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GEBIET DER ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft Mittel zur
Verbesserung der Mucus-Clearance,
und insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung eines nicht-sulfatierten,
Polysaccharids, wie zum Beispiel Dextran, zur Herstellung eines
Medikaments zur Verbesserung der Mucus-Clearance.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Mucus ist eine kritische Komponente
des primären
Verteidigungsmechanismus der Atemwege, indem er eingeatmete Teilchen
und mikrobielles Material zur Entfernung über das mucociliäre System
abfängt.
Wenn dieser Mechanismus versagt, in ausreichender Weise zu klären, sammelt
sich der Mucus an und muß als
Sputum abgehustet werden; andernfalls verbleibt er im Respirationstrakt
und begünstigt
eine Kolonisierung durch Mikroorganismen, welche zu einer chronischen
Lungenentzündung
und Obstruktion führen
können.
Bei cystischer Fibrose (CF) wurde die Obstruktion der Atemwege durch
Mucus lange Zeit als das am meisten heimtückische Agens für Krankheit
und Sterblichkeit angesehen. Therapien, die auf eine Verdünnung des
Mucus in den Atemwegen und eine Verbesserung seiner Fähigkeit
zur Clearance abzielten, sind nach wie vor im Mittelpunkt der Aufmerksamkeit.
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Mucus in den Atemwegen ist ein komplexes,
viskoelastisches Gel, dessen physikalische Eigenschaften für die Abwehr
in den Atemwegen bedeutend sind. Mucus ist eine variable Mischung
von Wasser, Mucus-Glycoproteinen, Ionen von niederem Molekulargewicht,
Proteinen und Lipiden. Die dreidimensionale Struktur, die das Mucusgel
bildet, ist abhängig
von der Zahl der Arten von Bindungen. Die Hauptelemente umfassen
die folgenden: 1) Disulfid-Bindungen – diese kovalenten Verknüpfungen
sind hauptsächlich
intramolekular, und verbinden Glycoproteinuntereinheiten in ausgedehnten
makromolekularen Ketten, die als Mucine bekannt sind. 2) Aufgrund
ihrer ausgedehnten Größe bilden
diese Mucinpolymere leicht Verwicklungen mit benachbarten Makromolekülen. Diese
wirken als zeitabhängige
Vernetzungen, welche einem mechanischen Abbau zugänglich sind.
3) Die Zuckereinheiten, die die Oligosaccharidseitenketten ausmachen
(etwa 80% des Mucingewichtes) bilden Wasserstoffbrückenbindungen
mit komplementären
Einheiten auf benachbarten Mucinen. Obwohl jede Bindung schwach
ist und leicht dissoziiert, macht die Anzahl dieser Bindungsstellen
diese Art von Bindung potentiell sehr bedeutend. 4) Mucine sind
ebenfalls ionisiert, und enthalten sowohl positiv geladene Aminosäurereste
ebenso wie negativ geladene Zuckereinheiten, grundsätzlich Sialinsäure und
sulfatierte Reste. Diese nehmen bei einer Atemwegserkrankung im
allgemeinen zu, und bei cystischer Fibrose wird der Anteil sulfatierter
Reste aufgrund der Veränderungen
in der Glycosyltransferase-Aktivität, innerhalb des Golgi-Apparats
weiter erhöht.
Die ionischen Wechselwirkungen zwischen den festen negativen Ladungen
führen
zu einer steiferen, weiter ausgedehnten makromolekularen Konformation,
indem sie in wirksamer Weise die Polymergröße erhöhen und die Anzahl der Verwicklungen
vermehren. 5) Zusätzlich
zu diesem treten bei Atemwegserkrankungen, die sich durch Infektion
und Entzündung
auszeichnen, insbesondere bei cystischer Fibrose, die Extranetzwerke
aus DNA von hohem Molekulargewicht und Aktinfilamenten auf, die
durch sterbende Leukozyten freigesetzt werden, und Exopolysacchariden,
die von den Bakterien sezerniert werden.
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Einer der primären Aspekte der derzeitigen
Behandlung von CF-Lungenkrankheit
hat zum Ziel, die physikalischen Eigenschaften der Lungensekrete
zu verändern,
um deren Clearance aus den Atemwegen zu verbessern. Die erfolgreichste
Therapie bei cystischer Fibrose und das einzige mucoaktive Agens
mit nachgewiesener Wirksamkeit ist rh-DNase. Die Behandlung mit
rh-DNase basiert auf der Tatsache, daß der Haupt-Faktor, der an
der erhöhten
Viskoelastizität
von CF-Sputum beteiligt ist, auf die Präsenz von bloßer DNA zurückzuführen ist,
die von Bakterien, Neutrophilen und andere cellulären Bestandteilen
in die Oberflächenflüssigkeit
der Atemwege (ASF) abgegeben wird. Enzymatischer Abbau dieser DNA-Makromoleküle setzt
in wirksamer Weise die Mucus-Viskoelastizität sowie die Fähigkeiten,
Spinnfäden
zu bilden, herab, und verstärkt die
Fähigkeit
zur Clearance der Atemwegssekrete. Andere direkt wirkende mucolytische
Behandlungen, wie zum Beispiel N-Acetylcystein-Derivate, Gelsolin
und hypertonische Saline, sind in vitro bei CF wirksam, müssen jedoch
nicht notwendigerweise klinische Wirksamkeit zeigen. Indirekte Mucolyse,
wie zum Beispiel mit inhaliertem Amilorid, welches die Aufnahme
von Salz und Wasser durch das Atemwegsepithel blockiert, ist eine Strategie,
die zum Ziel hat, das Ausmaß der
Hydratisierung zu steigern und den makromolekularen Bestandteil des
ASF zu verdünnen.
Kombinierte mucokinetische Therapien können zum Ziel haben, mehr als
einen Mechanismus anzusprechen, der an der Kontrolle der Mucus-Sekretion
und Clearance der Atemwege beteiligt ist.
