DE69839160T2

DE69839160T2 - Verfahren zur herstellung eines spezifischen antiserums gegen das universelle tumor-antigen und verfahren zur diagnose von bösartigen tumoren, welches dieses antiserum verwendet

Info

Publication number: DE69839160T2
Application number: DE69839160T
Authority: DE
Inventors: Valentin Sergeevich Moscow ERKHOV
Original assignee: Widnes Co Inc
Current assignee: Widnes Co Inc
Priority date: 1998-04-20
Filing date: 1998-05-18
Publication date: 2009-02-26
Anticipated expiration: 2018-05-19
Also published as: ES2300123T3; DE69839160D1; EP1072272A4; WO1999053952A1; KR20010034791A; US7160686B1; KR100581553B1; US20070099253A1; RU2149023C1; CA2330639A1; JP4322424B2; EP1072272A1; JP2002512359A; EP1072272B1; AU8891698A; CA2330639C

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin, insbesondere die Onkologie, ihre Gebiete und die Diagnose von bösartigen Tumoren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein kurzer Überblick der Immundiagnose in der Onkologie zeigt das Folgende. 1949 wurde es von L. A. Zilber zuerst erwähnt und 1957 wurde von T. Pran und G. Main bewiesen, dass bösartige Zellen ihre eigenen Antigene haben.
Gemäß Abilev gibt es 4 Gruppen von Antigenen.

1) Virale Tumorantigene. Sie sind für jeden viralen Tumor dieses Typs identisch.
2) Karzinogene Tumorantigene. Sie sind individuell für Patienten ebenso wie für Tumore.
3) Isoantigene vom Transplantationstyp oder tumorspezifische Transplantationsantigene. Sie sind verschieden bei allen individuellen Typen von Tumoren, die von chemischen Mitteln hervorgerufen wurden. Und sie sind dieselben bei verschiedenen Tumoren, die vom selben Virus verursacht wurden.
4) Embryonale Antigen

Im Verlauf der Karzinogenese werden die Zellen zur Dedifferenzierung gebracht, somit nehmen sie eine embryonale Struktur an. In ihnen können embryonale Antigene gefunden werden, die für die embryonale Entwicklung von Organismen spezifisch sind. Diese Antigene können den Organismus gegen Tumore immunisieren. Die besser untersuchten Antigene sind die folgenden: α-Fötoprotein und das embryonale Krebsantigen (CEA). Das erstere wird bei Karzinomen der Leber gefunden, das letztere bei Adenokarzinomen des Darms, Magens, der Speiseröhre und des Pankreas.
Kinder, die Neuroblastome, Lymphosarkome oder Hirntumore haben, haben das α₂-Fötoprotein. Diejenigen, die ein Magenkarzinom haben, haben das fötale Sulfoglycoprotein. Die vorstehend erwähnten Antigene liegen innerhalb der Zellmembran oder zirkulieren im Blut.
Es existiert eine spezifische Gruppe von Antigenen, die so genannten heterospezifischen Antigene. Sie konnten nicht als für den Organismus heterolog klassifiziert werden, weil sie außer in Tumoren auch in anderen normalen Geweben existieren. Unter den heterospezifischen Antigenen gibt es ein Nierenantigen, das als Norm in der Niere und im Lebertumor-Hepatom existiert.
Das Adenokarzinom der Niere enthält ein Antigen der Lunge und der Leber.
Die immunologische Diagnose von bösartigen Tumoren basiert auf dem Nachweis der vorstehend erwähnten Antigene und der Antikörper dagegen im Blut eines Individuums und auf dem Nachweis von Lymphocyten, die für die Tumorantigene sensibilisiert sind.
Verfahren für die Diagnose von Lymphosarkom und Neuroblastom basieren auf dem Nachweis von α-Fötoprotein. (Auf dem Nachweis von Antikörpern gegen CEA – vgl. das Verfahren im Patent RU, 2077725 , G. 01 N 33/53).
Für den Nachweis von heterogenen Antigenen vgl. Patent RU N 2063768, 1991 , A 61K 39/00, Patent RU N 2025734 , MPK G 01 N33/53, Autorenzertifikat USSR N 170922, Autorenzertifikat N 1589215.
In dem Autorenzertifikat N 1805392 (G 01 N 33/53) wird das Verfahren für die Diagnose von Krebs mit Lymphocytenantigenen (H_la-b 35) beschrieben.
In der Tat ist kein Test des existierenden Niveaus der Diagnose universell. Der Nachweis von Antikörpern im Blut ist ein weniger zuverlässiger Test, denn im menschlichen Blut gibt es ein breites Spektrum von Antitumor- und Gewebeantikörpern. Es existiert kein Verfahren für den Nachweis des spezifischen universellen Tumorantigens.
Eine Perspektive auf diesem Gebiet offenbart sensibilisierte Lymphocyten, die das Wachstum von bösartigen Zellen inhibieren. Aber sie sind nur gegen "ihren eigenen" Typ von Tumor aktiv.
Somit erfüllen die verwendeten Verfahren für die immunologische Diagnose von Tumoren nicht bei allen Aspekten die Erfordernisse der primären Diagnose von Tumoren, sie sind völlig ungeeignet beim Screening auf bösartige Neoplasmen und auf Hochrisikogruppen. Somit können sie nur zu einem gewissen Grad für die Immunbeobachtung der Heilung von bösartigen Tumoren verwendet werden.
Das Fehlschlagen der existierenden Verfahren kann durch die Tatsache erklärt werden, dass die verwendeten Antiseren gegen Antigene von bösartigen Tumoren ihre eigenen Charakteristika nicht erfüllen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Das Ziel der Erfindung ist die Produktion eines Antiserums gegen (ein) universelle(s) Tumorantigen(e) unabhängig vom Tumor und Organtyp.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren für die Produktion eines spezifischen Antiserums für spezifische Lymphocyten, welches die Entnahme von Gewebeproben, den Erhalt einer zellulären Suspension, die Immunisierung von Tieren, die Entnahme von Blutproben aus den immunisierten Tieren, den Erhalt des spezifischen Antiserums aus den immunisierten Tieren einschließt, gekennzeichnet durch:

