DE69828618T2

DE69828618T2 - Transkriptions-silencer protein nrf, diese kodierende nukleinsäure und deren verwendung

Info

Publication number: DE69828618T2
Application number: DE69828618T
Authority: DE
Inventors: Hansjörg HAUSER; Mahtab Nourbakhsh
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-07-24
Filing date: 1998-07-24
Publication date: 2006-04-27
Anticipated expiration: 2018-07-25
Also published as: JP2003521214A; WO1999005269A8; US20030125286A1; WO1999005269A3; WO1999005269A2; ATE286977T1; DE69828618D1; EP1002082A2; EP0894853A1; EP1002082B1

Description

Die Erfindung betrifft einen neuen inhibitorisch wirkenden Transkriptionsfaktor, das transkriptionelle Silencer-Protein NRF und einige damit in Verbindung stehende Dinge. Im Folgenden wird der wissenschaftliche Hintergrund der Erfindung dargestellt.
NFκB/rel Protein
Die Familie der NFκB/rel Transkriptionsfaktoren regulieren eine Vielzahl von Promotoren durch Bindung an spezifische DNA-Sequenzen. Die NFκB/rel Sequenzen fungieren als konstitutive Enhancer (Verstärker). Allerdings gibt es viele Promotoren, die, obgleich sie NFκB/rel bindende Sequenzen enthalten, keine basale Aktivität zeigen. Dies wird durch die Existenz von sogenannten Silencer Elementen erklärt. Zusätzlich zu der konstitutiven Enhancer-Aktivität der NFκB-bindenden Sequenzen gibt es viele Induktoren wie z.B. Viren, TNFα oder PMA, die durch Auslösung einer Signalkaskade die Aktivität der NFκB Enhancer Aktivität zeitweise verstärken. Diese Induktoren führen zu einer vorübergehenden Inaktivierung von IκB, dem zytosplasmatischen Inhibitor einiger NFκB Familienmitglieder. Dies führt zur nukleären Translokation des Prototyp NFκB, einen Heterodimer aus p50 und p65, und der Aktivierung der erwähnten Zielgene durch DNA-Bindung und Transkriptionsaktivierung.
Die Familie der nukleären NFκB/rel Familienmitglieder ist an der Regulation vieler Gene beteiligt, welche zu physiologischen Aktivitäten wie z. B. Entzündungen und Zellwachstum beitragen. Pathologische Entzündungsreaktionen und Krebs sind oft mit der Dysregulation dieser Gene assoziiert, woraus sich schließen lässt, dass die Auslösung einer Reihe von pathologischen Prozessen durch NFκB/rel vermittelte Transaktivierung zustande kommt. Deshalb könnten Inhibitoren der NFκB Aktivierung ein breites Anwendungsspektrum von neuen therapeutischen Ansätzen bei menschlichen Krankheiten besitzen. Natürliche Repressionsmechanismen spielen vermutlich eine wichtige Rolle in der Kontrolle der Dysregulation von NFκB/rel Aktivitäten.
Das negativ regulatorische Element (NRE) des Interferon β Promotors
Ein Beispiel für den o.g. Repressionsmechanismus wurde bei der Kontrolle des Interferon-β Gens von einigen Säugern gefunden. Die Interferon-β (IFNβ) Gene sind absolut still, können aber durch transkriptionelle Aktivierung in fast allen differenzierten Zelltypen durch Viren oder doppelsträngige RNA induziert werden.
In den Promotoren der IFNβ Gene sind einige positiv regulatorische Domänen (PRDs) innerhalb weniger hundert Basenpaare angeordnet. Die PRD II, welche als Bindungsstelle für NFκB/rel Proteine fungiert und PRD I, an welche Mitglieder der IRF-Familie binden können, sind verantwortlich für die basale Expression dieses Promotors (1, 9, 14, 18, 38). Für die vollständige Aktivierung des IFNβ Promotors sind jedoch weitere PRD Sequenzen notwendig.
Es wurde das kleinstmögliche „viral response element" (VRE) im IFNβ-Promotor identifiziert. Essentiell dafür sind PRDI, PRDII und eine ausgedehnte negativ regulatorische Domäne (NRD). Diese NRD wurde als Repressionssequenz für die basale Transkriptionsaktivität in Abwesenheit von Induktoren beschrieben (10, 11). Innerhalb dieses NRD fungiert ein 11-Basenpaar Element als negativ regulatorisches Element (NRE) auf die PRDII Sequenz. Obwohl das NRE physikalisch mit PRD II überlappt, kann es auch positionsunabhängig als Silencer auf PRDII wirken (24).
NRE Sequenzen in anderen Promotoren
Eine Untersuchung von Promotoren, die sowohl NFκB bindende DNA-Sequenzen als auch NRE-ähnlichen Motive und Funktionen besitzen, zeigte, dass es mehrere solcher Sequenzen mit Ähnlichkeit zum IFNβ NRE gibt.
