DE69838175T2

DE69838175T2 - Plasmide aus ammonium oxidierenden bakterien und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69838175T2
Application number: DE69838175T
Authority: DE
Inventors: Hisao Higashihiroshima-shi OHTAKE; Junichi Higashi-Hiroshima KATO; Yosuke c/o Sumitomo Chemical Company Konohana-ku NAKAMURA
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1997-02-07
Filing date: 1998-02-04
Publication date: 2008-04-17
Anticipated expiration: 2018-02-05
Also published as: CA2280893C; WO1998035050A1; US6350577B1; CA2280893A1; EP1016725A1; EP1016725A4; DE69838175D1; EP1016725B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Plasmide, die von Ammonium-oxidierenden Bakterien stammen, und die Verwendung derselben.
Ammonium-oxidierende Bakterien, die zu chemoautotrophen Bakterien gehören, sind Mikroorganismen, die Energie, die für ihren Lebensablauf nötig ist, nur durch eine biologische Reaktion beim Oxidieren von Ammonium in salpetrige Säure erhalten. Die Ammonium-oxidierenden Bakterien haben eine wichtige Rolle im Stickstoff-Kreislauf in der Natur. Zusätzlich sind sie auch als Mikroorganismen, die den Nitrierungsvorgang als die Hauptreaktion der Stickstoffeliminierung in der biologischen Behandlung von menschlichem Abwasser, Haushalts-Abwasser und industriellem Abwasser durch das Belebtschlammverfahren („activated sludge process") vermitteln, wichtig. In den vergangenen Jahren hat es eine Tendenz gegeben, eine Verbesserung in der Effizienz der Stickstoffeliminierung in der obigen biologischen Behandlung von Abwasser aus der Sicht der Vermeidung einer Eutrophierung von Gewässern zu fordern, und die Funktion von Ammonium-oxidierenden Bakterien hat viel Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Ammonium-oxidierende Bakterien zeigen jedoch eine extrem niedrige Geschwindigkeit in der Oxidierung von Ammonium und im Wachstum, weil sie im Gegensatz zu den gewöhnlichen aeroben heterotrophen Mikroorganismen Energie nicht durch oxidativen Abbau von organischem Material erhalten können. Zusätzlich sind Ammonium-oxidierende Bakterien empfindlich gegenüber der Wachstumsinhibition durch verschiedene organische chemische Substanzen oder Metall-Elemente, sodass der Grad der Stickstoffeliminierung leicht gesenkt werden kann, wenn schädliches Material während der biologischen Behandlung von Abwasser in das einfließende Roh-Abwasser gemischt wird.
Als ein Mittel zum Überwinden der obigen Defekte von Ammonium-oxidierenden Bakterien kann eine genetische Rekombinationstechnik verwendet werden, die eine Technik zum Übertragen eines geeigneten fremden Genfragments auf Ammonium-oxidierende Bakterien zum Verbessern der Funktion von Genen ist, die Enzyme codieren, die mit der Ammonium-Oxidierung assoziiert sind und die auf den Chromosomen von Ammonium-oxidierenden Bakterien existieren, gefolgt von der Expression dieser Fragmente, oder zum Übertragen von Enzym-Genen auf Ammonium-oxidierende Bakterien ist, wobei diese Gene Enzyme codieren, die eine entgiftende Wirkung von schädlichen Substanzen für die Ammonium-oxidierenden Bakterien zeigen, gefolgt von der Expression dieser Gene. Es ist jedoch bis jetzt kein Vektorsystem etabliert worden, für das Ammonium-oxidierende Bakterien als ein Wirtsorganismus verwendet werden; daher kann eine solche genetische Rekombinationstechnik nicht ausgeführt werden. Es hat eine große Nachfrage für die Entwicklung von Vektorsystemen gegeben, für die Ammonium-oxidierende Bakterien als ein Wirtsorganismus verwendet werden.
Unter diesen Umständen haben die hier genannten Erfinder umfangreiche Untersuchungen durchgeführt. Als ein Ergebnis haben sie Plasmide gefunden, die in den Zellen von Ammonium-oxidierenden Bakterien replizierbar sind, und dadurch die vorliegende Erfindung vervollständigt.
So liefert die vorliegende Erfindung:

1) Ein Plasmid, gekennzeichnet dadurch, dass es die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 hat (wobei das Plasmid hierin nachstehend als das vorliegende Plasmid S bezeichnet wird).
2) Ein Plasmid, gekennzeichnet dadurch, dass es die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 hat (wobei das Plasmid hierin nachstehend als das vorliegende Plasmid L bezeichnet wird).
3) Ein Plasmid, gekennzeichnet dadurch, dass es mindestens die Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOs: 1 und/oder 2 hat und darüber hinaus ein Selektionsmarker-Gen enthält, gekennzeichnet dadurch, dass es in Zellen sowohl der Ammonium-oxidierenden Bakterien, die zur Gattung Nitrosomonas gehören, als auch von Escherichia coli replizierbar sind (wobei das Plasmid hierin nachstehend als das vorliegende chimäre Plasmid bezeichnet wird).
4) Ein Plasmid gemäß Punkt 3, gekennzeichnet dadurch, dass es etwa 7,6 Kilobasenpaare umfasst und durch die Restriktionskarte, die in 3 gezeigt ist, repräsentiert wird.
5) Eine Transformante, gekennzeichnet dadurch, dass sie durch Übertragen von mindestens einem Plasmid gemäß irgendeinem der Punkte 1 bis 4 in einen Wirtsorganismus erhalten wird.
6) Ein Verfahren zum Nachweis von Ammonium-Ionen in einer wässrigen Lösung, gekennzeichnet dadurch, dass eine Transformante, die durch Transfer eines Plasmids gemäß Punkt 3 oder 4, das darüber hinaus ein von einem lumineszierenden Organismus stammendes Gen umfasst, das ein Protein codiert, das mit Biolumineszenz assoziiert ist, vorzugsweise ein Luciferase-Gen, in Ammonium-oxidierende Bakterien erhalten wird, sowohl mit einer wässrigen Probenlösung als auch einem Substrat für die Biolumineszenz in Kontakt gebracht, und die Biolumineszenz der Transformante gemessen wird.
7) Ein Verfahren zum Herstellen von Ammonium-oxidierenden Bakterien, die eine Resistenz gegen Nitrifizierungs-inhibierende Substanzen haben, gekennzeichnet dadurch, dass ein Plasmid gemäß Punkt 3 oder 4, das darüber hinaus ein Gen, das ein Enzym codiert, das Nitrifizierungs-inhibierende Substanzen katabolisiert, vorzugsweise ein Xylol-Katabolisierungsgen umfasst, in Ammonium-oxidierende Bakterien übertragen wird, um eine Transformante zu erhalten.
8) Ein Verfahren zum Verstärken der Fähigkeit von Ammonium-oxidierenden Bakterien, Ammonium zu oxidieren, gekennzeichnet dadurch, dass ein Plasmid gemäß Punkt 3 oder 4, das darüber hinaus ein Gen, das ein Enzym codiert, das mit Ammonium-Oxidierung assoziiert ist, vorzugsweise ein Ammonium-Monooxygenasegen oder ein Hydroxylaminoxid-Reduktasegen umfasst, in Ammonium-oxidierende Bakterien übertragen wird, um eine Transformante zu erhalten.

1 ist ein Diagramm, das die Restriktionskarte von Plasmid pAYS zeigt. Der Teil, der durch die dicke Linie in der Figur repräsentiert wird, zeigt eine Region an, die hochgradig homolog mit Plasmid pAYL ist.
2 ist ein Diagramm, das die Restriktionskarte von Plasmid pAYL zeigt. Der Teil, der durch die dicke Linie in der Figur repräsentiert wird, zeigt eine Region an, die hochgradig homolog mit Plasmid pAYS ist.
