害細胞は細胞数によっ
て確認された。細胞を培養し、細胞数を上述のように、
又図2で示したように定量化した。各棒グラフは24時間
培養した15,000個／ウェルの細胞を用いた6回の実験で
の直接目視染色細胞数の平均を示したものである。

【００６８】図９は、24時間では16α-ブロモエピアン
ドロステロン（16α-BrEA）が上清中のLDH活性を増加さ
せないことを示したものである。この例では、気道平滑
筋細胞をコンフルエント状態に成長させ、上清のLDH活
性測定の前に5μl／ウェルDMSO賦形剤又は16α-BrEAを
加えた賦形剤で24時間培養した。ここで、1.0単位は37
℃、pH7.5で１分あたり1.0μモルのピルビン酸塩をL-乳
酸塩に還元することを示す。各棒グラフは、6回の実験
の平均を示す。阻害剤を加えて2時間培養した場合も同
様の結果が観察された。16α-BrEAで処理した細胞とDMS
O賦形剤のみで処理した細胞の間に有意差は見られなか
った。

【００６９】表１に示したように、DHEA及び16α-BrEA
はヒト赤血球からの精製G6PDHの活性及び気道平滑筋細
胞の可溶物に直接添加した場合のG6PDHの活性を阻害し
た。細胞の増殖を阻害するようなDHEA又は16α-BrEAの
濃度で単一層を前処理した場合、細胞可溶物のG6PDH活
性はさほど減少しなかった（表１）。

【００７０】

【表１】

【００７１】悪性の不朽化した細胞株における知見と比
較して、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシ
ドを培地に添加した場合、DHEA又は16α-BrEAからの成
長阻害を逆転させることはできなかった（図１０から図
１３）。これらのデータはつまり、DHEA又は16α-BrEA
は、RNA及びDNA合成に必要なリボース及びデオキシリボ
ース糖のヘキソース一りん酸経路依存形成を破壊するこ
とによって気道平滑筋細胞の増殖を損なっているのでは
ない事を示している。この例では、細胞を培養し、前述
のように定量化した。各棒グラフは24時間（図１０及び
図１２）又は48時間（図１１及び図１３）、DHEA又は16
α-BrEAと200μMのリボヌクレオシド（R、アデノシン、
グアノシン、サイチジン、及びウリジン）又はデオキシ
リボヌクレオシド（D、デオキシアデノシン、デオキシ
グアノシン、デオキシサイチジン、及びサイミジン）の
存在下又は非存在下でDMEM及び10%FBS混合物中で培養し
た50,000細胞／ウェルで行った4回の実験のMTTホルマザ
ン吸収度の平均を示している。

【００７２】図１４に示したように、メバロン酸を培地
に補充した場合、16α-BrEAによる気道平滑筋単一層の
成長阻害に打ち勝つことができなかった。この例では、
細胞を培養し前述のように定量した。各棒グラフは、6m
Mのメバロン酸塩のDMEM溶液の存在下又は非存在下で0.5
%のFBS、１０％のFBS、10%のFBS+5μlのDMSO賦形剤及び
10%のFBS+阻害剤含有のDMSOのいずれかを各ウェルに添
加して36時間培養した50,000個／ウェルの細胞を用いて
6回実験を行いその平均MTTホルマザン吸収度を示したも
のである。DHEAを用いた場合も同様の結果が得られた。

【００７３】図１５は16α-BrEAで処理しても培養した
気道平滑筋細胞の膜中のP21^rasは枯渇しない事を示して
いる。示したゲルは、21kdのRasタンパク質の代表的な
免疫ブロットであり、0.5%FBS（レーン１）、10%FBS
（レーン３）、10%FBS+DNS賦形剤（レーン５）及び10%F
BS+10μMの16α-BrEA （レーン7）で24時間処理したコ
ンフルエント状態のそれぞれの単一層からの膜タンパク
質分画と等量である。レーン2、4、6、8は対応する上清
画分の免疫ブロットである。レーン9はA431細胞可溶物
の免疫ブロットを示す。

