JPH09224669A - ニトロソモナス属細菌用ベクターおよび宿主−ベクター系 - Google Patents
ニトロソモナス属細菌用ベクターおよび宿主−ベクター系Info
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- JPH09224669A JPH09224669A JP3237696A JP3237696A JPH09224669A JP H09224669 A JPH09224669 A JP H09224669A JP 3237696 A JP3237696 A JP 3237696A JP 3237696 A JP3237696 A JP 3237696A JP H09224669 A JPH09224669 A JP H09224669A
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- Japan
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- bacterium
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- nitrosomonas
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ニトロソモナス属細菌に遺伝子を導入するこ
とができるベクターを提供し、ニトロソモナス属細菌を
形質転換する。 【解決方法】 ＩｎｃＱ系のプラスミドをベクターとし
て使用して遺伝子を導入し、ニトロソモナス属細菌を形
質転換する。
とができるベクターを提供し、ニトロソモナス属細菌を
形質転換する。 【解決方法】 ＩｎｃＱ系のプラスミドをベクターとし
て使用して遺伝子を導入し、ニトロソモナス属細菌を形
質転換する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ニトロソモナス属
細菌用ベクター、およびニトロソモナス属細菌の宿主−
ベクター系に関する。
細菌用ベクター、およびニトロソモナス属細菌の宿主−
ベクター系に関する。
【０００２】
【従来の技術】アンモニア酸化細菌はアンモニアを酸化
して亜硝酸を生成する化学反応を通じてエネルギーを獲
得する独立栄養細菌であり、この菌によるアンモニア酸
化は自然環境中の窒素循環において重要な役割を持って
いる。ニトロソモナス属細菌はこのようなアンモニア酸
化細菌に属する細菌であり、土壌、水中、廃水プラント
等の環境中に広範囲に生息することが知られている。
して亜硝酸を生成する化学反応を通じてエネルギーを獲
得する独立栄養細菌であり、この菌によるアンモニア酸
化は自然環境中の窒素循環において重要な役割を持って
いる。ニトロソモナス属細菌はこのようなアンモニア酸
化細菌に属する細菌であり、土壌、水中、廃水プラント
等の環境中に広範囲に生息することが知られている。
【０００３】環境浄化における排水中の窒素除去は自然
環境中の窒素循環を模擬したプロセスによって行われて
いる。すなわち、排水中のアンモニアをアンモニア酸化
細菌および亜硝酸酸化細菌を用いて硝酸に酸化し、さら
に窒素呼吸能を持つ細菌によって硝酸を還元し、窒素ガ
スとして空気中に放出する。このようなプロセスのアン
モニア酸化過程において、アンモニア酸化細菌は必要不
可欠な微生物であり、ニトロソモナス属細菌の研究が最
も進んでいる。
環境中の窒素循環を模擬したプロセスによって行われて
いる。すなわち、排水中のアンモニアをアンモニア酸化
細菌および亜硝酸酸化細菌を用いて硝酸に酸化し、さら
に窒素呼吸能を持つ細菌によって硝酸を還元し、窒素ガ
スとして空気中に放出する。このようなプロセスのアン
モニア酸化過程において、アンモニア酸化細菌は必要不
可欠な微生物であり、ニトロソモナス属細菌の研究が最
も進んでいる。
【０００４】ニトロソモナス属細菌を遺伝子工学的手法
を用いた育種によって機能改変することにより、新たな
機能が付与された菌株、例えばアンモニア酸化効率の高
い菌株、アンモニア・亜硝酸両方を酸化できる菌株、硝
化・脱窒能を両方兼ね備えた菌株などを構築することが
可能になる。
を用いた育種によって機能改変することにより、新たな
機能が付与された菌株、例えばアンモニア酸化効率の高
い菌株、アンモニア・亜硝酸両方を酸化できる菌株、硝
化・脱窒能を両方兼ね備えた菌株などを構築することが
可能になる。
【０００５】現在、宿主となる微生物細胞への外来遺伝
子の導入には、プラスミドまたはファージをベクターと
して利用して導入する遺伝子工学的手法が一般的に用い
られている。具体的な方法としては、接合伝達法、陽イ
オン処理法、プロトプラスト法、エレクトロポレーショ
ン法などが知られている。ベクターとして用いられるプ
ラスミド、ファージは通常宿主または宿主が属する細菌
群の別株から見出されるが、宿主の種類に対して幅広い
対応を持つプラスミドの存在も知られており、進化学的
に極めて遠縁の微生物から分離されたプラスミドでもベ
クターとして利用できる場合もある。このようなベクタ
ーに外来ＤＮＡを連結し、このベクターを宿主に導入し
て形質転換することにより、宿主に新たな形質を付与す
ることが可能になる。
子の導入には、プラスミドまたはファージをベクターと
して利用して導入する遺伝子工学的手法が一般的に用い
られている。具体的な方法としては、接合伝達法、陽イ
オン処理法、プロトプラスト法、エレクトロポレーショ
ン法などが知られている。ベクターとして用いられるプ
ラスミド、ファージは通常宿主または宿主が属する細菌
群の別株から見出されるが、宿主の種類に対して幅広い
対応を持つプラスミドの存在も知られており、進化学的
に極めて遠縁の微生物から分離されたプラスミドでもベ
クターとして利用できる場合もある。このようなベクタ
ーに外来ＤＮＡを連結し、このベクターを宿主に導入し
て形質転換することにより、宿主に新たな形質を付与す
ることが可能になる。
【０００６】しかしながら、ニトロソモナス属細菌内に
存在するプラスミドは知られておらず、またニトロソモ
ナス属細菌用のベクターとして利用することができる異
種微生物のプラスミドやニトロソモナス属細菌に感染す
るファージも知られていない。このためニトロソモナス
属細菌にベクターを用いて外来遺伝子を導入することは
できないのが現状である。
存在するプラスミドは知られておらず、またニトロソモ
ナス属細菌用のベクターとして利用することができる異
種微生物のプラスミドやニトロソモナス属細菌に感染す
るファージも知られていない。このためニトロソモナス
属細菌にベクターを用いて外来遺伝子を導入することは
できないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ニト
ロソモナス属細菌に遺伝子を効率よく導入することがで
きるニトロソモナス属細菌用ベクター、およびこれを用
いたニトロソモナス属細菌の宿主−ベクター系を提供す
ることである。
ロソモナス属細菌に遺伝子を効率よく導入することがで
きるニトロソモナス属細菌用ベクター、およびこれを用
いたニトロソモナス属細菌の宿主−ベクター系を提供す
ることである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は次のニトロソモ
ナス属細菌用のベクターおよび宿主−ベクター系であ
る。 （１）ニトロソモナス（Nitorosomonas）属細菌を宿主
とするベクターにおいて、ＩｎｃＱ系のプラスミドから
なることを特徴とするニトロソモナス属細菌用ベクタ
ー。 （２）ニトロソモナス（Nitorosomonas）属細菌を宿主
とし、ＩｎｃＱ系のプラスミドをベクターとすることを
特徴とするニトロソモナス属細菌の宿主−ベクター系。
ナス属細菌用のベクターおよび宿主−ベクター系であ
る。 （１）ニトロソモナス（Nitorosomonas）属細菌を宿主
とするベクターにおいて、ＩｎｃＱ系のプラスミドから
なることを特徴とするニトロソモナス属細菌用ベクタ
ー。 （２）ニトロソモナス（Nitorosomonas）属細菌を宿主