3 ist ein Diagramm, das die Restriktionskarte des Chimeren-Plasmids pAY3 zeigt. In der Figur zeigt Km ein Kanamycinresistenz-Gen; Amp ein Ampicillinresistenz-Gen; und ori den Replikationsursprung von Escherichia coli an.
4 ist ein Diagramm, das die Vorgehensweisen für die Konstruktion des Chimeren-Plasmids pAY3. In der Figur zeigt Km das Kanamycinresistenz-Gen; Amp das Ampicillinresistenz-Gen; und ori den Replikationsursprung von Escherichia coli an.
Das Folgende wird die vorliegende Erfindung im Detail beschreiben.
Die vorliegenden Plasmide S und L sind jene, die von Ammonium-oxidierenden Bakterien erhalten werden können, die zur Gattung Nitrosomonas gehören. Genauer schließt das vorliegende Plasmid S das Plasmid pAYS ein, umfassend 1823 Basenpaare, wobei die gesamte Nucleotidsequenz durch SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, und das vorliegende Plasmid L schließt das Plasmid pAYL ein, umfassend 1910 Basenpaare, wobei die gesamte Nucleotidsequenz durch SEQ ID NO: 2 gezeigt ist.
Die vorliegenden Plasmide S oder L können durch das Verfahren für das Herstellen von Plasmiden, das in der gewöhnlichen Gentechnologie-Technik verwendet wird, wie zum Beispiel durch J. Sambrook, E.F. Fritsch und T. Maniatis, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory, 1989, beschrieben, hergestellt werden. Genauer werden Ammonium-oxidierende Bakterien, die zur Gattung Nitrosomonas gehören und das vorliegende Plasmid S oder L enthalten, zuerst gezüchtet, und von den erhaltenen bakteriellen Zellen werden die Plasmide extrahiert. Als das Verfahren zum Züchten von Ammonium-oxidierenden Bakterien, die zur Gattung Nitrosomonas gehören, kann ein gewöhnliches Verfahren zum Züchten von Ammonium-oxidierenden Bakterien verwendet werden. Im Kulturmedium können zum Beispiel Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid als Ammoniumquellen; Sulfate, Phosphate oder Chloride von Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium oder Eisen als anorganische Salze; und organische Salze verwendet werden. Spezifische Beispiele sind Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Natriumchlorid, Natriumhydrogencarbonat, Dinatriumhydrogenphosphat, Magnesiumsulfatheptahydrat, Calciumchloriddihydrat, Calciumcarbonat, Eisen(II)sulfatheptahydrat und Eisenethylendiamintetraacetattrihydrat. Als andere anorganische Elemente können zum Beispiel auch Sulfate oder Chloride von Kupfer, Kobalt, Molybdän, Mangan oder Zink in geringen Mengen zugefügt werden. Spezifische Beispiele sind Kupfersulfatpentahydrat, Kobaltchloridhexahydrat, Natriummolybdatdihydrat, Manganchloridtetrahydrat, Mangansulfattetrahydrat und Zinksulfatheptahydrat. Das Wachstum von Ammonium-oxidierenden Bakterien involviert die Oxidation von Ammonium, das im Medium enthalten ist, in salpetrige Säure, sodass der pH-Wert der Kulturflüssigkeit im Laufe der Zeit gesenkt wird. Zu der Zeit können auch chemische Substanzen, die eine Pufferwirkung haben und für das Wachstum von Ammonium-oxidierenden Bakterien harmlos sind, im Voraus zum Kulturmedium zugefügt werden, um zu verhindern, dass der pH-Wert der Kulturflüssigkeit gesenkt wird. Die chemische Substanz, die zugefügt werden kann, kann zum Beispiel HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure) einschließen.
Das Kultivieren wird gemäß dem gewöhnlichen Verfahren für das Kultivieren von streng anaeroben Bakterien ausgeführt. Jede Art der Flüssigkultur kann verwendet werden, wie Schüttelkulturen in Teströhrchen, Reziprokschüttelkulturen, Rotationsschüttelkulturen und Kulturen in Glas-Fermentern. Die Inkubationstemperatur kann geeigneterweise innerhalb eines Bereichs verändert werden, in dem Ammonium-oxidierende Bakterien gezüchtet werden können, aber sie ist zum Beispiel im Bereich von etwa 20°C bis etwa 35°C, vorzugsweise etwa 25°C bis etwa 30°C. Der pH-Wert eines Kulturmediums hat einen geeigneten Bereich, der sich von neutralen zu leicht alkalischen Punkten erstreckt, und ist zum Beispiel vorzugsweise etwa 7 bis etwa 8. Wenn nötig, kann eine Lösung einer alkalischen Substanz wie etwa 5 Gewichts% bis etwa 10 Gewichts% Natriumcarbonat oder etwa 1 N Natriumhydroxid geeigneterweise tropfenweise zum Medium zugefügt werden, um den pH-Wert im passenden Bereich zu halten. Die Inkubationszeit kann mit verschiedenen Bedingungen variieren, aber es wird gewöhnlich bevorzugt, dass sie etwa 5 Tage bis etwa 20 Tage ist. Für den obigen Mikroorganismus ist es schwierig, das Wachstum durch zum Beispiel Messen der Trübheit der Kulturflüssigkeit durch visuelle Beobachtung oder mit einem Trübungsmesser oder anderen Mitteln zu bestätigen, da die Geschwindigkeit des Wachstums und die Ausbeute der bakteriellen Zellen im Allgemeinen niedrig sind. Es wird daher bevorzugt, dass das Wachstum durch Nachweisen der Bildung von salpetriger Säure in der Kulturflüssigkeit unter Verwendung von Ionenchromatographie oder anderen Techniken bestätigt wird. Im Falle einer festen Kultur wird es bevorzugt, dass gereinigte Polysaccharide wie GELLAN GUM (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.) als ein Verfestigungsmittel für das Medium verwendet werden. Agar, der weithin verwendet wird, kann im Allgemeinen oft Unreinheiten enthalten, und daher wird, wenn Agar verwendet wird, die Kolonie des obigen Mikroorganismus nicht gebildet werden, oder selbst wenn sie gebildet wird, ist sie von sehr kleiner Größe, was es schwer macht, die bakteriellen Zellen zu handhaben. Die bakteriellen Zellen des so gezüchteten obigen Mikroorganismus werden durch Zentrifugation gewonnen, und das vorliegende Plasmid S oder L kann dann gemäß einem gewöhnlichen Verfahren für das Extrahieren von Plasmiden von Bakterien wie das alkalische SDS-Verfahren, wie zum Beispiel durch H.C. Birnboim und J. Doly, Nucleic Acids Research, 7, 1513-1523 (1979), beschrieben, erhalten werden.
Die Plasmidstruktur kann durch jedes Verfahren gemäß den gewöhnlichen Gentechnologie-Techniken bestimmt werden. Verschiedene Restriktionsfragmente des vorliegenden Plasmids S oder L werden in Plasmidvektoren, für die Escherichia coli als ein Wirtsorganismus verwendet wird, inseriert, gefolgt von einer Transformation von Escherichia coli, von denen die Plasmidvektor-DNA extrahiert und dann einem kommerziell erhältlichen Sequenziergerät ausgesetzt wird. Die bestimmte Nucleotidsequenz kann für die Herstellung einer Restriktionskarte zum Vergleich mit bekannten Nucleotidsequenzen oder anderen Untersuchungen unter Verwendung einer kommerziell verfügbaren Software der Genanalyse für die Verwendung in Personalcomputern verwendet werden. Darüber hinaus können gemäß dem obigen Vergleichsverfahren zum Beispiel einige Regionen mit hoher Homologie zwischen den Plasmiden gefunden werden, und diese Regionen können auch für die Konstruktion von Transformationsvektoren ausgenutzt werden. Die Regionen mit hoher Homologie zwischen den Plasmiden können, wenn die Nucleotidsequenzen von pAYS als das vorliegende Plasmid S und pAYL als das vorliegende Plasmid L durch Vergleich untersucht werden, zum Beispiel die 262 Basenpaar-Region von pAYS, die sich von der 1152. Stelle zu der 1413. Stelle in SEQ ID NO: 1 erstreckt, und die 261 Basenpaar-Region von pAYL, die sich von der 1340. Stelle zu der 1600. Stelle in SEQ ID NO: 2 erstreckt, einschließen.

