DE69835223T2

DE69835223T2 - Sphingosinderivate und medizinische zubereitung

Info

Publication number: DE69835223T2
Application number: DE69835223T
Authority: DE
Inventors: Kazutoh Takesako; Toru Kusatsu-shi KUROME; Naoyuki Awazu; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1998-09-11
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2018-09-12
Also published as: US6239297B1; JP4091250B2; EP1020429A1; DE69835223D1; KR20010023477A; KR100561890B1; EP1020429A4; ATE332888T1; AU9002298A; EP1020429B1; WO1999012890A1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Derivate von Sphingosin-Analogen und deren pharmazeutische Zusammensetzungen, welche als Arzneimittel für die Heilbehandlung von Pilzerkrankungen, allergischen Krankheiten, Immunstörungen usw. Verwendung finden.
Stand der Technik
Sphingosin ist eine Verbindung mit der chemischen Struktur, die in der unten angeführten allgemeinen Formel dargestellt ist, in welcher Y¹ Wasserstoff ist. Es ist bekannt, daß verschiedene Sphingolipide, die Sphingosin als Bestandteil haben, in Lebewesen einschließlich auf der Oberfläche der Zellmembrane der Zellen im Nervensystem weit verbreitet sind. Ebenfalls sind Glycosphingolipide bekannt, die eine oder mehrere Arten von Zuckern als Y¹ durch eine Glycosidbindung an ein Keramid gebunden haben, welches eine Fettsäurebindung an der Aminogruppe des Sphingosins durch eine Peptidbindung hat, und Sphingophospholipide, Sphingomyelin umfassend, die Phosphorsäure und eine Base wie Cholin oder Ethanolamin als Y¹ an dem oben genannten Keramid gebunden haben.
Ein Sphingolipid ist eines der Lipide, das eine wichtige Rolle in Lebewesen hat. Es ist eine Krankheit bekannt, genannt Lipidose, welche durch die Akkumulierung eines spezifischen Sphingolipids in den Körper gleichzeitig mit den Anormalitäten in den metabolischen Verläufen infolge des Defekts eines Enzyms etc. bewirkt wird. Die attraktiven Effekte der auf der Zellmembran vorhanden Sphingolipide umfassen Funktionen in der Regelung des Zellwachstums und Unterscheidung jeder Zelle, siehe z. B. EP-A-381 514; Entwicklungs- und Unterscheidungsfunktionen; Funktionen in Nerven, Beteiligung in den Infektionen und Malignome der Zellen und andere. Viele physiologische Rollen solcher Effekte sind noch ungelöst. Kürzlich wurde die Wahrscheinlichkeit entdeckt, daß Keramid, ein Sphingosin-Derivat, eine wichtige Rolle in dem Mechanismus der Zellsignal-Transduktion hat, und Studien betreffend seine Effekte (des Keramids) und dergleichen mehr auf Apoptose und Zellzyklus wurden aktiv ausgeführt.
Pilze und Pflanzen enthalten Sphingolipide und das bedeutende Sphingosin, enthalten in diesen Organismen, hat die unten beschriebene Formel. Es ist bekannt, daß diese Lipide eine wichtige Rolle im Zellwachstum der Pilze und Pflanzen haben, aber die Einzelheiten dieser Rollen bleiben noch zu lösen.
Kürzlich wurde entdeckt, daß die Sphingolipid-Derivate und ihre zugehörigen Verbindungen eine Vielfalt biologischer Aktivitäten durch die Hemmung oder Stimulierung der metabolischen Verläufe aufweisen. Diese Verbindungen enthalten C-Proteinkinase-Inhibitoren, Apoptose-Induzierer, immununterdrückende Verbindungen, antimykotische Verbindungen und andere ähnliche. Es ist damit zu rechnen, daß die Substanzen, die diese biologischen Aktivitäten haben, nützliche Verbindungen für verschiedene Krankheiten sind.
Kurze Darstellung der Erfindung
In Anbetracht der oben genannten Angaben, ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Derivat der Sphingosin-Analoge zu schaffen, das fähig ist, die Funktionen des Sphingolipids zu regeln, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen hiervon.
Im Laufe der Forschung nach neuen biologisch aktiven Verbindungen haben die Erfinder neue biologisch aktive TKR1785 Verbindungen entdeckt, die eine antimykotische Aktivität und eine immununterdrückende Aktivität aufweisen, und zwar in einem Kulturbullion des Stamms TKR1785, zu Penicillium sp. zugehörig.
In dieser Druckschrift werden TKR1785-Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel (II) gezeigt. Die oben beschriebenen TKR1785er enthalten TKR1785-I der folgenden Formel (IIa) und TKR1785-II (IIb), die in der WO-A-9734012, veröffentlicht am 18.09.97, offenbart sind.
Die Erfinder haben durch die Hydrolyse der oben dargestellten TKR1785er die Herstellung von neuen Sphingozin-Analogen geschafft, dargestellt durch die folgende Formel (III).
Darüber hinaus ist ihnen die Synthese der in der folgenden allgemeinen Formel (Ia) beschriebenen Peptid-Derivate gelungen, wobei sie die Verbindung der oben dargestellten Formel (III) oder die Verbindung der folgenden Formel (IIIa), die aus der Verbindung der obigen Formel (III) als Ausgangsstoff hergestellt wurde, als Ausgangsstoff verwendet haben. Sie haben herausgefunden, daß diese Verbindungen biologische Aktivitäten aufweisen, wie etwa eine antimykotische Aktivität und eine immununterdrückende Aktivität.
In der Formel sind R³ und R⁴, die gleich oder voneinander verschieden sind, Hydroxylgruppen oder Wasserstoff; oder R³ und R⁴ bilden eine kovalente Bindung. Y² ist -COOH oder -CH₂OH.
In der Formel ist R¹ Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen oder eine Acylgruppe mit 2–5 Kohlenstoffatomen. R³ und R⁴, die gleich oder voneinander verschieden sind, sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen; oder R³ und R⁴ bilden eine kovalente Bindung. X² ist -CO-NH-CH(R⁵)R⁶ oder -CH₂-O-CO-CH(R⁷)-R⁸. R⁵ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R⁶ ist -CH₂OH, -COOH, -CONH₂ oder -CO-NH-CH(R⁹)-R¹⁰. R⁹ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R¹⁰ ist -CH₂OH, -COOH, -CONH₂ oder -CO-NH-CH(R¹¹)-R¹². R¹¹ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R¹² ist -CH₂OH, -COOH sau -CONH₂. R⁷ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R⁸ ist -CH₂-OH, -NH₂ oder -NH-CO-CH(R¹³)-R¹⁴. R¹³ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R¹⁴ ist -CH₂OH, -NH₂ oder -NH-CO-CH(R¹⁵)-R¹⁶. R¹⁵ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R¹⁶ ist -NH₂ oder -CH₂OH.