とし、ＩｎｃＱ系のプラスミドをベクターとすることを
特徴とするニトロソモナス属細菌の宿主−ベクター系。
【０００９】本発明において宿主として使用するニトロ
ソモナス（Nitorosomonas）属細菌はアンモニアを酸化
して亜硝酸を生成し、このとき得られるエネルギーを用
いて二酸化炭素の同化を行う独立栄養細菌であり、具体
的にはNitorosomonas europaeaなどが使用できる。ニト
ロソモナス属細菌はＡＴＣＣ（American Type Culture
Collection)、ＩＦＯ（Institute for Fermentation, O
saka）などの公的微生物保存機関から入手可能であり、
これらの機関から分譲されたものを使用することができ
る。具体的には、Nitorosomonas europaea IFO14298株
などがあげられる。またニトロソモナス属細菌は土壌、
海水、廃水処理プラントなどの環境中に広範囲に生息し
ており、これらの環境中から分離した菌株を使用するこ
ともできる。
ソモナス（Nitorosomonas）属細菌はアンモニアを酸化
して亜硝酸を生成し、このとき得られるエネルギーを用
いて二酸化炭素の同化を行う独立栄養細菌であり、具体
的にはNitorosomonas europaeaなどが使用できる。ニト
ロソモナス属細菌はＡＴＣＣ（American Type Culture
Collection)、ＩＦＯ（Institute for Fermentation, O
saka）などの公的微生物保存機関から入手可能であり、
これらの機関から分譲されたものを使用することができ
る。具体的には、Nitorosomonas europaea IFO14298株
などがあげられる。またニトロソモナス属細菌は土壌、
海水、廃水処理プラントなどの環境中に広範囲に生息し
ており、これらの環境中から分離した菌株を使用するこ
ともできる。
【００１０】ニトロソモナス属細菌を生育させる培地と
しては、エネルギー源としてアンモニアまたはアンモニ
ウム塩を含み、さらに無機塩としてカリウム、ナトリウ
ム、リン酸、マグネシウム、カルシウム等の各種塩類を
含む培地を使用することができる。培養温度はニトロソ
モナス属細菌が良好に生育する温度、好ましくは２５〜
３０℃がよい。培地ｐＨは６．５〜８．５、好ましくは
７．５〜８．０の範囲に保つことが望ましい。培養中、
亜硝酸の生成によってｐＨが低下するので、ｐＨ計やフ
ェノールレッド、クレゾールレッド等のｐＨインディケ
ーターを用いて培地ｐＨをモニターし、ｐＨ低下が観察
された時点でアルカリ性の溶液を培地中に添加してｐＨ
を前記値に保つことが好ましい。振盪または通気によっ
て好気的に暗所で培養を行い、菌体が対数増殖期にあり
菌体濃度が高まった時点、好ましくは菌体濃度として１
０5〜１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時点で集菌するの
が好ましい。増殖した菌体は遠心分離、膜濃縮などの方
法を用いて集菌することができる。
しては、エネルギー源としてアンモニアまたはアンモニ
ウム塩を含み、さらに無機塩としてカリウム、ナトリウ
ム、リン酸、マグネシウム、カルシウム等の各種塩類を
含む培地を使用することができる。培養温度はニトロソ
モナス属細菌が良好に生育する温度、好ましくは２５〜
３０℃がよい。培地ｐＨは６．５〜８．５、好ましくは
７．５〜８．０の範囲に保つことが望ましい。培養中、
亜硝酸の生成によってｐＨが低下するので、ｐＨ計やフ
ェノールレッド、クレゾールレッド等のｐＨインディケ
ーターを用いて培地ｐＨをモニターし、ｐＨ低下が観察
された時点でアルカリ性の溶液を培地中に添加してｐＨ
を前記値に保つことが好ましい。振盪または通気によっ
て好気的に暗所で培養を行い、菌体が対数増殖期にあり
菌体濃度が高まった時点、好ましくは菌体濃度として１
０5〜１０7ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなった時点で集菌するの
が好ましい。増殖した菌体は遠心分離、膜濃縮などの方
法を用いて集菌することができる。
【００１１】一般に複製機構や分配機構が同じである類
縁の２種プラスミドを同一宿主に導入した場合、これら
は安定に共存することができない。この現象は不和合性
（incompatibility）と呼ばれている。プラスミドの分
類には不和合性を利用した分類法が提唱されており、不
和合性を示すプラスミドはひとつの不和合性グループと
してグループ化される。現在、３０程度のグループ（例
えば、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ・・・・）が知られている。
縁の２種プラスミドを同一宿主に導入した場合、これら
は安定に共存することができない。この現象は不和合性
（incompatibility）と呼ばれている。プラスミドの分
類には不和合性を利用した分類法が提唱されており、不
和合性を示すプラスミドはひとつの不和合性グループと
してグループ化される。現在、３０程度のグループ（例
えば、ＩｎｃＡ、ＩｎｃＢ・・・・）が知られている。
【００１２】本発明のニトロソモナス属細菌用ベクター
はＩｎｃＱ系の不和合性グループに属するプラスミドか
らなる。ＩｎｃＱ系のプラスミドは、通常グラム陰性細
菌の広宿主域プラスミドであり、公知であるが、ニトロ
ソモナス属細菌用のベクターとして使用された例はな
い。
はＩｎｃＱ系の不和合性グループに属するプラスミドか
らなる。ＩｎｃＱ系のプラスミドは、通常グラム陰性細
菌の広宿主域プラスミドであり、公知であるが、ニトロ
ソモナス属細菌用のベクターとして使用された例はな
い。
【００１３】本発明におけるＩｎｃＱ系のプラスミドの
具体的なものとしては、ＲＳＦ１０１０（J. Bacterio
l., 117, 619(1974))、ｐＫＴ２４０（Gene, 26, 273(1
983))、ｐＫＴ２３０（Gene 16, 237(1981))、およびこ
れらのプラスミドから派生したものなどがあげられる。
なお、ＲＳＦ１０１０の全塩基配列はGene, 75(1989)27
1-288に記載されている。
具体的なものとしては、ＲＳＦ１０１０（J. Bacterio
l., 117, 619(1974))、ｐＫＴ２４０（Gene, 26, 273(1
983))、ｐＫＴ２３０（Gene 16, 237(1981))、およびこ
れらのプラスミドから派生したものなどがあげられる。
なお、ＲＳＦ１０１０の全塩基配列はGene, 75(1989)27
1-288に記載されている。
【００１４】本発明におけるＩｎｃＱ系のプラスミドは
プラスミドが導入された細胞を選択するためのマーカー
遺伝子を有している必要がある。マーカー遺伝子として
は、宿主の遺伝的形質を変化させるものがよい。例え
ば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子やルシフェラーゼ遺伝
子のように発色基質、発光基質等の存在で宿主に発色・
発光等の表現形質を与えるもの；アミノ酸合成系の遺伝
子のように宿主の栄養要求性を相補できるもの；カナマ
イシンやアンピシリン等の抗生物質に対する耐性遺伝子
のように薬剤に対する耐性を宿主に与えるものなどが適
当であるが、スクリーニングの容易さから抗生物質耐性
を宿主に与えるマーカー遺伝子が適している。具体的な
抗生物質耐性遺伝子としては、アミノグルコシド ３′
−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（カナマイシン耐性
遺伝子）などがあげられる。
プラスミドが導入された細胞を選択するためのマーカー
遺伝子を有している必要がある。マーカー遺伝子として
は、宿主の遺伝的形質を変化させるものがよい。例え
ば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子やルシフェラーゼ遺伝
子のように発色基質、発光基質等の存在で宿主に発色・