Die Ammonium-oxidierenden Bakterien, die zur Gattung Nitrosomonas gehören und die das vorliegende Plasmid S oder L enthalten, können zum Beispiel ein Bakterium einschließen, das von Belebtschlamm durch das Verfahren, wie unten in Beispiel 1 beschrieben, isoliert und Nitrosomonas sp. ENI-11 bezeichnet wurde, das unter dem Budapester Vertrag als FERM BP-5774 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung, 18. Dezember 1996) beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, hinterlegt wurde. Die bakteriologischen Charakteristika von Nitrosomonas sp. ENI-11 sind wie folgt: (a) Morphologie

Zellform und Dimensionen
Form:	Stäbchen (kurze Stäbchenbakterien)
Dimensionen:	0,5 μm bis 0,7 μm × 1,0 μm bis 1,4 μm
Gram-Färbung:	negativ
Motilität:	keine

(b) Wachstum

Produktion von salpetriger Säure aus Ammonium:	+
Produktion von Salpetersäure aus salpetriger Säure:	–
Wachstum auf einem Nährmedium wie CGY-Medium:	–
Bedarf für Sauerstoff:	streng aerob
Optimaler Wachstumstemperatur-Bereich:	28°C bis 32°C
Optimaler Wachstums-pH-Bereich:	7,5 bis 8,0

(c) Andere Charakteristika

GC-Gehalt:

50%

Die vorliegenden Erfinder suchten diese Charakteristika im Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1984) und bestimmten, dass der bakterielle Stamm vernünftigerweise der Gattung Nitrosomonas zugeteilt wird.
Ein chimäres Plasmid kann hergestellt werden, das mindestens die Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOs: 1 beziehungsweise 2, die in den vorliegenden Plasmiden S und L enthalten sind, aufweist und das weiterhin ein Selektionsmarker-Genfragment enthält, gekennzeichnet dadurch, dass es in Zellen entweder von Ammonium-oxidierenden Bakterien, die zur Gattung Nitrosomonas gehören, oder von Escherichia coli replizierbar ist (wobei das Plasmid hierin nachstehend als das vorliegende chimäre Plasmid bezeichnet wird). Das vorliegende chimäre Plasmid kann zum Beispiel ein Plasmid, das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 und ein Selektionsmarker-Gen enthält, ein Plasmid, das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 und ein Selektionsmarker-Gen enthält, und ein Plasmid, das die Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOs: 1 und 2 und ein Selektionsmarker-Gen enthält, einschließen. Ein spezifisches Beispiel ist ein Plasmid, das etwa 7,6 Kilobasenpaare umfasst und durch die Restriktionskarte, die in 3 gezeigt ist, repräsentiert wird.
Das Selektionsmarker-Gen, das im vorliegenden chimären Plasmid enthalten sein soll, bezieht sich auf ein Gen, das als ein Marker funktionsfähig ist, der es ermöglicht, die Anwesenheit des Plasmids in einem Wirtsorganismus nachzuweisen. Der Selektionsmarker kann zum Beispiel für das Screenen der Wirtsorganismen, in die das Plasmid übertragen wurde, aus den Wirtsorganismen, in die kein Plasmid übertragen wurde, ausgenutzt werden. Das Selektionsmarker-Gen ist nicht besonders limitiert, so lange es als ein Selektionsmarker in einem Wirtsorganismus, in den das vorliegende chimäre Plasmid transferiert werden soll, funktionsfähig ist. Zum Beispiel können ein Gen, das eine Arzneistoff-Resistenz an den Wirtsorganismus verleiht, oder ein Gen, das das Nährstoffbedürfnis des Wirtsorganismus kompensiert, verwendet werden. Spezifische Beispiele des Selektionsmarker-Gen sind Antibiotikumresistenz-Gene, die von verschiedenen, kommerziell verfügbaren Vektoren stammen, wie ein Kanamycinresistenz-Gen, ein Ampicillinresistenz-Gen, ein Tetracyclinresistenz-Gen, ein Neomycinresistenz-Gen und ein Chloramphenicolresistenz-Gen; den Aminosäure-Bedarf kompensierende Gene wie ein den Tryptophan-Bedarf kompensierendes Gen und ein den Histidin-Bedarf kompensierendes Gen; und den Nucleinsäure-Bedarf kompensierende Gene wie ein den Uracil-Bedarf kompensierendes Gen. Das vorliegende chimäre Plasmid, das in zwei oder mehrere Arten von Wirtsorganismen transferiert werden soll, kann auf demselben Plasmid zwei oder mehrere Arten von Genen enthalten, die als der Selektionsmarker in jedem der Wirtsorganismen funktionsfähig sind, oder kann nur eine Art von Gen enthalten, das als der Selektionsmarker in beiden Wirtsorganismen funktionsfähig ist. Zusätzlich, zum Beispiel wenn zwei Arten der vorliegenden chimären Plasmide beide in einen Wirtsorganismus transferiert werden, ist es praktisch für das Screenen von Transformanten, wenn zwei Arten von chimären Plasmiden, die für den Transfer verwendet werden sollen, unterschiedliche Selektionsmarker-Gene enthalten.
Die vorliegenden chimären Plasmide können gemäß den gewöhnlichen Gentechnologie-Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel werden, um ein Plasmid, das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 oder 2 und ein Selektionsmarker-Gen enthält, herzustellen, das vorliegende Plasmid S oder L und das Selektionsmarker-Gen, das einen Escherichia coli-Vektor enthält, mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, beide Fragmente werden durch Ligierung kombiniert, und das resultierende Konstrukt wird in Escherichia coli transformiert, woraus die Plasmid-DNA extrahiert wird. Darüber hinaus werden, zum Beispiel um ein Plasmid herzustellen, das die Nucleotidsequenzen der SEQ ID NOs: 1 und 2 und ein Selektionsmarker-Gen enthält, die vorliegenden Plasmide S und L und das Selektionsmarker-Gen, das einen Escherichia coli-Vektor enthält, mit geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, diese drei Fragmente werden durch Ligierung kombiniert, und das resultierende Konstrukt wird in Escherichia coli transformiert, woraus die Plasmid-DNA extrahiert wird. Für das Selektionsmarker-Gen, das einen Escherichia coli-Vektor enthält, können zum Beispiel kommerziell erhältliche Plasmidvektoren für Escherichia coli verwendet werden.
Der Transfer der vorliegenden Plasmide S, L oder des vorliegenden chimären Plasmids in einen Wirtsorganismus gemäß den gewöhnlichen Gentechnologie-Techniken erreicht die Herstellung einer Transformante. Genauer können die vorliegenden Plasmide S, L oder das vorliegende chimäre Plasmid zum Beispiel in Ammonium-oxidierende Bakterien, von denen Nitrosomonas europaea ein typisches Beispiel ist, durch das Elektroporationsverfahren, wie durch N.G. Hommes, L.A. Sayavedra-Soto und D.J. Arp, Journal of Bacteriology, 178, 3710-3714 (1996) beschrieben, transferiert werden, um eine Transformante herzustellen. Der Transfer von mehrfachen Arten der obigen Plasmide in Ammonium-oxidierende Bakterien kann auch für die Herstellung einer Transformante verwendet werden. Darüber hinaus kann der Transfer des vorliegenden chimären Plasmids in Escherichia coli durch die Calciumchlorid-Behandlung, wie durch D. Hanahan, Journal of Molecular Biology, 166, 557-580 (1983) beschrieben, auch die Herstellung einer Transformante erzielen.
