Fachgebiet der Erfindung
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Diese Erfindung betrifft chemische Konstrukte zur Verwendung in der
Festphasensynthese und Verfahren zum Nachweis und/oder zur Charakterisierung der
Produkte der Festphasensynthese unter Verwendung der Konstrukte.
Hinterrund der Erfindung
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Festphasensynthese ist seit vielen Jahren auf dem Fachgebiet der Peptidsynthese
bekannt und wird seit kurzem zunehmend auch zur Synthese von Nicht-Peptiden
verwendet.
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Festphasensynthese fand besondere Anwendung auf dem Fachgebiet der
kombinatorischen Chemie und Erstellung von chemischen Bibliotheken als potentielle
Quellen von neuen Leitfäden für Arzneimittelentdeckung, siehe zum Beispiel Anthony W.
Czarnik, Analytical Chemistry News and Features, I. Juni 1998, S. 378A-386A, und The
Combinatorial Index, Barry A. Bunin, Academic Press, San Diego 1998. Ein Merkmal der
kombinatorischen Chemieverfahren ist, dass sie ermöglichen, dass eine sehr große Zahl
von unterschiedlichen Verbindungen aus einer relativ beschränkten Zahl von molekularen
Aufbaublöcken in einer relativ kleinen Zahl von Reaktionen hergestellt werden kann. Die
kombinatorische Chemie verwendet die "Trenn- und Sammel"-Annäherung, wobei eine
Suspension von chemischer Ausgangssubstanz, gebunden an einen festen Träger, in N-
Teile gespalten wird, von denen jeder mit einem unterschiedlichen Reagens umgesetzt
wird. Die Produkte der N-Reaktionen werden dann gesammelt und gründlich gemischt,
wobei die anschließende gesammelte Substanz in N'-Teile geteilt und wieder jeder Teil
mit einem unterschiedlichen Reagens umgesetzt wird. Das Verfahren kann so viele Male
wiederholt werden, wie es Schritte in der Reaktionssequenz gibt. So ist für eine
Dreischrittreaktionssequenz, wenn das Reaktionsgemisch in jedem Schritt in zehn
Portionen aufgeteilt wird, jede gesammelte Substanz mit einem unterschiedlichen Reagens
vor erneutem Kombinieren mit anderen Teilen umgesetzt wird, die Gesamtzahl der mit
dem Verfahren gebildeten Verbindungen 10³ = 1000. So ist zu erkennen, dass unter
Verwendung des Trenn- und Sammelverfahrens eine große Zahl unterschiedlicher
Moleküle unter Verwendung einer minimalen Zahl von Reaktionen (im vorstehend
erwähnten Fall dreißig) synthetisiert werden kann.
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Jeder der festen Träger (z. B. ein Harzkügelchen) weist ein einzelnes
Produktmolekül daran gebunden auf, und daher kann im Prinzip jedes der
Reaktionsprodukte abgetrennt und analysiert oder biologischer Untersuchung unterzogen
werden, indem man einfach jeden einzelnen festen Träger isoliert und das Produkt vom
Träger abspaltet. Jedoch bedeutet die Zahl der in großen Bibliotheken durch
kombinatorische Verfahren erzeugten Verbindungen, dass es unpraktisch sein kann, jede
Verbindung zu charakterisieren und zu identifizieren. Folglich werden die Verbindungen
üblicherweise erst getestet, entweder auf dem festen Träger oder nach Abspalten vom
Träger, und nur jene Verbindungen, die gewisse biologische Wirksamkeit zeigen, werden
anschließend identifiziert. Um die Zahl der durchgeführten biologischen Tests zu
minimieren, können die Verbindungen in Pools, die eine festgelegte Zahl von
Verbindungen enthalten, getestet werden, wobei inaktive Pools verworfen werden und die
aktiven Pools weiterer Untersuchung unterzogen werden. Die biologischen Wirksamkeiten
der Verbindungen können unter Verwendung automatisierter Untersuchungsverfahren mit
hohem Durchsatz analysiert werden, die ermöglichen, dass eine große Zahl an
Verbindungen innerhalb kurzer Zeit analysiert wird.
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Eines der für den Chemiker auftretenden Probleme ist die Identifikation und
Charakterisierung der verschiedenen Verbindungen in einer kombinatorischen Bibliothek,
da jede Verbindung in der Bibliothek nur in sehr geringen Konzentrationen vorhanden ist,
und üblicherweise ist nicht ausreichend Verbindung auf einem festgelegten festen Träger
vorhanden, um sowohl eine biologische Untersuchung als auch Identifikation der
Verbindung zu ermöglichen. An das Problem wurde durch Bereitstellung eines festen
Trägers mit einer Kodierungsmarkierung gedacht, aus der die Identität der Verbindung
bestimmt werden kann. So kann zum Beispiel eine Kodierungsmarkierung in
hintereinanderfolgenden Schritten auf dem festen Träger parallel zum Aufbau der
gewünschten Zielverbindung aufgebaut werden, wobei die Kodierungsmarkierung die
Synthesegeschichte der Produktverbindung widerspiegelt und einzigartig für jede
Produktverbindung ist. Die Kodierungsmarkierung wird üblicherweise auf dem Träger
unter Verwendung von chemischen Reaktionen einer Art aufgebaut, die orthogonal zur
zum Aufbau der Produktverbindung verwendeten Chemie sind, wobei sichergestellt wird,
dass die Kodierungseinheiten und Produktverbindungen nicht verwechselt werden.
Nachdem die Produktverbindung getestet und ihre biologische Aktivität bestätigt wurde,
kann die Kodierungsmarkierung dann dekodiert werden, was eine Identifikation der
Verbindung ermöglicht.
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Wenn eine Produktverbindung einem vorhergehenden biologischen Screening als
Teil eines Pools von Verbindungen unterzogen wurde und der Pool Wirksamkeit zeigte,
dann ist erforderlich, entweder kleinere Pools von Verbindungen oder einzelne
Verbindungen zu betrachten, um die Identität der wirksamen Verbindung festzustellen. In
vielen Testsystemen ist es erforderlich, die Verbindung vom festen Träger zu spalten, um
ein biologisches Testen durchzuführen, und das kann zu Problemen mit der
Pooltestannäherung führen. So enthält, wenn die gesamte aktive Verbindung vom festen
Träger zum Durchführen des Testens gespalten wurde, der Pool ein Gemisch einer großen
Zahl gelöster Verbindungen, wobei die Gewinnung jeder einzelnen Verbindung zum
weiteren Testen ein ernstes Trennproblem bewirken würde. Um dieses Problem zu
überwinden oder zu vermeiden, wurden Konstrukte mit "Differentialfreisetzung" erzeugt,
in denen die Produktverbindung, z. B. ein Arzneistoffmolekül an den festen Träger durch
mehrere unterschiedliche Arten von Bindungsgruppen gebunden ist, wobei jede
Bindungsgruppe orthogonal und selektiv unter unterschiedlichen chemischen
Bedingungen spaltbar ist. Ein solches Konstrukt (Konstrukt A) ist nachstehend
schematisch gezeigt.
Konstrukt A
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Beim Befolgen eines kombinatorischen Syntheseschemas können die
Reaktionsprodukte in x-Pools aufgeteilt werden, die jeweils y-feste Träger enthalten,
wobei jeder feste Träger ein unterschiedliches Produktarzneistoffmolekül trägt. Jeder Pool
kann dann Spaltungsbedingungen unterzogen werden, die zum selektiven Abspalten der
Verbindungsgruppe B geeignet sind, um so einen Anteil des gesamten auf dem festen
Träger vorhandenen Arzneistoffs freizusetzen. Die festen Träger können dann entfernt
werden und die restliche Lösung den erwünschten biologischen Versuchen unterzogen
werden. Wenn der Pool als Gesamtes biologische Wirksamkeit zeigt, können die
einzelnen teilweise gespaltenen festen Träger in dem aktiven Pool dann in einzelne
Behälter getrennt und Bedingungen unterzogen werden, die wirksam sind, um die
Spaltung der zweiten Verbindungsgruppe, Verbindungsgruppe C, zu bewirken.
Anschließend können die einzelnen Arzneistoffe jeweils auf biologische Wirksamkeit
getestet werden.
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Nachdem biologische Wirksamkeit für einen Arzneistoff beobachtet wurde, der mit
einem bestimmten einzelnen festen Träger verbunden ist, wird der Träger Bedingungen
unterzogen, die ermöglichen, dass der Markierungscode decodiert und die Identität der
Arzneistoffverbindung bestimmt wird.