– Entnahme von Gewebeproben eines Embryos eines Tieres in der fötalen Phase zum Erhalt der zellulären Suspension,
– Ausführung einer ersten Immunisierung durch Immunisieren eines Tieres derselben genetischen Linie mit der zellulären Suspension,
– Gewinnung von Milzzellen aus dem immunisierten Tier und Abtrennung der Lymphocyten, um eine Lymphocytensuspension zu erhalten,
– Ausführen einer weiteren Immunisierung durch Immunisieren von Tieren derselben genetischen Linie mit der Lymphocytensuspension durch die wiederholte Verabreichung der Lymphocytensuspension in Intervallen an die Tiere,
– Gewinnung eines Antiserums von den Tieren, welche in den späteren Immunisierungen immunisiert wurden,
– Zugabe von Zellen intakter Organe der Tiere zu dem Antiserum und Filtrierung des Antiserums,
– mit der Maßgabe, dass der Embryo, welcher benutzt wird, kein menschlicher Embryo ist.

Der Prototyp des beanspruchten Verfahrens für die Produktion eines spezifischen Antiserums ebenso wie das Verfahren für die Diagnose unter Verwendung des Antiserums ist das Verfahren, das in dem Patent RU N2063768 , 1991, IPC, A 61 K 39/00 beschrieben ist. Dieses Verfahren umfasst die Entnahme von Tumorgewebeproben von toten Menschen, ihr Einfrieren, den Erhalt einer Zellsuspension, die Zelldispersion und das Abgießen, die Extraktion von Antigenen aus dem flüssigen Überstand, die Immunisierung von Tieren mit dem Extrakt, die Gewinnung von Blut von den immunisierten Tieren, den Erhalt des Produkts daraus, das Zur-Reaktion-Bringen des spezifischen Antiserums mit dem Blut des Individuums, wobei als Resultat ein Tumor diagnostiziert wird.
Das beanspruchte Verfahren erlaubt den Erhalt eines Antiserums für den Idiotyp des T-Zell-Rezeptors, der in bösartigen Tumoren funktioniert. Es wird ein anti-idiotypisches anti-embryonales Serum erhalten, welches die Diagnose aller Typen von Tumoren zulässt, unabhängig von ihrem Ursprung und ihrem Ort.
Um das Verfahren für die Produktion des spezifischen Antiserums durchzuführen, ist es erforderlich, eine Immunisierung in zwei Stufen durchzuführen.
Dies umfasst die Entnahme von Proben von einem Embryo in der fötalen Phase von Tieren desselben genetischen Typs, ihre Dispersion, den Erhalt einer Zellsuspension. Dann wird das Tier derselben genetischen Linie mit der Zellsuspension immunisiert. Nach der Immunisierung ist es erforderlich, Milzzellen von dem Tier zu gewinnen und mit einem Dichtegradienten von 1,065–1,079 die Lymphocyten von der Zellsuspension abzutrennen. Unter Verwendung der vorstehend erwähnten Lymphocyten ist es erforderlich, eine mehrfache Immunisierung von syngen intakten Tieren durchzuführen und dann unter Verwendung von Standardverfahren das Antiserum von ihnen zu erhalten. Dieses Antiserum sollte filtriert werden (der ungefähre Porendurchmesser bei den Filtern ist 20 µm).
