DE2643414A1

DE2643414A1 - Filter und zubereitung zur umwandlung und zum nachweis von kohlenmonoxid in gasstroemen und verfahren zu deren herstellung

Info

Publication number: DE2643414A1
Application number: DE19762643414
Authority: DE
Inventors: Israel Herbert Dr M Scheinberg
Original assignee: Scheinberg israel Herbert drmed
Current assignee: Scheinberg israel Herbert drmed
Priority date: 1976-02-19
Filing date: 1976-09-27
Publication date: 1977-08-25
Also published as: CA1087968A; GB1503879A; JPS52102090A

Description

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Patentanwälte Dipl.-Ing. H.Weickmann, Dipl.-Phys. Οΐ\. If. F

Dipl.-Ing. F.AAVeickmann, DiPL.-CH.t>i ty, )\\}pj j£f\

8 MÜNCHEN 86, DEN

POSTFACH 860 820

MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

Case P-91958-D HtM/S

Israel Herbert Scheinberg
5447 Palisade Avenue
Bronx, New York 10471/USA

Filter und Zubereitung zur Umwandlung und zum Nachweis von Kohlenmonoxid in Gasströmen und Verfahren zu deren Herstellung

Die Erfindung betrifft ein Filter zur Umwandlung und zum Nachweis von Kohlenmonoxid in Gasströmen, eine dafür geeignete Zubereitung und ein Verfahren zu deren Herstellung.

Es wurde gefunden, daß in tierischem Gewebe, wie im Plasma oder in den roten Blutkörperchen und in verschiedenen Bakterien und Pflanzen, einschließlich Algen und Pilzen, ein Enzym enthalten ist, das als Kohlenstoffmonoxidase oder auch CMase bezeichnet wird. Das Enzym bewirkt die Umwandlung von in einem Gasstrom enthaltenem Kohlenmonoxid. Wenn die Umwandlung darin besteht, Kohlenmonoxid zu Kohlendioxid zu oxidieren, kann das

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Enzym zum Nachweis von Kohlenmonoxid verwendet werden. Damit ist dieses Enzym zur quantitativen Bestimmung von Kohlenmonoxid in Gasströmen geeignet.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Filter zur Umwandlung und zum Nachweis von Kohlenmonoxid in Gasströmen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Zubereitung enthält, die das Enzym Kohlenstoffmonoxidase (CMase) und einen Träger oder ein Lösungsmittel für dieses Enzym umfaßt.

Die Bildung der Kohlenstoffmonoxidase kann dadurch beschleunigt werden, daß man Bakterienkulturen oder Pflanzen in einer Atmosphäre züchtet, die eine erhöhte Konzentration an Kohlenmonoxid aufweist. Die gleichzeitige Steigerung der Sauerstoffkonzentration begünstigt die Bildung dieses Enzyms ebenfalls.

Gegenstand der Erfindung ist daher auch ein Verfahren zur Herstellung und zur Reinigung des Enzyms Kohlenstoffmonoxidase (CMase), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Material, ausgewählt aus der Tiergewebe, Kohlenstoffmonoxidase bildende Bakterien und Kohlenstoffmonoxidase bildende Pflanzen, wobei der Ausdruck "Pflanzen" auch Algen und Pilze einschließt, umfassenden Gruppe auswählt, das Material in Wasser suspendiert, das Material fragmentiert, das fragmentierte Material in lösliche und unlösliche Fraktionen aufteilt, ermittelt, ob die Kohlenstoffmonoxidase in der löslichen oder in der unlöslichen Fraktion enthalten ist, und die Kohlenstoffmonoxidase aus der Fraktion gewinnt, in der sie enthalten ist.

Es hat sich ferner gezeigt, daß ein Filtermedium,das Kohlenstoffmonoxidase enthält, dazu geeignet ist, die Kohlenmonoxidkonzentration in einem Gasstrom wesentlich zu vermindern, wobei ein Gasstrom von besonderem Interesse Tabakrauch ist. Vorteile lassen sich auch dadurch erzielen, daß man die Kohlenstoffmonoxidase in einem Filter mit Verbindungen kombiniert, die Kohlenmonoxid reversibel binden.

