DE60113145T2

DE60113145T2 - Selektive glucocorticoid rezeptor agonisten

Info

Publication number: DE60113145T2
Application number: DE60113145T
Authority: DE
Inventors: Stephen Alexander Barr; Michael Anthony Mckervey; Hughes Jean-Pierre Miel; David William Oxford Road RAY; Andrew Michael Brass
Original assignee: University of Manchester
Current assignee: University of Manchester
Priority date: 2000-11-03
Filing date: 2001-11-02
Publication date: 2006-06-22
Anticipated expiration: 2021-11-03
Also published as: US20080090792A1; DE60113145D1; PT1335928E; US7763596B2; AU1076802A; DK1335928T3; NZ526216A; AU2002210768B2; ATE303398T1; EP1335928A1; EP1335928B1; WO2002036606A1; CA2427569A1; CA2427569C; US20040102425A1; ES2249483T3

Description

Gebiet der Erfindung
Glucocorticoide (GC) werden therapeutisch seit vielen Jahren verwendet, um Entzündungen zu behandeln, als Mittel zur Unterdrückung von Immunabstoßungsreaktionen und in der Behandlung von lymphoproliferativen Störungen und bestimmten anderen Erkrankungen ^1;2. Diese Verbindungen sind die potentesten und wirksamsten bekannten entzündungshemmenden Mittel. Die Verwendung von GC ist durch ihre vielfachen und oft zerstörerischen Nebenwirkungen eingeschränkt. Diese Erfindung betrifft derartige Verbesserungen bei GC, dass die therapeutischen Effekte von ausgewählten Agonisten beibehalten wird, dass aber das Potential der Verbindungen, schädliche Nebenwirkungen zu verursachen, signifikant reduziert wird.
Hintergrund der Erfindung und Stand der Technik
GC wurden zuerst in den 1950er in die Medizin Jahren eingeführt. Anfänglicher Enthusiasmus bezüglich dieser Drogen aufgrund von Erfolg beim Beherrschen von Entzündungen in einem weiten Bereich von Krankheiten wurde bald durch die Erkenntnis gedämpft, dass diese Verbindungen einen weiten Bereich von Nebenwirkungen verursachen, die oft ernst, oft irreversibel und in vielen Fällen ernster sind, als der behandelte entzündliche Zustand.
Die Erkrankungen, bei denen GC gezeigt haben, dass sie einen starken entzündungshemmenden Effekt haben, umfassen entzündliche Arthritiserkrankungen, wie beispielsweise rheumatische Arthritis, Wirbelsäulenversteifung und psoriatische Arthropathie, andere rheumatische Erkrankungen, wie beispielsweise systemische Schmetterlingsflechte, Sklerodermie, Gefäßentzündungskrankheiten, einschließlich temporärer Arteriitiis und Kussmaul-Krankheit, entzündliche Darmerkrankungen, wie beispielsweise Crohn-Krankheit und ulzerative Colitis, Lungenerkrankungen, wie beispielsweise Asthma und chronische obstruktive Luftwegserkrankungen, sowie viele andere Zustände wie polymyalgische rheumatische Zustände. GC sind auch umfangreich in Bezug auf ihre Immunabstoßungsreaktionen unterdrückenden Eigenschaften bei der Verhinderung und Behandlung von Transplantatsabstoßung eingesetzt. Letztlich sind GC aufgrund ihrer Antitumorwirkungen bei einer Anzahl von Malignitäten verwendet worden. Die Aktivität von GC bei der Behandlung von lymphoproliferativen und anderen Geschwüren wird auf die Fähigkeit von GC zurückgeführt, Apoptose zu induzieren ^3;4.
Die Verwendung von GC, insbesondere bei entzündlichen Erkrankungen, ist stark durch deren Nebenwirkungen eingeschränkt, die unten diskutiert werden. Eine Anzahl von Anläufen ist unternommen worden, die Nebenwirkungen der Drogen zu überwinden. Der am häufigsten unternommene Anlauf war es, das Steroid lokal am Entzündungsort anzuwenden. Zielorgane, bei denen dieser Ansatz angewandt wurde, umfassen die Lunge mit oraler Inhalation für die Behandlung von Asthma und chronischen obstruktiven Luftwegserkrankungen; die Nase mit lokaler Instillation für die Behandlung von allergischer Rhinitis; das Auge mit lokaler Instillation für die Behandlung einer Anzahl von ernsten entzündlichen Augenzuständen, wie beispielsweise Uveitis; bei großen Gelenken mit intra-artikulärer Injektion von Steroiden, um Entzündungen zu behandeln; und auf der Haut für die Behandlung von Ekzemen, Psoriasis und einer Anzahl anderer Zustände der Haut. Lokaler Austrag hat eine Dosisreduktion mit einer entsprechenden Reduzierung von systemischen Nebenwirkungen erlaubt. Systemische Nebenwirkungen sind durch die Einführung von so genannten "weichen Steroiden", wie beispielsweise Fluticason, für äußerliche Anwendungen, während der letzten Jahre weiter reduziert worden. Diese weichen Steroide werden nach Absorption in den systemischem Kreislauf schnell durch Stoffwechsel inaktiviert, wodurch systemische Nebenwirkungen minimiert werden. Lokale Anwendung von weichen Steroiden ist jedoch weiterhin mit signifikanten lokalen Nebenwirkungen verbunden, wie beispielsweise einem Dünnwerden der Haut. Weiche Steroide sind sinnlos, wenn eine systemische Verabreichung der Droge bei Krankheiten, wie beispielsweise temporärer Arteriitis oder polymyalgischer rheumatischer Zustände, erforderlich ist.
Die Nebenwirkungen von Steroiden umfassen die Folgenden:
Osteoporose; Wachstumsschwäche; gefäßlose Knochennekrose; proximale Muskelerkrankung; verschlechterte Glucosetoleranz oder einfachen Diabetes; Gewebeschwellung und Ödeme; Hypertonie; Hypokaliämie; geschwollenes Gesicht; Gewichtszunahme; Fettsucht; Euphorie; Psychose; Schlaflosigkeit; erhöhten Intrakranialdruck; Verschlimmerung von Epilepsie; Gedächtnisstörung; Hippocampusatrophie; Magengeschwür; Pankreatitis; Unterdrückung der Hypothalamus-Hypophyse-Achse; erhöhter Augendruck; Glaukome; Papillenödem; Dünnwerden der Haut; verringerter Widerstand gegenüber Infektionen; verschlechterte Wundheilung.
Trotz dieses Katalogs von Nebenwirkungen werden diese Drogen weiterhin aufgrund ihrer entzündungshemmenden Wirkungen umfangreich eingesetzt, die jene jeder anderen Drogenklasse übersteigen; und sie spielen weiterhin eine zentrale Rolle bei der Behandlung und Verhinderung von Transplantatabstoßung und der Behandlung von lymphoproliferativen Störungen und bestimmten anderen Malignitäten. Es gibt deshalb ein Bedürfnis nach neuen Steroiden mit derselben Wirksamkeit wie die vorhandenen Drogen dieser Klasse, aber mit einem reduzierten Nebenwirkungspotential.
GC wirken über spezifische Glucocorticoidrezeptoren (GR), die Mitglieder der Kernrezeptorsuperfamilie sind. Hormonbindung fördert Rezeptordimerisierung, DNS-Bindung und transkriptionale Aktivierung. Dieser Mechanismus der GC-Wirkung ist in vitro gut bekannt und ist kritisch für die Regulierung der Hypothalamus-Hypophyse-Adrenalin-Achse und der Gluconeogenese in vivo. An einen Rezeptor gebundenes Hormon ist auch in der Lage, die Gentranskription durch Wechselwirken mit der Aktivität von Transkriptionsfaktoren, wie beispielsweise AP-1 und NFkB, die wesentlich in die entzündliche Reaktion eingebunden sind, in einer dimerisierungsunabhängigen Weise zu beeinflussen.
Die Induktion von Apoptose bei Thymozyten und anderen Zelltypen ist eine gut bekannte Wirkung von GC. Der Mechanismus hinter der GC-Induktion von Apoptose ist unklar, obwohl allgemein geglaubt wird, dass er die transkriptionale Aktivierung, zum Beispiel die Aktivierung des Caspase-Leitungswegs einbezieht ⁹. Dies bleibt kontrovers ^10-13, und eine unerwartete Entdeckung, die wir gemacht haben und die zu dem ersten Aspekt dieser Erfindung führte, war die Entdeckung, dass die Aktivitäten von GC im Sinne ihrer Fähigkeit, Aktivierung zu verursachen, ihrer Fähigkeit, Unterdrückung zu verursachen, und ihrer Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, unterschieden werden konnten. Bevorzugte Verbindungen sind, wie unten diskutiert werden wird, jene, die die Fähigkeit, Genexpression zu unterdrücken und Apoptose zu induzieren, beibehalten, aber die Fähigkeit verlieren, Genexpression zu aktivieren.
Die Induktion von Apoptose bei T-Lymphozyten mag für die Immunabstoßungsreaktionen unterdrückende Aktivität von GC wichtig sein. Zusätzlich kann dieser selbe Mechanismus bei den entzündungshemmenden Wirkungen von GC wichtig sein, wobei die Zerstörung von klonogenischen Gedächtnis-T-Zellen für die Induktion einer Antwort auf ein Antigen verantwortlich ist ¹⁴. Letztlich gibt es Beweise, dass bei bestimmten Erkrankungen die entzündlichen Prozesse zumindest teilweise von einem Fehlen von Apoptose bei entzündeten Zellen abhängen. Dies ist im Fall von Neutrophilen bei entzündlichen Darmerkrankungen gezeigt worden ¹⁵.
Nach Ligandenbindung wandern GR von dem Zytoplasma der Zelle zum Kern und binden an Glucocorticoidantwortelemente in der regulatorischen Region des Zielgens an. Der aktivierte GR rekrutiert dann Cofaktoren einschließlich des glucocortikoidrezeptorinteragierenden Proteins 1 (GRIP-1) und des Steroidrezeptorcoaktivators 1 (SRC1). Diese assessorischen Proteine binden an den Rezeptor an und verbinden den GR mit der allgemeinen Transkriptionsmaschinerie ^16-22.
Glucocortikoideffekte auf die Transkription können sowohl durch die direkte Bindung von aktiviertem GR an Ziel-DNS, Homodimerisierung und Rekrutierung von Coaktivatoren als auch durch GR-Wechselwirkung mit anderen Transkriptionsfaktorfunktionen, einschließlich AP-1, NFkB und NUR77 vermittelt werde ^23-31. Diese zwei Modi von Rezeptoraktivität sind dissoziierbar, d. h. negative Einflüsse auf NFkB-Aktivität werden beibehalten, aber mit Verlust an Transaktivierung. Es scheint so, dass dieser zweite Mechanismus im Wesentlichen für die Vermittlung der therapeutisch wünschenswerten entzündungshemmenden Aktivität der GR verantwortlich ist ^28;31-33. Interessanterweise ist der IC50-Wert für die Inhibierung von AP-1 oder NFkB (0,04 nM) kleiner als der EC50 für die Aktivierung von Zielgenen (5 nM) ^8;34, obwohl hohe Dosierungen an GC häufig erforderlich sind, um Patienten mit entzündlichen Erkrankungen zu behandeln. Es scheint, als wenn Zytokine, die am Ort der Entzündung expressiviert werden, eine relative Glucocorticoidbeständigkeit induzieren, möglicherweise durch Aktivierung von AP-1 oder NFkB ^{19;23;31;34-37}. Dies ist von Bedeutung, da das entzündungsfördernde Zytokinsignal durch Aktivierung von NFkB und die Mehrheit der entzündungshemmenden Wirkungen von GC als durch gegenläufige NFkB-Aktivität vermittelt angesehen wird.
