DE69836335T2

DE69836335T2 - Natürliche inhaltsstoffe enthaltende nahrungsergänzungsstoffe

Info

Publication number: DE69836335T2
Application number: DE69836335T
Authority: DE
Inventors: Lynn Rexburg PERKES
Original assignee: Melaleuca Inc
Current assignee: Melaleuca Inc
Priority date: 1997-08-06
Filing date: 1998-08-05
Publication date: 2007-05-24
Anticipated expiration: 2018-08-06
Also published as: JP4047538B2; EP1009417A1; TW542721B; CN101849675B; US6818233B2; CA2244512C; AU731089B2; AU8686898A; JP2001513332A; CA2244512A1; EP1009417B1; DE69836335D1; HK1027973A1; EP1009417A4; ATE344048T1; WO1999007400A1; US20020048575A1; CN1268891A; CN101849675A

Description

1. Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft Nahrungsergänzungsmittel, welche natürliche Inhaltsstoffe enthalten.
2. Sintergrundinformation
Koronare Arterienerkrankung, Myokardinfarkt, Schlaganfall und andere Gefäßverschlüsse sind bedeutende Gesundheitsbelange. Ein gemeinsames Kennzeichnen dieser Krankheiten ist der arteriosklerostische Vorgang, oder die Verengung von Arterien. Thrombozyten tragen zu der Entwicklung und dem Fortschreiten des arterioskletorischen Vorgangs durch Absondern von Wachstumsfaktoren, chemotaktischen Substanzen und anderen Faktoren bei, welche den arteriosklerotischen Vorgang beschleunigen. Weiterhin trägt eine Thrombozyten Aggregation an oder in der Nähe des Orts der arteriellen Beschädigung zu der Entwicklung von Arteriosklerose und der Bildung eines akuten Thrombozytenthrombus bei.
Cholesterin mit Lipoprotein geringer Dichte (LDL) wird auch mit Arteriosklerose in Verbindung gebracht. Es ist vorgeschlagen worden, dass nicht arterogenes LDL Cholesterin, welches sich im Blutkreislauf befindet, in arterogenes LDL Cholesterin durch Oxidation von polyunsaturierten Lipiden umgewandelt wird, was zur Modifikation des Apoproteins führt.
Ärzte verwenden verschiedene Medikamente, wie z. B. Aspirin, um arteriosklerotische Fälle zu behandeln. Aspirin ist jedoch nicht ohne negative Nebenwirkungen, welche Entzündungen im Magen-Darm-Bereich einschließen. Interventionen wie Angioplastie stehen auch zur Verfügung, um stenose Arterien zu erweitern und damit den Blutdurchfluss zu erhöhen. Interventionelle Verfahren verursachen intimale und mediale Arterienbeschädigungen und legen thrombogene Oberflächen frei. Somit ist Restenose und das Auftreten des plötzlichen Herztods nach einer Angioplastie eine erhebliche Besorgnis für Patienten mit bekannten oder anzunehmenden Koronararterienerkrankungen.
In Anbetracht der schwerwiegenden Auswirkungen von Arteriosklerose und der Kosten ärztlicher Behandlungen besteht ein Bedarf für pharmakologische und ernährungstechnische Interventionen, die geeignet sind, um das Auftreten und das Wiederauftreten dieser Bedingungen zu verhindern.
Epidemiologische Studien weisen eine inverse Korrelation zwischen der Aufnahme von diätetischen Flavonoiden aus Früchten und Gemüse, und dem Tod durch Koronararterienerkrankungen aus. Diese Korrelation tritt vermutlich wegen der antioxidierenden und Thrombozyten hemmenden Eigenschaften von in Früchten und Gemüse gefundenen Flavonoiden auf.
Bestimmte Flavonoide, einschließlich derjenigen, die in Traubensamenextrakt und Traubenhautextrakt gefunden werden, sind mit den gesundheitlich vorteilhaften Auswirkungen, die für Aspirin beobachtet wurden, aber ohne die negativen Nebenwirkungen die dem Aspirin nachgesagt werden, in Zusammenhang gebracht worden. Nichtsdestotrotz ist die biologische Verfügbarkeit oder Aktivität von Flavonoiden bei vielen Quellen von Flavonoiden niedrig. Deshalb erfordern bestimmte Nahrungsquellen von Flavonoiden große Mengen, um nützlich zu sein. Im Ergebnis sind viele Quellen von Flavonoiden unpraktisch, zu teuer oder beides, um im täglichen Gebrauch nützlich zu sein.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass die Kombination von bestimmten Flavonoiden und Enzymen in der Form eines Nahrungsergänzungsmittels die Dosierung des Ergänzungsmittels reduziert, die nötig ist, um die Thrombozytenaktivität und die LDL Cholesterin-Oxidation in einem Säuger zu reduzieren.
In einem Aspekt bietet die Erfindung ein Nahrungsergänzungsmittel, welches zumindest eine Quelle von Flavonoiden enthält, und ein Enzym, wobei das Ergänzungsmittel wirksam ist, um die Thrombozytenaktivität und LDL Cholesterin-Oxidation in einem Säuger mit einer Dosierung von ungefähr 30 mg/kg oder weniger zu hemmen. Ein Beispiel eines Nahrungsergänzungsmittels gemäß der Erfindung ist PROVEXCV^TM. Es ist zu beachten, dass sich eine Dosierung des Ergänzungsmittels, wie sie hier verwendet wird, auf das Gesamtgewicht der Flavonoidquelle oder -quellen und der Enzyme bezieht. Weiterhin können andere Inhaltsstoffe, wie Füllstoffe, Schmiermittel, Trägerstoffe und dergleichen als zusätzliche Inhaltsstoffe enthalten sein.
Die Flavonoidquelle oder -quellen in dem Nahrungsergänzungsmittel sind oder werden aus Traubensamenextrakt und Traubenhautextrakt gewonnen, und können weiterhin aus Ginkgo-Biloba-Extrakten, Heidelbeerextrakten oder Querzetin gewonnen werden. Die Enzyme können Pilzproteasen, säurebeständige Proteasen, neutral stabile Proteasen, basisch stabile Proteasen oder Bromelain enthalten.
Falls es nicht anderweitig bestimmt ist, haben alle technischen und wissenschaftliche Ausdrücke und Abkürzungen, die hier verwendet werden, die gleiche Bedeutung, die der Durchschnittsfachmann gewöhnlich auf dem Gebiet, auf das sich diese Erfindung bezieht, versteht.
Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein schematisches Diagramm, welches das Tiermodell zum Erzeugen von stenosen Arterien beschreibt, um Änderungen in der koronaren Durchblutung zu messen, die beobachtet werden, wenn eine periodische Thrombose auftritt, um die Probleme zu imitieren, die bei Patienten mit verengten Koronararterien bei Arteriosklerose auftreten.
2 ist eine Streifendiagrammaufzeichnung, welche die wiederholte durch Thrombozyten hergerufene Thrombosenbildung zeigt, auf die eine Embolie folgt, was die zyklischen Durchflussreduzierungen (CFR's), die für einen in stenosen Arterien gemessenen nach dem Folts Modell erzeugen Blutdurchfluss beobachtet werden.
3 ist eine Streifendiagrammaufzeichnung, welche die Eliminierung von CFR's nach der Einnahme von PROVEXCV^TM wegen der Fähigkeiten von PROVEXCV^TM zur in vivo Hemmung von Thrombozyten zeigt, welches ein bevorzugtes Nahrungsergänzungsmittel gemäß der Erfindung ist.
4 ist eine Streifendiagrammaufzeichnung, welche zeigt, dass die CFR's, welche durch die Verabreichung von PROVEXCV^TM eliminiert wurden, nicht wieder auftraten, wenn Epinephrin (Adrenalin) zweieinhalb Stunden nach der Verabreichung von PROVEXCV^TM verabreicht wurde.
