DE69805002T2 - Kv2.1 antagonisten - Google Patents

Kv2.1 antagonisten

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Behandlung von Diabetes mellitus. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Antagonisten des Kaliumkanals Kv2.1, Verfahren zur Verwendung und Herstellung der Antagonisten und Tests zur Identifizierung solcher Antagonisten.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Die Sekretion von Insulin durch Pankreas-β-Zellen spielt eine kritische Rolle in der Regulierung des Glucose-Metabolismus. Eine Störung in der Insulin-Sekretion kann daher zu beeinträchtigter Regulierung von Blutzucker führen, was sich als Hypoglykämie oder Hyperglykämie offenbart, was z. B. in Insulin-abhängigem (Typ 1) Diabetes mellitus oder Nicht- Insulin-abhängigem (Typ 2) Diabetes mellitus (NIDDM) resultiert. Anders als Typ 1-Diabetes gibt es bei NIDDM keine Autoimmunzerstörung von Pankreas-β- Zellen.
  • Die Behandlung von Typ 2- oder Nicht-Insulin-abhängigem Diabetes mellitus (NIDDM) bleibt trotz der weitverbreiteten Verwendung von Insulin und oralen Mitteln (Sulfonylharnstoffen, Biguaniden und Thiazolidindionen) unzufriedenstellend. Unglücklicherweise leiden die verfügbaren oralen Mittel an einer Anzahl von unerwünschten Nebenwirkungen, die ihre Brauchbarkeit in der Behandlung von NIDDM einschränken. Es besteht daher ein deutlicher Bedarf an der Entwicklung neuer hypoglykämischer Mittel, die weniger toxisch sein können, oder die dort Erfolg haben, wo andere unwirksam sind.
  • β-Zellen, die sich in den Langerhans'schen Inseln in der Bauchspeicheldrüse befinden, reagieren auf eine Zunahme der Glucose- Konzentration durch Sekretion von Insulin (A. E. Boyd III, J. Cell Biochem., 48, 234-241, 1992). Der Mechanismus, durch den Glucose als ein sekretionsanregendes Mittel für Insulin wirkt, ist nicht völlig verstanden, aber eine Hauptkomponente seiner Wirkung auf β-Zellen wird über Veränderungen in der K&spplus;-Leitfähigkeit vermittelt. Eine Anzahl von Arten von Kaliumkanälen sind in β-Zellen vorhanden: diese schließen Calciumaktivierte Kaliumkanäle, ATP-empfindliche Kaliumkanäle (KATP) und verzögerte Gleichrichter-Kaliumkanäle ("delayed rectifier potassium channels", Kv) ein (I. D. Dukes, L. H. Philipson, Diabetes, 45, 845-853, 1996). Die jeweiligen Rollen dieser Kaliumkanäle bei der Regulierung der Glucose-stimulierten Insulinsekretion wurden noch nicht völlig aufgeklärt.
  • Kv-Kanäle sind multimere Membran-Proteine, die den Ausfluß von K&spplus; aus Zellen erlauben, wenn das Membranpotential angeregt ist (d. h. depolarisiert) (Hille, 1993, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2. Auflage, Sunderland MA, Sinauer Associates, 1991). Eine Anzahl von Isoformen von Kv- Kanälen wurde beschrieben, und man einigte sich auf eine einheitliche Nomenklatur für ihre Benennung (K. G. Chandy, G. A. Gutman, Trends Pharmacol. Sci. 14, 434, 1993). Es gibt derzeit 8 Familien von Säugetier- Genen für verzögerte Gleichrichter-Kaliumkanäle (Kv1.x-8.x), von denen für 4 (Kv1.x-4.x) gezeigt wurde, daß sie funktionelle Ionenkanäle codieren (K. G. Chandy, G. A. Gutman, Ligand and Voltage Gated Ion Channels, Hrsg. R. A. North, CRC Press, 1994). Die Information auf Bezug auf die Kv-Kanal-Gen- Expression in Pankreas-β-Zellen ist etwas widersprüchlich. Während einige Gruppen unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Kv1.x-Isoformen in Insel- und Insulom-Zellen der Maus nachgewiesen haben (C. Betshlolz et al., FEBS Lett, 263, 121-123, 1990; K. Kalman et al., Biophys J. 68: A268, 1996) und US-PS 5 559 009 die Existenz von Kv1.7-Signal in Pankreas-β-Zellen der Ratte und Insulom-Zellen des Hamsters offenbart, haben andere im Nachweis der Expression dieser Isoformen in β-Zellen versagt und berichten stattdessen von der Expression von Kv2.1- und -3.2- Transkripten (M. W. Roe et al., J Biol Chem 271, 32241-32246, 1996).
  • Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben überraschend gefunden, daß Antagonisten des verzögerten Gleichrichter-Kaliumkanals Kv2.1 die Insulinsekretion steigern. Entsprechend sind Antagonisten für den verzögerten Gleichrichter-Kaliumkanal Kv2.1 nützlich in der Behandlung von NIDDM.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung der Formel (1) oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Solvats davon
  • worin R C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkenyl, -CyH2y-R&sup7; oder -CyH2y-O-R&sup7; darstellt, worin y eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist und R&sup7; Wasserstoff, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl, C&sub4;&submin;&sub7;-Cycloalkenyl oder substituiertes oder unsubstituiertes Imidazolidinyl, Piperidyl, Piperazinyl, Pyrrolidinyl, Morpholinyl, Pyridyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Pyranyl, Furyl, Thienyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Oxadiazolyl, Thiazolyl, Thiadiazolyl, Triazolyl oder Tetrazolyl ist,
  • oder R -CyH2y-R&sup9;, -CyH2y-O-R&sup9; oder -CyH2y-O-CH&sub2;-R&sup9; darstellt, worin y unabhängig wie oben definiert ist und R&sup9; R&sub1;
  • ist, worin R&sub4; Wasserstoff oder Halogen ist und R&sub5; und R&sub6; unabhängig Wasserstoff, Halogen oder -O-C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl darstellen oder R&sub5; und R&sub6; zusammen einen Methylendioxy- oder Ethylendioxy-Ring bilden können;
  • darstellt, worin R&sub8; jeweils unabhängig Wasserstoff, Halogen, -O-C&sub1;&submin;&sub3;- Alkyl, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub3;-Fluoralkyl oder -C(O)-R&sup9; ist, worin R&sup9; C&sub4;&submin;&sub8;-Alkyl oder C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl ist;
  • X O, S oder N-R² darstellt, worin R² unabhängig wie oben für R definiert ist;
  • R³ oder C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl darstellt, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von NIDDM bereit.
  • Wie hier verwendet, können Begriffe wie Alkyl, Alkenyl und dgl. entweder geradkettig oder verzweigtkettig sein, wenn nicht anders angegeben.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegenden Erfindung die Verwendung von Hanatoxin oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Solvats davon in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von NIDDM bereit.
  • In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren (einen Test) zur Identifizierung von extrinsischen Stoffen bereit, die die Fähigkeit zur Modulierung der Kv2.1-Kanalaktivität und dadurch zur Modifizierung der Insulinsekretion besitzen.
  • Die folgenden sind besondere Aspekte der vorliegenden Erfindung:
  • a) Verwendung eines Kv2.1-Antagonisten zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von NIDDM.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Eine Anzahl von aus giftigen Tieren isolierten Toxinen sind dafür bekannt, daß sie Kaliumkanäle blockieren (C. Miller et al., Nature, 313, 316-318, 1985; M. Garcia-Calvo et al., J. Biol. Chem., 268, 18866-18874, 1993; J. V. Halliwell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 493-497, 1986). Von Hanatoxin, das dem Gift der Chilenischen Rosentarantel (Grammulosa spatulata) isoliert wird, wurde gezeigt, daß es selektiv Kv2.1- Kanäle blockiert, wobei von minimalen Wirkungen auf repräsentative Mitglieder der verzögerten Gleichrichterkanäle Kv1, Kv3 und Kv4 berichtet wird (K. J. Swartz, R. MacKinnon, Neuron, 15, 941-949, 1995). Entsprechend ist Hanatoxin (das im Gift aus der Chilenischen Rosentarantel gefunden wird) nützlich in der vorliegenden Erfindung als Antagonist des Kv2.1-Kanals.
  • Zusätzlich zu Naturprodukten sind kleine organische Moleküle dafür bekannt, Kaliumkanäle zu blockieren. Sulfonylharnstoffe wechselwirken spezifisch mit KATP-Kanälen. Tetraethylammonium (TEA) und 4-Aminopyridin blockieren eine große Vielzahl von Kaliumkanälen, einschließlich derjenigen des verzögerten Gleichrichtertyps im mM-Konzentrationsbereich (R. G. Chandy, G. A. Gutman, Ligand and Voltage Gated Ion Channels, Hrsg. R. A. North, CRC Press, 1994). Wirksamere Kaliumkanal-Antagonisten wurden ebenfalls beschrieben. Z. B. blockiert Tedisamil (3,7-Di(cyclopropylmethyl)- 9,9-tetramethylen-3,7-diazabicyclo-(3.3.1)nonan) Kv-Kanäle im unteren uM-Bereich ohne Wirkung auf nach innen gerichtete Gleichrichter-Kaliumkanäle. Tedisamil besitzt ebenfalls Wirkungen auf spannungsaktivierte Natrium- und Kaliumkanäle in höheren Konzentrationen (I. D. Dukes et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 254, 560-569, 1990). 3,7-Diazabicyclo-(3.3.1)- nonan-(Bispidin)-Verbindungen haben beträchtliches Interesse als potentielle antiarrhythmische Mittel gefunden. Z. B. offenbart US-PS 4 550 112 eine Reihe von substituierten 3,7-Diazabicyclo-(3.3.1)-nonan-Verbindungen (einschließlich Tedisamil) und ihre Verwendung in der Behandlung von Herzerkrankungen. US-PS 4 451 473 offenbart eine andere Reihe von 3,7-Diazabicyclo-(3.3.1)-nonan-Verbindungen, die nützlich als antiarrhythmische Mittel sind. US-PS 4 451 473 schließt die als Bisaramil bekannte Verbindung (3-Ethyl-7-methyl-3,7-diazobicyclo[3.3.1]non-9-yl-4- chlorbenzoat) ein. Gleichsam offenbart US-PS 4 959 373 eine andere Reihe von Verbindungen mit dem Bispidin-Gerüst, die nützlich als antiarrhythmische Mittel sind. Keine dieser vorhergehenden Veröffentlichungen beansprucht, daß Verbindungen dieses Typs nützlich in der Behandlung von NIDDM sind.
  • Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß Verbindungen der Formel (1) wirksame Antagonisten des verzögerten Gleichrichter-Kaliumkanals Kv2.1 sind und die Insulinsekretion steigern. Entsprechend sind Verbindungen der Formel (1) nützlich in der Behandlung von NIDDM.
  • Der Begriff 5- oder 6-gliedrige heterocyclische Gruppe wie hier verwendet schließt 5- oder 6-gliedrige substituierte oder unsubstituierte Heterocycloalkyl- und Heteroaryl-Gruppen ein, z. B. substituierte oder unsubstituierte Heteroaryl-Gruppen, z. B. substituiertes oder unsubstituiertes Imidazolidinyl, Piperidyl, Piperazinyl, Pyrrolidinyl, Morpholinyl, Pyridyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Pyranyl, Furyl, Thienyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Oxadiazolyl, Thiazolyl, Triazolyl oder Tetrazolyl.
  • Die heterocyclische Gruppe kann gegebenenfalls mit einem oder mehreren der folgenden substituiert sein: Halogenatome, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkoxy.
  • Bevorzugt ist R C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl, wenn R Alkyl ist. Bevorzugt ist R&sup7;, wenn es ein Heterocyclus ist, ein unsubstituierter Heterocyclus, am meisten bevorzugt ist R&sup7; Furyl oder Thienyl. Bevorzugt ist y 3, 4 oder 5. Bevorzugt sind zwei der R&sub6;-Substituenten in R&sub1; Wasserstoff, und am meisten bevorzugt ist der andere R&sub8;-Substituent Halogen. Bevorzugt ist R&sub2; C&sub1;&submin;&sub2;-Alkyl, wenn R&sub2; Alkyl ist. Bevorzugt ist R&sub3; Methyl oder Wasserstoff.