Allerdings ist die Verbindung ausgeschlossen, die Wasserstoff als R¹ und R³, eine Hydroxylgruppe als R⁴ und -CH₂-CO-NH-CH(R⁵)-R⁶ als X² hat, in welcher R⁵ -CH(CH₃)₂ oder -CH-(CH₃)C₂C₅ ist und R⁶ -CO-NH-CH(R⁹)-R¹⁰ ist, in welcher R⁹ und R¹⁰ -CH₂OH sind.
Den Erfindern ist es ebenfalls gelungen, die durch die folgende allgemeine Formel (Ib) beschriebenen Peptid-Derivate aus verschiedenen Sphingosin-Analogen, die eine chemische Struktur ähnlich der obigen Formel (III) haben, einschließlich die o. g. Sphingosin und Phythosphingosin, herzustellen, und sie haben herausgefunden, daß diese ähnliche biologische Aktivitäten aufweisen wie die Verbindungen der o. g. allgemeinen Formel (Ia), welche zu der Vervollständigung der vorliegenden Erfindung geführt haben.
In der Formel sind R¹, R³ und R⁴ die gleichen Substanzen wie oben beschrieben. X³ ist gleich mit X² aus der obigen Formel (Ia).
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung ausführlich beschrieben.
Derivate der Sphingosin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung sind durch die unten aufgeführte allgemeine Formel (I) dargestellt.
In der Formel sind R¹ und R², die gleich oder voneinander verschieden sein können, Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1–4 Kohlenstoffatomen oder Acylgruppen mit 2–5 Kohlenstoffatomen. R³ und R⁴, die gleich oder voneinander verschieden sind, sind Wasserstoff oder Hydroxylgruppen; oder R³ und R⁴ bilden eine kovalente Bindung. X¹ ist -(CH₂)_n-CO-NH-CH(R⁵)-R⁶ oder -(CH₂)_m-O-CO-CH(R⁷)-R⁸. In der Formel bedeutet stellt eine ganze Zahl von 0 bis 3 dar. R⁵ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R⁶ ist -CH₂OH, -COOH, -CONH₂ oder -CO-NH-CH(R⁹)-R¹⁰. R⁹ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R¹⁰ ist -CH₂OH, -COOH, -CONH₂ oder -CO-NH-CH(R¹¹)-R¹². R11 ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R¹² ist -CH₂OH, -COOH oder -CONH₂. In der Formel stellt m eine ganze Zahl von 1 bis 3 dar. R⁷ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R⁸ ist -CH₂-OH, -NH₂ oder -NH-CO-CH(R¹³)-R¹⁴. R¹³ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R¹⁴ ist -CH₂OH, -NH₂ oder -NH-CO-CH(R¹⁵)-R¹⁶. R¹⁵ ist Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann. R¹⁶ ist -NH₂ oder -CH₂OH.
Allerdings ist die Verbindung ausgeschlossen, die Wasserstoff als R¹, R² und R³, eine Hydroxylgruppe als R⁴ und -CH₂-CO-NH-CH(R⁵)-R⁶ als X¹ haben, in welcher R⁵ -CH(CH₃)₂ oder -CH(CH₃)C₂H₅ ist und R⁶ -CO-NH-CH(R⁹)-R¹⁰ ist, in welcher R⁹ und R¹⁰ -CH₂OH sind.
Die Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen ist nicht begrenzt; Beispiele hierfür sind Methyl, Ethyl, Propyl, i-Propyl, n-Buthyl und die t-Buthyl-Gruppe.
Die Acylgruppe mit 2–5 Kohlenstoffatomen ist nicht begrenzt; Beispiele hierfür sind Acethyl, Propionyl, n-Buthiryl und die Valeryl Gruppe.
Derivate der Sphingosin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung sind Verbindungen, dargestellt durch die oben aufgeführte allgemeine Formel (I), welche Verbindungen der o. g. allgemeinen Formel (Ia) oder der o. g. allgemeinen Formel (Ib) enthalten; Beispiele sind die Verbindungen gemäß in Tabelle 1, welche unten gezeigt ist.
TKR1785er entsprechend der o. g. allgemeinen Formel (II), TKR1785-I und TKR1785-II werden durch Züchtung eines Stammes hergestellt, der die Erzeugung von TKR1785 erlaubt und zu Penicillium sp. zugehörig ist, und durch ihre weitere Isolierung von dem Bouillon, wo sie kultiviert wurden. Der für die Herstellung der oben beschriebenen TKR1785er nützliche Stamm ist beispielsweise Penicillium sp. TKR1785 (weiter als "TKR1785 Stamm" bezeichnet). Das heißt, daß der Stamm TKR1785 in einem Nährmedium geimpft und in der Flüssigkeit gezüchtet wird, um die oben beschriebenen TKR1785er zu erhalten.
Die Erfinder haben den obigen Stamm TKR1785 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5788 (das Originaldatum der Hinterlegung: 17. Mai 1995; Datum des Antrags für Umwandlung in eine internationale Hinterlegung: 17. Januar 1997) bei dem National Institute for Bioscience and Human Technology [Adresse: 1–3 Higashu 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan (PLZ 305)] hinterlegt.
Die oben beschriebene Kultur wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 25°C durchgeführt, und eine Inkubation von 3 bis 11 Tagen ergibt normalerweise eine ausreichende Produktion. Die in dem gezüchteten Produkt angesammelten TKR1785er werden durch Reinigung unter Ausnutzung ihrer biologischen und physikalisch-chemischen Eigenschaften erhalten. Wenn die o. g. Reinigung durch ein Hochleistungsflüssigchromatographie-Verfahren durchgeführt werden kann, wird ein Kieselgel chemisch gebunden, z. B. an einer Octadecyl-, Octyl- oder Phenylgruppe, ein poröses Polymergel von Polystyrolart oder andere ähnliche. Die mobile Phase enthält eine wäßrige Lösung eines in Wasser löslichen organischen Lösungsmittels, z. B. wäßriges Methanol, wäßriges Acetonitril oder andere ähnliche.
In den Verbindungen der vorliegenden Erfindung entsprechend der o. g. allgemeinen Formel (I) kann die Verbindung entsprechend der o. g. Formel (III) durch die Hydrolyse der TKR1785er entsprechend der o. g. allgemeinen Formel (II) erhalten werden. Z. B. kann die Verbindung durch Säurehydrolyse des TKR1785-I aus der obigen Formel (IIa) erhalten werden, z. B. durch Zersetzung unter Bedingungen von 6 N HCl bei 110°C über Nacht, welche für die Hydrolyse der Peptidbindung verwendet wird, gefolgt von der Neutralisierung der Reaktionslösung und Einstellung auf alkalisch. Die hergestellte Verbindung kann durch eine erneute Neutralisierung der Reaktionslösung, Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel wie etwa Chloroform, einem Chloroform/Methanol Gemisch oder anderen ähnlichen erhalten werden, und wenn es nötig ist, kann eine weitere Reinigung eingesetzt werden unter Verwendung einer Adsorbtionschromatographie, welche Kieselgel verwendet, oder einer Verteilungschromatographie, die ein chemisch gebundenes Kieselgel verwendet.
