DE69733083T2

DE69733083T2 - Methode und zusammensetzungen für die diagnose von extra-esophagem reflux

Info

Publication number: DE69733083T2
Application number: DE69733083T
Authority: DE
Inventors: James Koufman
Original assignee: Wake Forest University
Current assignee: Wake Forest University
Priority date: 1996-09-23
Filing date: 1997-09-23
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2017-09-24
Also published as: JP2001501817A; US5879897A; CA2266850C; ATE293704T1; EP0944736B1; EP0944736A1; WO1998012349A1; EP0944736A4; CA2266850A1; DE69733083D1; AU4738297A

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete Otolaryngologie, Gastroenterologie, Anästhesiologie, Pulmonologie und Intensivmedizin und insbesondere die Gebiete Nachweis und Diagnose von Ösophagus- und Extraösophagus-Magen-Rückfluß (EEGR).
2. Beschreibung des verwandten Stands der Technik
Magen-Rückfluß, und insbesondere EEGR, beeinflußt die Entwicklung, Dauer und/oder das Ergebnis der meisten Haupterkrankungen der Atemwege (d.h. der Laryngopharynx, des Tracheobronchialbaums und der Lunge (Koufman 1991). Es ebenso vorgeschlagen worden, daß EEGR ein ursächlicher Faktor für Asthma, chronische obstruktive Lungenkrankheit, plötzlicher Kindstod (SIDS) und Larynx-Carcinogenese ist (Baccino et al., 1988; Herbst et al., 1979; Paton et al., 1989; Morrison 1988; Ward and Hanson 1988; Koufman 1991).
Gastro-Ösophagus-Rückfluß (GER) bezieht sich auf den Rückfluß von Mageninhalten in die Speiseröhre. Ein gewisser GER ist normal. Jedoch verursacht GER in Individuen mit übermäßigem Rückfluß, entweder hinsichtlich der Menge oder der Dauer, ein signifikantes Leiden und Gewebeschädigung und wird als Magen-Speiseröhre-Rückflußerkrankung (GERD) bezeichnet. GERD hat ein relativ breites Spektrum an klinischen Manifestationen, ist aber im wesentlichen durch die Entwicklung von „Peptischer Ösophagitis" (Speiseröhrenentzündung, sogar Ulceration, Strictur, Metaplasie und Neoplasie als das Ergebnis von übermäßigem Kontakt der Speiseröhrenschleimhaut mit Magensäure und Pepsin, dem Hauptverdauungsenzym des Magens) definiert.
Es wird geschätzt, daß 10% aller Amerikaner täglich Symptome von Sodbrennen und Regurgitation haben, und 30% haben weniger häufig Symptome (Castell et al. 1987), aber Schätzungen der Anzahl an Amerikanern mit Larynx-, Stimm- und Luftwegserkrankungen, die mit Rückfluß in Verbindung stehen, bleiben unbekannt, da Leute mit EEGR oft keine Ösophagitis oder Sodbrennen haben (Koufman 1991). Obwohl berichtet worden ist, daß zwei Drittel der Patienten mit Larynx- und Stimm-Erkrankungen EEGR als entweder das hauptsächliche ur sächliche Agens oder als einen signifikanten ätiologischen Co-Faktor haben, bleibt daher das Vorherrschen dieser Zustände, die mit EEGR in Beziehung stehen, unbekannt. Es wird geschätzt, daß EEGR bis zu 50% der erwachsenen Amerikaner über 40 Jahre beeinträchtigen kann.
Dennoch bleiben die Epidemiologien und natürlichen Historien von GERD aufgrund eines Mangels an empfindlichen und genauen Diagnosewerkzeugen zum Nachweis und Unterscheiden von GERD von EEGR und anderen Erkrankungen der Speiseröhre, der Kehle und der Luftwege volkommen unverstanden. Gastroenterologen und Otolaryngologen sind gegenwärtig gezwungen, Diagnosen auf der Grundlage der klinischen Hauptsymptome zu erstellen, z.B. Sodbrennen für GERD und EEGR für Heiserkeit. Jedoch beklagen sich weniger als die Hälfte aller Patienten mit EEGR in den Larynx- und Pharynxregionen (d.h. der Kehle), dokumentiert anhand von einer Überwachung des pH, über Sodbrennen oder Regurgitation (Ossakow et al. 1987; Koufman et al 1988; Koufman 1991; Koufman 1993; Koufman 1996; Wiener et al. 1986; Wiener et al. 1987; Wiener et al. 1989). Daher scheint der Hautunterschied hinsichtlich der Symptome zwischen EEGR- und GERD-Patienten zu sein, daß EEGR-Patienten selten Sodbrennen haben, das Hauptsymptom der Ösophagitis.
Patienten mit EEGR beklagen sich gewöhnlich über Symptome in der Kehle, wie etwa Heiserkeit, dem Empfinden eines Klumpen in der Kehle, chronisches Räuspern, Schluckepisoden oder Halsschmerz oder manchmal Lungensymptome, wie etwa chronischer Husten und Asthma (Ohman et al. 1983; Olson 1986; Wiener et al. 1986; Ossakow et al; 1987; Flores et al. 1981). Ösophagitis und Sodbrennen treten gewöhnlich in Patienten mit nächtlichem Rückfluß in Rückenlage auf, aber Patienten mit EEGR erfahren im allgemeinen einen Rückfluß tagsüber in aufrechter Lage (Koufman 1991; Wiener et al. 1989). Zusätzlich tendieren Patienten mit EEGR dazu, eine Dysfunktion des oberen Ösophagus-Sphincter (UES) zu haben, während typische Ösophagitis-Patienten überwiegend eine Dysfunktion des unteren Ösophagus-Sphincter (LES) haben. Da sich die Muster und Mechanismen des Rückfluß in Patienten mit EEGR signifikant von denen der Patienten mit GERD zu unterscheiden scheinen, werden Patienten mit EEGR häufig fehldiagnostiziert, da sie keine Ösophagitis und ihre Symptome haben (Wiener et al. 1989; Koufman 1991).
Über mehrere Studien, die Symptome, diagnostische Daten und Ergebnisse einer Behandlung von Patienten mit EGGR mit normalen Kontrollen und mit GERD (d.h. Ösophagitis)- Patienten vergleichen, ist berichtet worden (Koufman 1991; Wiener et al. 1986; Ossakow et al. 1987; Wiener, et al 1989). Auf der Grundlage der Tatsache, daß ähnliche diagnostische Verfahren für alle diese Studien verwendet wurden, wird ein Vergleichsprofil der beiden Zustände EEGR und GERD, in Tabelle 1 gezeigt. Diese zusammengesetzten Profile stammen aus der GERD-Literatur und den Daten des Erfinders.