【００７４】最後に、Ras/Raf-媒介シグナル導入の妨害
は、c-fosのような初期反応遺伝子の発現を損なうと考
えられていたが、16α-BrEAは、10%FBSに正常に反応し
ているように見えるc-fosタンパク質（図１６）又はmRN
A（図１７と図１８）に対する刺激を阻害しなかった。
これらの結果からDHEA及びその類似物質は気道平滑筋に
おいて増殖反応に重要な初期シグナル導入を阻害しない
ことがわかる。図１６は、0.5%FBS（レーン２）で処理
した対照単一層、10%FBSで刺激した後15分(レーン3から
６)、30分（レーン6から8）及び60分(レーン9-11)経過
後のc-fosタンパク質の免疫ブロットである。レーン4、
7、10の細胞は刺激2時間前にDMSO賦形剤で前処理した。

【００７５】レーン５、8及び11の細胞は10μlMの16α-
BrEAで前処理した。レーン1はA431細胞可溶物の免疫ブ
ロットである。図１７では、実験したPCRゲルは次のと
おりである。レーン1から3は0.5%FBS対照群、レーン4か
ら6は10%FBSの対照群、レーン7から9は10μMの16α-BrE
A で前処理した10%FBS、レーン10から12はDMSO賦形剤で
前処理した10%FBSである。図１８は、図１７で示した実
験の概要である。C-fos mRNAの発現はハウスキーピング
遺伝子γ-アクチンに標準化される。図１８において、C
-fos mRNAの発現はハウスキーピング遺伝子β-アクチン
に標準化される。

【００７６】図１９は10%FBSで刺激する前に2時間DHEA
又は16α-BrEAで前処理した気道平滑筋細胞の核タンパ
ク質の電気泳動モービリティシフト分析を示したもので
ある。核タンパク質は6時間後に単離され電気泳動モー
ビリティシフト分析(EMSAs)を行った。図１９のA欄から
図１９のB欄は、各阻害剤で少なくとも3回行った実験の
代表的なゲルを示す。図１９のA欄は細胞のEMSAはDHEA
で前処理して行ったレーン1は0.5%のFBS、レーン２は10
%のFBS、レーン3は10%のFBS+50μMのDHEA、レーン4は10
%のFBS+DMSO賦形剤である。図１９のB欄では、細胞のEM
SAは16α-BrEAで前処理して行ったレーン1は0.5%のFB
S、レーン２は10%のFBS、レーン3は10%のFBS+DMSO賦形
剤、レーン4は10%のFBS+2μMの16α-BrEA、レーン5は10
%のFBS+10μMの16α-BrEA（図１９のC欄）である。細胞
のEMSAは10%FBSで刺激して行った。レーン2における結
合反応は、AP−１に対する10X未標識親株オリゴヌクレ
オチド配列との競合の存在下で行った以外は、配列レー
ン１の核タンパク質と同量で行われた。その結果、DHEA
（図１９のA欄）と16α-BrEA（図１９のB欄）はAP−１
のDNA結合を阻害していることがわかった。

【００７７】試験管内気管支平滑筋収縮への影響：図２
０は、3×10^-2MのKClで部分的に収縮させた単離モルモ
ットの主気管支にDHEAの濃度が与える影響を示したもの
である。賦形剤の場合と比較して、統計的に異なってい
た（P<0.01）。DHEAが最大濃度の場合、KCl誘発収縮の7
6.28±6.96%が弛緩した（時間−賦形剤による力の減少
を差し引いた後の値）。KCl誘発収縮の50%の弛緩を引き
起こすDHEAの濃度は2.16±10^-5M（GSEM=1.11）であっ
た。図２０の白丸は、DHEAを用いた実験を示し、白抜き
の四角はDMSO賦形剤のみを示したものである。各値は平
均±SEMである。DHEAはn=6でDMSO賦形剤はn=5である。