Die Carboxylgruppe der Verbindung entsprechend der o. g. Formel (III) kann in ein Amid umgewandelt werden durch die Methylierung der Carboxylgruppe gefolgt von einer Amonolyse, oder in einer Hydroxylgruppe durch die Reduktion unter Anwendung von Lithiumaluminiumhydrid (LiAlH₄), Natriumborhydrid (NaBH₄) oder anderen ähnlichen, ergebend die Verbindung, die -CH₂OH als Y² in der obigen allgemeinen Formal (IIIa) umfaßt.
Das Lakton entsprechend der nachstehenden Formel (IV) kann erhalten werden, wenn TKR1785-I einer säuren Hydrolyse in Bedingungen ähnlich den oben beschriebenen unterworfen wird, gefolgt von Konzentrierung und anschließender Reinigung.
Die Verbindung, in der R³ und R⁴ aus der Verbindung der o. g. allgemeinen Formel (IIIa) eine kovalente Bindung zusammen bilden, was in einer Doppelbindung zwischen Kohlenstoff Nummer 4 und Kohlenstoff Nummer 5 resultiert, kann leicht aus dem Lakton mit der obigen allgemeinen Formel (IV) durch Dehydratierung durch Behandlung mit konzentrierter Schwefelsäure oder durch eine Reaktion mit Thionylchlorid in Pyridin und gefolgt von einer basischen Hydrolyse, erhalten werden.
Die Verbindung, in der R³ und R⁴ aus der Verbindung der o. g. allgemeinen Formel (IIIa) eine kovalente Bindung zusammen bilden und Y² -COOH ist, kann durch basische Hydrolyse der obigen Verbindung erhalten werden.
Die Sphingosin-Analoge, die für die Herstellung der Derivate entsprechend der o. g. allgemeinen Formel (I) der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, enthalten nicht nur die Verbindungen entsprechend der o. g. allgemeinen Formel (IIIa), sondern auch die handelsüblichen Phytosphingosin und Sphingosin, Verbindungen abgeleitet aus diesen Verbindungen durch die Hydrierung ihrer Doppelbindung und Verbindungen abgeleitet aus diesen Verbindungen durch die Veränderung der endständigen Hydroxylgruppe in einer Carboxylgruppe.
Um die Verbindungen entsprechend der o. g. allgemeinen Formel (I) herzustellen, kann man viele der weit verbreiteten Schutzgruppen, die man bei der Peptidsynthese benutzt, in geeigneter Weise verwenden. Solche Schutzgruppen enthalten z. B. Gruppen für den Schutz der Aminogruppe, Gruppen für den Schutz der Carboxylgruppe und Gruppen für den Schutz der Hydroxylgruppe.
Die obige Schutzgruppe für die Aminogruppe ist nicht spezifisch begrenzt und enthält z. B. die t-Butoxycarbonylgruppe (Boc), die Trichlorethoxycarbonylgruppe (Troc) und ähnliche.
Die obige Schutzgruppe für die Carboxylgruppe ist nicht spezifisch begrenzt und enthält z. B. die Phenacylgruppe (Pac), die Benzylgruppe (Bzl) und ähnliche.
Die obige Schutzgruppe für die Hydroxylgruppe ist nicht spezifisch begrenzt und enthält z. B. die Gruppe Bzl, die Acetylgruppe, die Methylgruppe, die Trimethylsylilgruppe und andere ähnliche.
Wenn es nötig ist, wird die obige Schutzgruppe entfernt durch eine bekannte Eliminierungsreaktion entsprechend jeder Gruppe oder durch deren angewandte Eliminierungsreaktionen, resultierend in einer Veränderung der erhaltenen Verbindung. Im Falle der Verwendung von Schutzgruppen, die unter unterschiedlichen Bedingungen entfernen kann, kann eine selektive Veränderung leicht durchgeführt werden durch die Durchführung der obigen Eliminierungsreaktion.
Z. B. wird, um ein Derivat herzustellen, eine Verbindung entsprechend der allgemeinen Formel (I), unter Verwendung eines Sphingosin-Analogons, das eine endständige Carboxylgruppe aufweist, die Carboxylgruppe des Sphingosin-Analogon an die Aminogruppe einer Aminosäure oder eines Amnioalkohols durch eine Peptidbindung angeschlossen. Verfahren für die Herstellung der obigen Peptidbindung umfassen z. B. ein Verfahren, welches die Aktivierung der Carboxylgruppe durch wasserlösliche Carbodiimide (WSCD) und HOBt umfaßt, ein Verfahren, welches die Aktivierung der Carboxylgruppe durch Herstellung eines Carboxyazids durch Diphenylphosphorylazid umfaßt, und ein Verfahren unter Verwendung von (Benzotriazolyloxy)tris(dimethylamino)phosponium fluorophosphat (BOP).
Um ein Derivat herzustellen, eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) unter Verwendung eines Sphingosin-Analogon, der eine endständige Hydroxylgruppe aufweist, ist die Hydroxylgruppe des Sphingosin-Analogon an die Carboxylgruppe einer Aminosäure oder einer Carbonsäure durch eine Estherbindung angeschlossen. Die Verfahren für die Herstellung der obigen Estherbindung umfassen z. B. ein Verfahren, das N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in Gegenwart eines Katalysators wie Dimethylaminopyridin (DMAP) oder 4-Pyrolidonpyridin verwendet, und das Verfahren des gemischten Säureanhydrids unter Verwendung von 2,4,6-Trichlorbenzoylchlorid.
Viele Arten von Sphyngosid-Analogen, die Sphyngosin und Phytosphyngosin enthalten, können als Ausgangsstoff für die Herstellung des Derivats entsprechend der o. g. allgemeinen Formel (I) der vorliegenden Erfindung verwendet werden und ein acyliertes oder alkyliertes Produkt der Sphingosin-Analoge kann ebenfalls verwendet werden, weil das Derivat entsprechend der o. g. allgemeinen Formel (I) ein Produkt mit einer davon acylierten oder alkylierten Aminogruppe umfaßt.
Die obige Acylierung kann durch ein konventionelles Verfahren unter Verwendung von Säureanhydrid oder Säurechlorid usw. durchgeführt werden und die obige Alkylierung kann durch ein Verfahren unter Verwendung von Natriumhydrid oder Alkyliodid durchgeführt werden.