TABELLE 1: Zusammenfassung der Unterschiede zwischen EEGR und GERD-Patienten
Da Patienten mit EEGR einen Rückfluß überwiegend am Tage in aufrechter Position haben, während GERD-Patienten einen nächtlichen Rückfluß in Rückenposition haben, ist es nicht überraschend, daß die Clearance von Säure aus der Speiseröhre bei Patienten mit EEGR bei nahe immer normal ist, während sie für Ösophagitis-Patienten immer verlängert ist. Diese Ergebnisse helfen zu erklären, warum Patienten mit EEGR keine Ösophagitis haben. Die gesamte Ösophagus-Säure-Kontaktzeit ist bei der EEGR-Gruppe normal, nicht aber in der Ösophagitisgruppe.
Zusätzlich zum Mangel an Sodbrennen und Ösophagitis scheinen Patienten mit EEGR eine sehr hohe Rate an Versagen einer medizinischen Behandlung mit H2-Rezeptor-Antagonisten zu haben, unabhängig von der Dosis. Koufman (1991) berichtete, daß die Versagensrate für Patienten mit EEGR, die mit Ranitidin behandelt wurden (in Dosen von 600 mg bis 1,200 mg pro Tag) 38% betrug. Diese Rate an medizinischem Versagen ist mehr als zweifach diejenige von ähnlich behandelten GERD-Patienten. Die hohen Raten an Behandlungsversagen für EEGR mit H2-Antagonisten kann auf drei miteinander in Beziehung stehenden Variablen beruhen: (1) H2-Antagonisten reduzieren die Magen-Acidität, beseitigen sie jedoch nicht; (2) obwohl es allgemein akzeptiert ist, daß die Pepsin-Aktivität Säure-aktiviert ist, verbleiben immer noch 70% der peptischen Aktivität bei einem pH größer als pH 4,0 (Piper and Fenton 1965); und (3) es scheint, daß die Schleimhaut der Larynx ihre einzige Schutzbarriere gegen peptische Verletzung ist. Wenn die Schleimhaut verletzt wird, dann kann eine Ulceration, Granulierung und Perichondritis auftreten. Dieser Schaden scheint hauptsächlich durch ein Aussetzen gegenüber Pepsin in dem Rückflußmaterial stattzufinden (Koufman 1991; Little et al. 1985; Lillemoe et al. 1982; Hirschowitz 1991; Johnson and Harmon 1986; Samloff and Taggart 1987). Daher könnte eine EEGR, die die Larynx beeinträchtigt, als „peptische Laryngitis" bezeichnet werden.
Nach zuverlässigen Diagnosewerkzeugen für GERD und insbesondere EEGR ist für Jahrzehnte gesucht worden. Seit den 1960ern ist eine pH-Überwachung verwendet worden, um GER zu diagnostizieren, da die Säure in dem Rückflußmaterial durch pH-Überwachung leicht gemessen werden kann. Aus diesem Grund wurde eine Doppelsonden-pH-Überwachung entwickelt.
Eine pH-Überwachung mit doppelter Sonde („double-probe pH monitoring") ist eine Technik, die simultan den pH in der Speiseröhre und der Kehle unter Verwendung einer Vorrichtung mißt, die aus dualen pH-Sensoren besteht, die in einen einzelnen Katheter eingebettet sind, so daß bei Einbringung in die Kehle und die Speiseröhre eine Sonde in der distalen Speiseröhre 5 cm oberhalb des LES ist und die andere Sonde in der Hypopharynx hinter dem Larynxeingang gerade oberhalb des UES ist. Patienten werden für 24 Stunden überwacht. Ein plötzliches Abfallen unterhalb von pH 4 in der Pharynxsonde, dem unmittelbar ein vergleichbares Abfallen im pH in der Speisenröhrensonde vorausgeht, wird als Anzeichen für EEGR angesehen.
Während dieser pH-basierende Assay der empfindlichste und spezifischste zu sein scheint, der für die Diagnose von EEGR bislang zur Verfügung steht, hat er mehrere Nachteile. Die Berechnungen seiner Empfindlichkeit reichen von nur 68% bis 80% (Koufman 1991). Möglicherweise ist, weil EEGR eine intermittierende, „vom Lebensstil abhängige" Erkrankung ist (Koufman 1991, 1996), eine 24-stündige Überwachungsperiode nicht immer ausreichend, um zu bestimmen, ob ein Patient früher EEGR-Ereignisse hatte oder ob zukünftige Ereignisse auftreten können. Dieses Problem wird durch die Natur des Assay verstärkt, der Wasserstoffionen nachweist, ein kleines Molekül, das in der Kehle nicht verbleibt. Zusätzlich ist diese Technik stark invasiv, d.h. näherungsweise 12% der Otolaryngologie-Patienten verweigern entweder die Prozedur oder können sie nicht ertragen. Darüber hinaus finden signifikante Modifikationen in der Ernährung während der pH-Überwachungsprozedur statt, was den Rückfluß künstlich unterdrücken kann und somit eine negatives Ergebnis fraglich macht. Und schließlich ist das Verfahren teuer und hat eine beschränkte Verfügbarkeit.
Pepsin, das als Säure-aktiviert angesehen wird, ist als ein diagnostischer Marker für GERD und EEGR ignoriert worden, weil Säure (pH) im Vergleich zu Pepsin ziemlich leicht zu messen ist. Da aber Patienten mit EEGR häufig keine Ösophagitis oder Sodbrennen haben, sind die pH-Überwachung und andere diagnostische Assays, die auf eine Ösophagitis testen, oft bei diesen Patienten in falscher Weise negativ. Mehrere Immuno-Assays sind entwickelt worden, um die Konzentration an Pepsinogenen I und II im Serum und im Urin zu messen, um ihr Potential als Diagnosemarker von entweder gastrointestinalen Geschwüren oder Magenkrebs zu bewerten (Waldum et al., 1979; Axelsson et al.; 1982; Huang et al., 1987; Huang et al., 1988). Es wird in Erwägung gezogen, daß Pepsin in das Blutserum durch GERD-induzierte Läsionen in der Kehle eindringen kann. Jedoch sind Veränderungen in den Pepsin-Konzentrationen in entweder dem Blutserum oder dem Urin aufgrund von GERD niemals bewertet worden, noch sind sie zu ihrer Verwendung als Diagnosemarker von GERD oder EEGR in Erwägung gezogen worden. Pals et al, Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 47, no 1, 1987, 29–34 und EP-A959078 betreffen Assays für Pepsinogen zum Studieren von Magenkrebs und Magengeschwüren. US-A-3063915 betrifft einen pH-basierenden Assay zum Bestimmen von Proteaseaktivität in biologischen Flüssigkeiten.