Das vorliegende chimäre Plasmid kann durch Inkorporieren eines fremden Gens in den Vektor und Transferieren des so erhaltenen Vektors in die Ammonium-oxidierenden Bakterien als ein Wirtsorganismus als ein Vektor für die Expression eines Merkmals in Ammonium-oxidierenden Bakterien verwendet werden, wobei das Merkmal nicht von Natur aus von den Ammonium-oxidierenden Bakterien besessen wird. Ein Plasmid wird durch Inserieren zum Beispiel von Genen, die Proteine codieren, die mit der Biolumineszenz von lumineszierenden Bakterien wie Vibrio fischeri assoziiert sind, und Genfragmenten wie das lux-Operon, wie zum Beispiel durch J.H. Devine, C. Countryman und T.O. Baldwin, Biochemistry, 27, 837-842 (1988) beschrieben, in das vorliegende chimäre Plasmid konstruiert. Das so erhaltene Plasmid kann für das Transformieren von Ammonium-oxidierenden Bakterien wie Nitrosomonas europaea verwendet werden, um das Merkmal der Biolumineszenz in der Transformante zu exprimieren.
Die so erhaltene Rekombinante kann für den Nachweis und die Bestimmung von Ammonium-Ionen in einer Wasserprobe durch Inkontaktbringen der Transformante mit der Wasserprobe verwendet werden. Die Transformante kann als solche nach dem Wachstum in Suspensionskultur oder als eine, die durch Trage- und Immobilisierungstechniken für Mikroorganismen wie die Einfang-Immobilisierung, wie zum Beispiel in „Biseibutsu-koteika-ho ni yoru Haisui-shori (übersetzter Titel: Abwasser-Behandlung durch Mikroorganismus-Immobilisierungsverfahren)", Sudo Ryuichi Hrsg., veröffentlicht durch Sangyo-yosui Chosa-kai (1988), beschrieben, fixiert und auf einer geeigneten Unterlage getragen werden (was in dem Fall hierin nachstehend als die immobilisierten bakteriellen Zellen bezeichnet wird), verwendet werden. In beiden Fällen wirken manche Enzyme des Elektronentransportsystems in den bakteriellen Zellen unter Verwendung von Protonen (H⁺) als ein Substrat, die von Ammonium-Ionen durch die Ammonium-oxidierende Wirkung, die von Natur aus von der Transformante besessen wird, gebildet werden, und ein Enzym (d.h. Luciferase), das durch die Expression des lux-Gens, das in die Transformante transferiert wird, produziert wird, wirkt im Zusammenhang mit dem obigen Elektronentransportsystem und wirkt auf das Substrat, um eine Lumineszenzreaktion zu bewirken. Die Messung der Lichtmenge oder der Leuchtkraft zu jener Zeit unter Verwendung eines Photodetektors wie eines Luminometers ermöglicht es, den Nachweis und die Bestimmung von Ammonium-Ionen zu erzielen. Darüber hinaus wird, wenn Ammonium-Ionen in einer Wasserprobe in einem solchen Grad vorhanden sind, dass sie durch die Biolumineszenz der obigen Transformante nachgewiesen werden können, wenn chemische Substanzen, die die nitrifizierende Wirkung von Ammonium-oxidierenden Bakterien inhibieren (wobei die chemischen Substanzen hierin nachstehend als die Nitrifizierungs-inhibierenden Substanzen bezeichnet werden), auch in der Wasserprobe vorhanden sind, die Lumineszenzreaktion der obigen Transformante abhängig von der Konzentration der Nitrifizierungs-inhibierenden Substanzen inhibiert. Daher können die Nitrifizierungs-inhibierenden Substanzen in einer Probe auch durch Verwenden einer Wasserprobe, von der gefunden worden ist, dass sie keine Nitrifizierungs-inhibierenden Substanzen enthält, als eine Kontrolle, Inkontaktbringen der Kontroll- und einer Testprobe mit der Kulturflüssigkeit oder den immobilisierten bakteriellen Zellen der obigen Transformante, Messen der Biolumineszenz der Transformante und dann Vergleichen der gemessenen Werte für die Kontroll- und die Testprobe nachgewiesen und bestimmt werden. Ein spezifisches Beispiel ist der Test von Roh-Abwasser auf Nitrifizierungs-inhibierende Substanzen in der biologischen Behandlung (z.B. dem Belebtschlamm-Verfahren oder dem biologischen Membran-Verfahren) von Abwasser, industriellem Abwasser oder dergleichen.
Die obige Transformante kann auch verwendet werden, um einen Sensor für Ammonium-Ionen durch Immobilisieren der Transformante auf solch eine Weise als eine Sonde zum Beispiel gemäß dem Verfahren, wie durch M. Hikuma, T. Kubo und T. Yasuda, Analytical Chemistry, 52, 1020-1024 (1980) beschrieben, und Verbinden der Sonde zum Beispiel mit einem optischen Faserkabel mit einem Luminometer, wie oben beschrieben, herzustellen. Die Bestimmung der Ammonium-Ionenkonzentration unter Verwendung solch eines Sensors ermöglicht es, die Messung von Ammonium und/oder Nitrifizierungs-inhibierenden Substanzen ohne Gewinnen einer Testwasserprobe zum Beispiel sogar im System des Fließwassers durchzuführen. Zum Beispiel kann ein Abwasser-Beobachtungssystem konstruiert werden, in dem Nitrifizierungs-inhibierende Substanzen im Abwasser, das in einen Kontrolltank fließt, der im vorhergehenden Stadium eines Tanks für die Abwasser-Behandlung mit Belebtschlamm ausgestattet war, durch Verwendung der obigen Transformante nachgewiesen werden, um Anordnungssignale wie Schließen der Einflussventile und temporäre Lagerung von eine toxische Substanz enthaltendem Abwasser in einer Nebengrube zu geben.
Die Resistenz gegen Nitrifizierungs-inhibierende Substanzen kann durch Inserieren von Fragmenten von Enzym-Genen, die für die Katabolisierung oder Entgiftung von Nitrifizierungs-inhibierenden Substanzen verantwortlich sind, in das vorhandene chimäre Plasmid und Transformieren von Ammonium-oxidierenden Bakterien wie Nitrosomonas europaea mit dem Plasmid auf Transformanten übertragen werden. Beispiele der Nitrifizierungs-inhibierenden Substanzen werden zum Beispiel durch C. Bedard et al., Microbiological Reviews, 53, 68-84 (1989) und D.J.W. Blum et al., Research Journal of Water Pollution Control Federation, 63, 198-207 (1991) beschrieben. Darunter sind Beispiele der Substanzen, für die die Enzyme, die mit der Katabolisierung oder Entgiftung dieser Substanzen durch Mikroorganismen assoziiert sind, auf der Ebene von Genen, die diese Enzyme codieren, bereits aufgeklärt worden sind, Cyanide, Phenol, Toluol, Xylol, Cresol und Anilin. Die Transformation von Ammonium-oxidierenden Bakterien wird mit einem Plasmid erreicht, das durch Inserieren von Enzym-Genen, die für die Katabolisierung oder Entgiftung dieser Nitrifizierungs-inhibierenden Substanzen verantwortlich sind, wie dem Xylol-Katabolisierungsgen xyl-Operon, beschrieben durch T. Nakazawa, S. Inouye und A. Nakazawa, Plasmids in Bacteria, 415, Plenum Publishing (1985), alleine oder in Kombination in das vorliegende chimäre Plasmid erhalten wird. Die so erhaltene Transformante bekommt eine Resistenz gegen jede Nitrifizierungs-inhibierende Substanz. Zum Beispiel ermöglicht es die Zugabe von Kulturflüssigkeit oder bakteriellen Zellen (einschließlich jenen, die durch die Einfang-Immobilisierung oder andere Techniken verarbeitet worden sind) der obigen Transformante zu einem Tank für die Abwasser-Behandlung mit Belebtschlamm während des Verfahrens der biologischen Behandlung von industriellem Abwasser, das Nitrifizierungs-inhibierende Substanzen enthalten kann, wie oben beschrieben, die Nitrifizierungs-inhibierenden Substanzen im Tank für die Abwasser-Behandlung zu katabolisieren oder zu entgiften, die Verminderung der Nitrifizierungsfunktion des Belebtschlamms im Tank für die Abwasser-Behandlung zu steuern und die Effektivität der Stickstoff-Eliminierung vom zu behandelnden Wasser zu stabilisieren.