  • Beispiele für bevorzugte Verbindungen zur Verwendung in dieser Erfindung sind:
  • anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
  • anti-3-(4-(3,4-Ethylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
  • anti-3-(3-Methyl-3-benzyloxypropyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9- ol-4-chlorbenzoatester;
  • anti-3-(Benzyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4- chlorbenzoatester;
  • anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7,9-dimethyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoat;
  • 3,7-Di(4-(3,4-methylendioxyphenyl)butyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol- 4-chlorbenzoatester;
  • 3,7-Di(4-(3,4-dimethoxyphenyl)butyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4- chlorbenzoatester;
  • 3,7-Di(furanylmethyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
  • 3,7-Di(4-(3,4-ethylendioxyphenyl)butyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4- chlorbenzoatester;
  • syn-7-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]- nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
  • syn-7-Hexyl-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
  • syn-7-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]- nonan-9-ol-4-chlorbenzylether;
  • syn-7-Hexyl-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzylether;
  • syn-7-(2-Benzyloxypropyl)-3-thia-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4- chlorbenzoatester;
  • und pharmazeutisch akzeptable Salze oder Solvate davon.
  • Eine besonders bevorzugte Verbindung zur Verwendung in dieser Erfindung ist eine Verbindung der Formel (1a) (Beispiel 1) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat davon.
  • Die Fachleute werden erkenne, daß in den Verbindungen der Formel (1) Stereozentren existieren. Entsprechend schließt die vorliegende Erfindung alle möglichen Stereoisomere und geometrischen Isomere der Formel (1) ein und schließt nicht nur racemische Verbindungen, sondern ebenfalls die optisch aktiven Isomere ein. Wenn eine Verbindung der Formel (1) als einzelnes Enantiomer gewünscht ist, kann es entweder durch Auftrennung des Endprodukts oder durch stereospezifische Synthese aus entweder isomerreinem Ausgangsstoff oder einer beliebigen zweckmäßigen Zwischenstufe erhalten werden. Die Auftrennung des Endprodukts, einer Zwischenstufe oder eines Ausgangsstoffs kann durch jedes auf diesem Gebiet bekannte, geeignete Verfahren bewirkt werden. Siehe z. B. Stereochemistry of Carbon Compounds, E. L. Eliel (Mcgraw Hill, 1962) und Tables of Resolving Agents, S. H. Wilen. Zusätzlich soll die vorliegende Erfindung in Situationen, in denen Tautomere der Verbindungen der Formel (1) möglich sind, alle tautomeren Formen der Verbindungen einschließen.
  • Es wird ebenfalls von den Fachleuten anerkannt werden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen in Form eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Solvats davon verwendet werden können. Die physiologisch akzeptablen Salze der Verbindungen der Formel (I) schließen herkömmliche Salze, die aus pharmazeutisch akzeptablen anorganischen oder organischen Säuren oder Basen gebildet werden, sowie quaternäre Ammonium-Säureadditionssalze ein. Besonders spezifische Beispiele für geeignete Säuresalze schließen solche ein von: Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Fumarsäure, Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Glycolsäure, Ameisensäure, Milchsäure, Maleinsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Pamoasäure, Malonsäure, Hydroxymaleinsäure, Phenylessigsäure, Glutaminsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Fumarsäure, Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Naphthalin-2-sulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Hydroxynaphthoesäure, Jodwasserstoffsäure, Äpfelsäure, Stearinsäure, Gerbsäure und dgl. Andere Säuren wie Oxalsäure, obwohl sie als solche nicht pharmazeutisch akzeptabel sind, können nützlich in der Herstellung von Salzen sein, die als Zwischenstufen bei dem Erhalt der Verbindungen der Erfindung und ihrer pharmazeutisch akzeptablen Salze nützlich sind. Besonders spezifische Beispiele für geeignete basische Salze schließen ein: Natrium-, Lithium-, Kalium-, Magnesium-, Aluminium-, Calcium-, Zink-, N,N'-Dibenzylethylendiamin-, Chlorprocain-, Cholin-, Diethanolamin-, Ethylendiamin-, N-Methylglucamin- und Procainsalze. Nachfolgende Verweise auf eine erfindungsgemäße Verbindung schließen sowohl Verbindungen der Formel (1) als auch ihre pharmazeutisch akzeptablen Salze und Solvate ein.
  • Es wird von den Fachleuten anerkannt werden, daß Verweise hierin auf die Behandlung sich auf die Prophylaxe sowie auf die Behandlung bestehender Erkrankungen oder Symptome erstreckt. Außerdem wird es ersichtlich sein, daß die zur Verwendung in der Behandlung erforderliche Menge eines Kv2.1- Antagonisten mit der Natur des behandelten Zustandes und dem Alter und Zustand des Patienten variieren wird und letztlich in der Verantwortung des behandelnden Arztes oder Tierarztes liegen wird. Allgemein jedoch werden Dosen, die für die Behandlung eines erwachsenen Menschen eingesetzt werden, typischerweise im Bereich von 0,02 bis 5000 mg pro Tag liegen, z. B. 1 bis 1500 mg pro Tag. Die gewünschte Dosis kann zweckmäßig in einer Einzeldosis oder als verteilte Dosen verabreicht in zweckmäßigen Intervallen, z. B. als zwei, drei, vier oder mehr Unterdosen pro Tag, angeboten werden.
  • Obwohl es möglich ist, daß der Kv2.1-Antagonist, z. B. eine Verbindung der Formel (1), als Rohchemikalie therapeutisch verabreicht werden kann, ist es bevorzugt, den Wirkstoff als pharmazeutische Formulierung anzubieten. Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Formulierung bereit, die eine Verbindung der Formel (1) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat davon zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür und gegebenenfalls andere therapeutische und/oder prophylaktische Bestandteile umfaßt. Der (die) Träger muß (müssen) "akzeptabel" in dem Sinne sein, daß er (sie) mit den anderen Bestandteilen der Formulierung kompatibel und nicht nachteilig für den Empfänger ist (sind). Durch die vorliegende Erfindung wird ferner ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Formulierung, die eine Verbindung der Formel (1) umfaßt, bereitgestellt, wobei das Verfahren das Vermischen einer Verbindung der Formel (1) oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes davon mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern dafür und gegebenenfalls anderen therapeutischen und/oder prophylaktischen Bestandteilen umfaßt.
  • Formulierungen, die Kv2.1-Antagonisten der vorliegenden Erfindung umfassen, schließen jene ein, die speziell zur oralen, bukkalen, parenteralen, transdermalen, Inhalations-, intranasalen, transmukosalen, Implantations- oder rektalen Verabreichung formuliert sind, jedoch ist die orale Verabreichung bevorzugt. Zur bukkalen Verabreichung kann die Formulierung die Form von Tabletten oder Lutschtabletten annehmen, die in einer herkömmlichen Weise formuliert sind. Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können herkömmliche Exzipienten enthalten, wie Bindemittel (z. B. Sirup, Gummi arabicum, Gelatine, Sorbit, Tragacanth, Stärkeschleim oder Polyvinylpyrrolidon), Füllstoffe (z. B. Lactose, Zucker, mikrokristalline Cellulose, Maisstärke, Calciumphosphat oder Sorbit), Gleitmittel (z. B. Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, Polyethylenglycol oder Silica), Tablettensprengmittel (z. B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglycolat) oder Netzmittel wie Natriumlaurylsulfat. Die Tabletten können gemäß auf diesem Gebiet wohlbekannten Verfahren überzogen werden.
  • Alternativ können Kv2.1-Antagonisten in orale flüssige Zubereitungen eingearbeitet werden, wie z. B. wäßrige oder ölige Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupe oder Elixiere. Außerdem können diese Verbindungen enthaltende Formulierungen als trockenes Produkt zur Herrichtung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung angeboten werden. Solche flüssigen Zubereitungen können herkömmliche Additive enthalten, wie Suspendiermittel wie Sorbitsirup, Methylcellulose, Glucose/Zuckersirup, Gelatine, Hydroxyethylcellulose, Carboxymethylcellulose, Aluminiumstearat- Gel oder hydrierte eßbare Fette; Emulgatoren wie Lecithin, Sorbitanmonooleat oder Gummi arabicum; nicht-wäßrige Träger (die eßbare Öle einschließen können) wie Mandelöl, fraktioniertes Kokosöl, Ölsäureester, Propylenglycol oder Ethylalkohol; und Konservierungsmittel wie Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure. Solche Zubereitungen können ebenfalls als Suppositorien formuliert werden, die z. B. herkömmliche Suppositoriengrundlagen wie Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten.
  • Zusätzlich können Kv2.1-Antagonisten zur parenteralen Verabreichung durch Injektion oder kontinuierliche Infusion formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Trägern annehmen und können Formulierungsmittel wie Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform zur Herrichtung mit einem geeigneten Träger (z. B. sterilem, pyrogenfreiem Wasser) vor der Verwendung sein.
  • Die erfindungsgemäßen Formulierungen können ebenfalls als Depot- Zubereitung formuliert werden. Solche langwirkenden Formulierungen können durch Implantation (z. B. subkutan oder intramuskulär) oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Entsprechend können die Verbindungen der Erfindung mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Stoffen (z. B. als Emulsion in einem akzeptablen Öl), Ionenaustauscherharzen oder als schwach-lösliche Derivate, z. B. als schwach-lösliches Salz, formuliert werden.
  • Die erfindungsgemäßen Formulierungen können zwischen 0,1 und 99% des Wirkstoffs, zweckmäßig von 30 bis 95% für Tabletten und Kapseln und 3 bis 50% für flüssige Zubereitungen enthalten.
  • Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung von extrinsischen Stoffen bereit, die die Fähigkeit zur Modulierung der Kv2.1-Kanalaktivität besitzen und dadurch die Insulinsekretion modifizieren.
  • Z. B. stellt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Blockern des Kv2.1-Kaliumkanals bereit, welches das Messen von Veränderungen an intrazellulärem Ca²&spplus; in einer geeigneten Zellinie in Gegenwart von Glucose und in zusätzlicher Abwesenheit oder Gegenwart einer Verbindung umfaßt, die eine antagonistische Aktivität aufweisen kann. Z. B. reagieren βTC3- Neoinsulomzellen auf eine Veränderung an Glucose mit einem Anstieg von intrazellulärem Ca²&spplus;. Ihre Glucose-Empfindlichkeit ist deutlich unterschiedlich von normalen Pakreas-β-Zellen; eine maximale Reaktion wird durch 1 mM Glucose erzeugt, wohingegen normale β-Zellen empfindlich auf Glucose im Bereich von 6 bis 30 mM sind. Diese Zellinie stellt ein geeignetes Modellsystem zur Untersuchung verzögerter Gleichrichter-Kaliumkanäle dar, da sie Kv2.1-Kanäle exprimieren und auf nicht-selektive Blocker dieser Kanäle (wie TEA) mit einem Glucose-abhängigen Anstieg an intrazellulärem Ca²&spplus; reagieren. Andere Testmodalitäten sind möglich, um Blocker der verzögerten Gleichrichter-Kaliumkanäle in βTC3-Neozellen nachzuweisen. Diese schließen die Überwachung von Veränderungen im Membranpotential mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff (z. B. Bis-oxonol) oder das Messen von Veränderungen an intrazellulärem K&spplus; mit einem K&spplus;-empfindlichen Farbstoff (z. B. PBFI) ein.
  • Zusätzlich stellt die Erfindung ein Verfahren zur Expression von Kv2.1 in einer geeigneten Zellinie bereit, z. B. Ovarialzellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen). Diese Zellinie kann mit Verbindungen behandelt werden, um ihre Fähigkeit zur Modulierung der Kv2.1-Aktivität zu messen, z. B. durch Messung der Veränderung des K&spplus;-Stroms, z. B. durch die standardmäßigen Whole-Cell-Patch-Clamp-Verfahren, die im nachfolgenden Abschnitt über die Beispiele beschrieben werden.
  • Von anderen Mitteln wurde postuliert, daß sie eine Glucose-empfindliche sekretionsanregende Aktivität ausüben, z. B. Glucagon-artiges Peptid 1 (GLP-1). Von diesem Peptid wurde berichtet, daß es die Glucose- induzierte Insulinsekretion teilweise durch Erhöhung des intrazellulären Ca²&spplus; steigert. Entsprechend stellt die Erfindung ferner ein Verfahren zum Testen auf Verbindungen bereit, die eine Glucose-empfindliche sekretionsanregende Aktivität zeigen, welches das Messen von Veränderungen an intrazellulärem Ca²&spplus; in Gegenwart von Glucose und in zusätzlicher Gegenwart oder Abwesenheit einer Verbindung umfaßt, die eine Glucose-empfindliche sekretionsanregende Aktivität aufweisen kann. Ein alternatives Verfahren zur Messung der Aktivität von Antagonisten für Kv2.1 zur Steigerung der Insulinsekretion ist das Pankreas-Perfusionsverfahren. Dieses wird im Detail in den Beispielen beschrieben.