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DNase, Gelsolin und Acetylcystein-Derivate
sind alle in ihrer Wirkung ähnlich
dergestalt, daß sie
das dreidimensionale Netzwerk durch Mucolyse oder durch Spaltung
des Molekulargewichtes abbauen. Dies neigt vorzugsweise dazu, die
Elastizitätsbestandteile
des Netzwerkes (im Gegensatz zur Viskosität) zu beeinflussen, welche
in Modellstudien die Husten- oder die Luftströmungs-Clearance mehr als die
Clearance durch Wirkung der Lilien verbessern. Agentien, welche
die Wechselwirkungen durch ionische Ladungen und Wasserstoffbrückenbindungen
beeinflussen, sind andererseits nicht reine mucolytische Agentien,
da sie die Vernetzungsdichte verändern,
ohne die Polymerkettenlänge
zu reduzieren, deren Ergebnis eine gemeinsame Reduktion sowohl der
Elastizität
und der Viskosität
ist, und gemäß den Modellstudien
eine bevorzugte Verbesserung der Lilien-Clearance.
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Ionische Agentien, wie zum Beispiel
Natriumchlorid, werden für
mucoaktiv gehalten, indem sie die festen Ladungen entlang der makromolekularen
Kerne des Mucinpolymers abschirmen, wodurch sie es weniger steif
und weniger ausgedehnt machen, und somit die Anzahl der Verwickelungs-Vernetzungen
mit benachbaren Makromolekülen
reduzieren. Wills et al (J Clin Invest 1997; 99: 9–13) offenbaren,
daß das
Ausmaß der Vernetzungsreduktion
in einer Beziehung zur Innenstärke
im Bereich von 0 bis 500 mOsm NaCl steht. Nichtionische Agentien,
wie zum Beispiel Zucker, wurden ebenfalls vorgeschlagen, um die
Mucus-Clearance durch Erhöhung
der Osmolarität
zu verbessern. Wills et al (J Clin Invest, siehe oben) offenbaren,
daß die
Erhöhung der
Sputum-Osmolarität durch
Zugabe von Nicht-Elektrolyten, wie zum Beispiel Glucose, Mannitol
und Harnstoff, die Fähigkeit
des Cilien-Transports erhöht.
PCT-Veröffentlichtung
Nr. WO 95/22993, veröffentlicht
am 31. August 1997, offenbart in ähnlicher Weise eine Erhöhung der
Mucocilien-Clearance durch Inhalation einer Substanz, die zur Veränderung
der Osmolarität
der Oberflächenflüssigkeit
der Luftwege fähig
ist, einschließlich Zucker.
Andererseits offenbart die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 95/28944,
veröffentlicht
am 2. November 1995, daß nicht-ionisierbares
Material, wie zum Beispiel Glucose, bei der Verbesserung der Sputum-Transportabilität nicht
wirksam ist.
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WO 91/15216 offenbart die Verwendung
von polysulfatierten Polysacchariden, einschließlich polysulfatiertem Dextran,
für die
Behandlung von humanen Leukocytenelastase-behandelten Krankheiten.
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Dextran ist ein bakterielles Nebenprodukt;
das Dextranmakromolekül
besteht aus End-zu-End-verknüpften
Glucangruppen. Seine primäre
klinische Verwendung besteht in der Expansion des Plasmavolumens und
als ein antithrombotisches Agens, welches Antiaggregationswirkungen
besitzt. Es wurde ebenfalls gezeigt, daß Dextran antiadhäsive Eigenschaften
auf den Epithelzellen der Atemwege besitzt, welche es wertvoll als
ein antimikrobielles Agens bei der Prävention der Pseudomonasinfektion
in CF-Patienten macht (US-Patent Nr. 5,514,665, erteilt am 7. Mai
1996 an Speert et al; Barghouthi et al Am J Respir Crit Care Med
1996; 154: 1788–1793).
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Es wurde nunmehr gefunden, daß Dextran
die Mucus-Viskoelastizität
herabsetzt und die Fähigkeit
zur Clearance durch Muco-Cilien
steigert. Die vorliegende Erfindung betrifft dieses unerwartete
Auffinden, daß Dextran
und andere Polysaccharide zur Verbesserung der Mucus-Clearance verwendet
werden können.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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In einem Aspekt betrifft diese Erfindung
die Verwendung eines nicht-sulfatierten Polysaccharids zur Herstellung
eines Medikaments zur Verbesserung der Mucus-Clearance.
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In einem weiteren Aspekt betrifft
diese Erfindung die Verwendung eines nicht-sulfatierten Polysaccharids
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Lungenkrankheit,
die mit einer verschlechterten Mucus-Clearance einhergeht.
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In einem Aspekt betrifft diese Erfindung
die Anwendung eines Verfahrens zur Verbesserung der Fähigkeit
der Mucus-Clearance in einem Patienten mit cystischer Fibrose, umfassend
die Verabreichung einer wirksamen Menge von Dextran an den Atemwegstrakt
des besagten Patienten, der eine solche Behandlung nötig hat.
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Vorzugsweise wird das Molekulargewicht
des verabreichten Polysaccharids weniger als etwa 500.000, und mehr
bevorzugt weniger als etwa 250.000, und am meisten bevorzugt weniger
als etwa 2.000 betragen.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1A ist
eine Zeichnung, die die Wirkung einer Dextranbehandlung auf die
Viskoelastizität
von Sputum-Proben aus CF-Patienten zeigt. 18 ist
eine Zeichnung, die die Wirkung der Dextranbehandlung auf die Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance von Sputum-Proben von CF-Patienten zeigt. Sputum-Proben
wurden von 7 CF-Patienten erhalten, die nicht unter rh-DNase-Therapie standen.