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Die Anwesenheit des Enzyms Kohlenstoffmonoxidase in tierischem Gewebe und insbesondere in gepackten roten Blutzellen oder roten Blutkörperchen, zeigte sich bei Untersuchungen hinsichtlich der Verwendung von Eisen(II)-hämoglobin zur Entfernung von Kohlenmonoxid aus Zigarettenrauch, da das Kohlenmonoxid bei weitem der gesundheitsschädlichste Bestandteil des Zigarettenrauchs ist. Es hat sich gezeigt, daß gepackte rote Blutkörperchen des menschlichen Blutes bis zu dem Vierfachen der Kohlenmonoxidmenge absorbieren können, die auf der Grundlage des vorhandenen Hämoglobins stöchiometrisch zu erwarten wäre. Beim Inbetrachtziehen weiterer, offenbar damit nicht zusammenhängender Untersuchungen zeigte sich, daß dieses anfänglich überraschende Phänomen dadurch erklärt werden kann, daß in dem Blut ein Faktor enthalten ist, der die Umwandlung von Kohlenmonoxid katalysiert. So konnte gezeigt werden, daß bei vielen Tieren, einschließlich dem Menschen, ein geringer Anteil des Hämoglobins mit Kohlenmonoxid kombiniert ist, selbst wenn das Tier oder der Mensch in einer Umgebung lebt, deren Luft frei ist von irgendwelchen merklichen Kohlenmonoxxdkonzentrationen. Die Anwesenheit des Kohlenmonoxids in dem Blut liefert den Beweis, daß in den Tieren eine endogene Bildung von Kohlenmonoxid erfolgt. Wenn weiterhin kein Mechanismus vorhanden wäre, . der.das Kohlenmonoxid mit einer solchen Geschwindigkeit wieder entfernen würde, in der dieses Material gebildet und aufgenommen wird, würde sich das Kohlenmonoxid bis zu einer Konzentration anreichern, bei der es eine schädliche und möglicherweise tödliche Wirkung ausüben könnte. Es ist daher ersichtlich, daß das Kohlenmonoxid mit Hilfe eines Katalysators in Form eines Enzyms entfernt werden muß, zusätzlich zu einer Diffusion des Kohlenmonoxids in die Lungenbläschen. Insbesondere zeigte E. Killick, daß, wenn man Menschen wiederholt einer kohlenmonoxidhaltigen Atmosphäre aussetzt, sich bei einem gegebenen Prozentsatz des Kohlenmonoxids in der Atmosphäre weniger schwere Symptome der Kohlenmonoxidvergiftung und ein geringerer Gehalt an Carboxyhämoglobin in dem Blut ergeben, als es vor dieser Akklimatisierung der Fall ist.

Weiterhin hat sich bei Arbeiten, die bis auf das Jahr 1856 zurückgehen, gezeigt, daß Männer und Frauen, die aufgrund ihrer Beschäftigung häufig einer geringen Kohlenmonoxidkonzentration ausgesetzt

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sind/ eine gewisse Verträglichkeit für dieses Gas entwickeln.

A. Kistner gibt in "Proceedings of the Section of Sciences" Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen, Vol. LVI, Series C, 443-450 (1953) unter dem Titel "On a Bacterium Oxidizing Carbon Monoxide" eine Literaturübersicht. Er verweist auf H. Kaserer, Centr. Bakt. Parasitenk. II, 16, (1906) 681, 769, der versuchte, wasserstoffoxidierende Bakterien zu isolieren. Trotz unzureichenden Beweismaterials behauptete Kaserer die Entdeckung der Kohlenstoffmonoxidoxidation durch Mikroorganismen.

C. Wehmer brachte Leuchtgas mit Gartenerde in Kontakt und beobachtete eine Verminderung der Kohlenmonoxidkonzentration (Berichte 59, (1926) 887). Es zeigte sich jedoch keine Wirkung, wenn die gleiche Untersuchung mit sterilisierter Erde durchgeführt wurde. Offensichtlich war ein Organismus oder ein Enzym, der bzw. das die Umwandlung des Kohlenmonoxids verursacht, vorhanden. Tatsächlich isolierte Kistner aus der Gartenerde einen Organismus, dessen reine Kulturen sich in einer Kohlenmonoxid enthaltenden Atmosphäre entwickeln können. Dennoch gelang es Kistner nicht, den in den Bakterien vorhandenen Faktor zu isolieren, der für die Umwandlung des Kohlenmonoxids verantwortlich ist.

E.W. Chappelle berichtete in Biochimica Et Biophysica Acta, 62 (1962) 45-62, über die Kohlenmonoxidoxidation durch Algen. Er zeigte, daß Kohlenmonoxid in Gegenwart von Grünalgen und Sauerstoff zu Kohlendioxid oxidiert wird und daß die Reaktionsgeschwindigkeit in Gegenwart von Licht um ein Mehrfaches gesteigert wird.

Aus den obigen Literaturstellen ist ersichtlich, daß Säugetiere, Pflanzen und Bakterien die Fähigkeit besitzen, Kohlenmonoxid umzuwandeln und zwar im allgemeinen zu Kohlendioxid. Dies ist von Standpunkt der Evolution aus gesehen vernünftig, da Kohlenmonoxid überall vorkommt. Weiterhin ist festzustellen, daß diese Fähigkeit noch weiter verbreitet ist und vielen Vertretern sowohl der Klasse der Pflanzen als auch der Klasse der Tiere eigen ist.

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Spezifische Beispiele für Bakterien, aus denen das Enzym gewonnen werden kann, sind:

Methanosarcina barkerii,
Methanobacterium formicicum,
Bacillus oligocarbophillus
(hydrogenomonas carboxydovorans) Desulfovibrio desulfuricans

Spezifische Pflanzen, aus denen Kohlenstoffmonoxidase (CMase) isoliert werden kann, sind:

Chlorella vulgaris

Scenedesmus

Spinat- und Gurken-Blätter

Im folgenden sei ein Verfahren zur Gewinnung von Kohlenstoffmonoxidase aus hydrogenomonas carboxydovorans, einen, gramnegativen stabförmigen Bakterium mit endständiger Geißel. Zur Isolierung einer Kohlenstoffmonoxidase bildenden Kultur inkubiert man beispielsweise 200 ml eines Mediums, das 0,2 % KNO₃, 0,1 % K₃HPO₄ und 0,01 % MgSO₄ · 7H₂O enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, mit 2 g Abwasserschlamm. Die Schlammkultur züchtet man in einer Atmosphäre, die 30 % CO, 20 % O₃ und 50 % N₃ enthält, und erhält einen Organismus, der in der Lage ist, Kohlenmonoxid zu Kohlendioxid zu oxidieren. Die Kultur enthält mindestens sechs verschiedene Bakterienarten, was sich nach der morphologischen Untersuchung zeigt, nachdem man das Material in Form von Streifen ausgebreitet hat und diese Streifen auf einem festen Medium gezüchtet hat, d. h. in der oben beschriebenen Lösung, die mit 1 % sterilisiertem Abwasserschlamm angereichert und mit 2 % Agar versetzt ist. Dann züchtet man eine Kultur dieser sechs Organismen in einem flüssigen Medium der beschriebenen und angereicherten Art, wobei man jedoch unter einer Atmosphäre arbeitet, die 70 % CO, 20 % O₀ und 10 % N₉ enthält. Man erhält eine reine Kultur eines einzigen Bacteriums, nämlich des Bacteriums hydrogenomonas carboxydovorans. Offensichtlich werden die nicht spezifischen Organismen durch die relativ hohe Kohlenmonoxidkonzentration abgetötet.

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Auf die Anwesenheit des Enzyms Kohlenstoffmonoxidase kann geschlossen werden, da es gebildet wird, wenn der Organismus unter einer hohen Kohlenmonoxidkonzentration von beispielsweise 30 % gezüchtet wird. Bei Kohlenmonoxidkonzentrationen von bis zu 30 % wachsen ebenfalls nicht spezifische Bakterien, die voraussichtlich keine Kohlenstoffmonoxidase bilden; diese Bakterien werden jedoch bei wesentlich oberhalb 30 % liegenden Konzentrationen, beispielsweise Kohlenmonoxidkonzentrationen von 70% abgetötet, so daß man eine reine Kultur des Kohlenstoffmonoxidase bildenden Bakteriums erhält.

Die Bildungsgeschwindigkeit der Kohlenstoffmonoxidase kann dadurch gesteigert werden, daß man den Kohlenmonoxidpartialdruck erhöht, vorausgesetzt, daß die Sauerstoffkonzentration nicht zu gering wird. Dies bedeutet, daß es ebenfalls erwünscht ist, den Sauerstoffpartialdruck zu steigern. Es ist ersichtlich, daß die Partialdrücke von Kohlenmonoxid und Sauerstoff bis zu einem Punkt gesteigert werden können, an dem die Summe der Partialdrücke größer ist als der Atmosphärendruck, so daß man in diesem Fall ein Druckgefäß anwenden muß. Die obere Druckgrenze ist dann erreicht, wenn entweder die Bildungsgeschwindigkeit des Enzyms nachläßt, oder wenn es unwirtschaftlich wird, das Druckgefäß weiter zu verstärken .

Das Enzym kann gewünschtenfalls aus einem flüssigen Gewebe, wie Plasma, oder nach der Fragmentierung von Zellen, durch Gefriertrocknung, durch Ultraschalleinwirkung oder durch osmotischen Schock, konzentriert werden. Die gebildete Suspension wird in lösliche und unlösliche Fraktionen aufgetrennt, beispielsweise durch Zentrifugieren, worauf die Fraktionen analysiert werden, um jene Fraktion zu ermitteln, in der das gewünschte Enzym enthalten ist. Sollte eine merkliche oder eine überwiegende Konzentration des Enzyms in der unlöslichen Fraktion enthalten sein, führt man eine löslich machende Behandlung durch, beispielsweise mit Reagentien, wie nichtionischen Detergentien.

Die Kohlenstoffmonoxidase enthaltende Lösung wird dann üblichen

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Proteinfraktionierungsverfahren unterworfen, welche Verfahren geeignet sind, da das Enzym ein Protein ist. Beispiele für solche Verfahren sind die Äthanolfraktionierung, bei der die ionische Zusammensetzung, die Temperatur, der pH-Wert und die Konzentration des Proteins und des Äthanols gesteuert werden; die Ausfüllung mit Schwermetallen, wie Zink; und die chromatographische Trennung unter Verwendung geeigneter Adsorbentien. Beispiele für solche Adsorbentien sind die von der Firma Pharmacia hergestellten Produkte Sepharose und Sephadex (vernetztes Polysaccharid), Anionenaustauscherharze, wie die von den Firmen Dow Chemical Co., Diamond-Shamrock, Rohm and Haas Company und die Firma Permutit in England und USA hergestellten Produkte. Weitere Beispiele sind die von den gleichen Firmen hergestellten Kationenaustauscherharze, makroporöse Harze und Mischbettharze, die ebenfalls von den gleichen Firmen hergestellt werden. Weitere geeignete Adsorbentien sind die von der Firma.Bio-Rad Laboratories vertriebenen Ionenaustauschercellulosen. Von diesen Cellulosematerialien sind diejenigen besonders gut geeignet, die aus hochreiner Baumwolle mit einem Φ-Cellulosegehalt von etwa 98 %, faserigen Cellulosepulvern und mikrogranulären Pulvern hergestellt sind. Die Adsorbentien Sepharose und Sephadex sind Beispiele für eine Vielzahl von Gelen, die auch für die chromatographische Trennung von Proteinen geeignet sind.

Das genannte Verfahren ist auch zur Gewinnung des gewünschten Enzyms aus Pflanzen, einschließlich Algen und Pilzen (Fungi) geeignet. Es ist ersichtlich, daß man die Pflanzen durch Verfahrensweisen, wie Mazerieren, Hochgeschwindigkeitsvermahlen etc. fragmentieren kann. Weiterhin kann man durch Züchten der Pflanzen in hohen Kohlenmonoxidkonzentrationen und gegebenenfalls in hohen Sauerstoffkonzentrationen die Bildungsgeschwindigkeit des Enzyms erhöhen.