Die Ammonium-oxidierende Fähigkeit der Wirtsorganismen kann durch Inserieren von Fragmenten von Genen, die Enzyme codieren, die mit der Ammonium-Oxidierung assoziiert sind, wie Ammonium-Monooxygenase (amo) und Hydroxylaminoxid-Reduktase (hao) in das vorliegende chimäre Plasmid, Transformation von Ammonium-oxidierenden Bakterien wie Nitrosomonas europaea mit dem Plasmid und Steigern der Zahl der Kopien der amo- und hao-Gene in den Wirtsorganismen verstärkt werden. Genauer werden die amo- und hao-Gene der Nitrosomonas sp. ENI-11 oder anderer Ammonium-oxidierender Bakterien in das vorliegende chimäre Plasmid, das für die Transformation von Ammonium-oxidierenden Bakterien (z.B. Nitrosomonas sp. ENI-11) verwendet wird, inseriert. Die so erhaltene Transformante hat eine erhöhte Zahl von Kopien der entsprechenden Gene im Vergleich zu den gewöhnlichen Ammonium-oxidierenden Bakterien, die 2 Kopien des amo-Gens und 3 Kopien des hao-Gens auf dem Chromosom haben. Die Expression dieser Kopien kann eine hohe Aktivität für die Ammonium-Oxidation zeigen. Die Nitrifizierung von Abwasser kann durch Konstruieren eines Reaktors für das Herstellen einer Kultur der Transformante und Aussetzen von Haushalts-Abwasser, menschlichem Abwasser oder industriellem Abwasser, das eine hohe Konzentration von Stickstoff in der Form von Ammonium enthält, als ein Substrat für den Reaktor beschleunigt werden. In dem Reaktor kann die Transformante als eine verwendet werden, die durch Suspensionskultur gezüchtet wird, oder kann auch als immobilisierte bakterielle Zellen verwendet werden, die im Voraus gezüchtet worden sind. Das so in dem Reaktor behandelte Abwasser kann dem gewöhnlichen Vorgang der Abwasser-Behandlung mit Belebtschlamm, die einen anaeroben Schritt involviert, zugeführt und dann der Nitrifizierungs- oder Denitrifizierungsreaktion ausgesetzt werden, sodass die Stickstoffkonzentration im behandelten Wasser reduziert werden kann. Darüber hinaus ermöglicht es die Zugabe von Kulturflüssigkeit oder bakteriellen Zellen (einschließlich jenen, die durch die Einfang-immobilisierung oder andere Techniken verarbeitet wurden) der obigen Transformante zu dem gewöhnlichen Tank für die Abwasser-Behandlung mit Belebtschlamm, die Nitrifizierung in dem Tank für die Abwasser-Behandlung zu beschleunigen und die Stickstoffkonzentration in dem behandelten Wasser zu reduzieren.
Die folgenden Arbeitsbeispiele werden zum Herstellen und Verwenden der vorliegenden Erfindung bereitgestellt; die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Arbeitsbeispiele limitiert.
Beispiel 1 (Beispiel der Isolierung von bakteriellen Zellen)
Aktivierter Klärschlamm wurde von einer chemischen Fabrik gewonnen und in einem Trockengewicht von 10 mg zu 100 ml Medium zugefügt, enthaltend 0,2 Gewichts% Ammoniumsulfat, 0,05 Gewichts% Kaliumdihydrogenphosphat, 0,005 Gewichts% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,0004 Gewichts% Calciumchloriddihydrat und 0,00001 Gewichts% Eisenethylendiamintetraacetattrihydrat und eingestellt durch die Zugabe von 1 N Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 8 (wobei das Medium hierin nachstehend als das AL-Medium bezeichnet wird). In einem 500 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einem Silikonstöpsel wurde eine Rotationsschüttelkultur bei einer Geschwindigkeit von etwa 120 Umdrehungen pro Minute inkubiert. Die Inkubationstemperatur wurde bei 30°C gehalten. Vom 4. Tag nach dem Start der Inkubation an wurde der pH-Wert des Mediums jeden oder jeden zweiten Tag mit einem pH-Meter gemessen, und die Konzentrationen der Ammonium- und Nitrit-Ionen in dem Medium wurden durch Ionenchromatographie bestimmt. Jedes Mal, wenn der pH-Wert weniger als 7 wurde, wurde das Medium durch die Zugabe von 1 N Natriumhydroxid-Lösung auf einen pH-Wert von 8 eingestellt. Diese Vorgehensweisen wurden wiederholt. Da die Konzentration der Nitrit-Ionen in dem Medium am 10. Tag der Inkubation 50 mg/l überschritt, wurde ein Teil der Kulturflüssigkeit in ein frisches AL-Medium transferiert (die Menge der transferierten Kulturflüssigkeit wurde bei einem 1/10-fachen Spiegel im Vergleich zu dem frischen Mediumvolumen festgesetzt). Dieselben Vorgehensweisen für die Inkubation und den Transfer wurden viermal wiederholt, und eine Subkultur wurde dann auf einem Medium hergestellt, enthaltend 0,2 Gewichts% Ammoniumsulfat, 0,05 Gewichts% Natriumhydrogencarbonat, 0,05 Gewichts% Kaliummonohydrogenphosphat, 0,005 Gewichts% Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,0005 Gewichts% Calciumchloriddihydrat, 0,0005 Gewichts% Eisenethylendiamintetraacetattrihydrat, 0,0002 Gewichts% Mangansulfattetrahydrat, 0,00001 Gewichts% Kupfersulfat, 0,00001 Gewichts% Zinksulfatheptahydrat, 0,000005 Gewichts% Natriummolybdatdihydrat und 0,0000001 Gewichts% Kobaltchloridhexahydrat und eingestellt durch die Zugabe von 50 mM HEPES-Pufferlösung auf einen pH-Wert von 8 (das Medium wird hierin nachstehend als das modifizierte Alexander-Medium bezeichnet), gefolgt von einer Subkultur für vier Generationen. Bei solch einem Stadium, bei dem eine ausreichende Akkumulierung von Ammonium-oxidierenden Bakterien angenommen wurde, wurden Plattenkulturen hergestellt. Genauer wurde ein Teil der Kulturflüssigkeit mit einer physiologischen Salzlösung verdünnt und über Plattenmedien verteilt, die durch Verfestigung der Medium-Flüssigkeit erhalten worden waren, die dieselbe Zusammensetzung wie das obige flüssige Medium (d.h. das modifizierte Alexander-Medium) plus 1 Gewichts% GELLAN GUM hatte, gefolgt von einer Inkubation bei 30°C. Kolonien des Mikroorganismus, die sich nach etwa 10 Tagen zu bilden begann, wurden mit einem Platindraht gewonnen und in dasselbe flüssige Medium, wie oben beschrieben, das Nitrosomonas sp. ENI-11 bereitstellte, transferiert.
Beispiel 2 (Beispiel einer Kulturpräparation von bakteriellen Zellen)
Zuerst wurden 300 ml modifiziertes Alexander-Medium in einen 2000 ml-Erlenmeyer-Kolben mit einem Silikonstöpsel gegeben, und 5 bis 50 ml der Kulturflüssigkeit von Nitrosomonas sp. ENI-11 wurden zu dem Kolben zugegeben, in dem die Kulturflüssigkeit vorher auf Medien, die dieselbe Zusammensetzung wie das obige flüssige Medium haben, hergestellt worden war. Der Kolben wurde bei 28°C für 5 Tage auf einem Rotationsschüttelapparat, der bei einer Geschwindigkeit von etwa 120 bis etwa 160 Schlägen pro Minute arbeitet, inkubiert, was eine Kulturflüssigkeit von bakteriellen Zellen lieferte.