Spezifische Mutationen bei dem GR-Molekül können zu dissoziierten Rezeptoren führen ^25;26 d. h. zu Molekülen mit relativ inaktiver Transaktivierung verglichen mit Transrepression, und eine Anzahl von synthetischen Liganden weist differenzielle Aktivität auf diesen beiden GR-Leitungswegen auf, z. B. RU24858 ³⁸. Jedoch weist keiner/keines der beschriebenen Liganden oder Moleküle eine ausreichend weite Dissoziierung dieser GR-Wirkungen auf, so dass diese therapeutisch nutzbar wären. Zusätzlich induziert RU24858 keine Apoptose, und so fehlt es ihm an einer der wichtigen Aktivitäten von GC sowie der Aktivierung des Progesteronrezeptors, wodurch es ein unerwünschtes Fehlen von Spezifizität der Wirkung aufweist (unpublizierte Daten).
Es wäre von immensem Wert, Glucocorticoidwirkung spezifisch auszurichten, um NFkB, AP-1 zu inhibieren und die Fähigkeit, Apoptose zu induzieren, beizubehalten, und zur selben Zeit die transaktivierende Aktivität stark zu reduzieren.
Vorangegangene Studien haben versucht, die Effekte von bekannten und neuen Steroiden nach ihrer Fähigkeit, Transaktivierung und Transrepression zu verursachen, zu differenzieren ^39;40. Bis heute sind keine neuen Verbindungen entwickelt worden. Wir beschreiben eine Strategie, durch die wir in der Lage waren, Verbindungen mit nützlicher therapeutischer Aktivität zu identifizieren.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines entzündlichen Zustands, zur Behandlung von hämatologischen und anderen Geschwüren, zur Auslösung von Immunsupression oder zum Verhindern oder Behandlungen von Transpantatabstoßung bei Menschen oder anderen Tieren bereitgestellt, dass das Verabreichen einer Verbindung an einen Patienten umfasst, welche die Struktur der Formel I oder der Formel II oder eines pharmazeutisch aktzeptablen Derivats oder Prodrugs davon aufweist:
Formel I, wobei R = NH₂, NHR¹, NHOR², NHNHR², NHCOR²,
und
R¹ = C_(1-4)-Alkyl, C_(3-6)-Zykloalkyl,
wobei n = 1–3,
R² = Methyl, Ethyl,
R³ = C_1-6-Alkyl, Benzyl oder Halogenbenzyl; oder
Formel II, wobei R⁴, R⁵ = C_(1-4)-Alkyl.
Die Alkylgruppen von jedem R¹ bis R⁵ können gerade oder verzweigte Ketten sein.
Gemäß diesem Verfahren wurde von den Verbindungen herausgefunden, dass sie Apoptose in vorentzündlichen Zellen induzieren.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung gemäß der Formel III oder der Formel IV bereitgestellt, wie sie unten definiert sind:
Formel III, wobei R⁶ und R⁷ irgendeines von H, CH₃CO, CH₃CH₂CO, CH₃CH₂CH₂CO sind, vorausgesetzt, dass R⁶ und R⁷ nicht beide H sind,
oder
Formel IV, wobei R⁸ und R⁹ irgendeines von H, CH₃CO, CH₃CH₂CO, CH₃CH₂CH₂CO sind.
Die Verbindungen, die die Struktur der Formel III oder IV aufweisen, sind nützlich als Prodruge. Mit dem Begriff "Prodrug" ist eine Verbindung gemeint, die eine chemische Umwandlung durchläuft, um eine aktive Droge zu werden, wenn sie durch den Körper umgesetzt wird. Dies führt normalerweise aufgrund einer Erhöhung bei der Absorption durch den Körper zu einer erhöhten Drogenwirksamkeit, einer Verlängerung des Anhaltens der Wirkung im Körper oder zu einer Reduktion von bestimmten Nebenwirkungen.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung gemäß der Formel I oder II, wie sie oben definiert ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat oder Prodrug davon oder eine Verbindung gemäß Formel III oder IV zur Verwendung als Medizin bereitgestellt. Diese Verbindungen sind insbesondere wirksam bei der Behandlung eines entzündlichen Zustands, zur Behandlung von hämatologischen und anderen Malignitäten, zum Unterdrücken von Immunabstoßungsreaktionen oder zur Verhinderung oder Behandlung von Transplantatabstoßungen.
Gemäß einem vierte Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung gemäß der Formel I oder II, wie sie oben definiert sind, oder eines pharmazeutisch akzeptablen Derivats oder Prodrugs davon oder einer Verbindung gemäß Formel III oder IV bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines entzündlichen Zustands, für die Behandlung von hämatologischen oder anderen Malignitäten, für die Unterdrückung von Immunabstoßungsreaktionen oder für die Verhinderung oder Behandlung von Transplantatabstoßungen bereitgestellt.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die eine Verbindung gemäß der Formel I oder II, wie sie oben definiert ist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat oder Prodrug davon oder eine Verbindung gemäß Formel III oder IV und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist. Solch eine Zusammensetzung ist insbesondere nützlich bei der Behandlung eines entzündlichen Zustands, für die Behandlung hämatologischer oder anderer Malignitäten, zum Unterdrücken von Immunabstoßungsreaktionen oder bei der Verhinderung oder Behandlung von Transplantatabstoßungen. Der sechste Aspekt der vorliegenden Erfindung richtet sich auf die Verwendung solch einer Zusammensetzung bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines entzündlichen Zustands, für die Behandlung hämatologischer oder anderer Malignitäten, zum Unterdrücken von Immunabstoßungsreaktionen oder zum Verhindern oder Behandeln von Transplantatabstoßungen.
Gemäß einem siebten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Induzieren von Apoptose in Zielzellen bereitgestellt, das das Verabreichen einer Erfindung gemäß der Formel I oder II wie oben definiert oder eines pharmazeutisch akzeptablen Derivats oder Prodrugs davon oder einer Verbindung gemäß Formel III oder IV an die Zielzellen oder in die Umgebung, in der die Zielzellen angeordnet sind, aufweist. Der achte Aspekt der vorliegenden Erfindung ist auf die Verwendung einer Verbindung gemäß der Formel I oder II wie oben definiert oder eines pharmazeutisch akzeptablen Derivats oder Prodrugs davon oder einer Verbindung gemäß der Formel III oder IV bei der Herstellung eines Medikaments zum Induzieren von Apoptose in Zielzellen gerichtet. Die Zielzellen sind allgemein vorentzündliche Zellen oder maligne Zellen. So ist dieser Aspekt nützlich für die Behandlung von Entzündungen und zum Behandeln von hämatologischen oder anderen Malignitäten.
Die bevorzugten Verbindungen der Formel I, die gemäß der Erfindung verwendet werden, umfassen jene, bei denen R NHR¹ ist und R¹ Methyl, Ethyl, Propyl, Zyklopropyl, Butyl, Zyklobutyl oder
ist und n = 1. Weitere bevorzugte Verbindungen sind jene, bei denen die Verbindung die Struktur der Formel I aufweist, wobei R
ist und R³ ein gerad- oder verzweigtkettiges Alkyl oder substituiertes Alkyl, vorzugsweise C_(1-6)-Alkyl oder substituiertes Alkyl, am meisten bevorzugt Propyl oder Hexyl ist oder wobei R³ eine Benzyl- oder eine substituierte Benzylgruppe, vorzugsweise Halogenbenzyl, am meisten bevorzugt Fluorbenzyl, ist oder wobei R³ die substituierte Alkylgruppe
ist, wobei n = 1–6, vorzugsweise n = 1, ist, oder wobei R³ eine C_(3-6)-Zykloalkyl- oder substituierte Zykloalkylgruppe ist.
Bevorzugte Verbindungen weisen eine Struktur gemäß Formel II auf, einschließlich jener Fälle, in denen R⁴ und/oder R⁵ Methyl und/oder Ethyl ist.
Beispiele von insbesondere bevorzugten Verbindungen zusätzlich zu den neuen Verbindungen gemäß den Formeln III und IV, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, werden als "Verbindung A", "Verbindung G" und "Verbindung H", "Verbindung I", "Verbindung K", "Verbindung M", "Verbindung N", "Verbindung S", "Verbindung T", "Verbindung 2", "Verbindung 3", "Verbindung 4", "Verbindung 5" und "Verbindung 7", bezeichnet, deren Strukturen in den 2A und 2B der beigefügten Zeichnungen gezeigt sind. Die am meisten bevorzugte Verbindung, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist Verbindung G in Hinblick auf Ihre überlegene Potenz und Selektivität für Transrepression und Transaktivierung.
Die Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können eine Anzahl von unterschiedlichen Formen annehmen, insbesondere abhängig von der Weise, in der die Zusammensetzungen zu verwenden sind. So kann die Zusammensetzung z. B. in der Form eines Pulvers, einer Tablette, einer Kapsel, einer Flüssigkeit, einer Salbe, einer Creme, eines Gels, eines Hydrogels, eines Aerosols, eines Sprays. einer Mizelle, eines Liposoms oder in irgendeiner anderen geeigneten Form vorliegen, die an eine Person oder ein Tier verabreicht werden kann. Es wird vorausgesetzt werden, dass das Vehikel der Zusammensetzung der Erfindung ein solches sein sollte, das von dem Subjekt, an das es verabreicht wird, gut toleriert wird, und das die Austragung der Verbindung an das Zielgewebe ermöglicht. Die gemäß dieser Erfindung verwendeten Verbindungen können über jegliche Route verabreicht werden, einschließlich aber nicht beschränkt auf orale Inhalation, lokales Instillieren in die Nase oder das Auge, lokale Injektion in Gelenke oder Muskel, oral in Form von Kapseln, Tabletten, Flüssigkeiten oder Suspensionen, durch Injektion in eine Vene, einen Muskel oder unter die Haut und oberflächlich auf die Haut. Das Vehikel wird üblicherweise 0,1 bis 99,9%, vorzugsweise 90% bis 99,9% bezogen auf das Gewicht der Zusammensetzung ausmachen und kann in der Abwesenheit anderer Adjuvanzien den Rest der Zusammensetzung ausbilden.
Die folgenden Formulierungen werden nur als Beispiel angegeben. Ein Fachmann wird in der Lage sein, jegliche Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung zu formulieren, da sie Formulierungseigenschaften mit Steroiden teilen, die in allgemeiner Verwendung stehen. A. Verbindung G 500 Mikrogramm Tabletten

* Das Wasser wird während des Trocknungsprozesses verdunstet und erscheint ein nicht in der fertigen Form.