Es gibt deshalb einen unmittelbaren Bedarf, für ein nicht-invasives, genaues und weniger teures Diagnoseverfahren, das verwendet werden kann, um EEGR zu diagnostizieren und den Fortschritt von Behandlungen für eine Vielzahl von Krankheiten zu überwachen, einschließlich derjenigen der Kehle und der Speiseröhre, die mit EEGR und GERD in Beziehung stehen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung versucht, bestimmte Nachteile im Stand der Technik zu überwinden, indem sie Verfahren zum Nachweis und zum Diagnostizieren von Rückflußerkrankungen und Störungen bereitstellt, die mit Rückfluß in Beziehung stehen, indem die Anwesenheit von Pepsin in Sekretionen der Atemwege (z.B. Kehle, Lunge, Ösophagus oder Mund-Schleim/Sputum/Saliva) oder anderen Körperflüssigkeiten von Patienten nachgewiesen wird, von denen angenommen wird, daß sie eine Rückflußerkrankung oder Krankheit haben. Ein Vorteil der offenbarten Verfahren gegenüber Verfahren, die auf dem Nachweis von pH-Veränderungen basieren, ist der, daß Pepsin oder Pepsinogen aus Rückfluß im Schleim eingefangen wird und in der Kehle oder dem Ösophagus länger verbleibt als Säure (Wasserstoffionen) und somit für Stunden oder Tage nach einem Rückflußereignis nachgewiesen werden kann. Andere Vorteile schließen die nicht-invasive Natur und größere Empfindlichkeit eines Immunassay oder sogar eines enzymatischen Assay gegenüber der pH-Überwachung und die Fähigkeit ein, neutralen oder schwach sauren Rückfluß nachzuweisen, der durch ein pH-Überwachungsverfahren verpaßt werden kann.
Magenrückfluß wurde zuerst mit nachteiligen Effekten auf die Larynx (d.h. Kontaktgeschwüre und Granulom der Larynx) durch Cherry and Margulies (1968) und Delahunty und Cherry (1968) assoziiert. Wie hierin verwendet, betrifft GER einen Magen-Speiseröhren-Rückfluß („gastroesophageal reflux") oder die Anwesenheit von Mageninhalt in der Speiseröhre. GER enthält Säure und Pepsin. Der Bergriff „GERD", wie hierin verwendet, bedeutet eine Magen-Speiseröhren-Rückflußerkrankung. Laryngopharyngealer-Rückfluß (LPR) wird hierin als die außerhalb der Speiseröhre auftretende Manifestation von GER definiert und bezieht sich insbesondere auf den Rückfluß von Mageninhalt in die Laryngopharynx (d.h. die Kehle). Dieser Begriff ist mit dem Begriff „EEGR" austauschbar, betrifft aber insbesondere außerhalb der Speiseröhre auftretenden Magenrückfluß genau in die Laryngopharynx (d.h. die Kehle). Daher ist, obwohl die beiden Begriffe austauschbar verwendet werden können, der allgemeinere Begriff EEGR, aber der Begriff LPR ist in der „Laryngologie-Literatur" verwendet worden. LPR und EEGR werden hierin austauschbar verwendet.
Alle Patienten mit LPR haben einen gewissen GER, aber das umgekehrte ist nicht zutreffend (Koufman, 1991). In anderen Worten, Rückflußmaterial muß, um die Kehle zu erreichen, durch den Ösophagus wandern, aber bei den meisten Leuten mit GERD entkommt das Rückflußmaterial niemals dem Ösophagus in die Kehle oberhalb, da der obere Speiseröhren-Sphincter (UES) als eine effektive Barriere gegenüber EEGR dient (Koufman 1991, Gerhardt et al. 1987, Kahrilas et al. 1987). Wie hierin verwendet, bezieht sich die Abkürzung LES auf den unteren Speiseröhren-Sphincter, der den Magen von der Speiseröhre trennt. LPR ist eine zu GERD klinisch unterschiedliche Erkrankung.
Die vorliegende Erfindung kann in bestimmten breiten Aspekten als ein Verfahren zum Nachweis eines Magenrückflußereignisses definiert werden, umfassend den Nachweis von Pepsin oder Pepsinogen im Mund, einem Speiseröhren- oder Kehlen-Gebiet, eine Atemwegs- oder Körperflüssigkeitsprobe (z.B. einer Blutfraktion, wie etwa Blutserum oder Urin) eines Patienten. Der Magenrückfluß kann eine Manifestation einer Magen-Speiseröhren-Erkrankung, einer Laryngopharynx-Rückflußerkrankung oder sogar eines einzelnen akuten Zustands oder einer Erkrankung aufgrund einer ernährungsbedingten oder Lebensstil-Situation sein.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen ist das Verfahren zum Nachweis ein Immunassay. Der Immunassay kann eine beliebige Anzahl von Formen annehmen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf einen ELISA, einen ELCA, einen Radioimmunassay, eine Immunfällung oder andere auf dem Gebiet bekannte Verfahren. Insbesondere bevorzugt sind diejenigen Immunassays, bei denen ein Antikörper auf einem festen Träger immobilisiert ist. Solche Verfahren würden kompetitive ELISAs einschließen und würden ebenso Verfahren einschließen, bei denen ein immobilisierter Antikörper an ein Probenentnahmemittel angehängt ist, wie etwa einen Streifen aus Papier, Nitrocellulose oder einem anderen geeigneten Material, so daß der Antikörper in den Mund, die Kehle und/oder die Speiseröhre eines Patienten eingeführt werden kann. In bestimmten Ausführungsformen kann der immobilisierte Antikörper an ein Instrument oder Sonde angehängt sein, die in die Kehle aus einem anderen Zweck eingeführt ist, wie etwa einen Aspirator, ein Endoskop, ein Faserskop („fiberscope"), ein Laryngoskop, ein Endotrachealtubus, eine transnasale Magensonde, eine pH-Kathetersonde oder eine andere Dauerverweilvorrichtung.
Bevorzugte Antikörper zur Verwendung bei den vorliegenden Verfahren schließen jeden Antikörper ein, der mit den Pepsinen und Pepsinogenen immunreagiert, die im menschlichen Magen gefunden werden, einschließlich monoklonaler oder polyklonaler Antikörper. Da die Verfahren der vorliegenden Erfindung nicht von der Fähigkeit abhängen, eine bestimmte Isoform von Pepsin oder sogar von Pepsinogen nachzuweisen, wird gezeigt, daß eine Hühnchenantikörperzubereitung aufgrund ihrer Fähigkeit, mit vielfachen Antigenen kreuzzureagieren, besonders effektiv ist. Jedoch werden Antikörper aus einer beliebigen Quelle, wie etwa Kaninchen, Mäusen, Ratten, Ziegen und sogar menschlichen Zellen als effektiv bei der Ausübung der beanspruchten Verfahren in Erwägung gezogen, und bevorzugte Antikörper wären Antikörper, die mit humanem Pepsin immunreaktiv sind, die in einem Tier, wie etwa z.B. einer Ziege, entwickelt werden.