Aliquote von Sputum wurden bei 37°C
für 30
Minuten entweder mit Ringer-Lösung
(10% zugegebenes Volumen) oder USHERDEX 4 (DEX) inkubiert, um eine
Endkonzentration von 0,4% zu erreichen. Das Starrheitsmodul (Viskoelastizität) wurde
durch magnetische Rheometrie bestimmt, und die Fähigkeit zur mucociliären Clearance
wurde durch Beobachtung der Geschwindigkeit des Sputum-Transports
auf ausgeschnittenen Frosch-Gaumen bestimmt. (* bezeichnende Abweichung
von der Basislinie; ÷ bedeutende
Abweichung von Ringer).
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2A ist
eine Zeichnung, die die Wirkung von 0,4%-iger und 4%-iger Dextranbehandlung
auf die Viskoelastizität
von Sputum-Proben von CF-Patienten zeigt. 2B ist
eine Zeichnung, die die Wirkung von 0,4%-iger und 4%-iger Dextranbehandlung
auf die Fähigkeit
der Spinnbarkeit von Sputum-Proben aus CF-Patienten zeigt. Sputum-Proben
wurden von 8 GF-Patienten, die keine rhDNase erhalten haben, erhalten.
Aliquote des Sputums wurden bei 37°C für 30 Minuten lang mit Ringer
(10 zugegebenes Volumen) oder USHERDEX 4 (DEX) inkubiert, um Endkonzentrationen
von 0,4% (4 mg/ml oder 4% (40 mg/ml) zu erhalten. Das Starrheitsmodul
(Viskoelastizität)
wurde durch magnetische Rheometrie bestimmt, und die Spinnbarkeit
wurde durch ein Fadenmeßgerät (filancemeter)
bestimmt. (* bezeichnende Abweichung von Ringer; ÷ bezeichnende
Abweichung von DEX 0,4%).
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3A zeigt
die Korrelation zwischen der Spinnbarkeit und der Viskoelastizität. 3B zeigt die Korrelation zwischen der
Spinnbarkeit und der Fähigkeit
zur Clearance durch Husten. Die Spinnbarkeit des Sputums wurde durch
ein Fadenmeßgerät (filancemeter)
bestimmt, und der Starrheitsmodul (Viskoelastizität) wurde
durch magnetische Rheometrie bestimmt, und die Fähigkeit zur Clearance durch
Husten wurde aus den viskoelastischen Daten vorhergesagt. Eine negative
Korrelation zwischen der Spinnbarkeit und MCI (mucociliärer Index
für die
Fähigkeit
zur Clearance) wurde ebenso erhalten (p = 0,0138).
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4 ist
eine Zeichnung, die die Wirkung von 0,4%-iger und 4%-iger Dextranbehandlung
auf die Viskoelastizität
von Mucus zeigt, der von gesunden Hunden erhalten wurde. Mucus aus
der Luftröhre
wurde aus 7 gesunden anästhesierten
Hunden aus der Luftröhren-Manschette
gewonnen. Aliquote des Mucus wurden bei 37°C für 30 Minuten lang mit Ringer
(10% zugegebenes Volumen) oder USHERDEX 4 (DEX) inkubiert, um eine
Endkonzentration von 0,4% (4 mg/ml) oder 4% (40 mg/ml) zu erhalten.
Das Starrheitsmodul (Viskoelastizität) wurde durch magnetische
Rheometrie bestimmt. (* bezeichnende Abweichung von der Ringer-Behandlung).
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5 ist
eine Zeichnung, die die Wirkung von unterschiedlichen Molekulargewichten
von Dextran auf die Viskoelastizität der Sputum-Proben von CF-Patienten
zeigt. (* bezeichnende Abweichung von der Ringer-Behandlung).
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GENAUE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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In der vorliegenden Erfindung ist
gezeigt worden, daß Dextran
die Viskoelastizität
reduziert und die Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance des Sputums, das von CF-Patienten erhalten wurde, in vitro
erhöht,
und daß die
Wirkungen dosisabhängig
waren. Eine Verabreichung von 4% und 0,4% Dextran führte zu
einer abnehmenden Spinnbarkeit und Viskoelastizität, und die
Wirkungen waren größer bei
der höheren
Dextrankonzentration. Die vorhergesagte Fähigkeit zur mucociliären Clearance
und die Fähigkeit
zur Clearance durch Husten verbesserten sich signifikant bei beiden
Konzentrationen und keine signifikante Dosisabhängigkeit wurde mit diesen abgeleiteten
Parametern beobachtet. Die Behandlung eines CF-Patienten mit Dextran
führte zu
einer abnehmenden Sputum-Viskosität und erhöhte die vorhergesagte Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance und die Fähigkeit
zur Clearance durch Husten.
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Diese Wirkungen des Dextrans sind
nicht spezifisch für
die CF-Lungenkrankheit,
und Dextran reduzierte signifikant die Viskoelastizität vom Mucus
gesunder Hunde sowohl in vitro als auch in vivo. Die vorliegende
Erfindung ist daher nicht darauf beschränkt, die Fähigkeit zur Mucus-Clearance
in CF-Patienten zu verbessern, und kann dazu verwendet werden, andere
Krankheiten, die mit einem Defekt in der Mucus-Clearance der Atemwege
einhergehen, einschließlich
chronischer Bronchitis, Bronchiektasie, bronchiales Asthma, Mucus-Retention,
Mucus-Hypersekretion und reduzierte mucociliäre Clearance, zu behandeln.