Das Derivat der Sphingosin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung weist eine biologische Aktivität auf, so wie es in der nachstehenden Tabelle 2 beschrieben ist, und wird als pharmazeutische Zusammensetzung verwendet.
Jedes der Derivate der Sphingosin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung kann als solches oder als ein pharmazeutisch verträgliches Salz in medizinischen Anwendungen verwendet werden. Es gibt keine spezielle Einschränkung hinsichtlich der Art des pharmazeutisch verträglichen Salzes. Folglich umfaßt das Salz Salze der anorganischen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure, Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, usw., Salze der organischen Säuren wie Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Benzoesulfonsäure, Toluolsulfonsäure, Naftalensulfonsäure, Camphorsulfonsäure, usw., und Salze der Alkalimetalle oder Erdalkalimetalle wie Natrium, Kalium, Kalzium usw.
Um das Derivat der Sphingosin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung oder sein pharmakologisch verträgliches Salz als Arzneimittel Tieren und auch Menschen verabreichen zu können, kann das Derivat der Sphingosin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung entweder als solches oder unter der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die normalerweise 0,1 bis 99,5%, vorzugsweise 0,5 bis 90%, von diesem in einem pharmazeutisch verträglichen, nicht-toxischen und inerten Trägerstoff, enthält.
Der oben erwähnte Trägerstoff umfaßt feste, halbfeste oder flüssige Verdünnungsmittel, Füllstoffe, andere pharmazeutische Hilfsstoffe, usw. und solche Trägerstoffe können alleine oder in Kombination verwendet werden.
Die oben genannte pharmazeutische Zusammensetzung wird vorzugsweise in Dosierungseinheiten verabreicht und kann durch orales Einnehmen, parenteral, lokal (z. B. transdermal) oder rektal verabreicht werden. Natürlich müssen diese pharmazeutischen Zusammensetzungen in Dosierungen, die dem jeweiligen Weg der Verabreichung angepaßt sind, verabreicht werden.
Für die Verabreichung des Derivats der Sphingosin-Analoge oder seiner pharmazeutisch verträglichen Salze gemäß der vorliegenden Erfindung als Arzneimittel wird die Dosis eines antimykotischen Mittels oder eines antiallergischen Mittels vorzugsweise unter Berücksichtigung verschiedener Kriterien des Patienten, wie Alter und Körpergewicht, Weg der Verabreichung, Natur und Ernsthaftigkeit der Krankheit, usw. gewählt. In der Praxis beträgt die tägliche Dosis des Wirkstoffes für einen erwachsenen Patienten beim Menschen von 10 bis 2000 mg. Obwohl einerseits in einigen Fällen eine kleinere Tagesdosis als die aus dem o. g. Bereich für einen erwachsenen Patienten ausreichend sein kann, kann in anderen Fällen eine größere Dosis als die aus dem o. g. Bereich erforderlich sein. Wenn eine größere Dosis verwendet wird, wird die Tagesdosis vorzugsweise in mehreren aufgeteilten Portionen verabreicht.
Die o. g. orale Verabreichung kann verwendet werden bei festen, pulverförmigen oder flüssigen Arzneiformen wie Bulkpulver, Pulver, Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropfen, sublingualen Tabletten, usw.
Für die o. g. parenterale Verabreichung kann man einheitliche Arzneiformen für subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung, normalerweise Lösungen oder Suspensionen, verwenden. Diese Präparate können durch Suspendieren oder Auflösen einer vorbestimmten Menge des Derivats des Sphingozin-Analogon oder seines pharmakologisch verträglichen Salzes gemäß der vorliegenden Erfindung in einem flüssigen nicht-toxischen Trägerstoff, der für die Impfung geeignet ist, wie etwa einem wäßrigen Medium oder einem öligen Medium, und Sterilisierung der erhaltenen Suspension oder Lösung, erhalten werden.
Die o. g. lokale Verabreichung (z. B. die transdermale Verabreichung) kann durchgeführt werden, indem man eine Vielfalt von lokalen Arzneiformen, wie Lösungen, Cremen, Pulvern, Pasten, Gels oder Salben verwendet. Diese Arzneiformen können hergestellt werden durch Verwendung einer vorbestimmten Menge des Derivats der Sphingosin-Analoge der vorliegenden Erfindung oder eines seiner pharmakologisch verträglichen Salze in Kombination mit einem oder mehreren für die lokalen Arzneiformen geeigneten Duftstoff, Farbmittel, Füllstoff, Tensid, Befeuchtungsmittel, erweichendes Mittel, Gelierungsmittel, Trägerstoff, Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, usw.
Rektale Verabreichung kann z. B. durchgeführt werden durch die Verwendung von Zäpfchen, die jedes eine vorbestimmte Menge des Derivats des Sphingosin-Analogon oder seines pharmakologisch verträglichen Salzes gemäß der vorliegenden Erfindung, gemischt mit einer festen niedrig schmelzenden Base, wie einem höheres Esther, z. B. Myristylpalmitat, Polyethylenglykol, Kakobutter oder einem Gemisch von diesem, enthält.
Beste Ausführungsform der Erfindung
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung in zusätzlichen Einzelheiten, ohne daß dabei beabsichtigt wird, den Bereich der Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1: Synthese der Verbindung (1) aus Sphingosin (siehe Schema 1)

1) Die Herstellung eines N-Boc Derivats: Sphingosin (10,0 mg, 33,4 μmol) wurde in Wasser-Dioxan (10:1, 300 μl) gelöst, Buc-ON (12,7 mg, 50,2 μmol) und N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) (8,8 μl, 50,2 μmol) wurden bei Raumtemperatur hinzugefügt und das Gemisch wurde 5 Stunden gerührt. Nach der Zugabe von Ethylacetat wurde das Reaktionsgemisch mit einer wässrigen 10% Zitrussäure-Lösung und danach mit einer gesättigten wässrigen NaCl Lösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde auf Magnesiumsulphat getrocknet, bei niedrigem Druck konzentriert und gereinigt durch Kieselgel Dünnschichtchromatographie (TLC) (Chloroform-Methanol 19:1), ergebend ein farbloses Pulver der Verbindung (2a) (7,7 mg). FAB-MS: m/Z 400 (M+H) ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 6,18 (d), 5,51 (m), 5,40 (m), 4,76 (d), 4,39 (t), 3,83 (m), 3,49-3,38 (m), 1,93 (m), 1,36-1,20 (m), 0,84 (t), 0,00 (s).