Das gewonnene Antiserum induziert eine Ausfällungsreaktion bei verschiedenen Arten von Tumoren, die von verschiedenen Menschen und verschiedenen Organen erhalten worden waren.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt auf der Basis des gewonnen Antiserums die Entwicklung von Verfahren für die Diagnose von bösartigen Tumoren.
Die wohl bekannten analogen Verfahren für die Diagnose von Tumoren besitzen keine ausreichend hohe Sensitivität. Selbst die effektiveren unter ihnen haben das Sensitivitätsniveau von nicht mehr als 40–60%. Solch ein niedriges Niveau von wohl bekannten onkologischen immundiagnostischen Tests kann so erklärt werden, dass die onkologischen Marker, die bei den Reaktionen verwendet werden, in der Tat ihre eigenen Charakteristika nicht erfüllen. Sie sind organspezifische oder onkofötale Antigene, charakteristisch für individuelle Organismen oder Organsysteme innerhalb einer Norm. Dies führt zu folgendem: eine erwartete universelle immunologische Äußerung der einzigen Besonderheiten des Tumorbildungsmechanismus wird durch die individuelle Charakteristik von nicht tumoralen Zuständen (Entzündung, Kollagenose) ersetzt.
Von organspezifischen Antikörpern ist gut bekannt, dass sie nicht mit der tumoralen Zelltransformation in Verbindung stehen. Dies ergibt einen hohen Prozentsatz an pseudopositiven Resultaten bei der Diagnose von bösartigen Tumoren.
Das vorgeschlagene Verfahren für das Auffinden von onkologischen Markern unterscheidet sich wesentlich von den wohl bekannten, indem es einen universellen hochspezifischen antigenen Marker für das Tumorwachstum offenbart, der während der gesamten Periode der Tumorentwicklung erhalten bleibt.
Das Verfahren beruht auf den Resultaten der theoretischen und experimentellen Arbeiten des Autors, in denen nachgewiesen wurde, dass in histologisch unterschiedlichen Zellen von bösartigen Tumoren ein stabiler Faktor bei der Tumorentwicklung funktioniert, der die embryonenspezifischen Antigene auf der Oberfläche erkennt. Es wird bewiesen, dass der Mechanismus auf der Basis der Phänomene der Tumorbildung (Unsterblichkeit und Vermehrung) stattfindet.
Um das Verfahren der Diagnose von Tumoren durchzuführen, ist es notwendig, unter Verwendung des vorgeschlagenen Verfahrens das spezifische Antiserum zu gewinnen und das Antiserum gegen spezifische Lymphocyten in eine immunologische Reaktion mit Geweben oder einer physiologischen Flüssigkeit des Individuums zu bringen. Danach wird der Tumor durch eine Immunfluoreszenzreaktion oder durch Bluttests diagnostiziert. Als Gewebe können Gewebe des Tumors bei der Immunfluoreszenzreaktion oder der Bluttest des Individuums verwendet werden.
Die Tumordiagnose wird mittels statistisch zuverlässiger Unterschiede der Reaktionsergebnisse zwischen Versuchs- und Kontrolltests bewiesen.
Zum Erhalten des Bluttests (ESR; Erythrocytensedimentationsrate) sollte die folgende Formel für die Berechnung der Unterschiede zwischen den Versuchs- und Kontrolltests verwendet werden:
wobei für α, den Diagnosekoeffizienten, bei Vorliegen eines Tumors α ≥ 1,5 gilt.