Zum Beispiel sind Antikörper gegen humane Pepsinogene entwickelt und verwendet worden, um Pepsinogene in menschlichem Serum nachzuweisen (Huang et al. Clinical Chimica Acta, 175: 37–50, 1988; Axelson et al. Clinical Chimica Acta, 121: 309–319, 1982), und solche Verfahren zum Verwenden von immunologischen Assays zum Nachweis von Pepsinogenen oder Pepsinen in außerhalb der Speiseröhre befindlichen Gebieten eines Patienten sind ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Es wird ebenso klar sein, daß die Anwesenheit von Pepsinogen als ein Indikator für Magengeschwüre berichtet worden ist, und es ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, daß die Anwesenheit von Pepsinogen im Serum eines Patienten auf entweder ein Magengeschwür oder eine Magenrückflußerkrankung hinweisen kann. In einem positiven Test auf Serum-Pepsinogen wäre deshalb eine weitere Diagnose notwendig. Da jedoch der gegenwärtige Erfinder keine Beschreibung von hohen Konzentrationen oder übernormalen Konzentrationen von Pepsinogen im Serum als einen Indikator für eine Magenrückflußerkrankung vor der vorliegenden Offenbarung kennt, ist dieser Aspekt einer kombinierten Diagnose ein neuer Aspekt der Praxis.
Es wird verstanden, daß die Ausübung der vorliegenden Erfindung nicht auf immunologische oder Antikörper-basierende Assays beschränkt ist. Der Nachweis von Pepsin oder Pepsinogen mit jedem bekannten oder auf dem Gebiet entwickelten Verfahren wird durch die vorliegende beanspruchte Erfindung umfaßt. Solche Verfahren schließen Proteinisolierungstechniken ein, die auf dem Gebiet bekannt sind, oder sogar enzymatische Assays auf die Anwesenheit von Pepsinaktivität. Beispielhafte enzymatische Assays wären Hämoglobinsubstratassays, beschrieben von Gotley et al. Gut, 32: 1093–1099, 1991, oder Yamada et al. Forensic Science International 52: 215–221, 1992. Zusätzlich wird jeder Assay, der die Aktivität oder das Vorhandensein von Pepsin in einem außerhalb der Speiseröhre befindlichen Gebiet, das kein Gebiet ist, in dem Pepsinogen sezerniert wird, von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Unter bestimmten breiten Aspekten kann die vorliegende Erfindung als ein Verfahren zum Diagnostizieren einer Magenrückflußerkrankung beschrieben werden. Dieses Verfahren umfaßt den Erhalt einer Probe aus einem Patienten, von dem angenommen wird, daß er eine Magenrückflußerkrankung hat, und den Nachweis der Anwesenheit von Pepsin oder Pepsinogen in der Probe. Der Nachweis kann, wie oben diskutiert, über jedes Mittel erfolgen, und ein bevorzugtes Mittel kann das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper sein, der mit humanem Pepsin und/oder Pepsinogen immunreaktiv ist, Nachweisen der Immunreaktion und Vergleichen der Immunreaktion mit einem Standard-Immunreaktions-Niveau. Wenn ein Standard für eine jeweilige Population festgesetzt worden ist, könnte man die Konzentrationen an Pepsin oder Pepsinogen, die z.B. im Mund, der Kehle, der Speiseröhre oder in Sekretionen oder Flüssigkeiten, die aus solchen Gebieten stammen, eines Mitglieds dieser Populationsgruppe vergleichen, um eine Rückflußerkrankung oder -ereignis zu diagnostizieren. Populationsgruppen könnten einschließen, wären aber nicht beschränkt auf erwachsene Männer, erwachsene Frauen, Kleinkinder oder verschiedene ethnische Gruppen. Grenzkonzentrationen und pathogene Konzentrationen von Pepsin können für jede dieser oder für alle solche Gruppen bei der Ausübung der beanspruchten Verfahren festgestellt werden. Zusätzlich würden die Kenntnisse, die durch die vorliegende Erfindung im Hinblick auf normale und pathologische Bereiche von Pepsin-Konzentrationen in Kleinkindern, Kindern und Erwachsenen bereitgestellt werden, die natürliche Geschichte von Erkrankungen, die mit Rückfluß in Beziehung stehen, etablieren und könnten bei der Vorhersage und Prognose der Entwicklung von anderen Zuständen der Atemwege, wie etwa z.B. Asthma, Lungenkrebs und dem plötzlichen Kindstod, nützlich sein.
Die zu analysierende Probe kann eine Auswurf-, eine Speichelprobe oder eine Probe aus der Schleimhaut der Atemwege oder sogar eine Serum- oder Urinprobe sein. In bestimmten Aus führungsformen, kann die Probe aus dem Gebiet zwischen dem unteren Speiseröhren-Sphincter und dem oberen Speiseröhren-Sphincter eines Patienten, aus dem Gebiet oberhalb des oberen Speiseröhren-Sphincter des Patienten oder beides sein. Beispielsweise kann das Nachweisverfahren auf einer kolorimetrischen Markierung, die an einen Antikörper angehängt ist, eine fluoreszierende Markierung, die an besagten Antikörper angehängt ist, beruhen oder mittels eines spektrophotometrischen Assay auf enzymatische Aktivität erfolgen.
Ein Aspekt der Erfindung kann in einer breiten Ausführungsform als ein Kit zum Nachweis von Magenrückfluß beschrieben werden. Der Kit umfaßt einen Antikörper, der mit humanem Pepsin oder Pepsinogen immunreaktiv ist, und ein Mittel für eine Probenentnahme bei einem Patienten. Der Kit kann ebenso Markierungsmittel, Indikatorreaktionsenzyme und Substrate und alle Lösungen, Puffer oder anderen Inhaltsstoffe, die für den Immunassay notwendig sind, umfassen. Mittel zu Probenentnahme können Tupfer („swabs"), Gefäße für Auswurf- oder Speichelproben oder sogar Streifen einschließen, die mit Antikörpern imprägniert sind. Die Bestandteile des Kit sind in enger Umfassung in einem Kasten enthalten, bevorzugt aus Plastik oder Karton, der zum Lagern des Kit in einem Kühlschrank, Gefrierschrank oder einem Schrank geeignet ist, solange der Kit nicht gebraucht wird. Ebenso kann Pepsin oder Pepsinogen-Proteine und möglicherweise Pepsinsubstrate zur Verwendung als Kontrollen eingeschlossen sein, um eine Standardkurve zu etablieren, ebenso wie geschriebene Anweisungen, die die Einzelheiten der bei der Verwendung der Kits zu befolgenden Protokolle darlegen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die folgenden Zeichnungen bilden Teil der vorliegenden Beschreibung und werden eingebaut, um bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung näher zu demonstrieren. Die Erfindung kann durch Bezugnahme auf eine oder mehrere dieser Zeichnungen in Kombination mit der detaillierten Beschreibung spezifischer hierin dargelegter Ausführungsformen verstanden werden.