Zur Gewinnung der Kohlenstoffmonoxidase aus Blut unterwirft man die roten Blutkörperchen einer Lyse und trennt die von dem Hemoglobin befreiten Blutkörperchen ab. Durch Zugabe von Ammoniumsulfat bis zu einer Konzentration von 45 bis 55 % der Sättigung fällt man das Hemoglobin aus der überstehenden Flüssigkeit aus, wobei man

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• bilden pH-Wert oberhalb 6,0 hält. Dann trennt man das Hemoglobin ab. Die überstehende Flüssigkeit wird gegen eine 0,01 molare Ammoniumacetatlösung oder gegen Lösungen von anderen Salzen flüchtiger schwacher Säuren und flüchtiger schwacher Basen dialysiert, um das Ammoniumsulfat zu entfernen, wobei man die überstehende Flüssigkeit puffert. Die gebildete Lösung wird auf den Kohlenstoffmonoxidasegehalt analysiert, indem man den Kohlenmonoxid und Sauerstoff enthaltenden Gasstrom durch die Lösung führt und das Ausmaß der Kohlenmonoxidabtrennung bestimmt.

Zur Untersuchung der von dem Hämoglobin abgetrennten roten Blutkörperchen in Bezug auf gebundene Kohlenstoffmonoxidase fragmentiert man diese Zellen durch Einwirkung von Ultraschall oder durch osmotischen Schock und behandelt sie mit einem Detergens, wie dem von der Firma Rohm and Haas hergestellten Produkt Triton X-100, um die in den Membranen gebundene Kohlenstoffmonoxidase löslich zu machen. Die gebildete Lösung wird dann in der oben beschriebenen Weise untersucht.

Die Kohlenstoffmonoxidase kann man durch Gefriertrocknen zu einem trockenen Pulver verarbeiten, was den weiteren Vorteil hat, daß das Ammoniumacetat die Lösung während der Durchführung des Verfahrens in der Nähe des Neutralpunktes hält und diese Verbindung durch Sublimation entfernt wird.

Obwohl man das entweder zur Umwandlung von Kohlenmonoxid oder zum Nachweis von Kohlenmonoxid verwendete Enzym vorzugsweise konzentriert, kann man auch eine Zusammensetzung oder Zubereitung, die intakte oder aufgebrochene tierische Blutzellen oder andere Zellen, Bakterien oder Pflanzen enthält, als solche verwenden, obwohl man dies vorzugsweise in Kombination mit einem Trägermaterial tut. Somit kann man die ganzen Bakterien gefriertrocknen und das erhaltene trockene Pulver direkt als Filtermedium verwenden. Wenn man die gefriergetrockneten Bakterien als Filtermedium verwendet, kann man in der Filterkette dem Filter Wasser oder eine geeignete Lösung vorschalten, das bzw. die den erforderlichen Wasserdampf liefert, der notwendig ist,

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damit das Enzym mit Kohlenmonoxid reagieren kann. Alternativ kann man den Gasstrom oder Rauchstrom mit dem für diesen Zweck geeigneten Wasserdampf versetzen.

Wie bereits erwähnt, kann man das konzentrierte oder gereinigte Enzym, das man in der oben beschriebenen Weise isoliert hat, auch gefriertrocknen und in ähnlicher Weise als Filtermedium verwenden. Vorzugsweise setzt man das Enzym jedoch auf einem Trägermaterial der beschriebenen Art ein. Weitere Trägermaterialien sind Aktivkohle und die Kationenaustauscher und Ionenaustauscherharze IR-120 und IRA-400 der Firma Rohm and Haas. Es hat sich gezeigt, daß auch Carbo-Resin (Carbacrylamxnharζ) ein geeignetes Trägermaterial darstellt.

Wenn die Enzyme (Kohlenstoffmonoxxdasen) von Pflanzen abgeleitet werden, kann man sie auch in Form des ganzen Organismus, oder wenn die darin vorhandene Enzymkonzentration zu gering ist, in Form von Präparaten einsetzen, die man durch Fraktionierung mit Hilfe der Techniken erhält, die in Bezug auf die Gewinnung dieser Enzyme aus Bakterien beschrieben wurden.

Ein besonders geeignetes Substrat, das man in Kombination mit dem Enzym einsetzen kann, ist ein Material, das in der Lage ist, Kohlenmonoxid und Sauerstoff reversibel zu binden. Im allgemeinen handelt es sich bei diesen Materialien um Verbindungen mit Strukturen, die eine oder mehrere Häm-Reste aufweisen, die an eine PoIypeptidkette gebunden sind. Beispiele hierfür sind Eisen(II)-hämoglobin und das als Mikroperoxidase bezeichnete Enzymfragment. Mikroperoxidase ist ein Häm-polypeptid oder ein Häm-peptid, das man durch Fermentierung von Cytochrom c mit Pepsin erhält, wobei man ein Verfahren anwendet, das ein modifiziertes Verfahren nach Tuppy und Paleus ist (Acta Chem. Scand. 9 (1955) 353). Das Material besitzt ein Molekulargewicht von etwa 1900, wogegen Hämoglobin ein Äquivalentgewicht von 16500 besitzt. Demzufolge kann das Material bei Anwendung gleicher Gewichtsmengen fast die 9-fache Menge Kohlenmonoxid binden. Obwohl die Bindung reversibel erfolgt, ist die Festigkeit der Bindung wesentlich grö-

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ßer als im Fall von Hämoglobin. Daher ist es dem Hämoglobin auf stöchiometrischer Basis und auch in Bezug auf die Gleichgewichtskonzentration überlegen, auf die der Kohlenmonoxidgehalt eines Gasstroms durch die Verwendung dieses Materials in einem Filter abgesenkt werden kann.