A – Definition des Bluttests beim Versuchstest (das Antiserum gegen das Tumorantigen wird zu dem mit Citrat behandeltem Blut des Individuums zugegeben)
B₁ und B₂ – Definition des Bluttests bei den Kontrolltests (das Serum desselben Tieres, das zur Gewinnung des Antiserums verwendet wurde, wird zu dem mit Citrat behandeltem Blut des Individuums zugegeben)
X – Maximalwert des Bluttests im Test
A oder der Mittelwert von B₁ und B₂, welcher
ist.

VARIANTEN DER DURCHFÜHRUNG DER ERFINDUNG
Ein Beispiel für ausführende Verfahren für die Diagnose von bösartigen Tumoren.
Ein Embryo im fötalen Stadium wird von Ratten der Wister-Linie von 300–500 g Gewicht entnommen. Das Gewebe des Embryos wird in Medium 199 mit dem folgenden Verhältnis von Volumen und Gewebe zu Medium 199 dispergiert: 1:5. Die erhaltene Suspension wird für wöchentliche Immunisierung von intakten Ratten der Wister-Linie verwendet.
Nach einem Zeitraum von 1,5 Monaten werden den Tieren Milzzellen entnommen, dispergiert und mit einem Ficoll-Verogratin-Dichtegradienten von 1.065–1.079 werden Lymphocyten gewonnen.
Mit den Lymphocyten wird die Suspension gewonnen: Medium 199 mit einem Verhältnis 1:1, das wöchentlich in andere intakte Ratten gegeben wird. Nach fünf Immunisierungen werden die Ratten getötet, ihr Blut wird entnommen, "aufgehellt", das Antiserum wird daraus gewonnen und filtriert. Mit dem vorstehend erwähnten Antiserum wurde bei den nachstehend erwähnten Patientengruppen der Bluttest durchgeführt. Zur Durchführung des Bluttests wurde die Standardkapillare mit einem Innendurchmesser von etwa 0,8 mm verwendet. 800 mcl von frischem venösem Gesamtblut, die während der Analyse entnommen wurden, werden nicht später als 20 Sekunden nach dem Zeitpunkt der Entnahme zu 200 mcl 5%-iger Natriumcitrat-Pufferlösung zugegeben. Die Analyse sollte innerhalb von 60 Minuten nach dem Mischen des Bluts und des Konservierungsmittels durchgeführt werden. Die Analyse sollte im Falle von Hämolyse oder Koagulation nicht durchgeführt werden. Das Blut sollte in 3 Teile von jeweils 70 mcl aufgeteilt werden und die Teile sollten in drei separate Teströhrchen gegeben werden. Einem Teil sollte das Testserum (mit Antikörpern) zugegeben werden, den beiden anderen sollte ein Kontrollserum (ohne Antikörper) zugegeben werden, jeweils 20 mcl. Die Seren sollten direkt zu dem Blut mit Konservierungsmittel zugegeben werden, nicht an die Wände. Die Kapillaren sollten von derselben Größe sein. Die Gemische werden gemischt und bis zur Füllmarke 5/0 in die Kapillaren gefüllt. Sie werden 60 Minuten so belassen. 60 Minuten später sollen die Indices abgelesen und gemäß der vorstehend erwähnten mathematischen Formel berechnet werden.
Das Antiserum, das mit dem Verfahren unter Verwendung von Ratten der Wistar-Linie gewonnen wurde, wurde für die Diagnose von Krankheiten bei gewissen Patienten verwendet.
Beim Bluttest eines Patienten K., Geburtsjahr 1942,
d-s: Mastdarmkarzinom, die erhaltenen Resultate waren die folgenden:
A = 25, B₁ = 28, B₂ = 28
Gemäß der mathematischen Formel wurde der Koeffizient α berechnet:
1,7 > 1,5, das heißt, dass die Diagnose bösartiger Tumor bestätigt wurde.
Beim Bluttest eines Patienten mit einem Fibrom des Ohrläppchens ("lobule of the auricle") waren die Resultate wie folgt:
A = 10, B₁ = 12, B₂ = 12
Gemäß der mathematischen Formel wurde der Koeffizient α berechnet:
α < 1,5, das heißt, dass die Diagnose gutartiger Tumor bestätigt wurde.
Nachstehend sind die Resultate der Untersuchung einer Gruppe von Patienten, die bösartige Tumore haben.