Im HIV-1 Promotor wurden zwei Sequenzen mit Homologie zum IFNβ NRE in einer Region, die funktionell als negativ regulierende Region für die HIV-1 Transkription definiert wurde, gefunden (3,22). Saksela und Baltimore (1993) haben ein negativ wirkendes Element (κNE genannt) unmittelbar stromaufwärts der NFκB-Bindungsstelle in IGκ Intron Enhancer gefunden. Das Zentrum dieser 27 Basenpaare langen κNE Sequenz zeigt hohe Homologie zum IFNβ NRE. Auch in der α Kette des IL2 Rezeptor Promotors wurde ein negativ regulatorisches Element gefunden, welches Sequenzhomologie zum IFNβ NRE aufweist (33). Eine homologe Sequenz zum IFNβ NRE im HTLV-I Promotor wurde ebenfalls gefunden. Die Region, in welcher diese Sequenz lokalisiert ist, kooperiert positiv mit dem 21 Basenpaar Enhancer nach Aktivierung durch das Tax Protein (2,34). Die Induzierbarkeit dieser Promotoren wird durch die NFκB/rel DNA Bindungssequenzen vermittelt Die NRE-ähnlichen Sequenzen, welche in den Promotoren von HIV I, HTLV I und den IL2 Rezeptor α Genen gefunden wurden, sind funktionell als Silencer-Elemente charakterisiert, welche die konstitutive Enhancer Aktivität ihrer NFκB/rel Bindungssequenzen inhibieren. Daraus wurde geschlossen, dass die NRE Sequenzen eine neue Klasse von transkriptionalen Repressersequenzen mit einer Silencer-Aktivität auf die konstitutive Aktivität von NFκB/rel Bindungssequenzen darstellen sind.
Alle NRE Sequenzen zeigen ähnliche Eigenschaften hinsichtlich der Bindung von Proteinen aus nukleären Extrakten. Allerdings sind die Affinitäten bei der Bindung dieser Proteine unterschiedlich. Die Affinitäten reflektieren die Silencer Kapazität der NRE Sequenzen. Der NRE-vermittelte Silencing-Effekt wird durch Enhancerspezifische Induktoren wie Viren, TAX oder PMA aufgehoben. Abgesehen von ihrer Homologie zeigen die Silencer von HIV I und im IFNβ Promotor signifikante Unterschiede. Diese Unterschiede basieren auf der Sequenzspezifität der NFκB/rel Bindungssequenzen, nicht aber auf den Sequenzen der NRE Sequenz.
Gemeinsame Eigenschaften von NRE Sequenzen
Die gemeinsamen Eigenschaften der bisher bekannten 5 NRE Sequenzen sind: Sequenzhomologie, eine Größe von 11 bis 13 Basenpaaren, distanz- und positionsunabhängige Wirkung, spezifische Interaktion mit NFκB/rel Bindungssequenzen und nicht unterscheidbare Bindungsmuster von nukleären Faktoren. Es wird erwartet, dass eine große Anzahl weiterer NRE-Sequenzen in Genen existiert. So zeigen Sequenzvergleiche, NRE-homologe Sequenzen in den Promotoren der Adhäsionsmoleküle ELAM-1 und NCAM-1. Ein negativ wirkendes Element (als κNE bezeichnet) mit Homologie zur zentralen NRE-Sequenz liegt unmittelbar stromaufwärts von der NFκB Bindungssequnz im intronischen Igκ Enhancer (27).
Sequenzspezifität der NRF-Bindungsfunktion
Die NRE Sequenzen wirken nicht auf die basale Transkriptionsmaschinerie (24). Bisher wurde ausschließlich eine Silencer-Wirkung in der NRE Sequenz auf NFκB/rel Enhancer beschrieben. Allerdings kann nicht ausgeschlossen werden, dass andere Sequenzen ebenfalls von NRE-Sequenzen in ihrer Aktivität beeinflusst werden. Dies wird unterstützt durch die Identifizierung eines Silencers aus dem Gastrin-Promotor (39), welcher hohe Homologie zu den beschriebenen NRE Sequenzen zeigt. Der Gastrin-Promotor enthält keine bekannte NFκB/rel-verwandte Sequenz, was vermuten lässt, dass ein anderer Enhancer von dem Silencer des Gastrin-Promotors interagieren beeinflusst wird (37).
Proteinbindung an NRE Sequenzen
Sowohl die Sequenzhomologie wie auch die funktionelle Homologie der bisher bekannten NRE Sequenzen suggerieren, dass Faktoren, die an diese NRE Sequenzen binden, distinkt oder identisch sind.
In Gelretardierungsuntersuchungen (EMSA) wird das IFNβ NRE (M) so retardiert, dass es zwei Hauptkomplexe bildet, wobei der schneller wandernde Komplex eine höhere Affinität als der langsamer migrierende Komplex aufweist (24). Alle funktionelle NRE-Sequenzen werden auf dieselbe Weise retardiert, nämlich, indem sie diese beiden Komplexe bilden. Diese Fähigkeit, nicht unterscheidbare Komplexe zu bilden, lässt darauf schließen, dass die Faktoren, die an diese Oligonukleotide binden, identisch sind. Dies wurde durch Kreuzkompetitionsexperimente bestätigt. Alle NRE Sequenzen kompetieren mit den anderen in derselben Art und Weise wie mit sich selbst. Allerdings zeigen die Kompetitionsdaten auch, dass die Affinität der verschiedenen Komplexe unterschiedlich ist. Die höchste Affinität zeigt das IFNβ NRE gefolgt vom NRE des IL2 Rezeptor α. Die NRE-Sequenzen vom HIVI und von HTLV-1 zeigen eine niedrigere Affinität. Die Affinitäten der NRE-Sequenzen an nukleäre Proteine reflektieren grob ihre Silencer-Kapazität auf die entsprechenden NFκB/rel Enhancer.
UV-Vernetzungsexperimente lassen darauf schließen, dass die Proteine Molekulargewichte von etwa 100 kDa haben (24). Die derzeit publizierten Experimente erlauben aber nicht, die Anzahl der Faktoren zu bestimmen, welche bei diesen NRE-spezifischen Silencer Funktionen beteiligt sind.