  • Ein alternatives Verfahren zum Nachweis unbekannter Moleküle mit Aktivität an verzögerten Gleichrichter-Kv2.1-Kaliumkanälen beinhaltet die Messung der Verdrängung von markiertem Hanatoxin (gereinigt aus natürlichen Quellen oder rekombinant oder synthetisch). Z. B. gibt es verschiedene Tyrosin-Reste in Hanatoxin, die zweckmäßig radiomarkiert werden könnten, und das resultierende radiomarkierte Hanatoxin könnte dann in einem Bindungstest eingesetzt werden.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können gemäß den folgenden allgemeinen Synthetikschemata hergestellt werden. Es wird anerkannt werden, daß ein Fachmann diese Schemata leicht anpassen würde, um eine besondere Verbindung der Formel (1) herzustellen.
    • Allgemeines Syntheseverfahren 1:
  • Die Synthese von Verbindungen der Formel (1), worin
  • R wie oben definiert ist,
  • R&sub1; 4-Chlorbenzoyl ist,
  • R&sub3; H ist
  • und X N-R² ist, worin R² Methyl ist, wird in Schema 1 umrissen.
  • Das Keton, 7-Methyl-3-benzyl-3,7-diazabicyclononan-9-on, wurde mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert, und die Benzyl-Gruppe des resultierenden Alkohols wurde unter Hydrierungsbedingungen entfernt. Das resultierende freie Amin wurde mit einer BOC-Gruppe geschützt, und der Alkohol wurde zum Ester durch Behandlung mit einem Acetylierungsmittel wie 4-Chlorbenzoylchlorid konvertiert, um anti-3-(tert-Butoxycarbonyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester zu ergeben. Auftrennung der aus der Lithiumaluminiumhydrid-Reduktion erhaltenen geometrischen Isomere kann an verschiedenen Punkten entlang des Syntheseweges durchgeführt werden. In diesem Fall wurden die Isomere nach der Einführung der Ester-Gruppe getrennt. Die Stereochemie des anti-3-(tert-Butoxycarbonyl)-7-methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatesters wurde durch NMR, nOe und röntgenkristallographische Analyse bestimmt. Entfernung der BOC-Gruppe wurde durch Behandlung mit einer starken Säure wie Trifluoressigsäure erreicht, und das resultierende sekundäre Amin wurde mit einem Aldehyd in Gegenwart eines Reduktionsmittels wie Natriumtriacetoxyborhydrid umgesetzt, um die gewünschte Verbindung zu ergeben. Verbindungen der Formel (1) können zu einem Säureadditionssalz, wie dem HCl-Salz, durch einfache Behandlung mit HCl in einem organischen Lösungsmittel konvertiert werden.
  • Schema 1: (i) LiAlH&sub4;, THF; (ii) H&sub2;, Pd/C, Ethanol, Wasser; (iii) (Boc)&sub2;O, DMAP, Et&sub3;N, CHCl&sub3;, 4-ClPhCOCl; (iv) TFA, CH&sub2;Cl&sub2;; (v) RCHO NaB(OAc)&sub3;H, ClCH&sub2;CH&sub2;Cl.
    • Herstellung von anti-3-(tert-Butoxycarbonyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester.
  • Zu 3-Methyl-7-benzyl-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-on in trockenem Tetrahydrofuran (350 ml) wurde Lithiumaluminiumhydrid (41 ml, 1 M in Tetrahydrofuran) getropft. Die Mischung wurde für 30 min gerührt, und Natriumhydroxid (1 M, wäßrig) wurde zum Verbrauch von überschüssigem Lithiumaluminiumhydrid hinzugegeben. Die Mischung wurde filtriert, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der resultierende ölige Rückstand wurde in Ethanol/Wasser (1 : 1, 200 ml) gelöst, und der pH wurde mit HCl (conc.) auf 1 eingestellt. Palladium auf aktiviertem Kohlenstoff (10%, 250 mg) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde für 12 h hydriert (50 psi). Die Mischung wurde filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Zum resultierenden hellgelben Rückstand, gelöst in Chloroform (400 ml) und Triethylamin (10 ml), wurden 4-Dimethylaminopyridin (4,88 g, 0,04 mol) und Di-tert-butyldicarbonat (8,72 g, 0,04 mol) hinzugegeben. Die Mischung wurde für 4 h gerührt, und 4-Chlorbenzoylchlorid (7,7 g, 0,04 mol) wurde hinzugegeben. Die Mischung wurde über Nacht gerührt und mit Natriumbisulfat (1 M, wäßrig), Wasser und Natriumbicarbonat (gesättigte wäßrige Lösung) gewaschen. Die organische Phase wurde mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel unter Elution mit 80 : 20 Hexan : Ethylacetat gereinigt, um die Titelverbindung (6 g, 37%) als weißen Feststoff zu ergeben:
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,99 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,44 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 5,10 (m, 1H), 4,52 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 4,34 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 3,20 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 3,07 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 3,00-2,50 (m, 4H), 2,15 (s, 3H), 2,05-1,96 (m, 2H), 1,47 (s, 9H);
  • Massenspektrum m/z 395 (M + H)&spplus;.
    • Beispiel 1: anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester (1).
  • Zu anti-3-Methyl-7-tert-butoxycarbonyl-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan- 9-ol-4-chlorbenzoat (0,5 g, 1,27 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wurde Trifluoressigsäure (5 ml) gegeben, die Mischung wurde für 4 h gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in Dichlorethan (10 ml) gelöst, 4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butanal (0,27 g, 1,4 mmol) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde für 30 min gerührt. Natriumtriacetoxyborhydrid (1,06 g, 5,0 mmol) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde über Nacht gerührt. Chloroform (25 ml) wurde hinzugegeben, und die Lösung wurde mit Natriumbicarbonat (2 · 30 ml, gesättigte wäßrige Lösung) und Natriumhydroxid (2 · 20 ml, 1 N wäßrig) gewaschen. Die organische Phase wurde mit Natriumsulfat getrocknet, filtriert und mit HCl (4 N in Dioxan) versetzt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde mit Diethylether verrieben, was das Dihydrochloridsalz der Titelverbindung als amorphen weißen Feststoff lieferte (0,7 g, 98%):
  • ¹H-NMR (freie Base) (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,98 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 7,42 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 6,70 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 6,65 (s, 1H), 6,60 (d, J = 7,8, 1H), 5,89 (s, 2H), 4,97 (m, 1H), 3,08 (bd, J = 10,2 Hz, 2H), 2,83 (bd, J = 10,2 Hz, 2H), 2,56-2,49 (m, 4H), 2,44-2,38 (m, 2H), 2,32-2,26 (m, 28), 2,30 (s, 3H), 2,10 (bs, 3H);
  • Massenspektrum m/z 471 (M + H)&spplus;.
  • Unter Verwendung eines dem für die obige Verbindung 1 ähnlichen Verfahrens wurden die in Tabelle 1 aufgeführten Verbindungen unter Verwendung des entsprechenden Aldehyds hergestellt. In einigen Fällen können andere Reduktionsmittel als Natriumtriacetoxyborhydrid in der Reaktion verwendet werden. Z. B. wurde in verschiedenen Fällen harzgebundenes Cyanoborhydrid verwendet. Tabelle 1
    • Allgemeines Syntheseverfahren 2:
  • Eine Synthese von Verbindungen der Formel (1), worin
  • R 4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl ist,
  • R&sub1; wie in der allgemeinen Formel (1) definiert ist,
  • R&sub3; H ist
  • und X = N-R² ist, worin R² Methyl ist, wird in Schema 2 umrissen.
  • Verbindungen der Formel (1), worin die R&sub1;-Gruppe nicht 4-Chlorbenzoyl ist, wie in obigem Beispiel 1, können ebenfalls hergestellt werden. Ein einfaches Verfahren wird in Schema 2 umrissen, in dem die Ester-Gruppe der Verbindung 1 unter basischen Bedingungen abgespalten und der resultierende Alkohol, anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol, mit einem aktivierten Ester oder einem Säurechlorid acetyliert wird, um eine Verbindung der Formel (1) zu ergeben. Der Alkohol kann ebenfalls zu einem Carbamat gemäß Standardverfahren konvertiert werden, wie durch Behandlung mit einem Isocyanat oder einem Amin und CDI.
  • Schema 2: (i) LiOH, H&sub2;O, THF; (ii) RCOCl oder RCNO oder RNH&sub2;, CDI.
    • Herstellung von anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl- 3,7-diazabicyclononan-9-ol.
  • Zu anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester (1,0 g, 2,1 mmol) in 10 ml THF wurde eine wäßrige Lösung aus LiOH (60 mg, 2,5 mmol, in 2,5 ml Wasser) und Methanol (2,5 ml) gegeben. Die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur für ca. 14 h gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit Wasser verdünnt, mit Methylenchlorid extrahiert und mit 1 N Natriumhydroxid gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat und Filtrieren wurde HCl in Dioxan (4 N, 2 ml) hinzugegeben, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde zwischen Wasser und Diethylether aufgetrennt. Die wäßrige Schicht wurde zweimal mit Ether gewaschen, dann mit 10 N Natriumhydroxid basisch gemacht und mit Methylenchlorid extrahiert. Die Lösung wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt, um die Titelverbindung als gelbes Öl zu ergeben (0,46 g, 67%).
  • ¹H-NMR (400 MHz, CD&sub3;OD): 6,70 (d, J = 8,24 Hz, 1H), 6,67 (s, 1H), 6,61 (d, J = 7,87 Hz, 1H), 5,85 (s, 2H), 3,60 (t, J = 3,39 Hz, 1H), 2,99 (d, J = 10,25 Hz, 2H), 2,75 (dd, J&sub1; = 3,30 Hz, J&sub2; = 11,17 Hz, 2H), 2,67 (d, J = 10,99 Hz, 2H), 2,53 (t, J = 7,05 Hz, 2H), 2,25 (m, 4H), 2,19 (s, 3H), 1,85 (m, 2H), 1,5 (m, 4H);
  • Massenspektrum m/z 333 (M + H)&spplus;.
    • Beispiel 13: anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl-7-methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-4-methoxybenzoatester (13).
  • Zu anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl-7-methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol (55 mg, 0,16 mmol) in 1 ml Methylenchlorid wurden Triethylamin (45 ul, 0,32 mmol) und 4-Methoxybenzoylchlorid (34 mg, 0,20 mmol) gegeben. Die Mischung wurde für 2 h gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel mit Ethylacetat, das 5% Triethylamin enthielt, gereinigt, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben (33 mg, 44%).
  • ¹H-NMR (400 MHz, CD&sub3;OD): 7,99 (d, J = 8,62 Hz, 2H), 7,00 (d, J = 8,61 Hz, 2H), 6,69 (d, J = 7,69 Hz, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,62 (d, J = 7,87 Hz, 1H), 5,86 (s, 2H), 4,93 (m, 1H), 3,85 (s, 3H), 3,16 (d, J = 10,99 Hz, 2H), 2,93 (d, J = 11,35, 2H), 2,74 (d, J = 11,54 Hz, 2H), 2,55 (m, 2H), 2,46 (d, J = 11,35 Hz, 2H), 2,32 (m, 2H), 2,29 (s, 3H), 2,15 (s, 2H), 1,57 (m, 4H);
  • Massenspektrum m/z 467 (M + H)&spplus;.
  • Die freie Base wurde zum HCl-Salz durch Auflösen in Methylenchlorid und Zugeben von HCl (4 N in Dioxan) konvertiert.
    • Beispiel 14: anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-phenylcarbamat (14).
  • Zu anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol (49 mg, 0,15 mmol) in 1 ml Acetonitril wurde Phenylisocyanat (17 ul, 0,16 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde für 4 h auf ca. 50ºC erwärmt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und der resultierende Rückstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung eines Gradienten von Acetonitril/0,01% wäßriges TFA gereinigt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, der Rückstand wurde in Wasser gelöst, mit 1 N wäßriger HCl angesäuert und mit Diethylether gewaschen. Die wäßrige Phase wurde dann mit 5 M Natriumhydroxid basisch gemacht, mit Methylenchlorid extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel entfernt, um die Titelverbindung zu ergeben (7 mg, 10%).