Komedokarzinom – 125 Patienten
Sensitivität 83,2%
Lungenkarzinom – 247 Patienten
Sensitivität 98,1%
Magenkarzinom – 156 Patienten
Sensitivität 85,2%
Colonkarzinom – 23 Patienten
Sensitivität 85,2%
Mastdarmkarzinom – 27 Patienten
Sensitivität 92,5%
Struma maligna – 58% Patienten
Sensitivität 79,5%
Nierenkarzinom 38 Patienten
Sensitivität 78,6%
Gebärmutterkarzinom – 412 Patienten
Sensitivität 75,0%
Gebärmutterhalskarzinom – 41 Patienten
Sensitivität 81,8%

Kontrollgruppe

Fast gesund – 400 Patienten
Sensitivität 5,1%
Fibrotische Mastopathia cystica – 221 Patienten
Sensitivität 8,3%
Gastritis – 120 Patienten
Sensitivität 6,2%
Magengeschwür – 62 Patienten
Sensitivität 8,3%
Kollagenose – 40 Patienten
Sensitivität 6,5%
Lungenentzündung – 40 Patienten
Sensitivität 7,2%
(akut und chronisch)
Prostatitis 18 Patienten
Sensitivität 2,1%
Chronische Kolitis – 115 Patienten
Sensitivität 4,2%

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Schlussfolgerung: Das vorgeschlagene Verfahren besitzt eine Sensitivität von nicht weniger als 92,4%, es ist ein hoch effizienter diagnostischer Test.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines spezifischen Antiserums für spezifische Lymphocyten, welches die Entnahme von Gewebeproben, den Erhalt einer zellulären Suspension, die Immunisierung von Tieren, die Entnahme von Blutproben aus den immunisierten Tieren, den Erhalt des spezifischen Antiserums aus den immunisierten Tieren, einschließt, gekennzeichnet durch: – Entnahme von Gewebeproben eines Embryos eines Tieres in der fötalen Phase zum Erhalt der zellulären Suspension, – Ausführen einer ersten Immunisierung durch das Immunisieren eines Tieres derselben genetischen Linie mit der zellulären Suspension, – Gewinnung von Milzzellen aus dem immunisierten Tier und Abtrennung der Lymphocyten, um eine Lymphocytensuspension zu erhalten, – Ausführen einer weiteren Immunisierung durch das Immunisieren von Tieren derselben genetischen Linie mit der Lymphocytensuspension durch die wiederholte Verabreichung der Lymphocytensuspension in Intervallen an die Tiere, – Gewinnung eines Antiserums von den Tieren, welche in den späteren Immunisierungen immunisiert wurden, – Zugabe von Zellen intakter Organe der Tiere zu dem Antiserum und Filtrierung des Antiserums, – mit der Maßgabe, dass der Fötus, welcher benutzt wird, kein menschlicher Fötus ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Filtrierung durch eine Filtration durch poröse Filter ausgeführt wird und die Trennung des Überstandes von den Sedimenten ermöglicht.
Verfahren zur Diagnose bösartiger Tumore unter Verwendung des spezifischen Antiserums, welches in einem der Ansprüche 1 oder 2 erhalten wurde, gekennzeichnet durch: – Zugabe des Antiserums zu einer Gewebeprobe, Blut oder anderen physiologischen Flüssigkeiten eines zu untersuchenden Individuums, – Anwendung eines Immunnachweisverfahrens auf das erhaltene Gemisch, und – Bestimmung der Anwesenheit eines bösartigen Tumors durch Abweichung des Testresultats von Kontrolltests.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Immunnachweisverfahren ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Immunfluoreszenztest oder einem Erythrocytensedimentationstest.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Ergebnis des Erythrocytensedimentationstests ermittelt wird durch die Formel:
wobei: der Diagnosekoeffizient alpha α einen Tumor anzeigt, wenn α ≥ 1,5, A ESR-Index des Versuchstests, B₁ und B₂ ESR-Index der Kontrolltests, X Maximalwert der ESR im Test A oder der Mittelwert von B₁ und B₂, welcher
ist.
Diagnosemittel, umfassend das spezifische Antiserum für spezifische Lymphocyten, welches durch das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 erhalten wird.
Verwendung eines spezifischen Antiserums für spezifische Lymphocyten, welches durch das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 erhalten wird, für die Herstellung eines Diagnosemittels zum Nachweis bösartiger Tumore.