1A. Die Ergebnisse von ELISA-ELCA-Assays, die die Fähigkeit von Hühnchen-Antikörpern zeigen, Schweine- und humanes Pepsin in vitro nachzuweisen. Nicht ausgefüllte Kreise sind Schweine-Pepsin bei 100 ng/ml. Ausgefüllte Kreise sind humaner Magensaft in einer 1:50-Verdünnung. Die Einheiten auf der Abszisse sind -fache Verdünnung der Probe.
1B. Ergebnisse von ELISA-ELCA-Assays, die die Fähigkeit von Ziegenantikörpern zeigen, Schweine-Pepsin in vitro nachzuweisen. Nicht-ausgefüllte Kreise sind Schweine-Pepsin bei 100 ng/ml. Ausgefüllte Kreise sind humaner Magensaft in einer 1:50-Verdünnung. Die Einheiten auf der Abszisse sind -fache Verdünnung der Probe.
2. Quantitativer Nachweis von Schweine-Pepsin durch Ziegenantikörper für bis zu fünf Stunden nach einer einzelnen, künstlich induzierten Pharynx-Rückfluß-Episode. Die Balken zeigen zwei Replikate, die aus Larynx-Auswaschungen von Ratten erhalten wurden. Die Einheiten auf der vertikalen Achse sind Konzentration von Pepsin in Nanogramm/ml, und die Abszisse ist die Zeit in Stunden nach dem Einflößen von Pepsin.
BESCHREIBUNG VON AUSFÜHRUNGSFORMEN ZU VERANSCHAULICHUNG
Es beruht auf der Entdeckung des gegenwärtigen Erfinders, daß ein effektiverer, empfindlicherer, weniger teurer und weniger invasiver Test auf EEGR auf dem Nachweis von Pepsin beruht, im Gegensatz zu den im Stand der Technik akzeptierten Verfahren, die auf einem Nachweis eines niedrigen pH aufgrund der Anwesenheit von Magensäure beruhen. Die vorliegende Entdeckung beruht auf der Erkenntnis, daß jeglicher GER Pepsin enthält, aber nicht jeglicher Rückfluß Säure enthält. Zum Beispiel kann, wenn ein Patient mit Antazida behandelt wird, der Patient einen Rückfluß mit neutralem pH (Rückfluß mit einem pH oberhalb pH 4) haben und immer noch an einer von mehreren Erkrankungen aufgrund von GER oder EEGR leiden oder diese entwickeln. Deshalb ist der wichtigste diagnostische Bestandteil von Magenrückfluß, der nachgewiesen werden muß, nicht die Säure oder ein niedriger pH, was von der medizinischen Öffentlichkeit als der diagnostische Marker akzeptiert worden ist, sondern Pepsin. Zusätzlich kann, weil Pepsin ein großes Molekül ist, das nicht rasch absorbiert oder neutralisiert wird, es in Ausscheidungen der Atemwege viel länger nachgewiesen werden, nachdem ein Magenrückfluß stattfindet, im Vergleich mit Wasserstoff-Ionen (oder niedrigem pH), da das Pepsin in Schleim und auf der Schleimhaut durch Schleim produzierende Drüsen eingefangen wird. Daher hat ein Immunassay, basierend auf dem Nachweis von Pepsin, das Potential, GERD und EEGR Stunden oder Tage, nachdem ein Rückflußereignis stattgefunden hat, nachzuweisen.
Die vorliegende Erfindung kann in bestimmten breiten Aspekten als Zusammensetzungen und hierin beschriebene Verfahren beschrieben werden, die verwendet werden können, um die Fähigkeit zur Diagnose und Behandlung von Patienten, die an GERD und insbesondere EEGR leiden, signifikant zu verbessern, indem viele der Nachteile und Beschränkungen der gegenwärtigen diagnostischen Methodologie überwunden werden. Die Erfindung stellt einen leicht zu verwendenden, nicht-invativen Diagnoseassay und bevorzugt einen Immunassay mit verbesserter Empfindlichkeit und Genauigkeit bereit, der weniger teuer und weniger invasiv ist als gegenwärtige diagnostische Verfahren, und von dem daher erwartet wird, daß er größere Akzeptanz bei der medizinischen Öffentlichkeit erreichen wird.
Insbesondere kann die Erfindung in bestimmten Ausführungsformen als ein ultraempfindlicher, hochspezifischer Immunassay beschrieben werden, der in der Lage ist, humanes Pepsin in vitro und in vivo (z.B. in Sekretionen der Atemwege), insbesondere in Sputum aus der Kehle, nachzuweisen. Pepsin ist immer im Rückfluß vom Mageninhalt vorhanden, und seine Anwesenheit im Sputum aus der Kehle wird als Hinweis auf LPR angesehen. Da die Anwesenheit von jeder Isoform von Pepsin für LPR diagnostisch ist, ist es nicht notwendig, zwischen den unterschiedlichen Isoformen von humanem Pepsin oder zwischen säureaktivierten und inaktiven (pepsinogenen) Formen von Pepsin zu unterscheiden. Daher hat diese Erfindung den zusätzlichen Vorteil, daß sie in der Lage ist, LPR im Rückfluß mit neutralem pH von Patienten zu diagnostizieren, die eine Säureunterdrückungstherapie durchlaufen, was die gegenwärtige Methodologie nicht leisten kann.
Die hierin offenbarten Anti-Schweine-Pepsin-Antikörper können verwendet werden, um humanes Pepsin aus Magenflüssigkeit oder Autopsie-Magenextrakten zur Verwendung als ein spezifisches Antigen für die weitere Antikörperproduktion aufzureinigen. Da kreuzreaktive Determinantien bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung nachgewiesen werden, können dieselben Hühnchen mit dem humanen Antigen „geboosted" werden, um zusätzliche kreuzreaktive Antikörper zur Verwendung bei den hierin offenbarten Verfahren zu erzeugen. Diese anti-humanen Antikörper aus den „geboosteten" Hühnchen sollten sogar eine größere Empfindlichkeit zur Verwendung bei der Diagnose von GER und insbesondere EEGR, wie hierin beschrieben, haben. Zusätzlich kann isoliertes humanes Pepsin ebenso verwendet werden, um Antikörper in einem Säugetier zu erzeugen, wie etwa einer Ziege, zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung.
Der für diesen Assay entwickelte Ansatz beruhte auf einer bekannten allgemeinen Beziehung zwischen evolutionärer Divergenz und immunologischer Erkennung. Je älter die evolutionäre Divergenz zwischen Spezies aus einer Linie der gemeinsamen Herkunft, desto größer ist im allgemeinen die immunologische Erkennung und Kreuzreaktivität zwischen den Spezies. Zum Beispiel werden Antikörper gegen Säugetier-IgG sowohl in Säugetieren als auch Hühnchen gezogen. Die in Hühnchen gezogenen Anti-Säugetier-IgG-Antikörper werden die IgGs von evolutionär weit divergenten Säugetierspezies erkennen, während die Anti-Säugetier-IgG-Antikörper, die in Säugetieren gezogen werden, hauptsächlich nur die IgG dieses spezifischen Antigens und aus Säugetier-Spezies erkennen werden, die evolutionär eng mit der immunisierten Säugetierspezies verwandt sind (Neo et al. 1973).