  • ¹H-NMR (400 MHz, CD&sub3;OD): 7,42 (d, J = 7,87 Hz, 2H), 7,25 (m, 2H), 7,00 (t, J = 7,32 Hz, 1H), 6,65 (m, 3H), 5,85 (s, 2H), 4,66 (t, J = 3,20 Hz, 1H), 3,08 (d, J = 9,89 Hz, 2H), 2,79 (d, J = 11,35 Hz, 2H), 2,65 (d, J = 10,62 Hz, 2H), 2,55 (t, J = 6,77 Hz, 2H), 2,35 (d, J = 11,72 Hz, 2H), 2,25 (m, 2H), 2,20 (s, 2H), 2,05 (s, 2H), 1,55 (m, 4H);
  • Massenspektrum m/z 452 (M + H)&spplus;.
  • Unter Verwendung eines dem für die obigen Verbindungen 13 und 14 ähnlichen Verfahrens wurden die in Tabelle 2 aufgeführten Verbindungen unter Verwendung des entsprechenden Säurechlorids oder Isocyanats hergestellt. In einigen Fällen in Tabelle 2 wurde das Carbamat hergestellt, indem zunächst das Amin mit CDI umgesetzt und dann das anti-3-(4-(3,4- Methylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol hinzugegeben wurde. Tabelle 2
    • Allgemeines Syntheseverfahren 3:
  • Eine Synthese von Verbindungen der Formel (1), worin
  • R wie für die allgemeine Formel (1) definiert ist,
  • R&sub2; wie in der allgemeine Formel (1) definiert ist,
  • R&sub3; wie für die allgemeine Formel (1) definiert ist
  • und X = N-R² ist, worin R² Methyl ist, wird in Schema 2 umrissen.
  • Verbindungen der Formel (1), worin R&sub3; C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl ist, sind wie in Schema 3 umrissen zugänglich. Das Keton, 3,7-Bis(phenylmethyl)-3,7- diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-on, wird mit einem Alkyllithium-Mittel wie Methyllithium alkyliert, und der resultierende Alkohol wird mit Benzoylchlorid umgesetzt. Die Benzyl-Gruppen werden zu BOC-Gruppen konvertiert, und diese werden unter Standardbedingungen entfernt, um 9-Methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-benzoat-bis-trifluoressigsäuresalz zu ergeben. Das Diamin wurde mit CBZ-Cl unter Pufferbedingungen behandelt, um eine Mischung der mono-geschützten Verbindungen zu ergeben, die durch Flash-Chromatographie (das gewünschte syn-Isomer eluierte zuerst) getrennt werden konnten. Die resultierende mono-geschützte syn-Verbindung wurde mit einem Aldehyd in Gegenwart eines Reduktionsmittels umgesetzt. Die CBZ-Gruppe wurde zu Methyl reduziert und der Ester durch Behandlung mit LAH entfernt, und das 4-Chlorbenzoat wurde dann unter Standardbedingungen eingeführt, um die gewünschte Verbindung zu ergeben. Ein Fachmann wird erkennen, daß andere Gruppen als das 4-Chlorbenzoat an der R¹-Gruppe im letzten Schritt in Schema 3 eingeführt werden können.
  • Schema 3: (i) Methyllithium, THF, Benzoylchlorid; (ii) H&sub2; 10% Pd/C, Ethylacetat, (BOC)&sub2;O; (iii) TFA, Methylenchlorid; (iv) CBZ-Cl, THF, EtOH, H&sub2;O, gepuffert; (v) RCHO, 1,2-Dichlorethan, NaBH(OAc)&sub3;; (vi) LAH, THF; (vii) 4-Chlorbenzoylehlorid, Methylenchlorid, DMAP, Triethylamin.
    • Herstellung von 3,7-Di(phenylmethyl)-9-methyl-3,7-diazabicyclononan- 9-ol-benzoat
  • Eine Lösung aus MeLi (30,80 ml, 43,12 mmol) wurde zu 3,7-Bis(phenylmethyl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-on (6,00 g, 18,75 mmol) in THF (ca. 100 ml) bei Raumtemperatur unter N&sub2; getropft. Nach 2 h wurde Benzoylchlorid (13,1 ml, 112,50 mmol) hinzugegeben, und die Lösung wurde für 4 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und Ethylacetat (ca. 100 ml) und Wasser (ca. 100 ml) wurden hinzugegeben. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und filtriert, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das rohe Öl wurde durch Säulenchromatographie (4 : 1 Hexan/Ethylacetat mit 5% Triethylamin) gereinigt, um die Titelverbindung (7,38 g, 89%) als orangefarbenes Öl zu ergeben.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,08 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,65-7,25 (m, 13H), 3,61 (s, 2H), 3,52 (s, 2H), 3,05 (d, J = 11,5 Hz, 2H), 2,93-2,78 (m, 6H), 2,49 (bs, 2H), 1,83 (s, 3H);
  • Massenspektrum m/z 441 (M + H)&spplus;.
    • Herstellung von 3,7-Di(tert-butoxycarbonyl)-9-methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-benzoat.
  • Eine mit einem Rührstab ausgerüstete Fischer-Porter-Flasche wurde mit Ethylacetat (70 ml), 3,7-Di(phenylmethyl)-9-methyl-3,7-diazabicyclononan-9- ol-benzoat (2,10 g, 4,75 mmol), 10% Pd/C (1,00 g) und Di-t-butyldicarbonat (2,60 g, 11,88 mmol) gefüllt. Die Fischer-Porter-Flasche wurde verschlossen, evakuiert und mit Stickstoff erneut gefüllt. Dies wurde zweimal wiederholt, dann wurde sie evakuiert und mit Wasserstoff (50 psi) gefüllt. Die Mischung wurde bei RT für 15 h gerührt und dann vorsichtig belüftet. Die Mischung wurde durch Celite filtriert, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung (2,05 g, 94%) als klares Öl zu ergeben.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,95 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 7,55 (t, J = 7,8 Hz, 1H), 7,40 (t, J = 7,8 Hz, 2H), 4,19-3,95 (m, 4H), 3,44-3,24 (m, 4H), 2,49 (bs, 1H), 2,40 (bs, 1H), 1,79 (s, 3H), 1,40 (s, 9H), 1,36 (s, 9H).
    • Herstellung von 9-Methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-benzoat-bistrifluoressigsäuresalz.
  • Trifluoressigsäure (2,06 ml, 26,7 mmol) wurde zu einer Lösung aus 3,7-Di(tert-butoxycarbonyl)-9-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-benzoat (2,05 g, 4,46 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) bei RT unter Argon gegeben. Die Lösung wurde gerührt, bis kein Ausgangsstoff zurückblieb, dann wurde das. Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung (2,09 g, 96%) als weißen Feststoff zu ergeben.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CD&sub3;OD): 8,05 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,65 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,51 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 3,70-3,56 (m, 8H), 3,02 (s, 2H), 1,94 (s, 3H);
  • Massenspektrum m/z 261 (M + H)&spplus;.
    • Herstellung von syn-7-Benzoyloxycarbonyl-9-methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-benzoat.
  • Methansulfonsäure (0,80 ml; 12,3 mmol) und eine katalytische Menge Bromkresolgrün (ca. 15 mg) wurden zu einer Lösung aus 9-Methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-benzoat-bis-trifluoressigsäuresalz (3,00 g, 6,15 mmol) in Ethanol (7 ml) und Wasser (7 ml) bei 0ºC gegeben. Eine Lösung aus Benzylchlorformiat (0,85 ml, 5,96 mmol) in THF (5 ml) wurde hinzugetropft, während eine gelbgrüne Farbe der Lösung durch alternierende Zugabe einer 50%igen wäßrigen KOAc-Lösung aufrechterhalten wurde. Nach Zugabe der Benzylchlorformiat-Lösung wurde das Reaktionsgefäß auf RT erwärmt und für 1 h erwärmt. Die Lösung wurde unter reduziertem Druck aufkonzentriert, dann wurde eine 1 N NaOH-Lösung hinzugegeben, um pH = 10 zu erhalten. Ethylacetat (50 ml) wurde hinzugegeben, und die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und filtriert, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (9 : 1 Ethylacetat/Triethylamin) gereinigt, um die Titelverbindung als das schneller eluierende Isomer zu ergeben (0,85 g, 35%).
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,98 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 7,57 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 7,44 (t, J = 7,7 Hz, 2H), 7,35-7,26 (m, 5H), 5,13 (s, 2H), 4,13-4,06 (m, 2H), 3,57 (d, J = 13,0 Hz, 2H), 3,27-3,16 (m, 4H), 2,35 (bs, 2H), 1,89 (s, 3H);
  • Massenspektrum m/z 395 (M + H)&spplus;.
    • Herstellung von syn-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7- benzyloxycarbonyl-9-methyl-3, 7-diazabicyclononan-9-ol-benzoat.
  • Eine Lösung aus syn-7-Benzyloxycarbonyl-9-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-benzoat (0,39 g, 0,98 mmol) und 4-(3,4-Methylendioxyphenyl)- butanal (0,28 g, 1,48 mmol) in 1,2-Dichlorethan (10 ml) wurde für 0,5 h gerührt, dann wurde Natriumtriacetoxyborhydrid (0,72 g, 3,43 mmol) hinzugegeben. Nach 16 h wurde gesättigte Natriumbicarbonat-Lösung (10 ml) hinzugegeben. Die Mischung wurde zweimal mit Chloroform extrahiert, dann wurden die vereinigten organischen Schichten über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (9 : 1 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um die Titelverbindung (0,25 g, 45%) als klares Öl zu ergeben.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,98 (d, J = 7,58z, 2H), 7,55 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,42 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,33-7,24 (m, 5H), 6,69-6,58 (m, 3H), 5,85 (s, 2H), 5,08 (d, J = 12,6 Hz, 1H), 4,93 (d, J = 12,6 Hz, 1H), 4,23 (d, J = 13,282, 1H), 4,11 (d, J = 13,2 Hz, 1H), 3,48 (d, J = 13,4 Hz, 2H), 3,00 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 2,93 (d, J = 10,8 Hz, 1H), 2,55-2,40 (m, 6H), 2,25-2,14 (m, 2H), 1,76 (s, 3H), 1,60-1,45 (m, 2H), 1,40-1,25 (m, 2H);
  • Massenspektrum m/z 571 (M + H)&spplus;.
    • Herstellung von anit-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7,9- dimethyl-3,7-diazabicyclo-nonan-9-ol.
  • Eine 1 M-Lösung aus Lithiumaluminiumhydrid (0,54 ml, 0,54 mmol) in THF wurde langsam zu einer Lösung aus syn-3-(4-(3,4- Methylendioxyphenyl)butyl)-7-benzyloxycarbonyl-9-methyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-benzoat (0,14 g, 0,24 mmol) in THF (10 ml) bei 0ºC unter Argon gegeben. Nach 1 h wurde weiteres Lithiumaluminiumhydrid (0,30 mol, 0,30 mmol) hinzugegeben, und die Lösung wurde über Nacht auf RT erwärmt. Nach ca. 16 h wurden Wasser (5 ml) und dann 1 N NaOH-Lösung (5 ml) hinzugegeben, gefolgt von Chloroform (10 ml). Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Eine versuchte Reinigung durch Säulenchromatographie (9 : 1 Ethylacetat/Triethylamin) ergab ein klares Öl, das die Titelverbindung und Benzylalkohol enthielt. Dieser Stoff wurde im nächsten Schritt verwendet.
    • Beispiel 20: anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7,9-dimethyl- 3,7-diazabicyclo-nonan-9-ol-4-chlorbenzoat (20).
  • Eine Portion des Rohprodukts aus dem obigen Schritt (0,054 g) wurde in Methylenchlorid (3 ml) gelöst, und 4-Chlorbenzoylchlorid (0,030 g, 0,17 mmol), 4-Dimethylaminopyridin (0,020 g, 0,16 mmol) und Triethylamin (0,022 ml, 0,16 mmol) wurden hinzugegeben. Die Lösung wurde für 15 h gerührt, dann wurden Wasser (5 ml) und Chloroform (5 ml) hinzugegeben. Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie gereinigt, um die Titelverbindung (25 mg) als klares Öl zu ergeben, das durch Zugabe von 1 N HCl in Et&sub2;O im Überschuß zum HCl-Salz konvertiert wurde.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,94 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 6,70 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 6,65 (s, 1H), 6,60 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 5,90 (s, 2H), 3,03 (d, J = 11,4 Hz, 2H), 2,87 (d, J = 11,0 Hz, 2H), 2,64-2,51 (m, 6H), 2,40-2,32 (m, 4H), 2,15 (s, 3H), 1,71 (s, 3H), 1,54 (m, 4H);
  • Massenspektrum m/z 485 (M + H)&spplus;.