* Das Wasser wird während des Trocknungsprozesses verdunstet und erscheint nicht in der fertigen Form.

* Natriumhydroxyd wird verwendet, um den pH-Wert auf 7,5 bis 8,5 einzustellen.

Damit die vorliegende Erfindung einfacher verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele gegeben, aber nur zum Zwecke der Illustrierung der Erfindung.
Die hier beschriebene Arbeit, die zu dieser Erfindung führte, erwuchs aus unseren Studien des GR ⁸. Die Resultate dieser Arbeit werden in diese Beschreibung einbezogen.
Beispiel 1 – Ligandenbindungsdomain des humanen Glucocorticoidrezeptors
Wir verwendeten die Kristallstruktur des humanen Progesteronrezeptors (PR) als Matrize zum Modellieren des humanen Glucocorticoidrezeptors, weil die zwei Moleküle mehr als 50% Identität in der ligandenbindenden Region und eine starke Sequenzähnlichkeit aufweisen. Die bei dem Östrogenrezeptor (ER), dem PR und dem Retinsäurerezeptor (RAR) beobachteten 12 Helizes sind bei dem humanen GR sämtlich erhalten. Weiterhin teilt der humane GR die hochgradig konservierten Aminosäuren, die die Kernrezeptorsignatur ausmachen ⁴¹. Wie bei dem PR bilden die Helizes 2 und 3 eine durchgängige Helix, wie es auch bei den Helizes 10 und 11 der Fall ist.
Die tertiäre Struktur der Liganden-bindenden Domaiin (LBD) des GR, die 251 Aminosäuren (Q527-K777) enthält, wurde unter Verwendung von SWISS-MODEL vorhergesagt. Das Resultat umfasste strukturelle Ausrichtung gegenüber Matrizen und 3D-Koordinaten. Es verwendete das 1,8 Å PR LBD-Dimer (1A28) als Matrize, und die Identität zwischen diesen beiden LBD ist größer als 50%.
Auswertung der 3D-Struktur
Die qualitative Verifizirung dieser Struktur wurde unter Verwendung des PROCHECK-Programms durchgeführt, das eine Ramachandran-Auftragung erzeugt. Ungefähr 99% der ϕ-φ-Winkel bei diesem Modell lagen innerhalb der am meisten bevorzugten und auch innerhalb der erlaubten Bereiche des Konformationsraums. Die energetische Analyse dieses Modells wurde durch das Proteine Structure Analysis (Prosa) Programm durchgeführt ⁴². Dieses sagt voraus, dass jede Restwechselwirkungsenergie bei der Struktur negativ war. Die 3D-Struktur, die für die LBD des humanen GR vorhergesagt wurde, konnte bei einer Standardabweichung (SD) von 0,38 Å für 250 Cα-Atome mit derjenigen für den PR überlagert werden.
Die Liganden-bindende Domain des humanen GR (hGR) wird durch die Helizes 5, 7, 11 und 12, die β-Kurve und die Schleifen L6-7 und L11-12 beschrieben. Von der Liganden-bindenden Tasche wird vorhergesagt, dass sie durch 18 Aminosäuren ausgekleidet ist. Von diesen wird für 15 vorausgesagt, dass sie zu der hydrophoben Umgebung der Tasche beitragen: Met560, Leu563, Leu566, Gly567, Trp600, Met601, Met604, Ala605, Leu608, Phe623, Met646, Leu732, Tyr735, Thr739, Phe749. Es gibt drei polare Reste, zwei an einem Ende der Tasche, Gln570 und Arg611, und das andere an dem gegenüberliegenden Ende, Cys736.
Beispiel 2 – Passung von Liganden innerhalb der vorhergesagten Struktur
Die Struktur von Dexamethason wurde von der Cambridge Structural Database (SCD) erhalten. Wir sagen voraus, dass die Liganden-bindende Tasche ein länglicher Spalt mit zwei polaren Resten an einem Ende und einem einzigen polaren Rest an dem gegenüberliegenden Ende ist. Wir können nicht mit absoluter Sicherheit die Orientierung des Liganden innerhalb der Tasche bestimmen, aber einige Indizienketten stützen die Ausrichtung des Steroid A-Rings an dem Arg611-Ende der Tasche. Die Liganden sowohl für den ER und den PR sind in dieser Weise ausgerichtet, und sowohl für Cortisol als auch Aldosteron innerhalb des Mineralcorticoidrezeptors wird basierend auf Modellierung und Mutationserzuegungsstudien vorhergesagt, dass sie in dieser Ausrichtung vorliegen. Die Ligandenwechselwirkung mit dem Rezeptor wurde unter Verwendung des Ligplot-Programms detektiert, das auch verwendet wurde, um die Wechselwirkung aufzutragen. Basierend auf dieser Analyse sagen wir voraus, dass die Liganden-bindende Domain des hGR eine dreilagige antiparallele 12 ∀-helikale Struktur aufweist, die homolog mit derjenigen des PR ist. Der Ligand wird durch drei Wasserstoffbindungen gebunden; Arg611 und Gln570 wechselwirken mit der Ketongruppe bei C3 des SteroidA-Rings und Cys736 mit der Ketongruppe bei C20 des D-Rings. Von weiteren 15 Aminosäuren wird gefunden, dass sie zu den hydrophoben Wechselwirkungen mit dem Liganden beitragen. Arg611, Gln570 und Cys736 sind konservierte Reste, deren Wichtigkeit für die Ligandenbindung durch Untersuchen Ihrer natürlichen und künstlichen Mutanten verifiziert worden ist. Der aromatische Ring von Tyr735 schien eine hydrophobe Wechselwirkung mit dem Liganden einzugehen. Der Abstand von dem aromatischen Ring zu dem C22-Substituenden des Steroid D-Rings wurde zu 2,98 Å und zu dem D-Ring zu 3,98 Å berechnet. Die Hydroxylgruppe des Tyrosins 735 war jedoch von der Liganden-bindenden Tasche weg gerichtet.
Beispiel 3 – Affinität von mutiertem humanem GR für Dexamethason
Da von Tyr735 vorhergesagt wurde, dass es eine hydrophobe Wechselwirkung mit dem D-Ring von Dexamethason eingeht, war es wichtig, Änderungen bei der Liganden-bindenden Affinität vorherzusagen, die durch die Mutationen an der Position 735 verursacht werden.
Platzgerichtete Erzeugung vob Mutationen zu Phenylalanin (Tyr735Phe) resultierte in keine Änderung bei der Liganden-bindenden Affinität (4,3 nM verglichen mit 4,6 mM für den Wildtyp) was im Einklang mit der Hypothese war, dass der Benzenring ausreichend ist, um eine hydrophobe Oberfläche für die Ligandenwechselwirkung zu erzeugen. Eine Änderung zu Valin (Tyr735Val) resultierte in eine Bindung mit niedrigerer Affinität verglichen mit dem Wildtyp, aber nur zu einem geringen Anteil (6 nM). Die Änderung zu Serin (Tyr735Ser) resultierte jedoch in eine zweifache Reduktion bei der Liganden-bildenden Affinität (10,4 nM).
Alle mutierten Rezeptoren wurden in COS 7-Zellen expressiviert, und die Mutationen änderten die Rezeptorzahlen pro Zelle nicht.
Beispiel 4 – Transaktivierung durch mutierten GR
Alle drei mutierten GR-Moleküle waren in der Lage, den MMTV-Promotor zu transaktivieren. Als Antwort auf Dexamethason wies Tyr735Phe einen ähnlichen EC50-Wert wie der Wildtyp auf (8,6 mM verglichen mit 6 mM), und Tyr735Val wies einen niedrigeren EC50-Wert von 14.8 mM auf. Das maximale Transaktiviertungspotential dieser beiden mutierten GR-Molekülen war jedoch geringer als dasjenige des Wildtyps.
Der EC50-Wert von Tyr735Ser für die Transaktivierung war auf 118 mM erhöht, und eine genaue Abschätzung des maximalen Effekts war nicht möglich. Es ist klar, dass dieser Effekt disproportional zu der Verdopplung von Kd ist, was darauf hinweist, dass eine Unterbrechung der Ligandenbindung allein nicht ausreichend ist, um die beobachtete Endung bei der Rezeptortransaktivierung zu erklären.
Weiterhin induzierte physiologisches Ligandenhydrocortison (100 nM) eine 18-fache Induktion von MMTV über den Wildtyp-GR, eine 11-fache bei dem Tyr735pHe, eine 10,6-fache bei dem Tyr735Val und scheiterte daran, den Reporter über den Tyr735Ser zu indizieren. So weisen die mutierten Rezeptoren dieselbe Rangordnung an Aktivität bezüglich beider Agonistenliganden auf.
Beispiel 5 – Transrepression durch mutierten GR
Transrepression durch aktivierten GR weist üblicherweise einen niedrigeren EC50-Wert als Transaktivierung auf und auferlegt dem Rezeptor weniger stringente Anforderungen. So sind Liganden identifiziert worden, die die Transrepression in der Abwesenheit von Transaktivierung fördern, aber nicht umgekehrt. Wir haben die Fähigkeit von mutierten GR-Molekülen untersucht, NFkB P65-vermittelte Transaktivierung durch ein NFkB-Antwortelement verknüpft mit Luziferase zu inhibieren. Das Ergebnis wurde durch Cotransfektion eines p65-Expressionsvektors bestimmt. Der Wildtyprezeptor erreichte eine signifikante Unterdrückung von 0,1 mM Dexamethason und maximale Unterdrückung bei 1 nM, wie es auch bei Tyr735Phe und Tyr735Val der Fall war. Tyr735Ser wiesen einen kleinen aber konsistenten Anstieg bei dem IC50-Wert für diesen Effekt auf, bei keiner Unterdrückung bei 0,1 nM Dexamethason. Diese Daten sind kompatibel mit dem beobachteten Kd-Wert für die Bindung an Dexamthason und zeigen, dass die Dosis-Antwort-Kurve im Vergleich mit der Transaktivierung nach links verschoben ist. Im Gegensatz zu den Transaktivierungsdaten wirkten Cyr735Pae und Tyr735Val ähnlich zu den Wildtyp-GR, was anzeigt, dass die Substitution von Tyr735 bei Abwesenheit von signifikanten Änderungen bei der Liganden-bindenden Affinität und Transrepression in eine selektive Verschlechterung resultiert. Tyr735Ser weist einen etwas höheren IC50-Wert für die Transrepression verglichen mit den anderen drei untersuchten GR-Molekülen auf, was kompatibel mit der Beobachtung ist, dass seine Affinität zu Dex reduziert ist. Bei 100 nM Dex hat Tyr735Ser jedoch eine maximale Unterdrückung erreicht, die nahe dem ist, was bei dem Wildtyp-GR beobachtet wird, was in überraschendem Kontrast zu den Resultaten steht, die bei der Transaktivierung gesehen wurden.
Wir haben uns deshalb für die Synthese einer Reihe von Verbindungen mit einem Bereich von Substituenten an dem D-Ring entschieden, da unsere vorangegangene Arbeit indizierte, dass die Wechselwirkung zwischen dem D-Ring des Steroids und dem Tyrosin 735 wesentlich für die Transaktivierung war. Wir haben auch eine Anzahl von Verbindungen mit Modifikationen an der oder im Umfeld der C17-Position synthetisiert. Die Verbindungen sind in 2 gezeigt. Diese Verbindungen und das nichtselektive aktive Glucocorticoidagonistensteuermolekül Dexamethason, wie es in 1 gezeigt ist, wurden wie folgt auf Transrepressions-, Transaktivierungs und Apoptoseaktivität getestet:
Beispiel 6 – In vitro-Tests
METHODEN
Zelllinien
Die COS 7-Zellinie (ECACC:87021302) wird von transformierten Nierenzellen des afrikanischen grünen Affen (Cercopithecus aethiops) erhalten. Dieser Zellinie fehlt es an GR, und sie wird deshalb umfangreich als Werkzeug verwendet, um GR-Funktionen durch gesteuerte künstliche Expression mittels Transfektion zu studieren.
Die A549-Zellinie (ECACC:86012804) wird von humanen Lungenepithelialzellen aus einem Karzinom erhalten. Die Zelllinie enthält funktionalen endogenen GR und wird durch Tumornekrosefaktor (TNF) stimuliert, um IL-8 zu produzieren.
Die HPEP G2-Zelllinie (ECACC:85011430) wird von humanen Leberepithelialzellen aus einem gut differenzierten Leberzellenkarzinom gehalten. Diese Zelllinie weist funktionalen endogenen GR auf und wird durch GR-Aktivierung stimuliert, um Thyrosinaminotransferase zu produzieren.
Die CEM-C7A-Zelllinie ist ein steroidempfindlicher Klon der CCRF-CEM-Zelllinie (ECACC 85112105). Dies ist eine T-Lymphoblastomzelllinie mit funktionalem endogenen GR.
COS 7-Zellen und A549-Zellen wurden in DMEM mit Glutamax (Gibco BRL, Paisley, UK) und 10 fötales Kalbsserum (FCS) kultiviert. HEP G2-Zellen wurden in DMEM mit Glutamax (Gibco BRL), 1% nicht essentiellen Aminosäuren (Gibco BRL) und 10% FCS kultiviert. CEM-C7A-Zellen wurden in Optimem (Gibco BRL) mit 5% FCS kultiviert.
Plasmide