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Eine Alternative zur "Differentialfreisetzung" ist "Reihenfreisetzung". In einem
Reihenfreisetzungssystem verwendet das Konstrukt nicht zwei orthogonale
Spaltungsstellen, wie bei den Differentialfreisetzungs-Konstrukten, sondern verwendet nur
eine einzelne Spaltungsstelle. Ein Anteil des Arzneistoffs oder der Testverbindung wird in
einem ersten Spaltungsschritt freigesetzt, um ausreichend Verbindung für einen ersten
biologischen Test bereitzustellen, und anschließend kann mehr Arzneistoff durch Spalten
an der selben Spaltungsstelle für weitere biologische Tests freigesetzt werden. Solche
Reihenfreisetzungssysteme verwenden Spaltungsreaktionen, die relativ langsam sind, und
bei denen die Geschwindigkeit der Spaltung vernünftig gut kontrolliert werden kann. Eine
photochemische Spaltung wird typischerweise in Reihenfreisetzungssystemen verwendet.
Ein Konstrukt zur Verwendung in einem Reihenfreisetzungssystem ist nachstehend als
Konstrukt B gezeigt.
Konstrukt B
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In jedem Festphasensyntheseverfahren, ob ein Teil eines kombinatorischen
Verfahrens oder nicht, ist es wichtig, die optimalen Bedingungen für einen festgelegten
Reaktionsschritt in einer Reihe von Schritten bestimmen zu können. Es ist auch wichtig,
den Fortschritt oder Weg einer Reaktion überwachen zu können, so dass bestimmt werden
kann, ob eine bestimmte Reaktion vollständig ablief oder tatsächlich, ob eine bestimmte
Reaktion überhaupt ablief. Das ist in einer Festphasensynthese mit mehreren Stufen
besonders wichtig, wenn ein Fehler bei einer festgelegten Stufe zum Fortschritt der
vollständigen Umsetzung zur Bildung von Nebenprodukten führen kann und dabei zu
einer Komplizierung führt, was andernfalls ein relativ gerade ablaufendes Trennverfahren
ist.
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Obwohl sowohl invasive als auch nicht invasive Analyseverfahren zum Bestimmen
der Produkte der Festphasensynthese (siehe The Combinatorial Index, idem) bekannt sind,
ist eines der festgestellten Probleme mit der Festphasensynthese, dass es im Allgemeinen
schwieriger ist, den Fortschritt einer Reaktion zu überwachen; siehe zum Beispiel die
vorstehend zitierte Czarnik-Veröffentlichung. Das gilt besonders bei Produkten von
kombinatorischen Chemieverfahren, bei denen die Verwendung schneller Verfahren mit
hohem Durchsatz zum Analysieren der großen Zahl von mit solchen Verfahren erzeugten
Verbindungen erforderlich ist. Verfahren, wie Massenspektrometrie, sind potentiell ideal
als Maßnahme zum Bereitstellen von Analysen mit hohem Durchsatz geeignet, aber ein
wesentliches Problem ist, dass nicht alle Verbindungen eine garantierte Reaktion unter
massenspektrometrischen Bedingungen bewirken. Tatsächlich sind viele Verbindungen
gegenüber sogenannten "weichen" Verfahren der Massenspektrometrie, wie
Matrixunterstützte Laserdesorptions-Ionisation (MALDI) und Elektrospray-
Massenspektrometrie, unsichtbar, die Molekülionen ohne signifikante Fragmentierung des
Moleküls nachweisen sollen. Einer der Gründe dafür ist, dass unter MALDI- und
Elektrospray-Bedingungen viele Verbindungen, insbesondere Peptide, nicht ausreichend
gut ionisieren, um eine nachweisbare Massenspektral-Antwort zu erhalten.
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Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, ein Mittel zum Überwachen des
Fortschritts oder Wegs einer chemischen Reaktion auf einem festen Träger, zum Beispiel
in einer kombinatorischen Synthese, bereitzustellen, die den bekannten Verfahren
inhärente Probleme vermeidet und eine Vorrichtung zum Nachweis und zur Identifikation
der Produkte der Festphasensyntheseverfahren unter Verwendung von
Massenspektroskopie bereitstellt.
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Demgemäß stellt die Erfindung in einem ersten Gesichtspunkt ein chemisches
Konstrukt zur Verwendung in der Festphasensynthese bereit, umfassend einen festen
Träger Q mit daran gebundenen Resten Y¹R und Y²R; wobei R ein Substrat oder eine
Kodierungsmarkierung ist und die Reste Y¹ und Y² Verbindungsgruppen mit jeweils einer
ersten Spaltungsstelle sind, wobei mindestens einer der Reste Y¹ und Y² eine zweite
Spaltungsstelle aufweist, die sich zwischen der ersten Spaltungsstelle und dem Rest R
befindet, wobei die erste Spaltungsstelle orthogonal und selektiv spaltbar in Bezug auf die
zweite Spaltungsstelle ist, und, wenn beide Reste Y¹ und Y² eine zweite Spaltungsstelle
enthalten, die zweite Spaltungsstelle in Y¹ selektiv und orthogonal in Bezug auf die zweite
Spaltungsstelle in Y² spaltbar ist; die zweite Spaltungsstelle spaltbar ist, wobei das
Substrat freigesetzt wird, und die erste Spaltungsstelle selektiv spaltbar ist, wobei ein
Fragment Fr freigesetzt wird, das das Substrat R und mindestens einen Teil der
Verbindungsgruppe Y umfasst; und wobei:
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(i) das chemische Fragment Fr eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das
chemische Fragment Fr für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse
sensibilisiert und/oder:
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(ii) das Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine
charakteristische Signatur zu verleihen.
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Vorzugsweise ist mindestens ein Rest R ein Substrat, und stärker bevorzugt ist das
Substrat ein Arzneistoffmolekül oder ein anderes Molekül mit biologischer Wirksamkeit.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein chemisches Konstrukt zur
Verwendung in Festphasensynthese bereitgestellt, umfassend einen festen Träger Q mit
daran gebundenen Resten Y¹R und Y²R; wobei R ein Substrat (wie ein
Arzneistoffmolekül) ist und die Reste Y¹ und Y² Verbindungsgruppen mit jeweils einer
ersten und zweiten Spaltungsstelle sind, die orthogonal und selektiv spaltbar sind, wobei
die zweite Spaltungsstelle in Y¹ selektiv und orthogonal in Bezug auf die zweite
Spaltungsstelle in Y² spaltbar ist; die zweite Spaltungsstelle spaltbar ist, wobei das
Substrat freigesetzt wird, und die erste Spaltungsstelle sich an einer Stelle zwischen der
ersten Spaltungsstelle und dem festen Träger befindet und selektiv spaltbar ist, wobei ein
Fragment Fr freigesetzt wird, das das Substrat R und mindestens einen Teil der
Verbindungsgruppe Y umfasst; und wobei:
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(i) das chemische Fragment Fr eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das
chemische Fragment für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse
sensibilisiert und/oder:
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(ii) das Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine ·
charakteristische Signatur zu verleihen.
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Die erfindungsgemäßen Konstrukte können durch die allgemeine Formel:
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veranschaulicht werden.
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Die erfindungsgemäßen Konstrukte stellen ein Differentialfreisetzungssystem
bereit, das leichter analysierbar ist, um das Ergebnis der einzelnen Reaktionen auf dem
festen Träger zu bestimmen. So werden z. B., indem man das Konstrukt
Spaltungsbedingungen aussetzt, die wirksam sind, um eine Spaltung selektiv an jeder der
ersten Spaltungsstellen zu bewirken, chemische Fragmente hergestellt, die die Substrate R,
gebunden an einen "analytischen Hebel" enthalten, in denen die Nachweisbarkeit der
chemischen Fragmente und daher der Substrate erhöht ist. So kann die Spaltung an der
ersten Spaltungsstelle zum Bestimmen verwendet werden, ob ein bestimmtes Substrat
gebildet wurde, eine Einrichtung, die als Maßnahme zum Durchführen einer
Qualitätskontrolle (QC) während eines Reaktionsschemas oder bei einer
Bibliotheksbildung geeignet ist, und die ein Mittel der Analyse bereitstellt, die zur
Optimierung der Bedingungen für einen festgelegten Syntheseverfahrensschritt verwendet
werden kann.
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Die Konstrukte können weiter Gruppen Yn enthalten, von denen jede eine zweite
Spaltungsstelle aufweist, die selektiv und orthogonal in Bezug auf die zweiten
Spaltungsstellen in den anderen Gruppen Y spaltbar sind. So können zum Beispiel die
Konstrukte eine Gruppe Y³Q enthalten, in der die zweite Spaltungsstelle in der Gruppe Y³
unter zu den zweiten Spaltungsstellen in Y¹R und Y²R verschiedenen chemischen
Bedingungen gespalten wird. So ist es mit Hilfe der Erfindung möglich, eine
Differentialfreisetzung der Produkt-Substratmoleküle (z. B. Arzneistoffe) in zwei, drei,
vier oder mehreren Schritten bereitzustellen, wobei das biologische Screening der
Produkte von großen Kombinationsbibliotheken in Pools mit handhabbarer Größe
unterstützt wird.