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Die Wirkungen von Dextran, einem
neutralen Polymer, sind jenen einer Natriumclorid-Behandlung ähnlich,
da beide Formen der Behandlung die Sputum-Viskoelastizität in vitro
reduzieren. Jedoch glaubt man, daß das Dextran der vorliegenden
Erfindung die Viskoelastizität
durch Konkurrenz die Wasserstoffbrückenbindestellen mit anderen
Mucus-Glycoproteinen reduziert, was zu einer Substitution durch
Dextrankohlehydrat-Einheiten von Oligosaccharid-Einheiten führt, die
an die Mucin-Peptide mit hohem Molekulargewicht gebunden sind, welche
das Mucus-Gel ausmachen. Für
das Dextran mit geringerem Molekulargewicht (am meisten bevorzugt
im Bereich von 2.000 oder weniger) sind diese neuen Wasserstoffbrückenbindungen
strukturell und rheologisch unwirksam, so daß die die gesamte Vernetzungsdichte
reduzieren. Man glaubt, daß diese
Reduktion in der Vernetzung des dreidimensionalen Mucus-Glycoproteinnetzwerkes
die Mucus-Clearance
durch Lilien und Husten-Mechanismen verbessert.
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Dextran kann an den Atemwegstrakt
in der bekannten Weise verabreicht werden, einschliefllich eines Nebulizers über die
Luftröhre,
oder topisch, unmittelbar auf die Schleimhaut. Dextran kann unter
Beimischung mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel
oder Träger
verabreicht werden.
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Verträgliche Verdünnungsmittel oder Träger umfassen
Natriumchlorid- oder Ringer-Lösung,
L-Arginin oder Lysin und deren Salze. Vorzugsweise wird Dextran
mit einem Molekulargewichtsbereich von etwa 360 bis 4.000 verabreicht
werden. Dextran mit einer Endkonzentration von 4 mg/ml und 40 mg/ml
in den Atemwegs-Sekreten kann die gewünschte therapeutische Wirkung
erzielen. Die Konzentration von 4 mg/ml Dextran in den Atemwegssekreten
ist erreichbar mit einer Aerosolzufuhr von 80 mg/ml Dextranlösung, beruhend
auf Modellberechnungen. Dextran kann zwei- oder dreimal täglich verabreicht
werden, und die Häufigkeit
wird von dem individuellen Bedürfnis
des Patienten abhängen.
Andere geeignete Verabreichungsformen, Häufigkeit und Arten der Verabreichung
werden dem Fachmann ersichtlich werden.
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Man führt den Mechanismus für die Verbesserung
der Viskoelastizität
durch Dextran-Verabreichung auf die Substitution der Dextranbausteine
in Wasserstoffbrückenbindestellen
zurück,
die sonst durch Oligosaccharid-Einheiten besetzt sind, welche an
benachbarte Peptide mit hohem Molekulargewicht gebunden sind. Die
ursprünglichen
intermolekularen Mucin-Mucin-Bindungen tragen zu der dreidimensionalen
Struktur bei, welche das Mucus-Gel
ausmacht, während
die neuen Mucin-Dextran-Bindungen aufgrund der verhältnismäßig geringen
Länge des
Dextran-Polymers unwirksame Vernetzungen ausbilden. Andere Polysaccharide
mit einer ähnlichen
Anzahl von Wasserstoffbrückenbindestellen
wie das Dextran der vorliegenden Erfindung, oder die Zuckereinheiten
enthalten, welche stereochemisch die Oligosaccharid-Einheiten, wie
sie natürlich
in den Mucinen des Atemwegstraktes vorkommen, ergänzen, einschließlich der
Oligomere von Galactose und Fucose und der Aminozucker Glucosamin
und Galactosamin, glaubt man, daß sie um die Wasserstoffbrückenbindestellen
im Mucus-Gel konkurrieren, indem sie sich gegenseitig er gänzende Wechselwirkungen
mit den Oligosaccharid-Seitenketten der Mucinmakromoleküle ausbilden
und dadurch die gesamte Vernetzungsdichte des Mucus-Gels herabsetzen.
Diese Polysaccharide können
bei geeigneter Dosierung in der bekannten Weise an Patienten verabreicht
werden, die unter Krankheiten leiden, welche mit einem Defekt in
der Mucus-Clearance der Atemwege einhergehen, einschließlich CF,
chronischer Bronchitis, Bronchiektasie und bronchialem Asthma.
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Die vorliegende Erfindung wird weiterhin
anhand der folgenden Experimente ersichtlich. Darüber hinaus
kann ein Fachmann leicht ermessen, daß zahlreiche Modifikationen
zu den beschriebenen Ausführungsformen
gemacht werden können,
ohne vom Umfang und dem Geist der Erfindung abzuweichen. Solche
Modifikationen sollen ebenfalls in den Rahmen der Erfindung fallen.
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BEISPIEL 1
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Materialien und Methoden:
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Subjekte – Sputum-Proben wurden durch
freiwillige Expektoration von 15 heranwachsenden und jungen erwachsenen
Patienten mit CF erhalten. Diese Patienten waren alle mit Pseudomonas
aeruginosa infiziert. Keiner der Patienten war unter laufender Behandlung
mit rh-DNase. Die Erlaubnis, Sputum für diese in vitro-Analyse zu
sammeln und zu verwenden, wurde von der University of Calgary Research
Ethics Board gegeben.
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Hunde-Mucus wurde von gesunden, anästhesierten
Hunden mittels einer Luftröhren-Manschette
erhalten. Dextran (USHERDEX 4; Handelsname) wurde von Polydex Pharmaceuticals
Ltd. geliefert (Toronto, ON, Kanada). USHERDEX 4 wurde mit HPLC
analysiert und enthält
Dextranoligomere von zwei Einheiten (Dimer) bis 19 Einheiten (19-mer).
USHERDEX 4-Dextran besitzt ein Molekulargewicht im Bereich von etwa
360 bis etwa 4.000.