発光等の表現形質を与えるもの；アミノ酸合成系の遺伝
子のように宿主の栄養要求性を相補できるもの；カナマ
イシンやアンピシリン等の抗生物質に対する耐性遺伝子
のように薬剤に対する耐性を宿主に与えるものなどが適
当であるが、スクリーニングの容易さから抗生物質耐性
を宿主に与えるマーカー遺伝子が適している。具体的な
抗生物質耐性遺伝子としては、アミノグルコシド ３′
−ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（カナマイシン耐性
遺伝子）などがあげられる。
【００１５】前記ｐＫＴ２４０は前記ＲＳＦ１０１０に
由来するプラスミドであって、アンピシリン耐性遺伝
子、およびカナマイシン耐性遺伝子などを有する１２．
９ｋｂのプラスミドである。ｐＫＴ２４０はＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｐａＩ、ＳｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、
ＣｌａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｔＥIIなどの制限酵素切断部
位を有しており、この部位をクローニングサイトとして
外来遺伝子を連結することができる。ｐＫＴ２４０はＡ
ＴＣＣから入手できる（ATCC No.37258; ATCC Catalogu
e of Recombinant DNA Materials 2nd edition, 199
1)。
由来するプラスミドであって、アンピシリン耐性遺伝
子、およびカナマイシン耐性遺伝子などを有する１２．
９ｋｂのプラスミドである。ｐＫＴ２４０はＥｃｏＲ
Ｉ、ＨｐａＩ、ＳｓｔＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII、
ＣｌａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｔＥIIなどの制限酵素切断部
位を有しており、この部位をクローニングサイトとして
外来遺伝子を連結することができる。ｐＫＴ２４０はＡ
ＴＣＣから入手できる（ATCC No.37258; ATCC Catalogu
e of Recombinant DNA Materials 2nd edition, 199
1)。
【００１６】前記ｐＫＴ２３０は前記ＲＳＦ１０１０に
由来するプラスミドであって、カナマイシン耐性遺伝
子、およびストレプトマイシン遺伝子などを有する１
１．９ｋｂのプラスミドである。ｐＫＴ２３０はＨｉｎ
ｄIII、ＢａｍＨＩ、ＸｍａＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＳｓｔＩ、ＢｓｔＥIIなどの制限酵素切断部位を有
しており、この部位をクローニングサイトとして外来遺
伝子を連結することができる。ｐＫＴ２３０はＡＴＣＣ
から入手できる（ATCC No.37294; 前記ＡＴＣＣのカタ
ログ）。
由来するプラスミドであって、カナマイシン耐性遺伝
子、およびストレプトマイシン遺伝子などを有する１
１．９ｋｂのプラスミドである。ｐＫＴ２３０はＨｉｎ
ｄIII、ＢａｍＨＩ、ＸｍａＩ、ＸｈｏＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＳｓｔＩ、ＢｓｔＥIIなどの制限酵素切断部位を有
しており、この部位をクローニングサイトとして外来遺
伝子を連結することができる。ｐＫＴ２３０はＡＴＣＣ
から入手できる（ATCC No.37294; 前記ＡＴＣＣのカタ
ログ）。
【００１７】本発明におけるＩｎｃＱ系のプラスミドは
必ずしもニトロソモナス属細菌を宿主とする組換体から
抽出・調製する必要はなく、大腸菌等のグラム陰性細菌
を宿主とする組換体から抽出・調製することができる。
必ずしもニトロソモナス属細菌を宿主とする組換体から
抽出・調製する必要はなく、大腸菌等のグラム陰性細菌
を宿主とする組換体から抽出・調製することができる。
【００１８】本発明のニトロソモナス属細菌の宿主−ベ
クター系は、前記ニトロソモナス属細菌を宿主とし、前
記ＩｎｃＱ系のプラスミドをベクターとする宿主−ベク
ター系であり、この宿主−ベクター系を用いることによ
り、発現させようとするタンパク質をコードするＤＮＡ
をベクターに連結して宿主となるニトロソモナス属細菌
に導入することで、ニトロソモナス属細菌を遺伝子工学
的に育種することが可能である。
クター系は、前記ニトロソモナス属細菌を宿主とし、前
記ＩｎｃＱ系のプラスミドをベクターとする宿主−ベク
ター系であり、この宿主−ベクター系を用いることによ
り、発現させようとするタンパク質をコードするＤＮＡ
をベクターに連結して宿主となるニトロソモナス属細菌
に導入することで、ニトロソモナス属細菌を遺伝子工学
的に育種することが可能である。
【００１９】宿主となるニトロソモナス属細菌にＩｎｃ
Ｑ系のプラスミドを導入する方法としては、エレクトロ
ポレーション法、接合伝達法、カルシウム処理法、プロ
トプラスト法など、公知の宿主へのプラスミド（ベクタ
ー）の導入法が採用できる。
Ｑ系のプラスミドを導入する方法としては、エレクトロ
ポレーション法、接合伝達法、カルシウム処理法、プロ
トプラスト法など、公知の宿主へのプラスミド（ベクタ
ー）の導入法が採用できる。
【００２０】エレクトロポレーション法によりニトロソ
モナス属細菌にＩｎｃＱ系のプラスミドを導入する場
合、ニトロソモナス属細菌の菌体懸濁液にＩｎｃＱ系の
プラスミド溶液を混合し、この宿主−ベクター混合液に
５〜２５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは１２．５ｋＶ／ｃｍ以
上の電気パルスを１〜１５ｍｓｅｃ、好ましくは約５ｍ
ｓｅｃ与えるのが望ましい。具体的な操作としては、宿
主−ベクター混合液を電極と連結可能な構造を持つ容器
に移し、陰陽両電極を介してパルス発生装置と連結し、
電気パルスを負荷する。電気パルスの瞬間的な負荷によ
って、宿主の細胞膜・内細胞膜・細胞壁に孔があき、こ
の孔からベクターが細胞内に導入される。
モナス属細菌にＩｎｃＱ系のプラスミドを導入する場
合、ニトロソモナス属細菌の菌体懸濁液にＩｎｃＱ系の
プラスミド溶液を混合し、この宿主−ベクター混合液に
５〜２５ｋＶ／ｃｍ、好ましくは１２．５ｋＶ／ｃｍ以
上の電気パルスを１〜１５ｍｓｅｃ、好ましくは約５ｍ
ｓｅｃ与えるのが望ましい。具体的な操作としては、宿
主−ベクター混合液を電極と連結可能な構造を持つ容器
に移し、陰陽両電極を介してパルス発生装置と連結し、
電気パルスを負荷する。電気パルスの瞬間的な負荷によ
って、宿主の細胞膜・内細胞膜・細胞壁に孔があき、こ
の孔からベクターが細胞内に導入される。
【００２１】上記ニトロソモナス属細菌の菌体懸濁液と
しては、前述のような方法で集菌した菌体を、例えば次
のような方法により懸濁して形質転換に使用する。すな
わち、氷中で冷却した後、予め冷却しておいた１０％グ
リセリン溶液または１０％ショ糖溶液などの高張緩衝液
を用いて洗浄する。この高張緩衝液は無機塩、金属イオ
ン等をほとんど含まない低イオン濃度の溶液であること
が好ましい。さらに同じ緩衝液を用いて高菌体濃度、好
ましくは終濃度１０8〜１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌになる
ように懸濁する。この懸濁液は数分ないし１時間程度の
短時間であれば氷中で保存しておいても差支えない。
しては、前述のような方法で集菌した菌体を、例えば次
のような方法により懸濁して形質転換に使用する。すな
わち、氷中で冷却した後、予め冷却しておいた１０％グ
リセリン溶液または１０％ショ糖溶液などの高張緩衝液
を用いて洗浄する。この高張緩衝液は無機塩、金属イオ
ン等をほとんど含まない低イオン濃度の溶液であること
が好ましい。さらに同じ緩衝液を用いて高菌体濃度、好
ましくは終濃度１０8〜１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌになる
ように懸濁する。この懸濁液は数分ないし１時間程度の
短時間であれば氷中で保存しておいても差支えない。
【００２２】前記プラスミド溶液としては、前記Ｉｎｃ
Ｑ系のプラスミドを適当な水性媒体に溶解して用いるこ
とができるが、水またはＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液などの
低塩濃度の水溶液に溶解して用いるのが好ましい。
Ｑ系のプラスミドを適当な水性媒体に溶解して用いるこ
とができるが、水またはＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）緩衝液などの
低塩濃度の水溶液に溶解して用いるのが好ましい。
【００２３】接合伝達法によりニトロソモナス属細菌に
ＩｎｃＱ系のプラスミドを導入する場合、ＩｎｃＱ系の
プラスミドは単独では伝達能力を持たないので供与菌と
してはＩｎｃＱ系のプラスミドの伝達に必要なｔｒａ遺
伝子群をプラスミド上または染色体上に内在するグラム
陰性細菌を用いることが望ましい。このような供与菌を
用いることによって、可動化（mobilization）により、
高頻度にニトロソモナス属細菌にＩｎｃＱ系のプラスミ
ドを導入することができる。
ＩｎｃＱ系のプラスミドを導入する場合、ＩｎｃＱ系の
プラスミドは単独では伝達能力を持たないので供与菌と
してはＩｎｃＱ系のプラスミドの伝達に必要なｔｒａ遺
伝子群をプラスミド上または染色体上に内在するグラム
陰性細菌を用いることが望ましい。このような供与菌を
用いることによって、可動化（mobilization）により、
高頻度にニトロソモナス属細菌にＩｎｃＱ系のプラスミ
ドを導入することができる。
【００２４】ＩｎｃＱ系のプラスミドは、前述の供与菌
にエレクトロポレーション、カルシウム処理法等の方法
により、あらかじめ導入しておかなければならない。得
られたＩｎｃＱ系のプラスミドを含む供与菌と受容菌で
あるニトロソモナス属細菌とを混合して培養することに
よって、供与菌から受容菌へのＩｎｃＱ系のプラスミド
の移行が起こる。
にエレクトロポレーション、カルシウム処理法等の方法
により、あらかじめ導入しておかなければならない。得
られたＩｎｃＱ系のプラスミドを含む供与菌と受容菌で
あるニトロソモナス属細菌とを混合して培養することに
よって、供与菌から受容菌へのＩｎｃＱ系のプラスミド
の移行が起こる。
【００２５】この場合、生育培地としては、供与菌、受
容菌がともに生育可能な培地を用いる必要があり、また
両者がともに生育可能な温度下で培養しなければならな
い。また、接合伝達に必要な時間は数分〜数時間である
が、伝達後プラスミド上のマーカー遺伝子が充分発現す
る時間、好ましくは１〜４日程度培養することが望まし
い。
容菌がともに生育可能な培地を用いる必要があり、また
両者がともに生育可能な温度下で培養しなければならな
い。また、接合伝達に必要な時間は数分〜数時間である
が、伝達後プラスミド上のマーカー遺伝子が充分発現す
る時間、好ましくは１〜４日程度培養することが望まし
い。
【００２６】ＩｎｃＱ系のプラスミドの導入後は、プラ
スミド導入時の菌体損傷の回復、およびプラスミドにコ
ードされた遺伝子の発現を行うための培養を行う。菌体
を生育させる培地としては、エネルギー源としてアンモ
ニアまたはアンモニウム塩を含み、さらに無機塩として
カリウム、ナトリウム、リン酸、マグネシウム、カルシ
ウム等の各種塩類を含む培地を使用することができる。
培養温度はニトロソモナス属細菌が良好に生育する温
度、好ましくは２５〜３０℃がよい。初発培地ｐＨは８
前後が好ましい。このような条件で、暗所で振盪または
通気によって好気的に培養を行うのが好ましい。培養期
間は菌体損傷が充分回復し、マーカー遺伝子が充分発現
する期間、例えば１〜５日間の培養を行えばよい。
スミド導入時の菌体損傷の回復、およびプラスミドにコ
ードされた遺伝子の発現を行うための培養を行う。菌体
を生育させる培地としては、エネルギー源としてアンモ
ニアまたはアンモニウム塩を含み、さらに無機塩として
カリウム、ナトリウム、リン酸、マグネシウム、カルシ
ウム等の各種塩類を含む培地を使用することができる。
培養温度はニトロソモナス属細菌が良好に生育する温
度、好ましくは２５〜３０℃がよい。初発培地ｐＨは８
前後が好ましい。このような条件で、暗所で振盪または
通気によって好気的に培養を行うのが好ましい。培養期
間は菌体損傷が充分回復し、マーカー遺伝子が充分発現
する期間、例えば１〜５日間の培養を行えばよい。
【００２７】培養後の菌体は選択培地に移して、プラス
ミドが導入された細胞だけを選別するための培養を行
う。培地としては、エネルギー源としてアンモニアまた
はアンモニウム塩を含み、さらに無機塩としてカリウ
ム、ナトリウム、リン酸、マグネシウム、カルシウム等
の各種塩類を含む培地が好ましい。そしてプラスミドが
導入された細胞だけを選別できるように培養条件を設定
する必要があり、例えばマーカー遺伝子として抗生物質
耐性遺伝子を用いている場合は、培地中に選択圧として
抗生物質を添加する。接合伝達法を採用した場合は、供
与菌の生育を抑えるための選択圧も加える必要があり、
例えば宿主（受容菌）は耐性を持つが、供与菌は感受性
を持つ薬剤を培地中に添加する。培地の形状としては、
寒天、ゲランガム、シリカゲル等のゲル化剤を用いて固
化させたものが好ましい。
ミドが導入された細胞だけを選別するための培養を行
う。培地としては、エネルギー源としてアンモニアまた
はアンモニウム塩を含み、さらに無機塩としてカリウ
ム、ナトリウム、リン酸、マグネシウム、カルシウム等
の各種塩類を含む培地が好ましい。そしてプラスミドが
導入された細胞だけを選別できるように培養条件を設定
する必要があり、例えばマーカー遺伝子として抗生物質
耐性遺伝子を用いている場合は、培地中に選択圧として
抗生物質を添加する。接合伝達法を採用した場合は、供
与菌の生育を抑えるための選択圧も加える必要があり、
例えば宿主（受容菌）は耐性を持つが、供与菌は感受性
を持つ薬剤を培地中に添加する。培地の形状としては、
寒天、ゲランガム、シリカゲル等のゲル化剤を用いて固
化させたものが好ましい。
【００２８】培養温度は２５〜３０℃、初発培地ｐＨは
８前後が好ましい。このような条件のもとに、暗所で２
〜４週間、菌体が充分生育するまで培養を行い、マーカ
ー遺伝子が発現した細胞をプラスミドが導入された細胞
として分離することができる。
８前後が好ましい。このような条件のもとに、暗所で２
〜４週間、菌体が充分生育するまで培養を行い、マーカ
ー遺伝子が発現した細胞をプラスミドが導入された細胞
として分離することができる。
【００２９】以上のような方法によりニトロソモナス属
細菌にベクターを導入できるので、本発明のＩｎｃＱ系
のプラスミドに目的とする遺伝子を連結して導入するこ
とにより、例えばアンモニア酸化効率の高いニトロソモ
ナス属細菌、アンモニアおよび亜硝酸の両方を酸化でき
るニトロソモナス属細菌、硝化および脱窒能の両方を兼
ね備えたニトロソモナス属細菌などを構築することが可
能である。そしてこのような菌株は環境浄化における排
水中の窒素除去プロセスに好適に利用することができ
る。
細菌にベクターを導入できるので、本発明のＩｎｃＱ系
のプラスミドに目的とする遺伝子を連結して導入するこ
とにより、例えばアンモニア酸化効率の高いニトロソモ
ナス属細菌、アンモニアおよび亜硝酸の両方を酸化でき
るニトロソモナス属細菌、硝化および脱窒能の両方を兼
ね備えたニトロソモナス属細菌などを構築することが可
能である。そしてこのような菌株は環境浄化における排
水中の窒素除去プロセスに好適に利用することができ
る。
【００３０】
【発明の効果】本発明のニトロソモナス属細菌用ベクタ
ーは、従来ベクターが知られていないニトロソモナス属
細菌用のベクターであり、本発明のニトロソモナス属細
菌用ベクターを用いることにより、宿主となるニトロソ
モナス属細菌に効率よく遺伝子を導入することができ
る。本発明のニトロソモナス属細菌の宿主−ベクター系