2) Herstellung eines TBDMS Derivats des primären Alkohols: Die Verbindung (1a) (5,7 mg, 14,3 μmol) wurde in Dichlormethan (400 μl) gelöst, Dimethylaminopyridin (DMAP) (1 mg), Triethylamin (Net₃) (2,4 μl, 17,1 μmol) und t-Buthyldimethylsylil Chlorid (TBDMS-Cl) (2,4 mg, 15,7 μmol) wurden hinzugefügt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 16 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch TLC (Chloroform-Methanol 100:1) gereinigt, ergebend ein farbloses Öl der Verbindung (2b) (6,7 mg). FAB-MS: m/z 514 (M+H) ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 6,18 (d), 5,50 (m), 5,41 (m), 4,74 (d), 3,82 (m), 3,67 (m), 3,52-3,39 (m), 1,94 (m), 1,35-1,19 (m), 0,84 (m), 0,00 (s).
3) Die Herstellung eines N-Boc Derivats des sekundären Alkohols: Die Verbindung (1b) (2,0 mg, 3,89 μmol) wurde in CH₂Cl₂ (400 μl), DMAP (1 mg) gelöst und Boc₂O (1,0 mg, 4,67 μmol) wurde hinzugefügt und das Gemisch wurde 5,5 Stunden gerührt. Nach zusätzlicher Zugabe von Boc₂O (2,0 mg, 9,34 μmol) wurde das Gemisch weitere 17,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch TLC (Chloroform-Methanol 200:1) gereinigt, ergebend ein farbloses Öl der Verbindung (1c) (2,4 mg). FAB-MS: m/z 614 (M+H) ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 6,65 (d), 5,65 (m), 5,41 (m), 4,92 (t), 3,73 (m), 3,52 (m) 1,97 (m), 1,41-1,22 (m), 0,84 (m).
4) Selektive Entfernung des TBDMS: Die Verbindung (1c) (2,4 mg, 3,91 μmol) in Tetrahydrofuran (THF)-Essigsäure-Wasser (1:2:1 1,5 ml) wurde 17,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Konzentrierung bei niedrigem Druck wurde das Reaktionsgemisch durch TLC (Chloroform-Methanol 50:1) gereinigt, ergebend ein farbloses Öl der Verbindung (1d) (2,0 mg). FAB-MS: m/z 500 (M+H) ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 6,58 (d), 5,64 (m), 5,39 (m), 4,91 (t), 4,62 (t), 3,66 (m), 3,44 (m), 1,96 (m), 1,40-1,22 (m), 0,84 (t).
5) Kopplung des Sphingosins mit Valin: Die Verbindung (1 d) (3,7 mg, 7,40 μmol), Z-Val-OH (2,8 mg, 11,1 μmol; Z: Benzyloxycarbonylgruppe) und DMAP (0,45 mg, 3,70 μmol) wurden in CH₂Cl₂ (300 μl) gelöst, DCC (2,3 mg, 11,1 μmol) wurde unter Eiskühlung hinzugefügt und das Gemisch wurde 10 Minuten gerührt und danach bei Raumtemperatur noch weitere 16 Stunden. Nach Filtrieren wurde das Reaktionsgemisch bei niedrigem Druck konzentriert und gereinigt durch TLC (Chloroform-Methanol 100:1), ergebend ein farbloses Öl der Verbindung (1e) (4,0 mg). FAB-MS: m/z 733 (M+H) ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 7,66 (d), 7,36-7,28 (m), 6,97 (d), 5,67 (m), 5,55 (d), 5,39 (m), 5,03 (d) 4,88 (t), 3,93 (m), 1,96 (m), 1,71 (m), 1,60 (m), 1,50 (m), 1,38-1,00 (m), 0,84 (m).
6) Synthese der Verbindung (1f): Zu einer Lösung der Verbindung (1e) (4,0 mg, 5,46 μmol) in Ethylacetat (20 ml) wurde Palladiumschwarz (20 mg) hinzugefügt und das Gemisch wurde 90 Minuten mit Wasserstoffgas bei Raumtemperatur gebrodelt. Nach der Entfernung des Katalysators durch Filtrieren wurde das Gemisch bei niedrigem Druck konzentriert, was zu der Abspaltung der Z Gruppe und zu der Reduktion der Doppelbindung führte und die Verbindung (1f) (3,8 mg) wurde erhalten. FAB-MS: m/z 890 (M+H) ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 8,40 (d), 6,99 (d), 5,07 (m), 4,61 (m), 4,33-3,85 (m), 2,07 (m), 1,54-1,22 (m), 0,84 (m).
7) Synthese der Glycerin-Boc-O-Säure: Zu einer Glycerinsäure-Lösung (92, 4 mg, 0,871 mmol) in Aceton (300 μl), wurden Net₃ (14,6 μl, 1,05 mmol) und Phenacylbromid (PacBr) (203 mg, 1,05 mmol) unter Eiskühlung hinzugefügt und das Gemisch wurde 1 Stunde gerührt und danach noch weitere 4 Stunden bei Raumtemperatur. Nach Konzentrieren bei niedrigem Druck wurde der Rückstand in Ethylacetat gelöst und mit Wasser, gesättigter wäßriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und danach mit gesättigter wäßriger NaCl-Lösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde auf Magnesiumsulphat getrocknet, konzentriert und danach bei niedrigem Druck getrocknet. Der Rückstand wurde in Ethylacetat (2 ml) gelöst, DMAP (36,4 mg, 0,298 mmol) und Boc₂O (260,3 mg, 1,193 mmol) wurden unter Eiskühlung hinzugefügt und das Gemisch wurde 5 Minuten gerührt und noch andere 4 Stunden bei Raumtemperatur. Ethylacetat wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, welches danach mit einer 10% wäßrigen Zitrussäure-Lösung, einer gesättigten wäßrigen NaCl-Lösung, einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung und danach mit einer gesättigten wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen wurde. Die Ethylacetatschicht wurde auf Magnesiumsulphat getrocknet, konzentriert und danach bei niedrigem Druck getrocknet und gereinigt durch TLC (Benzol-Ethylacetat 30:1), ergebend das Pac-Esther der Glycerin-Boc-O-Säure (4,76 mg). Diese Verbindung (42,8 mg, 0,101 mmol) wurde in einer 90% wäßrigen Essigsäure-Lösung (5 ml) gelöst, Zn-Pulver (330,2 mg, 5,05 mmol) wurde unter Eiskühlung hinzugefügt und das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und danach 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach der Entfernung der unlöslichen Stoffe durch Filtrieren wurde das Reaktionsgemisch bei niedrigem Druck konzentriert und der Rückstand wurde in Ethylacetat gelöst, mit einer 10% wäßrigen Zitrussäure-Lösung und danach mit einer gesättigten wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen. Die Ethylacetatschicht wurde auf Magnesiumsulphat getrocknet, konzentriert, bei niedrigem Druck getrocknet und danach durch TLC (Chloroform-Methanol-Essigsäure 95:5:3) gereinigt, ergebend ein farbloses Pulver der Glycerin-Boc-O-Säure (19,7 mg). FAB-MS: m/z 305 (M+H) ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ 5,05 (m), 4,34 (m), 1,41 (d).