Bekannte NFκB Repressoren
Kürzlich wurde ein nukleärer NFκB/rel-Inhibitor beschrieben. Diese Faktor inhibiert die DNA-Bindung, des p50/p65 Heterodimers in Adenovirus transformierten Zellen (21). Offensichtlich wirkt dieser Repressor durch Unterdrückung der induzierten NFκB-Enhancers-Aktivierung und ist insofern von den Faktoren zu unterscheiden, welche die konstitutive Aktivität von den NFκB Enhancer Aktivitäten blockieren.
In Experimenten mit Drosophila wurde ein 43 kDa HMG1 Protein mit dem Namen DSP-1 (dorsal switch protein) beschrieben. Dieses Protein inhibiert den „dorsal" Enhancer durch Bindung an eine proximal lokalisierte Sequenz (17). Weiterhin wurde gezeigt, dass DSP-1 die NFκB/rel vermittelte Enhancer-Wirkung in Mammalierzellen reprimieren kann. Ein humanes Homolog zu DSP-1, das die IFNβ spezifische Silencer Wirkung ausübt, wurde bisher nicht beschrieben.
Der Transaktivator Tax vom HTLV-1 Virus ist in der Lage, die von NRE inhibierte Aktivität vom HIV-I NFκB Enhancer wiederherzustellen. Analog dazu beschrieben Salvetti et al. (29) die Repression einer NFκB-bindenden Stelle im humanen Vimentin Promotor durch ein negativ wirkendes Element, deren Wirkung wiederum durch Tax aufgehoben wird. Tax aktiviert verschiedene Promotoren durch die nukleare Translokation des zytoplasmatischen NFκB/rel Dimers und der de novo-Synthese von c-rel (16). Es wurde gezeigt, dass Tax die nukleäre Translokation von NFκB/rel Proteinen, welche normalerweise durch Interaktion mit p105 oder p100 im Zytoplasma zurückgehalten werden, induziert (19, 23). Die Induktion der NFκB/rel Enhancer-Aktivität durch das Tax Protein könnte also in einer Maskierung des inhibitorischen Effekts liegen, welche durch NRE Sequenzen hervorgerufen werden. Die Tatsache, dass sowohl der IFNβ Promotor wie auch HTLV-1 NFκB-Enhancer nach Tax Expression die NRE Wirkung nicht aufheben können, wird auf verschiedene Enhancer zurückgeführt. Solche Unterschiede in der Bindung und Transaktivierung von bekannten NFκB/rel Dimeren sind gut dokumentiert (20).
Aufhebung der Repression
Die reprimierende Wirkung der IFNβ NRE Sequenz auf PRDII kann durch virale Infektion nicht eliminiert werden, obwohl dies zu einer Induktion der NFκB-Bindungsaktivität führt (24). Die induzierbare Derepression von PRDII hängt von der Interaktion mit PRDI, einer Bindungsstelle für IRF Proteine ab. Eine analog dazu durch Viren induzierte Aktivität der NFκB/rel-Sequenz ist nicht ausreichend, den HTLV Enhancer zu aktivieren. Abhängig vom NFκB-Enhancer Element und dem Induktor wird für die Derepression von Promotoren ein zusätzlicher Aktivator benötigt. Die konzertierte Aktivität von Koaktivatoren oder die Induktion eines bestimmten Sets von NFκB/rel-Bindungsproteinen sind ausreichend für die Aufhebung der Repression.
Die Virusinduktion hat keinen Einfluss auf die negative Aktivität der NRE-Sequenz auf isolierte PRDII Sequenzen. Ein 28 Basenpaar-Fragment, das PRDII und NRE enthält, funktioniert als minimales VRE, was den kooperativen Effekt von PRDI und PRD II der für die Aufhebung der NRE-Funktion nach Virusinfektion notwendig ist, beweist. Diese Eigenschaften zusammen mit den Gelretardierungsuntersuchungen und den DNA-Vernetzungsdaten zeigen, dass die Proteine, welche für die Silencing-Effekte verantwortlich sind, weiterhin an die NRE-Sequenzen gebunden bleiben, auch wenn die transkriptionale Induktion, z.B. durch Virusinduktion, erfolgt. Erklärungen für die Silencer-Wirkung der NRE Bindungsfaktoren beinhalten die Maskierung von NFκB/rel-Aktivatoren oder einen Verschluss des transkriptionalen Komplexes für die NFκB/rel-Aktivierung. Andere Überlegungen beinhalten den Ersatz, die posttranskriptionale oder die sterische Veränderungen von Faktoren, welche an die PRDs gebunden sind. Sie könnten verantwortlich für die Eliminierung der negativen Aktivität des Silencer Proteins sein (24).
Unabhängig vom Aktivierungsmechanismus ist festzustellen, dass NFκB-Sequenzen eine basale konstitutive Aktivität zeigen. Vermutlich ist diese Hintergrundaktivität auf die Bindung von NFκB/rel-Proteinen zurückzuführen, welche der zytoplasmatischen Rückhaltung durch IκB entkommen. Allerdings ist diese basale Aktivität in einer Anzahl von NFκB-Promotoren, zu denen die des IFNβ, und des IL-2 Rezeptors der α-Kette gehören, reprimiert.
Entsprechend einer Ausführungsform bezieht sich die Erfindung auf ssDNA (einzelstängige DNA)