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Planung der Studie – Protokoll
A (CF-Sputum – 0,4%
Dextran): Sieben Proben von Sputum (0,40 bis 0,60 g) wurden wie
folgt behandelt:
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- i) Aliquot für die Grundlinie (keine in
vitro-Behandlung),
- ii) Aliquot für
die Negativkontrolle, Zugabe von 10% Vol.-Ringer-Lösung und Inkubation für 30 Minuten
bei 37C,
- iii) Anwendung von 10% Vol. Ringer-Lösung, die 40 mg/ml USHERDEX
4 enthält,
um eine Endkonzentration von 0,4% (4 mg/ml) im Sputum zu ergeben;
die Probe wurde für
30 Minuten bei 37 C inkubiert.
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Protokoll B (CF-Sputum Dosis-Reaktion):
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Acht Proben von Sputum (0,40 bis
0,60 g) wurden wie folgt behandelt:
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- i) Aliquot für Negativkontrolle, Zugabe
von 10% Vol. Ringer-Lösung und
Inkubation für
30 Minuten bei 37 C,
- ii) Anwendung der Ringer-Lösung,
die 40 mg/ml USHERDEX 4 enthält,
um eine Endkonzentration von 0,4% (4 mg/ml) im Sputum zu ergeben,
- iii) Anwendung der Ringer-Lösung,
die 400 mg/ml USHERDEX 4 enthält,
um eine Endkonzentration von 4% (40 mg/ml) im Sputum zu ergeben.
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Protokoll C (tracheale Hunde-Mucus-Dosisreaktion):
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Sieben Proben von trachealem Hunde-Mucus
(etwa 0,1 g) wurden wie folgt behandelt:
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- i) Aliquot für Negativkontrolle, Zugabe
von 10% Vol. Ringer-Lösung, 30
Minuten inkubiert bei 37°C,
- ii) Anwendung der Ringer-Lösung,
die 40 mg/ml USHERDEX 4 enthält,
um eine Endkonzentration von 0,4% (4 mg/ml) im Sputum zu ergeben,
30 Minuten inkubiert bei 37°C,
- iii) Anwendung der Ringer-Lösung,
die 400 mg/ml USHERDEX 4 enthält,
um eine Endkonzentration von 4% (430 mg/ml) im Sputum zu ergeben,
30 Minuten inkubiert bei 37 C.
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Mucociliäre Transportierbarkeit auf
einem Froschgaumens (FMT, frog palate mucociliary transportability):
Diese wurde bestimmt aus der Bewegung von CF-Sputum auf dem mit
Cilien ausgestatteten, von Mucus befreiten Froschgaumen, relativ
zur natürlichen
Frosch-Kontrolle, (native frog control) (relative Geschwindigkeit
(FMT), ausgedrückt
als Bruchteil). Die Bewegung eines 2–5 μl Aliquots von CF-Sputum wurde
zeitlich gemessen; 5 Messungen der Sputum-Transportrate wurden genommen,
um die Varianz der Messung zu minimieren. FMT wurde nur für die Proben
im Protokoll A bestimmt.
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Rheologische Messungen mit CF-Sputum:
in dieser in vitro-Studie wurden zwei Techniken verwendet, um die
rheologischen Eigenschaften des Sputums zu messen: die Spinnbarkeit
durch ein Filancemeter und die Viskoelastizität durch magnetische Rheometrie.
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Die Spinnbarkeit ist die Fähigkeitkeit
des Mucus, unter dem Einfluß einer
elastischen Deformation von geringer Amplitude Fäden zu bilden. Die Spinnbarkeit
von CF-Sputumproben wurde unter Verwendung eines Filancemeters (SEFAM,
Nancy, Frankreich) gemessen, bei dem 20 bis 30 μl Mucus-Probe bei einer Ablenkungsgeschwindigkeit
von 10 mm/s gedehnt werden. Ein elektrisches Signal, das durch die
Mucus-Probe geleitet wird, wird an dem Punkt unterbrochen, an dem
der Mucus-Faden zerrissen wird. Die Länge dieses Fadens ist als die
Mucus-Spinnbar keit (gemessen in mm) bekannt. Die Spinnbarkeit wurde
nur für
Sputum-Proben in Protokoll B bestimmt.
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Die Viskoelastizität und Clearance-Indices:
die magnetische Mikrorheometertechnik wurde verwendet, um die Viskosität und Elastizität von Sputum-Proben
zu messen. Eine 100 μm-Stahlkugel
wurde in eine Sputum-Probe von 5 bis 10 μl positioniert, und die Bewegung
dieser Kugel unter dem Einfluß eines
Elektromagneten wurde herangezogen, um die rheologischen Eigenschaften
des Sputums zu bestimmen. Das Bild der Stahlkugel wurde mittels
eines Mikroskops auf ein Paar Photozellen projiziert, deren Output
vergrößert und
an ein Oszilloskop übertragen
wurde. Durch Auftragen der Verschiebung der Kugel gegen die magnetische
Antriebskraft wurden die viskoelastischen Eigenschaften des Sputums
festgestellt.
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Die Parameter der bestimmten Mucus-Viskoelastizität waren
der Rigiditätsindex
oder mechanische Impedanz, das heißt G*, die hier auf einer logarithmischen
Skala dargestellt ist, ausgedrückt
als Vektorsumme von „Viskosität + Elastizität". Zwei
abgeleitete Parameter – Index
der Fähigkeit
mucociliärer
Clearance (MCI, mucociliary clearbility Index) und Index der Fähigkeit
der Clearance durch Husten (CCI, cough clearability Index) – wurden
aus den in vitro-Beziehungen berechnet. Diese beiden Indices sagen
die Fähigkeit
zur Mucus-Clearance durch ciliäre
bzw. Hustenmechanismen voraus, basierend auf den gemessenen rheologischen Eigenschaften
und Beobachtungen der Clearance aus Modellstudien. Die jeweiligen
Formeln lauten wie folgt: MCI = 1,62 – (0,22 × log G*
l) – (0,77 × tanδ 1) CCI = 3,44 – (1,07 × log G* 100) + (0,89 × tanδ 100)
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Statistische Analysen – die Daten
aus jedem Protokoll werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD)
vom Mittelwert dargestellt. Um die Signifikanz der Veränderung
bezüglich
der Spinnbarkeit, log G * bei 1 rad /s, MCI, und CCI nach Verabreichung
der Ringerkontrolle, 0,4% Dextran und 4% Dextran zu analysieren, diente
das Sputum eines jeden Patienten als seine eigene Kontrolle. Die
Gleichheit der Mittelwerte wurde getestet durch Analyse der Varianz
(ANOVA), post hoc-Analyse der Veränderungen von der Grundlinie
wurden bestimmt durch den zweiteiligen, gepaarten T-Test und Regression.