pcDNA3-GR
AH3-Luc
NRE-Luc
P65

Lipofektamintransfektion
Alle Transfektionen wurden unter Verwendung von Lipofektamin-plus (Gibco BRL) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, wie zuvor beschrieben wurde ¹. Kurz gesagt werden alle Zellen mit 5 × 10⁵ pro 10 cm Gewebekulturplatte 18 h vor der Transfektion beimpft, am nächsten Tag wurden die relevanten Plasmide mit serumfreiem Medium und "Plus"-Reagenz (Gibco BRL) gemischt und für 15 min. inkubiert, Lipofektaminreagenz wurde zugegeben, und die Mischung wurde für weitere 15 min. inkubiert. Diese Mischung wurde zu den Zellen auf dem serumfreien Medium in den 10 cm Gewebekulturplatten zugegeben und für drei Stunden stehengelassen, die Zellen wurden dann trypsiniert und in 24 Loch-Platten verteilt, die Zellen wurden zur Erholung über Nacht stehengelassen, und sie wurden für 16 h mit Steroid behandelt, bevor sie geerntet wurden. Alle Experimente wurden aus einer Transfektion dreifach und bei getrennten Gelegenheiten mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt.
Luziferasetest
Das Glühwürmchenluziferasegen katalysiert die Erzeugung von Licht aus dem Substrat Luziferin. Wenn Plasmidkonstrukte, die dieses Gen enthalten, in Zelllinien transfiziert werden, kann die Aktivität des Gens durch die Intensität der Lumineszenz getestet werden. Der Luziferasetest ergibt Lumineszenz durch eine ATP-abhängige Oxidation von Luziferin, wobei die Menge an produziertem Licht durch ein Luminometer gemessen werden kann und ein Maß der Genaktivität ist (Davis, 1996). Die Lichtintensität wurde in einem Lunimometer gemessen (LB 9501, Berthold). Die Lichtintensität sollte in dem Bereich von 10^–6 M (10 pg/l) bis 10^–8 M (1 mg/l) proportional zu der Luziferasekonzentration sein. Um die Luminzeszenz behandelter Zellen zu messen, wurden 150 μl 1X-Reporterlysepuffer (RLB: 25 mM Tris-Phosphat pH 7,8, 10 mM MgCL₂, 15% Glycerol, 1% Triton, 1 mM EDTA, in die 24 Loch-Platten zugegeben, um die Zellen aufzulösen, und bei Raumtemperatur für 30 min. inkubiert, während geschüttelt wurde. Dann wurden 100 μl des Raumtemperaturzellextrakts mit 100 μl Raumtemperaturluziferasetestreagenz (LAR: 1 mM ATP, 0,3 mM D-Luziferin, 66% RLB) gemischt. Diese Reaktion wurde in einem Luminometer gemischt (LB 9501, Berthold), und das erzeugte Licht wurde über einen Zeitraum von 5 s gemessen.
(a) Transaktivierungstest unter Verwendung von künstlich expressiviertem Glucocorticoidrezeptor bei der COS 7-Affennierenzellinie
In diesem Test wurde der GR künstlich in einer Zelllinie expressiviert, der es an GR fehlt, und ein Glucocorticoidantwortelement (GRE), das ein Luziferasereportergen "treibt" wurde verwendet, um die Liganden-abhängige Aktivierung zu messen.
COS 7-Zellen wurden mit 1 μg pcDNA3-GR und 3 μg AH3-Luc pro 10 cm Gewebekulturschale transfiziert. Die Zellen wurden nach der Transfektion in 24 Loch-Platten plattierte, und die Steroide wurden sofort hinzu gegeben. Nach 18 h Inkubation wurden die Zellen aufgelöst, und ein Luziferasetest wurde durchgeführt.
(b) SRC-1 Assoziationstest durch Säugetierzweihybridanalyse
SRC-1 ist ein wichtiger Coaktivator von GR-Aktion, der sich mit dem GR in einer Liganden-abhängigen Weise assoziiert. Die Fähigkeit von SRC-1, sich mit dem GR in dieser Weise zu assoziieren, kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der Liganden-vermittelten Transaktivierung zu messen. Um diesen Test durchzuführen, wurden Plasmide, die eine VP16-GR-Liganden-bindende Domäne (LBD) und GAL4-SRC-1-Fusionsproteine erzeugten und ein GAL4-bindendes Luziferasereportergenkonstrukt in eine Zelllinie transfiziert, der es an GR fehlt und an endogenem SRC-1 mangelt. Das GAL4-SRC-1-Fusionsprotein konnte an bestimmte Plätze stromauf des Luziferasereportergenkonstrukts anbinden. Wenn das SRC-1-Fusionsprotein mit dem Liganden-gebundenen VP16-GRLBD-Fusionsprotein assoziiert war, dann unterstützte die VP-16-Aktivierungsdomäne die Luziferasegenexpression. Die Ligandendosisantworten wurden bezüglich der SRC-1-Bindung für die Verbindungen analysiert, die in den 1 und 2A gezeigt sind.
(c) Quantifizierung von endogenem Tyrosinaminotransferase-(TAT)-Protein bei der HEPG-2-Leberzelllinie
Bei diesem Verfahren wird ein kolorimetrischer Ansatz verwendet, um TAT-Aktivität zu quantifizieren. Das TAT-Enzym katalysiert die folgenden Reaktionen: L-Tyrosin + 2-Oxoglutarat ⇄ 4-Hydroxyphenylpyruvat (pHPP) + L-Glutamat
Die Reaktion erfordert auch Pyridoxalphosphat (PLP) als Cofaktor. Stark alkalische Bedingungen können dann angewendet werden, um pHPP in p-Hydroxybenzaldehyd (pHBA) und Oxalat umzuwandeln. Die Menge an pHBA kann dann durch Messen seiner Absorption bei 331 nm erfasst werden (Extinktionskoeffizient 19.900 M^–1 cm^–1). Wobei von dieser Zahl dann angenommen wird, dass sie direkt proportional zu der TAT-Aktivität ist. HEP G2-Zellen wurden kultiviert, bis sie auf einer 10 cm Platte zusammenflossen (~10⁷ Zellen). Diese Zellen wurden dann abgeschabt und in 500 μl eiskaltem 0,14 M KCl. suspendiert. Die Zellen wurden durch drei Zyklen von 10 sek. Stoßbeschallung bei voller Leistung (50 W, 20 kHz Sonicator; Jencons, Leighton Buzzard; Vereinigtes Königreich) aufgelöst. Die Zellen wurden zwischen den jeweiligen Stößen auf Eis gehalten. Die Zelltrümmer in den aufgelösten Zellsuspensionen wurde dann abgeschleudert (13.000 Umdrehungen/min./10 min; Mikrofuge), und die Proteinkonzentration des Überstands wurde unter Anwendung der Bradford-Methode getestet. 100 μg Protein wurden dann verwendet, um die TAT-Aktivität zu testen.
Um den TAT-Test durchzuführen, wurde die folgende Reaktionsmischung in einer 1,5 ml Eppendorfpipette zubereitet:

900 μl 7 mM L-Tyrosin in 0,2 M KPO₄

30 μl 0,3 Ketoglutarat

30 μl 1.2 mM PLP

? 100 μg von Zellprotein

? 0,2 M KPO₄

1000 μl
Für ihre Reaktion wurde eine Kontrollreaktion ohne das Ketoglutarat durchgeführt. Die Proben wurden bei 37°C für 20 min. inkubiert, und dann wurden 60 μl 10 M NaOH zugegeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für weitere 30 min. inkubiert, und dann wurde auf einem Spektrophotometer (Ultrospec III, Pharmacia) die Absorption jeder Probe bei 331 nm bestimmt.
(d) Transrepressionstest unter Verwendung von künstlich expressiviertem Glucocorticoidrezeptor und P65 bei der COS 7-Affennierenzelllinie
Um diesen Test durchzuführen, wurden der GR und p65 künstlich in einer Zelllinie expressiviert, der es an GR fehlte und an endogenem P65 mangelte. Die Fähigkeit von P65 ein NFkB-Antwortelement (NRE) zu aktivieren, das ein Luziferasereportergen "treibt", konnte dann durch GR in einer Liganden-abhängigen Weise unterdrückt und deshalb verwendet werden, um die Transrepression zu messen.
COS 7-Zellen wurden mit 1 μg pcDNA3-GR und 3 μg NRE-Luc und 200 ng p65 pro 10 cm Gewebekulturschale transfiziert. Die Zellen wurden nach der Transfektion in 24 Loch-Platten plattiert und für 18 h stehen gelassen, um sich zu erholen, bevor die Steroide gemäß den 1 und 2A hinzu gegeben wurden. Nach einer weiteren Inkubation für 18 h wurden die Zellen aufgelöst, und ein Luziferasetest wurde durchgeführt.
(e) Transrepressionstests unter Verwendung von endogenem GR bei der A549-Lungenepithelialzelllinie
In diesem Test wurde TNF verwendet, um NFkB-Aktivität bei einer Zelllinie zu stimulieren, die endogenen GR expressivierte. Die Fähigkeit von NFkB, ein NRE zu aktivieren, das ein Luziferasereportergen "treibt", konnte dann durch GR in einer Liganden-abhängigen Weise unterdrückt und deshalb verwendet werden, um die Transrepression zu messen.
COS 7-Zellen wurden mit 3 μg NRE-Luc pro 10 cm Gewebekulturschale transfiziert. Die Zellen wurden in 24 Loch-Platten nach der Transfektion plattiert und für 18 h stehengelassen um sich zu erholen, bevor die Steroide der 1 und 2 zugegeben wurden. Als nächstes wurde nach 3 h Inkubation mit den Steroiden TNF zu den Proben zugegeben, und nach weiteren 15 h wurden die Zellen aufgelöst und ein Luziferasetest wurde durchgeführt.
(f) Repression von endogenem IL-8 in A549
Bei diesem Test wurde TNF verwendet, um NFkB-Aktivität bei einer Zelllinie zu stimulieren, die endogenen GR expressivierte. Die Fähigkeit von NFkB, IL-8-Gentranskription zu induzieren, konnte dann durch GR in einer Liganden-abhängigen Weise unterdrückt und deshalb zum Messen der Transrepression verwendet werden.
COS 7-Zellen wurden mit 3 μg NRE-Luc pro 10 cm Gewebekulturschale transfiziert. Die Zellen wurden nach der Transfektion in 24 Loch-Platten plattiert und für 18 h stehengelassen, um sich zu erholen, bevor die Steroide der 1 und 2A zugegeben wurden. Nach Inkubation für 3 h mit den Steroiden wurde TNF zu den Proben zugegeben, und nach weiteren 15 h wurde ein IL-8-Test (R & D Systems) an den Zellüberständen gemäß den Herstelleranweisungen durchgeführt. Kurz gesagt wurden drei Sätze von 100 μl einer 1:2-Verdünnung von Zellüberstand und 100 μl einer bekannten Verdünnungsserie von IL-8 in die Löcher einer Mikrotiterplatte gegeben, die mit einem monoklonalem IL-8-Antikörper beschichtet waren, die Proben wurden mit einem polyklonalen biotinylierten IL-8-Antikörper für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert und gewaschen. Streptaridinmeerrettichperoxidaselösung wurde dann in alle Löcher gegeben und vor dem Waschen für 30 min. inkubiert. Tetramethylbenzidin (TMB, ein Chromagen) wurde in die Löcher zugegeben und im Dunklen für 10 min. inkubiert, die Reaktion wurde durch die Zugabe von H₂SO₄ gestoppt, und die Absorption jedes Lochs wurde auf einem Spektrophotometer abgelesen, das 450 nm als primäre Wellenlänge verwendete. Regressionsanalyse wurde an den Standarddaten durchgeführt, und die Unbekannten wurden als pg/ml IL-8 aus dem Vergleich mit den Standards ausgedrückt.
(g) Bestimmung der Kerntranslokation unter Verwendung von GFP-markiertem GR und Fluoreszenzmikroskopie
Der GR ohne Liganden liegt in dem Zytoplasma von Zellen assoziiert mit Hitzeschockproteinen (HSP) vor. Die Bindung eines Agonistenliganden an den GR verursacht Dissoziation von den HSP und Translokation zu dem Kern. Ein Typ I-Antagonistenligant kann an den GR binden, kann aber keine Translokation zu dem Kern ausführen und kann an DNS binden, kann aber keine Gentranskription aktivieren. Deshalb hilft die Fähigkeit eines putativen Liganden, eine Translokation des GR herbeizuführen, seinen Status als Agonist oder Antagonist zu bestimmen.
COS 7-Zellen wurden mit 5 μg eines mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) markierten GR-Expressionsvektor transfiziert. Nach der Transfektion wurden diese Zellen in 6 Loch-Platten aufgeteilt, wobei sterile Mikroskopabdeckplättchen an dem Grund jedes Lochs angeordnet waren. Den Zellen wurde es erlaubt, sich für 18 h zu erholen, und dann wurde das Medium entfernt, die Zellen wurden dreimal mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, und neues Medium wurde zugegeben, das mit Holzkohle gestripptes FCS anstelle von normalem FCS enthielt. Die Zellen wurden für 18 h inkubiert, und dann wurden die Steroide gemäß 1 und 2A zugegeben, um eine Endkonzentration von 10 nM zu ergeben. Die Zellen wurden für weitere 3 h inkubiert, und dann wurde das Medium veratmet, und die Zellen wurden auf den gläsernen Abdeckplättchen durch Zugabe von eiskaltem Methanol und Inkubieren bei 20°C für 30 min. fixiert. Die Abdeckplättchen mit den transfizierten Zellen, die an ihnen befestigt waren, wurden dann auf Probenträger montiert, und die zelluläre Lokalisierung des GFP-markierten GR wurde durch Fluoreszenzmikroskopie unter Verwendung eines Axioplan 2-Mikroskops (Zeiss, Oberkochen, Deutschland) und der KS300 Version 3.0-Analysesoftware (Zeiss) analysiert.
(h) Typ II-Antagonistenaktivitätstests: Wettbewerb zur Dexamethasontransaktivierung
Ein Typ II-Antagonist sollte in der Lage sein, mit Agonistenaktivität in Wettbewerb zu treten. Da ein Antagonist keine Fähigkeit zur Transaktivierung besitzt, kann der Wettbewerb durch Inhibierung eines Agonisten in einem Transaktivierungstest gemessen werden. RU486 ist ein Typ II-Antagonist zu GR-Funktion und kann mit dem Agonisten Dexamethose in Bezug auf Ligandenbindung in Wettbewerb treten. Diese Interaktion kann als positive Kontrolle für diese Analyse verwendet werden.
Wie bei dem Standardtransaktivierungstest, der zuvor beschrieben wurde, wurde der GR künstlich in einer Zelllinie expressiviert, der es an endogenem GR fehlt, und ein GRE, das ein Luziferasereportergen "treibt", wurde verwendet, um die Liganden-abhängige Aktivierung zu messen. COS 7-Zellen wurden mit 1 μg pcDNA3-GR und 3 μg AH3-Luc pro 10 cm Gewebekulturschale transfiziert. Die Zellen wurden nach der Transfektion in 24 Loch-Platten plattiert, und die Steroide wurden sofort hinzu gegeben. Alle Löcher außer denjenigen der negativen Kontrolle wurden mit 5 μM Dexamethason behandelt, um eine Endkonzentration von 100 nM zu erzeugen. Bestimmte Steroide aus 2A wurden in derselben Konzentration in alle Löcher gegeben. Nach 18 h Inkubation wurden die Zellen aufgelöst, und ein Luziferasetest wurde durchgeführt.
(i) Progestogenaktivitätstest unter Verwendung von Progesteronrezeptortransaktivierung
Da die GR-LBD eine starke Homologie mit der PR-LBD aufweist, gibt es eine Chance, dass jedes der getesteten Steroide gemäß 1 und 2A, das einen dieser Rezeptoren aktiviert, auch den anderen aktiviert. Die Präsenz von illegitimer Progestogen-Aktivität, die mit den Steroiden der 1 und 2A verbunden ist, wurde unter Verwendung eines Transaktivierungstests mit dem PR anstelle des GR untersucht.
Der PR wurde künstlich in einer Zelllinie expressiviert, der endogener PR fehlt, und ein GRE, das ein Luziferasereportergen "treibt", wurde verwendet, um Liganden-abhängige Aktivierung zu messen.
COS 7-Zellen wurden mit 1 μg pSO-PRB und 3 μg AH3-Luc pro 10 cm Gewebekulturschale transfiziert. Die Zellen wurden nach der Transfektion in 24 Loch-Platten plattiert, und die Steroide gemäß 1 und 2A wurden sofort hinzu gegeben, um eine Endkonzentration von 10 nM zu erzeugen. Nach 18 h Inkubation wurden die Zellen aufgelöst, und ein Luziferasetest wurde durchgeführt.
(j) Apoptosetest
Apoptose (programmierter Zelltod) wird durch ein Protein vermittelt, das Bax genannt wird, und dessen Transkription vorwiegend durch den GR in einer Liganden-abhängigen Weise gesteuert wird. Um die Fähgikeit eines GR-Liganden, die Apoptose zu beeinflussen, zu messen, wurde eine geeignete Zellinie mit Lignaden inkubiert, und eine Zählung der lebensfähigen Zellen wurde nach drei Tagen durchgeführt.
CEM-C7A-Zellen wurden mit 5 × 10⁵/Loch in eine 96 Loch-Platte plattiert. Die Steroide der 1 und 2A wurden sofort hinzu gegeben, um eine Endkonzentration von etwa 100 nM zu ergeben. Nach einer Inkubation von 3 Tagen wurde die Zahl der lebenden Zellen in jedem Loch unter Verwendung des Celltiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) bestimmt. Dieser Test ist eine kolorimetrische Methode zum Bestimmten der Anzahl von lebensfähigen Zellen in Proliferations- oder Chemoempfindlichkeitstests.
Kurz gesagt besteht der Test aus Lösungen einer neuen Tetrazoliumverbindung (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, MTS) und eines elektronischen Kopplungsreagenz (Phenazinmethosulfat; PMS). MTS wird durch Zellen biologisch zu einem Formazanprodukt abgebaut, das in Gewebekulturmedium löslich ist. Die Absorption des Formazans bei 490 nM kann an den 96 Loch-Testplatten ohne zusätzliche Verarbeitung direkt gemessen werden. Die Umwandlung von MTS in wässriges, lösliches Formazan wird durch Dehydrogenaseenzyme bewirkt, die in stoffwechselaktiven Zellen gefunden werden. Die Menge an Formazanprodukt, wie sie durch das Maß an 490 nm-Absorption gemessen wird, ist der Anzahl von lebenden Zellen in der Kultur direkt proportional.