a) mit der Sequenz entsprechend 1B oder
b) mit der Sequenz entsprechend 1B, worin
i) zwischen den Positionen 984 und 1077 und
ii) zwischen den Positionen 1897 und 1979 die Nukleotide von 1B ersetzt sind durch jene aus der 2. Reihe unter der Sequenz, oder
c1) welche dieselbe Anzahl von Nukleotiden wie die ssDNA entsprechend a) oder
c2) welche eine reduzierte Anzahl von Nukleotiden entsprechend der ssDNA entsprechend a) haben, worin die ssDNA entsprechend c1 und c2 hybridisierbar zu der von a) und/oder b) ist.

Eine ssDNA entsprechend der Erfindung beinhaltet auch die Nukleotidregion

i) zwischen Position 654 und 1817 oder
ii) zwischen Position 1518 und 1817 (DNA Bindungsdomäne = DBD) oder iii) zwischen den Positionen 654–1526 (Silencer Domäne) oder
iv) zwischen Position 1 und 653 entsprechend 1B, oder ssDNA
v-i) mit derselben oder einer reduzierten Anzahl von Nukleotiden verglichen mit der ssDNA entsprechend i) oder
v-ii) mit derselben oder einer reduzierten Anzahl von Nukleotiden verglichen mit der ssDNA entsprechend (ii) oder
v-iii) mit derselben oder einer reduzierten Anzahl von Nukleotiden im Vergleich zur ssDNA entsprechend (iii) oder
v-iv) mit derselben oder einer reduzierten Anzahl von Nukleotiden im Vergleich zur ssDNA entsprechend (iv)

Für die ssDNA entsprechend (iv) oder (v-iv) oder einer dsDNA oder einer RNA, die dazu homolog ist, wird der Hintergrund im Folgenden dargestellt: Die NRF mRNA hat eine außerordentlich lange 5' nicht translatierte Region von 654 Nukleotiden, welche verschiedene offene Leseraster enthält. Grundsätzlich sind alle mRNAs mit ungewöhnlich langen Leader-Sequenzen und und mehrfach vorkommenden Leserastern in diesem Bereich gute Kandidaten für sog. IRES Elemente (internal ribosomal entry sites), Elemente, bei denen die Translation in einer cap-unabhängigen Ribosomenbindung funktioniert (Sachs et al., 1997). Dieses cap-unabhängige interne Initiationsmodell wurde ursprünglich für picarnovirale mRNA entwickelt. Die IRES Elemente wurden erfolgreich von ihrer viralen Umgebung herausgenommen und an fremde Gene gekoppelt, um polycistronische mRNAs zu produzieren. In der Zwischenzeit wurden auch einige zelluläre mRNAs gefunden, die solche IRES Elemente enthalten. Soweit dies bisher beschrieben ist, führen zelluläre IRES Elemente zu niedrig effizienter interner Translationsinitiation. Grundsätzlich ist die Translationsinitiation von IRES Elementen gleich oder schwächer, wenn sie mit der cap-abhängigen Translation verglichen wird.
Eine andere „Ausführungsform" der Erfindung betrifft eine ssDNA, die dadurch charakterisiert ist, dass sie komplementär zu der zuvor beschriebenen ssDNA ist.
Die Bedingungen für diese Hybridisierung mit der ssDNA entsprechend (c1), (c2) oder (iv) sind wie zuvor definiert, zum Beispiel bei einer Temperatur von mindestens 25°C und einer 1 molaren Natriumchlorid-Konzentration.
Entsprechend einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung die dsDNA (doppelsträngige DNA), welche der oben beschriebenen ssDNA und ihrem komplementären Strang entspricht.
Entsprechend einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung eine RNA

a) mit einer Sequenz, welche zu einer DNA, wie oben beschrieben, korrespondiert oder
b) mit einer Sequenz, wie sie zu der unter a) beschriebenen RNA korrespondiert, aber in antisense oder
c) einem Abbauprodukt einer RNA entsprechend a) oder b), wobei der Abbau in bekannter Weise erfolgt.