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In einem zweiten Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein
Differentialfreisetzungsverfahren zum Untersuchen einer chemischen Bibliothek auf
biologische Wirksamkeit bereit, wobei das Verfahren umfasst:
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(i) Aussetzen eines einen festen Träger Q mit daran gebundenen Resten Y¹R und Y²R
umfassenden Konstrukts, wie vorstehend definiert, an Spaltungsbedingungen, die
wirksam sind, um das Substrat R vom Rest Y¹R freizusetzen;
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(ii) Testen des vom Rest Y¹R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test;
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(iii) anschließend Aussetzen des Konstrukts an Spaltungsbedingungen, die wirksam
sind, um das Substrat R vom Rest Y²R freizusetzen; und
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(iv) Testen des vom Rest Y²R freigesetzten Substrats R in einem biologischen Test.
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Zusätzlich zum Bereitstellen des Differentialfreisetzungsverfahren bei der Analyse
einer Bibliothek stellt die Erfindung auch ein Verfahren der Reihenfreisetzungsanalyse
bereit, die Konstrukte verwendet, die selektiv unter Freisetzung eines Fragments Fr
spaltbar sind, das das Substrat R und mindestens einen Teil einer Verbindungsgruppe Y
umfasst; und wobei:
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(i) das chemische Fragment Fr eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das
chemische Fragment Fr für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse
sensibilisiert und/oder:
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(ii) das Fragment Fr ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine
charakteristische Signatur zu verleihen.
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Demgemäß stellt die Erfindung in einem weiteren Gesichtspunkt ein
Reihenfreisetzungsverfahren zum Untersuchen einer chemischen Bibliothek auf
biologische Wirksamkeit bereit, wobei das Verfahren umfasst:
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(i) Aussetzen eines Konstrukts, das einen festen Träger Q mit einem daran
gebundenen Rest Y¹R wie vorstehend definiert umfasst, an Spaltungsbedingungen,
die wirksam sind, einen ersten Teil des Substrats R vom Rest Y¹R freizusetzen;
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(ii) Testen des ersten Teils des vom Rest Y¹R freigesetzten Substrats R in einem
biologischen Test;
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(iii) Aussetzen des Konstrukts an Spaltungsbedingungen, die wirksam sind, um einen
zweiten Teil des Substrats R vom Rest Y¹R freizusetzen; und
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(iv) Testen des zweiten Teils des vom Rest Y¹R freigesetzten Substrats R in einem
biologischen Test.
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In sowohl dem vorstehenden Differentialfreisetzungs- als auch
Reihenfreisetzungsverfahren der Erfindung wird der Spaltungsschritt (i) typischerweise
bei einem Pool von festen Trägern durchgeführt, wobei jeder ein unterschiedliches
Substrat R trägt, und nach dem Spaltungsschritt (I) wird der feste Träger typischerweise
vom freigesetzten Substrat R abgetrennt. Wenn die biologische Wirksamkeit im Pool
nachgewiesen wird, können die festen Träger isoliert oder zu kleineren Pools gruppiert
und dann einem Spaltungsschritt (iii) unterzogen werden, um weiter das Substrat zum
Testen freizusetzen, so dass die biologische Aktivität für einen bestimmten festen Träger
oder kleine Gruppen von Trägern nachgewiesen werden kann.
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Zum Unterstützen der Bestimmung der Identitäten der Produkte eines
kombinatorischen Syntheseschemas kann jeder feste Träger eine Kodierungsmarkierung
oder Kodierungssequenz enthalten, die die Information entschlüsselt, die ein Hinweis auf
zumindest einen Teil der Synthesegeschichte des Konstrukts ist. Die
Kodierungsmarkierung kann in den festen Träger selbst eingebaut oder eine
Kodierungssequenz kann an den festen Träger gebunden werden. Die Kodierungssequenz
ist vorzugsweise an den festen Träger durch eine Verbindungsgruppe Ya mit einer
Spaltungsstelle gebunden, die unter Freisetzung eines Fragments Fa vom festen Träger
spaltbar ist, wobei das Fragment F3 die Kodierungssequenz und gegebenenfalls
mindestens einen Teil der Bindungsgruppe Ya umfasst.
Vorzugsweise:
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(i) enthält das chemische Fragment Fa eine Sensibilisierungsgruppe G, die das
chemische Fragment Fa für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse
sensibilisiert und/oder:
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(ii) enthält das Fragment Fa ein Mittel, um dem Massenspektrum des Fragments eine
charakteristische Signatur zu verleihen.
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Die Kodierungsmarkierung kann die Form einer Gruppe oder Sequenz von
Kodierungsgruppen annehmen, die unter Massenspektroskopiebedingungen fragmentiert
und insbesondere sequenziell fragmentiert werden können, wobei ein oder mehrere
charakteristische Massenspektral-Peaks erhalten werden, die einen Code bereitstellen, aus
dem das Substrat identifiziert werden kann. Zum Beispiel kann die Kodierungsmarkierung
eine Sequenz unterschiedlicher Aminosäuren, z. B. zwei, drei oder vier Aminosäuren,
umfassen, wobei die Identität und Reihenfolge der einen Code bildenden Aminosäuren ein
Hinweis auf die Identität des Substrats ist. Unter Massenspektrometriebedingungen
können die Kodierungsgruppen (z. B. Aminosäuren) sequenziell gespalten werden, wobei
eine Reihe von charakteristischen Massenspektralfragmenten erhalten wird, die die
Kodierungsmarkierungen betreffen, in denen zum Beispiel eine oder zwei oder mehrere
Aminosäuren aus der Markierung verloren gingen. Durch Rückbezug der Massen der
Fragmentpeaks auf die Massen der Stammkodierungsmarkierung ist es möglich, die
einzelnen Kodierungsgruppen (z. B. Aminosäuren) und ihre Stellung an der
Kodierungsmarkierung zu bestimmen, wobei ermöglicht wird, dass der Code
aufgebrochen und das Substrat identifiziert wird. Durch Bereitstellen einer
Sensibilisierungsgruppe G und eines Mittels, dem Massenspektrum eine charakteristische
Signatur zu verleihen, stellt die vorliegende Erfindung ein Mittel bereit, erstens
sicherzustellen, dass die Aminosäuren oder andere Kodierungsgruppen ausreichend
ionisiert werden, wobei starke Massenspektralpeaks erhalten werden, und zweitens
sicherzustellen, dass jedes der charakteristischen Massenspektralfragmente, die aus der
Fragmentierung der Kodierungssequenz gebildet werden, von nicht zugehörigen Peaks
unterschieden werden kann.
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Demgemäß stellt die Erfindung in einem anderen Gesichtspunkt ein Verfahren zum
Bestimmen der Identität eines an einen festen Träger Q gebundenen Substrats R mit
massenspektrometrischen Verfahren bereit, wobei der feste Träger Q eine daran durch
eine Verbindungsgruppe Ya gebundene Kodierungssequenz mit einer Spaltungsstelle
aufweist, die unter Freisetzen eines Fragments Fa vom festen Träger spaltbar ist, wobei das
Fragment Fa die Kodierungssequenz und mindestens einen Teil der Verbindungsgruppe Ya
umfasst, wobei (i) das chemische Fragment Fa eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die
das chemische Fragment Fa für Massenspektroskopie-Analyse sensibilisiert; und
vorzugsweise
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(ii) das Fragment Fa ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine
charakteristische Signatur zu verleihen;
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die Kodierungssequenz eine Sequenz von Kodierungsgruppen der Art und
Reihenfolge umfasst, die ein Hinweis auf die Identität des Substrats R ist;
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wobei das Verfahren Spalten der Verbindungsgruppe Ya, um das Fragment Fa vom
festen Träger freizusetzen, Massenspektrometrie des Fragments Ya unter Bedingungen, die
wirksam sind, um eine Massenspektralfragmentierung der Kodierungsgruppe und die
Bildung der Massenspektral-Fragment-Ionen zu bewirken, die dem Verlust von einem
oder mehreren Kodierungsresten von der Kodierungssequenz entsprechen, und danach
Korrelieren der Peaks des Massenspektrums der Massenspektral-Fragmentionen mit den
Molekülionen des Fragments Ya zum Identifizieren der Sequenz der einzelnen
Kodierungsgruppen umfasst.