Beispiel 3 (Beispiel einer Plasmidextraktion)
Die bakteriellen Zellen wurden von der obigen Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation bei 10000 UpM für 10 Minuten gewonnen und dann in 0,1 ml TE-Lösung (10 mM Trishydroxymethylaminomethan, pH 8, 1 mM Dinatriumethylendiamintetraacetat) suspendiert. Die Suspension wurde in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Röhrchen) transferiert, und 0,4 N Natriumhydroxid-Lösung und 2 Gewichts% Natriumdodecylsulfat-Lösung wurden in Volumina von 0,1 ml zugefügt, das Ganze wurde sanft geschwenkt und für 5 Minuten ungestört auf Eis belassen. Weiterhin wurden 0,15 ml 3 M Kaliumacetat-Lösung (pH 5,2) zugefügt, und das Gemisch wurde sanft geschwenkt und ungestört für 5 Minuten auf Eis belassen. Das Mikrozentrifugenröhrchen wurde bei 15000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Dann wurden 0,45 ml TE-Lösung-gesättigtes Phenol/Chloroform (Volumenverhältnis 1/1) zugefügt, und das Gemisch wurde unter sanftem Umdrehen des Röhrchens gerührt. Das Mikrozentrifugenröhrchen wurde wieder bei 15000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Dann wurden 0,45 ml TE-Lösung-gesättigtes Phenol/Chloroform (Volumenverhältnis 1/1) zugefügt, und das Gemisch wurde für 5 Minuten unter sanftem Umdrehen des Röhrchens gerührt. Das Mikrozentrifugenröhrchen wurde weiter bei 15000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, und der Überstand wurde in ein anderes Mikrozentrifugenröhrchen übertragen. Dann wurden 0,9 ml 99,5% Ethanol zugefügt, und das Gemisch wurde für 10 Minuten auf Eis platziert. Das Mikrozentrifugenröhrchen wurde bei 15000 UpM für 5 Minuten zentrifugiert, wonach der Überstand verworfen wurde, und das Präzipitat wurde mit 70% Ethanol gewaschen. Nach einer Vakuumtrocknung wurde das Präzipitat (Plasmid-DNA) in 0,015 ml TE-Lösung gelöst. Auf solch eine Weise wurde die Plasmid-DNA erhalten.
Beispiel 4 (Beispiel einer Plasmid-Clonierung und DNA-Sequenzbestimmung für eine Nucleinsäure)
Die in Beispiel 3 erhaltene Plasmid-DNA wurde mit einem oder zwei der Restriktionsenzyme EcoRI, BamHI, SacI, SphI, Ball und KpnI, die von Takara Shuzo Co., Ltd. oder Boehringer Mannheim Corporation erhältlich sind, durch Inkubation bei 37°C für 1 Stunde im Fall eines vollständigen Verdaus oder für 10 Sekunden im Fall eines teilweisen Verdaus behandelt. Die Lösungen wurden nach dem Restriktionsverdau einer Elektrophorese in 1,0% Agarosegelen bei 100 V ausgesetzt, um die entsprechenden DNA-Restriktionsfragmente aufzutrennen. Die Gele wurden dann in 0,5 mg/l Ethidiumbromid-Lösung für 15 Minuten eingetaucht, gefolgt von einem Nachweis der DNA-Fragmente unter Verwendung eines Ultraviolettbestrahlers. Die Teile der Gele, die die gewünschten DNA-Fragmente enthielten, wurden mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, und die DNA-Fragmente wurden isoliert und von den Gelen unter Verwendung des GENE CLEAN II KIT, der von BIO101, Inc. erhältlich ist, gereinigt. Die entsprechenden DNA-Restriktionsfragmente wurden in Clonierungsvektor-Plasmide von Escherichia coli, pUC118, pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.) und pBluescript II SK (Stratagene, Inc.), unter Verwendung des Ligation high-Kits, der von Toyobo Co., Ltd. erhältlich ist, ligiert. Die Bedingungen der Behandlung wurden bei 16°C für 30 Minuten festgesetzt. Die Clonierungsvektor-Plasmide, die die entsprechenden ligierten DNA-Restriktionsfragmente enthielten, wurden für die Transformation von Escherichia coli MV1184 durch das kompetente-Zelt-Verfahren, das die Calciumchlorid-Behandlung involviert, verwendet. Die Insertion der erwünschten DNA-Fragmente in die Clonierungsvektor-Plasmide wurde durch die Technik bestätigt, bei der die Bildung von weißen Kolonien durch das Fehlen der β-Galactosidase-Aktivität auf den Agarplattenkulturen der transformierten Stämme zur Unterscheidung verwendet wurde. Gemäß dem gewöhnlichen Verfahren zur Herstellung von Escherichia coli-Kulturen wurden Übernacht-Kulturen der weißen Kolonien hergestellt, von denen die Clonierungsvektor-Plasmide, die die entsprechenden ligierten DNA-Restriktionsfragmente enthielten, extrahiert und durch Restriktionsbehandlung und Elektrophorese hinsichtlich der Insertion des Fragments bestätigt wurden. Die Sequenzbestimmung für die Nucleinsäure des inserierten Fragments wurde unter Verwendung eines ALFred-DNA-Sequenziergeräts, das von Pharmacia Biotech AB erhältlich ist, ausgeführt. Basierend auf den Nucleotidsequenzen der bestimmten inserierten Fragmente wurden unter Verwendung der DNASIS V2.0-Genanalyse-Software, die von Takara Shuzo Co., Ltd. erhältlich ist, Restriktionskarten der Plasmide hergestellt (1 und 2). Der Vergleich der Nucleotidsequenzen der zwei bestimmten Plasmiden (bezeichnet als pAYS beziehungsweise pAYL) legte offen, dass die Region von 262 Basenpaaren, die sich von der 1151. Stelle zur 1412. Stelle in SEQ ID NO: 1 erstreckt, und die Region von 261 Basenpaaren, die sich von der 1339. Stelle zur 1599. Stelle in SEQ ID NO: 2 erstreckt, eine hohe Homologie aufweisen.
Beispiel 5 (Konstruktion der vorliegenden chimären Plasmide)
Das Plasmid pAYL, von dem die Nucleotidsequenz in Beispiel 4 bestimmt wurde, und Plasmid pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurden mit dem Restriktionsenzym KpnI (Takara Shuzo Co., Ltd.) getrennt verdaut, und die beiden wurden unter Verwendung des Ligation high-Kits, der von Toyobo Co., Ltd. erhältlich ist, zusammen ligiert. Die Bedingungen der Ligierung wurden bei 16°C für 30 Minuten festgesetzt. Unter Verwendung des Ligierungsgemischs wurde Escherichia coli MV1184 als ein Wirtsorganismus durch das kompetente Zell-Verfahren, das die Calciumchlorid-Behandlung involviert, transformiert. Die Insertion des erwünschten DNA-Fragments von Plasmid pAYL in das Clonierungsvektor-Plasmid pUC119 wurde durch die Technik bestätigt, bei der die Bildung von weißen Kolonien durch das Fehlen der β-Galactosidase-Aktivität auf den Agarplattenkulturen der transformierten Stämme für eine Unterscheidung verwendet wurde. Gemäß dem gewöhnlichen Verfahren für die Herstellung von Escherichia coli-Kulturen wurden über Nacht-Kulturen der weißen Kolonien hergestellt, von denen die Plasmid-DNA extrahiert und durch Restriktionsbehandlung und Elektrophorese auf eine Insertion des Fragments bestätigt wurde. Das erhaltene Plasmid (hierin nachstehend als pUC119L bezeichnet) wurde mit den Restriktionsenzymen SacI und Bam HI (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut, und die Lösung wurde nach der Restriktionsbehandlung einer Elektrophorese in einem 1,0% Agarosegel bei 100 V ausgesetzt, um die DNA-Restriktionsfragmente aufzutrennen. Das Gel wurde dann in 0,5 mg/l Ethidiumbromid-Lösung für 15 Minuten eingetaucht, gefolgt von einem Nachweis des DNA-Fragments unter Verwendung eines Ultraviolettbestrahlers. Der Teil des Gels, der das DNA-Fragment enthielt, das das Plasmid pAYL aufweist (etwa 1,9 kb, bezeichnet als DNA-Fragment L), wurde mit einer Rasierklinge ausgeschnitten, und das DNA-Fragment wurde isoliert und unter Verwendung des GENE CLEAN II KIT, der von Funakoshi erhältlich ist, von dem Gel gereinigt.