Entsprechend einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung einen Vektor, der eine dsDNA, wie beschrieben, enthält. Der Vektor kann enthalten

i) eine dsDNA, welche aus einer ssDNA, wie beschrieben in den Paragraphen i), ii) und iii) und einem komplementären Strang enthält oder
ii) einer ssDNA entsprechend der Paragraphen i), ii) und iii) und einem komplementären Strang, welche dieselben Aminosäuren wie die dsDNA entsprechend i) kodieren, aber im Vektor in antisense Richtung enthalten sind.

Entsprechend der Erfindung kann ein Vektor für die Transformation von Zellen und Organismen benutzt werden, wobei sowohl eine vorübergehende als auch eine permanente Expression des Proteins durch die dsDNA des Vektors erfolgt.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Protein, welches durch ssDNA oder durch eine dsDNA, wie oben beschrieben kodiert wird, aber beliebig mit einem anderen funktionalen Protein oder einer oder mehrerer funktionaler Fragmente davon fusioniert ist. Entsprechend der Erfindung können die funktionalen Fragmente, die an das Protein fusioniert werden, auch in die Proteinsequenz an beliebiger Stelle eingeschoben sein. Natürlich kann das Protein entsprechend der Erfindung auch ein nicht fusioniertes Protein sein.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Protein (dominante negative Mutante), welche zu erhalten ist durch

a) Mutation der ssDNA Sequenz entsprechend der Erfindung in bekannter Weise,
b) Expression der mutierten ssDNA Sequenzen in bekannter Weise,
c) Verwendung des Expressionsprodukts (der Expressionsprodukte) in einem Kompetitionstest für die Inhibition der Transkription für ein Protein, welches durch die nicht modifizierte ssDNA kodiert und
d) Isolierung eines Proteins, welches als dominante negative Mutante auf das durch nicht modifizierte ssDNA kodierende Protein wirkt.

Bereits zu einem früheren Zeitpunkt wurde ein Protein postuliert, welches den humanen IFNβ Promotor inhibiert oder reprimiert. Dennoch sind die Eigenschaften von NRF und die Konsequenzen, die sie durch die Überexpression seiner RNA in sense oder antisense auslösen, unerwartet, weil

– eine Kreuzvernetzungsanalyse nicht eins, sondern mindestens zwei Proteine von etwa 100 kDa Molekulargewicht zeigten und
– NRF keine Homologie zum DSP-1 Protein, welches als das Drosophila homologe zum Interferon-β Suppressor beschrieben wurde (17) hat.

Entsprechend der Erfindung hat das Protein, welches durch ein humanes Gen kodiert ist, die folgenden Eigenschaften:

– Es bindet spezifisch DNA-Sequenzen, die mit dem NRE Motiv identisch oder verwandt sind. Die NRE Sequenzen werden in verschiedenen Promotoren von humanen Genen gefunden.
– Es beeinflusst die Transkription verschiedener zellulärer und viraler Gene, zum Beispiel reprimiert es die Hintergrundaktivität von NF-κB/rel-bindenden Enhancer-Elementen. Durch diese Eigenschaften reprimiert es konstitutiv die Aktivität einer Vielzahl von zellulären Genen.
– Die Inaktivierung der endogenen NRF Expression führt zur Induktion von zellulären Genen, wie zum Beispiel des IFNβ Gens.

NRF kann als Modulator von Proteinen der NF-κB Familie betrachtet werden. Diese Familie kontrolliert Gene mit signifikanter biomedizinischer Bedeutung, zum Beispiel solche, die für inflammatorische Zytokine, MHC-Proteine, Zelladhäsionsproteine und Viren kodieren. Deshalb wird NRF als molekulares Zielprotein als Basis für die Entwicklung neuer anti-inflammatorischer Therapien für eine Vielzahl von pathologischen Zuständen, wie z.B. Ischemie, hämorragischer und antiseptischer Schock, Abstoßung von Transplantaten, bakterielle Meningitis, akute Luftwegsentzündungen und Lungenkomplikationen, welche durch Bypässe hervorgerufen werden. Weiterhin gilt dies für bestimmte Tumore und andere Krankheiten.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung von

