DE69819154T2

DE69819154T2 - Hemmung von hiv-1 replikation mittels oligocarbamat-derivaten

Info

Publication number: DE69819154T2
Application number: DE69819154T
Authority: DE
Inventors: M. Tariq RANA; Ikramul Huq
Original assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Current assignee: University of Medicine and Dentistry of New Jersey; Rutgers State University of New Jersey
Priority date: 1997-07-07
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2018-07-08
Also published as: CA2296018A1; WO1999002488A1; CA2296018C; DE69819154D1; EP0994850A1; AU8292198A; ATE252552T1; US5843995A; EP0994850B1

Description

Diese Arbeit basiert zum Teil auf Unterstützung des National Institutes of Health, Erteilungsnr. AI 34785, AI 01369 und TW00702. Gewisse Rechte daraus stehen möglicherweise dem Staate zu.
HINTERGRUND ZU DER ERFINDUNG
RNA-Protein-Interaktionen sind für viele zelluläre Funktionen wie der Transkription, dem Spleißen der RNA sowie der Translation von Bedeutung. Ein Beispiel einer derartigen Wechselwirkung stellt der Mechanismus der trans-Aktivierung der Genexpression des menschlichen Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1) dar, die die Interaktion des Tat-Proteins mit der in der auf trans-Aktivierung ansprechenden Region (TAR) der RNA erfordert, nämlich eine Stammschleifenstruktur mit 59 Basen, die an dem 5'-Ende sämtlicher naszierender HIV-1-Transkripte angeordnet ist.
Der in der U3-Region der viralen Wiederholung am langen Terminal (LTR) angeordnete Promoter von HIV-1 ist ein induzierbarer Promoter, der durch das trans-Aktivatorprotein Tat stimuliert werden kann. Wie in anderen Lentiviren ist das Tat-Protein für eine trans-Aktivierung einer viralen Genexpression von größter Bedeutung.
Von Tat abgeleitete Peptide, die die argininreiche RNA-Bindungsdomäne von Tat enthalten, sind in der Lage, in vitro Komplexe mit TAR-RNA zu bilden. Strukturelle Untersuchungen des Tat-Proteins zeigen, dass die RNA-Bindungsdomäne keine starre Spirale ist. Da die RNA-Bindungsdomäne von Tat eine elastische Struktur aufweist, ist die Symmetrie kleiner Peptide, die argininreiche Sequenzen enthalten, für eine TAR-RNA-Erkennung möglicherweise unproblema tisch.
Um wirkungsvolle Therapien für die Behandlung und Vorbeugung von AIDS zu entwickeln, ist die Aufklärung der Mechanismen, die dem Virus die Replikation im menschlichen Wirt ermöglichen, von größter Bedeutung. Es ist daher offensichtlich, dass nach dem Stand der Technik noch Bedarf nach Möglichkeiten der Identifizierung und Charakterisierung von Agenzien besteht, die in der Lage sind, den Prozess der Transkription des HIV-1 zu verhindern oder zu verzögern.
KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Oligocarbamatderivate, die als Peptidnachahmer für die Erkennung von und Bindung durch RNA- und DNA-Strukturen verwendet werden können. Insbesondere betrifft die Erfindung Tat-inhibitorische Oligocarbamatderivate der Formel I
wobei: R¹ eine p-Hydroxybenzyl- oder Benzylgruppe ist;
R² ein Wasserstoff oder Methyl ist;
R³ Guanidinopropyl ist;
R⁴ Aminobutyl oder Guanidinopropyl ist; und
R⁵ Amidomethyl oder Amidoethyl ist; und die biologisch und pharmazeutisch verwendbaren Salze davon, die vorteilhafte Eigenschaften aufweisen, einschließlich eines spezifischen Bindens an HIV-1-TAR-RNA mit hohen Affinitäten und Stabilität der resultierenden Oligocarbamat-RNA-Komplexe gegenüber einer proteolytischen Zersetzung. Stellenspezifische photochemische Quervernetzungstests unter Verwendung eines photoaktiven Analogstoffs (4-Thio-Oracil), der TAR-RNR enthält, zeigen an, dass diese Oligocarbamate mit RNA in der Hauptrille interagieren. Diese Oligocarbamate sind daher in der Lage, mit der TAR-RNA-Bindungsdomäne des Tat-Proteins zu konkurrieren. Diese Verbindungen sind somit im Zusammenhang mit der Behandlung von HIV-1-Infektion insofern nützlich, dass sie in der Lage sind, die Interaktion von Tat-Protein mit TAR-RNA zu blockieren und dadurch die Stufe der Transaktivierung im Replikationszyklus von HIV-1 zu stören. Die rationale Grundlage dieses Ansatzes liegt darin, dass derartige Oligocarbamate was das Binden an TAR-RNA betrifft, mit Tat-Protein in voller Länge konkurrieren und dadurch die erforderlichen Interaktionen zwischen anderen Domänen in dem Tat-Protein und den Transkriptionsmechanismus im Keim verhindern.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verbindungen zu schaffen, die für die Behandlung vielfältiger Krankheiten, insbesondere solcher wie HIV-1, nützlich sind, indem sie in der Lage sind, die Interaktion von Proteinen und deren RNA, insbesondere des Tat-Proteins mit TAR-RNA, zu blockieren und dadurch die Interaktion zwischen Protein und RNA, und im Falle von HIV-1, die Stufe der Transaktivierung im Replikationszyklus dieses Virus zu stören.
Es ist weiterhin eine Aufgabe dieser Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen zu schaffen, die sich für die Verabreichung derartiger Verbindungen eignen.
Es ist eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Behandlung von HIV-1 Infektionen bei Säugern zu schaffen, das die Verabreichung der Verbindungen der vorliegenden Erfindung umfasst.
Weitere Aufgaben und Vorteile erschließen sich dem Fachmann beim Lesen der folgenden Beschreibung in Verbindung mit den nachfolgenden, der Veranschaulichung dienenden Zeichnungen.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1A zeigt die Sequenz für die von Tat abgeleiteten Peptidaminosäuren 47 bis 57, die die RNA-Bindungsdomäne des Tat-Proteins enthält.