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In den Verfahren und Konstrukten der Erfindung kann als Alternative oder
zusätzlich zum Einschluß einer Kodierungsmarkierung, die vom Substrat chemisch
verschieden ist, ein Anteil des Substrats selbst an den festen Träger derart gebunden
werden, dass es vom Träger nicht unter den Bedingungen gespalten wird, die zum
Entfernen des Rests des Substrats vom Träger verwendet werden. Das verbliebene
Substrat kann deshalb als analytische Markierung dienen, die eine Identifikation durch ein
Verfahren, wie Massenspektrometrie, ermöglicht. Insbesondere kann ein Anteil des
gesamten Substrats R im Konstrukt an den festen Träger durch eine Verbindungsgruppe
Yb mit einer Abspaltungsstelle gebunden werden, die unter Freisetzen eines Fragments Fb
vom festen Träger spaltbar ist, wobei das Fragment Fb das Substrat und mindestens einen
Teil der Verbindungsgruppe Yb umfasst; wobei die Verbindungsgruppe Yb nicht unter
Freisetzen des Substrats R unter Bedingungen spaltbar ist, die wirksam sind, die zweiten
Spaltungsstellen in den Gruppen Y¹R, Y²R und Ya [falls vorhanden] zu spalten, und
wobei:
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(i) das chemische Fragment Fb eine Sensibilisierungsgruppe G enthält, die das
chemische Fragment Fa für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse
sensibilisiert und/oder:
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(ii) das Fragment Fb ein Mittel enthält, um dem Massenspektrum des Fragments eine
charakteristische Signatur zu verleihen.
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Deshalb kann nach Freisetzung des Hauptteils des Substrats von den Konstrukten
zum biologischen Testen das Fragment Fb selektiv vom festen Träger gespalten werden,
wobei ein sensibilisiertes Substrat erhalten wird, das leicht mit Verfahren, wie
Massenspektrometrie, analysierbar ist. Das könnte zum Beispiel durchgeführt werden,
nachdem biologische Versuche beim Hauptteil des Substrats durchgeführt wurden,
biologische Wirksamkeit festgestellt wurde und die Bestimmung der Identität des
Substrats erforderlich war. In einer anderen Ausführungsform kann das Fragment Fb vom
festen Träger ohne das andere Substrat zuerst vom festen Träger zu entfernen gespalten
werden, zum Beispiel als Teil eines Qualitätskontroll-(QC)-Verfahrens zum Testen der
Qualität der Produkte der Festphasensynthese. In diesem letzteren Verfahren kann das
Fragment Fb vom festen Träger zusammen mit den Fragmenten Fr und Fa gespalten
werden, wobei eine Analyse der Fragmente Fr, Fa und Fb ein vollständiges Bild des
Ergebnisses der Synthese liefert.
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Die Spaltungsstelle der Gruppen Ya und Yb ist vorzugsweise unter Bedingungen
spaltbar, die den zum Spalten der ersten Spaltungsstellen in den Gruppen Y¹R und Y²R
erforderlichen entsprechen. So können das Produkt oder die substrathaltigen Fragmente
und das die Kodierungsmarkierung enthaltende Fragment vom festen Träger gleichzeitig
gespalten werden, was ermöglicht, dass sie gleichzeitig analysiert (z. B. durch
Massenspektrometrie) werden.
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Das chemische Fragment Fa enthält vorzugsweise eine Sensibilisierungsgruppe G,
die das chemische Fragment Fa für instrumentale, z. B. Massenspektroskopie-Analyse
sensibilisiert.
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In einem bevorzugten Gesichtspunkt der Erfindung ist das Konstrukt dadurch
gekennzeichnet, dass die Sensibilisierungsgruppe G durch Spaltung an der ersten
Spaltungsstelle(n) der Gruppen Y¹, Y², Yn, Ya oder Yb erzeugt wird. In dieser bevorzugten
Ausführungsform der Erfindung wird eine die Sensibilisierungsgruppe G enthaltende
Einheit gebildet oder an der ersten Spaltungsstelle(n) durch Spalten des "Gerüsts" des
Konstrukts eingeführt, verschieden zur Spaltung einer Seitenkette oder bloßen Entfernung
einer Schutzgruppe.
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Die Sensibilisierungsgruppe G macht das Fragment Fr, Fa oder Fb und daher das
Substrat R, die Kodierungsmarkierung oder die substrathaltige Kodierungsmarkierung
empfindlicher gegenüber Analyse mit einem festgelegten Analyseverfahren und
insbesondere einem massenspektrometrischen Verfahren. So kann die
Sensibilisierungsgruppe eine Gruppe sein, die unter den in einem Massenspektrometer und
insbesondere Elektrospray-Massenspektrometrie, auftretenden Bedingungen leicht
ionisierbar ist, wobei ein starkes Signal erhalten wird.
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Die ionisierbare Sensibilisierungsgruppe dient dazu, sicherzustellen, dass das
Fragment Fr, Fa oder Fb im Massenspektrometer ausreichend ionisiert wird, damit eine
starke Reaktion erhalten wird. Das überwindet das Problem, das vielen durch
Festphasenverfahren synthetisierten Molekülen inhärent ist, in denen eine geeignete
ionisierende Gruppe nicht vorhanden ist und eine Analyse durch Massenspektralverfahren
mit hohem Durchsatz problematisch ist.
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Die ionisierbare Gruppe kann zum Beispiel eine basische Aminogruppe oder eine
Carboxylatgruppe sein, ist aber vorzugsweise eine basische Aminogruppe. Es ist zu
erkennen, dass der Begriff "basische Aminogruppe", wie hier verwendet, sich
insbesondere auf eine Aminogruppe bezieht, die leicht protoniert wird.
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Die basische Aminogruppe kann eine primäre Aminogruppe, sekundäre
Aminogruppe oder tertiäre Aminogruppe sein. Wenn die basische Aminogruppe eine
tertiäre Aminogruppe ist, kann sie zum Beispiel eine cyclische Aminogruppe, wie eine
Piperidin-, Piperazin-, Pyrrolidin- oder Morpholingruppe sein, wobei eine Piperidin- oder
Piperazin- (z. B. N-Methylpiperazin)-Gruppe gegenwärtig bevorzugt wird.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Einheit, die
die Sensibilisierungsgruppe G enthält, wie eine basische Aminogruppe, gebildet oder an
der Spaltungsstelle eingeführt, während das chemische Fragment Fr, Fragment Fa oder Fb
(nachstehend zusammenfassend als analytisches Fragment bezeichnet) vom festen Träger
gespalten wird. Der Vorteil der Bildung der Sensibilisierungsgruppe G auf diese Weise ist,
dass sie das mögliche Problem einer vorher vorhandenen oder vorher gebildeten
Sensibilisierungsgruppe, die die Chemie des Konstrukts beeinträchtigt, vermeidet.
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Die Atome oder funktionelle Gruppe zum Bilden der Sensibilisierungsgruppe G
können in einer maskierten Form im Konstrukt vor Abspalten des analytischen Fragments
vom Harz vorhanden sein, wobei die Spaltungsbedingungen nur zum Demaskieren der
Sensibilisierungsgruppe G dienen. In einer anderen Ausführungsform können die Atome
oder funktionelle Gruppe, die die Sensibilisierungsgruppe G bilden oder enthalten, an der
Spaltungsstelle während der Spaltungsreaktion eingeführt werden. Wenn zum Beispiel die
Sensibilisierungsgruppe eine basische Aminogruppe ist, kann das Stickstoffatom der
Aminogruppe im Konstrukt vor der Spaltung vorhanden sein oder während der
Spaltungsreaktion eingeführt werden.
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Wenn die Sensibilisierungsgruppe G aus einer externen Quelle während der
Spaltungsreaktion eingeführt wird, kann sie einen Teil einer größeren Einheit bilden. Zum
Beispiel kann die Gruppe G als Teil einer Gruppe X-G eingeführt werden, wobei X der
Rest eines Nucleophils oder Elektrophils, zum Beispiel ein Nucleophil auf Stickstoffbasis
oder auf Schwefelbasis, ist. Beispiele der Reste X-G schließen Reste der Formel G-Alk-
Nuc ein, wobei Alk ein Alkylenrest ist und Nuc ein Nucleophil, wie eine sekundäre
Aminogruppe (z. B. die sekundäre Aminogruppe in N-Methylpiperazin) oder eine
Thiolatgruppe ist.
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Vorzugsweise enthält das analytische Fragment ein Mittel, um dem
Massenspektrum des Fragments eine charakteristische Signatur zu verleihen. Die Signatur
kann vorteilhafterweise bereitgestellt werden, in dem man in das Fragment eine
"peakauftrennende" isotope Markierung eingliedert. Die peakauftrennende isotope
Markierung umfasst mindestens ein Atom, das in einer Reihe von stabilen isotopen
Formen vorkommt. Durch isotope Markierung eines oder mehrerer bestimmter Atome im
analytischen Fragment, so dass ein festgelegtes Atom mit einem Gemisch von Isotopen
markiert wird, erscheinen die Massenspektren der Molekülionen als charakteristisches
Muster, wobei das genaue Muster von der relativen Menge der einzelnen Isotope abhängt.
So zeigt zum Beispiel, wenn ein festgelegtes Atom im Fragment Fr so markiert wird, dass
50% der Atome eine isotope Form aufweisen und 50% eine andere isotope Form
aufweisen, das Massenspektrum das Molekülion als charakteristisches Dublett, in dem die
Peaks etwa gleiche Höhe aufweisen.