Der Punkt der Divergenz der Säugetierspezies von Vogel-Spezies lag vor mehreren hundert Millionen Jahren, deshalb ist es wahrscheinlich, daß Hühnchen-Antikörper in der Lage wären, diese Determinantien zu erkennen, wenn es irgendwelche gemeinsamen strukturellen Merkmale gibt, die die Säugetier-Pepsine von den Vogel-Pepsinen differenzieren. Auf dieser Annahme basierend, sollten Antikörper aus Hühnchen, die mit Schweine-Pepsin immunisiert worden sind, in der Lage sein, mit zu verwendenden humanen Pepsinen kreuz-zu-reagieren, um das Vorhandensein von Pepsin in Sputum aus der Kehle oder anderen menschlichen Proben nachzuweisen, oder um humanes Pepsin aus einer Lösung von humanem Magensaft zu isolieren.
Die als ein Teil der vorliegenden Entdeckung entwickelten Antikörper und Verfahren sind ebenso zum Quantifizieren von normalen Konzentrationen von Pepsinen und Pepsinogenen in den Gebieten Speiseröhre und Kehle einer allgemeinen Population oder sogar im Serum und Urin einer allgemeinen Population nützlich. Die Kenntnis von normalen Konzentrationen wird bei der Diagnose und Prognose von Magenrückflußerkrankungen mit jeglichem Mittel nützlich sein, das von der Bestimmung von Pepsinkonzentrationen in jeglicher biologischer Probe abhängt. Die Anti-Schweine-Pepsin-Antikörper sind ebenfalls nützlich, um humane Pepsine und Pepsinogene durch Kreuzreaktivität zu isolieren, und diese humanen Proteine sind nützlich, humanspezifischere Antikörper zur Verwendung bei den offenbarten Verfahren zu entwickeln. Es wird in Erwägung gezogen, daß diese anti-humanes-Pepsin-Antikörper bei der Ausübung der beanspruchten Verfahren empfindlicher sind.
Es ist klar, daß die Pepsin-Immunassays zum Nachweis von Magenrückfluß, wie hierin offenbart, die pH-basierenden Verfahren nach dem Stand der Technik ersetzen können. Von besonderem Vorteil ist die erhöhte Empfindlichkeit, die längere Periode nach einem Rückflußereignis, in der Pepsin im Vergleich mit Säure verbleiben kann, und die Fähigkeit, den Assay in ein Festträgerformat zu simplifizieren, z.B. einen Eintauchstab („Dipstick").
Jedoch wird ebenso in Erwägung gezogen, daß diese neuen Verfahren zusammen mit einem pH-basierenden Verfahren verwendet werden können, um ein zweites Diagnoseverfahren bereitzustellen, und ein Mittel zum Probennehmen für den Immunassay kann sogar an eine pH-Sonde für eine zeitgleiche Messung mit beiden Verfahren angehängt sein.
Immunnachweisverfahren
In bestimmten Ausführungsformen betrifft die vorliegende Erfindung Immunnachweisverfahren zum Binden, Reinigen, Entfernen, Quantifizieren oder andersartig allgemein Nachweisen von Pepsin. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Pepsinproteine oder -Peptide nachzuweisen. Die Schritte verschiedener nützlicher Immunnachweisverfahren sind in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben worden, wie etwa z.B. Nakamura et al. (1987), hierein durch Bezugnahme eingebaut.
Im allgemeinen schließen die Immunbindeverfahren den Erhalt einer Probe ein, von der angenommen wird, daß sie Pepsinproteine, -Peptide oder Anti-Pepsin-Antikörper enthalten, und In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Antikörper oder Pepsin-Protein oder -Peptid in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, wie der Fall gelagert sein mag, unter Bedingungen ein, die ausreichen, um die Bildung von Immunkomplexen zu ermöglichen.
Hinsichtlich des Antigen-Nachweises kann die analysierte biologische Probe jede Probe sein, von der vermutet wird, daß sie Pepsin-Proteine oder -Peptide enthält, wie etwa Speichel, Sputum aus der Kehle, GER, Schleimhaut, Schleimhautpräparationen, eine Schleimhautmembran, eine Schleimhautmembranpräparation, getrennte oder aufgereinigte Formen von einer der obigen Protein-enthaltenden Zusammensetzungen oder sogar jegliche biologische Flüssigkeit, die mit den oben erwähnten Geweben in Kontakt kommt, wie etwa Blut, Serum oder Urin.
Das In-Kontakt-Bringen der ausgewählten biologischen Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen, die wirksam sind, um die Bildung von Immunkomplexen zu ermöglichen (primäre Immunkomplexe) und für eine hierzu ausreichende Zeitperiode, ist im allgemeinen eine Angelegenheit des einfachen Zugebens der Antikörperzusammensetzung zu der Probe und des Inkubierens der Mischung für eine Zeitperiode, die für die Antikörper lange genug ist, um Immunkomplexe mit jeglichen vorhandenen Antigenen zu bilden, d.h. daran zu binden. Nach dieser Zeit wird die Proben-Antikörper-Zusammensetzung, wie etwa der Gewebeschnitt, die ELISA-Platte, der Dot-Blot oder der Western-Blot, im allgemeinen gewaschen, um jegliche nicht-spezifisch gebundene Proteine oder Peptide zu entfernen, was es nur denjenigen Proteinen oder Peptiden, die innerhalb der primären Immunkomplexe spezifisch gebunden sind, erlaubt, nachgewiesen zu werden.
Im allgemeinen ist der Nachweis der Immnunkomplexbildung auf dem Gebiet wohlbekannt und kann durch die Anwendung zahlreicher Ansätze erreicht werden. Diese Verfahren beruhen im allgemeinen auf dem Nachweis einer Markierung oder eines Marker, wie etwa einem aus den radioaktiven, fluoreszierenden, biologischen oder enzymatischen Anhängseln oder Markierungen, die Fachleuten auf dem Gebiet wohlbekannt sind. US-Patente, betreffend die Verwendung von solchen Markierungen, schließen 3,817,837; 3,850,752; 3,939,350; 3,996,345; 4,277,437; 4,275,149 und 4,366,241 ein, von denen jedes hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird. Natürlich kann man zusätzliche Vorteile durch die Verwendung eines sekundären Bindungsliganden finden, wie etwa eines zweiten Antikörpers oder einer Biotin/Avidin-Ligandenbindungsanordnung, wie auf dem Gebiet bekannt ist.