Resultate
Die Verbindungen wurden in zwei Durchgängen wie folgt getestet:
Durchgang 1: Verbindungen A, H und D. Die Verbindungen C und E erwiesen sich als zu unlöslich, um reproduzierbare Ergebnisse zu ergeben, und für diese Verbindung werden keine Daten präsentiert.
Durchgang 2: Verbindungen G bis T (einschließlich).
In allen Fällen wurde Dexamethason, dessen Struktur in 1 gezeigt ist, als aktive Kontrolle eingeschlossen.
Ligandeninduzierte Transaktivierung durch den Glucocorticoidrezeptor
(a) Transaktivierungstest unter Verwendung von künstlich expressiviertem Glucocorticoidrezeptor bei der COS 7-Affennierenzelllinie
Die Fähigkeit aller Verbindungen, die in 2A dargestellt sind, zu transaktivieren, wurde zuerst bei 1, 10 und 100 nM untersucht (3 und 4). Verbindung D schien beim Verursachen von Transaktivierung aktiver als Dexamethason zu sein (3). Es wurde herausgefunden, dass die Verbindungen L, O, Q und R bei jeder Konzentration daran scheiterten, eine Antwort hervorzurufen. Verbindung G war viel weniger potent und hatte einen niedrigeren maximalen Effekt, wenn sie mit Dexamethason verglichen wurde. Alle anderen Verbindungen zeigten eine gewisse Fähigkeit zu transaktivieren mit unterschiedlicher maximaler Induktion, obwohl diese Antwort verglichen mit Dexamethason "nach rechts verschoben" war (3 und 4).
Um das Transaktivierungspotential der getesteten Verbindungen weiter zu untersuchen, wurde dieses Experiment mit den Verbindungen, die eine gewisse Antwort in dem ersten Experiment hervorgerufen hatten (d. h. alle außer L, O, Q und R) bei 1, 10, 100 und 500 nM wiederholt. Dieses Experiment bestätigte, dass die Verbindungen H, I, J, K, M, N und S eine ähnliche maximale Antwort verglichen mit Dexamethason aufwiesen, obwohl sie alle mit einer "Verschiebung nach rechts" ansprachen (5). Die Verbindungen E, P und T wiesen verglichen mit Dexamethason eine "nach rechts verschobene Antwort" und ein reduziertes Maximum auf, obwohl der Unterschied im Fall von T (5) nur gering war. Die Verbindung G wies die insgesamt niedrigste Maximalantwort auf und verglichen mit den anderen Verbindungen auch die niedrigste Antwort bei jeglicher Dosis (5).
(b) SRC-1 Assoziierungstest durch Säugetierzweihybridanalyse
Die Fähigkeit aller Verbindungen, die in 2A gezeigt sind, SRC-1 zu rekrutieren, wurde gegen Dexamethason getestet. Sie wurden bei 1, 10 und 100 nM Konzentration getestet (6 und 7). Es wurde herausgefunden, dass nur Verbindung D SRC-1 in demselben Maße rekrutierte wie Dexamethason. Die Verbindung A produzierte eine submaximale Antwort (~50%). Bei den klinisch relevanten Konzentrationen von 1 und 10 nmolar verursachte die Verbindung G keine Transaktivierung, wie sie durch SRC-1-Rekrutierung gemessen wird. Selbst bei der höchsten getesteten Konzentration verursacht die Verbindung G keine SRC-1-Rekrutiertung. Keine der restlichen Verbindungen rekrutierte SRC-1 so wie Dexamethason, und nur die Verbindungen J, K, R, S und T erzeugten bei 100 nM eine signifikante Antwort.
(c) Quantifizierung von endogenem Tyrosinamionotransferase-(TAT)-Protein bei der HEP G2-Leberzelllinie
Die Fähigkeit der Verbindung G, das endogene Tyrosinaminotransferase-(TAT)-Gen zu aktivieren, wurde mit Dexamethason bei einer Konzentration von 1 μM verglichen. Es wurde herausgefunden, dass es beim Verwenden der Verbindung G als GR-Ligand verglichen mit Dexamethason eine signifikante Reduktion bei der TAT-Aktivität gab (p = 0,014, zweiseitiger t-Test) (8).
Ligandeninduzierte Transrepression durch den Glucocorticoidrezeptor
(d) Transrepressionstest unter Verwendung von künstlich expressiviertem Glucocorticoidrezeptor und P65 bei der COS 7-Affennierenzelllinie
Die Fähigkeit der Verbindungen gemäß 2A, die P65-Stimulation eines NFkB-Antwortelements zu unterdrücken, wurde bei 1, 10 und 100 nM (9 und 10) untersucht. Die Verbindungen A und H waren weniger potent als Dexamethason, produzierten aber dieselbe maximale Antwort bei 100 nM. Die Verbindung D war genauso potent wie Dexamethason (9). Bei der zweiten Serie von Verbindungen wurde herausgefunden, dass nur drei der Verbindungen (L, O und R) vollständig daran scheiterten P65-Funktion zu unterdrücken, dass aber einige Verbindungen bei einer nur vernachlässigbaren Unterdrückung bei 100 nM keinen Effekt bei 1 und 10 nM zeigten (J, P und Q). Die verbleibenden Verbindungen unterdrückten alle P65 mindestens genauso gut wie Dexamethason mit einer "nach links verschobenen" Antwort und größerer maximaler Respression in dem Fall der Verbindungen G und T.
(e) Transrepressionstest unter Verwendung von endogenem GR bei der A549-Lungenepithelialzellllinie
Die Fähigkeit der Verbindungen gemäß 2A, TNF-Aktivierung bei A549-Zellen einer Transrepression zu unterwerfen, ist in den 11 und 12 gezeigt. Die Fähigkeit der Verbindung G, TNF-Aktivierung von A549-Zellen zu unterdrücken, wurde unter Verwendung eines NRE-Reportergens und 1, 10, 100 und 500 nM der Verbindung untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die Verbindung G mindestens genauso gut wie Dexamethason unterdrückte und zudem eine "nach links verschobene" Antwort mit größerer maximaler Repression aufwies. Die Verbindungen A, D und H wurden in diesem Test ebenfalls getestet. Alle Verbindungen entwickelten Transrepression.
(f) Unterdrückung von endogenem IL-8 bei A549
Die Fähigkeit der Verbindungen gemäß 2A, IL-8-Aktivierung in A549-Zellen einer Transrepression zu unterwerfen, ist in den 13 und 14 gezeigt. Die Fähigkeit von 100 nM Verbindung G, TLF- Aktivierung von A549-Zellen zu unterdrücken, wurde unter Verwendung von IL-8-Produktion als endogener Endpunkt ebenfalls untersucht. Es wurde herausgefunden, dass die Verbindung G die IL-8-Produktion besser unterdrückt als Dexamethason (p = 0,0076, zweiseitiger t-Test). Die Verbindungen A, D und H entwickelten Transrepression in diesem Test.
(g) Test von Kerntranslokation unter Verwendung von GFP-markiertem GR und Fluoreszenzmikroskopie
Die Verbindungen A, H und D verursachten nukleare Lokalisierung des mit GFP markierten Glucocorticoidrezeptors, deshalb sind sie alle zur GR-Bindung in der Lage (15). Die Fähigkeit von bestimmten Verbindungen aus dem zweiten Satz von Verbindungen, Translokation zu verursachen, ist in 16 gezeigt. Die Verbindung O scheiterte daran, Translokation zu verursachen, was konsistent mit der Inaktivität bei all den anderen Tests und der Schlussfolgerung ist, dass diese Verbindung nicht an dem Glucocorticoidrezeptor anbindet. Die anderen getesteten Verbindungen verursachten Translokation des Reporters zum Kern.
(h) Typ II-Antagonistenaktivitätstest: Wettbewerb zu Dexamethasontransaktivierung.
Vier putative Antagonisten wurden durch ihr Fehlen von Funktion in entweder dem Transaktivierungs- oder dem Transrepressionstest identifiziert (L, O, Q, R). Um die Typ II-Antagonistenfunktion zu überprüfen, wurde die Fähigkeit dieser Verbindungen, mit Dexamethason in Bezug auf GR-Bindung in Wettbewerb zu treten, unter Verwendung von RU486, einem gut definierten GR-Typ II-Antagonisten als positive Kontrolle getestet. COS 7-Zellen wurden mit einem transaktivierungsempfindlichen Reportergen transfiziert und wurden dann mit 1 nM Dexamethason stimuliert. RU486 (1, 10, 100 nM) trat mit einer maximalen Transaktivierungsunterdrückung von ~50% mit Dexamethasonfunktion in dosisabhängiger Weise in Wettbewerb. Die Verbindungen L, O, Q und R scheiterten daran, Dexamethasontransaktivierung zu unterdrücken, und deshalb daran, als in Wettbewerb tretende Antagonisten zu wirken (17).
(i) Progestogenaktivitätstest unter Verwendung von Progesteronrezeptortransaktivierung
Illegitime Progestogenaktivität, die von den in 18 gezeigten Verbindungen entwickelt wird, wurde durch einen Transaktivierungstest unter Verwendung des AH3-Luc-Reporters und eines PRB-Expressionsvektors untersucht. In diesem System verursacht 100 nM Progesteron eine starke Induktion des Reportergens, während 100 nM Dexamethason nur einen sehr kleinen Anstieg bei der Reportergenaktivierung gegenüber der negativen Kontrolle verursachten. Die Verbindungen G, H, I und P entwickeln verglichen mit derjenigen von Dexamethason eine ähnliche oder verringerte Reportergenaktivierung. Die Verbindungen J, K, L, M, N, O, Q, R, S und T entwickelten verglichen mit derjenigen von Dexamethason eine leicht erhöhte Reportergenaktivierung. Keine der Verbindungen zeigte die Potenz von Progesteron bei der PRB-Aktivierung; die stärkste, L, zeigte nur ~40% der Aktivierung, die von Progesteron erzeugt wird.
(j) Apoptosetest
CEM-C7A-Zellen sind eine humane Lymphoblastomzelllinie, die als Antwort auf Glykocorticoid eine Apoptose durchläuft. Der exakte Mechanismus ist unbestimmt, basiert aber wahrscheinlich auf der lymphozytolytische Wirkung von Glucocorticoid in vivo und mag Aspekte von Glucocorticoid-vermittelter entzündungshemmender Wirkung modellieren. In der ersten Serie von Verbindungen waren Dexamethason und Verbindung A die stärksten Induzierer von Apoptose. RU24858 verschlechterte die Proliferation, induzierte aber keine signifikante Apoptose (20). Wir haben umfangreiche frühere Daten unter Verwendung von RU 24858, und es scheitert konsistent daran, Apoptose zu induzieren. In der zweiten Serie von Verbindungen wurde Apoptose durch G bis K induziert, aber nicht durch die Verbindung Q. Diese letzte Verbindung hatte keine Aktivität bei irgendeinem der Tests und es wird angenommen, dass sie nicht anbindet. Die Tatsache, dass Apoptose durch die hochselektive Verbindung, Verbindung G, induziert wurde, der es wesentlich an Transaktivierungsaktivität fehlt, die aber hohe Transrepressionsaktivität aufweist, war ein unerwartetes Ergebnis und stand im Gegensatz zu der Aktivität von anderen selektiven Agonisten, wie beispielsweise RU24858.
Beispiel 7 – Ligandenbindungstests