i) einer ssDNA entsprechend der Erfindung
ii) einer dsDNA entsprechend der Erfindung oder
iii) einem Vektor entsprechend der Erfindung oder
iv) einem Protein entsprechend der Erfindung oder
a) für die Identifizierung und Entwicklung von Agonisten und Antagonisten von NRF-Funktionen,
b) für die Entwicklung von verbesserten Antisense-NRF und Ribozymen,
c) für die Entdeckung und Diagnose von vorübergehenden oder chronischen Krankheiten, die durch NF-κB/rel und/oder NRF regulierte physiologische Muster in Tieren und Menschen oder
d) für die Entwicklung von Therapeutika und die Behandlung von Krankheiten, insbesondere von rheumathoider Arthritis, Entzündungen, Infektionskrankheiten, Tumore und/oder genetischen Krankheiten oder
e) für die Gentherapie in Tieren und Menschen.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verwendung einer RNA entsprechend der Erfindung, welche eine Sequenz besitzt, die zu der DNA entsprechend iv) oder v-iv), wie oben angegeben, korrespondiert.
Es betrifft die Verwendung als IRES Element in einem polyzistronischen Expressionsvektor für die Verwendung in eukariontischen Zellen oder einem transgenen, nicht humanen Tier.
Die erwähnte Sequenz kann als translationaler Enhancer in monocistronischen oder polycistronischen Expressionsvektoren für die Verwendung in eukaryontischen Zellen oder transgenen Tieren verwendet werden.
Die nachfolgenden 1–9(Figuren) und die nachfolgenden Beispiele erklären die Erfindung im Detail.
Beispiel 1
1. Klonierung des humanen und murinen "NRE binding factor" (Negative Regulatory Factor):

A) Die Methode beruht auf der Expression einer humanen cDNA Bank aus HeLa Zellen in Bakteriophagen lambda gt11. Fusionsproteine, die auf Nitrozellulose Filter (NC) absobiert sind, werden identifiziert mithilfe radioaktiv markierter doppelstrangiger NRE-Sequenz (vgl. Nourbakhsh et al. In EMBO J., 12 (1993) 451–459. Spezifische NRE-bindende Signale auf den Filtern, die zu Bakteriophagen-Plaques korrespondieren, wurden isoliert. Spezifische DNA-bindende Signale wurden auf Duplikaten von Filtern nachgewiesen, die entweder mit der NRE-Sequenz oder einer Mutante der NRE-Sequenz reproduziert wurden. Es wurde ein cDNA Klon gefunden, der für ein 44 kDa Protein kodiert, welches mit hoher Spezifität an die NRE-Sequenz bindet. Mit den rekombinanten Bakteriophagen wurden Bakterienzellen in einer definierten Menge auf Duplikate von Filtern gebracht und mit markierter DNA, wie angegeben, hybridisiert. Ein Röntgenbild wurde über Nacht auf die Filter exponiert, um autoradiographische Bilder zu produzieren (1A).
B) Die humane NRF cDNA wurde als Hybridisierungsprobe genutzt, um eine Mausembryo cDNA-Bank (Tag 11) bei reduzierter Stringenz auf homologe Sequenzen zu untersuchen. Die somit identifizierten Klone wurden isoliert, charakterisiert und sequenziert. 1B zeigt den Sequenzvergleich von menschlicher (mittlere Zeile) und muriner (unten liegende Zeile) NRF cDNA. Die proteinkodierende Sequenz der humanen NRF cDNA ist in der oberen Zeile gezeigt.