は、上記ベクターを使用しているので、宿主となるニト
ロソモナス属細菌に効率よく遺伝子を導入することがで
きる。
ーは、従来ベクターが知られていないニトロソモナス属
細菌用のベクターであり、本発明のニトロソモナス属細
菌用ベクターを用いることにより、宿主となるニトロソ
モナス属細菌に効率よく遺伝子を導入することができ
る。本発明のニトロソモナス属細菌の宿主−ベクター系
は、上記ベクターを使用しているので、宿主となるニト
ロソモナス属細菌に効率よく遺伝子を導入することがで
きる。
【００３１】
【発明の実施の形態】次に本発明の実施例について説明
する。実施例で使用したプラスミド、微生物などは次の
通りである。 《Nitrosomonas europaea IFO14298株》ＩＦＯ発行の
「LIST OF CULTURES 1992 MICROORGANISMS NINTH EDITI
ON」に記載されている。
する。実施例で使用したプラスミド、微生物などは次の
通りである。 《Nitrosomonas europaea IFO14298株》ＩＦＯ発行の
「LIST OF CULTURES 1992 MICROORGANISMS NINTH EDITI
ON」に記載されている。
【００３２】《ｐＫＴ２４０》ＩｎｃＱ系のプラスミ
ド。ＡＴＣＣから入手できる。ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７２
５８（Catalogue of Recombinant DNA Materials 2nd e
dition, 1991）。 《Escherichia coli S17-1》ＩｎｃＰ系プラスミドＲＰ
４を染色体上に内在する大腸菌であって、作成方法はBI
O/TECHNOLOGY 1, 784-791(1983)に記載されており、ま
たUS. Department ofAgriculture, Northern Regional
Research Centerに寄託されている（Accession No.B-15
483, US. Patent 4,680,264）。
ド。ＡＴＣＣから入手できる。ＡＴＣＣ Ｎｏ．３７２
５８（Catalogue of Recombinant DNA Materials 2nd e
dition, 1991）。 《Escherichia coli S17-1》ＩｎｃＰ系プラスミドＲＰ
４を染色体上に内在する大腸菌であって、作成方法はBI
O/TECHNOLOGY 1, 784-791(1983)に記載されており、ま
たUS. Department ofAgriculture, Northern Regional
Research Centerに寄託されている（Accession No.B-15
483, US. Patent 4,680,264）。
【００３３】《Ｐ培地》（ＮＨ4）2ＳＯ4＝２．５ｇ／
ｌ、ＫＨ2ＰＯ4＝０．７ｇ／ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4＝１３．
５ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ3＝０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ＝０．１ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ＝５ｍｇ／
ｌ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ＝１ｍｇ／ｌ、ｐＨ８．０ 《ＬＢ培地》バクト−トリプトン（ディフコ社）＝１０
ｇ／ｌ、バクト−イーストエキストラクト（ディフコ
社）＝５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ＝５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０ 《メイティング用培地》バクト−トリプトン（ディフコ
社）＝１．０ｇ／ｌ、バクト−イーストエキストラクト
（ディフコ社）＝５ｇ／ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4＝２．５
ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4＝０．７ｇ／ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4＝１
３．５ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ3＝０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ＝０．１ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ＝５ｍ
ｇ／ｌ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ＝１ｍｇ／ｌ、ゲランガム＝１
０ｇ／ｌ、ｐＨ７．５
ｌ、ＫＨ2ＰＯ4＝０．７ｇ／ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4＝１３．
５ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ3＝０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4・７
Ｈ2Ｏ＝０．１ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ＝５ｍｇ／
ｌ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ＝１ｍｇ／ｌ、ｐＨ８．０ 《ＬＢ培地》バクト−トリプトン（ディフコ社）＝１０
ｇ／ｌ、バクト−イーストエキストラクト（ディフコ
社）＝５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ＝５ｇ／ｌ、ｐＨ７．０ 《メイティング用培地》バクト−トリプトン（ディフコ
社）＝１．０ｇ／ｌ、バクト−イーストエキストラクト
（ディフコ社）＝５ｇ／ｌ、（ＮＨ4）2ＳＯ4＝２．５
ｇ／ｌ、ＫＨ2ＰＯ4＝０．７ｇ／ｌ、Ｎａ2ＨＰＯ4＝１
３．５ｇ／ｌ、ＮａＨＣＯ3＝０．５ｇ／ｌ、ＭｇＳＯ4
・７Ｈ2Ｏ＝０．１ｇ／ｌ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ＝５ｍ
ｇ／ｌ、Ｆｅ−ＥＤＴＡ＝１ｍｇ／ｌ、ゲランガム＝１
０ｇ／ｌ、ｐＨ７．５
【００３４】実施例１Nitrosomonas europaea IFO14298株を１００ｍｌのＰ培
地を含む培養用フラスコに植菌して、暗所で３０℃、１
４日間の振盪培養を行い、前培養とした。この前培養液
３０ｍｌを、３ literのＰ培地を含む５ liter容発酵槽
に植種し、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌数２５０ｒｐｍ、
３０℃の条件で１０日間暗所で培養した。培地ｐＨは
８．０を保つようにｐＨ電極とＮａＯＨの添加を連動さ
せて調整した。培養終了時の菌濃度は７×１０5ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌであった。
地を含む培養用フラスコに植菌して、暗所で３０℃、１
４日間の振盪培養を行い、前培養とした。この前培養液
３０ｍｌを、３ literのＰ培地を含む５ liter容発酵槽
に植種し、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌数２５０ｒｐｍ、
３０℃の条件で１０日間暗所で培養した。培地ｐＨは
８．０を保つようにｐＨ電極とＮａＯＨの添加を連動さ
せて調整した。培養終了時の菌濃度は７×１０5ｃｅｌ
ｌｓ／ｍｌであった。
【００３５】上記培養液２．５ literをただちに氷中で
冷却し、遠心分離（８０００ｇ、１５分間）によって菌