In Bezug auf die Bindung von Kohlenmonoxid ist Harn als solches nicht annähernd so wirksam wie Hämoglobin oder Mikroperoxidase. Obwohl das Molekulargewicht dieser Verbindung lediglich 616,5 beträgt, kann man die Häm-polypeptide nicht durch diese Verbindung ersetzen.

Man kann ein Häm-polypeptid und vorzugsweise Mikroperoxidase zusammen mit einem geeigneten Trägermaterial dazu verwenden, Kohlenmonoxid aus der Umgebungsatmosphäre durch Binden des Kohlenmonoxids zu entfernen. Zusätzlich führt die Verwendung eines Hämpolypeptids als Substrat, das man in Kombination mit Kohlenstoffmonoxidase verwendet, nicht nur dazu, die Oberfläche des Enzyms für das Kohlenmonoxid zugänglicher zu machen, sondern dient auch dazu, sowohl Kohlenmonoxid als auch Sauerstoff zu binden und diese beiden von der Kohlenstoffmonoxidase benötigten Reaktionsteilnehmer zusammenzubringen. Weiterhin verlängert das Material den Kontakt zwischen den beiden Reaktionsteilnehmern und dem katalytischen Enzym. Aufgrund der Tatsache, daß Eisen(II)-hämoglobin insbesondere während der Verarbeitung in Methämoglobin ungewandelt werden kann, ist es erwünscht, ein Reduktionsmittel, wie Ascorbinsäure, Methylenweiss oder Dithionitionen zuzugeben. Vorzugsweise sollte das Verhältnis von Reduktionsmittel zu Hämoglobin, als Äquivalente gerechnet, im Bereich von 1 bis 8 liegen. Weiterhin sollte ein Puffer, wie ein Phosphatpuffer oder ein Tris(hydroxymethyl)-aminoäthan-Chlorwasserstoffsäure-Puffer in einer solchen Menge vorhanden sein, daß der pH-Wert der Zubereitung zwischen 6,0 und 8,5 liegt, insbesondere wenn die Zubereitung in Lösung vorliegt. Weiterhin ist es bevorzugt, ein Reduktionsmittel und einen Puffer.zusammen mit anderen Häm-polypeptid-Verbindungen einzusetzen, die in der Lage sind, Kohlenmonoxid und Sauerstoff zu binden.

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Weitere Ausführungsformen, Gegenstände und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der weiteren Beschreibung, in der auf die beigefügte Zeichnung Bezug genommen ist.

In der Zeichnung zeigen:

Fig. 1 eine waschflaschenartige Vorrichtung zur Absorption von Kohlenmonoxid aus einem Gasstrom;

Fig. 2 eine Schnittansicht einer Zigarette mit einem Filter, das eine Zusammensetzung enthält, in der ein Enzym enthalten ist, das zur Umwandlung von in Tabakrauch enthaltenem Kohlenmonoxid geeignet ist; und

Fig. 3 eine Vorrichtung zur Bestimmung von Kohlenmonoxid in Umgebungsluft oder einem Gasstrom.

In der Fig. 1 ist eine Absorptionseinrichtung gezeigt, in der das Enzym entweder als solches oder in Kombination mit einem Häm-polypeptid in wirksamer Weise verwendet werden kann. Der Gasstrom, aus dem das Kohlenmonoxid entweder vollständig oder teilweise entfernt werden soll, wird über die Einlaßleitung 12 und die Einlaßspitze 13 in die Lösung 14 eingeführt, die in der Waschflasche 11 vorliegt. Das Gas tritt über das Auslaßrohr 16 aus der Absorptionseinrichtung 11 aus. Zur Vermeidung eines nachteiligen Schäumens ist es von Vorteil, eine geringe Menge, üblicherweise wenige Tropfen, eines Antischäummittels, wie Methylsilikon oder Octylalkohol zuzusetzen. Wenn in der Lösung ein Häm-polypeptid vorhanden ist, setzt man der Lösung vorzugsweise eines der oben erwähnten Reduktionsmittel zusammen mit einem Puffer zu. Das Reduktionsmittel sollte dazu geeignet sein, die Umwandlung des Eisen(II)-häm-proteins durch gegebenenfalls vorhandenen Sauerstoff zu verhindern. Weiterhin sollte das Reduktionsmittel ein solches Material sein, das die gewünschte Wirkung ausübt, wenn der pH-Wert der Lösung innerhalb des Bereiches liegt, in dem das Häm-polypeptid aktiv ist, da das Häm-polypeptid bei pH-Werten, die außerhalb dieses Bereiches liegen, denaturiert werden kann. Im Fall von Hämoglobin erstreckt sich dieser pH-

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Bereich von 6,0 bis 8,5. Es sollte berücksichtigt werden, daß, wenn heißer Rauch durch die Lösung geführt wird, das Reduktionsmittel ein solches Material sein sollte, das keine flüchtigen toxischen Produkte liefert, da dieses Material dann nicht geeignet ist, wenn der Rauch inhaliert werden soll. Es ist jedoch ersichtlich, daß ein solches Reduktionsmittel bei Testversuchen oder für Analysenzwecke eingesetzt werden kann.