1B zeigt eine schematische Struktur der Oligocarbamathauptkette. Die Substituenten der Sequenz des Oligocarbamats entsprechen den varianten Abschnitten der Aminosäuren des in 1A gezeigten Tat-Peptids. Das von Tat abgeleitete Oligocarbamat wurde auf einem ABI-431-Peptid-Systhetisierer mittels N-α-Fmoc-geschützter p-Nitrophenylcarbonatmonomere gemäß dem durch Cho et al., Science 1993, 261, 1303–5 beschriebenen Verfahren synthetisiert. Das Oligocarbamat wurde nach Abspaltung von dem Harz mit Hilfe von HPLC auf einer Zorbax-300-SB-Cg-Säule gereinigt. Die Masse des vollkommen isolierten und gereinigten Oligocarbamats wurde durch FAB-Massenspektrometrie erfasst; 1831,3 (M + H).
1C zeigt die sekundären Strukturen der in dieser Untersuchung verwendeten TAR-RNA des Wildtyps. Wildtyp-TAR-RNA überspannt die minimalen Sequenzen, die für ein Ansprechen von Tat in vivo und für ein Binden von von Tat abge leiteten Peptiden in vitro erforderlich sind. Wildtyp-TAR weist zwei Basenpaare auf, die nicht vom Wildtyp sind, um die Transkription durch T7-RNA-Polymerase zu fördern.
1D zeigt die sekundäre Struktur der konstruierten Doppelstrang-TAR-RNA, die in photochemischen Quervernetzungstests verwendet wurden. Die Doppelstrang-RNA enthält die Nukleotide C18 bis C29 und G36 bis G44 aus der Wildtyp-TAR-RNA-Sequenz, und zusätzliche flankierende Basenpaare, um die Hybridisierung von zwei RNA-Strängen zu erleichtern. Die Nummerierung der Nukleotide in der Doppelstrang-TAR-RNA entspricht deren Positionen in der Wildtyp-TAR-RNA. Sämtliche RNAs wurden mittels in-vitro-Transkription hergestellt. Für Transkriptionsreaktionen (20 ML), die 8,0 pMol Muster-DNA enthielten, wurden 40–60 Einheiten T7-Polymerase (Promega) verwendet. Für die Synthese von mit 4-ThioU markierter RNA, wurde UTP durch 4-ThioUTP (4 mM, endgültige Konzentration) in dem Transkriptionspuffer ersetzt. 4-Thio-UTP wurde nach dem Verfahren von Stade et al. synthetisiert. Die Reinigung und Markierung der RNA wurde nach dem von Bayer. P., et al. in J. Mol. Biol. 247: 529–535 (1995) beschrieben Verfahren durchgeführt.
2 veranschaulicht anhand einer Photographie die Analyse der Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität des von Tat abgeleiteten Oligocarbamats, das an die TAR-RNA der natürlichen Form (wild) und die TAR-RNA der mutanten Form (mut) der Trinucleotidausbuchtung bindet. RNA und RNA-Oligocarbamatkomplexe sind mit R bzw. R-P bezeichnet. ³²P-5'-endmarkierte TAR-RNAs wurden für 3 Minuten auf 85°C erhitzt und anschließend in TK-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,4), 20 mM KCl, 0,1% Triton-X-100) auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Oligocarbamat wurde in reiner Form oder gemeinsam mit den konkurrierenden RNAs (der natürlichen Form TAR oder als mutantes TAR) zugefügt, in TK-Puffer für 3 Minuten auf 85°C vorgewärmt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Oligocarbamat-RNA-Bindungsreaktionen wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt und durch Hinzufügen von 30% Glycerol angehalten. Die Oligocarbamat-RNA-Komplexe wurden auf einem nicht denaturierenden, 12%igen Acrylamidgel aufgelöst und mittels Autoradiographie oder Phosphorspektroskopie sichtbar gemacht.
3 veranschaulicht anhand einer Photographie die stellenspezifische photochemische Quervernetzungsreaktion des an Position 23 mit 4-ThioUracil markierten TAR-RNA-Doppelstrangs mit dem Oligocarbamat. Die Quervernetzung von RNA-RNA und RNA-Oligocarbamat sind mit R-R bzw. R-P XL bezeichnet. Für die photochemischen Reaktionen wurde der RNA-Doppelstrang durch Hybridisierung von zwei Strängen zubereitet. Strang 1 des Doppelstrangs wurde mit ³²P 5'-endmarkiert. Vorgeformte RNA-Doppelstränge (0,04 μM) wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von Oligocarbamat (1,5 μM) bestrahlt (360 nm) und mittels Denaturierungsgelen nach dem in Wang et al., Biochemistry, 1996 35: 6491–6499 beschriebenen Verfahren analysiert.
4A veranschaulicht anhand einer Photographie die Spezifität der durch Konkurrenzversuche ermittelten Oligocarbamat-TAR-Komplexbildung. Die RNA-Oligocarbamatkomplexe wurden zwischen 0,04 μM ³²P-5'-endmarkierter TAR-RNA und 1,5 μM des von Tat abgeleiteten Oligocarbamats in Anwesenheit von nicht markierter TAR-RNA der mutanten Form der Trinucleotidausbuchtung (A) oder der Wildtyp-TAR-RNA gebildet.
4B zeigt anhand einer Photographie, dass die Konzentrationen der konkurrierenden RNA in den Bahnen 1, 2, 3, 4, 5 jeweils 0,5, 1, 2, 3 und 4 μM betrug. Die Bahn M ist eine Markerbahn, die die RNA und die RNA-Oligocarbamatkomplexe zeigt, die mit R-P bezeichnet sind.
5A und 5B zeigen anhand von Photographien die Spezifität der durch Konkurrenzexperimente ermittelten Oligocarbamat-TAR-RNA Quervernetzungsreaktion. Die Oligocarbamat-RNA-Komplexe wurden in Anwesenheit von nicht markierter Wildtyp-TAR-RNA (A) oder mutanter TAR-RNA (B) zwischen 0,04 μM ³²P-5'-endmarkierter Doppelstrang-TAR-RNA und 1,5 μM von Tat abgeleitetem Oligocarbamat gebildet. (A): Die Konzentrationen der konkurrierenden RNA in den Bahnen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 betrugen 0, 0,5, 1, 2, 3 bzw. 4 μM. (B): Die Konzentrationen der konkurrierenden RNA in den Bahnen 1, 2, 3 und 4 betrugen 1, 2, 3 bzw. 4 μM. Bahn a: Doppelstrang-RNA ohne UV-Licht. Bahn b: Doppelstrang-RNA unter UV-Licht, das die elektrophoretische Mobilität der RNA-RNA-Quervernetzung sichtbar macht. Bahn c: der Oligocarbamat-RNA-Komplex in Dunkelheit. Die Quervernetzung von RNA-RNA und RNA-Oligocarbamat sind mit R-R bzw. R-P XL bezeichnet.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Interaktionen von Protein-RNA und Protein-DNA sind für den zellulären Replikationsprozess kritisch. Ein Unterbrechen dieses Prozesses stellt ein Verfahren zur Verfügung, die Vermehrung vieler viraler und bakterieller Pathogene zu stören, und ermöglicht dadurch ein therapeutisches Eingreifen in den Verlauf unterschiedlicher Erkrankungen.