Immunassays
Immunassays, die von der vorliegenden Erfindung umfaßt sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf diejenigen, die in US-Patent Nr. 4,367,110 (doppelter monoklonaler Antikörper-Sandwich-Assay) und US-Patent Nr. 4,452,901 (Western Blot) beschrieben sind. Andere Assays schließen die Immunfällung von markierten Liganden und die Immuncytochemie sowohl in vitro als auch in vivo ein.
Immunassays sind in ihrem einfachsten und direkten Sinne Bindungsassays. Bestimmte bevorzugte Immunassays sind die verschiedenen Typen von Enzym-verknüpften immunosorbierenden Assays (ELISAs) und andere Festträger-Immunassays, die auf dem Gebiet bekannt sind. Am bevorzugtesten sind ELISAs, wie beschrieben von Doellgast et al. (1993, 1994) und von US-Patent Nr. 4,668,621. Immunhistochemischer Nachweis unter Verwendung von Gewebeschnitten und Radioimmunassays (RIA) sind ebenso besonders nützlich. Jedoch wird in leichter Weise erkannt werden, daß der Nachweis nicht auf solche Techniken beschränkt ist, und Western-Blotting, Dot-Blotting, FACS-Analysen und ähnliches können ebenso verwendet werden.
In einem exemplarischen ELISA werden die Antikörper der Erfindung auf einer ausgewählten Oberfläche immobilisiert, die Proteinaffinität aufweist, wie etwa in einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Dann wird eine biologische Probe, von der angenommen wird, daß sie das Pepsin- oder Pepsinogen-Antigen(e) enthält, das selbst an eine nachweisbare Markierung gebunden sein kann, zu den Näpfen zu begeben. Nach Bindung und Waschung, um nichtspezifisch gebundene Immunkomplexe zu entfernen, kann die Menge an gebundenem Pepsin- oder Pepsinogen-Antigen(en) bestimmt werden.
Alternativ kann der erste zugegebene Bestandteil, der innerhalb der primären Immunkomplexe gebunden wird, mittels eines zweiten Bindungsliganden nachgewiesen werden, der eine Bindungsaffinität für den primären Antikörper hat. In diesen Fällen kann der zweite Bindungsligand an eine nachweisbare Markierung verknüpft sein. Der zweite Bindungsligand selbst ist oft ein Antikörper, der daher als ein „sekundärer" Antikörper bezeichnet werden kann. Die primären Immunkomplexe werden mit dem markierten, sekundären Bindungsliganden oder Antikörper für eine ausreichende Zeitperiode und unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die effektiv sind, um die Bildung von sekundären Immunkomplexen zu ermöglichen. Die sekundären Immunkomplexe werden dann im allgemeinen gewaschen, um jegliche nicht-spezifisch gebundenen, markierten sekundären Antikörper oder Liganden zu entfernen, und die verbleibende Markierung in den sekundären Immunkomplexen wird dann nachgewiesen. Dieser Typ von ELISA ist ein einfacher „Sandwich-ELISA".
Weitere Verfahren schließen den Nachweis von primären Immunkomplexen mit einem zweistufigen Ansatz ein. Ein zweiter Bindungsligand, wie etwa ein Antikörper, der eine Bindungsaffinität für den primären Antikörper hat, wird verwendet, um sekundäre Immunkomplexe, wie oben beschrieben zu bilden. Nach Waschen werden die sekundären Immunkomplexe mit einem dritten Bindungsliganden oder Antikörper in Verbindung gebracht, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper hat, wiederum unter Bedingungen, die effektiv sind, und für eine Zeitperiode, die ausreicht, um die Bildung von Immunkomplexen zu ermöglichen (tertiäre Immunkomplexe). Der dritte Ligand oder Antikörper ist an eine nachweisbare Markierung geknüpft, was den Nachweis der so gebildeten tertiären Immunkomplexe ermöglicht. Dieses System kann eine Signalamplifizierung ermöglichen, sofern erwünscht.
In einem anderen beispielhaften ELISA werden die Proben, von denen angenommen wird, daß sie das Pepsin- oder Pepsinogen-Antigen(e) enthalten, auf die Napfoberfläche immobilisiert und dann mit Antikörpern der Erfindung in Kontakt gebracht. Nach Bindung und Waschung zum Entfernen von nicht-spezifisch gebundenen Immunkomplexen werden das gebundene Pepsin- oder Pepsinogen-Antigen(e) nachgewiesen. Wenn die anfänglichen Antikörper an eine nachweisbare Markierung geknüpft sind, können die Immunkomplexe direkt nachgewiesen werden. Wiederum können die Immunkomplexe unter Verwendung eines zweiten Antikörpers nachgewiesen werden, der eine Bindungsaffinität für den ersten (die ersten) Antipepsin- oder Pepsinogen-Antikörper hat, wobei der zweite Antikörper an eine nachweisbare Markierung geknüpft ist.
Ein weiterer ELISA, bei dem die Proteine oder Peptide immobilisiert sind, beinhaltet die Verwendung eines Antikörper-Wettbewerbs beim Nachweis. Bei diesem ELISA werden markierte Antikörper zu den Näpfen zugegeben, binden gelassen und mittels ihrer Markierung nachgewiesen. Die Menge an Pepsin- oder Pepsinogen-Antigen(en) in einer unbekannten Probe wird dann durch Mischen der Probe mit den markierten Antikörpern vor oder während der Inkubation mit beschichteten Näpfen bestimmt. Die Anwesenheit von Pepsin- oder Pepsinogen-Antigen(en) in der Probe dient dazu, die Menge an Anti-Pepsin- oder Pepsinogen-Antikörper(n) zu reduzieren, die für die Bindung an den Napf zur Verfügung stehen, und reduziert daher letztendlich das Signal.
Unabhängig von dem verwendeten Format haben ELISAs bestimmte Merkmale gemeinsam, wie etwa Beschichtung, Inkubation oder Bindung, Waschung, um nicht-spezifisch gebundene Spezies zu entfernen, und Nachweis der gebundenen Immunkomplexe. Diese werden wie folgt beschrieben:
Beim Beschichten einer Platte mit entweder Antigen oder Antikörper wird man im allgemeinen die Näpfe der Platte mit einer Lösung aus dem Antigen oder Antikörper inkubieren, entweder über Nacht oder für eine spezifizierte Periode an Stunden. Die Näpfe der Platte werden dann gewaschen werden, um unvollständig adsorbiertes Material zu entfernen. Jegliche verbleibende, zur Verfügung stehende Oberflächen der Näpfe werden dann mit einem nichtspezifischen Protein „beschichtet", das antigenisch neutral ist im Hinblick auf die Test-Antiseren. Diese schließen bovines Serumalbumin (BSA), Casein und Lösungen aus Milchpulver ein. Die Beschichtung ermöglicht eine Blockierung der nicht-spezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und reduziert damit den Hintergrund, der durch nicht-spezifisches Binden von Antiseren auf die Oberfläche verursacht wird.