Die Bindung von Verbindung G an den Glucocorticoidrezeptor wurde unter Verwendung eines Standardwettbewerbstests untersucht. Die Bedingungen waren wie folgt:

Quelle	Humane HeLa 53-Zellen
Ligand	6 nM ³H-Dexamethason
Vehikel	0,4% DMSO
Inkubationszeit/Temperatur	2 h bei 25°C
Inkubationspuffer	RPMI 1640, 10 nM Hepes, pH 7,2
Nicht-spezifischer Ligand	20 μM Dexamethason
Kd	5 nM
B_max	61000 R/Zelle
Spezifische Bindung	75%
Quantifizierungsmethode	radiologische Bindung
Signifikanzkriterien	> 50% der maximalen Stimulation oder Inhibierung.

IC₅₀-Werte wurden durch eine nicht-lineare Regression nach dem kleinsten quadratischen Fehler bestimmt. Die K_i-Werte wurden unter Verwendung der Gleichung von Cheng und Prusoff unter Verwendung des beobachteten IC₅₀-Werts für die Testverbindung, der Konzentration des bei dem Test verwendeten Radioliganden und des historischen Werts für den K_d für den Liganden berechnet. Der Hill-Koeffizient (n_H), der als die Steigung der Wettbewerbsbindungskurve definiert ist, wurde berechnet.
Die Verbindung G band an den Glucocorticoidrezeptor an. Die Bindungskurve war verglichen mit Dexamethason nach rechts verschoben. Dies war ein überraschendes Ergebnis, da die Verbindung G in den Transrepressionstests mindestens genauso wirksam wie Dexamethason war. Es ist möglich, zu spekulieren, dass die Bindung bei diesem Test die Transaktivierungsaktivität der Verbindungen besser reflektiert als die transrepressive Aktivität der Verbindungen.
Von der Verbindung G wurde aufgezeigt, dass sie in einem klassischen Rezeptorbindungstest nicht an den Progesteronrezeptor anbindet (Daten nicht gezeigt). Von der Verbindung G wurde auch gezeigt, dass sie nicht an andere Mitglieder der Steroidzrezeptorsuperfamilie anbindet. Interessanterweise schien die Verbindung G in einem klassischen Rezeptorbindungstest (19) ein weniger potenter Ligand als Dexamethason für den GR zu sein, so dass die Ergebnisse sowohl in dem in vitro als auch dem in vivo-Test überraschend waren, bei denen G dieselbe oder eine größere Aktivität bei der Transrepression zeigte.
Beispiel 8 – in vivo Tests
Um die Gültigkeit der in vitro-Modelle als Vorhersagen der antientzündlichen Wirkungen in vivo und der Induktion von Proteinsynthese (Transaktivierung) in vivo weiter zu testen, wurde die Verbindung G in einem klassischen Tiermodell für Entzündungen studiert.
Männliche Schweizer Albinomäuse von nicht eng miteinander verwandten Elterntieren (18 bis 20 g Körpergewicht) wurden von Bantin and Kingman (T. O. Stamm; Hull, Humberside) gekauft und unter einer Standardfutterpelletdiät mit Leitungswasser zur freien Verfügung und einem 12:00 h Licht-/Dunkelheitszyklus gehalten. Alle Tiere wurden drei Tage vor den Experimenten eingehaust, um es dem Körpergewicht zu erlauben, 20 bis 22 g zu erreichen. Am Tag des Experiments reichten die Mäuse von 24 bis 26 g.
Lufttaschen wurden an dem Rücken der Mäuse durch Luftinjektion (2,5 ml s.c.) an dem Tag 0 und dem Tag 3 ausgebildet (Pirretti und Flower, 1993).
Am Tag 6 wurden die Mäuse dem Vehikel (300 μl, Gruppe A und D) ausgesetzt oder mit Dexamethason (3 μg, Gruppe B) oder Verbindung G (3 μg, Gruppe C) zum Zeitpunkt –1 h, intra-peritoneal (i.p.) injiziert behandelt; Gruppe E blieb unbehandelt. Die Verbindung G und Dexamethason wurden durch Verdünnen von Stammlösungen in DMSO in Paraffinöl zubereitet (DMSO-N-Konzentration < als 0,01%).
Zymosan A wurde es erlaubt, bei Raumtemperatur für 30 min. aufzutauen, bevor es zu sterilem PBS in einer Konzentration von 2 mg/ml hinzu gegeben wurde, um eine homogene Suspension auszubilden.
Zum Zeitpunkt 0 erhielten die Mäuse entweder 0,5 ml Zymosan (1 mg) (Gruppe A, B, C), lokal injiziert in die Lufttasche. Die Gruppen D und E blieben zu diesem Zeitpunkt unbehandelt. Vier Stunden nach der Thymosanverabreichung wurden die Tiere in CO₂ gegeben. Die Lufttaschen wurden dann mit 2 ml PBS gewaschen, die 3 mM EDTA enthielten, und die Lebern wurden geborgen und für die spätere Analyse schockgefrostet.
Die Anzahl an gewanderten Leukozyten (≥ 90% polymorphkernige Leukozyten, PMN) wurde in der Waschlösung von jeder Lufttasche bestimmt, indem ein Aliquot (100 μl) der Waschflüssigkeit genommen und 1:10 in Turk-Lösung (0,01% Kristallviolett in 3% Essigsäure) verdünnt wurde. Die Proben wurden dann verwirbelt, und 10 μl der gefärbten Zelllösung wurden in ein Neubauer-Hämatozytometer angeordnet, und es wurden die Zahlen der Neutrophilen unter Verwendung eines Lichtmikroskops (Olympus BO61) gezählt.
Quantifizierung des Tyrosinaminotransferase-(TAT)-Proteins in den Lebern: Bei dieser Methode wird ein kolorimetrischer Ansatz angewendet, um die TAT-Aktivität zu quantifizieren. Das TAT-Enzym katalysiert die folgende Reaktion: L-Tyrosin + 2-Oxoglutarat ⇆ 4-Hydroxyphenxlpyruvat (pHPP) + L-Glutamat.
Diese Reaktion erfordert auch Pyridoxalphosphat (PLP) als Cofaktor. Stark alkalische Bedingungen können dann angewendet werden, um pHPP zu p-Hydroxybenzaldehyd (pHBA) und Oxalat umzuwandeln. Die Menge an pHBA kann dann durch Messen seiner Absorption bei 331 nM (Extinktionskoeffizient 19.900 M¹cn^–1) bestimmt werden; von dieser Zahl wird dann angenommen, dass sie der TAT-Aktivität direkt proportional ist. Die Lebern wurden homogenisiert und die Zellen wurden auf Eis gelagert. Die Zelltrümmer in der aufgelösten Zellsuspension wurde dann abgeschleudert (13.000 U/min, 20 min; Mikrofuge), und die Proteinkonzentration des Überstands wurde unter Anwendung der Bradford-Methode getestet. 100 μg Protein wurden dann verwendet, um die TAT-Aktivität zu testen. Um den TAT-Test durchzuführen, wurde die folgende Reaktionsmischung in einer 1,5 ml Eppendort-Pipette zubereitet:

900 μl 7 mM L-Tyrosin in 0,2 M KPO₄

30 μl 0,3 Ketoglutarat

30 μl 1.2 mM PLP

? 100 μg von Zellprotein

? 0,2 M KPO₄

1000 μl
Für jede Reaktion wurde eine Kontrollreaktion ohne das Ketoglutarat durchgeführt. Die Proben wurden bei 37°C für 20 min. inkubiert, und dann wurden 60 μl 10 M NaOH zugegeben. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für weitere 30 min. inkubiert, und dann wurde die Absorption jeder Probe bei 331 nm auf einem Spektrophotometer (Ultropec III, Pharmacia) getestet.
Die experimentellen Gruppen sind unten beschrieben:
Gruppe A, Vehikel i.p. + Zymosan in die Tasche, n = 8
Gruppe B, Dexamethason + Zymosan in die Tasche, n = 8
Gruppe C, Verbindung G + Zymosan in die Tasche, n = 8
Gruppe D, Vehikel i.p., n = 8
Gruppe E keine Behandlung, n = 8
Statistik
Die Anzahl an Neutrophinen wurden zwischen den Gruppen unter Verwendung von ANOVA und des Bonferroni-Tests verglichen. Die TAT-Niveaus wurden unter Anwendung eines t-Tests verglichen.
Diese Resultate der Akkumulation von Neurophilen sind in Tabelle I, unten, gezeigt, und der TAT-Test in 22. Tabelle 1 Effekt der Verbindung G auf eine Zymosan-induzierte Wanderung von Neurophilen (10⁶ pro Maus) wie zu dem 4 h Zeitpunkt ausgewertet (kumulative Daten).