    • Allgemeines Syntheseverfahren 4.
  • Eine Synthese von Verbindungen der Formel (1), worin
  • R wie für die allgemeine Formel (1) definiert ist,
  • R¹ wie in der allgemeinen Formel (1) definiert ist,
  • R³ H ist
  • und X = N-R² ist, worin R² gleich R ist, ist in Schema 4 umrissen. In Schema 4 wird 3,7-Bis(phenylmethyl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-on mit LAH reduziert, um den Alkohol zu ergeben. Die Benzyl-Gruppen werden entfernt und gegen BOC-Gruppen in einer Eintopfreaktion ersetzt, um 3,7-Di- (tert-butoxycarbonyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol zu ergeben. Der Alkohol kann dann zu einem Ester unter Standardbedingungen acyliert und die BOC- Gruppen durch Behandlung mit einer Säure entfernt werden. Die resultierende Verbindung wird dann mit zwei oder mehr Äquivalenten Aldehyd in Gegenwart eines Reduktionsmittels, wie harzgebundenem Cyanoborhydrid oder Natriumtriacetoxyborhydrid, umgesetzt, um Verbindungen der Formel (1) zu ergeben, worin R = R² ist.
  • Schema 4: (i) LAH, THF; (ii) H&sub2;, Pd/C, (BOC)&sub2;O, Ethylacetat; (iii) RCOCl, Et&sub3;N, CH&sub2;Cl&sub2;; (iv) HCl, Dioxan, CH&sub2;Cl&sub2;; (v) RCHO, harzgebundenes BH&sub3;CN, CN&sub3;CN.
    • Herstellung von 3,7-Di(tert-butoxycarbonyl)-3,7-diazabicyclononan-9- ol.
  • Zu 3,7-Bis(phenylmethyl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-on (4,2 g, 13,25 mmol) in wasserfreiem THF (200 ml) wurde LAH in drei Portionen (1,51 g, 39,75 mmol) gegeben. Die Reaktion wurde für ca. 12 h zum Rückfluß erwärmt und dann auf Eis gekühlt. Zur Reaktion wurden dann vorsichtig Wasser (1,5 ml), 15%iges wäßriges Natriumhydroxid (1,5 ml) und Wasser (4,5 ml) gegeben. Die Mischung wurde dann für ca. 12 h gerührt, Natriumsulfat wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde für ca. 1 h gerührt. Die Mischung wurde filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um ein Öl (4,1 g) zu ergeben. Eine Portion dieses Öls (768 mg) wurde in Ethylacetat (80 ml) in einer Fisher-Porter-Flasche gelöst. Zu dieser Lösung wurden Pd auf Kohlenstoff (10%, 750 mg) und Di-t-butyldicarbonat (1,33 g, 6,10 mmol)gegeben, und die Flasche wurde dreimal mit Stickstoff gespült und gefüllt. Die Flasche wurde dann evakuiert und mit 50 psi Wasserstoff unter Druck gesetzt. Diese Mischung wurde für ca. 16 h gerührt. Der Wasserstoff wurde evakuiert, und die Flasche wurde dreimal mit Stickstoff gespült. Die Mischung wurde filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das resultierende Öl wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt (Ethylacetat/Hexan-Gradient), um die Titelverbindung als weißen Schaum (495 mg) zu ergeben.
  • ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): 7,32 (m, 108), 3,48 (s, 2H), 3,07 (t, 1H), 2,60 (d, J = 10,2 Hz), 2,53 (d, J = 10,6 Hz, 1H), 2,25 (d, J = 8,88z, 1H), 2,05 (d, 2H);
  • Massenspektrum m/z 323,4 (M + H)&spplus;.
    • Herstellung von 3,7-Di-(tert-butoxycarbonyl)-3,7-diazabicyclononan-9- ol-4-chlorbenzoat.
  • Zu 3,7-Di(tert-butoxycarbonyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol (475 mg, 1,39 mmol) in Methylenchlorid (25 ml) wurden Triethylamin (0,390 ml), 4-Chlorbenzoylchlorid (0,23 ml, 1,81 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (221 mg, 181 mmol) gegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 2,5 h gerührt und dann mit Methylenchlorid verdünnt und mit 0,5 N wäßriger HCl und Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde die Lösung aufkonzentriert, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel mit 25% Ethylacetat in Hexan gereinigt, um die Titelverbindung zu ergeben (611 mg, 91%).
  • ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): 1,18 (s, 18H), 1,80 (s, 3H), 3,00 (t, 2H), 3,31 (t, 2H), 3,99 (m, 3H), 4,30 (m, 2H);
  • Massenspektrum m/z 365 (M + Na)&spplus;.
    • Herstellung von 3,7-Diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatdihydrochlorid.
  • Zu 3,7-Di(tert-butoxycarbonyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4- chlorbenzoat (605 mg, 1,25 mmol), gelöst in Methylenchlorid (20 ml), wurde 4 N HCl in Dioxan (20 ml) gegeben. Die Mischung wurde für 2 h gerührt und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben.
  • Massenspektrum m/z 281 (M + H)&spplus;.
    • Beispiel 21 : 3,7-Di(4-(3,4-methylendioxyphenyl)butyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester (21).
  • Zu 3,7-Diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatdihydrochlorid (1,00 g, 1,96 mmol) in Acetonitril (20 ml) wurden 4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butanal (1,32 g, 6,87 mmol) und 1,5 g harzgebundenes Cyanoborhydrid-Reagens gegeben. Die Mischung wurde für 1,5 Tage gerührt. Die Mischung wurde dann filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde an Silicagel mit einem Methylenchlorid/Methanol-Gradienten chromatographiert. Das Dihydrochloridsalz wurde dann durch Auflösen der freien Base in Methylenchlorid und Zugeben von 4 N HCl in Dioxan hergestellt. Entfernung des Lösungsmittels ergab die Titelverbindung als weißen Schaum (703 mg, 50%).
  • ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): 1,45 (s, 18H), 2,12 (s, 2H), 3,16 (m, 2H), 3,36 (t, 2H), 4,11 (m, 2H), 4,30 (m, 2H), 7,46 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,98 (d, J = 8,6 HZ, 2H);
  • Massenspektrum m/z 503,2 (M + Na)&spplus;.
  • Unter Verwendung eines dem für die obige Verbindung 21 ähnlichen Verfahrens wurden die in Tabelle 3 aufgeführten Verbindungen unter Verwendung des entsprechenden Aldehyds hergestellt. In einigen Fällen können andere Reduktionsmittel als das harzgebundene Cyanoborhydrid in der Reaktion verwendet werden. Z. B. wurde in mehreren Fällen Natriumtriacetoxyborhydrid verwendet. Tabelle 3
    • Allgemeines Syntheseverfahren 5
  • Eine Synthese von Verbindungen der Formel (1), worin
  • R wie für die allgemeine Formel (1) definiert ist,
  • R&sub1; wie für die allgemeine Formel (1) definiert ist,
  • R&sub3; H ist
  • und X Sauerstoff ist, ist in Schema 5 umrissen.
  • Die Synthese von Verbindungen der Formel (1), worin X Sauerstoff ist und R&sub2; 4-Chlorbenzoyl ist, ist in Schema 5 umrissen. Es ist für die Fachleute ersichtlich, daß andere Ester als das 4-Chlorbenzoat durch ähnliche Verfahren sowie andere Gruppen als Ether als R&sub1;-Verknüpfung hergestellt werden können. Das zuvor angegebene 7-(Phenylmethyl)-3-oxa-7- azabicyclo[3.3.1]nonan-9-on wurde mit einem Reduktionsmittel wie Natriumborhydrid reduziert, und die Benzyl-Gruppe wurde gegen BOC in einem Eintopfverfahren ausgetauscht, um den Alkohol als Mischung der Isomeren zu ergeben. Der Alkohol wurde mit 4-Chlorbenzoylchlorid umgesetzt, und die Isomere wurden durch Flasch-Chromatographie an Silicagel aufgetrennt, wobei das sich schneller bewegende Isomer syn-7-(tert-Butoxycarbonyl)-3-oxa-7- azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester ist. Die BOC-Gruppe wurde dann unter Standardbedingungen entfernt, und das resultierende Amin wurde mit Aldehyden unter reduzierenden Bedingungen umgesetzt, um die gewünschten Produkte zu ergeben.
  • Schema 5: (i) NaBH&sub4;, iPrOH; (ii) H&sub2;, Pd/C, (BOC)&sub2;O, Ethylacetat; (iii) RCOCl, Et&sub3;N, DAMP, CH&sub2;Cl&sub2;; (iv) TFA, CH&sub2;Cl&sub2;; (v) RCHO, harzgebundenes BH&sub3;CN, CN&sub3;CN
    • Herstellung von syn-7-(tert-Butoxycarbonyl)-3-oxa-7- azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester
  • Zu einer Lösung aus 7-(Phenylmethyl)-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan- 9-on (8,02 g, 34,67 mmol) in 2-Propanol (120 ml) wurden Natriumborhydrid. (18,30 mmol) und Wasser (60 ml) gegeben. Die Mischung wurde ca. 15 h gerührt. Die Reaktion wurde mit 1 N wäßriger Hei gelöscht und der pH mit 15%igem wäßrigem Natriumhydroxid auf ca. 10 eingestellt. Die Mischung wurde dann mit Chloroform extrahiert, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um den Alkohol (8,0 g, 99% Ausbeute) zu ergeben. Dieser Stoff wurde direkt im nächsten Schritt verwendet.
  • Unter einer Stickstoffatmosphäre wurde Pd auf Kohlenstoff (10%1 g, 8,0 g) mit genügend Ethylacetat zur Herstellung einer dicken Aufschlämmung benetzt. Der obige Alkohol (8,0 g, 34,3 mmol) wurde in einer minimalen Menge Ethylacetat gelöst und zur Aufschlämmung aus Pd auf Kohlenstoff hinzugegeben. Di-t-butyldicarbonat (34,3 mmol), gelöst in einer minimalen Menge Ethylacetat, wurde dann hinzugegeben, und die Mischung wurde unter 5 psi Wasserstoff für ca. 15 h geschüttelt. Die Mischung wurde dann filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um ein Öl zu ergeben (7,7 g).
  • Zu einer Lösung des obigen BOC-geschützten Aminoalkohols (7,7 g, 31,6 mmol) in Methylenchlorid (250 ml) wurden Dimethylaminopyridin (39,56 mmol) und Triethylamin (63,3 mmol) gegeben. Dazu wurde dann 4-Chlorbenzoylchlorid getropft. Die resultierende Lösung wurde ca. 15 h gerührt. Die Mischung wurde mit 1 N wäßrigem Natriumbisulfit und gesättigtem Natriumbicarbonat gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde einer Mitteldruckchromatographie an Silicagel unter Verwendung von 30% Ethylacetat in Hexan unterworfen, um die Titelverbindung zu ergeben (2,59 g, 21%). Das schnellere Isomer wurde als das gewünschte anti-Isomer durch NMR-Methoden identifiziert.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,02 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,48 (d, J = 8,41 Hz, 2H), 4,61 (d, J = 13,8 Hz, 1H), 4,44 (d, J = 13,9 Hz, 1H), 4,09 (m, 2H), 3,91 (m, 2H), 1,92 (d, J = 9,9 Hz, 2H), 1,53 (s, 9H);
  • Massenspektrum m/z 404 (M + Na)&spplus;.
    • Herstellung von syn-3-Oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatestertrifluoressigsäuresalz.
  • syn-7-(tert-Butoxycarbonyl)-3-oxy-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4- chlorbenzoatester (3,61 mmol) wurde in Methylenchlorid (20 ml) gelöst und mit TFA (5 ml) behandelt. Die Mischung wurde für ca. 2 h gerührt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung zu ergeben.