Das Tat-Protein des menschlichen Immunschwächevirus Typ-1 (HIV-1) bindet an seine Ziel-RNA, nämlich TAR, und aktiviert die Transkription. Ein 36-Aminosäuren-Peptidabschnitt, Tat (37–72), der die RNA-Bindungsdomäne von Tat enthält, bindet speziell an TAR-RNA.
Die Erfindung schafft durch chemische Synthese Oligocarbamatderivate, die geeignet substituiert sind, um das Tat(47-57)-Peptid nachzuahmen. Die Oligocarbamatderivate der vorliegenden Erfindung sind durch die folgende Formel I dargestellt:
wobei R¹ eine p-Hydroxybenzyl- oder Benzylgruppe ist;
R² Wasserstoff oder Methyl ist;
R³ Guanidinopropyl ist;
R⁴ Aminobutyl oder Guanidinopropyl ist; und
R⁵ Amidomethyl oder Amidoethyl ist; und deren biologisch und pharmazeutisch verwendbare Salze. Unter diesen sind gewisse Derivate bevorzugt, nämlich diejenigen, bei denen R5 eine Amidoethylgruppe ist. Besonders bevorzugt ist das Derivat, bei dem jeder der veränderlichen R-Substituenten geeignet ausgewählt ist, um die natürlich vorkommende Tat-Sequenz, wie sie in SEQ ID NO: I gezeigt ist, nachzuahmen oder zu simulieren. Dieses Derivat ist daher eine Verbindung gemäß Formel I, wobei R1 eine p-Hydroxybenzylgruppe, R2 Wasserstoff, R4 Aminobutyl und R5 eine Amidoethylgruppe ist.
Überraschenderweise stellte sich heraus, dass diese Oligocarbamate, wie durch die Verschiebung elektrophoretischer Mobilitäts- und stellenspezifische photochemische Quervernetzungstests ermittelt, spezifisch mit hohen Affinitäten an TAR-RNA binden und mit RNA in der erweiterten Hauptrille interagieren. Die Oligocarbamatderivate verhindern die Bindung des L-Peptids an TAR-RNA in vitro und inhibieren auf diese Weise die Tat trans-Aktivierung in vivo.
Solche Ergebnisse weisen nach, dass die Oligocarbamatderivate der vorliegenden Erfindung in der Lage sind, spezifische Nucleinsäurestrukturen zu erkennen. Da diese Oligocarbamatderivatliganden resistent gegenüber Degradation durch natürlich auftretende Enzyme sind und keine kräftige humorale Immunantwort induzieren, sind sie somit geeignet, um Protein-Nucleinsäure-Interaktionen in vivo zu steuern.
Um festzustellen, ob die Oligocarbamatderivate natürlich auftretende Nucleinsäurestrukturen erkennen, wurde das Tat-Peptid (SEQ ID NO: 1, 1), das die an Basisarginin reiche Region von Tat enthält, mittels Festphasenpeptidsyntheseverfahren synthetisiert. Nach einer HPLC-Reinigung und Charakterisierung durch Massenspektrometrie wurde das Tat-Peptid auf TAR-RNA-Bindung getestet. Ähnlich wie im Falle von L-Tat war das Oligocarbamatderivat in der Lage, an die TAR-RNA zu binden, und war nicht in der Lage, an eine die Ausbuchtungsreste nicht aufweisende mutante TAR-RNA zu binden.
Mittels direkter und konkurrierender elektrophoretischer Mobilitätsversuche wurden Gleichgewichtsdissoziationskonstanten der RNA-Komplexe von Oligocarbamat-TAR ermittelt. Die Dissoziationskonstanten wurden anhand mehrerer Versuchsreihen berechnet, die zeigten, dass das Oligocarbamat mit einem K_d von 1,13 μM an TAR-RNA bindet. Um die RNA-Bindungsaffinitäten des Oligocarbamats mit natürlichem Peptid zu vergleichen, wurde ein tat-abgeleitetes Peptid (Tyr47 bis Arg57) synthetisiert, das die RNA-Bindungsdomäne des Tat-Proteins enthielt (1). Die Dissoziationskon stanten der Tat-Peptid-RNA-Komplexe wurden anhand mehrerer Versuchsreihen unter den gleichen Bedingungen ermittelt, wie sie für RNA-Komplexe von Oligocarbamat-TAR verwendet wurden. Diese Versuche zeigten, dass das Tat-Peptid (47-57) mit einem K_d von 0,78 μM an TAR-RNA bindet. Eine relative Dissoziationskonstante (K_rel) lässt sich durch Messen der Verhältnisse des Wildtyp-Tat-Peptids gegenüber den Dissoziationskonstanten (K_d) von Oligocarbamat für TAR-RNA ermitteln. Die Ergebnisse wiesen nach, dass der berechnete Wert für K_rel 0,69 betrug, was anzeigt, dass die Carbamat-Hauptkettenstruktur die TAR-Bindungsaffinitäten des nicht natürlichen Biopolymers nicht erheblich veränderte. Auf die Spezifität der RNA-Komplexbildung von Oligocarbamat-TAR wurde durch Konkurrenzexperimente eingegangen. Die Komplexbildung von Oligocarbamat-RNA wurde durch die Hinzufügung nicht markierter Wildtyp-TAR-RNA inhibiert und nicht durch eine mutante TAR-RNA. Diese Ergebnisse zeigen, dass das tat-abgeleitete-Oligocarbamat geeignet ist, TAR-RNA spezifisch zu erkennen.
Ohne eine Beschränkung auf eine spezielle Theorie zu beabsichtigen, sind eine Anzahl von Weisen aufgezeigt, nach denen das Oligocarbamatderivat der Formel I mit TAR-RNA interagieren könnte. Einige beweiskräftige Anzeichen weisen darauf hin, dass das Tat-Protein mit der TAR-RNA in einer erweiterten Hauptrille interagiert.
Ein stellenspezifisches Quervernetzungsverfahren, das auf einer 4-Thio-Uracil (4-ThioU) verwendenden photochemischen Untersuchung basierte, wurde eingesetzt, um die Konformation von TAR-RNA und deren Interaktion mit Tat-Protein unter physiologischen Bedingungen zu ermitteln. Um die Interaktionen von Oligocarbamatderivat-RNA nachzuweisen, wurde TAR-RNA, das 4-ThioU an Position 23 aufweist, synthetisiert und photochemische Quervernetzungstests, wie in 3 gezeigt, ausgeführt. Eine Bestrahlung des Oligocarbamatderivat-RNA-Komplexes erbringt ein neues Band mit einer elektrophoretischen Mobilität, die geringer ist, als diejenige der RNA (3, Bahn 4). Sowohl das Oligocarbamatderivat als auch UV-Bestrahlung (360 nm) sind erforderlich, um diesen quervernetzten RNA-Peptidkomplex zu bilden (siehe Bahnen 3 und 4). Da der vernetzte Oligocarbamatderivat-RNA-Komplex gegenüber alkalischen pH-Bedingungen (9,5), hoher Temperatur (85°C) und denaturierenden Bedingungen (8 M Urea, 2% SDS) stabil ist, kann daraus geschlossen werden, dass es während der Quervernetzungsreaktion zu einer Atombindung zwischen der TAR-RNA und dem Peptid kommt.