5 zeigt ein schematisches Diagramm, welches das gesamte Blutaggregometrieverfahren beschreibt, welches hier verwendet wird, um Thrombozytenaktivität ex vivo zu messen.
6 ist ein Diagramm, welches den zeitlichen Ablauf von LDL Cholesterin-Oxidation zeigt, welche bei 234 nm in der Anwesenheit von Vitamin E oder PROVEXCV^TM beobachtet wird.
7 zeigt ein Diagramm der Höhe des Schutzes gegen LDL Cholesterin-Oxidation, welche durch PROVEXCV^TM zur Verfügung gestellt wird.
8 ist ein Graf, welcher die Rate der LDL Cholesterin-Oxidation abbildet.
Detaillierte Beschreibung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass die Kombination von bestimmten Flavonoiden und Enzymen in der Form eines Nahrungsergänzungsmittels die Dosierung des Ergänzungsmittels reduziert, die nötig ist, um die Thrombozytenaktivität und die LDL Cholesterin-Oxidation in einem Säuger zu reduzieren.
Koronare Arterienerkrankung, zerebrovaskuläre Erkrankung und peripher vaskuläre Okklusionen sind gekennzeichnet durch eine Arterienverengung. Wenn die Arterienverengung weiter durch thrombotische Okklusionen verschlimmert wird, wird der Blutdurchfluss weiter reduziert und ein Myokardinfarkt oder ein Schlaganfall kann auftreten. Diese Umstände haben mit Thrombozyten Aktivität und LDL Cholesterin-Oxidation zu tun. Heutige Behandlungen für diese Arten von vaskulären Okklusionen, wie Angioplastie, verursachen intimale und mediale Schäden in Arterien, welche Restenose, akute Thrombose, Myokardinfarkt und den plötzlichen Herztod bei Patienten verursachen können. Weiterhin spielt Thrombozyten induzierte Thrombosenbildung auch eine Rolle bei instabiler Angina, Myokardinfarkt und Restenose, die auf eine Angioplastie oder eine Arterektomie folgen. Die vorliegende Erfindung stellt ein Nahrungsergänzungsmittel zur Verfügung, welches die Thrombozytenaktivität und die LDL Cholesterin-Oxidation hemmt.
Verfahren zur Auswertung von Thrombozytenaktivität 1. Das Folts Modell
Das Folts Modell für koronare Thrombose („Folts Modell") wird verwendet, um Thrombozytenaggregation und Thrombose in einer Reihe von Tiermodellen zu untersuchen. Folts, J. D., Circulation (Supplement 4), 83: 3–14 (1991); Folts, J. D., J. Cardiovasc. Drugs & Therapy, 9: 31–43 (1995); Folts et al., Circulation, 54: 365–370 (1976). Das Folts Modell imitiert die Probleme, die bei Patienten mit durch Arteriosklerose verengten Koronararterien auftreten.
Um das Folts Modell zu verwenden wird, der Brustkorb eines vollständig betäubten Tieres geöffnet und das Herz offen gelegt. Obwohl die hier beschriebenen Experimente mit Hunden durchgeführt wurden, sind andere Tiere auch für das Folts Modell geeignet, wie Schweine, Kaninchen, Affen und andere ähnliche Tiere. Weiterhin ist das Folts Modell ein Modell für das klinische Syndrom instabiler Angina und anderer Thrombozyten induzierter thrombotischer Vorgänge bei Menschen. Samama et al., Thromb. Haemost., 68: 500–05 (1992); Raeder et al., Am. Heart J., 104: 249–253 (1983); Sherry, S., Cardiovasc. Rev. Rep., 5: 1208–19 (1984); Ikeda et al., J. Am Coll. Cardiol., 21: 1008–1017 (1993).
Wie in 1 gezeigt, ist die circumflex Koronararterie freigelegt, und ein koronarer Arterienflusssensor ist an der Arterie angebracht. Der koronare Arterien Flusssensor misst fortlaufend den Blutfluss durch die Arterie, ohne die Arterie zu beeinflussen. Die Arterie wird dann eingeklemmt, um intimale und mediale Schäden an der Koronararterie zu erzeugen. Ein Plastikverengungszylinder wird um die Außenseite der Koronararterie am Ort der arteriellen Beschädigung gelegt, um den Innendurchmesser der Koronararterie zu verringern. Das Ausmaß der Stenose oder die Durchmesserreduzierung, die von dem Zylinder erzeugt wird, wird unter Verwendung eines angioplastischen Ballons oder eines anderen geeigneten Verfahrens verändert.
Der Koronararterienflusssensor misst Veränderungen in dem Koronararterienblutfluss, wenn sich periodisch Gerinnsel entwickeln. Wenn eine Arterie stenosiert wird, häufen sich periodisch Thrombozyten in dem verengten und beschädigten Teil der Koronararterie an. Thrombozytenansammlung erzeugt eine Thrombose (Blutgerinnsel), welche sich vergrößert und in zunehmendem Maße den Blutfluss in der Koronararterie abschneidet. Wenn die Arterie okkludiert wird, baut sich Druck hinter der Thrombozytenaggregation auf und kann das Gerinnsel ablösen, und es durch die Stenose drücken, was eine plötzliche Wiederherstellung des koronaren Blutflusses in der verengten Arterie bedingt. Thrombozytenaggregation in einer beschädigten Arterie, die den Blutfluss verringert, wird als akute Thrombozytenthrombusbildung (APTF) bezeichnet.
Eine thrombotische arteriale Okklusion in menschlichen arteriosklerotischen Arterien beginnt vermutlich mit der Offenlegung der thrombogenen Oberfläche unter der intimalen Auskleidung einer Arterie. Weiterhin legen aktuelle Informationen nahe, dass eine Vielzahl verschiedene Stimuli Thrombozyten dazu bringen, an einer offen liegenden thrombogenen Oberfläche anzuhaften und zu aggregieren. Zu berücksichtigen ist jedoch, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht durch eine bestimmte Theorie der Pathogenese eingeschränkt ist.
Eine wiederholte, durch Thrombozyten induzierte Thrombose, gefolgt von der Bildung einer Embolie, und die beobachteten begleitenden Änderungen im Blutfluss werden als zyklische Durchflussverringerungen (CFR's) oder zyklische Durchflussvariationen (CFV's) bezeichnet. Dieses Dokument verwendet den Ausdruck CFR's. CFR's sind auch in beschädigten und verengten Arterien bei Menschen mit Oberschenkelarterien- oder Koronararterienerkrankungen beobachtet worden. Folts et al., Tex. Heart Int. J., 9: 19–27 (1982); Eichorn et al., J Am. Coll. Cardiol., 17: 43–52 (1991). Wie 2 zeigt, werden CFR's durch Messung des Koronararterienblutflusses erkannt und beobachtet. Obwohl 2 CFR's darstellt, die für Koronarblutfluss beobachtet werden, muss berücksichtigt werden, dass das Folts Verfahren allgemein auf Arterienfluss anwendbar ist (z. B. Oberschenkelarterienfluss). Weiterhin werden Techniken, die zur Verwendung des Folts Modells erforderlich sind, und Variationen des Modells in Folts, J. D., Circulation (Supplement 4), 83: 3–14 (1991); Folts, J. D., J. Cardiovasc. Drugs & Therapy, 9: 31–43 (1995) und in den Referenzen darin beschrieben.
Die Häufigkeit oder Anzahl von CFR's pro Zeiteinheit ist ein direkter Maßstab für in vivo Thrombozytenaktivität. Folts, J. D., J. Cardiovasc. Drugs & Therapy, 9: 31–43 (1995). Durch Messung der Häufigkeit und des Ausmaßes von CFR's in stenosen Arterien kann das Folts Modell verwendet werden, um Mittel zu untersuchen, die die Thrombozytenaktivität verändern. Folts, J. D., J. Cardiovasc. Drugs Ther., 9: 31–43 (1995). So gesehen identifiziert das Folts Modell Thrombozytenhemmer, das Ausmaß von Hemmeraktivität, die wirksamen Dosierungen von Hemmern, die Dauer der Hemmung und die Fähigkeit eines Hemmers, Thrombozytenagonisten entgegenzuwirken.