Ein effektives Reduktionsmittel muß daher ein Material sein, das das Häm-polypeptid in Gegenwart von Sauerstoff in dem aktiven Zustand hält, bis das Reduktionsmittel verbraucht ist. Es darf weiterhin die Wirkung des Enzyms oder des Häm-polypeptids oder der anderen Faktoren in Bezug auf Kohlenmonoxid nicht beeinträchtigen und darf keine unerwünschten Verunreinigungen in den durchgeführten Gasstrom abgeben, wenn dieser Strom inhaliert werden soll.

Es ist festzuhalten, daß man ein Häm-polypeptid und insbesondere Mikroperoxidase in Form einer Lösung oder eines festen Substrates ohne Kohlenstoffmonoxidase verwenden kann. Wenn das Material in dieser Weise eingesetzt wird, ist die Fähigkeit des Filters in Bezug auf die Entfernung des Kohlenmonoxids aufgrund des Polypeptids auf die stöchiometrische Menge dieser Verbindung beschränkt, während bei Anwesenheit des Enzyms Kohlenstoff monoxidase , das als Katalysator wirkt, eine theoretisch unbegrenzte Umwandlung des Kohlenmonoxids erreicht werden kann.

Wenn man Kohlenmonoxid aus Tabakrauch entfernen will, ohne eine Lösung in einer Absorptionsvorrichtung zu verwenden, wie sie in der Fig. T dargestellt ist, kann man das Zellenmaterial zu einem Filter verarbeiten, das in das Mundstück einer Zigarette, einer Zigarre oder einer Pfeife eingebracht wird. Eine Form eines solchen Filters ist in der Fig. 2 wiedergegeben, in der die Zigarette allgemein durch die Bezugsziffer 18 bezeichnet ist, wobei die Zigarette einen Tabak 21 enthaltendes Zigarettenpapier 19 und am distalen Ende eine Filterpatrone 22 im Mundstück der Zigarette umfaßt, wobei das Filter 22 und die

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Tabakfüllung 21 durch eine permeable oder perforierte Sperrschicht 23 getrennt sind. Die Filterfüllung 24 enthält entweder eine Kohlenstoffmonoxidase als solche oder dieses Enzym in Kombination mit einem Häm-polypeptid und/oder einem absorbierenden Material, wie Celluloseflocken, Aktivkohle oder einem der oben erwähnten Adsorbentien. Der Zweck der Anwendung einer solchen festen Adsorbens besteht natürlich darin, das Hindurchtreten des Tabakrauches zu erleichtern. Der Ausdruck "Tabakrauch" umfaßt sowohl den Gasstrom, der den brennenden Tabak verläßt, als auch das darin enthaltende teilchenförmige Material.

Wenn das Filter Hämoglobin und Kohlenstoffmonoxidase enthält, umfaßt die Filterfüllung vorzugsweise 1 bis 8 Äquivalente eines wirksamen Reduktionsmittels, pro Äquivalent des in der Füllung enthaltenen Hämoglobins. Weiterhin sollte in der Füllung ein Puffer, der in der Lage ist, den pH-Wert zwischen 6,0 und 8,5 zu halten, enthalten sein, wobei der Puffer und das Reduktionsmittel solche Materialien sein sollten, die die Wirkung der Kohlenstoffmonoxidase oder des Hämoglobins nicht beeinträchtigen und die keine toxischen flüchtigen Substanzen in den Gasstrom einbringen.

Zum Schutz der Kohlenstoffmonoxidase und insbesondere dann, wenn diese in Kombination mit einem Häm-polypeptid eingesetzt wird, kann die Füllung des Filters 22 während der Lagerung der mit solchen Filtern ausgerüsteten Zigaretten in einen zerstörbaren Behälter 26 eingekapselt sein, wie es in der Fig. 2 dargestellt ist. Der Behälter sollte aus einem Material bestehen, das ohne weiteres zwischen den Fingern zerbrochen oder zerrissen werden kann. Alternativ kann der Behälter mit einer (nicht dargestellten) Spitze ausgerüstet sein, die ohne weiteres abgebrochen werden kann. Ein zusätzlicher Filter 27, der verhindert, daß irgendwelche Glasreste oder dgl. zusammen mit dem Gasstrom durch den Raucher inhaliert werden, kann ebenfalls in der Zigarette vorhanden sein.

Es ist ersichtlich, daß man einen ähnlichen Aufbau für Zigarren verwenden kann. Alternativ kann man eine Absorptionseinrichtung,

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wie sie unter der Bezugsziffer 11 in der Fig. 1 dargestellt ist, in Kombination mit einer üblichen Zigarette (die jedoch nicht den Filter 22 aufweist) oder einer Zigarre oder einer Pfeife verwenden. Weiterhin ist es möglich, eine (nicht dargestellte) Pfeife mit einem solchen Stiel zu versehen, daß man beim Stopfen der Pfeife mit frischem Tabak einen Filter einführen kann. Wenn der Filter Hämoglobin oder ein anderes Hämpolypeptid enthält, kann eine Zerstörung oder Zersetzung dieses Materials dadurch verhindert oder zumindest verzögert werden, daß man die Zubereitung in gekühltem Zustand aufbewahrt.