Das Plasmid pAYS, dessen Nucleotidsequenz in Beispiel 4 bestimmt wurde, und das Plasmid pBluescript II KS+ (Toyobo Co., Ltd.) wurden getrennt mit dem Restriktionsenzym EcoRV (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut, und beide wurden unter Verwendung des Ligation high-Kits, der von Toyobo Co., Ltd. erhältlich ist, zusammen ligiert. Die Bedingungen der Ligierung wurden bei 16°C für 30 Minuten festgesetzt. Unter Verwendung des Ligierungsgemisches wurde Escherichia coli MV1184 als ein Wirtsorganimus durch das kompetente Zell-Verfahren, das die Calciumchlorid-Behandlung involviert, transformiert. Die Insertion des gewünschten DNA-Fragments von Plasmid pAYS in das Clonierungsvektor-Plasmid pBluescript II KS+ wurde durch die Technik bestätigt, bei der die Bildung von weißen Kolonien durch das Fehlen der β-Galactosidase-Aktivität auf den Agarplattenkulturen der transformierten Stämme für eine Unterscheidung verwendet wurde. Gemäß dem gewöhnlichen Verfahren für die Herstellung von Escherichia coli-Kulturen wurden Übernacht-Kulturen der weißen Kolonien hergestellt, von denen die Plasmid-DNA extrahiert und durch Restriktionsbehandlung und Elektrophorese hinsichtlich der Insertion des Fragments bestätigt wurde. Das erhaltene Plasmid (hierin nachstehend als pBS-S bezeichnet) wurde mit den Restriktionsenzymen XhoI und BamHI (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut, und ein DNA-Fragment, das das Plasmid pAYS aufweist (etwa 1,8 kb, bezeichnet als DNA-Fragment S), wurde isoliert und auf dieselbe Weise, wie oben im Fall von pUC119L beschrieben, gereinigt.
Darüber hinaus wurde das Plasmid pCRII (Invitrogen Corp.), das ein Kanamycinresistenz-Gen und ein Ampicillinresistenz-Gen aufweist, mit den Restriktionsenzymen SacI und XhoI (Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut, und ein DNA-Fragment, das das Plasmid pCRII aufweist (etwa 3,9 kb, bezeichnet als DNA-Fragment C), wurde isoliert und auf dieselbe Weise, wie oben im Fall von pUC119L beschrieben, gereinigt.
Die erhaltenen DNA-Fragmente L, S und C (jedes zu etwa 0,5 μg) wurden gemischt und unter Verwendung des Ligation high-Kits, der von Toyobo Co., Ltd. erhältlich ist, zusammen ligiert. Die Bedingungen der Ligierung wurden bei 16°C für 30 Minuten festgesetzt. Das Ligierungsgemisch wurde für die Transformierung von Escherichia coli MV1184 als ein Wirtsorganismus durch das kompetente Zell-Verfahren, das die Calciumchloridbehandlung involviert, verwendet. Eine Kultur der transformierten Escherichia coli wurde zum Screenen auf die Transformante auf einer Agarplatte, enthaltend Ampicillin (100 mg/l), gezüchtet. Gemäß dem gewöhnlichen Verfahren für die Herstellung von Escherichia coli-Kulturen wurde eine Übernacht-Kultur der Transformanten-Kolonien hergestellt, von der die Plasmid-DNA extrahiert und durch Restriktionsbehandlung und Elektrophorese hinsichtlich der Plasmidstruktur bestätigt wurde. Das Plasmid mit einer solchen Struktur, in dem die DNA-Fragmente L, S und C zusammen ligiert sind (3), wurde als chimäres Plasmid pAY3 bezeichnet.
Beispiel 6 (Erstes Beispiel einer Transformierung von Ammonium-oxidierenden Bakterien unter Verwendung der vorliegenden chimären Plasmide)
Unter Verwendung der vorliegenden chimären Plasmide als Vektoren wird die Transformation der Ammonium-oxidierenden Bakterien ENI-11, die zur Gattung Nitrosomonas gehören, ausgeführt. Zwei chimäre Plasmide werden hergestellt (hierin nachstehend als die chimären Plasmide pAYS beziehungsweise pAYL bezeichnet). Das Erstere wird durch Ligieren eines mit EcoRV verdauten DNA-Fragments (3932 Basenpaare Größe) von Plasmid pCRII (Invitrogen Corp.), das ein Kanamycinresistenz-Gen und ein Ampicillinresistenz-Gen aufweist, in die EcoRV-Restriktionsstelle (d.h. die 991. Stelle in SEQ ID NO: 1) von pAYS, das in Beispiel 4 erhalten wurde, unter Verwendung des obigen Ligation high-Kits erhalten; und das Letztere wird durch Ligieren eines mit KpnI verdauten DNA-Fragments (2676 Basenpaare Größe) von Plasmid pHSG298 (Takara Shuzo Co., Ltd.), das ein Kanamycinresistenz-Gen an der KpnI-Restriktionsstelle (d.h. der 1515. Stelle in SEQ ID NO: 2) von pAYL, das in Beispiel 4 erhalten wurde, aufweist, unter Verwendung des obigen Ligation high-Kits erhalten. Eine Schüttelkultur der Ammonium-oxidierenden Bakterien ENI-11 als ein Wirtsorganismus wird in 1000 ml Medium für 38 bis 40 Stunden gemäß Beispiel 2 gezüchtet, und die bakteriellen Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen und dreimal mit sterilisiertem Wasser gewaschen; sie werden dann in 0,4 ml sterilisiertem Wasser suspendiert. Dazu werden 0,01 ml TE-Lösung, enthaltend je 1 μg DNA der chimären Plasmide pAYS und pAYL, zugefügt, und diese Gemische werden vollständig in Küvetten mit 2 mm-Abständen transferiert. Unter Verwendung eines Geräts für die Elektroporation, Electro Cell Manipulator 600, erhältlich von BTX, wird eine Spannung an die Küvetten angelegt. Die Bedingungen für die Spannungsanwendung werden bei einer Spannung von 1,2 kV/mm, einer Kapazität von 50 μF und einem Widerstand von 720 Ω festgesetzt. Die Suspensionen der bakteriellen Zellen werden nach der Elektroporation vollständig von den Küvetten entfernt und in Sakaguchi-Flaschen transferiert, die je 100 ml modifiziertes Alexander-Medium enthalten, gefolgt von einer Inkubation unter Schüttel für 24 Stunden. Jeder 10 ml-Teil der Kulturflüssigkeiten wird in 100 ml frisches Alexander-Medium, enthaltend 10 mg/l Kanamycin, transferiert, und diese Kulturen werden unter Schütteln inkubiert. Die Inkubation für 7 Tage resultiert im Wachstum von Mikroorganismen, bis es durch visuelle Beobachtung bestätigt werden kann (Absorptionsvermögen bei 600 nm von etwa 0,1), zu diesem Zeitpunkt werden diese Kulturen um den Faktor 10⁵ bis 10⁷ verdünnt und auf Platten von modifiziertem Alexander-Medium, enthaltend 10 mg/l Kanamycin, verteilt. Diese Platten werden in einem Brutschrank bei 28°C für 10 Tage platziert, was Kolonien der Transformanten ergibt. Die Transformations-Effizienz wird aus dem Grad der Kolonie-Bildung für die chimären Plasmide pAYS und pAYL bestimmt.