体を集菌した。集菌した菌体は氷冷しておいた１０％グ
リセリン水溶液５０ｍｌに懸濁して洗浄した後、遠心分
離によって回収した。回収した菌体は、さらに氷冷１０
％グリセリン水溶液１ｍｌに懸濁し、氷中に１０分間置
いた。この時点で菌濃度は１．８×１０9ｃｅｌｌｓ／
ｍｌであった。
冷却し、遠心分離（８０００ｇ、１５分間）によって菌
体を集菌した。集菌した菌体は氷冷しておいた１０％グ
リセリン水溶液５０ｍｌに懸濁して洗浄した後、遠心分
離によって回収した。回収した菌体は、さらに氷冷１０
％グリセリン水溶液１ｍｌに懸濁し、氷中に１０分間置
いた。この時点で菌濃度は１．８×１０9ｃｅｌｌｓ／
ｍｌであった。
【００３６】上記懸濁液を４０μｌずつ、予め氷冷して
おいた１．５ｍｌ容量の微量遠沈管に分注した後、プラ
スミドｐＫＴ２４０を１００ｎｇ／μｌの濃度で含む水
溶液５μｌを混合し、さらに１分間氷冷した。この菌体
−プラスミド混合液を下記のようにして処理し、エレク
トロポレーション法により形質転換を行った。なお装置
としてはバイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）製のジー
ンパルサーおよびキュベットを使用した。すなわち、菌
体−プラスミド混合液４０μｌを氷冷しておいたキュベ
ット（電極間隔０．２ｃｍ）に移し、ただちにジーンパ
ルサー・キュベットチャンバーに装着して電気パルスを
かけた。パルスの設定条件は、５〜１２．５ｋＶ／ｃ
ｍ、５．０ｍｓｅｃとした。
おいた１．５ｍｌ容量の微量遠沈管に分注した後、プラ
スミドｐＫＴ２４０を１００ｎｇ／μｌの濃度で含む水
溶液５μｌを混合し、さらに１分間氷冷した。この菌体
−プラスミド混合液を下記のようにして処理し、エレク
トロポレーション法により形質転換を行った。なお装置
としてはバイオラッド社（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）製のジー
ンパルサーおよびキュベットを使用した。すなわち、菌
体−プラスミド混合液４０μｌを氷冷しておいたキュベ
ット（電極間隔０．２ｃｍ）に移し、ただちにジーンパ
ルサー・キュベットチャンバーに装着して電気パルスを
かけた。パルスの設定条件は、５〜１２．５ｋＶ／ｃ
ｍ、５．０ｍｓｅｃとした。
【００３７】パルス後、ただちにキュベットに１ｍｌの
新鮮なＰ培地を添加し、パスツールピペットを用いて菌
体−プラスミド混合液とよく混和した後、その全量を４
ｍｌのＰ培地を分注しておいた培養用試験管に移した。
培養用試験管より０．１ｍｌを生菌数測定用の試料とし
て分取した後、残りを３０℃で４日間、暗所で振盪培養
した。
新鮮なＰ培地を添加し、パスツールピペットを用いて菌
体−プラスミド混合液とよく混和した後、その全量を４
ｍｌのＰ培地を分注しておいた培養用試験管に移した。
培養用試験管より０．１ｍｌを生菌数測定用の試料とし
て分取した後、残りを３０℃で４日間、暗所で振盪培養
した。
【００３８】上記培養液を遠心分離（１０，０００ｇ×
１０分間）して菌体を回収し、０．１ｍｌの５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液全量を、
２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有したＰ平板培地
（１％（ｗ／ｖ）ゲランガムで固化したＰ培地）に塗布
し、３０℃で３週間培養した。形質転換された細胞は本
培地上で生育可能なカナマイシン耐性コロニーとして分
離された。
１０分間）して菌体を回収し、０．１ｍｌの５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁した。懸濁液全量を、
２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有したＰ平板培地
（１％（ｗ／ｖ）ゲランガムで固化したＰ培地）に塗布
し、３０℃で３週間培養した。形質転換された細胞は本
培地上で生育可能なカナマイシン耐性コロニーとして分
離された。
【００３９】表１に各設定電位における細胞生存率と形
質転換率を示す。
質転換率を示す。
【表１】
【００４０】実施例２Nitrosomonas europaea IFO14298株を１００ｍｌのＰ培
地を含む培養用フラスコに植菌して、暗所で３０℃、１
４日間の振盪培養を行い、前培養とした。この前培養液
３０ｍｌを、３ literのＰ培地を含む５ liter容発酵槽
に植種し、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌数２５０ｒｐｍ、
３０℃の条件で７日間暗所で培養した。培地ｐＨは８．
０を保つようにｐＨ電極とＮａＯＨの添加を連動させて
調整した。培養終了時の菌濃度は６×１０4ｃｅｌｌｓ
／ｍｌであった。
地を含む培養用フラスコに植菌して、暗所で３０℃、１
４日間の振盪培養を行い、前培養とした。この前培養液
３０ｍｌを、３ literのＰ培地を含む５ liter容発酵槽
に植種し、通気量０．５ｖｖｍ、攪拌数２５０ｒｐｍ、
３０℃の条件で７日間暗所で培養した。培地ｐＨは８．
０を保つようにｐＨ電極とＮａＯＨの添加を連動させて
調整した。培養終了時の菌濃度は６×１０4ｃｅｌｌｓ
／ｍｌであった。
【００４１】上記培養液２ literをただちに氷中で冷却
し、遠心分離（８０００ｇ、１５分間）によって菌体を
集菌した。集菌した菌体は氷冷しておいた５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して洗浄した後、遠心分
離によって回収した。回収した菌体は、さらに氷冷した
５０ｍＭリン酸緩衝液５０μｌに懸濁し、氷中に１０分
間置いた。この時点で菌濃度は２．４×１０9ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌであった（以下、Ｎ. europaea懸濁液とい
う）。
し、遠心分離（８０００ｇ、１５分間）によって菌体を
集菌した。集菌した菌体は氷冷しておいた５０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して洗浄した後、遠心分
離によって回収した。回収した菌体は、さらに氷冷した
５０ｍＭリン酸緩衝液５０μｌに懸濁し、氷中に１０分
間置いた。この時点で菌濃度は２．４×１０9ｃｅｌｌ
ｓ／ｍｌであった（以下、Ｎ. europaea懸濁液とい
う）。
【００４２】上記操作とは別に、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA., 69, 2110 (1972）記載の方法により、Escheri
chia coli S17-1株にｐＫＴ２４０を導入し、Escherich
iacoli S17-1（ｐＫＴ２４０）株を得た。この菌株を、
２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地５０
ｍｌを入れた培養用フラスコに植菌し、３７℃で１６時
間の振盪培養を行った。
i. USA., 69, 2110 (1972）記載の方法により、Escheri
chia coli S17-1株にｐＫＴ２４０を導入し、Escherich
iacoli S17-1（ｐＫＴ２４０）株を得た。この菌株を、
２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ培地５０
ｍｌを入れた培養用フラスコに植菌し、３７℃で１６時
間の振盪培養を行った。
【００４３】上記培養液約２０ｍｌをただちに氷中で冷
却し、遠心分離（８０００ｇ、１５分間）によって菌体
を集菌した。集菌した菌体は氷冷しておいた５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して洗浄した後、遠心
分離によって回収した。同様の洗浄をさらに２回繰返し
た後、菌体を氷冷した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）１ｍｌに懸濁し、氷中に１０分間置いた。この時点