Aspirin stellt ein anschauliches Beispiel des Folts Modells dar. Das Folts Modell hat gezeigt, dass Aspirin Thrombozyten aktivität hemmt und CFR's unter den experimentellen Bedingungen eliminiert. Folts et al., Clin. Res., 22: 595 (1974) (abstract); Folts, J., Circulation (Supplement 4), 83: 3–14 (1991); Folts, J. D., J. Cardiovasc. Drugs Ther., 9: 31–43 (1995). Aspirin hemmt bekanntermaßen Thrombozytenaktivität bei einer Dosierung von 5 mg/Kg. Wenn Thrombozytenaktivität mit Aspirin unter den in dem Folts Modell verwendeten Bedingungen gehemmt wird, kann die Thrombozytenaktivität durch eine Erhöhung der Konzentration von Epinephrin (Adrenalin) oder Norepinephrin im Blut wieder belebt werden. Diese Erhöhung des Adrenalins tritt natürlich bei vielen Leuten auf, wenn sie unter Stress stehen, Angst haben, besorgt sind oder sich bewegen. Folts, J. D. & Rowe, G. G., Thromb. Res., 50: 507–516 (1988). Weiterhin bedingt eine Steigerung der arteriellen Stenose auch ein Wiederauftreten von CFR's, die durch Aspirin beseitigt wurden. Folts, J., Circulation (Supplement 4), 83: 3–14 (1991). So gesehen stellt das Folts Modell ein wirksames Instrument zur Verfügung, um die Hemmung der Thrombozytenaktivität abzuschätzen.
2. Der Thrombozytenaggregometrietest
Ein zweites Verfahren, um die Thrombozytenaktivität bei Menschen oder Tieren zu messen, ist der Vollblut-Thrombozytenaggregometrietest. Geräte und Verfahren, um Vollblut-Thrombozytenaggregometrieauswertungen durchzuführen, welche hier beschrieben und verwendet werden, sind bei Chronolog Inc., 2 West Park Rd., Haverton, PA 19083 verfügbar. Um den Test durchzuführen, wird eine Blutprobe mit Standardverfahren entnommen, welche dann in ein Plastikröhrchen eingefüllt wird. Ein Elektrodenpaar wird in die Blutprobe eingebracht, um den elektrischen Widerstand der Blutprobe zu messen. Der elektrische Widerstand von Blut ist normalerweise niedrig, wegen der hohen Anzahl von Ionen und Elektrolyten, welche sich im Blut befinden. Ein bekannter Stimulus für Thrombozytenaggregation, wie z. B. Adenosindiphosphat (ADP), oder Kollagen, wird dann zu der Blutprobe hinzugefügt, um die Thrombozyten zu aktivieren. Aktivierte Thrombozyten schlagen sich auf den Elektroden nieder, welche in einem Thrombozytenaggregometrietest verwendet werden. Wie in 5 (rechte Seite) gezeigt, steigt der elektrische Widerstand einer Blutprobe üblicherweise in einer S-förmigen Weise, wenn sich Thrombozyten auf den Elektroden aggregieren. Wenn einer Person ein Stoff verabreicht wird, der die Thrombozytenaktivität hemmt, wird die Widerstandserhöhung, welche der Zugabe eines Thrombozytenstimulators folgt, kleiner.
Aspirin stellt ein anschauliches Beispiel der Verwendung des Blutaggregometrietests dar. Eine Blutprobe, die von einem Menschen entnommen wird, wird ein Basisniveau von Thrombozytenaktivität aufweisen. Die Zugabe von ADP erhöht den Widerstand der Blutprobe. Siehe 5, rechte Seite, „ADP" Kurve. Eine zweite Blutprobe wird, zwei Stunden nachdem die Person eine 325 mg Tablette Aspirin erhalten hat, entnommen. Die Thrombozytenaktivierung, welche der Zugabe von ADP folgt, steigert die Thrombozytenaktivität nicht zu dem Niveau, welches für die anfängliche Blutprobe beobachtet wurde. Siehe 5, rechte Seite, „ADP + ASA" Kurve. Die Verringerung des beobachteten Blutwiderstands ist als prozentuale Verringerung der ex vivo Thrombozytenaktivität, die durch Aspirin bedingt wurde, ausgedrückt. Wenn die Epinephrinspiegel einer Person, die Aspirin eingenommen hat, vor der Entnahme der Blutprobe gesteigert sind, verringern sich die hemmenden Effekte, die für Aspirin beobachtet werden. Siehe 5, rechte Seite, „ADP + ASA + EPI" Kurve. Folts, J. D., J. Cardiovascular Drugs & Therapy, 9: 31–43 (1995); Ingerman-Wojenski & Silver, Thromb. Haemost., 51: 154–156 (1984).
Aspirin reagiert auch ähnlich, wenn Kollagen verwendet wird, um die Thrombozytenaktivität zu steigern. Wenn Kollagen ver wendet wird, um die Thrombozytenaktivität im Blutaggregometrietest zu steigern, verringert Aspirin die Thrombozytenaktivität um 30 bis 40%. Daher kann die Blutaggregometrietechnik als weiteres Maß der Thrombozyten hemmenden Wirkung verwendet werden, die von Medikamenten oder Flavonoiden erzeugt wird.
3. Bewertung von LDL Cholesterin Oxidation
LDL Cholesterin-Oxidation oder Schutz davor kann durch verschiedene Verfahren bestimmt werden. Kleinveld et al., Clin. Chem., 38(10): 2066–2072 (1992) beschreibt die Verfahren für die LDL Oxidationsexperimente, die hier beschrieben und verwendet werden. Ein bevorzugter Weg, um das Verfahren auszuführen, umfasst das Extrahieren von LDL Cholesterin aus Vollblutproben, die von einer Person mittels Standardtechniken entnommen werden. Das extrahierte LDL Cholesterin wird in Kontroll- und Versuchsproben aufgeteilt. Die LDL Oxidation wird durch Zugabe einer Kupferionenlösung zu jeder LDL Cholesterinprobe katalysiert. Kupferionen sind dafür bekannt, dass sie die LDL Cholesterin-Oxidation katalysieren und verstärken.
LDL Cholesterin Kontrollproben enthalten extrahiertes LDL Cholesterin und Kupferionen. Die Kontrollproben liefern ein Grundmaß für die Antioxidantien in der Ernährung der Person, von der das Blut entnommen wurde, und des LDL Cholesterins, welches daraus hergestellt wurde. LDL Cholesterin Testproben werden mit Kupferionen, in der Gegenwart oder Abwesenheit von zusätzlichen Verbindungen, wie Nahrungsergänzungsmitteln, die als Antioxidantien wirken können, zusammengeführt.
Zusätzlich kann einer Person ein Antioxidant mit Standardtechniken verabreicht werden, bevor eine Blutprobe gesammelt wird, was die Messung von Antioxidationseigenschaften in vivo erleichtert. Um in vivo LDL Cholesterin Antioxidationseigenschaften zu messen, werden zu prüfende Vollblutproben vor und nach der Verabreichung einer Antioxidationsquelle entnommen.
