DE69831429T2

DE69831429T2 - Verfahren zur langzeitlagerung von dns-molekülen, und verpackung zur durchführung dieses verfahrens

Info

Publication number: DE69831429T2
Application number: DE69831429T
Authority: DE
Inventors: Sophie Tuffet; David Georges De Souza; Jacques Bonnet; Guy Campet; Thierry Noel
Original assignee: IMAGENE PESSAC SOC; IMAGENE Ste
Current assignee: IMAGENE PESSAC SOC; IMAGENE Ste
Priority date: 1998-05-06
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2006-06-29
Anticipated expiration: 2018-05-07
Also published as: PL191861B1; HUP0102541A2; IL139465A; CN1299412A; KR20010043362A; PL345095A1; CA2331374A1; HUP0102541A3; JP2002513567A; IL139465A0; HU225770B1; US6461571B1; NO20005546D0; NO327582B1; HK1039499A1; AU770977B2; BR9815842B1; AU7660398A; DE69831429D1; ES2248902T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die DNA (Desoxyribonuklerinsäure) insbesondere menschlichen Ursprungs, und die Konservierung des DNA-Moleküls, welches Träger der Genmerkmale eines Individuums ist, d.h. seines genetischen Erbmaterials.
Die Erfindung bezieht sich insbesondere auf den Erhalt der genetischen Information durch die möglichst langfristige Konservierung des DNA-Moleküls und zwar unter Bedingungen, mit denen die gesamte genetische Information erhalten bleiben kann. Diese Erfindung bringt vielerlei Vorteile, insbesondere für die prädiktive Medizin, für die genetische Genealogie und die Identifizierung.
Das DNA-Molekül ist zwar relativ stabil, und Studien der Paläogenetik haben gezeigt, dass sich genetisches Material unter günstigen Bedingungen Millionen von Jahren erhalten kann, ohne dieses günstige Umfeld kann es jedoch leicht beschädigt werden.
Zu den Gründen für die DNA-Veränderungen zählen ionisierende Strahlen wie Röntgen- oder Gammastrahlen, Ultraviolettstrahlen, Vorgänge der enzymatischen oder chemischen Oxydation bzw. Hydrolyse.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Konservierungstechnik der DNA in einem Umfeld vor, das sie vor oben genannten Auswirkungen schützt.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren der langfristigen Konservierung von DNA-Molekülen, die nach einer ersten Methode darin besteht, die DNA nach Extraktion und Reinigung durch eine geeignete Technik herkömmlicher oder anderer Art in einer Atmosphäre aus inerten Gasen oder Gasgemischen mit einem Feuchtigkeitsgehalt von unter 1 ppm zu verkapseln, wobei die DNA-Moleküle vorher dehydriert und in eine dichte, rostfreie Metallkapsel platziert wurden.
Nach einer zweiten Methode besteht das Verfahren darin, die DNA nach Extraktion und Reinigung durch geeignete Techniken herkömmlicher oder anderer Art in eine dichte, rostfreie Metallkapsel zu geben, wobei die vorher dehydrierte DNA vor dieser physikalischen Verkapselung chemisch von einer geeigneten (Ko)Polymerhülle umhüllt wird.
Nach einer Variante dieser zweiten Methode erfolgt die chemische Umhüllung zum verstärkten Schutz der DNA gegenüber ultravioletten oder ionisierenden Strahlen mit Hilfe eines Hybrids des besagten (Ko)Polymers, organischen Molekülen bzw. anorganischen Salzen.
Unabhängig von der Methode wird die physikalische Umhüllung der besagten dichten und rostfreien Metallkapsel bevorzugt durch einen zweiten schock- und druckresistenten Behälter ergänzt.
Die so verkapselte DNA kann theoretisch mehrere zehntausend Jahre geschützt vor ionisierenden bzw. ultravioletten Strahlen, chemischen Angriffen und mechanischen Beschädigungen aufgewahrt werden.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind die verschiedenen, nach obigem Verfahren beschriebenen Verpackungstypen. Die Verpackung besteht entweder aus einer Kapsel allein, oder aus einer Kapsel, die durch eine zusätzliche Umverpackung in Form eines Behälters geschützt ist.