Die hierin in Bezug auf die Wirkung von Kohlenstoffmonoxidase auf in einem Gas vorhandenes Kohlenmonoxid verwendeten Ausdrücke "absorbieren" , "Absorptionsvorrichtung" und "Umwandlung" umfassen irgendwelche Prozesse, durch die die Kohlenmonoxidkonzentration in dem Gas vermindert wird, unabhängig davon, ob die Kohlenstoffmonoxidase als Katalysator für eine Reaktion oder in anderer Weise wirkt,

Die Oxidation des Kohlenmonoxids zu Kohlendioxid durch Sauerstoff in Gegenwart von Kohlenstoffmonoxidase ermöglicht die Anwendung des Enzyms zum Nachweis und gewünschtenfalls zur quantitativen Bestimmung von Kohlenmonoxid in einem Gas. In der Fig. ist eine für diesen Zwecke geeignete Vorrichtung gezeigt. Das Gas wird mit Hilfe von (nicht gezeigten) geeigneten Vorrichtungen über die Einlaßleitung 31 in die Kohlendioxidabsorptionseinrichtung 32 und dann über die Leitung 33 in die Kohlenmonoxidumwandlungslösung 34, in der Kohlenstoffmonoxidase enthalten ist, überführt. Die Kohlenstoffmonoxidase enthaltende Zubereitung 34 wird als Reagens angesehen, das die Umwandlung von Kohlenmonoxid zu Kohlendioxid durch in dem Gasstrom enthaltenen Sauerstoff katalysiert. Der Gasstrom, der nun durch die Oxidation des in dem Gasstrom enthaltenen Kohlenmonoxids gebildetes Kohlendioxid enthält, wird über das Auslaßrohr 35 durch eine geeignete Kohlendioxidnachweisvorrichtung geführt, die unter der Bezugsζiffer 38 schematisch dargestellt ist. Gegebenenfalls kann man zwischen der Umwandlungsvorrichtung 39 und der Kohlendioxidnachweisvorrichtung einen Gaschromatographen 37 anordnen. Der Gaschromato-

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graph dient zu dem Nachweis, ob noch Kohlenmonoxid in dem Gasstrom enthalten ist.

Zur quantitativen Bestimmung der Umwandlung kann man als Kohlendioxidnachweiseinrichtung ein Wägeröhrchen verwenden, das irgendeines der üblichen Mittel zur Absorption von Kohlendioxid enthält, beispielsweise Calciumoxid. Alternativ kann man den die Absorptions-Umwandlungs-Vorrichtung 39 verlassenden Gasstrom in Kalkwasser einführen, um sichtbares Calciumcarbonat zu bilden. Wenn der zu analysierende Gasstrom anfänglich kein Kohlendioxid enthält, kann man den Strom über die Zuführungsleitung 41 und den Dreiwegehahn 42 in den Kolben 39 einführen.

Es wurde bereits erwähnt, daß ein Vorteil darin besteht, ein Häm-polypeptid, wie Hämoglobin, mit Kohlenstoffmonoxidase zu kombinieren, um Kohlenmonoxid und Sauerstoff in engerem Kontakt mit der Kohlenstoffmonoxxdase zu halten, und dies während einer längeren Zeitdauer, als es sonst der Fall wäre. Dies kann auch in anderer Weise erreicht werden. Untersuchungen haben gezeigt, daß ein Raucher normalerweise pro Zug etwa 30 ml Tabakrauch inhaliert, und daß die Pausen zwischen den Zügen mehrere Sekunden betragen. Das gleiche trifft auf Zigarrenraucher und Pfeifenraucher zu. Um die Zeit zu erhöhen, während der der Tabakrauch mit der Kohlenstoffmonoxxdase in Kontakt steht, kann man eine Filterfüllung 24 verwenden, die ein Gesamtvolumen aufweist, das mindestens gleich dem Volumen eines normalen Raucherzugs ist, d. h. mindestens 30 ml beträgt. Als Ergebnis wird bei jedem Zug an der Zigarette ein Gasvolumen angesaugt, das während' der Zeitdauer, die zwischen den Zügen vergeht, mit der Filterfüllung 24 in Kontakt gestanden hat. Gleichzeitig wird ein neues diesem Zug entsprechendes Volumen Tabakrauch in die Filterfüllung 24 eingebracht und verbleibt dort während der Zeitdauer, die zwischen den Zügen verstreicht. Somit kann durch Vergrößerung der Filterfüllung auf mindestens das Volumen, das einem normalem Raucherzug entspricht, die Kontaktzeit des Kohlenmonoxids und des Sauerstoffs mit dem Enzym in starkem Maße erhöht werden, so daß eine annähernd quantitative

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Umwandlung des Kohlenmonoxids zu den Endprodukten der Reaktion erleichtert wird. Natürlich muß die Filterfüllung nicht die Form aufweisen, die in der Fig. 2 dargestellt ist. Beispielsweise kann die Absorptions-Umwandlungs-Einrichtung 11 derart geformt sein, daß die Gasblasen langsam durch die Kohlenstoffmonoxidaselösung nach oben wandern, wobei die Durchlaufzeit durch die Kohlenstoffmonoxidase verlängert wird, um die Dauer des Kontakts des Gases mit der Kohlenstoffmonoxidase zu erhöhen und damit die vollständige Umwandlung zu begünstigen. Wenn das durch die Lösung geführte Gasvolumen gleich ist dem Volumen eines normalen Raucherzugs, dann ist die Wirkung genau die gleiche, wie sie mit der Filterpatrone der Fig. 2 erreicht wird.