Um die Proteasestabilität der Oligocarbamatderivat-RNA-Komplexe zu untersuchen, wurden die Quervernetzungsprodukte der Oligocarbamatderivat-RNA einer sehr intensiven Proteinase-K-Zersetzung unterworfen, wobei sich zeigte, dass die Komplexe vollkommen stabil waren, und dass es keine Anzeichen einer Degradation des Oligocarbamatderivats gab (Bahn 5). Unter ähnlicher Behandlung mit Proteinase-K zeigte sich, das die Photovernetzungsprodukte der Tat-TAR die RNA-Proteinquervernetzung vollständig verloren und es zu einem Ansteigen freier RNA kam, wie anhand der Bandintensität auf dem Gel zu beobachten.
Die Spezifität der Quervernetzungsreaktion wurde durch Konkurrenzexperimente bestätigt. Eine Quervernetzung wurde durch das Hinzufügung nicht markierter Wildtyp-TAR-RNA und nicht durch eine mutante TAR-RNA unterbunden, der die Trinucleotidausbuchtung fehlt (5A und 5B). Daraus kann der Schluss gezogen werden, dass für eine photochemische Quervernetzung die Bildung eines spezifischen RNA-Protein-Komplexes zwischen TAR-RNA und einem Tat-ähnlichen Oligocarbamatderivat unabdingbar ist. In dem Maße, wie der Anteil konkurrierender RNA der natürlichen Form erhöht wurde, war (wie erwartet) eine Abnahme der RNA-Proteinquer vernetzung zu beobachten, jedoch wurde gleichzeitig ein Anstieg von RNA-RNA-Quervernetzungen verzeichnet. Diese Ergebnisse zeigen an, dass durch die Anwesenheit des RNA-bindenden Oligocarbamatliganden Zwischenstrang-RNA-Quervernetzung verhindert wird. Ein ähnliches Ergebnis wurde zuvor in photochemischen Quervernetzungstests erhalten, bei denen ein 34 Aminosäuren enthaltendes L-Tat-Fragment und TAR-RNA, die 4-Thio-U enthielt, verwendet wurden.
Um zu ermitteln, ob das Oligocarbamatderivat geeignet ist, eine Komplexbildung von Tat-TAR in vitro zu verhindern, wurden photochemische Quervernetzungstests an dem Tat-TAR-Komplex in Anwesenheit steigender Mengen von Oligocarbamatderivat mit anschließender Proteinase-K-Zersetzung durchgeführt. Eine RNA-Proteinquervernetzung wurde in dem L-Tat-TAR-Komplex beobachtet, der durch die Hinzufügung von Proteinase-K-Enzym zu kleineren RNA-Peptidkomplexen zerfiel. Da die D-Tat-TAR-Quervernetzung gegenüber Proteolyse resistent ist, führte eine Steigerung der Menge an Oligocarbamatderivat vor den Quervernetzungsreaktionen zu einem Anstieg der RNA-Proteinquervernetzung nach der Proteinase-K-Zersetzung. In dem Maße wie die Konzentration des Oligocarbamatderivats erhöht wurde, ließ sich auch eine Abnahme der kleineren RNA-Peptid-Quervernetzungsprodukte beobachten. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Oligocarbamatderivat nach Formel I in der Lage ist, mit Tat zu konkurrieren, um mit TAR-RNA in vitro einen Komplex zu bilden.
Um zu ermitteln, ob das Oligocarbamatderivat eine Transaktivierung von Tat in vivo inhibiert, wurde Oligocarbamatderivat mit pSV2-Tat und pAL-Plasmiden in HeLa-Zellen transfiziert, die einen integrierten LTR-CAT-Nachweisstoff enthielten. Die Plasmide pSV2Tat und pAL exprimieren ein erstes Exon des Tat-Proteins bzw. Luciferaseenzyms. Die Transfektion von pSV2Tat verbesserte, wie durch die CAT-Aktivität ermittelt, die Transkription. Eine Steigerung der Menge des Oligocarbamatderivats bewirkte eine Verringerung der CAT-Aktivität, während dies auf die Luciferaseaktivität ohne Einfluss blieb. Mit 5 μg Oligocarbamatderivat wurde die trans-Aktivierung von Tat um mehr als 50% unterbunden. Die Transfektion von Tat-Peptiden verringerte die CAT-Aktivität nicht, was nahelegt, dass die L-Peptide gegenüber Proteolyse in vivo nicht stabil sind. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Oligocarbamatderivat spezifisch trans-Aktivierung durch Tat-Protein inhibiert.
Diese Erkenntnisse zeigen an, dass die simulierten Tat-Oligocarbamatderivate der vorliegenden Erfindung spezifisch an die TAR-RNA binden und in der erweiterten Hauptrille der TAR-RNA in einer ähnliche Weise interagieren, wie dies im Falle von Tat zu beobachten ist. Diese Erkenntnisse zeigen ferner, dass ein kleines tat-abgeleitetes Oligocarbamat spezifisch an TAR-RNA bindet und in der erweiterten Hauptrille von TAR-RNA interagiert. Aufgrund des Unterschieds der Hauptkettenstruktur können sich Oligocarbamate von Peptiden hinsichtlich Wasserstoffbindungseigenschaften, Lipophilität, Stabilität und Konformationsflexibilität unterscheiden. Darüber hinaus sind Oligocarbamate gegenüber Proteinase-K-Degradation resistent. Diese Charakteristiken von Oligocarbamaten lassen sich nutzen, um pharmakokinetische Eigenschaften gegenüber Peptiden zu verbessern. Die RNA-Erkennung durch ein nicht natürliches Biopolymer ermöglicht einen neuen Ansatz für die Entwicklung von Medikamenten, die in der Lage sind, RNA-Protein-Interaktionen zu modulieren.
Der Nutzen der Oligocarbamatderivate nach Formel I zeigt sich ferner in deren Fähigkeit die Replikation von HIV-1 in einem akute Infektionsversuch zu verhindern.
Ein ähnlicher Ansatz wurde berichtet, bei dem das kationische Peptid N-Azetyl-(DArg)₉-NH₂ verwendet wurde. Es stellte sich allerdings heraus, dass eine antivirale Aktivität des Peptids über eine Inhibierung des viralen Eintrags konsistent mit einer antiviralen Aktivität war, die zu beobachten ist, wenn die Zellen 24 Stunden vor der Infizierung mit Peptid vorbehandelt wurden. In der Untersuchung wurde die Wahrscheinlichkeit einer Inhibierung der Transaktivierung durch ein blockierendes Tat-Protein angenommen, jedoch nicht bewiesen, und es wurde kein Beweis erbracht, dass das Peptid eine Spezifität für TAR-RNA zeigte.