Der gepaarte T-Test
wurde ebenso verwendet, um die Unterschiede zwischen Spinnbarkeit
und Viskoelastizität
nach verschiedenen Behandlungen zu bestimmen. Die Regression wurde
verwendet, um die Korrelation zwischen Spinnbarkeit und Viskoelastizität zu bestimmen.
Das statistische Programmpaket StatView (Abacus Concepts, Palo Alto,
CA) wurde verwendet, um diese Analysen auszuführen.
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Ergebnisse:
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In Protokoll A nahm nach Verabreichung
von 0,4% USHERDEX 4 die Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance auf Froschgaumen signifikant zu (p = 0,046) verglichen
mit der Ringerkontrolle (1B). Hier
gab es einen moderaten Verdünnungseffekt
(Reduktion in der Mucus-Starrheit), einhergehend mit der Ringerbehandlung,
und eine weitere Reduktion aufgrund des Dextrans (signifikante w.
r. t. keine Behandlung, p = 0,004) (1A).
Die Fähigkeit
zur Clearance durch Husten (CCI, cough clearability Index, vorhergesagt
aus der Rheologie) nahm ebenso signifikant zu (p = 0,019). Die Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance auf einem Froschgaumen nahm mehr zu als von der Rheologie
vorhergesagt, diese zusätzliche
Fähigkeit
zur Clearance könnte ein
Hinweis auf einen Oberflächen-
oder Antihafteffekt sein.
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Nach den anfänglichen Tests, die nahelegten,
daß USHERDEX
4 direkte, möglicherweise
förderliche Wirkungen
auf das GF-Sputum hat, führten
wir weitere Experimente aus, um die Dosisabhängigkeit der Wirkungen zu erforschen
(Protokoll B), und ob nicht-infizierter Mucus von USHERDEX 4 ebenso
beeinflußt
wird (Protokoll C).
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In Protokoll B nahm die CF-Sputum-Spinnbarkeit
im Vergleich zur Kontrolle mit Saline um 34,2% nach Verabreichung
von 0,4% Dextran (p = 0,0121) und 59,8% nach Verabreichung von 4%
Dextran (p = 0,0016) ab (2B). Darüber hinaus
war die Abnahme in der Spinnbarkeit nach 4% Dextran größer als
diejenige, die nach 0,4% (p = 0,0046) gesehen wurde. Zur selben
Zeit wurde die Mucus-Viskoelastizität (log G*1) um einen Faktor
von 2,43 (0,385 logarithmische Einheiten) durch 0,4% Dextran (p
= 0,0404) und um den Faktor 4,57 (0,660 logarithmische Einheiten)
durch 4% Dextran (p = 0,0069) reduziert ( 2A).
Die zusätzliche
Reduktion der Mucus-Viskoelastizität, welche bei höherer Dextrankonzentration
beobachtet wurde, war ebenso signifikant (p = 0,0193). Die Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance (MCI, mucociliary clearability) und die Fähigkeit zur
Clearance durch Husten (CCI, cough clearability) (beide aus der
Rheologie vorhergesagt) verbesserten sich signifikant in beiden
Behandlungsgruppen (MCI: p = 0,0252, p = 0,003; CCI: p = 0,0227,
p = 0,0423), obwohl keine signifikante Dosisabhängigkeit bei diesen abgeleiteten
Parametern festgestellt wurde. Es existierte eine positive Beziehung
zwischen der Spinnbarkeit und der Viskoelastizität (3A)
ebenso wie negative Korrelationen zwischen der Spinnbarkeit und
der vorhergesagten mucociliären
Clearance und der Husten-Clearance (3B).
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In Protokoll C wurde die Viskoelastizität von Mucus
von gesunden Hunden signifikant herabgesetzt durch Behandlung mit
0,4% Dextran (log G* = 0,269, p = 0,0048) und mit 4% Dextran log
G* = 0,547, p = 0,0016) im Vergleich zur Kontrolle mit Saline (4). Die Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance (vor- hergesagt aus der Rheologie) nahm nur für 4% Dextran
(p = 0,0108) signifikant zu. Die Fähigkeit zur Clearance durch Husten
(vorhergesagt aus der Rheologie) nahm signifikant in beiden Behandlungsgruppen
(p = 0,0385; p = 0,0459). Die zusätzliche Reduktion in log G*
zwischen Behandlungen mit 0,4 % und 4% Dextran erreichte keine statistische
Signifikanz (p = 0, 09) .
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Unabhängig von CF-Sputum oder Mucus
von gesunden Hunden, reduzierte allgemein eine Behandlung mit USHERDEX
4 signifikant die Viskoelastizität
und erhöhte
die vorhergesagte Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance und die Fähigkeit
zur Clearance durch Husten. Diese Wirkung des Dextrans war dosisabhängig, wobei
sie signifikant größer für eine Behandlung
mit 4%-igem Dextran war. als für
eine Behandlung mit 0,4 % Dextran. Es gab keine große Korrelation
zwischen der Mucus-Transportfähigkeit
auf Froschgaumen und der Mucus-Viskoelastizität, jedoch bestand eine signifikante
Korrelation zwischen der Spinnbarkeit und der Mucus-Viskoelastizität (p = 0,0012),
der Spinnbarkeit und der Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance (p = 0,0138), sowie der Fähigkeit zur Clearance durch
Husten (p = 0,004) (beide vorhergesagt aus der Rheologie) (3).