Kupferionen beschleunigen die Herstellung von konjugierten Dienen bei der LDL Cholesterin Oxidation, die Licht bei 234 nm absorbieren. Deshalb wird die LDL Cholesterin Oxidation durch eine Beobachtung des Anstiegs der Absorption bei 234 nm als Funktion der Zeit überwacht, wie in 6 gezeigt. Antioxidantien verlängern den Anlauf der Dien Produktion bei LDL Cholesterin. Im Ergebnis können LDL Cholesterinproben, die Antioxidantien enthalten, durch Berechnung der abgelaufenen Zeit, bevor LDL Cholesterin Oxidation beobachtet wird (Zeitverzögerung), verglichen werden. Siehe 7. Die Zeitverzögerung ist der beste Indikator für den LDL Cholesterin Schutz vor Oxidationsschäden unter den experimentellen LDL Oxidationsbedingungen, die hier beschrieben werden. Längere Zeitverzögerungen bedeuten bessere Antioxidationseigenschaften.
Hemmung der Thrombozytenaktivität und Verringerung der LDL Cholesterin Oxidation
Viele komplexe Faktoren führen zu Arteriosklerose, Koronararterienerkrankung und verwandten Zuständen. Unter diesen Faktoren ist es bekannt, dass die Wechselwirkung zwischen Thrombozyten und Arterienwänden den Arterioskleroseprozess verstärken kann. Weiterhin hat gesteigerte Thrombozytenaktivität sehr viel, sowohl mit der Entwicklung von Arteriosklerose als auch dem vorübergehenden und permanenten Auftreten von thrombotischen Vorgängen zu tun. Daher sollten Faktoren, die die Thrombozytenaktivität täglich verringern, die Entwicklung oder das Auftreten von Arteriosklerose, Koronararterienerkrankungen und damit verwandten Zuständen hemmen. Folts et al., J. Myocard. Ischemia, 6(8): 33–40 (1994).
Epidemiologische Studien zeigen eine inverse Korrelation zwischen der Aufnahme von Nahrungsmitteln mit einem hohen Anteil an antioxidativen Flavonoiden oder Vitamin E mit reduzierter Koronarherzerkrankung. Hertog et al., Lancet, 342 (8878): 1007–11 (1993); Waterhouse et al., Hypernutritious Foods, Agscience, Inc., Auburndale, Fl., 219–238 (1997). Nahrungsquellen, welche bekanntermaßen Flavonoide enthalten, sind unter anderem Rotwein, Bier, Traubensaft, Früchte und Gemüse. Extrakte aus Traubensamen, Traubenhaut, Ginkgo-Biloba, Heidelbeeren und anderen ähnlichen Früchten, Gemüse und Kräutern sind auch Flavonoid- und Antioxidationsquellen.
Es gibt jedoch Hindernisse, die überwunden werden müssen, um wirksam die Vorteile zu erlangen, die mit Flavonoiden und Antioxidantien verbunden sind. Ein Hindernis ist die Bioverfügbarkeit der aktiven Inhaltsstoffe in Nahrungsquellen von Flavonoiden. Wenn die Bioverfügbarkeit oder Aktivität gering ist, muss eine Person große Mengen eines Thrombozytenhemmers, oder antioxidativen Nahrungsergänzungsmittels einnehmen, um die Vorteile zu erlangen, die mit einem Thrombozytenhemmer oder Antioxidant verbunden sind. Im Ergebnis kann die geringe Bioverfügbarkeit ein Nahrungsergänzungsmittel für viele Verbraucher unpraktisch, zu teuer oder beides machen.
Zudem variiert die Wirksamkeit der Thrombozyten-hemmenden und Antioxidationseigenschaften, die mit bestimmten Flavonoiden verbunden sind, zwischen einzelnen Flavonoiden, z. B. sind Flavonoide von Trauben bessere Thrombozytenhemmer in menschlichen Testpersonen und Tieren, als Flavonoide, die in Zitrusfruchtsäften gefunden werden. Folts et al., J. Am. Coll. Cardiology, 29 (2) (Supplement A) :303A (1997); Folts, J. D., J. Am. Coll. Cardiology, 29 (2) (Supplement A) :226A (1997); Folts et al., J. Am. Coll. Cardiology, 29 (2) (Supplement A) :180A (1997).
Weiterhin sind die Umweltbedingungen innerhalb des Blutstroms nicht statisch. Um wirksam zu sein, muss ein Nahrungsergänzungsmittel unter verschiedenen Bedingungen, einschließlich verschiedener Grade von Stress, Aufregung und Bewegung wirksam sein, welche die Grade der Thrombozytenaktivität üblicherweise steigern.
Schließlich enthalten viele Nahrungsquellen von Flavonoiden auch unerwünschte Inhaltsstoffe, wie z. B. den Alkohol in Weinen und Bieren und die Zucker und Kalorien in Traubensaft. Für verschiedene Flavonoide und Medikamente gibt es auch Bedenken der Toxizität. Zum Beispiel hat Aspirin gut dokumentierte Nebenwirkungen, die Magendarmreizung, Verlust der Wirksamkeit in der Gegenwart von Epinephrin, und die Unfähigkeit, CFR's unter extremen Stenose Bedingungen zu hemmen, beinhalten.
Deshalb wurde angenommen, dass es nützlich wäre, ein Nahrungsergänzungsmittel zu erzeugen, welches die Thrombozytenaktivität und die LDL Cholesterin-Oxidation unter einer Vielzahl von Bedingungen in einer praktischen und kostenwirksamen Weise hemmen würde. Es wurde weiterhin angenommen, dass es ein Hauptmerkmal eines nützlichen Nahrungsergänzungsmittels wäre, die Bioverfügbarkeit eines Nahrungsergänzungsmittels durch Einbeziehen von Inhaltsstoffen zu steigern, um die Aufnahme der aktiven Inhaltsstoffe des Nahrungsergänzungsmittels zu erhöhen. Der Erfinder hat ein solches Ergänzungsmittel entdeckt, und das Ergänzungsmittel wird hierin beschrieben und beansprucht.
In einer ersten Ausgestaltung stellt die Erfindung ein Nahrungsergänzungsmittel zur Verfügung, welches zumindest eine Flavonoidquelle und ein Enzym enthält, die wirksam sind, um Blutthrombozytenaktivität und LDL Cholesterin-Oxidation in einem Säuger bei einer Dosierung von ungefähr 30 mg/Kg oder weniger zu hemmen. Das Nahrungsergänzungsmittel kann weiterhin Flavonoidquellen, wie Traubensamenextrakte, Traubenhautextrakte, Ginkgo-Biloba Extrakte, Querzetin, Heidelbeerextrakte oder jedes andere spezifische Flavonoid enthalten. Die „Flavonoidquelle" kann von jeder Quelle abgeleitet werden und kann synthetische oder gereinigte Flavonoide aus bekannten Quellen enthalten. Die Flavonoidquelle kann z. B. ein oder mehrere Flavonoide sein, die alleine oder in Kombination als hochaktiv bestimmt wurden, wobei das Flavonoid aus einer komplizierten Mischung, wie einem Pflanzenextrakt isoliert ist, das eine Vielzahl von Flavonoiden enthält.
Ohne an eine bestimmte Theorie der Wirkung gebunden zu sein, wird davon ausgegangen, dass die Inhaltsstoffe der derzeit offenbarten Nahrungsergänzungsmittel synergetisch durch Steigerung der Bioverfügbarkeit oder pharmakologische Reaktionen wirken, um die Blutthrombozytenaktivität zu hemmen und LDL Cholesterin-Oxidation zu hemmen. In einem verwandten Aspekt der Erfindung bleibt das Nahrungsergänzungsmittel zur Verringerung der Thrombozytenaktivität und zum Hemmen der LDL Cholesterin-Oxidation in der Gegenwart von erhöhten Thrombozytenagonistenkonzentrationen (z. B. Epinephrin) wirksam.
Beispiele von Formulierungen für Nahrungsergänzungsmittel können einen oder mehrere der folgenden Inhaltsstoffe enthalten: Fruchtextrakte, Gemüseextrakte, Verdauungsenzyme, Kräuter, Flavonoide, Antioxidantien und andere ähnliche Stoffe.