で菌濃度は１．０×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった
（以下、Ｅ. coli（ｐＫＴ２４０）懸濁液という）。
却し、遠心分離（８０００ｇ、１５分間）によって菌体
を集菌した。集菌した菌体は氷冷しておいた５０ｍＭリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁して洗浄した後、遠心
分離によって回収した。同様の洗浄をさらに２回繰返し
た後、菌体を氷冷した５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．
０）１ｍｌに懸濁し、氷中に１０分間置いた。この時点
で菌濃度は１．０×１０10ｃｅｌｌｓ／ｍｌであった
（以下、Ｅ. coli（ｐＫＴ２４０）懸濁液という）。
【００４４】前記Ｎ. europaea懸濁液２５μｌとＥ. co
li（ｐＫＴ２４０）懸濁液１０μｌとを、予めメイティ
ング用培地上に置いた０．２２μｍのポアサイズのミリ
ポアフィルター上に滴下し、マイクロピペットを用いて
よく混合した。この混合物を３０℃で４日間暗所にて培
養した。
li（ｐＫＴ２４０）懸濁液１０μｌとを、予めメイティ
ング用培地上に置いた０．２２μｍのポアサイズのミリ
ポアフィルター上に滴下し、マイクロピペットを用いて
よく混合した。この混合物を３０℃で４日間暗所にて培
養した。
【００４５】上記培養液をフィルターごと氷冷しておい
た５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に移し、よく懸
濁した後、同緩衝液を用いて１０倍の希釈系列を作成し
た。懸濁液および希釈液各０．１ｍｌを、５μｇ／ｍｌ
のテトラサイクリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンを含有するＰ平板培地に塗布し、３０℃で３週間暗所
にて培養した。プラスミドが伝達された細胞（トランス
コンジュガント：transconjugant）は上記培地上で生育
可能なカナマイシン耐性コロニーとして分離された。伝
達頻度（全トランスコンジュガント／全受容菌）は１．
７×１０-5であった。
た５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に移し、よく懸
濁した後、同緩衝液を用いて１０倍の希釈系列を作成し
た。懸濁液および希釈液各０．１ｍｌを、５μｇ／ｍｌ
のテトラサイクリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシ
ンを含有するＰ平板培地に塗布し、３０℃で３週間暗所
にて培養した。プラスミドが伝達された細胞（トランス
コンジュガント：transconjugant）は上記培地上で生育
可能なカナマイシン耐性コロニーとして分離された。伝
達頻度（全トランスコンジュガント／全受容菌）は１．
７×１０-5であった。
【００４６】トランスコンジュガントは５μｇ／ｍｌの
テトラサイクリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシン
を含有するＰ培地で３０℃、２週間暗所で振盪培養し
た。再度、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２
５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＰ平板培地に塗
布し、３０℃で３週間培養してコロニーを純化し、トラ
ンスコンジュガントを得た。
テトラサイクリンおよび２５μｇ／ｍｌのカナマイシン
を含有するＰ培地で３０℃、２週間暗所で振盪培養し
た。再度、１０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２
５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＰ平板培地に塗
布し、３０℃で３週間培養してコロニーを純化し、トラ
ンスコンジュガントを得た。
【００４７】実施例３ 実施例１、２で得られた形質転換体およびトランスコン
ジュガントを、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有す
る１００ｍｌのＰ培地で２週間振盪培養を行い、次のよ
うにしてプラスミドの分離を行った。すなわち、培養液
５０ｍｌを氷冷後、遠心分離（１２，０００ｇ×１０分
間）によって菌体を回収し、１００μｌの５０ｍＭグル
コース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
１０ｍＭＥＤＴＡ溶液に懸濁し、１．５ｍｌ容量の微量
遠心管に移した。室温に１０分間置いた後、２００μｌ
の０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ溶液を加え、菌体を
溶菌させた。さらに、室温で１０分間置いた後、１５０
μｌの３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を加え、氷中に３
０分間放置した。
ジュガントを、２５μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有す
る１００ｍｌのＰ培地で２週間振盪培養を行い、次のよ
うにしてプラスミドの分離を行った。すなわち、培養液
５０ｍｌを氷冷後、遠心分離（１２，０００ｇ×１０分
間）によって菌体を回収し、１００μｌの５０ｍＭグル
コース、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、
１０ｍＭＥＤＴＡ溶液に懸濁し、１．５ｍｌ容量の微量
遠心管に移した。室温に１０分間置いた後、２００μｌ
の０．２Ｎ ＮａＯＨ、１％ＳＤＳ溶液を加え、菌体を
溶菌させた。さらに、室温で１０分間置いた後、１５０
μｌの３Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）を加え、氷中に３
０分間放置した。
【００４８】次に、遠心分離（１０，０００ｇ×５分
間）によって上澄液を分画し、これを新たな微量遠心管
に移した。さらに、４００μｌのＴＥ飽和、フェノール
・クロロホルム・イソアミルアルコール混液（２５：２
４：１）を加え、激しく攪拌した。遠心分離（１０，０
００ｇ×５分間）によって水層を分画した後、これを注
意深く分取し、新たな微量遠心管に移した。１ｍｌの氷
冷エタノールを加えてよく混合した後、−８０℃で３０
分間冷却した。遠心分離（１０，０００ｇ×１０分間）
によって得られた沈澱物を７０％エタノール水溶液でリ
ンスし、デシケーター中で減圧乾燥した。
間）によって上澄液を分画し、これを新たな微量遠心管
に移した。さらに、４００μｌのＴＥ飽和、フェノール
・クロロホルム・イソアミルアルコール混液（２５：２
４：１）を加え、激しく攪拌した。遠心分離（１０，０
００ｇ×５分間）によって水層を分画した後、これを注
意深く分取し、新たな微量遠心管に移した。１ｍｌの氷
冷エタノールを加えてよく混合した後、−８０℃で３０
分間冷却した。遠心分離（１０，０００ｇ×１０分間）
によって得られた沈澱物を７０％エタノール水溶液でリ
ンスし、デシケーター中で減圧乾燥した。
【００４９】得られた乾燥物を１０μｇ／ｍｌのＲＮａ
ｓｅＩを含むＴＥ溶液１０μｌに懸濁して試料とした。
この試料を１％アガロースゲル電気泳動にかけた後、エ
チジウムブロミド染色によってＤＮＡのバンドを検出し
た。結果を図１に示す。また試料を制限酵素で処理した
後、上記と同様にしてＤＮＡバンドを検出した。結果を
図２に示す。
ｓｅＩを含むＴＥ溶液１０μｌに懸濁して試料とした。
この試料を１％アガロースゲル電気泳動にかけた後、エ
チジウムブロミド染色によってＤＮＡのバンドを検出し
た。結果を図１に示す。また試料を制限酵素で処理した
後、上記と同様にしてＤＮＡバンドを検出した。結果を
図２に示す。
【００５０】図１において、レーン１はラムダファージ