  • ¹H-NMR (300 MHz, CD&sub3;CN): 8,09 (d, J = 8,6, 2H), 7,58 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 4,21 (d, J = 12,0 Hz, 2H), 3,93 (d, J = 12,2 Hz, 2H), 3,63 (t, 2H), 3,53 (d, J = 12,6 Hz, 2H), 2,30 (s, 2H);
  • Massenspektrum m/z 282,1 (M + H)&spplus;.
    • Beispiel 40: syn-7-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-3-oxa-7- azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester (40).
  • Zu syn-3-Oxa-7-azazbicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatestertrifluoressigsäuresalz (110 mg, 0,278 mmol), gelöst in 5 ml Acetonitril, wurden 4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butanal (80 mg, 0,417 mmol) und harzgebundenes Cyanoborhydrid (330 mg) gegeben. Dies wurde ca. 15 h geschüttelt, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel unter Verwendung von 10% Hexan in Ethylacetat gereinigt, um die Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben (87 mg, 68%).
  • ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): 8,01 (d, J = 8,68z, 2H), 7,46 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 6,70 (m, 3H), 5,92 (s, 2H), 4,15 (d, J = 11,9, 2H), 3,92 (d, J = 11,7 Hz, 28), 3,31 (d, J = 11,3, 2H), 2,57 (d, 48), 2,44 (s, 2H), 2,00 (s, 2H), 1,61 (s, 4H).
  • Massenspektrum m/z 458 (M + H)&spplus;.
  • Das Hydrochloridsalz der Verbindung 40 wird leicht unter Standardbedingungen hergestellt.
  • Unter Verwendung eines dem für die obige Verbindung 40 ähnlichen Verfahrens wurden die in Tabelle 4 aufgeführten Verbindungen unter Verwendung des entsprechenden Aldehyds hergestellt. In einigen Fällen können andere Reduktionsmittel als harzgebundenes Cyanoborhydrid in der Reaktion verwendet werden. Z. B. wurde in verschiedenen Fällen Natriumtriacetoxyborhydrid verwendet. Tabelle 4
  • Es wird für einen Fachmann ersichtlich sein, daß aus der oben in Schema 5 umrissenen Chemie Verbindungen der Formel (1) mit einer großen Reihe von unterschiedlichen Gruppen für R und R&sub1; hergestellt werden können. Dies kann z. B. durch Alkylierung, Acylierung oder Reaktion mit einem Isocyanat der Alkohol-Zwischenstufe, gefolgt von Entfernung der BOC- Schutzgruppe und anschließende Reaktion des Amins mit einem Aldehyd unter reduzierenden Bedingungen zum Erhalt des gewünschten Produkts erreicht werden. Durch eine solche Sequenz wurden die in Tabelle 5 aufgeführten Verbindungen hergestellt. Es wird ebenfalls durch einen Fachmann erkannt werden, daß dies in einer kombinatorischen Weise durchgeführt werden könnte, um eine große Anzahl von Verbindungen der Formel (1) zu erhalten. Tabelle 5 Tabelle 5 (Fortsetzung)
    • Allgemeines Syntheseverfahren 6
  • Eine Synthese von Verbindungen der Formel (1), worin
  • R wie für die allgemeine Formel (1) definiert ist,
  • R&sub1; 4-Chlorbenzoyl ist,
  • R&sub3; wie für die allgemeine Formel (1) definiert ist
  • und X Sauerstoff ist, ist in Schema 6 umrissen.
  • Die Einführung von Alkyl-Gruppen an R&sub3; wird durch Alkylierung von 7-(Phenylmethyl)-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-on unter Verwendung von Standardverfahren erreicht. Z. B. ergab die Behandlung von 7-(Phenylmethyl)- 3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-on mit Methyllithium in THF, gefolgt von Zugabe von 4-Chlorbenzoylchlorid und Trennung der Isomeren durch Silicagel- Chromatographie den syn-7-(Phenylmethyl)-9-methyl-3-oxa-7-azabicyclo- [3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester. Das schnellere Isomer wurde als das syn-Isomer durch 2D-NMR-Methoden identifiziert. Die Benzyl-Gruppe von syn-7-(Phenylmethyl)-9-methyl-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester wurde gegen Fmoc ausgetauscht, das nach der Reinigung entfernt wurde. Die freie Base wurde zum TFA-Salz konvertiert, und die Reaktion mit einem Aldehyd in Gegenwart eines Reduktionsmittels ergab Verbindungen der Formel (1).
  • Schema 6: (i) Alkyllithium, THF, 4-Chlorbenzoylchlorid; (ii) Fmoc-Cl, THF; (iii) Piperidin, DMF; (iv) TFA, CH&sub2;Cl&sub2;; (v) RCHO, harzgebundenes BH&sub3;CN, CN&sub3;CN
    • Herstellung von syn-7-(Phenylmethyl)-9-methyl-3-oxa-7-azabicyclo- [3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester.
  • Zu einer Lösung aus 7-(Phenylmethyl)-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan- 9-on (638 mg, 2,75 mmol) in THF (25 ml) wurde Methyllithium (3,92 ml, 1,4 M in Diethylether, 5,5 mmol) getropft. Die Reaktion wurde für 1 h gerührt, und dann wurde 4-Chlorbenzoylchlorid (0,70 ml, 5,5 mmol) hinzugegeben. Nach Rühren für ca. 2 h wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand durch Säulenchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines Ethylacetat/Hexan-Gradienten gereinigt. Das sich schneller bewegende Isomer wurde als Titelverbindung identifiziert (221 mg).
  • ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): 1,89 (S, 3H), 2,05 (S, 1H), 2,33 (S, 2H), 2,90 (D, J = 11,9 Hz, 2H), 3,62 (S, 2H), 3,90 (D, J = 11,3 Hz, 2H), 4,16 (M, 2H), 7,41 (M, 7H), 7,95 (D, J = 8,45 Hz, 2H);
  • Massenspektrum m/z 386,2 (M + H)&spplus;.
    • Herstellung von syn-7-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-9-methyl-3-oxa-7- azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester.
  • Zu einer Lösung aus syn-7-(Phenylmethyl)-9-methyl-3-oxa-7- azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester (3,97 g, 10,28 mmol) in THF (ca. 40 ml) bei -78ºC wurde 9-Fluorenylmethylchlorformiat (5,32 g, 20,56 mmol) gegeben, das in einer minimalen Menge THF gelöst war. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur über ca. 15 h erwärmt, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel mit 20% Ethylacetat in Hexan gereinigt, um die Titelverbindung als gelben Feststoff zu ergeben (3,54 g, 66% Ausbeute).
  • ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): 1,81 (s, 1H), 2,07 (s, 1H), 2,31 (s, 2H), 3,42 (t, 2H), 3,66 (t, 1H), 3,91 (d, 1H), 4,14 (m, 3H), 4,29 (t, 1H), 4,45 (m, 3H), 7,32 (m, 8H), 7,77 (d, 2H), 7,93 (d, 2H);
  • Massenspektrum m/z 518 (M + H)&spplus;.
    • Herstellung von syn-9-Methyl-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4- chlorbenzoatester.
  • Zu syn-7-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-9-methyl-3-oxa-7-azabicyclo- [3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester (3,29 g, 6,34 mmol) wurde 30%iges Piperidin in DMF (ca. 125 ml) gegeben. Die Lösung wurde für 2 h gerührt, und dann wurde Wasser hinzugegeben und die Mischung mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der resultierende Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel mit einem Methanol/Methylenchlorid-Gradienten gereinigt, um die Titelverbindung als Öl zu ergeben (1,01 g, 54%).
  • ¹H-NMR (300 MHz, CDCl&sub3;): 1,87 (S, 3H), 2,16 (S, 2H), 3,19 (M, 2H), 3,29 (S, 2H), 3,97 (D, J = 11,8 Hz, 2H), 4,19 (D, J = 11,7 Hz, 2H), 7,41 (D, J = 8,80 Hz, 2H), 7,96 (D, J = 8,90 Hz, 2H);
  • Massenspektrum m/z 296 (M + H)&spplus;.
  • Das TFA-Salz der Titelverbindung wurde durch Auflösen der freien Base in Methylenchlorid und Zugeben eines Überschuß von TFA hergestellt. Das Lösungsmittel wurde dann unter reduziertem Druck entfernt, um das TFA-Salz der Titelverbindung als weißen Feststoff zu ergeben.
    • Beispiel 73: syn-7-(3-Phenylpropyl)-9-methyl-3-oxa-7- azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester (73).
  • Zum TFA-Salz von syn-9-Methyl-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4- chlorbenzoatester (12 mg, 0,03 mmol) in Acetonitril (ca. 0,2 ml) wurden 3-Phenylpropanal (0,2 ml, 1,0 M in Acetonitril) und harzgebundenes Cyanoborhydrid (ca. 200 mg) gegeben. Die Reaktion wurde für ca. 15 h geschüttelt und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an Silicagel unter Verwendung eines Ethylacetat/Hexan-Gradienten gereinigt, um die Titelverbindung (6 mg) zu ergeben.
  • Massenspektrum m/z 414 (M + H)&spplus;.
  • Unter Verwendung eines dem für die obige Verbindung 73 ähnlichen Verfahrens wurden die in Tabelle 6 aufgeführten Verbindungen unter Verwendung des entsprechenden Aldehyds hergestellt. Tabelle 6
    • Allgemeines Syntheseverfahren 7
  • Eine Synthese von Verbindungen der Formel (1), worin
  • R für die allgemeine Formel (1) definiert ist,
  • R&sub1; wie für die allgemeine Formel (1) definiert ist,
  • R&sub3; H ist
  • und X Schwefel ist, ist in Schema 7 umrissen.
  • Verbindungen der Formel (1), worin X Schwefel ist, werden in einer Weise hergestellt, die ähnlich derjenigen ist, worin X Sauerstoff ist, und in Schema 7 umrissen ist. Die Reduktion von 7-Benzyl-3-thia-7-azabicyclo- [3.3.1]nonan-9-on wird durch Standardverfahren erreicht, und der resultierende Alkohol wird als 4-Chlorbenzoatester geschützt. Die zwei regiomeren Alkohole wurden an diesem Punkt in der Synthese getrennt, wobei das gewünschte syn-Isomer schneller eluierte. Die Benzyl-Gruppe wird unter reduktiven Bedingungen entfernt, und das freie Amin wird mit einer BOC- Gruppe geschützt. Die reduktiven Bedingungen entfernen ebenfalls das Cl vom 4-Chlorbenzoat. Das Benzoat wird entfernt, und der resultierende Alkohol wird durch Standardverfahren acyliert. Die BOC-Gruppe wird dann mit starker Säure entfernt, und das resultierende Amin wird mit einem Aldehyd in Gegenwart eines Reduktionsmittels umgesetzt, um die gewünschte Verbindung zu ergeben.
  • Schema 7: (i) LAH, THF; (ii) 4-ClPhCOCl, CH&sub2;Cl&sub2;, Et&sub2;N, DMAP; (iii) Pd/C, HCO&sub2;NH&sub4;; (iv) (BOC)&sub2;O, NaOH, THF; (v) LiOH, H&sub2;O, MeOH, THF; (vi) 4-ClPhCOCl, CH&sub2;Cl&sub2;, Et&sub2;N, DMAP; (vii) TFA, CH&sub2;Cl&sub2;; RCHO, NaB(OAc)&sub3;H, CH&sub3;CN.
    • Herstellung von syn-7-Benzyl-3-thia-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol- benzoatester
  • Eine 1 M-Lösung aus Lithiumaluminiumhydrid (13,00 ml; 13,00 mmol) in THF wurde langsam zu einer Lösung aus 7-Benzyl-3-thia-7-azabicyclo[3.3.1]- nonan-9-on (3,20 g, 13,00 mmol) in THF (100 ml) unter Argon gegeben. Nach 15 h wurde Wasser (100 ml) hinzugegeben, und die Mischung wurde mit Et&sub2;O (2 · 150 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Schichten wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um eine Mischung aus den zwei regiometren Alkoholen zu ergeben. Das Rohprodukt wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) gelöst, und 4-Chlorbenzoylchlorid (2,10 ml, 16,2 mmol), NEt&sub3; (5,44 ml, 39,0 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (1,98 g, 16,2 mmol) wurden hinzugegeben. Nach 15 h wurden Wasser (100 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (100 ml) hinzugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohmaterial wurde durch Säulenchromatographie (20 : 1 Hexan/Ethylacetat) gereinigt, um die Titelverbindung (0,70 g, 21%) als klares Öl zu ergeben.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 7,97 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,44 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,37 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,27 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 7,18 (m, 1H), 5,12 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 3,46-3,42 (m, 4H), 3,10 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 2,54 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 2,42 (d, J = 13,0 Hz, 2H), 2,26 (bs, 2H);
  • Massenspektrum m/z 388 (M + H)&spplus;.