【００７８】図２１は10^-5MのAChで部分的に収縮させた
気管支へのDHEAの効果を示したものである。10^-4MのDHE
AはACh-誘発収縮の37.98±4.76%の弛緩を引き起こした
（賦形剤の場合と比較してP<0.01）。図２１の白丸はDH
EAを用いた実験を示し、白抜きの四角はDMSO賦形剤のみ
を示したものである。各値は平均±SEMで、n=5である。

【００７９】AChに対する濃度反応曲線は10^-4ＭのDHEA
の存在により右に移動した(図２２)。ACh-EC₅₀は、10^-4
ＭのDHEAの存在下及び非存在下でそれぞれ1.4×10^-5M
（幾何学的平均GSEM=1.2）と8.4×10^-6M（幾何学的平均
GSEM=1.3）であった。図２２の白丸は10^-4ＭのDHEAの存
在下、白抜きの四角は10^-4ＭのDHEAの非存在下での実験
の結果である。各値は平均±SEMで、n=5である。最後
に、10^-4ＭのDHEAは10^-5AChに反応した張力の伸び率を
2.27±0.82から1.85±0.85まで減少させた（paired t
検定によりP<0.05）。

【００８０】試験管内ヒト気道上皮からのインターロイ
キン-8分泌への影響：表２で示したように、16α-BrEA
は、喘息などの多くの急性の肺疾患に存在する強力な炎
症性サイトカインであるTNFまたは空気汚染粒子によるB
EAS細胞の刺激に反応して起きるインターロイキン-8の
分泌を投与量依存的に阻害した。酸化防止剤としてのDM
SO賦形剤もIL-8の分泌を減少させるが（既知の効果）Br
EAはそれ以上に分泌を阻害する。

【００８１】

【表２】

【００８２】ラットの気道平滑筋細胞の増殖は、DHEA及
び16α-ブロモエピアンドロステロンを薬学的濃度で用
いて処理することにより実質的に抑えられることが分か
った（図４〜図７）。この阻害は、細胞数に関する代謝
分析及び直接目視により測定した細胞数の減少両方によ
り明らかになった(図８)。

【００８３】さらに、DHEA及び16α-BrEAは、精製した
酵素又は細胞可溶物を含有する反応混合物に直接添加し
た場合G6PD活性を阻害した(表１)。しかし、DHEA及び16
α-BrEAは酵素回収前に細胞の単一層自体を処理した場
合、G6PD活性を阻害しなかった（表１）。又、細胞可溶
物におけるG6PD活性の阻害剤としては、DHEAは16α-BrE
Aよりも強力であったが、気道平滑筋増殖の阻害剤とし
ては、全く逆であった（図４〜図７）。さらに、G6PD活
性の阻害は、RNA及びDNA合成に必要なリボース及びデオ
キシリボース糖の生成を妨害することで細胞の成長を損
なっていると考えられるが、成長培地にリボ-及びデオ
キシリボヌクレオシドを添加することでこれら因子を外
から提供してもDHEA及び16α-BrEAによる細胞成長の阻
害に打ち勝つことはできなかった。このように、気道平
滑筋増殖のDHEA及び16α-BrEAによる阻害のメカニズム
がG6PD活性を妨害しているのではなさそうだ。

【００８４】培地にメバロン酸塩を添加しても16α-BrE
Aの成長阻害効果を弱めることはできなかった（図１
４）し、細胞を16α-BrEAで処理しても細胞膜からRasタ
ンパク質を枯渇させることはできなかった（図１５）。
又、16α-BrEAの成長阻害濃度で単一層を処理した場
合、初期反応遺伝子c-fosの正常な発現はそのままであ
った（図１９）し、さらに、DHEA及びその類似物質はRa
s媒介伝達シグナル導入という重要な反応を損なった
り、MAP−キナーゼ経路の機能を破壊したりしないとい
うこともわかった。これらのデータにより、DHEA及びそ
の類似物質はコレステロールの生合成、第二に、細胞膜
へのRas付着及び成長に必要なRas媒介シグナル導入を妨
害することによって気道平滑筋成長を阻害するのではな
いことが明らかである。