Die vorliegende Erfindung schafft somit ein Verfahren der Behandlung einer retroviralen Proteaseinfektion bei einem Säuger, der einer derartigen Behandlung bedarf. Insbesondere lassen sich die Oligocarbamate der vorliegenden Erfindung als Nachahmer der Tat-Protein-RNA-Bindungsdomänen verwenden, um die HIV-1-Infektion und die daraus resultierende Erkrankung an AIDS zu behandeln. Bei dem behandelten Säuger kann es sich um einen Menschen, einen Primaten, eine Katze oder dergleichen handeln, wobei die Behandlung von Menschen besonders bevorzugt ist. Ein Tat-Antagonist würde sich ferner eignen, die pathogenen Wirkungen des Tat-Proteins für Wirtszellen aufgrund von Interaktionen mit TAR-ähnlichen Elementen auf zellulären Transkripten zu verbessern. Neuere Untersuchungen an Peptidanalogen der Kerndomänensequenz von Tat-Protein, von dem angenommen wird, dass es eher mit Wirtszellenfaktoren als mit viral kodierter RNA interagiert, führten zu demselben Vorschlag einer neuen Klasse therapeutischer Wirkstoffe gegen AIDS, die auf einer Inhibierung der Transaktivierungsstufe in dem HIV-1-Replikationszyklus basieren.
Die Oligocarbamatderivate nach Formel I und deren Analoge können durch herkömmliche Lösungsverfahren oder durch aus dem Stand der Technik bekannte Festphasensynthesetechniken synthetisiert werden.
Für die gesamte Beschreibung und die beigefügten Patentansprüche gilt, dass die Oligocarbamatderivate nach Formel I und deren Analoge und Salze sämtliche Stereo-, optische und geometrische Isomere davon, sofern solche Isomere existieren, sowie deren pharmazeutisch verwendbare Salze und Solvate umfassen. Falls es angebracht ist, ist es möglich, das Oligocarbamatderivat oder dessen Analoge als dessen entsprechende Amidform zu verwenden.
Der Begriff "biologisch und pharmazeutisch verwendbare Salze" soll jedes Salz umfassen, das aus einer anorganischen oder organischen Säure abgeleitet ist und mit dem Säugerorganismus verträglich ist. Diese Salze umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, Azetat, Adipat, Alginat, Citrat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Hexanoat, Succinct, Fumarat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Laktat, Maleat, Phosphat, Sulfat, Methansulfonat, Oxalat, Propionat, Tosylat und Mesylat. Beispiele von Säuren, die verwendet werden können, um derartige Salze zu bilden, schließen anorganische Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure und Phosphorsäure, und organische Säuren wie Oxalsäure, Maleinsäure, Sukzinsäure und Zitronensäure ein.
Die Nomenklatur, die verwendet wird, um die Oligocarbamate zu definieren, stimmt mit der herkömmlichen Polypeptiddarstellung überein, bei der die Aminogruppe an dem N-Terminal links und die Carboxylgruppe an dem C-Terminal rechts erscheint. NH₂ kennzeichnet die freie Aminogruppe, die an dem Aminoende des Oligocarbamats vorhanden ist. COOH kennzeichnet die freie Carboxylgruppe, die an dem Carboxyende des Oligocarbamats vorhanden ist.
Dementsprechend sind Oligocarbamatderivatanaloge, die gegenüber den Derivaten nach Formel I im Wesentlichen äquivalente Aktivität aufweisen, ebenso für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung in Betracht zu ziehen. Diese Modifikationen lassen sich durch eine Synthese erzielen, die das geeignete Ausgangsmaterial verwendet.
Außerdem sollen die Begriffe "aktives Agens" "aktiver Wirkstoff" und "aktives Medikament" das hier speziell erwähnte Oligocarbamatderivat nach Formel I sowie sämtliche im Wesentlichen homologen Analoge desselben mit einschließen.
In Angleichung an die Standardnomenklatur für Peptide in J. Biol. Chem., 243: 3552–59 (1969) sind Abkürzungen für Aminosäurereste in der nachfolgenden Tafel gegenübergestellt:
TAFEL ZUR GEGENÜBERSTELLUNG
Es ist zu beachten, dass sämtliche Aminosäurerestsequenzen hier durch Formeln dargestellt sind, deren Rechts-Links-Orientierung im Sinne der herkömmlichen Orientierung des Aminoterminus gegenüber dem Carboxyterminus ausgerichtet ist. Ferner ist zu beachten, dass ein Bindestrich zu Beginn oder am Ende einer Aminosäurerestsequenz eine Peptidbindung an eine weitere Sequenz eines oder mehrerer Aminosäurereste anzeigt. Obige Tafel dient dazu, die drei Buchstaben verwendende und die einen Buchstaben verwendende Notation zu korrelieren, die hier jeweils austauschbar eingesetzt sein können.
Ein Substituent auf der Carbamathauptkette in dem Oligocarbamatderivat dieser Erfindung kann gegenüber dem entsprechenden Substituenten der Aminosäure in der natürlich auftretenden Tat-Peptidsequenz in einer nicht konservativen Weise (d. h. durch Verändern eines Substituenten der Ausgangscarbonate, die einer Gruppierung von Carbonaten mit einer speziellen Abmessung oder Charakteristik zugeordnet sind, zu einem zu einer weiteren Gruppierung gehörendes Carbamat) oder in einer konservativen Weise (d. h. durch Verändern eines Carbonats, das zu einer Gruppierung von Carbonaten mit einer speziellen Größe oder Charakteristik zugeordnet ist, zu einem Carbonat, das zur selben Gruppierung gehört) verändert werden. Eine derartige konservative Veränderung zieht im Allgemeinen eine geringere Veränderung der Struktur und Funktion des sich ergebenden Oligocarbonats nach sich. Die vorliegende Erfindung sollte in den Schutzumfang Analoge mit einbeziehen, deren Sequenzen konservative Veränderungen aufweisen, die die Aktivität oder Bindungscharakteristiken des sich ergebenden Oligocar bonats nicht erheblich verändern.
Im folgenden wird ein Beispiel der unterschiedlichen Gruppierungen von Carbonaten beschrieben, die aufgebaut sind nach der Formel:
wobei R ein in einer natürlich auftretenden Aminosäure vorzufindender Substituent ist.
Carbonate mit nichtpolaren R-Gruppen R