2. Struktur des humanen negative regulatory factor (NRF):
Zwei mRNAs mit verschiedenen 3' nichttranslatierten Regionen wurden identifiziert, wobei beide für NRF in menschlichen Zellen kodieren. Die Größe der NRF mRNAs ist 2,8 und 3,8 kb (3 und 4). Die kodierende Region der mRNA ist durch einen offenen Balken in 2 dargestellt. In derselben Fig. ist die Proteinsequenz des 388 Aminosäuren großen NRF durch einen dunklen Balken dargestellt. Die Silencer-Domäne von NRF, welche den ersten 291 Aminosäuren zugeordnet ist, enthält zwei verschiedene Zinkfinger, welche durch ovale Fladen dargestellt sind. Die DNA-Bindungsdomäne von NRF (DBD) liegt innerhalb von 100 Aminosäuren am C-terminalen Ende und enthält ein „helix-loop-helix" Motiv (2).
3. NRF ist konstitutiv exprimiert:
Die Expressionshöhe von NRF mRNA wurde durch Northern Blot Analyse unter Verwendung von poly(A)RNA aus HeLa Zellen verwendet. In 3 sind zwei verschiedene mRNAs, welche beide zu NRF korrespondieren, angegeben (oberer Bildteil). Beide mRNAs sind konstitutiv exprimiert und ihre Expressionshöhe ist nicht durch die Behandlung der Zellen mit Newcastle Disease Virus verändert. Interferon-β mRNA (mittlerer Pfeil) zeigt eine typische Induktion der Zellen durch das Virus. Die Aktiv mRNA, welche durch Rehybndisierung kenntlich gemacht wurde (unterer Pfeil) zeigt an, dass gleiche Mengen von RNA in jeder Bahn aufgetragen wurden.
4. NRF ist ubiquitär exprimiert:
Die Expressionshöhe von NRF in verschiedenen menschlichen Geweben wurde ebenfalls durch Northern Blot Analyse bestimmt. Zwei verschiedene mRNAs, welche beide mit NRF korrespondieren, sind in der oberen Bildhälfte zu sehen. Dass jeweils gleiche RNA Mengen in jeder Bahn aufgetragen wurden, zeigt die Hybridisierung mit Aktiv mRNA (untere Bildhälfte; 4).
5. NRF bindet an NRE regulierte Promotoren in vivo:
Die DNA Bindungsaktivität von NRF in vivo wurde folgendermaßen getestet: Plasmidkonstruke, die entweder NRF oder ein chimäres Protein, welches aus dem vollständigen NRF und VP16, der aktivierenden Domäne des Herpes simplex Virus VP16, bestehen, wurden eingesetzt. Die Expression dieser (chimären) Proteine wurde in murinen Zellen, welche verschiedene Reporterkonstrukte, wie sie durch Balken auf der linken Seite von 5 dargestellt sind, enthalten. Die relativen Reporteraktivitäten sind durch schwarze Balken auf der rechten Seite von 5 angegeben. Die Daten zeigen, dass w.t. NRF die Expression vom NRE Promoter nicht verändert, wohl aber das synthetische Fusionsprotein NRF-VP16 als transkriptioneller Aktivator auf diesem Reporter fungiert. Die Represseraktivität von NRF ist in diesem Test nicht nachweisbar, da der Reporter keine NF-κB/rel Bindungsstelle enthält. Das Fusionssprotein beeinflusst keine Promotoren, die keine NRE Erkennungsstelle besitzen.
6. NRF inhibiert die transkriptionelle Aktivität von NF-κB Promotoren:
Die transkriptionelle Aktivität von NRF wurde folgendermaßen getestet: Plasmidkonstruke, die entweder NRF oder ein chimäres Protein, welches aus dem vollständigen NRF und der Gal4 DNA-bindenden Domäne bestehen, wurden eingesetzt. Die (chimären) Proteine wurden in murinen Zellen, welche die angegebenen Reporterkonstrukte enthalten, exprimiert. Die GAL4- und NF-κB-bindenden Stellen sind angegeben. Die relativen Reporteraktivitäten sind durch schwarze Balken auf der rechten Seite von 6 gezeigt.
Das Fusionsprotein GAL4-NRF zeigt seine Repressoraktivität in Kombination mit der DNA-bindenden Aktivität von GAL4. Der Promotor, indem die NF-κB Stelle zu einer basalen Aktivität führt, wird durch die Expression des Fusionsproteins inhibiert. Dagegen wird die Aktivität des Promotors ohne die NF-κB-Stelle nicht berührt. NRF zeigt keinen Effekt auf die Genexpression von diesem Promotor, da dieser kein NRE enthält.
7. NRF enthält getrennte Domänen für das Silencing und die DNA-Bindung:
Die 100 C-terminalen Aminosäuren von NRF sind ausreichend, die NRE Sequenz zu binden. Dies wurde bereits wie in 1A gezeigt durch die Expression eines eines Phagen in E.coli bewiesen. Zur Definition der Repressordomäne von NRF wurden Plasmidkonstrukte hergestellt, die chimäre Proteine, welche C-terminale Deletionen von NRF enthalten, kodieren. Diese chimären Porteine wurden in murinen Zellen exprimiert, die Reporterkonstrukte mit GAL4- und NF-κB-bindenden Stellen, wie in 8 gezeigt, enthalten. Die relativen Reporteraktivitäten sind durch schwarze Balken dargestellt.
8. NRF antisense RNA Expression verändert die endogene Genexpression von NRF:
Ein Plasmidkonstrukt, welches eine konditional exprimierbare humane NRF antisense cDNA enthält (Bp 1-344, Aminosäuren 1-114), wurde stabil in murine C243 Zellen transferiert. Die Interferon-Aktivität im Überstand wurde als Folge der Induktion der NRF antisense-Expression nachgewiesen. Das Ergebnis zeigt, dass die endogene NRF-Expression, welche für die Suppression des Interferon-β Promotors verantwortlich ist, durch antisense RNA aufgehoben werden kann.
Beispiel 2
Ein Oligonukleotid, welches die in 1B gezeigte Sequenz besitzt, kann auch durch Screening einer öffentlich erhältlichen Genbibliothek erhalten werden, wenn dies mit Hilfe eines synthetischen Primers mit einem Sequenzabschnitts entsprechend 1B geschieht.
Beispiel
Die IRES-spezifische Aktivität aus der 5' nichttranslatierten Region der humanen NRF mRNA wurde mithilfe bicistronischer Expressionsplasmide in vivo nachgewiesen. Diese wurden unter Nutzung der Gene der Renilla Luziferase und der Firefly Luziferase, welche unter Kontrolle des SV40 Promotors stehen, konstruiert. Die 5' nichttranslatierten Regionen von NRF und Poliovirus wurden zwischen die beiden Zistrone des Plasmids integriert (9A). Die so entstandenen Konstrukte wurden in murinen C243 Zellen transient exprimiert. Dies wurde getan, um einerseits die IRES-Aktivität der 5' nichttranslatierten Region des humanen NRF Gens zu beweisen und außerdem einen Vergleich der Effizienz der IRES-.Elemente aus NRF und Poliovirus durchzuführen. Aus den Expressionswerten der beiden Reporter wurden Quotienten gebildet; diese sind als „Relative Genexpression" angegeben. Die Figur zeigt, dass die Aktivität des NRF-IRES Elements 34,7 Mal höher ist, als die des IRES aus Poliovirus. Northern Blotts zum Nachweis der gleichstarken Transkription der bicistronischen mRNAs und zum Nachweis der Abwesenheit von Transkriptionsstarts innerhalb der IRES-Sequnzen wurden durchgeführt. 9 zeigt, dass die Größe und die Expressionshöhe beider mRNAs nicht unterscheidbar ist. Das beweist, dass eine Translationsinitiation von der 5' nichttranslatierten Region der humanen NRF mRNA stattfindet. Ausserdem zeigen die Daten, dass die Translationsinitiationsstärke des NRF IRES Elements höher ist als alle bisher bekannten IRES Elemente. Da die Translationsinitiationsstärke des Poliovirus IRES Elements etwa 1/3 der Stärke der cap-abhängigen Translation beträgt (Dirks, W., Wirth, M. and Hauser, H.: Bicistronic transcription units for gene expression in mammalian cells. Gene 128 247–249 (1993)), liegt die Stärke des NRF IRES über der der cap-abhängigen Translationsinitiation.
Referenzen