【００８５】DHEA及び16α-BrEAは、処理細胞の核タン
パク質を用いて行われた電気泳動モービリティシフト分
析において転写因子AP−１のDNA結合を減少させる（図
２０）。活性化タンパク質-1（AP−１）による第二次の
反応遺伝子の相互活動は、複数の経路―それを通して多
くの成長因子が細胞増殖を刺激するーの重要な集合点で
ある（Biochim. Biophys. Acta,1072:129-157(1991)に
記載のAngel,P及びKarin,Mによる“細胞増殖及び形質転
換におけるJun、Fos及びAP−１複合体の役割”）。AP−
１の相互抑制はグルココルチコイドの反増殖的作用を説
明するために示されている（EMBO J. 17:4087-4095 (19
94)に記載のHeck, S., Kullmann, M., Gast, Al, Pont
a, H., Rahmsdorf, H.J., Herrlich, Pl. 及びCata, A.
C.B.による“転写因子AP−１の活性抑制におけるグルコ
コルチコイド受容体モノマーの明確な調節領域”）。

【００８６】DHEAはグルココルチコイドではないが、細
胞質のステロイド受容体と相互に作用することが報告さ
れている（J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 42:293-
304(1992)に記載のMeikel, A.W., Dorchuck, R.W., Ara
neo, B.A., Stringham, J.D., Evans, T.G., Spruance,
S.L.及びDaynes, R.A.による“ネズミのT細胞における
デヒドロエピアンドロステロン特異的受容体結合複合体
の存在”）。このように、DHEA及びその類似物質はAP−
１のDNA結合を妨害しそれによって、AP−１媒介のシグ
ナル導入工程を妨害し、PDGF及びウシ胎仔血清のマイト
ジェン等各種のマイトジェンへの増殖反応を阻害してい
るものと思われる。AP−１反応の妨害は、ゆえに、どの
ようにDHEA及び類似物質が平滑筋増殖を損なうかの最も
よい説明となっている。

【００８７】気道平滑筋の増殖及びリモデリングを阻害
するために、DHEA及びその類似物質は喘息において、他
にも強力な医薬的利点を有していると思われる。第一
に、DHEA及びその類似物質はグルココルチコイドの代わ
りとして有用であろう。獲得したグルココルチコイド耐
性は、活性化したグルココルチコイド受容体複合体を結
合し相互抑制するAP−１複合体の発現過剰が、一部サイ
トカインにより誘導されて起きると仮定されている（Ad
cock、Lane、他による前述の文献）。DHEA又は類似物質
と受容体の複合体は、活性化したグルココルチコイド受
容体をGREsに結合するために開放し、代わりに犠牲的に
AP−１と結合し、炎症状態の相対的グルココルチコイド
耐性に打ち勝つ。

【００８８】第二に、DHEA及びその類似物質は本来抗炎
症活性を有している。多くの免疫調節遺伝子はAP−１プ
ロモーター部位を含有しており、AP−１の阻害は炎症性
サイトカインの発現に否定的な衝撃を与えるであろう。
又、DHEAは転写因子核因子кB（NF-кB）の活性化を抑
えると報告されている（AIDS Res. Hum. Retroviruses,
9, 747-754(1993)に記載のYang, Y.U., Schwartz, A.
及びHenderson, E.Eによる“デヒドロエピアンドロステ
ロン（DHEA）及びその類似物質によるHIV-1潜伏期再活
性化の阻害”）。さらに16α-BrEAは、腫瘍壊死因子及
び空気汚染粒子により刺激されたインターロイキン-8の
培養されたヒト呼吸器上皮からの分泌を減らすことがわ
かっている（表２）。炎症性サイトカインの分泌の減少
が、喘息患者の気道内でのすべての炎症性反応を減らす
ことを期待されている。