CH₃ (Methyl, Alaninanalog)
CH₃-CH(CH₃)- (Isopropyl, Valinanalog)
CH₃-CH(CH₃)-CH₂- (Isobutyl, Leuzinanalog)
CH₃-CH₂-CH(CH₃)- (1-Methylpropyl, Isoleuzinanalog)
ϕCH₂- (Benzyl, Phenylalanianalog)
CH₃-S-CH₂-CH₂- (Methylthioethyl, Methioninanalog)

Carbonate mit elektrisch neutralen polaren R-Gruppen R

H (Wasserstoff, Glyzinanalog)
HO-CH₂- (Hydroxymethyl, Serinanalog)
CH₃-CH(OH)- (α-Hydroxyethyl, Threoninanalog)
HS-CH₂- (Thiomethyl, Cysteinanalog)
HO-ϕ-CH₂- (Hydroxybenzyl, Tyrosinanalog)
(Amidomethyl, Asparaginanalog)
(Amidoethyl, Glutaminanalog)

Carbonate mit elektrisch geladenen polaren R-Gruppen

HOOC-CH₂- (Carboxymethyl, Aspartinsäureanalog)
HOOC-CH₂-CH₂- (Carboxyethyl, Glutaminsäureanalog)

Grundlegende Carbonate

HN₂-(CH₂)₄- (Aminobutyl, Lysinanalog)
NH
HN₂-C-NH-CH₂-CH₂-CH₂- (Guanidinopropyl, Argininanalog)