    • Herstellung von syn-3-Thia-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-benzoatester.
  • Ein Kolben, der syn.-7-Benzyl-3-thia-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4- chlorbenzoatester (0,080 g, 0,21 mmol), NH&sub4;CO&sub2;H (0,057 g, 0,91 mmol) und 10% Pd/C (0,060 g, 0,042 mmol) in Methanol (8 ml) enthielt, wurde für 15 h zum Rückfluß erwärmt. Nach Abkühlen auf RT wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, und CHCl&sub3; (10 ml) und gesättigte NaHCO&sub3;-Lösung (10 ml) wurden hinzugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das Lösungsmittel wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers entfernt, um die Titelverbindung (0,050 g, 91%) als gelbes Pulver zu ergeben.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,08 (d, J = 7,5 Hz, 2H), 7,58 (t, J = 7,5 Hz, 1H), 7,46 (t, J = 7,5 Hz, 2H), 5,30 (t, J = 4,5 Hz, 1H), 3,59 (d, J = 13,6 Hz, 2H), 3,43 (d, J = 14,3 Hz, 2H), 3,22 (d, J = 14,3 Hz, 2H), 3,00 (bs, 1H), 2,53 (d, J = 13,6 Hz, 2H), 2,09 (bs, 2H);
  • Massenspektrum m/z 264 (M + H)&spplus;.
    • Herstellung von syn-7-(tert-Butoxycarbonyl)-3-thia-7- azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester
  • Eine Lösung aus NaOH (0,15 g, 3,54 mmol) in Wasser (5 ml) wurde zu einer Lösung aus syn-3-Thia-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-benzoatester (0,62 g, 2,36 mmol) und (tBOC)&sub2;O (0,77 g, 3,54 mmol) in THF (20 ml) gegeben. Nach 16 h wurden CHCl&sub3; (20 ml) und 1 N NaOH-Lösung (20 ml) hinzugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das weiße Pulver wurde in THF (30 ml) und MeOH (5 ml) gelöst und zu einer Lösung aus LiOH (0,49 g, 11,8 mmol) in H&sub2;O (15 ml) gegeben. Die Mischung wurde bei RT gerührt, bis kein Ausgangsstoff zurückblieb, dann wurden CHCl&sub3; (40 ml) und H&sub2;O (40 ml) hinzugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Der rohe Alkohol wurde in CH&sub2;Cl&sub2; (35 ml) gelöst, und 4-Chlorbenzoylchlorid (0,37 ml, 2,95 mmol), NEt&sub3; (1,00 ml, 7,08 mmol) und 4-Dimethylaminopyridin (0,36 g, 2,95 mmol) wurden hinzugegeben. Nach 15 h wurden Wasser (50 ml) und CH&sub2;Cl&sub2; (50 ml) hinzugegeben. Die organische Schicht wurde abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohmaterial wurde durch Säulenchromatographie (20 : 1 Hexan/Ethylacetat mit 5% NEt&sub3; gereinigt um die Titelverbindung. (0,71 g, 76%) als weißes Pulver zu ergeben.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,01 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,43 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,22 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 4,43 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 3,47 (t, J = 10,7 Hz, 2H), 3,32 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 3,19 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 2,55 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 2,45 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 2,20 (d, J = 10,7 Hz, 2H), 1,48 (s, 9H).
    • Herstellung von syn-3-Thia-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatestertrifluoressigsäuresalz.
  • Trifluoressigsäure (0,68 ml, 8,82 mmol) wurde zu einer Lösung aus syn-7-(tert-Butoxycarbonyl)-3-thia-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester (0,70 g, 1,76 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (30 ml) bei RT unter Argon gegeben. Die Lösung wurde gerührt, bis kein Ausgangsmaterial zurückblieb, dann wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt, um die Titelverbindung (0,70 g, 97%) als blaßgelben Feststoff zu ergeben.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,01 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,43 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 5,22 (t, J = 4,4 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 4,43 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 3,47 (t, J = 10,7 Hz, 2H), 3,32 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 3,19 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 2,55 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 2,45 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 2,20 (d, J = 10,7 Hz, 2H), 1,48 (s, 9H).
    • Beispiel 78: syn-7-(2-Benzyloxypropyl)-3-thia-7-azabicyclo- [3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester (78)
  • Eine Lösung aus syn-3-Thia-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4- chlorbenzoatestertrifluoressigsäuresalz (0,17 g, 0,43 mmol) und 2-Benzyloxypropanal (0,10 g, 0,64 mmol) in Acetonitril (10 ml) wurde für 1 h gerührt, dann wurde NaB(OAc)&sub3;H (0,27 g, 1,29 mmol) hinzugegeben. Nach 16 h wurde gesättigte NaHCO&sub3;-Lösung (10 ml) hinzugegeben. Die Mischung wurde mit Chloroform (2 · 10 ml) extrahiert, dann wurden die vereinigten organischen Schichten über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das Rohprodukt wurde durch Säulenchromatographie (10 : 1 Hexan/Ethylacetat mit 5% NEt&sub3;) gereinigt, um die Titelverbindung (0,12 g, 63%) als weißen Feststoff zu ergeben.
  • ¹H-NMR (400 MHz, CDCl&sub3;): 8,03 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 7,45-7,25 (m, 78), 5,16 (t, J = 4,6 Hz, 1H), 4,69 (d, J = 12,0 Hz , 1H), 4,64 (d, J = 12,0 Hz, 1H), 3,75 (Sextett, J = 6,1 Hz, 1 h), 3,50-3,45 (m, 2H), 3,21-3,14 (m, 2H), 2,70- 2,28 (m, 8H), 1,31 (d, J = 6,1 Hz, 3H);
  • Massenspektrum m/z 445 (M + H)&spplus;.
  • Unter Verwendung eines dem für die obige Verbindung 78 ähnlichen Verfahrens wurden die in Tabelle 7 aufgeführten Verbindungen unter Verwendung des entsprechenden Aldehyds hergestellt. Tabelle 7
    • Beispiel 85: Verfahren zur Expression von Kv2.1 in einer Zellinie und Verfahren zur Messung der Fähigkeit von Hanatoxin und der Verbindung der Formel (1) zur Blockierung des Kv2.1-Kanals.
  • cDNA voller Länge von menschlichem Kv2.1 wurde aus polyA-RNA aus dem menschlichen Gehirn durch PCR amplifiziert. Zur PCR-Amplifizierung verwendete Oligo-Primer wurden gemäß der GeneBank-Eingangs-Nr. X68302 konstruiert. Die Sequenzen der zwei Primer sind: (5'PCR-Primer) 5'-GATGATATCAGCGATGCCGGCGGGCATGACGAAGCATG (SEQ ID NO: 1), (3'PCR-Primer) 5'-GCAGTTCAGATGCTCTGATCTCGTGTGCTTCC (SEQ ID NO: 2). Die cDNA wurde in pBS subkloniert und sequenziert. Ein HindIII-NotI-Fragment, das 2.1 voller Länge enthielt, wurde aus pBS/kv2.1 isoliert und zu pcDNA3 zur Expression subkloniert. Der Klon wurde in pcDNA3 unter CMV-Promotor überführt. Vorübergehende Expression in den CHO-Zellen wurde unter Verwendung von Lipofectamin erreicht. Spezifisch wurden 1,5 ug Plasmid-DNA (1,2 ug Kv2.1- Plasmid und 0,3 ug GFP-Plasmid Green LanternTM (GIBCO)) mit 100 ul DMEM/F 12 und 12 ul Lipofectamin für mindestens 15 min vorinkubiert. Im Anschluß an die Inkubation wurde 1,4 ml DMEM/F12 hinzugegeben und die Mischung auf CHO-Zellen (70 bis 90% konfluent) in einem Tablett mit 6 Vertiefungen überschichtet (1,5 ml/Vertiefung). Nach 6 bis 8 Stunden Inkubation wurden weitere 1,5 ml DMEM/F12-Medium, das 10% FBS enthielt, zur Transfektionsreaktion hinzugegeben. Nach weiterer Inkubation über Nacht wurden die Zellen aus der Platte mit 6 Vertiefungen mit 0,25% Trypsin entfernt und bei Einzelzelldichte (10% Konfluenz) in Platten mit 6 Vertiefungen plattiert, die 25 mm-Deckgläser enthielten. Nach Inkubation über Nacht wurden GFP-haltige Zellen auf Strom gepatcht.
  • Stabile CHO-Linien wurden unter Verwendung des gleichen Transfektionsprotokolls wie oben unter Ausschluß der GFP-DNA hergestellt. Nach 24 h wurden die Zellen auf DMEM/F12-Medium überführt, das 10% FBS und 50 ug/ml G418 enthielt. Nach 9 Tagen Selektion wurden Einzelzellklone unter Verwendung eines Zellsortierers erzeugt. Positive Klone wurden in situ unter Verwendung von Anti-Kv2.1-Antikörper (Upstate Bio) durchmustert, und positive Zellen wurden durch Patchen bestätigt.
  • Behandlung von CHO-Zellen, die Kv2.1 mit der Verbindung der Formel (1) stabil exprimieren, resultierte in einer Blockierung von Kv2.1, gemessen durch standardmäßige Whole-Cell-Patch-Clamp-Methoden (P. A. Smith, K. Bokvist, P. Arkhammer, P. O. Berggren, P. Rorsman, J Gen Pysiol 95, 1041-1059, 1990). Gemäß diesem Verfahren wies die Verbindung aus 4 einen IC&sub5;&sub0;-Wert von ca. 300 nM für die Blockierung von Kv2.1 auf. Ähnlich blockierte das aus dem Gift der Chilenischen Rosentarantel (Grammulosa spatulata) gereinigte Hanatoxin (durch das von K. J. Swartz, R. MacKinnon, Neuron, 15, 941-949, 1995 angegebene Verfahren) ebenfalls den verzögerten Gleichrichter-Kaliumstrom in diesen Zellen mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von ca. 60 nM. Diese Ergebnisse zeigen, daß sowohl die Verbindung der Formel (1) als auch Hanatoxin-Antagonisten für den verzögerten Gleichrichter- Kaliumkanal Kv2.1 sind.
    • Beispiel 86: Verfahren zur Messung der Fähigkeit von Antagonisten von Kv2.1 zur Steigerung der Insulinsekretion
  • Dieses Verfahren ist als das Pankreas-Perfusionsverfahren bekannt. Unter tiefer Isofluran-Anästhesie wurden die Tiere rasiert, mit Betadin gereinigt und auf einen Chirurgietisch plaziert. Ein Mittellinienschnitt wurde unter Verwendung eines Brenneisens zur Minimierung des Blutens durchgeführt, und die Eingeweide wurden zur rechten Seite zurückgezogen.