【００８９】第三に、DHEAはCa²⁺活性化K⁺チャネル（K
_ca）オープナー（Am. Rev. Respir.Crit. Care Med., 1
55, A790(1997, Abstract)に記載のPeng, W., Hoidal,
J.R.及び Farrukh, I.S.による“デヒドロエピアンドロ
ステロン、新規Ca²⁺活性化K⁺チャネルオープナー”）と
して機能し、各種アゴニストにより収縮した全身の血管
（Hypertension, 26, 1065-1069 (1995)に記載のBarbag
allo, M., Shan, J.,Pang, P.K.T.,及びResnick, L.M.
による“細胞のカルシウム反応性及び血管の収縮性に対
するデヒドロエピアンドロステロン硫酸塩の影響”）お
よび肺動脈（Am. J. Respir. Crit. Care Med., 153, A
586(1996, Abstract)に記載のFarrukh,I.S., Peng, W.,
Orlinska, U.及びHoidal, J.R.による“低酸素状態の
フェレットの肺の、デヒドロエピアンドロステロン介在
による肺血管拡張”）血管を弛緩することができ、モル
モットの気道平滑筋のKCl-誘発収縮を逆転させる。

【００９０】このように、DHEAは気道平滑筋において直
接気管支拡張活性を有する。又、DHEA及びその類似物質
は、気道平滑筋を弛緩する点においてベータアドレナリ
ン作動性気管支拡張薬と相乗効果を有する場合もある。
K_caチャネルはベータ-2-アドレナリン受容体アゴニスト
誘発弛緩のための重要な標的タンパク質として示されて
いる（Nature, 341, 152(1989)に記載のKume, H., Taka
il, A., Tokuno, H.及びTomita,T.による“気管の筋細
胞におけるCa²⁺依存K⁺チャネル活性のりん酸化による調
整”、J. Pharmacol. Exp. Ther., 255, 697(1990)に記
載のJones, T.R., Charette, L. Garcia, M.L.及びKacz
orowski, G.J.による“charybdotoxinによるモルモット
気管の弛緩の選択的阻害、強力なCa²⁺活性化K⁺チャネル
阻害剤”、Am. Rev. Respir. Dis. 146:132(1992)に記
載のMiura, M., Belvisi, M.G., Stretton, C.D., Yaco
ub, M.H.及びBarnes, P.J.による“ヒト気道の気管支拡
張反応におけるカリウムチャネルの役割”；Proc. Nat
l. Acad. Sci., U.S.A., 89, 110551(1992)に記載のKum
e, H., Grazizno, M.P.及びKotlikoff, M.I.による“グ
アニンヌクレオチド結合タンパク質によるカルシウム活
性化カリウムチャネルの刺激的及び阻害的調整”）。こ
れらのチャネルはヒト気道平滑筋の細胞膜に高密度に分
布している（Br. J. Pharmacol., 115, 1117(1995)に記
載のSnetkov,V.A., Hirst, S.J., Twort, C.H.C.及びWa
rd,.J.P.T.による“ヒトの単離したばかりの気管支平滑
筋細胞におけるカリウム流”）。

【００９１】細胞内cAMPを増加させてタンパク質キナー
ゼAを活性化しひいてはK_caをりん酸化することにより(N
ature, 341, 152(1989)に記載のKume, H., Takail, A.,
Tokuno, H.及びTomita,T.による“気管の筋細胞のCa²⁺
依存K⁺チャネル活性のりん酸化による調整”）ベータア
ゴニストはK_caチャネルをオープンするか又は、ベータ
アゴニストはGタンパク質依存性、タンパク質キナーゼA
非依存性メカニズムによりK_ca活性を刺激する（Scienc
e, 238, 1288(1987)に記載のYatani, A., Codina, J.,
Imoto, Y., Reeves, J.P., Birnbaumer, L.及びBrown,
A.M.による“Gタンパク質は哺乳類の心臓のカルシウム
チャネルを直接調整する”；J. Biol. Chem., 263, 998
7(1988)に記載のYatanni, A., Imoto, Y., Codina, J.,
Hamilton,S.L., Brown, A.M.及びBirnbaumer, L.によ
る“アデニリルシクローゼの刺激性Gタンパク質Gsはデ
ヒドロピリジン-感受性Ca²⁺チャネルも刺激する。ジヒ
ドロピリジンアゴニストによる刺激又はcAMP依存性タン
パク質キナーゼによるりん酸化からは独立した直接調整
の証拠”）。