Im Innern der Kapsel wird eine gewisse DNA-Menge aufbewahrt, zum Beispiel 30 μg, ausreichend, um jederzeit eine größere Anzahl Proben nehmen zu können.
Die DNA befindet sich direkt in der Kapsel oder auf einer Glasschale, die in die Kapsel eingeführt wird.
Bei jeder Probenentnahme wird die Kapsel geöffnet, die erwünschte DNA-Menge entnommen. Der Rest bleibt in der Kapsel und die ursprüngliche Dichtigkeit der Verpackung wird wieder hergestellt. Die entnommene DNA wird anschließend zu Analysezwecken rehydriert.
Eine solche Verpackung ist geeignet, eine dauerhafte Konservierung des genetischen Erbmaterials zu sichern, das so vor Oxydation, ionisierenden und ultravioletten Strahlen sowie weiteren chemischen Aggressionen und mechanischen Beschädigungen geschützt ist.
Weitere Merkmale und Vorteile ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Verfahren der Erfindung, eine Beschreibung, die nur exemplarisch und im Hinblick auf die Abbildung im Anhang gegeben wird, auf der eine einzige Abbildung schematisch die Struktur einer Verpackung gemäß der vorliegenden Erfindung wiedergibt. Vor Anwendung des Erfindungsverfahrens wird die DNA extrahiert und gereinigt.
Dies kann nach jeder herkömmlichen oder einer anderen Methode erfolgen. Die DNA kann beliebigen Zellen des Organismus entnommen werden.
Beispiel: die DNA kann dem Blut oder den Haarwurzeln, den Speichelzellen, Schleimhautzellen oder Hautzellen entnommen werden. Der Reinigungsprozess besteht aus mehreren Schritten, und zwar folgenden: Aufschluss der Zellen, Entfernen der Proteine durch enzymatischen Abbau, Isolierung bzw. Extraktion der DNA, Amplifikation durch Polymerisierung, wenn erforderlich, und vor Beeinträchtigungen geschützte Aufbewahrung.
Die so vorbereitete DNA liegt als Präzipitat in Alkohol vor. Obenstehendes Protokoll ist in Fachkreisen wohlbekannt und kann durch jedes andere bekannte oder neuere Verfahren ersetzt werden.
Die DNA wird dann der Erfindung entsprechend in eine dichte, rostfreie Metallkapsel platziert.
Ein solche, so genannte physikalische Verkapselung erfolgt in einer Atmosphäre aus inerten Gasen oder Gasgemischen, wie z.B. Edelgasen, bei sehr geringer Feuchtigkeit, wenn möglich unter 1 ppm Wassergehalt und bei Normaldruck.
Dies erfolgt zum Beispiel mit Hilfe einer herkömmlichen Trockenbox.
Die Kapsel, schematisch in 1 auf 1 im Anhang dargestellt, kann zum Beispiel aus Gold sein, bestehend aus einem kleinen runden Gefäß mit gefalztem Deckel.
Der Durchmesser der Goldkapsel kann z.B. etwa 5 mm und die Dicke 2 bis 3 mm betragen.
Die Abdichtung zwischen Kapsel und Deckel kann durch jede andere geeignete Technik erfolgen.
Gold ist vorzuziehen wegen seiner Formbarkeit und seiner Eigenschaft, die DNA nicht zu oxydieren und nicht zu kontaminieren. Als Variante kann eine Legierung auf Gold- oder Platinbasis eingesetzt werden.
Die Atmosphäre wird bei der Verkapselung dehydriert, um Hydrolyse und Oxydation der DNA nach Falzen des Deckels zu verhindern.
Eine DNA-Menge von etwa 30 Mikrogramm in der Kapsel reicht für eine größere Anzahl an DNA-Entnahmen aus der Kapsel während der Konservierung völlig aus.
Eine solche Verpackung reicht aus, um die dauerhafte Konservierung des genetischen Erbmaterials für mehrere zehntausende, ja hunderttausende von Jahren zu sichern, unter der Bedingung, dass die besagte Kapsel unversehrt bleibt.
Diese Verpackung schützt die DNA insbesondere vor:

– chemischen oder enzymatischen Hydrolysereaktionen;
– Abbauprozessen aufgrund von ultravioletten oder ionisierenden Strahlen wie Röntgen- oder Gammastrahlen;
– Oxydation durch den Luftsauerstoff.

Zur verbesserten Konservierung der DNA wird die Goldkapsel 1 bevorzugt in einen dichten Behälter 2 eingeschlossen, die aus einem Material mit guten mechanischen Eigenschaften besteht, um die Kapsel 1 gegen mechanische Beschädigungen, insbesondere durch Schwingungen, Erschütterungen und Druck zu schützen, oder zum Beispiel gegen Temperaturerhöhungen und um die Kapsel allgemein gegen normale oder abnormale Umweltbedingungen zu schützen.
Der Behälter 2 kann eine kleine Dose aus den zwei Teilen 2a und 2b sein, versiegelt oder durch jede andere Technik derart miteinander verbunden, dass die Unversehrtheit und 5 die Dichtigkeit der ganzen Verpackung gewährleistet ist.
Der Behälter 2 kann aus einem entsprechend geeigneten Material bestehen, zum Beispiel Keramik, Verbundwerkstoff, Metall oder Polymer. Nach einer anderen Anwendungsart des Erfindungsverfahrens kann die entsprechend vorbereitete DNA vor der Platzierung in die Kapsel 1 einer chemischen Umhüllung unterworfen werden.
Zu diesem Zweck wird die DNA in einem inerten Polymer oder Kopolymer verkapselt, um den Schutz gegenüber beeinträchtigenden Faktoren zu verstärken, da die DNA-Moleküle so in den Poren des (Ko)Polymers geschützt sind.
Das Umhüllungsmaterial wird so ausgesucht, dass es später aufgelöst werden kann, um die DNA-Moleküle zurückgewinnen zu können.
Jedes (Ko)Polymer kann geeignet sein, mit Ausnahme solcher, die mit der DNA reagieren, die die spätere Wiederauflösung der DNA verhindern oder die zur späteren Wiederauflösung ein saures Lösungsmittel, d.h. ein pH-Wert von unter 4 bis 4 erfordern.
Eine solche chemische Verkapselung kann erreicht werden, indem die derart vorbereitete DNA, z.B. ein durch Präzipitation erhaltenes DNA-Knäuel, in eine Lösung aus Acryl- oder Polyacrylsäure in Methylalkohol eingelegt wird.
Beispiel: 1 g Acryl- oder Polyacrylsäure wird mit 50 cm³ Methylalkohol in Lösung gebracht. Der Alkohol wird langsam zu einem viskösen Gel eingedampft. Ein in eine alkoholische Lösung suspendiertes DNA-Häufchen von etwa 1 mm³ wird in dieses Gel eingelegt.
Das Ganze wird bei 50°C eingetrocknet, bis ein fester Block entsteht, der die DNA enthält. Anschließend wird dieser nach dem oben beschriebenen Verfahren in die Kapsel platziert, und zwar auch hier unter Normaldruck mit dem Unterschied, dass hier keine Trockenbox mehr erforderlich ist.
Zu einem beliebigen späteren Zeitpunkt kann die DNA nach Öffnung der Verpackungen 1 und 2 durch einstündige Immersion in Äthylalkohol entkapselt werden. Der so erhaltene Molekülhaufen ist identisch mit der ursprünglichen DNA, wie sie nach dem Reinigungsverfahren vorlag.
Nach einem anderen Anwendungsbeispiel mit einem anderen (Ko)Polymer wird eine 1%ige Methylmetacrylat- oder Polymethylmetacrylat-Lösung in 50 cm³ Dichlormethan aufgelöst. Die Lösung wird zu einem viskösen Gel eingedampft. Ein in eine alkoholische Lösung suspendiertes DNA-Häufchen von etwa 1 mm³ wird in dieses Gel eingelegt. Das Ganze wird bei 50°C zu einem festen DNA-Block eingetrocknet, der anschließend unter den gleichen Bedingungen wie im vorherigen Beispiel in die Kapsel 1 eingegeben wird.
Zu einem beliebigen späteren Zeitpunkt kann die ursprüngliche DNA nach Öffnung der Verpackungen 1 und 2 durch Auflösung des (Ko)Polymers mit Dichlormethan regeneriert werden.
Nach einer Variante solcher chemischen Verkapselungsmethoden kann das (Ko)Polymer zum besseren Schutz gegen ultraviolette und ionisierende Strahlen mit organischen bzw. anorganischen Salzen gebunden werden. Insbesondere können dem (Ko)Polymer Schwermetall zugefügt werden, sofern gesichert ist, dass dies die DNA nicht beschädigt.
Nach einem anderen Anwendungsbeispiel wird 1 g Acrylamid oder Polyacrylamid in 25 cm³ destilliertes Wasser aufgelöst. Der Lösung werden 50 mg Cu-Acetat und 50 mg Zn-Acetat hinzugefügt. Das Wasser wird langsam zu einem viskösen Gel eingedampft. Ein in eine alkoholische Lösung suspendiertes DNA-Häufchen von etwa 1 mm³ wird in dieses Gel eingelegt. Das Ganze wird bei 50°C zu einem festen DNA-Block eingetrocknet, der anschließend unter den gleichen Bedingungen wie im vorherigen Beispiel in die Kapsel 1 eingegeben wird.
Die chemische Verkapselung mit einem (Ko)Polymer hat den Vorteil, dass eine Polymerisierung in einzelnen Kügelchen erfolgt, so dass die späteren DNA-Entnahmen leichter durchzuführen sind, da der Kapsel nur ein Kügelchen entnommen werden muss, ohne die anderen zu berühren.
Als verwendbares Polymer kann gemäß der Erfindung ebenfalls Agarose verwendet werden.
Die Erfindung ist selbstverständlich nicht auf die oben genannten Anwendungsverfahren begrenzt, sondern umfasst im Gegenteil sämtliche Varianten, insbesondere bezüglich der Materialien, die für die Kapseln 1 bzw. die Behälter 2 verwendet werden, die chemischen und physikalischen Verkapselungsbedingungen, die Art des für die chemische Verkapselung eingesetzten (Ko)Polymers und dessen mögliche Zusätze, sowie die Formen und Abmessungen der besagten Kapseln 1 bzw. Behälter 2.
So kann als Variante die DNA auf eine Glasschale platziert werden, insbesondere aus Alkalikalkglas, wie in 3 auf 2 im Anhang schematisch dargestellt ist.
Die DNA haftet am Glas der Glasschale 3, die zum Beispiel einen Durchmesser von 7 mm und eine Höhe von 1,2 mm haben kann und wobei die Glasschale 3 völlig dicht in die Kapsel 1 eingeschlossen ist.