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Der Zweck des (der) peakauftrennenden Atoms(e) ist, ein charakteristisches
Muster bereitzustellen, das jeden Peak im Massenspektrum charakterisiert, der aus dem
analytischen Fragment Fr und/oder Fa und/oder Fb stammt, wobei solche Peaks von denen
durch fremde Substanzen zu unterscheiden sind.
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Die analytischen Fragmente Fr, Fa und Fb können gleich oder verschieden markiert
werden, aber in einer bevorzugten Ausführungsform werden sie unterschiedlich markiert,
um so unterschiedliche charakteristische Signaturen zu ergeben. Auf diese Weise können
die Massenspektralpeaks aufgrund der Kodierungsmarkierung von den
Massenspektralpeaks von den das Substrat enthaltenden Fragmenten unterschieden
werden.
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Beispiele der Atome, die als isotope peakauftrennende Markierungen verwendet
werden können, schließen ¹H/²H(D), &sup7;&sup9;Br/&sup8;¹Br, ¹²C/¹³C, ¹&sup4;N/¹&sup5;N und ¹&sup6;O/¹&sup8;O ein.
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Die analytischen Fragmente Fr, Fb und Fa können jeweils eine einzelne
peakauftrennende isotope Markierung oder mehr als eine solche Markierung enthalten.
Zum Beispiel kann die isotope Markierung ein einzelnes Bromatom sein, wobei der Peak
für das Molekülion des nach Spaltung vom festen Träger freigesetzten analytischen
Fragments als Dublett erscheinen wird. Durch Einführen einer zweiten oder
nachfolgenden peakauftrennenden Markierung(en) wird ein komplexeres Peakmuster für
das Molekülion gebildet werden.
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Die isotope(n) peakauftrennede(n) Markierung(en) befindet/befinden sich
vorzugsweise zwischen den ersten und zweiten Spaltungsstellen der Reste Y¹ und Y².
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Die ersten und zweiten Spaltungsstellen in den Resten Y¹ können durch erste und
zweite Verbindungsgruppen L¹ und L² definiert werden, die ersten und zweiten
Spaltungsstellen im Rest Y² können durch erste und zweite Verbindungsgruppen L¹ und
L³ definiert werden und die Spaltungsstelle im Rest Ya kann durch eine
Verbindungsgruppe La definiert werden, die vorzugsweise L¹ entspricht, wobei L¹, L² und
L³ selektiv und orthogonal abspaltbar sind. Eine "Abstandsgruppe" A kann sich zwischen
jedem Paar der ersten und zweiten Verbindungsgruppe oder zwischen der
Verbindungsgruppe La und der Kodierungsmarkierung befinden, wobei die
Abstandsgruppe A typischerweise eine isotope peakauftrennende Markierung enthält.
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Demgemäß kann eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung durch die
Formel:
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wiedergegeben werden, in der "Tag" eine Kodierungssequenz darstellt.
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In einer anderen bevorzugten Ausführungsform weist das Konstrukt eine
substrathaltige analytische Gruppe R-A, gebunden an den festen Träger durch eine
Verbindungsgruppe L¹, auf, die orthogonal in Bezug auf die Verbindungsgruppen L² und
L³ abspaltbar ist. Ein Konstrukt dieser Art kann durch die Formel wiedergegeben werden:
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In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Kodierungssequenz
weggelassen und das Mittel zum Identifizieren des Substrats durch die Gruppe R-A-L¹
bereitgestellt, die zum Bereitstellen des sensibilisierten Substrats für Analyse durch
Massenspektrometrie gespalten werden kann. Ein solches Konstrukt weist die Formel auf:
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In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stellt die Erfindung ein Konstrukt
zur Verwendung in einem Reihenfreisetzungsverfahren des Screenings wie vorstehend
beschrieben bereit, wobei das Konstrukt eine sensibilisierte Kodierungsmarkierung
enthält. Ein solches Konstrukt kann durch die Formel Tag-A-L¹-Q-L¹-A-L²-R
wiedergegeben werden.
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In anderen Ausführungsformen der Erfindung können die Konstrukte eine Formel
aufweisen, ausgewählt aus:
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in denen L¹, L², L³, A und R die vorstehend angegebene Bedeutung haben und "Tag" eine
Kodierungssequenz darstellt.
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Die Verbindungsgruppen L¹, L² und L³ sind orthogonal und selektiv spaltbar; d. h.
die zum Durchführen der Spaltung an der Spaltungsstelle in einer Verbindungsgruppe
verwendeten Bedingungen spalten nicht die andere. Eine große Reihe von
unterschiedlichen Arten von Spaltungsreaktionen kann verwendet werden, von denen
Beispiele Reaktionen sind, ausgewählt aus säurekatalysierter Spaltung, basenkatalysierter
Spaltung, oxidativer Spaltung, reduktiver Spaltung, nucleophilem Ersetzen, elektrophilem
Ersetzen und thermischer, photochemischer und enzymatischer Spaltung.
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So wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein chemisches Konstrukt wie
vorstehend definiert bereitgestellt, in dem die erste Spaltungsstelle (z. B. wie durch die
Verbindungsgruppe L¹ definiert) selektiv durch eine Art eines chemischen Verfahrens,
ausgewählt aus einer Reihe von chemischen Verfahren, bestehend aus Spaltung unter
sauren Bedingungen, basenkatalysierte Spaltung, oxidative Spaltung, reduktive Spaltung,
nucleophiles Ersetzen, elektrophiles Ersetzen und thermische, photochemische und
enzymatische Spaltung spaltbar, eine der zweiten Spaltungsstellen (z. B. wie durch die
Verbindungsgruppe L² definiert) ist selektiv durch eine zweite und unterschiedliche Art
eines chemischen Verfahrens, ausgewählt aus der genannten Reihe, spaltbar, und die
andere der zweiten Abspaltungsstellen (z. B. wie durch die Verbindungsgruppe L³
definiert) ist selektiv durch eine dritte und unterschiedliche Art eines chemischen
Verfahrens, ausgewählt aus der genannten Reihe, spaltbar.
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Irgendeine oder mehrere der Abspaltungsstellen/Verbindungsgruppen können von
der "Sicherungs"-Variante sein; d. h. die Abspaltungsstelle oder Verbindungsgruppe muss
in einem ersten Schritt chemisch modifiziert werden, bevor sie der Spaltung in einem
zweiten Schritt unterzogen werden kann. Ein Vorteil einer solchen Anordnung ist, dass sie
die Möglichkeit, dass die Spaltung unbeabsichtigt stattfindet, verhindert oder deutlich
verringert. Ein Beispiel eines "Sicherungs"-Mechanismus bezieht die Oxidation einer
funktionellen Gruppe in einem ersten Schritt ein, wobei die Oxidation dazu dient, die
funktionelle Gruppe zugänglicher für ein Ersetzen durch ein Nucleophil in einem
anschließenden Abspaltungsschritt zu machen. Das Nucleophil kann in der Struktur
beträchtlich variieren. Zum Beispiel kann in einer Ausführungsform das Nucleophil ein
eine Aminogruppe enthaltendes Nucleophil sein, wobei die Aminogruppe an der
nucleophilen Ersetzungswirkung beteiligt ist, so dass die Aminogruppe direkt an die
Spaltungsstelle gebunden wird. Alternativ kann in einer anderen Ausführungsform die
Aminogruppe (oder eine andere sensibilisierende Gruppe) in einem Rest (z. B. einem
Dialkylaminoalkylthiolatanion) vorhanden sein, der ein anderes Nucleophil, wie ein
Schwefelnucleophil, enthält, das an die Spaltungsstelle gebunden wird. In einer weiteren
Ausführungsform kann das Nucleophil eine Einheit sein, die ein basisches Stickstoffatom,
das als Nucleophil dient, und ein anderes basisches Stickstoffatom enthält, das als
Sensibilisierungsgruppe G dient, wobei ein solches Beispiel eines Nucleophils eine N-
Methylpiperazingruppe ist.
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Beispiele der Verbindungsgruppen, die selektiv unter sauren Bedingungen
gespalten werden können, schließen geeignet substituierte Benzyloxycarbonylgruppen und
substituierte Diphenylmethylaminogruppen ein, die beide durch Wirkung von
Trifluoressigsäure gespalten werden können.
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Bestimmte Beispiele der säurespaltbaren Verbindungsgruppen sind in The
Combinatorial Index, Barry A. Bunin, Academic Press, San Diego 1998 dargestellt.
Verbindungsgruppen des "Rink" oder "Knorr"-Typs umfassen typischerweise eine N-
geschützte 1-Amino-1,1-diphenylmethaneinheit, wobei die Aminogruppe, wenn von ihr
die Schutzgruppe abgespalten wird, ein Binden an ein Substrat ermöglicht, wobei einer der
Phenylringe zum Beispiel mit Dimethoxygruppen substituiert ist und der andere einen
Carboxyalkyloxysubstituenten aufweist, der einen zweiten Punkt der Bindung bereitstellt.