【００９２】喘息患者の炎症を起こした気道の共通課題
であるベータ受容体脱感作等の現象による阻害に対し
て、これらのベータアゴニスト依存性メカニズムは両方
とも、感受性がある。DEHAは、ベータアゴニスト受容体
の相互作用を経る必要なしに、K_caチャネルを直接活性
化する方向にむけて“バイパス”的アプローチを提供す
るであろう。この事は、ベータアゴニストによる気管支
の弛緩に対してすでに比較的鈍感である急性の喘息では
特に有用である。

【００９３】喘息において迷走神経的に誘発された気道
の反応過敏性は、迷走神経に対するニューロンのM₂ムス
カリン様受容体の機能不全からきたものである。これら
の受容体は正常に機能して迷走神経からのアセチルコリ
ンの遊離を阻害し、それによって迷走神経の誘発する気
管支収縮を制限する。ニューロンのM₂ムスカリン様受容
体は喘息では機能しておらず（Chest, 96, 1285-1291(1
989)に記載のAyala, L.E.及びAhmed, T.による“喘息に
おいては保護的ムスカリン様受容体のロスはあるか
？”；J. Appl. Physiol., 64,2532-2537(1998)に記載
のMinette, P.及びBarnes, P.J.による“ヒト及びモル
モットの気道におけるコリン作用性神経末端の予備連結
的阻害性ムスカリン様受容体”）、刺激性の迷走神経反
射を引き起こし、喘息の患者にひどい気管支収縮をもた
らす。アセチルコリン誘発気管支収縮を阻止することに
よって、DHEA及びその類似物質は喘息の兆候に全般に関
わっている喘息の全般的な迷走神経介在気道反応過敏を
抑えることができるであろう。

【００９４】最後に、試験管内でのDHEA処理により、DH
EA又はその類似物質が喘息の気道リンパ球のTH2からTH1
の状態への逆転を促進する可能性が高まり、インターロ
イキン-2のT-リンパ球生成が増大する（前述のMeikle他
(1992)）。N. Engl. J. Med., 326, 298-304(1992)に記
載のRobinson, D.S., Hamid, Q., Ying, S., Tsicopoul
os, A.及び Barkans, J., Bentley, A.M., Corrigan,
C., Durham, S.R.及びKay, A.B.による“アトピー性の
喘息における主なTH2-様気管支肺胞のT-リンパ球群”参
照のこと。

【００９５】反増殖作用に基づき、DHEA及びその類似物
質はヒトにおける気道平滑筋リモデリングの治療薬とし
て有用性を提供することがわかった。グルココルチコイ
ドにまさるこれらの物質の利点は、これらの効果のわず
かなタンパク質同化及び反グルココルチコイドスペクト
ラムにある。Ann. N.Y. Acad. Sci., 719, 564-575 (19
94)に記載のRegelson, W.及びKalimi, M.による“デヒ
ドロエピアンドロステロン（DHEA）−多機能性ステロイ
ド。II：CNS、細胞増殖、代謝、血管への影響、臨床上
の効果等。作用のメカニズムは？”参照のこと。このよ
うに、DHEA又はその類似物質は、血圧やグルコース及び
骨の代謝に長期間のコルチコステロイドの使用がもたら
す望ましくない影響なしに、気道の疾病の治療に新しい
アプローチを提供するものであろう。