Claims

Verfahren zur Langzeitkonservierung von DNA-Molekülen, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, nach Extraktion und Reinigung der DNA durch jede geeignete Technik, konventioneller Art oder nicht, eine Verkapselung des vorher entfeuchteten DNA-Moleküls in einer metallischen, rostfreien, dichten Kapsel in einer Atmosphäre durchzuführen, die von einem oder mehreren Inertgasen gebildet ist und einen Feuchtigkeitsgrad kleiner oder gleich 1 ppm Wasser aufweist.
Verfahren zur Langzeitkonservierung von DNA-Molekülen, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, nach Extraktion und Reinigung der DNA durch jede geeignete Technik, konventioneller Art oder nicht, eine Verkapselung des vorher entfeuchteten DNA-Moleküls in einer metallischen, rostfreien, dichten Kapsel durchzuführen, wobei die DNA vor der physischen Verkapselung einer chemischen Verkapselung durch Ummanteln mit einem geeigneten (Co)polymer unterzogen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Verkapselung mit Hilfe eines Hybrids erfolgt, das von dem (Co)polymer, organischen und/oder anorganischen Molekülen gebildet ist, um die DNA verstärkt gegen ultraviolette oder ionisierende Strahlen zu schützen.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Hybrid von einem (Co)polymer und Schwermetallionen gebildet ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das (Co)polymer und seine möglichen organischen oder anorganischen Zusätze in einem Lösungsmittel gelöst sind, das dann bis zum Erhalt eines viskosen Gels verdampft wird, und dass dann eine bestimmte Menge an DNA in Suspension in einer alkoholischen Lösung innerhalb des Gels angeordnet und die Gesamtheit bei einer geeigneten Temperatur bis zum Erhalt eines festen, die DNA enthaltenden Blocks getrocknet wird.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass auf die chemische Verkapselung eine Verkapselung in einer metallischen, rostfreien, dichten Kapsel in einer von einem oder mehreren Inertgasen gebildeten Atmosphäre folgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Kapsel in einem dichten, gegen Stöße und Zusammendrücken festen Behälter angeordnet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA vor ihrer Verkapselung in der metallischen Kapsel auf eine Glaskuppel gelegt wird.
Konservierungsverpackung, die gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 erhalten wird, dadurch gekennzeichnet, dass sie von einer Kapsel aus Metall oder einer geschmeidigen Metalllegierung gebildet ist, Eigenschaften des Nichtrostens und der Nichtkontaminierung der DNA aufweist und dicht von einem Deckel durch jedes geeignete Mittel, insbesondere eine Crimpverbindung, verschlossen ist.
Verpackung nach Anspruch 9, die insbesondere für den Einsatz des Verfahrens des Anspruchs 7 bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie in einem Behälter aus einem Material eingeschlossen ist, das in der Gruppe ausgewählt wird, die die Keramikstoffe, Verbundstoffe, Metalle, Polymere enthält.
Verpackung nach Anspruch 9 oder 10, die insbesondere für den Einsatz des Verfahrens des Anspruchs 9 bestimmt ist, dadurch gekennzeichnet, dass sie im Inneren der metallischen Kapsel eine Glaskuppel umfasst, auf die die DNA gelegt wird.
Verpackung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Kuppel von einem Alkali-Kalk-Glas gebildet ist.