Eine weitere Gruppierung können Carbonate mit Phenylgruppen darstellen, beispielsweise die Phenylalanin- und Tyrosinanaloge.
Eine weitere Gruppierung kann gemäß dem Molekulargewicht gebildet sein (d. h. der Größe der R-Gruppen), wobei Gruppen mit ähnlichem Gewicht durch andere Gruppen ähnlichen Gewichts ersetzt werden können.
Besonders bevorzugte Substitutionen sind das Glutaminanalog gegen das Argininanalog oder Lysinanalog.
Carbonatsubstitutionen können ebenfalls eingeführt sein, um ein Carbonat mit einer besonders bevorzugten Eigenschaft zu substituieren. Beispielsweise kann ein Cysteinanalog als eine potentielle Stelle für eine Disulfidbrücke mit einem weiteren Cysteinanalog eingeführt sein.
Exemplarische Analoge des Oligocarbonats nach Formel 1 enthalten somit solche Analoge, bei denen
R¹ p-Hydroxybenzyl ist;
R₂ Wasserstoff ist;
R⁴ Aminobutyl ist; und
R⁵ Amidoethyl ist;
R¹ Benzyl ist;
R² Wasserstoff ist;
R⁴ Aminobutyl ist; und
R⁵ Amidoethyl ist;
R¹ P-Hydroxybenzyl ist;
R² Wasserstoff ist; und
R⁵ Amidomethyl ist.
Das aktive Oligocarbonatderivat für den Einsatz in der vorliegenden Erfindung kann ein Medikament, d. h. eine pharmazeutische Zusammensetzung sein und vorzugsweise als eine solche verabreicht werden. Wie weiter oben erörtert, können die erfindungsgemäßen Oligocarbamatderivate und deren Analoge in pharmazeutischen Zusammensetzungen mit einem geeigneten Trägerstoff und in einer wirksamen Dosierung zubereitet sein, um einem Patienten, dessen Gesundheitszustand sich aufgrund einer spezifischen neuronalen Degeneration verschlechtert, auf unterschiedlichem Wege zur Therapie der Degeneration verabreicht werden. Eine Vielfalt von Verabreichungstechniken können angewandt werden, darunter parenterale Techniken wie subkutane, intravenöse und intraperitoneale Injektionen, Katheterisierungen und dergleichen. Durchschnittliche Mengen des Polypeptids oder deren Analoge des Peptids können variieren und sollte insbesondere auf Empfehlungen und Verschreibungen eines qualifizierten Arztes basieren.
Die in den Verfahren dieser Erfindung für eine Verabreichung an Tiere und Menschen verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen die aktive Verbindung in Kombination mit einem pharmazeutischen Trägerstoff oder Vehikel.
Das Medikament kann in Form von Tabletten (einschließlich Pastillen und Granulaten), Dragees, Kapseln, Pillen, Ampullen, intranasalen Sprays oder Zäpfchen vorliegen, die jeweils die Verbindung der Erfindung enthalten.
Der Begriff "Medikament" in dem hier verwendeten Sinne bezeichnet physikalisch diskrete, kohärente Portionen, die sich für eine medizinische Verabreichung eignen. Der Ausdruck "Medikament in Form einer Dosierungseinheit" in dem hier verwendeten Sinne bezeichnet physikalisch diskrete, kohärente Einheiten, die sich für eine medizinische Verabreichung eignen, die jeweils eine Tagesdosis oder ein Vielfaches (bis zum Vierfachen) oder einen Bruchteil (bis zu einem Vierzigstel) einer täglichen Dosis der aktiven Verbindung der Erfindung in Verbindung mit einem Trägerstoff und/oder innerhalb einer Hülle eingeschlossen enthalten. Ob das Medikament eine Tagesdosis oder beispielsweise die Hälfte, ein Drittel oder ein Viertel einer täglichen Dosis enthält, hängt davon ab, ob das Medikament beispielsweise einmal, zweimal, dreimal oder viermal täglich verabreicht werden soll.
Vorteilhafterweise sind die Zusammensetzungen als Dosierungseinheiten formuliert, wobei jede Einheit eingerichtet ist, um eine festgesetzte Dosis an aktiven Wirkstoffen zuzuführen. Tabletten, beschichtete Tabletten, Kapseln, Ampullen, intranasale Sprays und Zäpfchen stellen Beispiele einer bevorzugten Dosierungsform gemäß der Erfindung dar. Es ist lediglich erforderlich, dass der aktive Wirkstoff in einer wirksamen Menge bereitsteht, d. h. so, dass eine geeignete wirksame Dosierung mit der in einzelnen oder mehreren Dosiseinheiten verwendeten Dosierungsform konsistent ist. Die genauen Einzeldosierungen, sowie die Tagesdosen werden selbstverständlich anhand standardisierter medizinischer Vorgaben unter der Leitung eines Arztes ermittelt.
Die aktive Verbindung kann ferner in Form von Suspensionen, Lösungen und Emulsionen der aktiven Verbindung in einem wässerigen oder nicht wässerigen Verdünnungsmittel, Sirupen, Granulaten oder Pulver verabreicht werden.
Zu den Verdünnungsmitteln, die in pharmazeutischen Zusammensetzungen (z. B. Granulaten) verwendet werden können, die die aktive Verbindung enthalten, die geeignet ist, um zu Tabletten, Dragees, Kapseln und Pillen geformt zu werden, zählen nachfolgende Beispiele: (a) Füllstoffe und Streckmittel, z. B. Stärke, Zucker, Mannitol und Kieselsäure; (b) Bindungsagenzien, z. B. Carboxymethylcellulose und andere Zellulosederivate, Alginate, Gelatine und Polyvinylpyrrolidon; (c) Befeuchtungsagenzien, z. B. Glycerol; (d) Disintegrierende Agenzien, z. B. Agar-Agar, Calciumcarbonat und Natriumbicarbonat; (e) Agenzien zum Verzögern der Auflösung, z. B. Paraffin; (f) Resorptionsbeschleuniger, z. B. quaternäre Ammoniumverbindungen; (g) oberflächenaktive Agenzien, z. B. Cetylalkohol, Glycerolmonostearat; (h) adsorptive Trägerstoffe, z. B. Kaolin und Bentonit; (i) Gleitmittel, z. B. Talkum, Calcium und Magnesiumstearat sowie feste Polyethylenglykole.
Die Tabletten, Dragees, Kapseln und Pillen, die die aktive Verbindung enthalten, können herkömmliche Beschichtungen, Hüllen und schützende Grundsubstanzen aufweisen, die gegebenenfalls Trübungsmittel enthalten. Diese können so eingerichtet sein, dass sie den aktiven Wirkstoff lediglich oder vorzugsweise in einem speziellen Abschnitt des Intestinaltrakts, und möglicherweise über eine vorgegebene Zeitspanne hinweg freigeben. Die Beschichtungen, Hüllen und schützenden Grundsubstanzen können beispielsweise aus polymeren Substanzen oder Wachsen hergestellt sein.
Der aktive Wirkstoff kann ferner in Form von Mikro kapseln zusammen mit einem oder mehreren der oben erwähnten Verdünnungsmittel hergestellt sein.
Die Verdünnungsmittel, die in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendet werden, die geeignet sind, um zu Zäpfchen geformt zu werden, können beispielsweise die üblichen wasserlöslichen Verdünnungsmittel wie Polyethylenglykole und Fette (z. B. Kakaoöl und hochwertige Ester, (z. B. C₁₄-Alkohol mit C₁₆-Fettsäure)) oder Mischungen dieser Verdünnungsmittel sein.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Lösungen und Emulsionen sind, können beispielsweise die herkömmlichen Verdünnungsmittel enthalten (selbstverständlich unter Ausschluss der oben erwähnten Lösungsmittel mit einem Molekulargewicht unterhalb von 200, außer es ist ein oberflächenaktives Agens anwesend), beispielsweise Lösungsmittel, Auflösungsagenzien und Emulgatoren. Zu speziellen nicht als beschränkend zu wertenden Beispielen derartiger Verdünnungsmittel zählen Wasser, Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylazetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle wie Erdnussöl, Glycerol, Tetrahydrofurfuryl Alkohol, Polyethylenglykole und Fettsäureester von Sorbitol oder Mischungen davon.
Für eine parenterale und intranasale Verabreichung sollten die Lösungen und Suspensionen steril sein, z. B. in Ampullen eingeschlossenes Wasser oder Arachisöl, und, falls angebracht, blutisotonisch sein.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen, die Suspensionen sind, können die üblichen Verdünnungsmittel enthalten, beispielsweise flüssige Verdünnungsmittel, z. B. Wasser, Ethylalkohol, Propylenglykol, oberflächenaktive Agenzien (z. B. ethoxylierte Isostearylalkohole, Polyoxyethylensorbi tole und Sorbitanester), mikrokristalline Zellulose, Aluminummethahydroxid, Bentonit, Agar-Agar und Tragant, oder Mischungen davon.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können ferner Farbstoffe und Konservierungsstoffe, sowie Duftstoffe und Geschmacksadditive (z. B. Pfefferminzöl und Eukalyptusöl und Süßstoffe (z. B. Sacharin und Aspartam) enthalten.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen werden im Allgemeinen einen Gewichtsanteil von aktiven Wirkstoff zwischen 0,5 und 90% enthalten.