【００９６】本発明の多くの修正や他の態様は、本発明
の関わる分野の同業者にとってはこれまでの説明及び関
連図面に示された説から明らかなものであろう。しかる
に、本発明は開示された特定の態様のみに限定されるの
ではなく、修正や他の態様は添付のクレームの範囲に含
まれる様意図したものである。本文中に特定の条件が含
まれているが、それらは限定する目的ではなく包括的か
つ叙述的な意味でもちいられている。

【図面の簡単な説明】

【図１】血球計により測定された細胞数の正確な測定同
様のMTT還元による測定を示したものである。

【図２】ラットの気道平滑筋の細胞成長に与えるマイト
ジェンの効果を示したものである（ウシ胎仔血清）。

【図３】ラットの気道平滑筋の細胞成長に与えるマイト
ジェンの効果を示したものである（血小板由来成長因
子）。

【図４】FBSにより刺激された気道平滑筋細胞の成長に
対するデヒドロエピアンドロステロン（DHEA）及びデヒ
ドロエピアンドロステロン硫酸塩（DHEAs）の効果を示
したものである。

【図５】PDGFにより刺激された気道平滑筋細胞増殖に対
するデヒドロエピアンドロステロンの効果を示したもの
である。

【図６】FBSにより刺激された気道平滑筋増殖に対する1
6α-ブロモエピアンドロステロンの効果を示したもので
ある。

【図７】デキサメタゾンと比較した16α-ブロモエピア
ンドロステロンの成長阻害に対する効果を示したもので
ある。

【図８】デヒドロエピアンドロステロン及び16α-ブロ
モエピアンドロステロンの成長阻害効果を示したもので
あり、機器による測定ではない。

【図９】細胞上清の乳酸脱水素酵素（LDH）の活性は16
α-ブロモエピアンドロステロンにより増加しないこと
を示したものである。

【図１０】気道平滑筋増殖のDHEAによる阻害は、培地に
後で補完的に添加したリボヌクレオシド及びデオキシリ
ボヌクレオシドにより逆転しないことを、２４時間の培
養で示したものである。

【図１１】気道平滑筋増殖のDHEAによる阻害は、培地に
後で補完的に添加したリボヌクレオシド及びデオキシリ
ボヌクレオシドにより逆転しないことを、４８時間の培
養で示したものである。

【図１２】気道平滑筋増殖の16α-ブロモエピアンドロ
ステロンによる阻害は、培地に後で補完的に添加したリ
ボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドにより逆
転しないことを、２４時間の培養で示したものである。

【図１３】気道平滑筋増殖の16α-ブロモエピアンドロ
ステロンによる阻害は、培地に後で補完的に添加したリ
ボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドにより逆
転しないことを、４８時間の培養で示したものである。

【図１４】コレステロール代謝の崩壊は気道平滑筋成長
の16α-ブロモエピアンドロステロンによる阻害を説明
しないことを示したものである。

【図１５】16α-ブロモエピアンドロステロンで単一層
を処理しても膜からP21^rasをなくすことはできないこと
をしめす免疫ブロットである。

【図１６】FBSで処理した対照単一層及びDMSO、16α-ブ
ロモエピアンドロステロン及びA431細胞可溶物それぞれ
で前処理した細胞からのc-fosタンパク質の代表的な免
疫ブロットである。

【図１７】DMSO賦形剤又は１０μMの16α-ブロモエピア
ンドロステロンで２時間行った前処理が正常なc-fos ｍ
RNAの増加を阻害しなかったことを示すものである。

【図１８】図１７の実験の概要を示すものである。

【図１９】気道平滑筋をデヒドロエピアンドロステロン
又は16α-ブロモエピアンドロステロンで処理すること
により転写因子AP−１のDNA結合を阻害することを示し
たものである。

【図２０】部分的に３×１０−２MのKClで収縮させたモ
ルモットの主気管支における、DHEA及び賦形剤のみ（DM
SO）のそれぞれの濃度効果曲線を示したものである。