Illustrative Beispiele von nützlichen Verdauungsenzymen enthalten Pepsin, Papain, Pilzproteasen, säurebeständige Proteasen, neutral beständige Proteasen, basebeständige Proteasen und Bromelain.
Illustrative Beispiele von nützlichen Flavonoiden enthalten Catechine, Procyanidine, Proanthocyanidine, Querzetin, Rutin und glykosidische Formen der Flavonoide.
Nahrungsergänzungsmittel der vorliegenden Erfindung können oral, intravenös, subkutan, sublingual, intragastral, als Phytosome und durch jedes andere Verabreichungsverfahren verabreicht werden. Weiterhin kann das Nahrungsergänzungsmittel mit jedem geeigneten Träger kombiniert werden, um die Verabreichung zu erleichtern. Die hier unter Verwendung des Folts Modells getesteten Ergänzungsmittel wurden entweder intravenös oder intragastral verabreicht. Die Absorption durch die Magenschleimhaut dauert normalerweise 2 bis 4 Stunden. So gesehen können Nahrungsergänzungsmitteln die intragastral verabreicht werden, die CFR's nicht vor 2 bis 4 Stunden nach der Verabreichung eines Nahrungsergänzungsmittels beeinflussen.
Kommerzielle Nahrungsergänzungsmittel sind im Allgemeinen zur oralen Verabreichung formuliert. Nützliche Formen der Verabreichung für Nahrungsergänzungsmittel enthalten Pillen, Pasten, Pulver, Flüssigkeiten und andere übliche orale Formulierungen. Zubereitungen der Nahrungsergänzungsmittel können unter Verwendung üblicher Herstellungstechniken für die verschiedenen Formen des hierin beschriebenen Ergänzungsmittels hergestellt werden. Die hierin beschriebenen Nahrungsergänzungsmittel können zusätzlich Magnesiumstearat als ein Schmiermittel enthalten, um die Verabreichung des Ergänzungsmittels in Kapseln zu erleichtern. Magnesiumstearat wird üblicherweise in Konzentrationen von 1 bis 4 mg/Kapsel, vorzugsweise 1 bis 2 mg/Kapsel, verwendet.
Das Folts Modell kann verwendet werden, um Nahrungsergänzungsmittel Formulierungen zu identifizieren, die die Thrombozytenaktivität verringern. Die Koronararterie eines Hunds wird präpariert um CFR's darzustellen, wie sie hier beschrie ben werden. Dem Hund werden dann bemessene Dosen eines Nahrungsergänzungsmittels durch eines der anerkannten Verfahren verabreicht. Die Wirkung, welche die Dosis des Nahrungsergänzungsmittels auf die beobachteten CFR's hat, wird beobachtet. Unter Verwendung des Folts Modells können die effektive Dosis, die Halbwertzeit, und das Maß der Absorption bestimmt werden. Blutproben, welche dem Hund entnommen werden, bieten Information in Bezug auf Ergänzungsmittelkonzentrationen und Grade der Thrombozytenaktivität innerhalb des Blutstroms.
Zusätzliche Experimente können verwendet werden, um die Charakteristiken von nützlichen Nahrungsergänzungsmitteln zu bewerten. Zum Beispiel kann der Grad der Stenose nach Verabreichung eines Nahrungsergänzungsmittels verstärkt werden, um festzustellen, ob CFR's wieder auftreten. Zusätzlich identifizieren zu verschiedenen Zeitpunkten vor oder nach der Verabreichung eines Nahrungsergänzungsmittels verabreichte Thrombozytenagonisten Nahrungsergänzungsmittel, die CFR Eliminierung unter Thrombozyten aktivierenden Bedingungen aufrechterhalten können. Nützliche Agonisten enthalten Epinephrin und Norepinephrin. Nützliche Dosen von Epinephrin enthalten für diesen Zweck Epinephrin, welches intravenös mit 0,2 μg/kg/min für 15 Minuten verabreicht wird.
Versuchspersonen oder Patienten mit Koronararterienerkrankung können auch die Nahrungsergänzungsmittel verabreicht werden, die hierin beschrieben und beansprucht werden, und Variationen davon, um die Wirksamkeit des Nahrungsergänzungsmittel unter Verwendung von Thrombozytenaggregometrie und LDL Cholesterin-Oxidationsexperimenten, wie hierin beschrieben, zu bewerten.
Nützliche Formulierungen für Nahrungsergänzungsmittel können eines oder mehrere der Folgenden enthalten: Traubensamenextrakt, Traubenhautextrakt, Ginkgo-Biloba Extrakt, Heidel beerextrakt, Querzetin und eine Enzymmischung. Das Nahrungsergänzungsmittel kann gewichtsmäßig folgendermaßen formuliert werden: Traubensamenextrakt zu 12% Nassgewicht, Traubenhautextrakt zu 20% Nassgewicht, Ginkgo-Biloba Extrakt zu 10% Nassgewicht, Heidelbeerextrakt zu 10% Nassgewicht, Querzetin zu 24% Nassgewicht und eine Enzymmischung zu 24% Nassgewicht.
So gesehen ist ein nützliches Nahrungsergänzungsmittel, welches Flavonoide und Enzyme gemäß der vorliegenden Erfindung enthält PROVEXCV^TM. PROVEXCV^TM ist von Melaleuca, Inc., Idaho Falls, Idaho, erhältlich.
PROVEXCV^TM enthält die folgenden Inhaltsstoffe pro 380 mg Kapsel:
Ein Ergänzungsmittel kann auch gemäß der vorliegenden Erfindung zubereitet werden, so dass es alle oben genannten Inhaltsstoffe, außer der Enzymmischung, enthält.
Die in jeder 380 mg Kapsel PROVEXCV^TM verwendete Enzymmischung enthält die folgenden Enzyme:
Die Pilzproteasen 20053 und 20054 sind Enzymmixturen aus sauren, neutralen und basischen Proteaseenzymen. HUT Aktivität ist die Aktivität eines Enzyms, welches in dem FCC HUT Verfahren gemessen wird, welches auf der Hydrolyse von denaturiertem Hämoglobin basiert. Eine HUT Einheit ist als die Menge eines Enzyms definiert, welche ein Hydrosylat produziert, dessen Absorption bei 275 nm gleich der einer Lösung von 1,10 mg/ml Tyrosin in 0,006 N HCl in einer Minute ist. Die SAPU Aktivität wird in dem FCC SAPU Verfahren gemessen, welches auf der Hydrolyse von Hammarsten-Casein-Substrat basiert. Eine SAPU Einheit ist als diejenige Menge eines Enzyms definiert, die ein μMol Tyrosin pro Minute bei pH 3 und 37°C freisetzt. PU Aktivität ist die Aktivität eines Enzym, welche in dem FCC PU Verfahren gemessen wird, das auf der Hydrolyse von Casein basiert. Eine PU Einheit ist als diejenige Menge eines Enzyms definiert, die ein μg Tyrosin pro Stunde bei pH 6.0 und 40°C freisetzt. Mehr Information bezüglich der oben genannten Enzyme ist von der National Enzyme Company, Forsyth, Missouri, (417) 546–4796 durch technische Mitteilungen bezüglich der Enzyme erhältlich.
Die in PROVEXCV^TM enthaltenen Inhaltsstoffe können von den folgenden Quellen erlangt werden. Die tatsächlich verwendeten Quellen sind durch Unterstreichen des Zulieferers gekennzeichnet.