Eine Spaltung mit Trifluoressigsäure ergibt eine Substratverbindung mit einer
endständigen Carboxamidogruppe. Verbindungsgruppen des "Wang"-Typs enthalten
typischerweise eine substituierte Phenoxyacetylgruppe, wobei die Acetylgruppe einen
Punkt der Bindung bereitstellt, und eine benzylische Hydroxylgruppe am Phenylring, die
einen zweiten Punkt der Bindung bildet. Ester können zwischen einer Carboxylgruppe
eines Substrats und der benzylischen Hydroxylgruppe gebildet werden, wobei die
Estergruppen anschließend mit Trifluoressigsäure (TFA) unter Freisetzen einer
Substratverbindung mit einer endständigen Carboxylatgruppe spaltbar sind.
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Beispiele der Reste, die unter photochemischen Bedingungen selektiv gespalten
werden können, schließen Carbamatgruppen, wie o-Nitrobenzyloxycarbamatgruppen, ein,
in denen die anfängliche Spaltung zwischen den Benzyloxy- und Carbonylgruppen
stattfindet, wobei die Abspaltung von Kohlendioxid aus dem erhaltenen Fragment eine
basische Aminogruppe ergibt.
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Beispiele der Reste, die durch nucleophilen Ersatz gespalten werden können,
schließen "Sicherungs"-Verbindungsgruppen auf Mercaptopyrimidinbasis, wie 5-
Carboxy-2-mercaptopyrimidin, ein, in denen die Spaltung durch Umsetzung unter
Oxidationsbedingungen zum Erzeugen einer Sulfoxid- oder Sulfonbindung, gefolgt von
Umsetzung mit einer nucleophilen Aminogruppe zum Bilden eines 2-Aminopyrimidins
bewirkt werden kann. Besondere Beispiele der nucleophilen Gruppen, die zum Bewirken
der Spaltung von oxidierten Verbindungsgruppen auf Mercaptopyrimidinbasis verwendet
werden, können, schließen cyclische Amine, wie Piperidin und N-substituiertes Piperazin
(z. B. N-Methylpiperazin) und Aminogruppen enthaltende Thiolatnucleophile (z. B.
Dimethylaminoethylthiolat) ein. Beispiele der Oxidationsbedingungen sind jene erzeugten
Oxidationsmittel, wie Persäuren, z. B. eine Perbenzoesäure, wie m-Chlorperbenzoesäure,
und bestimmte anorganische Persalze, wie Kaliummonoperoxysulfat.
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Indem man die erste und zweite Spaltungsstelle, z. B. wie durch die ersten und
zweiten Verbindungsgruppen L¹ und L² oder L¹ und L³ definiert, orthogonal spaltbar
macht, ist es möglich, selektiv vom Konstrukt entweder das analytische Fragment oder das
Substrat R zu spalten, indem einfach unterschiedliche Spaltungsbedingungen verwendet
werden. Das bedeutet, dass während der Experimente, die zum Optimieren der
Bedingungen für einen bestimmten Reaktionsschritt entworfen sind, der Chemiker das
Konstrukt Bedingungen aussetzen kann, die zum Abspalten des analytischen Fragments
geeignet sind, wobei die Durchführung einer Analyse ermöglicht wird, um das Ergebnis
jeder Testreaktion zu bestimmen. Ähnlich kann während einer Reaktion im präparativen
Maßstab (z. B. eine Steigerungsreaktion oder kommerzielle Herstellung) eine
Qualitätskontrolle (QC) durch Entfernen einer Reihe von festen Trägern aus dem
Reaktionsbehälter, Spalten der Konstrukte an der ersten Spaltungsstelle und Analysieren
des erhaltenen Fragments, um zu erkennen, ob ein bestimmter Reaktionsschritt
funktionierte, durchgeführt werden. Andererseits wird durch Spalten an der zweiten
Spaltungsstelle, z. B. an der zweiten Verbindungsgruppe, und nicht an der ersten das
Reaktionsprodukt R vom festen Träger freigesetzt. So ist ein Vorteil der
erfindungsgemäßen Konstrukte, dass sie in sowohl experimentellem Maßstab zum
Optimieren eines bestimmten Verfahrensschritts als auch im präparativen Maßstab ohne
Modifizieren der Verbindungsgruppen verwendet werden können.
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In einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die Fragmente Fr, Fa oder Fb
und stärker bevorzugt die Abstandsgruppe A einen Alkylendiaminrest oder
Aminoalkoxyrest. Die genaue Größe des Alkylenrests und sein Grad der Substitution wird
gegenwärtig nicht als wichtig angesehen, aber bestimmte Beispiele sind Ethylen- oder
Propylendiamin oder Aminoalkoholgruppen, die substituiert oder unsubstituiert sein
können. Die Alkylendiamingruppe oder der Aminoalkohol enthält typischerweise eine
peakauftrennende isotope Markierung, wie vorstehend definiert. Die zwei Aminogruppen
können jeweils an die ersten bzw. zweiten Verbindungsgruppen gebunden werden. Zum
Erhöhen der Masse der Abstandsgruppe A oder zum Ändern ihrer Eigenschaften kann die
Alkylendiamingruppe mit einem Arylrest, zum Beispiel einem N-Arylrest, wie einer N-
Benzylgruppe, substituiert werden oder die Alkylenkette kann substituiert werden (zum
Beispiel mit einem oder mehreren Fluoratomen, um die Flüchtigkeit des analytischen
Fragments zu ändern). Der N-Arylrest kann gegebenenfalls mit einer oder mehreren
Substituentengruppen substitiuert werden.
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Wenn, wie bevorzugt, die Abstandsgruppe eine oder mehrere
massenspektralpeakauftrennende isotope Markierungen enthält, können sich diese entweder in der
Alkylenkette oder in einem an die Alkylenkette gebundenen Substituenten befinden. Zum
Beispiel kann eine an eine der zwei Aminogruppen in einem Alkylendiamin gebundene N-
Benzylgruppe eine Methylengruppe aufweisen, die mit dem peakauftrennenden Atom
Deuterium substituiert ist. In einer anderen Ausführungsform kann ein Arylring (z. B. eine
N-Benzylgruppe), der in einem Substituenten am Alkylendiamin vorhanden ist, mit einem
peakauftrennenden Bromatom substituiert sein, wobei ein bestimmtes Beispiel eines
Arylrests eine N-o-Brombenzylgruppe ist.
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Die Fragmente Fr, Fa oder Fb und insbesondere die Abstandsgruppe A, sowie die
Bereitstellung eines Mittels zur Identifikation unter Verwendung von
Massenspektrometrie, können auch mit einem oder mehreren zusätzlichen Sensibilisatoren
versehen werden, um eine Charakterisierung durch andere Analyseverfahren zu
ermöglichen. Zum Beispiel kann die Abstandsgruppe ein Chromophor enthalten, um eine
Charakterisierung durch ultraviolette (UV) oder Fluoreszenzspektroskopie zu
ermöglichen.
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Obwohl Alkylendiamin- und Aminoalkoholgruppen als spezielle Beispiele der
Abstandsgruppen aufgeführt sind, können alternative Abstandsgruppen verwendet werden.
Zum Beispiel können die Abstandsgruppen aus Kohlenwasserstoffketten gebildet werden,
die bis zu dreißig oder mehr Kohlenstoffatome in der Kette enthalten, die gegebenenfalls
durch ein oder mehrere Heteroatome, wie Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel,
unterbrochen werden können. Als weitere Alternative kann die Abstandsgruppe zum
Beispiel eine Peptidkette sein, die eine oder mehrere Aminosäuren enthält. Die genaue Art
und Länge der Abstandsgruppe wird gegenwärtig nicht als wichtig angesehen, mit der
Maßgabe, dass die Abstandsgruppe die Chemie des Konstrukts nicht beeinträchtigt.
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Der feste Träger Q kann jede Art von festem Träger sein, die zur Verwendung in
der Festphasensynthese und insbesondere kombinatorischen Chemie, geeignet ist. So kann
nur veranschaulichend der feste Träger die Form von Kügelchen, einer festen Oberfläche,
festen Substraten, Teilchen, Pellets, Scheiben, Kapillaren, Hohlfasern, Nadeln, festen
Fasern oder organischen oder anorganischen Gelen, wie Kieselgelen, und unlöslichen
organischen Teilchen, wie aus Fullerenen gebildeten Teilchen, annehmen.
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Beispiele der Kügelchen sind polymere Kügelchen, wie Cellulosekügelchen oder
Harzkügelchen, wobei besondere Beispiele der Substanzen, aus denen Harzkügelchen
hergestellt werden können, funktionalisierte Polymerharze, wie Polystyrolharze,
Polyacrylamidharze und Dimethylacrylamidharze einschließen. Beispiele geeigneter
Träger sind in The Combinatorial Index von Barry A. Bunin, vorstehend bezeichnet,
aufgeführt.