【図２１】部分的に１×１０−５Mのアセチルコリン（A
ch）で収縮させたモルモットの主気管支における、DHEA
及び賦形剤のみ（DMSO）のそれぞれの濃度効果曲線を示
したものである。

【図２２】図２２は、モルモットの主気管支における１
０−４M のDHEAの存在下又は非存在下でのAChに対する
濃度反応曲線を示したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ０７Ｊ 1/00 Ｃ０７Ｊ 1/00

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記化１で表される化合物の有効投与量
   を動物に投与するステップを含んでなる、動物のAP−１
   のDNA結合と気道平滑筋増殖とを阻害する治療方法。 【化１】 この式中では、Xはハロゲン、水酸基、水素、低級アル
   キル基又は低級アルコキシ基を表し、Yは水素又は水酸
   基を表し、Zは低級アルキル基又は水素を表す。
2. 【請求項２】 上記化合物が、16α-ブロモ-5-アンドロ
   ステン-17-オン、16β-ブロモ-5-アンドロステン-17-オ
   ン、16α-フルオロ-5-アンドロステン-17-オン、16β-
   フルオロ-5-アンドロステン-17-オン、16α-ブロモ-5-
   アンドロスタン-17-オン、16β-ブロモ-5-アンドロスタ
   ン-17-オン、16α-フルオロ-5-アンドロスタン-17-オン
   と16β-フルオロ-5-アンドロスタン-17-オンからなるグ
   ループから選ばれる一つであることを特徴とする、請求
   項１記載の治療方法。
3. 【請求項３】 上記化合物がデヒドロエピアンドロステ
   ロン(dehydroepiandrosterone)であることを特徴とす
   る、請求項１記載の治療方法。
4. 【請求項４】 上記化合物がデヒドロエピアンドロステ
   ロンであり、上記化合物の有効投与量が2から10 mg / k
   g／日であることを特徴とする、請求項１記載の治療方
   法。
5. 【請求項５】 上記化合物が16-ブロモ又はそのフッ素
   化類似物であり、化合物の有効投与量が0.2から2 mg /
   kg／日であることを特徴とする、請求項１記載の治療方
   法。
6. 【請求項６】 上記化合物がエアロゾール投与により投
   与されることを特徴とする、請求項１記載の治療方法。
7. 【請求項７】 上記化合物が計量投与吸入器により投与
   されることを特徴とする、請求項１記載の治療方法。
8. 【請求項８】 上記化合物が粉末投与吸入器により投与
   されることを特徴とする、請求項１記載の治療方法。
9. 【請求項９】 上記化合物がリポゾーム担体の一部とし
   て処方された薬物の吸入により投与されることを特徴と
   する、請求項１記載の治療方法。
10. 【請求項１０】 上記投与が、直接気道に上記化合物を
    投与することからなることを特徴とする、請求項１記載
    の治療方法。
11. 【請求項１１】 上記方法が、気管支収縮 (bronchocon
    striction) の阻害を含むことを特徴とする、請求項１
    記載の治療方法。
12. 【請求項１２】 上記方法が、気管上皮により炎症性サ
    イトカインの喘息関連分泌 (asthma-related secretio
    n) の阻害を含むことを特徴とする、請求項１記載の治
    療方法。
13. 【請求項１３】 上記方法が、喘息におけるアセチルコ
    リン添加による、迷走神経性の気道過敏反応の阻害を含
    むことを特徴とする、請求項１記載の治療方法。
14. 【請求項１４】 上記方法が、ベータアゴニスト気管支
    拡張薬 (beta agonist bronchodilators) の気管支拡張
    活性の増強を含むことを特徴とする、請求項１記載の治
    療方法。
15. 【請求項１５】 上記方法が、AP−１の阻害によって、
    喘息におけるグルココルチコイド (glucocorticoid) の
    不感受性の抑制を含むことを特徴とする、請求項１記載
    の治療方法。