8) Kopplung der Verbindung (1f) mit Glycerinsäure: Die Verbindung (1f) (3,1 mg, 5,18 μmol) und Glycerin-Boc-O-Säure (2,4 mg, 7,76 μmol) wurden in Dimethylformamid (DMF) (500 μl) gelöst, HOBt (0,84 mg, 6,21 μmol) und WSCD (1,0 μl, 5,69 μmol) wurden unter Eiskühlung hinzugefügt und das Gemisch wurde 3 Stunden gerührt. Das Ethylacetat wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, welches danach mit einer 10% wäßrigen Zitrussäure-Lösung, einer gesättigten wäßrigen NaCl-Lösung, einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung und danach mit einer gesättigten wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen wurde. Die Ethylacetatschicht wurde auf Magnesiumsulphat getrocknet, bei niedrigem Druck konzentriert, der erhaltene Rückstand wurde durch TLC (Chloroform-Methanol 200:1) gereinigt und so wurde das geschützte Produkt (1) erhalten. TFA (500 μl) wurde zu dem erhaltenen Produkt hinzugefügt und das Gemisch wurde bei niedrigem Druck konzentriert nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur, ein farbloses Öl der Verbindung (1) (0,5 mg) ergebend, wie in Tabelle 1 dargestellt. FAB-MS: m/z 489 (M+H)

Beispiel 2: Synthese der Verbindung (2)
Die Verbindung (1d) (9,3 mg, 18,6 μmol), Fmoc-Val-OH (9,5 mg, 27,9 μmol; 9-Fluorenylmethoxycarbonylgruppe) und DMAP (1,1 mg, 9,31 μmol) wurden in CH₂Cl₂ (500 μl) gelöst, DCC (5,8 mg, 27,9 μmol) wurde unter Eiskühlung hinzugefügt, gefolgt von 45 Minuten Rühren und danach bei Raumtemperatur noch weitere 19 Stunden. Nach Filtrieren und Konzentrieren bei niedrigem Druck wurde das Reaktionsgemisch durch TLC (Chloroform-Methanol 200:1) gereinigt, eine Verbindung (10,7 mg) ergebend. Zu der erhaltenen Verbindung (8,6 mg, 10,5 μmol) wurde eine 30% Pyperidin/DMF-Lösung (1 ml) unter Eiskühlung hinzugefügt, gefolgt von 30 Minuten Rühren und danach bei Raumtemperatur noch 1 Stunde, um die Schutzgruppe Fmoc selektiv zu entfernen. Das Reaktionsgemisch wurde durch 1 N HCl unter Eiskühlung neutralisiert, bei niedrigem Druck konzentriert und durch TLC (Chloroform-Methanol 19:1) gereinigt, das Kopplungsprodukt (4,5 mg) zwischen dem geschützten Sphingosin (1d) und Valin (Fmoc-Val-OH) ergebend.
FAB-MS: m/z 599 (M+H)
Das erhaltene Produkt (5,4 mg, 9,02 μmol) und die Glycerin-Boc-O-Säure (4,1 mg, 13,5 μmol) wurden in DMF (500 μl) gelöst, HOBt (1,5 mg, 10,8 μmol) und WSCD (1,8 μl, 9,92 μmol) wurden unter Eiskühlung hinzugefügt, gefolgt von 3 Stunden Rühren. Das Ethylacetat wurde zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, welches danach mit einer 10% wäßrigen Zitrussäure-Lösung, einer gesättigten wäßrigen NaCl-Lösung, einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung und danach mit einer gesättigten wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen wurde. Die Ethylacetatschicht wurde auf Magnesiumsulphat getrocknet, bei niedrigem Druck konzentriert, der erhaltene Rückstand wurde durch TLC (Chloroform-Methanol 100:1) gereinigt, ergebend das geschützte Produkt (2) (4,3 mg). Zu dem erhaltenen Produkt wurde TFA (500 μl) hinzugefügt und das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, bei niedrigem Druck konzentriert, ergebend ein farbloses Öl der Verbindung (2) (1,8 mg), in Tabelle 1 dargestellt.
FAB-MS: m/z 487 (M+H)
Beispiel 3: Synthese der Verbindung (3)
Als Ausgangsstoff wurde Phythosphingosin an Stelle des in Beispiel 1 verwenden Sphingosins verwendet und es ergab ein farbloses Öl (1,5 mg) der Verbindung (3), dargestellt in Tabelle 1, durch Schritte ähnlich mit denen für die Synthese der Verbindung (1) aus Beispiel 1.
FAB-MS: m/z 505 (M+H)
Referenzbeispiel 1: Synthese des TKR1785-I

1) Die Herstellung des Isopropylidenderivats der Verbindung (III). Die Verbindung (III) (5,0 mg, 14,5 μmol) wurde in Aceton (900 μl) suspendiert und Acetondimethylacetat (150 μl) und dl-Camphorsulphonsäure (1 mg) wurden hinzugefügt, gefolgt von 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde mit Net₃ (10 μl) neutralisiert und bei niedrigem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch TLC (die untere Schicht eines Chloroform-Methanol-Wasser Gemisches (8:3:1)] gereinigt und es ergab die gewünschte Verbindung (Menge 2,8 mg, Ausbeute 51%) als farbloses Öl. FAB-MS: m/z 386 (M+H)
2) Herstellung des Trichlorethoxicarbonylderivats (Troc). Die in 1. erhaltene Verbindung (1,4 mg, 3,6 μmol) wurde in Pyridin (100 μl) gelöst, Trichlorethoxycarbonyl chlorid (1,5 μl, 10,9 μmol) wurde unter Eiskühlung hinzugefügt, gefolgt von 30 Minuten Rühren unter Eiskühlung und danach noch 1 Stunde bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde durch TLC (die untere Schicht eines Chloroform-Methanol-Wasser Gemisch 8:3:1) gereinigt und es ergab die gezielte Verbindung (Menge 1,0 mg, Ausbeute 42%) als farbloses Pulver. FAB-MS: m/z 734 (M+H)
3) Synthese des TKR1785-I. Die unter Punkt 2 erhaltene Verbindung, das Troc Derivat (5,0 mg, 6,0 μmol), und HCL·H₂N-CH(CH(CH₃)₂)-CONH-CH(CH₂OBzl)-CH₂OBzl (4,8 mg, 12,0 μmol), welches separat hergestellt wurde unter Verwendung von Boc-NH-CH(CH₂OH)CH₂Obzl als Ausgangsmaterial, wurden in CH₂Cl₂ (100 μl) gelöst und die entsprechenden Mengen von WSCD und HOBt wurden hinzugefügt, so wie es in den Beispielen 1.–8. beschrieben wurde. Das Gemisch wurde 30 Minuten unter Eiskühlung gerührt und danach über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde durch TLC (Chloroform: Methanol 19:1) gereinigt und ergab die gewünschte Verbindung (Menge 3,9 mg, Ausbeute 60%) als farbloses Pulver. FAB-MS: m/z 1088 (M+H)

Das Produkt (3,9 mg, 3,6 μmol) wurde in Methanol (3 ml) gelöst und Palladiumschwarz (15 mg) wurde hinzugefügt, gefolgt von 90 Minuten Rühren bei Raumtemperatur unter Brodeln von Wasserstoffgas. Nach der Entfernung des Katalysators aus dem Reaktionsgemisch durch Filtrieren wurde das Filtrat bei niedrigem Druck konzentriert, ein farbloses Pulver ergebend.