Legende: Werte sind Mittelwert ± SD von 8 Mäusen pro Gruppe. *P < 0.05 gegenüber Gruppe A

Dexamethason und die Verbindung G verursachten eine signifikante Reduktion (~30%) der Neutrophilenakkumulation. Der TAT-Test zeigte, dass alle Tiere, die das Drogenvehikel ip erhalten hatten, verglichen mit den unbehandelten Kontrollen erhöhte Niveaus an TAT aufwiesen. Dies beruhte auf dem Stress, der mit einer entzündlichen Reaktion, welche von dem Vehikel induziert wird, und dem zugehörigen erhöhten endogenen Glucocorticoidniveaus verbunden ist. Dexamethason verursachte weiterhin eine Erhöhung an TAT, anders als die Verbindung G. Dieses Experiment zeigt deshalb, dass die Verbindung G und Dexamethason eine äquivalente entzündungshemmende Wirkung haben, wenn sie in derselben Dosierung verabreicht werden, und dass die Verbindung G, anders als Dexamethason, keine Induktion des gluconeogenischen Enzyms Tyrosinaminotransferase bei dieser Dosis verursacht. Dies beweist, dass die Verbindung G und somit andere Verbindungen der Reihe, von denen gezeigt wurde, dass sie Selektivität in den in vitro-Tests aufweisen, in vivo die gewünschte Reduktion der Nebenwirkungen aufweisen, die aus der Transaktivierung resultiert.
Eine zusätzliche interessante Beobachtung aus dieser Studie bei der Maus war, dass die Verbindung G nicht als Antagonist im Hinblick auf Transaktivierung wirkte. Dies kann als dadurch begründet angesehen werden, dass die Verbindung G das Niveau an TAT verglichen mit den Vehikelkontrollgruppen nicht reduzierte.
Diskussion
Uns vorangegangene Forscher haben danach gestrebt, selektive Steroide zu identifizieren ^44,45. Sie waren bei der Identifizierung nützlicher Verbindungen nicht erfolgreich. Es war daher vollständig unerwartet, dass wir in der Lage waren, eine bestimmte Reihe von Verbindungen zu identifizieren, wie sie hier zuvor in den Formeln I, II und III definiert wurden, die überraschenderweise die gewünschte Funktionalität aufweisen, und insbesondere, eine Verbindung (Verbindung G) zu identifizieren, die ein ganz beachtliches Maß an Selektivität aufweist. Wie die obigen Daten anzeigen, sind Beispiele der erfindungsgemäßen Verbindung als Verbindungen A, G, H, I, K, M, N, S und T identifiziert, deren Strukturen in 2A gezeigt sind, und Vergleichsbeispiele, die aus dem Bereich der vorliegenden Erfindung herausfallen, sind als Verbindungen D, J, L, O, P, Q und S identifiziert worden, deren Strukturen ebenfalls in 2A gezeigt sind.
Die ausgewählte Reihe von Dexamethasolanalogons der vorliegenden Erfindung, die eine Struktur gemäß I, II, III und IV, wie sie hier zuvor definiert wurden, aufweisen, entwickelt eine Selektivität für Transrepression gegenüber Translokation. Die ausgewählte Reihe von Verbindungen der vorliegenden Erfindung bindet eindeutig an den Glucocorticoidrezeptor an und verursacht keine Transaktivierung oder verursacht signifikant weniger Transaktivierung als Dexamethason bei Konzentrationen, die den Entzündungsprozess inhibieren. Dies ist klassisch eine Situation, in der man Antagonistenaktivität zu sehen erwarten würde. Diese tritt überraschenderweise nicht auf. Von einem klinischen Standpunkt ist dies von beachtlicher Bedeutung, da ein Antagonist zur Transaktivierung den Wirkungen von endogenen Steroiden entgegenwirken und einen Zustand induzieren würde, der einem Fehlen von Steroid äquivalent wäre, was als Addison-Krankheit bekannt ist, die durch reduzierten Blutdruck, Hypokalämie, Koma, reduzierten Widerstand gegenüber Stress und Infektion charakterisiert ist.
So ist durch die oben beschriebenen Experimente für die ausgewählte Reihe von Dexamethasonanalogons gemäß Formel I, II und III, wie sie hier zuvor definiert wurden, gezeigt worden, das sie Eigenschaften aufweisen, die für einen selektiven Steroidrezeptoragonisten notwendig sind, zusammen mit reduzierten Nebenwirkungen; d. h., die definierten Verbindungen:

1. verursachen Transrepression in demselben oder einem signifikant größeren Ausmaß als Dexamethason und Inhibieren Entzündung genauso wirksam wie Dexamethason.
2. transaktivieren bei klinisch relevanten Konzentrationen in den in vitro-Tests nicht, und scheitern auch bei den in vivo-Tests daran, zu transaktivieren und werden deshalb nicht die charakteristischen Steroidnebenwirkungen verursachen, die aus diesem Mechanismus resultieren und die die Nützlichkeit dieser Drogen in der klinischen Praxis stark einschränken.
3. antagonisieren nicht die Effekt von endogenen Steroiden und haben deshalb nicht die Kapazität, ein Addison-Nebenwirkungsbild zu induzieren.
4. Induzieren Apoptose, was ein wichtiger Mechanismus für die klonale Selektion und die Behandlung von Entzündungen und Transplantatabstoßung ist und was die Basis ist, auf der Steroide hämatologische und andere Malignitäten behandeln.

Somit ist von den speziellen Verbindungen, die eine Strukturformel gemäß Formel I, II oder III, wie sie hier zuvor definiert wurden, aufweisen, gezeigt worden, dass sie die Eigenschaften einer Gruppe von Steroiden haben, die das gewünschte therapeutische Profil in Bezug auf reduzierte Nebenwirkungen unter Beibehaltung der Wirksamkeit aufweisen. Andere Forscher haben Moleküle identifiziert, die eine gewisse Selektivität in in vitro-Tests aufweisen. Von RU24858 wurde gezeigt, dass es eine zweifache Selektivität für die Transrepression gegenüber der Transaktivierung in vitro aufweist. Diese Verbindung scheitert jedoch daran, dass gewünschte Profil in vivo zu zeigen ^44,45. Von der Verbindung G wurde gezeigt, dass sie das gewünschte Profil in vivo aufweist und dass dies nahezu sicher auf die Tatsache zurückgeht, dass sie große Selektivität (ungefähr 1.000-fach in vitro) aufweist, hochpotent für die Transrepression ist und dass sie selbst bei sehr hohen Konzentrationen daran scheitert, eine maximale Transaktivierung zu induzieren.
Beispiel 9 – Synthese von neuen Verbindungen gemäß Formel III und IV
Ein Fachmann wird erkennen, dass der folgende Prozess verwendet werden kann, um die neuen Verbindungen gemäß der Formeln III und IV aus der Verbindung G zu synthetisieren.
Schritte

1. Schutz der zwei Hydroxylfunktionen mit R-Gruppen (wobei die R-Gruppen aus jenen ausgewählt sind, die hier zuvor bei den Formeln 3 und 4 definiert wurden),
2. Bildung des Enolazetats durch Behandlung mit Isopropenylazetat und einem sauren oder basischen Katalysator,
3. Entfernung der zwei Schutzgruppen.

Literaturliste

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Claims

Verbindung, die die Struktur der Formel I oder Formel II, wie sie unten definiert sind, aufweist, oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon zur Verwendung in der Medizin:
Formel I, wobei R = NH₂, NHR¹, NHOR², NHNHR², NHCOR²,
und R¹ = C_(1-4)-Alkyl, C_(3-6)-Zykloalkyl,
wobei n = 1–3, R² = Methyl, Ethyl, R³ = C_(1-6)-Alkyl, Benzyl oder Halogenbenzyl; oder
Formel II, wobei R⁴, R⁵ = C_(1-4)-Alkyl.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Struktur der Formel I aufweist, wobei R NHR¹ ist und R¹ Methyl, Ethyl, Propyl, Zyklopropyl, Butyl, Zyklobutyl oder
ist und n = 1.
Verbindung nach Anspruch 2, wobei R¹ Benzyl oder Methyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Struktur der Formel I aufweist, wobei R
ist und R³ C_(1-6)-Alkyl ist.
Verbindung nach Anspruch 4, wobei R³ Propyl oder Hexyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Struktur der Formel I aufweist, wobei R
ist und R³
ist, wobei n = 1–6 ist.
Verbindung nach Anspruch 6, wobei R³ Benzyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung die Struktur der Formel I aufweist, wobei R
ist und R³ Halogenbenzyl ist.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei R³ Fluorbenzyl ist.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung eine Struktur der Formel II aufweist und R⁴ und/oder R⁵ Methyl und/oder Ethyl ist.
Verbindung nach Anspruch 10, wobei R⁴ und R⁵ Methyl sind.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Verbindung ist:
Verbindung nach Anspruch 4, wobei R³ Propyl ist.
Verbindung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Verbindungen an einen Patienten verabreicht werden, um eine Apoptose bei vorentzündlichen Zellen und/oder bösartigen Zellen zu induzieren.
Verbindung, wie sie in Formel III oder Formel IV unten definiert ist:
Formel III, wobei R⁶ und R⁷ irgendeines von H, CH₃CO, CH₃CH₂CO, CH₃CH₂CH₂CO sind, vorausgesetzt, dass R⁶ und R⁷ nicht beide H sind, oder
Formel IV, wobei R⁸ und R⁹ irgendeines von H, CH₃CO, CH₃CH₂CO, CH₃CH₂CH₂CO sind.
Verbindung nach Anspruch 15 zur Verwendung als Medizin.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder pharmazeutisch akzeptables Derivat davon zur Verwendung bei der Behandlung eines entzündlichen Zustands, für die Behandlung von hämatologischen und anderen Malignitäten, zum Unterdrücken von Immunabstoßungsreaktionen oder zur Verhinderung oder Behandlung von Transplantatabstoßung.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Derivats davon bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines entzündlichen Zustands, für die Behandlung hämatologischer oder anderer Malignitäten, zum Unterdrücken von Immunabstoßungsreaktionen oder zur Verhinderung oder Behandlung von Transplantatabstoßung.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 19 für die Verwendung bei der Behandlung eines entzündlichen Zustands, für die Behandlung hämatologischer oder anderer Malignitäten, zum Unterdrücken von Immunabstoßungsreaktionen oder zur Verhinderung oder Behandlung von Transplantatabstoßung.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 19 bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung eines entzündlichen Zustands, für die Behandlung hämatologischer oder anderer Malignitäten, zum Unterdrücken von Immunabstoßungsreaktionen oder zur Verhinderung oder Behandlung von Transplantatabstoßung.
Verwendung einer Zusammensetzung nach Anspruch 19 bei der Herstellung eines Medikaments für das Induzieren von Apoptose in Zielzellen.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Derivats davon bei der Herstellung eines Medikaments für das Induzieren von Apoptose in Zielzellen.