Zusätzlich zu der aktiven Verbindung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Medikamente ferner andere pharmazeutisch aktive Verbindungen enthalten.
Jedes beliebige Verdünnungsmittel in den Medikamenten der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges jener oben in Verbindung mit den pharmazeutischen Zusammensetzungen erwähnten Verdünnungsmittel sein. Solche Medikamente können als das alleinige Verdünnungsmittel Lösungsmittel mit einem Molekulargewicht enthalten, das geringer ist als 200.
Es kommt in Betracht, diese aktive Verbindung peroral, intranasal, parenteral (beispielsweise intramuskulär, intrathekal, intraperitoneal, subkutan, transdermal oder intravenös), rektal oder lokal, vorzugsweise intranasal oder parenteral, insbesondere perlingual, oder intravenös zu verabreichen. Am meisten bevorzugt ist das Peptid nach Formel I oder dessen Analog oder Salz auf intranasalem oder intravenösem Weg verabreicht.
Die Dosierungsrate liegt vorzugsweise im Bereich von 0,01 bis 20 mg/kg Körpergewicht, und am meisten vorzuziehen im Bereich von 0,5 bis 5 mg/kg Körpergewicht, und wird abhängen von der Natur und dem Körpergewicht des zu behandelnden Subjekts, von dem individuellen Ansprechen des Subjekts auf die Behandlung, von der Art der Formulierung, in der der aktive Wirkstoff verabreicht wird, von dem Modus, in dem die Verabreichung durchgeführt wird und von dem Zeitpunkt des Fortschritts der Erkrankung oder von den Intervallen, in denen die Verabreichung erfolgen soll. Daher reicht es möglicherweise in manchen Fällen aus, weniger als eine minimale Dosierungsrate einzusetzen, während in anderen Fällen eine obere Grenze überschritten werden muss, um die gewünschten Ergebnisse zu erzielen. In Fällen, in denen größere Mengen zu verabreichen sind, kann es angebracht sein, diese auf mehrere einzelne Verabreichungen über den Tag zu verteilen. Diesbezüglich können für die intranasale Verabreichung aus dem Stand der Technik bekannte kalibrierte Dosierungsvorrichtungen verwendet werden.
Die nachfolgenden Beispiele werden vorgeschlagen, um die bevorzugten Ausführungsbeispiele der Erfindung vollständiger zu veranschaulichen. Diese sollten jedoch auf keinen Fall als Beschränkung des weiten Schutzumfangs der Erfindung aufgefasst werden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
VERFAHREN
RNA und von Tat abgeleitete Peptidsynthese
Sämtliche RNAs wurden mittels in-vitro-Transkription²⁹ präpariert. Für Transkriptionsreaktionen (20 μL), die 8,0 pMol Muster-DNA enthielten, wurden 40–60 Einheiten T7- Polymerase (Promega) verwendet. Für die Synthese von mit 4-ThioU markierter RNA wurde UTP durch 4-ThioUTP (4 mM, endgültige Konzentration) in dem Transkriptionspuffer ersetzt. 4-Thio-UTP wurde gemäß dem Verfahren von Stade, K., Rinke-Appel, J. & Brimacombe, R. Nucl. Acids Res. 17: 9889–9909 (1989) synthetisiert. Die Reinigung und Markierung der RNA wurde durchgeführt, wie in Wang et al., Biochemistry 35, 6491-6499 (1996) beschrieben.
Von Tat abgeleitete Peptide wurden mittels N-α-Fmoc-geschützter Monomere²⁴ auf einem ABI-431-Peptid-Systhetisierer synthetisiert. Nach Abspaltung des Harzes wurden die Peptide mittels HPLC auf einer Zorbax-300-SB-C₈-Säule gereinigt. Die Masse des vollkommen isolierten und gereinigten Peptids wurde durch FAB-Massenspektrometrie erfasst; 4186,8 (M + H).
Gelwanderversuche
³²P-5'-endmarkierte TAR-RNAs wurden für 3 Minuten auf 85°C erhitzt und anschließend in TK-Puffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 20 mM KCl, 0,1% Triton-X-100) auf Raumtemperatur abgekühlt. Das Tat-Peptid wurde in reiner Form oder gemeinsam mit den konkurrierenden RNAs (der natürlichen Form TAR oder als mutantes TAR) zugefügt, in TK-Puffer für 3 Minuten auf 85°C vorgewärmt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Peptid-RNA-Bindungsreaktionen wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur durchgeführt und durch Hinzufügen von 30 Glycerol angehalten. Die Peptid-RNA-Komplexe wurden auf einem nicht denaturierenden, 12%igen Acrylamidgel aufgelöst und mittels Autoradiographie oder Phosphorspektroskopie sichtbar gemacht.
Stellenspezifische Photoquervernetzungsreaktionen
Für die photochemischen Reaktionen wurde der RNA- Doppelstrang durch Hybridisierung von zwei Strängen²⁴ zubereitet. Strang 1 des Doppelstrangs wurde mit ³²P 5'-endmarkiert. Vorgeformte RNA-Doppelstränge (0,02 μM) wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit des Peptids (0,1 μM) bestrahlt (360 nm) und mittels Denaturierungsgelen nach dem in Wang et al., Biochemistry 35, 6491–6499 (1996) beschriebenen Verfahren analysiert.
Während die Erfindung hier anhand vielfältiger spezieller Materialien, Verfahren und Beispiele beschrieben und veranschaulicht wurde, versteht sich, dass die Erfindung nicht auf die speziellen Materialien, Kombinationen von Materialien und für den jeweiligen Zweck ausgewählte Verfahren beschränkt ist. Wie für den Fachmann ersichtlich, können zahlreiche Veränderungen an diesen Einzelheiten vorgenommen werden.
Es folgt eine Liste von Literaturstellen, die mit der obigen Offenbarung und insbesondere mit den experimentellen Verfahren und Erörterungen verwandt sind. Die Literaturstellen sollten dahingehend berücksichtigt werden, das auf deren gesamten Inhalt Bezug genommen ist.
Cullen, B. R. Microbiol. Rev. 56: 375–394 (1992).
Milton, R. C., Milton, S. C. & Kent, S. B. Science 256: 1445–8 (1992).
Zawadzke, L. E. & Berg, J. M. J. Am. Chem. Soc. 114: 4002 (1992).
Zawadzke, L. E. & Berg, J. M. Proteins 16: 301–5 (1993).
Schumacher, T. N. M., et al. Science 271: 1854–1857 (1996).
Dintzis, H. M., Symer. D. E., Dintzis, R. Z., Zawadzke. L. E. & Berg, J. M. Proteins 16: 306–8 (1993).
Hamy, F., et al. J. Mol. Biol. 230: 111–123 (1993).
Wang; Z. & Rana, T. M. Biochemistry 35: 6491–6499 (1996).
Wang, Z., Wang. X. & Rana, T. M. J. Biol. Chem. 271: 16995–16998 (1996).
Frankel, A. D. & Pabo, C. O. Cell 55: 1189–1194 (1988).
Nordeen, S. K. Biotechniques 6: 454–457 (1988).
Felber, B. K. & Pavlakis, G. N. Science 239: 184–187 (1988).
Milligan, J. F. Groebe. D. R., Witherell, G. W. & Uhlenbeck, O. C. Nucl. Acids Res. 15: 8783–8798 (1987). Jakobovits, A., Smith, d. h., Jakobovits, E. B. & Capon, D. J. Mot. Cell. Biol. 8: 2555–2561 (1988).
Aboul-ela, F., Karn. J. & Varani, G. J. Mol. Biol. 253: 313–332 (1995).
Calnan, B. J.; Biancalana, S.; Hudson,. D.; Frankel, A. D. Genes Dev. 1991, 5, 201–210.
Wang, Z.: Wang, X.: Rana, T. M. J. Biol. Chem. 1996, 271, 16995–16998.
Jakobovits, A.; Smith. D. H.; Jakobovits, E. B.; Capon, D. J. Mol. Cell. Biol. 1988, 8, 2555–2561.
Milligan, J. F.; Groebe, D. R.;. Witherell, G. W.; Uhlenbeck, O. C. Nucl. Acids Res. 1987. 15, 8783–8798.
Stade. K.; Rinke-Appel, J.: Brimacombe. R. Nucl. Acids Res. 1989, 17, 9889–9909.

Claims

Oligocarbamatderivat der Form
wobei: R¹ eine p-Hydroxybenzyl- oder Benzylgruppe ist; R² Wasserstoff oder Methyl ist; R³ Guanidinopropyl ist; R⁴ Aminobutyl oder Guanidinopropyl ist; und R⁵ Amidomethyl oder Amidoethyl ist; und deren biologisch und pharmazeutisch verwendbaren Salze.
Derivat nach Anspruch 1, wobei R¹ eine p-Hydroxybenzylgruppe ist.
Derivat gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei R² Wasserstoff ist.
Derivat gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei R⁴ Aminobutyl ist.
Derivat gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, wobei R⁵ Amidoethyl ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, zu der gehören: ein Oligocarbamat gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5 oder ein biologisch oder pharmazeutisch verwendbares Salz davon und ein pharmazeutisch verwendbarer Trägerstoff davon.
Derivat gemäß einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5 oder der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 6, das dazu dient, die Replikation von HIV-1 zu inhibieren.