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BEISPIEL 2
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Die Wirkung des Molekulargewichtes
des Dextrans auf die Rigidität
des CF-Sputums:
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Verfahren:
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Sputum-Proben wurden von 8 CF-Patienten
erhalten, die keine rh-DNase erhalten haben (Pulmozyme®)-Aliquote
von Sputum wurden bei 37 C 30 Minuten lang mit Ringer-Verdünnung (10%
des zugegebenen Volumens) oder mit drei Dextranen von verschiedenen
Molekulargewichten, das heißt
USHERDEX 4 (durchschnittliches Molekulargewicht von 1.800), Dextran
70.000 und Dextran 500.000, um eine Endkonzentration von 4% (40
mg/ml) zu erreichen. Der Rigiditätsmodul
(Viskoelastizität)
wurde durch magnetische Rheometrie bestimmt.
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Ergebnisse:
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Das Dextran mit dem höchsten Molekulargewicht
hatte keine signifikante Wirkung auf die Mucus-Viskoelastizität, während die
Wirkung von USHERDEX 4 mit der vergleichbar ist, die früher in Beispiel
1 gezeigt worden ist. Die mittlere Fraktion hatte eine mittlere
Wirkung (5).
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BEISPIEL 3
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Wirkungen des Dextrans auf
Hunde-Mucus
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Verfahren:
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Gesunde Mischlingshunde wurden mit
Pentobarbital anästhesiert
und intubiert. Nach 30 Minuten Verabreichung von Ringer-Aerosal
wurde die tracheale mucociliäre
Geschwindigkeit (TMV, tracheal mucociliary velocity) durch Holzkohleteilchen-Transport)
unter bronchoskopischer Kontrolle gemessen, und Mucus für die Viskoelastizitäts-Analyse
(magnetisches Rheometer) wurde mittels der endotrachealen Röhrenmethode
gesammelt. Dann wurde Dextran mit niederem Molekulargewicht (Polydex
Pharma, Charge #2764, Molekulargewichtsbereich von etwa 360 bis
etwa 4000) im Ringervehikel als Aerosol in die Luftröhre verabreicht
und es folgten dieselben Verfahrensschritte. Wir führten 8
Experimente in 8 Hunden durch, unter Verwendung einer 30-minütigen Verabreichung
von Dextran-Aerosol; alle Hunde erhielten Aerosole von 20 mg/ml,
65 mg/ml und 200 mg/ml Dextran.
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Ergebnisse:
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Verglichen mit der Ringerkontrolle
nahm die TMV um 145% gegenüber
der Kontrolle (p = 0,0417) bei 65 mg/ml Dextran zu. Es gab nur einen
mäßigen Anstieg
in der TMV bei 20 mg/ml und eine Abnahme in der TMF mit 200 mg/ml
Dextran. Die Mucus-Viskoelastizität nahm signifikant auf 35%
der Kontrolle ab (0,425 logarithmische Einheiten, p = 0,0426) bei
65 mg/ml. Diese in vivo Daten stützen
die in vitro gemachten Befunde, daß Dextran mit geringem Molekulargewicht
die Mucus-Viskoelastizität
herabsetzt und die mucociliäre
Clearance steigert.
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BEISPIEL 4
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Wechselwirkung von Dextran mit L-Arginin
auf die tracheale Mucus-Sekretion und Clearance in Hunden.
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Verfahren:
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Arginin/Arginin-HCl wurde zubereitet
wie von Solomons (Pediatrics 1971; 47: 384) beschrieben, indem eine
Stammlösung
von 290 mOsm, pH 7,4 hergestellt wurde. Zwei Verdünnungen
wurden zubereitet, 97 und 29 mOsm, wobei der Rest Ringer-Lösung war.
Die Lösungen
wurden über
einen Pari-Strahlvernebeler 8 gesunden Mischlingshunden zugeführt, die
mit Pentobarbital anästhesiert
und intubiert waren. Nach 30 Minuten Verabreichung von Ringer-Aerosol
wurde die tracheale Mucus-Geschwindigkeit (TMV, durch den Holzkohlenteilchen-Transport)
und die Potentialdifferenz (PD, potential difference, über eine
Agarbrücke)
unter bronchoskopischer Kontrolle gemessen, und Mucus für eine Viskoelastizitätsanalyse
(magnetisches Rheometer) wurde auf dem endotrachealen Tubus gesammelt.
Bei einer Gelegenheit wurde eine zunehmende Argininkonzentration
stündlich
als Aerosol verabreicht, gefolgt von der Ringerkontrolle. Bei einer
zweiten Gelegenheit wurden dieselben Argininlösungen verwendet, jedoch mit
65 mg/ml zugesetztem Dextran von niederem Molekulargewicht (Polydex,
Charge #2764).
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Ergebnisse:
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Gepuffertes L-Arginin wurde als eine
mucolytische Behandlung (Solomons, Pediatrics 1971; 47: 384) beschrieben,
obwohl seine Wirksamheit unsicher bleibt.
Jedoch ist Arginin ein Vorläufer
von Stickoxid, einem kritischen Mediator in vielen cellulären Prozessen
einschließlich
der Schleimsekretion, und es gibt einen Hinweis, daß Arginin
und die verwandte Aminosäure
Lysin den transepithelialen Wasserfluß über die apicalen Chloridkanäle stimulieren
kann, und dabei die Hydratation der Atemwegsflüssigkeit erhöhen kann.