ＤＮＡのＨｉｎｄIII消化物、レーン２は宿主由来の抽
出物、レーン３は実施例１で得られた形質転換体由来の
抽出物、レーン４は実施例２で得られたトランスコンジ
ュガント由来の抽出物を示す。図の左側の数字はラムダ
ファージＤＮＡのＨｉｎｄIII消化物の鎖長（ｋｂ）を
表す。なおレーン２は、宿主細胞をカナマイシンを含ま
ないＰ培地で培養して得た抽出物である。
ＤＮＡのＨｉｎｄIII消化物、レーン２は宿主由来の抽
出物、レーン３は実施例１で得られた形質転換体由来の
抽出物、レーン４は実施例２で得られたトランスコンジ
ュガント由来の抽出物を示す。図の左側の数字はラムダ
ファージＤＮＡのＨｉｎｄIII消化物の鎖長（ｋｂ）を
表す。なおレーン２は、宿主細胞をカナマイシンを含ま
ないＰ培地で培養して得た抽出物である。
【００５１】図２において、レーン１はラムダファージ
ＤＮＡのＨｉｎｄIII消化物、レーン２はｐＫＴ２４０
のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化物、レーン３はｐＫ
Ｔ２４０のＰｓｔＩ消化物、レーン４は実施例１で得ら
れた形質転換体より抽出したプラスミドのＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩ消化物、レーン５は実施例１で得られた
形質転換体より抽出したプラスミドのＰｓｔＩ消化物、
レーン６は実施例２で得られたトランスコンジュガント
より抽出したプラスミドのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
消化物、レーン７は実施例２で得られたトランスコンジ
ュガントより抽出したプラスミドのＰｓｔＩ消化物を示
す。図の左側の数字はラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄ
III消化物の鎖長（ｋｂ）を表す。
ＤＮＡのＨｉｎｄIII消化物、レーン２はｐＫＴ２４０
のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ消化物、レーン３はｐＫ
Ｔ２４０のＰｓｔＩ消化物、レーン４は実施例１で得ら
れた形質転換体より抽出したプラスミドのＥｃｏＲＩお
よびＢａｍＨＩ消化物、レーン５は実施例１で得られた
形質転換体より抽出したプラスミドのＰｓｔＩ消化物、
レーン６は実施例２で得られたトランスコンジュガント
より抽出したプラスミドのＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ
消化物、レーン７は実施例２で得られたトランスコンジ
ュガントより抽出したプラスミドのＰｓｔＩ消化物を示
す。図の左側の数字はラムダファージＤＮＡのＨｉｎｄ
III消化物の鎖長（ｋｂ）を表す。
【００５２】図１から明らかなように、宿主はプラスミ
ドＤＮＡを保持しないが（レーン２）、形質転換体およ
びトランスコンジュガント細胞内にはプラスミドＤＮＡ
の存在が確認された（レーン３、４）。また図２から明
らかなように、レーン４、５およびレーン６、７の分解
パターンはｐＫＴ２４０の分解パターン（レーン２、
３）と一致しているので、実施例１で得られた形質転換
体および実施例２で得られたトランスコンジュガントか
ら抽出したプラスミドはｐＫＴ２４０であることが確認
された。
ドＤＮＡを保持しないが（レーン２）、形質転換体およ
びトランスコンジュガント細胞内にはプラスミドＤＮＡ
の存在が確認された（レーン３、４）。また図２から明
らかなように、レーン４、５およびレーン６、７の分解
パターンはｐＫＴ２４０の分解パターン（レーン２、
３）と一致しているので、実施例１で得られた形質転換
体および実施例２で得られたトランスコンジュガントか
ら抽出したプラスミドはｐＫＴ２４０であることが確認
された。
【図１】実施例１で得られた形質転換体（レーン３）お
よび実施例２で得られたトランスコンジュガント（レー
ン４）のＤＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
よび実施例２で得られたトランスコンジュガント（レー
ン４）のＤＮＡの電気泳動パターンを示す図である。
【図２】実施例１で得られた形質転換体（レーン４、
５）および実施例２で得られたトランスコンジュガント
（レーン６、７）のＤＮＡの制限酵素消化物の電気泳動
パターンを示す図である。
５）および実施例２で得られたトランスコンジュガント
（レーン６、７）のＤＮＡの制限酵素消化物の電気泳動
パターンを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (2)
- 【請求項１】 ニトロソモナス（Nitorosomonas）属細
菌を宿主とするベクターにおいて、ＩｎｃＱ系のプラス
ミドからなることを特徴とするニトロソモナス属細菌用
ベクター。 - 【請求項２】 ニトロソモナス（Nitorosomonas）属細
菌を宿主とし、ＩｎｃＱ系のプラスミドをベクターとす
ることを特徴とするニトロソモナス属細菌の宿主−ベク
ター系。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3237696A JPH09224669A (ja) | 1996-02-20 | 1996-02-20 | ニトロソモナス属細菌用ベクターおよび宿主−ベクター系 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3237696A JPH09224669A (ja) | 1996-02-20 | 1996-02-20 | ニトロソモナス属細菌用ベクターおよび宿主−ベクター系 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09224669A true JPH09224669A (ja) | 1997-09-02 |
Family
ID=12357244
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3237696A Pending JPH09224669A (ja) | 1996-02-20 | 1996-02-20 | ニトロソモナス属細菌用ベクターおよび宿主−ベクター系 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09224669A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998035050A1 (fr) * | 1997-02-07 | 1998-08-13 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Plasmides tires de bacteries oxydant le gaz ammoniaque et leur utilisation |
-
1996
- 1996-02-20 JP JP3237696A patent/JPH09224669A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998035050A1 (fr) * | 1997-02-07 | 1998-08-13 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Plasmides tires de bacteries oxydant le gaz ammoniaque et leur utilisation |
| US6350577B1 (en) | 1997-02-07 | 2002-02-26 | Sumitomo Chemical Co., Ltd. | Plasmids originating in ammonia oxidizing bacteria and use of the same |
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