  • Das Kolon, Zökum und die damit verbundene Vene wurden isoliert und frei von Adventitia präpariert. Ein Paar Ligaturen wurde um das Kolon und das Zökum gesetzt, und sie wurden mit Scheren getrennt. Das Kolon wurde aus dem Duodenum getrennt, und die proximale Kolonvene wurde abgebunden und verschlossen. Die verbleibenden Eingeweide wurden dann abgebunden und entfernt. Die Nieren- und Nebennierengefäße wurden isoliert und abgebunden. Die Milz und das Magenmesenterium wurden getrennt, und die Magenarterie, -vene und die Speiseröhre wurden isoliert, abgebunden und zur rechten Seite zurückgezogen. Oberhalb der Niere wurden die Pakreas-Duodenum- und Bauch- Arterien freigelegt. Ligaturen wurden um die absteigende Aorta und die Vena cava sowohl unterhalb des Zwerchfells als auch auf der Höhe der Oberschenkel-Bifurkation gelegt. Eine Arterienklemme wird um die distale Aorta gerade unterhalb der Nierenarterie geklemmt, wodurch die Aorta verschlossen wird, so daß sie sicher durchschnitten und retrograd mit einer Kanüle versehen werden kann. Sobald die Klemme entfernt ist, wurde die Kanüle ca. 2 cm bis zu einem Punkt gerade oberhalb der Nierenarterien vorgeschoben und gesichert. Die Ligaturen um die Aorta am Zwerchfell wurden zugezogen, wodurch der Fluß vom Herz verschlossen wurde. Dies isolierte den Kreislauf in einer solchen Weise, daß der gesamte Strom zum Pankreas nun durch die Baucharterie über die Kanüle erfolgte. Die Pankreasperfusion wurde unter Verwendung einer Gilson-2-Kanal-Peristaltikpumpe (Modell 312) mit einer Fließgeschwindigkeit von ca. 3 ml pro Minute mit einem konstanten Perfusionsdruck von 28 bis 30 mmHg begonnen. Zwei Ligaturen wurden um den Gallengang und die Pfortader gelegt. Der proximale Knoten der Pfortader wurde verschlossen, das Gefäß durchschnitten und eine Kanüle eingeführt und fixiert. Das Zwerchfell wurde durchschnitten und die Aorta zum Ausbluten des Tieres durchtrennt. Nach Sicherung wurde der Chirurgietisch in eine Lucite-Box plaziert, auf -40ºC erwärmt und die Pfortvenen-Kanüle an einen automatisierten Fraktionssammler nach außen geführt. Die Temperatur des Pankreas wurde überwacht und auf -39ºC (±0,1º) unter Verwendung eines Thermistor-kontrollierten Erwärmungssystems (YSI, Yellow Springs, CO) gehalten.
  • Das Perfusat bestand aus den folgenden Bestandteilen (mM): NaCl, 119; KCl 4,70; NaHCO&sub3;, 5; CaCl&sub2;, 2,5; MgSO&sub4;, 1,2; NaH&sub2;PO&sub4;, 1,2; 0,3% BSA (Fraktion V, RIA-Qualität) und Na-HEPES, 20 mM; in entionisiertem Wasser vom Typ I (Picopure Systems, RTP, NC). Dextrose wurde zu den fertigen Perfusat-Lösungen zum Erhalt von Vorratskonzentrationen von 3 und 10 mM hinzugegeben. Testverbindungen und Standards zum Vergleich wurden in Perfusat-Vorratslösungen verdünnt. Im Anschluß an eine 25-minütige Äquilibrierungsperiode unter Verwendung von Perfusat, das 3 mM Glucose enthielt, wurde die Perfusat-Glucosekonzentration dann in einem Schritt auf 10 mM für 20 min erhöht, um die Insulin-Sekretionsreaktionen der ersten und zweiten Phase auszuwerten. Perfusat, das 10 mM Glucose und die Testverbindung enthielt, wurde begonnen und der Pankreas für 20 min durchspült. Proben wurden aus der Pfortader in 2 Minuten-Intervallen aufgefangen und die Insulinkonzentrationen unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Tests bestimmt. Die Fläche unter der Insulin/Zeit-Kurve wurde unter Verwendung von Standardverfahren berechnet.
  • Im obigen Test erhöhte die Verbindung 1 die Insulinsekretion gegenüber der Kontrolle. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in Tabelle 10 gezeigt.
    • Tabelle 10 Konzentration der Verbindung 1 im Perfusat Insulinfläche unter Kurve als % der Kontrolle
  • 100 nM 150
  • 300 nM 250
  • 1000 nM 280
    • Beispiel 87: Verfahren zur Identifizierung von extrinsischen Stoffen, die die Fähigkeit zur Modulierung der Kv2.1-Kanalaktivität besitzen.
  • βTC3-Neozellen (S. Efrat et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85, 9037- 9041, 1988) wurden zur Entfernung von Wachstumsmedium gewaschen, dann wurden pro Vertiefung 50 ul 4 uM Calciumgrün, das Pluronic F-127 enthielt, hinzugegeben und in FLIPR-Puffer ("Fluorometric Imaging Processor", fluorometrischer Bildgebungsverarbeiter) vermischt (145 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2;, 10 mM HEPES, pH 7,4). Die Zellen wurden bei 37ºC für 2 Stunden in Umgebungsluft ohne CO&sub2; inkubiert, um den Farbstoff in die intrazellulären Kompartimente zu füllen. Die Zellen wurden gewaschen, und pro Vertiefung wurden 100 ul von 1 mg/ml BSA in FLIPR-Puffer zur Entfernung von überschüssigem Farbstoff hinzugegeben. Nach 10 min bei RT wurde das BSA unter Verwendung des Mikroplattenspüler abgesaugt, und das entsprechende Volumen an Puffer wurde hinzugegeben. Die Platten wurden in einen Inkubator bei 37ºC plaziert und auf 37ºC vor der Verwendung im Test äquilibriert. Alle Platten mit Zugabe von Verbindung (125 ul von 4X Verbindung/Vertiefung) und Farbstoff-beladene Platten (125 ul, FLIPR-Puffer/Vertiefung) wurden auf 37ºC äquilibriert. Eine Fluoreszenz-Testplatte wurde mit FLIPR durchgeführt, und die Signalstärke wurde maximiert und das Signal angepaßt, um die Variation von Vertiefung zu Vertiefung zu minimieren. Eine repräsentative Testplatte wurde auf den Signalhintergrund untersucht und auf 22-25 000 Fluoreszenzeinheiten eingestellt. Glucose (25 ul einer 8 mM- Lösung in FLIPR-Puffer) wurde zu allen Vertiefungen einer mit Calcium Green beladenen Zelplatte gegeben, und die Platte wird in den FLIPR zur Überwachung der Zunahme der Fluoreszenz plaziert, um sicherzustellen, daß sie innerhalb des erwarteten Bereiches von 6 bis 8 min fällt, und um sicherzustellen, daß wenigstens 99% der Vertiefungen in einer ähnlichen Weise reagieren, um falsch-positive Ergebnisse zu minimieren. Wenn das Fluoreszenzsignal sich einem Plateau nähert, wurde der FLIPR zurückgesetzt, um Verbindungen aus der Zugabeplatte (50 ul; 1/4 Verdünnung) an die Zellplatte abzugeben (200 ul Endvolumen). Eine Zunahme im Fluoreszenzsignal, die 10% der KCl-Reaktion beträgt, ist charakteristisch für eine Verbindung, die den Kv2.1-Kanal moduliert. Z. B. besitzt die Verbindung 1 in diesem Testverfahren bei einer Konzentration von 1 uM eine Reaktion, die ca. 20% der KCl-Reaktion ist.

Claims (17)

1. Verwendung einer Verbindung der Formel (1) oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes oder Solvats davon:
worin R C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub1;&sub2;-Alkenyl, -CyH2y-R&sup7; oder -CyH2y-O-R&sup7; darstellt, worin y eine ganze Zahl von 1 bis 6 ist und R&sup7; Wasserstoff, C&sub1;&submin;&sub6;-Alkyl, C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl, C&sub4;&submin;&sub7;-Cycloalkenyl oder substituiertes oder unsubstituiertes Imidazolidinyl, Piperidyl, Piperazinyl, Pyrrolidinyl, Morpholinyl, Pyridyl, Pyridazinyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Pyrrolyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Pyranyl, Furyl, Thienyl, Oxazolyl, Isoxazolyl, Oxadiazolyl, Thiazolyl, Thiadiazolyl, Triazolyl oder Tetrazolyl ist,
oder R -CyH2y-R&sup9; -CyH2y-O-R&sup9; oder -CyH2y-O-CH&sub2;-R&sup9; darstellt, worin y unabhängig wie oben definiert ist und R&sup9;
ist, worin R&sub4; Wasserstoff oder Halogen ist und R&sub5; und R&sub6; unabhängig Wasserstoff, Halogen oder -O-C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl darstellen oder R&sub5; und R&sub6; zusammen einen Methylendioxy- oder Ethylendioxy-Ring bilden können;
R&sub1;
darstellt, worin R&sub8; unabhängig Wasserstoff, Halogen, -O-C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl, C&sub1;&submin;&sub3;-Fluoralkyl oder -C(O)-R&sup9; ist, worin R&sup9; C&sub4;&submin;&sub8;-Alkyl oder C&sub3;&submin;&sub7;-Cycloalkyl ist;
X O, S oder N-R² darstellt, worin R² unabhängig wie oben für R definiert ist; und
R³ H oder C&sub1;&submin;&sub3;-Alkyl darstellt, in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von nicht-insulinabhängigem Diabetes.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1, worin, wenn R² Alkyl ist, R² C&sub1;&submin;&sub2;- Alkyl oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat davon ist.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, worin R³ H oder Methyl oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat davon ist.
4. Verwendung gemäß Anspruch 1 bis 3, worin R&sup7; ein unsubstituierter Heterocyclus ist.
5. Verwendung gemäß Anspruch 4, worin der Heterocyclus Furyl oder Thienyl ist.
6. Verwendung gemäß Anspruch 1 bis 3, worin R C&sub6;&submin;&sub1;&sub0;-Alkyl ist.
7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, worin zwei der R&sup8;-Substituenten in R&sup7; Wasserstoff sind.
8. Verbindung gemäß Anspruch 7, worin der verbleibende R&sup8;- Substituent Halogen ist.
9. Verwendung einer Verbindung der Formel (1), die:
anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
anti-3-(4-(3,4-Ethylendioxyphenyl)butyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
anti-3-(3-Methyl-3-benzyloxypropyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9- ol-4-chlorbenzoatester;
anti-3-(Benzyl)-7-methyl-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4- chlorbenzoatester;
anti-3-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-7,9-dimethyl-3,7- diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoat;
3,7-Di(4-(3,4-methylendioxyphenyl)butyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol- 4-chlorbenzoatester;
3,7-Di(4-(3,4-dimethoxyphenyl)butyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4- chlorbenzoatester;
3,7-Di(furanylmethyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
3,7-Di(4-(3,4-ethylendioxyphenyl)butyl)-3,7-diazabicyclononan-9-ol-4- chlorbenzoatester;
syn-7-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]- nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
syn-7-Hexyl-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzoatester;
syn-7-(4-(3,4-Methylendioxyphenyl)butyl)-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]- nonan-9-ol-4-chlorbenzylether;
syn-7-Hexyl-3-oxa-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4-chlorbenzylether;
syn-7-(2-Benzyloxypropyl)-3-thia-7-azabicyclo[3.3.1]nonan-9-ol-4- chlorbenzoatester
oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat davon ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von NIDDM.
10. Verwendung einer Verbindung gemäß Anspruch 1, die eine Verbindung der Formel (1a) oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Solvat davon ist
in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von NIDDM.
11. Verwendung eines Antagonisten des verzögerten Gleichrichter- Kaliumkanals Kv2.1 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von NIDDM.
12. Verwendung gemäß Anspruch 11, worin der Antagonist Hanatoxin ist.
13. Verfahren zum Testen auf Verbindungen, die den verzögerten Gleichrichter-Kaliumkanal Kv2.1 modulieren, umfassend die Messung von Veränderungen im intrazellulären Ca²&spplus; in einer geeigneten Zellinie in Gegenwart von Glucose und zusätzlicher Gegenwart oder Abwesenheit einer Verbindung, die eine modulierende Aktivität aufweisen kann.
14. Verfahren zum Testen auf Verbindungen, die eine Glucose- empfindliche, die Sekretion von Insulin anregende Aktivität zeigen, umfassend die Messung von Veränderungen im intrazellulärem Ca²&spplus; in einer geeigneten Zellinie in Gegenwart von Glucose und zusätzlicher Gegenwart oder Abwesenheit einer Verbindung, die eine Glucose-empfindliche, die Sekretion von Insulin anregende Aktivität aufweisen kann.
15. Verfahren gemäß Anspruch 13 oder 14, worin die Zellinie die βTC3-Insulom-Neozellinie ist.
16. Verfahren zum Testen auf Verbindungen, die den verzögerten Gleichrichter-Kaliumkanal Kv2.1 modulieren, umfassend das Exprimieren von Kv2.1 in einer geeigneten Zellinie und das Behandeln mit Verbindungen, die die Fähigkeit zur Modulierung der Kv2.1-Aktivität aufweisen können, und Messen einer Veränderung im K&spplus;-Strom.
17. Verfahren zum Testen auf Verbindungen, die den verzögerten Gleichrichter-(Kv2.1)-Kaliumkanal modulieren, umfassend die Messung der Verdrängung von rekombinantem, synthetischem oder gereinigtem Hanatoxin aus Zellmembranen, die menschliche, verzögerte Gleichrichter-Kaliumkanäle Kv2.1 enthalten.
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