Wenn Lysin zum klassischen Mucolyticum N-Acetylcystein gegeben wird,
wird die mucokinetische Wirkung in der Tat verstärkt, zumindest teilweise durch
Stimulation des epithelialen Chloridtransfers (Tomkiewicz, Pulm
Pharm 1995, 8: 259). In Anbetracht dieser Überlegungen entschlossen wir
uns, die Kombination von Arginin und Dextran zu studieren, um zu
sehen, ob die mucokinetische Wirkung des Dextrans durch gleichzeitige
Anwendung von Arginin gesteigert werden kann, oder ob Arginin selbst
tatsächlich
eine signifikante mucolytische Aktivität besitzt. Im Vergleich zur
Ringer-Lösung
nahm die Lumen-negative Potentialdifferenz fortschreitend mit zunehmendem Arginin
ab, mit oder ohne zugegebenem Dextran (von –1,43 ± 1,4 mV bis –20,1 ± 3,6 mV),
TMV nahm im Durchschnitt zu, jedoch nicht signifikant (11,9 ± 2,2 bis
14,7 ± 2,9
mm/min), wohingegen die Mucus-Rigidität (log G*) für die Dextranbehandlung
abnahm (2,09 ± 0,13
bis 1,79 ± 0,07),
jedoch nicht für
Arginin. Unsere Ergebnisse stützen
weder die Verwendung von Arginin als ein mucolytisches Agens per
se, noch scheint die Zugabe von Arginin die mucolytische Aktivität von Dextran
zu steigern, zumindest in gesunden Tieren. Jedoch stimmt die Abnahme
in der Potentialdifferenz mit der Stimulation des transepithelialen
Ionenflusses überein, was
eine potentielle positive Wirkung hinsichtlich der Hydratation der
Atemwegsflüssigkeit
nahelegt, und Arginin kann eine größere Wirkung im Modell der
chronischen Bronchitis oder der CF haben.
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BEISPIEL 5
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Mit Erlaubnis der Gesundheitsschutzabteilung
des Ministeriums für
Gesundheit und Wohlfahrt in Kanada (Health Protection Branch of
the Ministry of Health and Welfare Canada) wurde ein Patient mit
fortgeschrittener CF-Lungenkrankheit mit Dextran behandelt. Der
Patient erhielt schon L-Arginin in Aerosolform, und Dextran wurde
in L-Arginin verabreicht. Die folgende Formulierung wurde verwendet:
200 mg Dextran (Molekulargewichtsbereich von etwa 360 bis etwa 4.000)
pro ml Arginin-Lösung
(50 g L-Arginin HCl und 3 g Arginin-freier Base pro Liter Wasser:
Solomons, 1971). Es wurde mit einer Testdosis von 200 mg/ml für 30 Sekunden
kein nachteiliger Effekt beobachtet, und eine 0,5 g Dosis wurde über 8 Minuten über einen
Vernebeler über eine
endotracheale Röhre
verabreicht. Diese anfängliche
Behandlung führte
zu einer Produktion von zahlreichen flüssigen Sekreten und die Behandlung
wurde dreimal täglich
während
der nächsten
beiden Tage wiederholt. Es gab einen Hinweis auf Verflüssigung
der Sekrete mit jeder Behandlung. Die Behandlung wurde abgebrochen,
da der Patient an einem plötzlichen
Auftreten einer Lungendekompensation litt.
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Die Sputum-Viskoelastizität wurde
an Proben durch magnetische Rheometrie festgestellt, die vor und nach
der Behandlung ge wonnen wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in
der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
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Nach der ersten Behandlung nahm die
Elastizität
mäßig ab,
während
die Viskosität
ziemlich substantiell abnahm und die vorausgesagte Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance und die Fähigkeit
zur Clearance durch Husten beide zunahmen. Zwei Tage später, nach
der letzten Behandlung, nahm die Viskosität auf einen normalen oder geringeren
Wert als der Normalwert ab, während
die Elastizität
höher war
und die vorhergesagte Fähigkeit
zur mucociliären
Clearance höher
war als vor der Behandlung.
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BEISPIEL 6
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Die Wirkungen zweier Lösungen,
bezeichnet als A und B, auf die mucociliäre Clearance auf Froschgaumen.
A war eine 4%-ige (40 mg/ml) Lösung
von Dextran Charge 1352 in amphibischer Ringer-Lösung
(R). B war eine 4%-ige Lösung
von Dextran mit einem nominellen Molekulargewicht von 10.000. Diese
Charge hat tatsächlich
ein durchschnittliches Molekulargewicht von 2.200, wie durch HPLC
bestimmt wurde. Charge 1352 hat ein durchschnittliches Molekulargewicht
von 1.600, wie durch HPLC bestimmt wurde.
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Leopardfrösche (rana pipiens) wurden
gekühlt
und durch Durchbohren des Rückenmarks
getötet;
der Gaumen wurde ausgeschnitten und unter einem Makroskop in einer
befeuchteten Kammer betrachtet. Um die Fähigkeit zur Mucus-Clearance
zu testen, wurde 1,25 μl
der Lösung
auf die Mittellinie des freigelegten Gaumens aufgebracht, und Messungen
der Clearance der Markerteilchen wurden über den nachfolgenden Zeitraum
von 10 Minuten (Mittelwert von 7 Beobachtungen) gemacht. Die Reihenfolge
der Anwendungen wurde abgewechselt, das heißt A, R, B oder B, R, A, um
den Zeitwirkungen Rechnung zu tragen.
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Drei gültige, zusammenpassende Ergebnisse
wurden von drei frisch ausgeschnittenen Froschgaumen erhalten: Geschwindigkeit:
(mm/min):
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Die Schlußfolgerung: Lösung A (Dextran,
Charge 1352, stimuliert die mucociliäre Clearance um etwa 20% mehr
als Lösung
B. Unsere vorhergehenden Ergebnisse weisen darauf hin, daß dieselben
Konzentrationen von Glucose Dimer, Trimer oder Tetramer von mittelmäßiger Wirksamkeit
(9 bis 19% Stimulation gegenüber
der Kontrolle) waren.