Experimente mit dem Folts Modell unter Verwendung eines Ergänzungsmittels, welches alle Inhaltsstoffe von PROVEXCV^TM außer der Enzymmischung enthält, haben gezeigt, dass ein solches Ergänzungsmittel zur Eliminierung von CFR's bei einer Dosierung von ungefähr 20 mg/kg oder weniger wirksam ist. Es ist entdeckt worden, dass die Dosierung, welche notwendig ist, um CFR's zu eliminieren, die mit dem Folts Modell beob achtet werden, durch die Kombination eines Nahrungs-Flavonoids mit einem Enzym weiter reduziert werden kann. Die Zugabe einer Enzymmischung, die gleiche Teile von zwei Pilzproteasen, eine säurebeständige Protease und Bromelain enthält, zu einem Ergänzungsmittel, welches alle Inhaltsstoffe von PROVEXCV^TM außer der Enzymmischung enthält, hat die Dosierung, die erforderlich ist, um CFR's in dem hierin verwendeten Tiermodell zu eliminieren, von ungefähr von 20 mg/kg auf etwa 10 mg/kg herabgesetzt.
Die Wirksamkeit von PROVEXCV^TM war derart, dass die erforderliche Dosierung zur Eliminierung von CFR's in dem hierin verwendeten Tiermodell ungefähr 10 mg/kg für PROVEXCV^TM betrug. Im Ergebnis sind nützliche Dosen von Nahrungsergänzungsmitteln, die hier beschrieben werden, ungefähr 30 mg/kg oder weniger. Vorzugsweise ist eine wirksame Dosierung ungefähr 20 mg/kg oder weniger. Besonders bevorzugt ist eine wirksame Dosierung ungefähr 10 mg/kg oder weniger.
So gesehen kann der Verbrauch von PROVEXCV^TM mit seinen antioxidativen und Thrombozyten hemmenden Eigenschaften vor der Entwicklung von Koronararterienerkrankung, akuter okklusiver Thrombose, Tod durch Myokardinfarkt und anderen Bedingungen, die mit Thrombozytenaktivität und LDL Cholesterin-Oxidation zu tun haben, schützen.
Eine andere Ausgestaltung der Erfindung enthält ein Nahrungsergänzungsmittel, welches mit PROVEXCV2^TM bezeichnet ist. Genauso wie PROVEXCV^TM kann PROVEXCV2^TM als ein Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden, um die Thrombozytenaktivität oder LDL Cholesterin Oxidation zu hemmen. PROVEXCV2^TM enthält die folgenden Inhaltsstoffe pro 1,638 mg:
Die Inhaltsstoffe für die Nahrungsergänzungsmittel, welche hierin beschrieben sind, einschließlich PROVEXCV2^TM, können von jedem Zulieferer erhalten werden. Zum Beispiel können die oben genannten Zulieferer verwendet werden, um alle Inhaltsstoffe für PROVEXCV2^TM zu erhalten. Weiterhin können die Inhaltsstoffe aus Quellen erhalten werden, die keinem Fermentierungsprozess unterzogen wurden. Zum Beispiel können unfermentiertes Traubensamenextrakt und unfermentiertes Traubenhautextrakt als Inhaltsstoffe für die hierin beschriebenen Nahrungsergänzungsmittel verwendet werden. Solche unfermentierten Inhaltsstoffe können von jedem Zulieferer, wie z. B. Polyphenolics (Canandaigua, NY), erhalten werden.
Kurz gesagt, werden Fermentierungsverfahren bei der Herstellung von Wein verwendet. Wenn ein Inhaltsstoff von einem Zulieferer bezogen wird, der mit Wein Produktion zu tun hat, könnte der Inhaltsstoff ein fermentierter Inhaltsstoff sein. Zum Beispiel kann ein fermentierter Inhaltsstoff, wie fermentiertes Traubensamenextrakt oder fermentiertes Traubenhautextrakt, jeder Inhaltsstoff sein, der von einer Quelle isoliert wurde, wie Trauben, die einer Fermentation unterzogen wurden. Im Gegensatz kann ein unfermentierter Inhaltsstoff jeder Inhaltsstoff sein, der von einer Quelle isoliert wurde, die keiner Fermentation unterzogen wurde. Solche unfermentierten Inhaltsstoffe können ergiebigere Quellen von Flavonoiden sein, als fermentierte Inhaltsstoffe. Zum Beispiel können unfermentiertes Traubensamenextrakt oder unfermentiertes Traubenhautextrakt die Thrombozytenaktivität oder LDL Cholesterin-Oxidation wirksamer hemmen als fermentiertes Traubensamenextrakt oder fermentiertes Traubenhautextrakt.
Anzumerken ist, dass der Prozentsatz für jeden Inhaltsstoff in PROVEXCV^TM und PROVEXCV2^TM verändert werden kann, wenn die entstehende Zusammensetzung die Thrombozytenaktivität oder LDL Cholesterin-Oxidation hemmen kann. Zum Beispiel kann der Prozentsatz an Ginkgo-Biloba Extrakt auf mehr als 10% erhöht werden.
Die Erfindung wird mit Bezug zu den folgenden beschreibenden Ausgestaltungen besser verständlich, welche nur beispielhaft sind, und sollte den wahren Umfang der vorliegenden Erfindung, wie in den Ansprüchen beschrieben, nicht einschränken.
Beispiele
Beispiel 1 – Auswertung der Thrombozytenhemmung durch Nahrungsergänzungsmittel.
Zehn anästhesierte Hunde mit Koronarstenose und medialen Schäden wurden für die Auswertung unter Verwendung der Verfahren des Folts Modells, wie in Folts, J., Circulation (Supplement 4), 83: 3–14 (1991) offenbart, vorbereitet. Blutdruck und Koronararterienblutfluss wurden während des Experiments fortlaufend überwacht. Wie in 2 beispielhaft dargestellt, traten CFR's, ähnlich der in 2 gezeigten CFR's, welche durch akute Thrombozytenthrombusbildung (APTF) bedingt waren, 8 ± 3 Mal in einem 30 Minuten Intervall bei 10 Hunden vor der Verabreichung von PROVEXCV^TM auf. Alle Figuren, welche Streifendiagrammaufzeichnungen zeigen, sind im selben Maß stab, der zehn Minuten pro zwölf Quadrate beträgt. 10 mg/kg PROVEXCV^TM wurde dann durch eine Magenröhre jedem Hund verabreicht. Wie in 3 beispielhaft dargestellt, eliminierte die gastrische Verabreichung von 10 mg/kg PROVEXCV^TM die beobachteten CFR's in 174 ± 24 Minuten bei 9 der 10 Hunde. Die bei dem zehnten Hund beobachteten CFR's wurden auf 2 CFR's in einem 30 Minuten Intervall reduziert, drei Stunden nach Verabreichung von 10 mg/kg PROVEXCV^TM. Es gab keine Veränderung in der Herzfrequenz oder beim durch die Nahrungs-Flavonoide in PROVEXCV^TM produzierten arteriellen Blutdruck.
Bei einer Auswertung nach dem Folts Modell wird die durch Aspirin gehemmte Thrombozytenaktivität durch intravenöse Verabreichung von 0,2 μg/kg/min Epinephrin reaktiviert. Folts, J., Circulation (Supplement 4), 83: 3–14 (1991). Acht Hunden, deren CFR's durch Verabreichung von 10 mg/kg PROVEXCV^TM eliminiert wurden, wurde 0,2 μg/kg/min Epinephrin intravenös für 15 Minuten verabreicht. Die rechte Seite von 4 zeigt, dass CFR's, die durch gastrisches Verabreichen von 10 mg/kg PROVEXCV^TM eliminiert wurden, nicht wieder auftraten, wenn Epinephrin intravenös mit 0,2 μg/kg/min für 15 Minuten bei allen acht Hunden verabreicht wurde.