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In einem anderen Gesichtspunkt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Analyse der
vorstehend definierten Konstrukte bereit; wobei das Verfahren Spalten der Reste Y¹ und
Y² und gegebenenfalls des Rests Ya zur Freisetzung des chemischen Fragments Fr (und
gegebenenfalls der Fragmente Fa und Fb) und dann Massenspektrometrie der chemischen
Fragmente Fr und Fa, z. B. Elektrospray-Massenspektrometrie, umfasst.
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Die Analyse des Fragments Fr liefert Information über die Reaktionsgeschichte des
Konstrukts. So kann durch massenspektrometrische Analyse leicht bestimmt werden, ob
das gewünschte Substrat in einer festgelegten Reaktionssequenz gebildet würde oder
nicht. Eine Analyse des Fragments Fr kann daher nicht nur zur Charakterisierung des
Substrats oder des Produkts der Festphasen-Reaktionssequenz, sondern auch zum
Verfolgen des Fortschritts der Reaktionen verwendet werden.
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In einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung chemische
Zwischenkonstrukte zur Verwendung bei der Herstellung eines chemischen Konstrukts
wie vorstehend definiert bereit, wobei die Zwischenkonstrukte die Formeln Y¹'-Q-Y²',
RY¹-Q-Y²'
und Y¹'-Q-Y²R aufweisen, in denen Y¹' und Y²' eine reaktive oder geschützte
Form des Rests Y sind; und R, Q und Y die vorstehend angegebene Bedeutung aufweisen.
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In noch einem weiteren Gesichtspunkt stellt die Erfindung Zwischenkonstrukte der
Formeln L²'-A-L¹'-Q-L¹-Ap, R-L²-A-L¹-Q-L¹-Ap, L³'-A-L¹-Q-L¹-Ap, R-L³-A-L¹-Q-L¹-Ap,
R-L³-A-L¹-Q-L¹-A-L²', L³'-A-L¹-Q-L¹-A-L²-R bereit, wobei L¹'-, L²' und L³' reaktive
oder geschützte Formen der vorstehend definierten Verbindungsgruppen L¹, L² und L³'L
sind, Ap eine reaktive oder geschützte Form der Abstandsgruppe A ist, die eine
peakauftrennende isotope Markierung enthält, und Q, R, A, L¹, L² und L³ die vorstehend
angegebene Bedeutung aufweisen. In einer besonderen Ausführungsform weist der Rest
Ap die Formel NH-Alk-NX¹ auf, wobei Alk ein Alkylenrest ist und X¹ ein
Wasserstoffatom oder Aralkylrest ist. Das Zwischenkonstrukt ist vorzugsweise isotop mit
einer peakauftrennenden Kombination von Atomen, wie ¹H/²H (D), &sup7;&sup9;Br/&sup8;¹Br, ¹²C/¹³C,
¹&sup4;N/¹&sup5;N und ¹&sup6;O/¹&sup8;O, markiert.
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In jedem der vorstehend erwähnten Zwischenprodukte kann der feste Träger
gegebenenfalls daran gebunden eine Kodierungsmarkierungssequenz L¹-A-Tag und/oder
eine auf einem Substrat basierende Markierungssequenz R-A-L¹ - und Vorstufenformen
davon, wie L¹-Ap, aufweisen.
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Die Erfindung wird jetzt, aber nicht einschränkend, in Bezug auf die folgenden
Beispiele veranschaulicht.
Kurze Beschreibung der Figuren
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Fig. 1 veranschaulicht das Massenspektrum des Produkts der Spaltung, durch
Oxidation und nucleophiles Ersetzen, eines Konstrukts der Formel Q-L¹-A-L²-R, wobei R
eine Modellverbindung Benzamid ist, L¹ eine Thiopyrimidinverbindungsgruppe ist, A eine
N-Brombenzyl-substituierte Ethylendiamin-"peakauftrennende Gruppe" ist und L² eine
Verbindungsgruppe ist, die unter photochemischen Bedingungen spaltbar ist.
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Fig. 2 veranschaulicht das Massenspektrum des Konstrukts von Fig. 1 nach
photochemischer Spaltung der Verbindungsgruppe L² und anschließende
Oxidation/nucleophiles Ersetzen an der Verbindungsgruppe L¹.
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Fig. 3 veranschaulicht das Massenspektrum des Produkts der Spaltung durch
Oxidation und nucleophiles Ersetzen eines Konstrukts der Formel Q-L¹-A-Tag, wobei L¹
eine Thiopyrimidinverbindungsgruppe ist, A die gleiche peakauftrennende Gruppe, wie im
Konstrukt von Fig. 1 vorhanden, ist und Tag eine aus einem Tripeptid bestehende
Kodierungssequenz ist.
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Fig. 4 veranschaulicht das Massenspektrum des Spaltungsprodukts von Fig. 3,
in dem aber die Bedingungen im Massenspektrometer so eingestellt wurden, dass eine
Fragmentierung des Molekülions bei 716 a.m.u bewirkt wurde, um Peaks durch die
Konstrukte zu bewirken, in denen eine oder mehrere Aminosäuren vom Molekülion
verloren gingen.
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Fig. 5 veranschaulicht das Massenspektrum des Produkts der Spaltung durch
Oxidation und nucleophiles Ersetzen eines Konstrukts der Formel:
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in dem "Tag" eine Allyloxyglycinkodierungsgruppe darstellt, L¹, L² und A die für die
Konstrukte der Fig. 1 bis 4 angegebene Bedeutung haben und L³ eine
Verbindungsgruppe des "Rink"- oder "Knorr"-Typs ist, die durch Trifluoressigsäure
abspaltbar ist.
Beispiel 1 Schema 1
Experiment für Schema 1
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Eine Lösung von 4-(Chlormethyl)benzoesäure (0,27 g, 1,6 mmol), Benztriazol-1-
yloxytrispyrrolidinphosphonium-Hexafluorphosphat (PyBOP)® (0,83 g, 1,6 mmol) und
Diisopropylethylamin (0,56 ml, 3,2 mmol) in Dimethylformamid (8 ml) wurde 20
Minuten geschüttelt und dann zu TentaGelTMNH&sub2; (Rapp Polymere)-Harz 1 (1 g, 0,32
mmol) gegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 5 Stunden geschüttelt, gefolgt von
Ablaufenlassen des Harzes und Waschen mit Dimethylformamid, Dichlormethan,
Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether. Das Harz (2) wurde dann im
Vakuum getrocknet.
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Eine Aufschlämmung von Thioharnstoff (0,58 g, 7,7 mmol) in Dioxan (4 ml) und
Ethanol (1 ml) wurde zu Harz 2 (1 g, 0,32 mmol) gegeben und das Ganze 16 Stunden auf
80ºC erwärmt. Man ließ das Harz ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid (5 ·),
Dichlormethan (5 ·), Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether
gewaschen, wobei Harz 3 erhalten wurde. Das Harz wurde dann im Vakuum getrocknet.
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Eine Lösung von 2-(Dimethylaminomethylen)-3-oxybutansäuremethylester (0,17
g, 0,96 mmol) und Triethylamin (65 ml, 0,48 mmol) in Dimethylformamid (10 ml) wurde
zu Harz 3 (1 g, 0,31 mmol) gegeben und das Gemisch 16 Stunden auf 80ºC erwärmt. Man
ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan,
Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Das gewaschene
Harz (4) wurde im Vakuum getrocknet.
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Harz 4 (0,5 g, 0,15 mmol) wurde dann mit einem 1 : 1-Gemisch von
Tetrahydrofuran und 2 n wässrigem Natriumhydroxid (4 ml) behandelt und 2 Stunden
geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Tetrahydrofuran/H&sub2;O, 10
%iger Essigsäure/Tetrahydrofuran, Tetrahydrofuran/H&sub2;O, Tetrahydrofuran,
Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan, Diethylether gewaschen
und dann im Vakuum getrocknet, wobei Harz 5 erhalten wurde.
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Eine Lösung von PyBOP® (24 mg, 0,045 mmol) und Diisopropylethylamin (16 ml,
0,09 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) wurde zu Harz 5 (50 mg, 0,015 mmol) gegeben,
gefolgt von einer Lösung von 1-tert-Butoxycarbonyl-1-(o-brombenzyl)diaminoethan (15
mg, 0,045 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) und das Gemisch 3 Tage geschüttelt. Man
ließ das Harz ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan,
Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Eine Lösung von 95
%iger wässriger Trifluoressigsäure in Dichlormethan (20%, 1 ml) wurde dann zum Harz
gegeben und das Gemisch 2 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz ablaufen und es
wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan gewaschen
und dann mit 10% Diisopropylethylamin in Dimethylformamid für 10 Minuten
geschüttelt. Man ließ das Harz ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid,
Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Das
Harz (6) wurde dann im Vakuum getrocknet.