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Claims

ssDNA, umfassend den Nukleotidbereich (i) von Position 654 bis Position 1817 oder (ii) von Position 1518 bis 1817 oder (iii) von Position 654 bis Position 1526 oder (iv) von Position 1 bis Position 653 gemäß 1B oder gemäß 1B, wobei an Positionen 984 bis 1077 und an Positionen 1897 bis 1979 die in 1B gezeigten Nukleotide durch die unter diesen in der zweiten Reihe gezeigten Nukleotide ersetzt werden.
ssDNA, dadurch gekennzeichnet, dass sie komplementär zu einer ssDNA gemäß Anspruch 1 ist.
dsDNA, umfassend eine ssDNA gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche und ihren komplementären Strang.
RNA (a) mit einer Sequenz, die der einer DNA gemäß Anspruch 1, 2, 3 entspricht, oder (b) mit einer Sequenz, die der einer RNA gemäß (a) entspricht, aber gegenläufig (in anti-sense).
Vector, (i) umfassend eine dsDNA, umfassend den Nukleotidbereich (i) von Position 654 bis Position 1817 oder (ii) von Position 1518 bis 1817 oder (iii) von Position 654 bis Position 1526 oder (iv) von Position 1 bis Position 653 gemäß 1B oder gemäß 1B, wobei an Positionen 984 bis 1077 und an Positionen 1897 bis 1979 die in 1B gezeigten Nukleotide durch die unter diesen in der zweiten Reihe gezeigten ersetzt werden, und einen komplementären Strang oder (ii) umfassend eine dsDNA und einen komplementären Strang, codierend dieselbe Aminosäure wie eine dsDNA gemäß (i), aber von dem Vektor in antisense-Richtung beinhaltet.
Verwendung eines Vektors gemäß Anspruch 5 für die Transformation von Zellen zur transienten oder zur permanenten Expression eines Proteins.
Protein, codiert durch eine ssDNA oder eine dsDNA gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einem Vektor gemäß Anspruch 5.
Protein gemäß Anspruch 7, fusioniert mit einem weiteren funktionellen Protein oder einem oder mehr funktionellen Fragmenten desselben.
Protein gemäß Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass es ein nicht-fusioniertes Protein ist.
Verwendung von (i) einer ssDNA gemäß Anspruch 1 oder 2 oder (ii) einer dsDNA gemäß Anspruch 3 oder (iii) einem Vektor gemäß Anspruch 5 oder (iv) einem Protein gemäß Anspruch 8 oder 9 (a) zum Identifizieren und Entwickeln von Agonisten und Antagonisten der NRF-Funktionen, oder (b) für die Entwicklung von verbessertem antisense-NRF und Ribozymen.
Verwendung von (i) einer ssDNA gemäß Anspruch 1 oder 2 oder (ii) einer dsDNA gemäß Anspruch 3 oder (iii) einem Vektor gemäß Anspruch 5 oder (iv) einem Protein gemäß Anspruch 8 oder 9 für die Herstellung einer Zusammensetzung für den Nachweis und die Diagnose von transienten oder permanenten regulatorischen Störungen von NF_KB/rel- und/oder NRF-regulierten physiologischen Mustern bei Tieren und Menschen.
Verwendung von (i) einer ssDNA gemäß Anspruch 1 oder 2 oder (ii) einer dsDNA gemäß Anspruch 3 oder (iii) einem Vektor gemäß Anspruch 5 oder (iv) einem Protein gemäß Anspruch 8 oder 9 für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Krankheiten, insbesondere rheumatoiden Krankheiten, Arthritis, Entzündungen, Infektionskrankheiten, Tumoren und/oder genetischen Krankheiten, oder für die Gen-Therapie bei Tieren und Menschen.
Nicht-humanes transgenes Tier, umfassend eine RNA gemäß Anspruch 4.
Isolierte eukaryotische Zelle, umfassend eine RNA gemäß Anspruch 4.