Ex vivo Thrombozytenaktivität wurde für alle zehn Hunde unter Verwendung eines Vollblut-Aggregometrieverfahrens bestimmt, wie hierin beschrieben. Blutproben wurden jedem Hund vor und nach der Verabreichung von 10 mg/kg PROVEXCV^TM entnommen, und geprüft. Wenn die Thrombozytenaggregation durch Kollagen stimuliert wurde, wurde ex vivo Vollblut-Thrombozytenaggregation um 40% ± 9% bei allen 10 Hunden, denen 10 mg/kg PROVEXCV^TM verabreicht wurde, reduziert. Im Unterschied zu Aspirin, wie in 5 gezeigt, wurden die beobachteten Anstiege der Thrombozytenaggregation in Antwort auf Epinephrin nicht mit PROVEXCV^TM beobachtet.
Beispiel 2 – Auswertung der LDL Cholesterin-Oxidation von Nahrungsergänzungsmitteln
Wie oben beschrieben, wird LDL Cholesterin-Oxidation üblicherweise durch Beobachtung der Absorption bei 234 nm (Abs_234nm) als eine Funktion der Zeit gemessen, während das LDL Cholesterin oxidativen Bedingungen ausgesetzt ist. Die Antioxidations-Wirksamkeit von PROVEXCV^TM und anderen Substanzen wurde ermittelt.
LDL Cholesterin wurde aus Blutproben von Testpersonen hergestellt. Isoliertes LDL Cholesterin wurde dann mit einem Puffer, Vitamin E oder PROVEXCV^TM gemischt („Curr" in 6). Experimentelle Lösungen von PROVEXCV^TM wurden mit einer Endkonzentration von 0,5 bis 1,0 mg/L zubereitet. Die Konzentrationen, die für PROVEXCV^TM gewählt wurden, waren eine Abschätzung erwarteter Blutspiegel der Nahrungsergänzungsmittel, basierend auf akzeptierten Blutabsorptionsmodellen. Zu jeder Probe wurde eine abgemessene Menge von Kupferionen hinzugefügt. Die verwendete Menge Vitamin E war vergleichbar mit der Menge, welche in dem Blut einer Testperson zu erwarten sind, der 400 IU Vitamin E verabreicht wurden.
Nach dem Mischen wurde Abs_234nm jeder Lösung als Funktion der Zeit überwacht. Wie in 6 gezeigt, schützte die Inkubation von LDL Cholesterin mit PROVEXCV^TM bei 0.5 mg/L oder 1.0 mg/L LDL Cholesterin länger vor Oxidation, als es für ein wohlbekanntes Antioxidationsmittel Vitamin E für 5.3 IU/L beobachtet wird.
Wie in 7 gezeigt, zeigte LDL Cholesterin bis 45 Minuten nach der Zugabe von Kupferionen keine merkliche Oxidation. Vitamin E schützt bei der beschriebenen Konzentration LDL Cholesterin für ungefähr 95 Minuten vor Oxidation. 1.0 mg/L PROVEXCV^TM schützte LDL Cholesterin für mehr als 150 Minuten unter diesen experimentellen Bedingungen vor Oxidation. Damit ist PROVEXCV^TM ein besseres Antioxidationsmittel als Vitamin E.
Beispiel 3 – Auswertung von PROVEXCV2^TM
Bei Hunden wurden die Wirkungen von PROVEXCV2^TM auf Thrombozytenaktivität in vivo unter Verwendung des Folts Modells und ex vivo unter Verwendung des Vollblut-Aggregometrietests ausgewertet. Kurz gesagt wurden zehn erwachsene Mischlingshunde beiderlei Geschlechts anästhesiert und der Brustkorb am fünften Zwischenrippenraum geöffnet. Die linke Circumflex-Koronararterie wurde freigelegt, und ein elektromagnetischer Flusssensor wurde um die Arterie gelegt, um koronaren Blutfluss zu messen. Distal zur Flussprobe wurde die Arterie dreimal mit einer speziellen chirurgischen Klammer abgeklemmt, um intimale und mediale Schäden hervorzurufen. Ein Plastikzylinder mit einem entsprechenden Innendurchmesser wurde um die Arterie herum angebracht, um eine 70% Verringerung im arteriellen Durchmesser herbeizuführen.
Während des Auftretens von CFR's wurde eine Blutprobe für den ex vivo Vollblut-Thrombozytenaggregometrietest entnommen. Nach der Beobachtung einer beständigen Bildung von CFR's für 20 Minuten wurde 15 mg/kg PROVEXCV2^TM durch eine Magenröhre verabreicht. Die CFR's wurden für drei Stunden beobachtet. Wenn die CFR's beseitigt waren, wurde eine zweite Blutprobe entnommen, um den ex vivo Thrombozytenaggregationstest zu wiederholen. Epinephrin (0,2 μg/kg/min) wurde dann für 20 Minuten infudiert, um zu beobachten, ob die CFR's erneuert werden konnten.
Die zehn Hunde mit Koronararterienstenose und intimalen Schäden hatten wegen der akuten Thrombozytenthrombusbildung CFS's mit einer Häufigkeit von 7 ± 3 pro 30 Minuten. Nachdem 15 mg/kg PROVEXCV2^TM mittels einer gastrischen Röhre verabreicht wurde, waren die CFR's für 164 ± 29 Minuten beseitigt. Die intravenöse Infusion von Epinephrin (0,2 μg/kg/min für 20 Minuten) hat die CFR's in keinem der Hunde wieder erneuert. Wiederum kann eine Epinephrin Infusion nach dem Beseitigen der CFR's mit 5 bis 10 mg/kg Aspirin zu erneuerten CFR's bei 50 bis 60% der untersuchten Hunde führen. Damit hemmt PROVEXCV2^TM offensichtlich die Thrombozytenaktivität stärker als Aspirin.
Die Aktivität von Thrombozyten in Vollblutproben, die vor und nach der PROVEXCV2^TM Verabreichung gesammelt wurden, wurden ex vivo unter Verwendung des Vollblut-Aggregometrietests ausgewertet. Nach der Verabreichung von PROVEXCV2^TM nahm die Thrombozytenaggregation, die von ADP (20 μMol/ml) induziert wurde, um 42 ± 10% ab (p < 0,03). Weiterhin wurde die Thrombozytenaggregation, welche durch die Kombination von Epinephrin und ADP produziert wurde, um 32 ± 11% (p < 0,05) nach der PROVEXCV2^TM Verabreichung reduziert.
Bei Menschen wurden die Wirkungen von PROVEXCV2^TM auf Thrombozytenaktivität auch ex vivo unter Verwendung des Vollblut-Aggregometrietests ausgewertet. Insbesondere wurden zwölf gesunde Testpersonen (8 Männer, 4 Frauen) im Alter von 22 bis 50 Jahre angeworben. Eine Woche vor und während der Studie nahmen diese weder Tee, noch alkoholische Getränke, Traubenprodukte, Flavonoide und Vitaminergänzungsmittel und alle Medikamente, die Aspirinprodukte enthalten, zu sich. Vegetarier waren von der Studie ausgeschlossen.
Am ersten Tag der Studie wurde bei jeder Testperson 18 ml venöses Blut für den ex vivo Vollblut-Thrombozytenaggregometrietest zwischen 8 Uhr Morgens und 12 Uhr Mittags im nüchternen Zustand entnommen. Dann wurde jede Testperson angewiesen 5 bis 7 Kapseln (ungefähr 20 mg/kg/Tag) PROVEXCV2^TM in Abhängigkeit von ihrem Körpergewicht für 7 bis 14 Tage einzunehmen. Nach 7 bis 14 Tagen kehrte jede Testperson im nüchternen Zustand zu dem Labor zurück, aber nach Einnahme der Dosis PROVEXCV2^TM für diesen Tag, und es wurde eine zweite Blutprobe entnommen. Diese Blutprobe wurde ungefähr 2 bis 4 Stunden nach der letzten Dosis PROVEXCV2^TM entnommen.