FAB-MS: m/z 908 (M+H)
Danach wurde das erhaltene Produkt in einer 90% wäßrigen Essigsäure-Lösung (2 ml) gelöst, Zn-Pulver (100 mg) wurde unter Eiskühlung hinzugefügt, gefolgt von 10 Minuten Rühren unter Eiskühlung und 2 Stunden bei Raumtemperatur. Nachdem die unlöslichen Stoffe durch Filtrieren entfern wurden, wurde das Filtrat bei niedrigem Druck konzentriert, ergebend TKR1785-I (Menge 1,1 mg) als farbloses Pulver.
FAB-MS: m/z 518 (M+H)
Beispiel 4: Synthese der Verbindung (4)

1) Die Oxidation der Verbindung (1d): Pyridiniumdichromat (12,8 mg, 34 μmol), suspendiert in DMF (50 μl), wurde zu einer Lösung der Verbindung (1 d) (4,8 mg, 9,6 μmol) in DMF (50 μl) hinzugefügt, gefolgt von 24 Stunden Rühren bei Raumtemperatur. Nach Wasserzugabe wurde das Gemisch 10 Minuten gerührt, extrahiert mit Chloroform und das Extrakt wurde bei niedrigem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde durch TLC gereinigt, einen farblosen Feststoff (Menge 2,5 mg, Ausbeute 51%) ergebend. FAB-MS: m/z 514 (M+H)
2) Synthese der Verbindung (4): Die Verbindung (2,0 mg, 3,9 μmol) erhalten unter 1. und HCL·H₂N-CH(CH(CH₃)₂)-CONH-CH(CH₂OTroc)-CH₂OTroc (4,5 mg, 7,8 μmol), welches separat hergestellt wurde unter Verwendung von Boc-NH-CH(CH₂OH)CH₂OH als Ausgangsstoff, wurden ähnlich wie in den Beispielen 1.–8. gekoppelt. Die Reinigung des Reaktionsgemisches durch TLC ergab das Schutzderivat der Verbindung (4) (Menge 2,8 mg, Ausbeute 70%) als farbloses Pulver. FAB-MS: m/z 1037 (M+H)

Diese erhaltene Verbindung (2,8 mg, 2,7 μmol) wurde in einer 90% wäßrigen Essigsäure-Lösung (2 ml) gelöst und Zn-Pulver (100 mg) wurde unter Eiskühlung hinzugefügt, gefolgt von 10 Minuten Rühren unter Eiskühlung und noch 1 Stunde Rühren bei Raumtemperatur. Nachdem die unlöslichen Stoffe durch Filtrieren entfernt wurden, wurde das Filtrat bei niedrigem Druck konzentriert, ein farbloses Pulver ergebend.
FAB-MS: m/z 687 (M+H)
Danach wurde zu dem erhaltenen Produkt Trifluoressigsäure (TFA) (500 μl) unter Eiskühlung hinzugefügt. Das Gemisch wurde 1 Stunde unter Eiskühlung gelassen und bei niedrigem Druck konzentriert, die Verbindung (4) (Menge 1,0 mg) als farbloses Pulver ergebend.
FAB-MS: m/z 487 (M+H)
Beispiel 5: Synthese der Verbindung (5)
Die Verbindung (1 d) (4,0 mg, 8,00 μmol), Glycerin-Boc-O-Säure (3,0 mg, 12,0 μmol) und DMAP (0,49 mg, 4,00 μmol) wurden in CH₂Cl₂ (300 μl) gelöst und DCC (2,5 mg, 12,0 μmol) wurde unter Eiskühlung hinzugefügt, gefolgt von 10 Minuten Rühren und danach noch 14 Stunden bei Raumtemperatur. Nach dem Filtrieren wurde das Reaktionsgemisch bei niedrigem Druck konzentriert und gereinigt durch TLC (Chloroform-Methanol 200:1). Zu der erhaltenen Verbindung wurde TFA (500 μl) hinzugefügt und nach 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur wurde das Gemisch bei niedrigem Druck konzentriert, die Verbindung (5) (1,4 mg) als farbloses Öl ergebend, dargestellt in Tabelle 1.
FAB-MS: m/z 388 (M+H)
Beispiel 6
Bei der in Beispiel 2 erhaltenen Kopplungsverbindung (4,4 mg, 7,35 μmol) des geschützten Sphingosins (1d) und Valin wurde TFA (500 μl) hinzugefügt, gefolgt von 3 Stunden Rühren bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wurde bei niedrigem Druck konzentriert, die Verbindung (6) (2,3 mg) als farbloses Öl ergebend, dargestellt in Tabelle 1.
FAB-MS: m/z 399 (M+H)
Beispiel 7: Synthese der Verbindung (7)
Die Carboxylgruppe der Verbindung (III) wurde mit LiAlH₄ reduziert, ein primäres OH ergebend, gefolgt von der Veränderung in ein N-Boc-Derivat. Danach wurde das primäre OH durch eine t-Buthyldimethylsylilgruppe (TBDMS) geschützt, das sekundäre OH wurde durch die O-Boc-Gruppe geschützt und danach wurde das TBDMS des primären OH entfernt, H₃C-(CH₂)₁₂-CH(Boc)-CH₂-CH(Oboc)-CH(NHBoc)-CH₂-CH₂OH ergebend. Diese Verbindung (3,5 mg, 5,5 μmol) und Fmoc-Ile-OH (2,5 mg, 7,1 μmol) wurden als Ausgangsstoffe verwendet, die in einer ähnlichen Weise mit der aus Beispiel 2 gekoppelt werden, Fmoc und Boc wurden von dem Produkt entfernt, die Verbindung (7) (1,7 mg) als farbloses Öl ergebend, dargestellt in Tabelle 1.