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Claims

Patentansprüche

1. Filter zur Umwandlung und zum Nachweis von Kohlenmonoxid in Gasströmen, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Zubereitung enthält, die das Enzym Kohlenstoffmonoxidase (CMase) und einen Träger oder ein Lösungsmittel für dieses Enzym umfaßt.

2. Filter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Kohlenstoffmonoxidase ein Produkt enthält, das aus tierischem Gewebe, einem Bacterium oder einer Pflanze gewonnen ist, wobei der Ausdruck "Pflanze" auch Algen und Pilze einschließt.

3. Filter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung ein mit Kohlenstoffmonoxidase vermischtes Häm-polypeptid enthält.

4. Filter nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß es als Häm-polypeptid Eisen(II)-hämoglobin oder Mikroperoxidase enthält.

5. Filter nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung zusätzlich ein Reduktionsmittel enthält, daß die Umwandlung von Eisen(II)-hämoglobin zu Methämoglobin in Gegenwart von Sauerstoff verhindert.

6. Filter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung in Form einer Lösung vorliegt.

7. Filter nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß"die Zubereitung ein Reduktionsmittel, das die Umwandlung von Eisen(II)-hämoglobin zu Methämoglobin in Gegenwart von Sauerstoff verhindert und einen Puffer enthält, der den pH-Wert der Lösung zwischen etwa 6,0 und 8,5 hält.

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8. Filter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Teil eines Tabakprodukts ist.

9. Filter nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Volumen des Filters mindestens gleich ist dem Volumen eines normalen Raucherzugs.

10. Filter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Filter eine zerbrechliche oder zerreißbare Einrichtung zum Schutz der Zubereitung vor der Verwendung des Filters umfaßt.

11. Filter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Filter ein festes Medium enthält, das aus der Gruppe Sepharose, Sephadex (Polysaccharide), Anionenaustauscherharze, Kationenaustauscherharze, pulverförmige Cellulose, faserförmige Cellulose, Carbo-resin (Carbacrylaminharz) und mikrogranuläre Cellulose ausgewählt ist.

12. Filter zur Beseitigung von Kohlenmonoxid aus der Umgebungsatmosphäre, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kombination aus einem Trägermaterial und Mikroperoxidase enthält.

13. Zubereitung zum Nachweis und zur Umwandlung von Kohlenmonoxid, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine wirksame Menge des Enzyms Kohlenstoffmonoxidase (CMase) und ein Trägermaterial umfaßt.

14. Zubereitung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Kohlenstoffmonoxidase ein Produkt enthält, das aus tierischem Gewebe, einem Bakterium oder einer Pflanze gewonnen ist, wobei der Ausdruck "Pflanze" auch Algen und Pilze einschließt.

15. Zubereitung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung zusätzlich ein mit der Kohlenstoffmonoxidase

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vermischtes Häm-polypeptid enthält.

16. Zubereitung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Häm-polypeptid Mikroperoxidase oder Eisen(II)-hämoglobin enthält.

17. Zubereitung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie zusätzlich ein Reduktionsmittel enthält, das in Gegenwart von Sauerstoff die Umwandlung von Eisen(II)-hämoglobin zu Methämoglobin verhindert.

18. Zubereitung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Form einer Lösung vorliegt.

19. Zubereitung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Reduktionsmittel, das in Gegenwart von Sauerstoff die Umwandlung von Eisen(II)-hämoglobin zu Methämoglobin verhindert und einen Puffer enthält, der den pH-Wert der Lösung zwischen etwa 6,0 und 8,5 hält.

20. Verfahren zur Herstellung und zur Reinigung des Enzyms Kohlenstoffmonoxidase (CMase), dadurch gekennzeichnet, daß man ein Material aus der tierische Gewebe, Kohlenstoff monoxidase bildende Bakterien und Kohlenstoffmonoxidase bildende Pflanzen, wobei der Ausdruck "Pflanzen" auch Algen und Pilze einschließt, umfassenden Gruppe auswählt, das Material in Wasser suspendiert, das Material fragmentiert, das fragmentierte oder zerkleinerte Material in eine lösliche und eine unlösliche Fraktion auftrennt, bestimmt, ob die Kohlenstoffmonoxidase in der löslichen Fraktion oder in der unlöslichen Fraktion enthalten ist, und die Kohlenstoffmonoxidase aus der sie enthaltenden Fraktion isoliert.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterien einen Vertreter der Gruppe Methanosarcina barkerii, Methanobacterium formicium, Bacillus

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oligocarbophillus (Hydrogenomonas carboxydovorans) und Desulfovibrio desulfuricans verwendet.

22. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kohlenstoffmonoxxdase durch Äthanol-Fraktionierung unter Steuerung der Ionenzusammensetzung, der Temperatur, des pH-Wertes, der Äthanol- und der Protein-Konzentration; durch Ausfällung mit Schwermetallen; und durch chromatographische Trennungsverfahren isoliert.

23. Verfahren nach Anspruch 20 _r dadurch gekennzeichnet, daß man das Bakterium in einer Atmosphäre züchtet und vermehrt, die eine Kohlenmonoxidkonzentration aufweist, die größer ist als die normalerweise in der Luft vorhandene.

24. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bakterien Hydrogenomonas carboxydovorans züchtet und die Kultur dadurch bildet, daß man 100 ml eines Mediums, das etwa 0,2 % KNO₃, 0,1 % K₃HPO₄ und 0,01 % MgSO₄-VH₃O enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, mit 1 g Abwasserschlamm animpft.

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