Kurz gesagt wurde 18 ml Vollblut in eine Spritze entnommen, die 2 ml von 3,8% Sodiumzitrat als ein Antikoagulans enthielt. Das Blut wurde sofort mit einem gleichen Volumen von konservierungsmittelfreier Salzlösung verdünnt. Ein Milliliter (1 ml) des verdünnten Bluts wurde in eine Cuvette mit einem silikanisierten Rührstab gebracht und für 5 Minuten auf 37°C erwärmt. Eine Elektrode wird in die Cuvette gebracht, um die Impedanzänderung zu messen, die proportional zur Thrombozytenaggregation ist. Wenn einmal die Grundlinie der Thrombozytenaktivität aufgezeichnet war, wurde eine hohe Dosis Kollagen (12,5 μg) zu dem vorgewärmten Blut hinzugefügt und in den Aggregometer gebracht, um eine maximale Thrombozytenaggregationsantwort zu erhalten. Die Impedanzänderung, die durch Thrombozytenaggregation hervorgerufen wurde, wurde für 7 Minuten beobachtet. Sub-maximale Dosen von Kollagen (0,5 μg/ml), Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA) (0,5 nmol/ml) und ADP (20 μmol/ml) wurden als Thrombozytenagonisten verwendet. Weiterhin wurde auch ADP (20 μmol/ml) als ein Agonist verwendet, um Thrombozyten in 1 ml Blut zu aggregieren, welches für eine Minute mit Epinephrin (0.5 μg/ml) vorinkubiert wurde. Die Aggregationsantworten wurden in der Kontrollprobe doppelt gemessen und mit den Antworten nach 7–14 Tagen von täglichem PROVEXCV2^TM verglichen.
Die Thrombozytenaggregationsantwort auf Kollagen (0,5 μg/ml), ADP (20 μmol/ml) und Phorbolester, Phorbol 12-Myristat 13-Acetat (PMA; 0,5 nmol/ml), in den nach 7–14 Tagen täglicher ProvexCV2^TM Verabreichung gesammelten Proben zeigte eine Re duzierung von jeweils 51,6 ± 41.1% (p < 0,005), 39,8+41,5 (p < 0,005) und 17,9 ± 10,0% (p < 0,002). Zudem zeigte die Thrombozytenaggregation in Antwort auf eine Kombination von Epinephrin (0,5 μg/ml) und ADP (20 μmol/ml) in den Proben, die nach 7–14 Tagen täglicher PROVEXCV2^TM Verabreichung gesammelt wurden, eine Reduzierung von 14.9 ± 8,5% (p < 0,05). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Mechanismus der Thrombozytenaktivitätshemmung durch PROVEXCV2^TM durch die Hemmung der Thrombozyten Proteinkinase C wirkt, da PMA induzierte Thrombozytenaggregation nach 7–14 Tagen täglicher ProVEXCV2^TM Verabreichung reduziert war.
Zusätzlich zur Auswertung der Wirkungen von PROVEXCV2^TM auf die Thrombozytenaktivität wurden die Wirkungen von PROVEXCV2^TM auf die LDL Cholesterin-Oxidation untersucht. Kurz gesagt wurde LDL von dem Serum isoliert, welches von einer gesund essenden Testperson unter Verwendung von sequentieller Ultrazentrifugierung mit Umläufen bei Dichten von 1,006 g/ml gesammelt wurde, um VLDL/Chylomikronen und 1.063 g/ml (KBr) zu entfernen, um das LDL von dem dichteren HDL und Serumproteinen zurückzugewinnen. Die Dauer jedes Umlaufs betrug 3 Stunden, unter Verwendung eines Beckmann Optima Satzes bei 100,000 U/min (> 4,000,000 × g). Das LDL wurde gegen EDTA enthaltende Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) für 48 Stunden mit mehreren Änderungen des Puffers dialysiert. Das dialysierte Material wurde dann durch Elektrophorese geprüft (Agarosegel), um die Abwesenheit von anderen Lipoproteinfraktionen oder Serumproteinen zu demonstrieren. Die Proteinkonzentration des isolierten LDL wurde gemessen und unter Verwendung von EDTA enthaltender PBS für Verdünnungen auf 0,5 g/L angepasst. Die LDL Lösung wurde dann in 0.7 ml Volumina in kleine Glasbehälter mit Schraubverschluss abgefüllt. Die Phiolen und die LDL Lösungen wurden mit Stickstoff gespült, um Spuren von Sauerstoff zu entfernen, um die Stabilität si cherzustellen und wurden bei –80°C bis kurz vor Gebrauch gespeichert.
Die LDL-Oxidation wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Kurz gesagt wurde die LDL mit EDTA freier PBS durch Mischen von 100 μl aufgetauter LDL mit 900 μl PBS kurz vor der Oxidierbarkeitsstudie verdünnt. Zehn (10) μl frisch zubereitetes CuCl₂ (Endkonzentration von 5 μmol/L) wurde der LDL Lösung zugesetzt, um die Oxidation einzuleiten. Die Bildungsrate konjugierter Diene wurde spektrophotometrisch bei 234 nm bei 30°C für 5 Stunden beobachtet, wobei alle 3 Minuten Absorptionsablesungen durchgeführt wurden. Das Spektralphotometer ist mit einem automatischen Probenhalter mit 6 Plätzen ausgerüstet, um eine Analyse von maximal 6 Proben in einem Durchlauf zu ermöglichen. LDL alleine mit PBS und CuCL₂ wird als eine Kontrolle verwendet, wenn die Fähigkeit von PROVEXCV2^TM unter Verwendung von direkt mischenden in vitro Experimenten bewertet wird.
Der zeitliche Ablauf der LDL Oxidation zeigt drei aufeinander folgende Phasen: eine Verzögerungsphase, in der kaum konjugierte Dienbildung stattfindet, eine Fortpflanzungsphase mit einer schnellen Zunahme der Dienbildung und schließlich eine Auflösungsphase. Die Verzögerungsphase, welche als die Zeit zwischen der Zugabe von CuCl₂ und dem Beginn der Fortpflanzung definiert wird, wird als Masstab für die Empfindlichkeit von LDL gegenüber der Oxidationsbelastung angesehen.
Die Produktionsrate konjugierter Diene in einer Probe von LDL Cholesterin ist in 8 gezeigt. Natürliches LDL Cholesterin wurde mit einer entsprechenden Probe LDL Cholesterin verglichen, welches mit Vitamin E (5.3 mg/L) oder mit PROVEX2^TM (1.0 mg/L) inkubiert wurde. Die Verzögerungszeit vor Oxidationsbeginn wurde durch Vitamin E verzögert und in signifikant größerem Masse durch PROVEXCV2^TM verzögert. Dieses Ergebnis zeigt, dass PROVEXCV2^TM ein stärkeres Antioxidationsmittel als Vitamin E ist, wenn es einer durch Kupferionen verstärkten Oxidation ausgesetzt wird.

Claims

Nahrungsergänzungsmittel, welches zumindest Traubensamenextrakt, Traubenhautextrakt und ein Enzym umfasst, wobei das Ergänzungsmittel zum Hemmen der Thrombozytenaktivität und der LDL Cholesterin-Oxidation in einem Säuger wirksam ist.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Enzym eine Pilzprotease, eine säurebeständige Protease oder Bromelain umfasst.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Ergänzungsmittel die Form einer Pille oder eines Pulvers hat.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Ergänzungsmittel ein Heidelbeerextrakt umfasst.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Ergänzungsmittel ein Ginkgo-Biloba-Extrakt umfasst.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Ergänzungsmittel Querzetin umfasst.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Enzym 24 oder weniger Gewichtsprozent des Ergänzungsmittels umfasst.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Ergänzungsmittel PROVEXCV^TM ist.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Ergänzungsmittel PROVEXCV2^TM ist.
Nahrungsergänzungsmittel nach Anspruch 1, wobei das Ergänzungsmittel ein Ginkgo-Biloba-Extrakt, ein Heidelbeerex trakt, Querzetin, eine Pilzprotease, eine säurebeständige Protease und Bromelain umfasst.