Beispiel 2
Experiment, den restlichen Arzneistoff auf dem Konstrukt nach Photolyse zu zeigen Schema 2
Experiment für Schema 2
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Eine Lösung von 4-[4-(1-(9-Fluorenylmethoxycarbonylamino)ethyl)-2-methoxy-5-
nitrophenoxy)butansäure (23 mg, 0,045 mmol), Diisopropylethylamin (16 ml, 0,09 mmol)
und 2-(1H-9-Azabenztriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-Hexafluorphosphat (17 mg,
0,045 mmol) in Dimethylformamid (2 ml) wurde zu Harz 6 (50 mg, 0,015 mmol) gegeben
und das Ganze 3 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz ablaufen, und es wurde mit
Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich
Diethylether gewaschen. Das Harz wurde dann mit 20% Piperidin in Dimethylformamid
(3 ml) behandelt und das Ganze 1 Stunde geschüttelt. Man ließ das Harz (7) dann ablaufen
und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und
schließlich Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
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Eine Lösung von Benzoesäure (11 mg, 0,09 mmol), Diisopropylethylamin (16 ml,
0,09 mmol) und 2-(1H-9-Azabenztriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-
Hexafluorphosphat (17 mg, 0,045 mmol) in Dimethylformamid (2 ml) wurde zu Harz 7
gegeen und das Gemisch 2 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz (8) dann ablaufen, und
es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und
schließlich Diethylether gewaschen.
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Eine Analyse des Produkts der Synthese wurde durch Aussetzen des
harzgebundenen Konstrukts an Thiopyrimidinspaltungsbedingungen (nachstehend
beschrieben), gefolgt von Analyse des Konstrukts durch Massenspektrometrie,
durchgeführt. Das Massenspektrum des Konstrukts ist in Fig. 1 gezeigt.
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Eine Lösung von 0,2% Hydrazinhydrat in Dimethylsulfoxid (0,1 ml) wurde zu
Harz 9 (2 mg, 0,6 mmol) gegeben und die Lösung 16 Stunden einer Photolyse ausgesetzt.
Das photolysierte Harz (9) ließ man dann ablaufen, und es wurde mit Dimethylsulfoxid,
Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen und
im Vakuum getrocknet. Das gewaschene Harz wurde Pyrimidinspaltungsbedingungen
(nachstehend beschrieben) unterzogen und das erhaltene Spaltungsprodukt durch
Massenspektrometrie analysiert. Das Massenspektrum ist in Fig. 2 gezeigt.
Allgemeines Verfahren der Konstruktanalyse von Harzen über die
Pyrimidinverbindungsgruppe
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Eine kleine Probe des Harzes (ca. 0,5 mg) wird mit 0,01 mol/l m-
Chlorperbenzoesäure (0,5 ml) für 2 Stunden behandelt. Man läßt das Harz dann ablaufen,
und es wird mit Dichlormethan, Diethylether und Dichlormethan gewaschen. Das Harz
wird dann mit 0,02 mol/l N-Methylpiperazin in Dimethylformamid (50 ml) behandelt und
das Gemisch 12 Stunden geschüttelt. Die Lösung wird dann entfernt und durch
Massenspektrometrie analysiert.
Beispiel 3
Identifikation einer sensibilisierten Sequenz von Aminosäuren Schema 3
Experiment für Schema 3
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Harz 10 wurde durch Umsetzung von Harz 7 mit den gewünschten 9-
Fluorenylmethoxycarbonyl-geschützten Aminosäuren, gefolgt von Abspalten der
Schutzgruppe und dann wiederholtes Koppeln an die nächste Aminosäure und
Schutzgruppenabspaltung (siehe allgemeines Verfahren) hergestellt. Die endständige
Aminogruppe wurde dann unter Verwendung von Essigsäureanhydrid (siehe
nachstehendes Verfahren) acyliert.
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Das erhaltene Harz wurde Pyrimidinspaltungsbedingungen (vorstehend
beschrieben), gefolgt von massenspektroskopischer Analyse, unterzogen. Das
Massenspektrum ist in Fig. 3 gezeigt. Mit Identifikation des Molekülions bei Masse 716
wurde das Massenspektrum wieder bei einer höheren Spannung durchgeführt, um eine
Fragmentierung und anschließende Spaltung der drei Aminosäuren zu bewirken. Das
Massenspektrum des fragmentierten Konstrukts ist in Fig. 4 gezeigt.
Allgemeines/typisches Verfahren zur Kopplung von Aminosäuren an eine
Verbindungsgruppe
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Eine Lösung der 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-geschützten Aminosäure (0,14
mmol, 10 Äqu.), Diisopropylcarbodiimid (22 ml, 0,14 mmol, 10 Äqu.) und N-
Hydroxybenztriazol (19 mg, 0,14 mmol, 10 Äqu.) in Dimethylformamid (1 ml) wurde
zum erforderlichen Harz 7 (30 mg, ca. 0,014 mmol) gegeben. Das Gemisch wurde dann 5
Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dichlormethan,
Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich
Diethylether gewaschen. Die 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Schutzgruppen wurden dann
durch die Behandlung der Harze mit 20%iger Piperidinlösung in Dimethylformamid (2
ml) und 30 Minuten Schütteln abgespalten. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es
wurde mit Dichlormethan, Dimethylformamid. Dichlormethan, Diethylether,
Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Das gewaschene Harz wurde im
Vakuum getrocknet.
Acetylierung der Dipeptide
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Eine Lösung von Essigsäureanhydrid (15 ml, 0,14 mmol) in Dichlormethan (1 ml)
wurde zu den Harzen (30 mg, ca. 0,014 mmol) gegeben, gefolgt von 4-
Dimethylaminopyridin (1 mg, 0,008 mmol), und das Gemisch 2 Stunden geschüttelt. Man
ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dichlormethan, Dimethylformamid,
Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen. Das
gewaschene Harz wurde im Vakuum getrocknet.
Beispiel 4
Herstellung des Differentialfreisetzungsharzes 11 Schema 4
Experiment für Schema 4
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Harz 7 (0,1 g, 0,03 mmol) wurde mit einer Lösung von 9-
Fluorenylmethoxycarbonylglycin (36 mg, 0,12 mmol), N-Allyloxycarbonylglycin (5,2 mg,
0,03 mmol), PyBOP (78 mg, 0,15 mmol) und Diisopropylethylamin (52 ml, 0,3 mmol) in
Dimethylformamid (1 ml) behandelt und das erhaltene Gemisch 3 Stunden geschüttelt.
Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit Dimethylformamid, Dichlormethan,
Diethylether, Dichlormethan und schließlich Diethylether gewaschen und im Vakuum
getrocknet.
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Das so hergestellte Harz wurde mit 20% Piperidin in Dimethylformamid (2 ml)
behandelt und 30 Minuten vor Ablaufen und Waschen wie vorstehend beschrieben
geschüttelt. Das Harz wurde dann mit einer Lösung von 4-[4-(1-(9-
Fluorenylmethoxycarbonylamino)ethyl)-2-methoxy-5-nitrophenoxy)butansäure (39 mg,
0,075 mmol), p-[(R,S)-α-[1-(9H-Fluoren-9-yl)methoxyformamido]-2,4-
dimethoxybenzyl]phenoxybutansäure (43 mg, 0,075 mmol), PyBOP (78 mg, 0,15 mmol)
und Diisopropylethylamin (52 ml, 0,3 mmol) in Dimethylformamid (1 ml) behandelt und
das Gemisch 3 Stunden geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde mit
Dimethylformamid, Dichlormethan, Diethylether, Dichlormethan und schließlich
Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
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Das Harz wurde dann mit 20% Piperidin in Dimethylformamid (2 ml) behandelt
und 30 Minuten geschüttelt. Man ließ das Harz dann ablaufen, und es wurde wie
vorstehend gewaschen. Das Harz wurde dann mit einer Lösung von Benzoesäure (18 mg,
0,15 mmol), 2-(1H-9-Azabenzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium-
Hexafluorphosphat (57 mg, 0,15 mmol) und Diisopropylethylamin (52 ml, 0,3 mmol) in
Dimethylformamid (1 ml) behandelt und das Ganze 2 Stunden geschüttelt. Man ließ das
Harz dann ablaufen, und es wurde wie vorstehend gewaschen.
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Das Produktharz wurde Pyrimidinspaltungsbedingungen (vorstehend beschrieben),
gefolgt von massenspektroskopischer Analyse, unterzogen, und das so erhaltene
Massenspektrum ist in Fig. 4 gezeigt.
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Es ist leicht zu erkennen, dass zahlreiche Modifikationen und Änderungen für die
in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Konstrukte ohne Abweichen von den der
Erfindung zugrunde liegenden Prinzipien gemacht werden können, und alle solchen
Modifikationen und Änderungen sollen durch die angefügten Patentansprüche
eingeschlossen sein.