FAB-MS: m/z 445 (M+H)
Beispiel 8: Synthese der Verbindung (8)
Boc-Ser(Bzl)-ol (300 mg, 1,07 μmol) wurde in DMF (2 ml) gelöst und NAH (50 Suspension in Öl, 77,3 mg, 1,61 mmol) wurde unter Eiskühlung hinzugefügt, gefolgt von 30 Minuten Rühren. Nach Zugabe von Benzylbromid (165 μ, 1,39 μmol), wurde das Gemisch 10 Minuten unter Eiskühlung und 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Eine 10% wäßrige Zitrussäure-Lösung wurde zu dem Reaktionsgemisch gegeben und das Ethylacetat wurde für die Extraktion dazugegeben. Die Ethylacetatschicht wurde mit einer gesättigten wäßrigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung und danach mit einer gesättigten wäßrigen NaCl-Lösung gewaschen, auf Magnesiumsulphat getrocknet, bei niedrigem Druck konzentriert, ergebend das Dibenzylderivat des Boc-Ser-ol. Die Boc-Gruppe dieser Verbindung wurde entfernt und der Reihe nach mit Boc-Val-OH und danach mit Boc-Ala-OH gekoppelt. Die Boc-Gruppe des Produktes wurde entfernt. Das erhaltene Produkt (9,5 mg, 16,9 μmol) wurde mit der in Schritt 1 der Synthese der Verbindung (4) erhaltenen Verbindung (5,7 mg, 11,1 μmol) gekoppelt und die Schutzgruppen wurden durch eine übliche Methode entfernt, eine Verbindung (8) (0,5 mg) als farbloses Öl ergebend, dargestellt in Tabelle 1.
FAB-MS: m/z 559 (M+H)
Beispiel 9: Synthese der Verbindung (9)
Die Verbindung (1) (2,0 mg, 4,1 μmol) wurde in Methanol (200 μl) gelöst und Essigsäureanhydridanhydrid (60 μl) wurde unter Eiskühlung hinzugefügt. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde bei niedrigem Druck konzentriert und der Rückstand wurde durch TLC (entwickelt und mit einer Chloroform-Methanol-Lösung 19:1 eluiert) gereinigt, die Verbindung (9) (1,5 mg) als farbloses Öl ergebend, dargestellt in Tabelle 1.
FAB-MS: m/z 531 (M+H)
Tabelle 1
Testbeispiel: Biologische Eigenschaften
Die antimykotische Aktivität und immununterdrückende Aktivität der Produktderivate der Sphingosin-Analoge wurde durch folgendes Verfahren erforscht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
Messung der antimykotischen Aktivität
Der im Test verwendete Mikroorganismus war Cryptococcus neoformans TIMM 0354. Es wurde das flüssige Medium YNBG (Stickstoffbase aus 0,67% Difca Hefe, 1% Glukose) verwendet und die minimale Wachstumshemmende Konzentration (MIC) wurde nach der 2 Tage langen Züchtung bei 30°C in Anwesenheit der seriellen zweifachen Verdünnung der Verbindung bestimmt. Die minimale Wachstumshemmende Konzentration (μg/ml) wurde als die minimale Konzentration, die die teilweise Hemmung des Wachstums des Mikroorganismus bewirkt, bestimmt und ist ebenfalls in Tabelle 2 in Klammern dargestellt.
Messung der Immununterdrückenden Aktivität
Es wurde die Hemmungsaktivität der Reaktion mit gemischten Lymphozyten (MLR) gemessen und es wurde eine Hemmungsaktivität von 50% ermittelt. Die verwendeten Lymphozyten sind T Zellen aus den Milzzellen der Mäuse C57BL/6 und der Mäuse BALB/c. Tabelle 2
Tabelle 3 (Schema 1)
Industrielle Anwendbarkeit
Die Derivate der Sphingosin-Analoge gemäß der vorliegenden Erfindung bestehen aus den oben beschriebenen Zusammensetzungen und haben eine antimykotische Aktivität und eine immunoregulierende Aktivität, einschließlich immunounterdrückende Aktivität. Folglich können sie als antimykotische Mittel und immunoregulierende Mittel verwendet werden.

Claims

Derivate von Sphingosin-Analogen, welche durch die allgemeine Formel (I)
dargestellt werden, in welcher R¹ und R², die gleich oder voneinander verschieden sind, Wasserstoff, Alkylgruppen mit 1–4 Kohlenstoffatomen oder Acylgruppen mit 2–5 Kohlenstoffatomen sind; R³ und R⁴, welche gleich oder voneinander verschieden sind, Wasserstoff oder Hydroxylgruppen sind; oder R³ und R⁴ eine kovalente Bindung bilden; X¹ -(CH₂)_n-CO-NH-CH(R⁵)-R⁶ oder -(CH₂)_m-O-CO-CH(R⁷)-R⁸ ist; n eine ganze Zahl von 0 bis 3 ist; R⁵ Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann, ist; R⁶ -CH₂OH, -COOH, -CONH₂ oder -CO-NH-CH(R⁹)-R¹⁰ ist; R⁹ Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann, ist; R¹⁰ -CH₂OH, -COOH, -CONH₂ oder -CO-NH-CH(R¹¹)-R¹² ist; R¹¹ Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann, ist; R¹² -CH₂OH, -COOH oder -CONH₂ ist; m eine ganze Zahl von 1 bis 3 ist; R⁷ Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann, ist; R⁸ -CH₂OH, -NH₂ oder -NH-CO-CH(R¹³)-R¹⁴ ist; R¹³ Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann, ist; R¹⁴ -CH₂OH, -NH₂ oder -NH-CO-CH(R¹⁵)-R¹⁶ ist; R¹⁵ Wasserstoff, eine Hydroxylgruppe oder eine Alkylgruppe mit 1–4 Kohlenstoffatomen, welche eine Hydroxylgruppe aufweisen kann, ist; R¹⁶ -NH₂ oder -CH₂OH ist, unter Ausschluss von den Verbindungen, welche Wasserstoff als R¹, R² und R³, eine Hydroxylgruppe als R⁴ und -CH₂-CO-NH-CH(R⁵)-R⁶ als X¹ aufweisen, wobei R⁵ -CH(CH₃)₂ oder -CH-(CH₃)C₂H₅ ist und R⁶ -CO-NH-CH(R⁹)-R¹⁰ ist, wobei R⁹ und R¹⁰ -CH₂OH sind.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, welche das Derivat des Sphingosinanalogen wie in Anspruch 1 beansprucht oder dessen pharmakologisch verträgliches Salz als einem wirksamen Bestandteil umfassen.