Beispiel 7 (Zweites Beispiel einer Transformation von Ammonium-oxidierenden Bakterien unter Verwendung des vorliegenden chimären Plasmids)
Unter Verwendung des vorliegenden chimären Plasmids als ein Vektor wurde die Transformation der Ammonium-oxidierenden Bakterien ENI-11, die zur Gattung Nitrosomonas gehören, ausgeführt. Eine Flüssigkultur der Ammonium-oxidierenden Bakterien ENI-11 als ein Wirtsorganismus wurde in einem Volumen von 1000 ml gemäß Beispiel 2 gezüchtet, und die bakteriellen Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und dreimal mit sterilisiertem Wasser gewaschen; sie wurden dann in 0,4 ml sterilisiertem Wasser suspendiert. Dazu wurden 0,01 ml TE-Lösung, enthaltend 1 μg DNA des chimären Plasmids pAY3, das in Beispiel 5 erhalten wurde, zugefügt, und das Gemisch wurde vollständig in Küvetten mit 2 mm-Abständen transferiert. Unter Verwendung eines Geräts für die Elektroporation, Electro Cell Manipulator 600, erhältlich von BTX, wurde eine Spannung an die Küvetten angelegt. Die Bedingungen für die Spannungsanwendung werden bei einer Spannung von 1,2 kV/mm, einer Kapazität von 50 μF und einem Widerstand von 720 Ω festgesetzt. Die Suspension der bakteriellen Zellen wurde nach der Elektroporation vollständig von den Küvetten entfernt und in eine Sakaguchi-Flasche transferiert, die 100 ml modifiziertes Alexander-Medium enthielt, gefolgt von einer Inkubation unter Schütteln für 24 Stunden. Ein 10 ml-Teil der Kulturflüssigkeit wurde in 100 ml frisches Alexander-Medium, enthaltend 10 mg/l Kanamycin, transferiert, und die Kultur wurde unter Schütteln inkubiert. Die Inkubation für 7 Tage resultierte im Wachstum von Mikroorganismen, bis es durch visuelle Beobachtung bestätigt werden konnte (Absorptionsvermögen bei 600 nm von etwa 0,1), zu diesem Zeitpunkt wurde die Kultur um einen Faktor von 10⁵ bis 10⁷ verdünnt und auf eine Platte von modifiziertem Alexander-Medium, enthaltend 10 mg/l Kanamycin, verteilt. Die Platte wurde in einem Brutschrank bei 28°C für 10 Tage platziert, um Kolonien der Transformanten zu ergeben. Die Transformations-Effizienz des chimären Plasmids pAY3 war etwa 100-1000/μg DNA, was aus dem Grad der Kolonie-Bildung berechnet wurde. Die so erhaltene Transformante wurde ein einem modifizierten Alexander-Medium, enthaltend 10 mg/l Kanamycin, gezüchtet, die Plasmid-DNA wurde davon extrahiert, und die Plasmidstruktur wurde durch Restriktionsbehandlung und Elektrophorese analysiert. Als ein Ergebnis wurden DNA-Fragmente in Größen nachgewiesen, wie sie aus der Restriktionskarte von Plasmid pAY3 berechnet wurden, was es ermöglicht, zu bestätigen, dass das chimäre Plasmid pAY3 von den Transformanten gewonnen wurde. Die DNA des chimären Plasmids pAY3, die von der Transformante gewonnen wurde, wurde für die Transformation von Escherichia coli MV1184 als ein Wirtsorganismus durch das kompetente Zell-Verfahren, das die Calciumchlorid-Behandlung involviert, verwendet. Eine Kultur der transformierten Escherichia coli wurde auf einer Agarplatte hergestellt, die Ampicillin (100 mg/l) enthielt, um auf Transformanten zu screenen. Gemäß dem gewöhnlichen Verfahren für die Herstellung von Escherichia coli-Kulturen wurde eine über Nacht-Kultur der erhaltenen Escherichia coli-Transformantenkolonien hergestellt, von der die Plasmid-DNA extrahiert wurde, und die Plasmidstruktur wurde durch Restriktionsbehandlung und Elektrophorese analysiert. Als ein Ergebnis wurden DNA-Fragmente in Größen nachgewiesen, wie es von der Restriktionskarte des chimären Plasmids pAY3 berechnet wurde, so dass das Gewinnen des chimären Plasmids pAY3 von den Escherichia coli-Transformanten bestätigt wurde. Aus diesen Tatsachen wurde gefunden, dass das chimäre Plasmid pAY3 als ein Pendelvektor fungieren kann.
Auswirkungen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung liefert Transformationsvektoren zum Ausführen einer Genmanipulation in Ammonium-oxidierenden Bakterien.
Sequenzprotokoll

Claims

Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 besitzt, oder Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 2 besitzt.
Plasmid, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 1 und/oder 2 besitzt, und dass es weiterhin ein Selektionsmarker-Gen enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es in Zellen von Ammonium-oxidierenden Bakterien, welche zur Gattung Nitrosomonas gehören, oder von Escherichia coli replizierbar ist.
Plasmid nach Anspruch 2, wobei das Plasmid 7,6 Kilobasenpaare umfasst und durch die Restriktionskarte wie in 3 gezeigt repräsentiert wird.
Plasmid nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Plasmid zusätzlich ein aus einem lumineszierenden Organismus stammendes Gen umfasst, welches ein Protein codiert, das mit Biolumineszenz in Zusammenhang steht.
Plasmid nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Plasmid zusätzlich ein Gen umfasst, welches ein Enzym codiert, das die Nitrifikation hemmende Stoffe verstoffwechselt.
Plasmid nach Anspruch 2 oder 3, wobei das Plasmid zusätzlich ein Gen umfasst, welches ein Enzym codiert, das mit Ammonium-Oxidation in Zusammenhang steht.
Plasmid nach Anspruch 4, wobei das aus einem lumineszierenden Organismus stammende Gen, welches ein Protein codiert, das mit Biolumineszenz in Zusammenhang steht, ein Luciferasegen ist.
Plasmid nach Anspruch 5, wobei das Gen, welches ein Enzym codiert, das die Nitrifikation hemmende Stoffe verstoffwechselt, ein Xylol katabolisierendes Gen ist.
Plasmid nach Anspruch 6, wobei das Gen, welches ein Enzym codiert, das mit Ammonium-Oxidation in Zusammenhang steht, ein Ammonium-Monooxygenasegen oder ein Hydroxylaminoxid-Reduktasegen ist.
Transformante, dadurch gekennzeichnet, dass sie erhalten wird durch den Transfer mindestens eines Plasmids nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in einen Wirtsorganismus.
Transformante nach Anspruch 10, wobei der Wirtsorganismus ein Ammonium-oxidierendes Bakterium ist.
Verfahren zum Nachweis von Ammoniumionen in einer wässrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, dass eine Transformante, welche durch den Transfer des Plasmids nach Anspruch 4 oder 7 in Ammonium-oxidierende Bakterien erhalten wird, mit einer wässrigen Probenlösung und einem Substrat für die Biolumineszenz in Kontakt gebracht wird, wobei die Biolumineszenz der Transformanten gemessen wird.
Verfahren zur Herstellung von Ammonium-oxidierenden Bakterien, welche eine Resistenz gegenüber die Nitrifikation hemmenden Stoffen haben, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid nach Anspruch 5 oder 8 in ein Ammonium-oxidierendes Bakterium transferiert wird, um eine Transformante zu erhalten.
Verfahren zur Steigerung der Fähigkeit von Ammonium-oxidierenden Bakterien, Ammonium zu oxidieren, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid nach Anspruch 6 oder 9 in Ammonium-oxidierende Bakterien transferiert wird, um eine Transformante zu erhalten.