Bei ELISAs ist es wahrscheinlich üblich, ein sekundäres oder tertiäres Nachweismittel statt einer direkten Prozedur zu verwenden. Daher wird nach Bindung eines Proteins oder eines Antikörpers an den Napf, Beschichtung mit nicht-reaktiven Material, um den Hintergrund zu reduzieren, und Waschen, um ungebundenes Material zu entfernen, die immobilisierende Oberfläche mit dem Kontrollantigen und/oder einer zu testenden biologischen Probe unter Bedingungen auf eine Weise in Kontakt gebracht, die der Bildung eines Immunkomplexes (Antigen/Antikörper) förderlich ist. Der Nachweis des Immunkomplexes erfordert dann einen markierten sekundären Bindungsliganden oder Antikörper oder einen sekundären Bindungsliganden oder Antikörper zusammen mit einem markierten tertiären Antikörper oder dritten Bindungsliganden.
„Unter Bedingungen auf eine Weise, die der Bildung eines Immunkomplexes (Antigen/Antikörper) förderlich ist" bedeutet, daß die Bedingungen bevorzugt die Verdünnung der Antigene und Antikörper mit Lösungen, wie etwa BSA, bovines Gammaglobulin (BGG) und Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS)/Tween einschließen. Diese zugegebenen Mittel haben ebenso die Tendenz, bei der Verringerung eines nicht-spezifischen Hintergrundes zu helfen.
Die „geeigneten" Bedingungen bedeuten ebenfalls, daß die Inkubation bei einer Temperatur und für eine Zeitperiode stattfindet, die ausreicht, um eine effektive Bindung zu ermöglichen. Die Inkubationsschritte sind typischerweise von ungefähr 1 bis 2 bis 4 Stunden bei Temperaturen bevorzugt in der Größenordnung von 25°C bis 27°C, oder können über Nacht bei ungefähr 4°C oder einer ähnlichen Temperatur stattfinden.
Nach allen Inkubationsschritten in einem ELISA wird die in Kontakt gebrachte Oberfläche gewaschen, um nicht-komplexiertes Material zu entfernen. Eine bevorzugte Waschprozedur schließt das Waschen mit einer Lösung, wie etwa PBS/Tween oder Boratpuffer ein. Nach der Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der Testprobe und dem ursprünglich gebundenen Material und einer darauffolgenden Waschung kann das Auftreten von sogar geringen Mengen an Immunkomplexen bestimmt werden.
Um ein Nachweismittel bereitzustellen, werden der zweite oder dritte Antikörper eine assoziierte Markierung haben, um einen Nachweis zu ermöglichen. Bevorzugt wird dies ein Enzym sein, das eine Farbentwicklung beim Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat erzeugen wird. Daher wird man z.B. den ersten oder zweiten Immunkomplex mit Urease-, Glukoseoxidase-, alkalischer Phosphatase- oder Wasserstoffperoxidase-konjugiertem Antikörper für eine Zeitperiode und unter Bedingungen in Kontakt bringen und Inkubieren, die die Entwicklung einer weiteren Immunkomplexbildung fördern (z.B. Inkubation für zwei Stunden bei Zimmertemperatur in einer PBS-enthaltenden Lösung, wie etwa PBS-Tween).
Nach einer Inkubation mit dem markierten Antikörper und im Anschluß an eine Waschung zum Entfernen von ungebundenem Material wird die Menge an Markierung quantifiziert, z.B. durch Inkubation mit einem chromogenen Substrat, wie etwa Harnstoff und Bromcresol-Violett oder 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure [ABTS] und H₂O₂, für den Fall, daß Peroxidase als die Enzymmarkierung eingesetzt wird. Die Quantifizierung wird dann durch Messen des Ausmaßes an Farberzeugung erzielt, z.B. unter Verwendung eines Spektrophotometers für Spektren im sichtbaren Wellenlängenbereich.
Die Verwendung der hierin offenbarten Verfahren und Zusammensetzungen sind nicht auf diejenigen Technologien beschränkt, die auf dem Gebiet bekannt sind, wie etwa ELCA, ELISA-Platte, Dot-Blot, Western-Blot oder andere Assays, die feste Träger als Teil ihrer Methodologie verwenden. Die vorliegende Erfindung kann ebenso in andere Vorrichtungen oder Verfahren zur Diagnose oder zum Überwachen von Magenrückfluß integriert sein. Diese anderen Vorrichtungen können einschließen, sind aber nicht beschränkt auf pH-Katheter-Sonden, doppelte pH-Sonden-Vorrichtungen, Endoskope, Faserskope, Laryngoskope, transnasale Magensonden, Endotrachealtuben oder andere Vorrichtungen, an die primäre, sekundäre oder tertiäre Immunkomplexe gebunden sein können, so daß Pepsin-Proteine oder -Peptide nachgewiesen werden können. Zusätzlich können Überwachungsports in Endotrachealtubi eingebracht sein, die zur Anästhesie (für eine Operation) oder für lebenserhaltende Maßnahmen in kritisch kranken Patienten im Körper des Patienten verweilen.
Alternativ können „Pepsin-Assay-imprägnierte Teststreifen" in Endotrachealtubi für eine einmalige Messung von Pepsin bei den Sekretionen von Atemwegen eingebettet sein. Ähnliche Vorrichtungen zur Verwendung in der Nasopharynx und Kehle werden ebenso als Teil von Schlafüberwachungsprozeduren und zum Rückfluß-Screening von anderen spezifischen Patientengruppen in Erwägung gezogen. Es ist ebenso klar, daß Proben von mehr als einem Ort, z.B. in der Speiseröhre und Kehle, entnommen und quantitativ verglichen werden können, um EEGR genauer zu diagnostizieren. Zusätzlich können diese „Pepsin-Assay-imprägnierten Teststreifen" mit einem pH-Teststreifen und/oder anderen Markern für Entzündung kombiniert werden, um beim Nachweis von EEGR oder anderen assoziierten Zuständen zu helfen.
Ein „Pepsin-Assay-imprägnierter Teststreifen" umfaßt bevorzugt einen Antipepsin- oder Antipepsinogen-Antikörper, der an das Teststreifenmaterial gebunden ist. Wenn dieser Streifen mit Pepsin in einer Probe aus einem Patienten in Kontakt tritt, wird ein Pepsin/Antikörperkomplex gebildet. Nach Waschen wird dieser Komplex durch einen zweiten oder sogar einen dritten Antikörper nachgewiesen, der an eine Indikatorgruppe konjugiert ist, wie oben diskutiert.
Antikörpererzeugung
Mittel zum Herstellen und Charakterisieren von Antikörpern sind auf dem Gebiet gut bekannt (siehe z.B. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; durch Bezugnahme hierin aufgenommen).
Polyklonale Antikörper
Ein polyklonaler Antikörper wird oft durch Immunisieren eines Tieres mit einer immunogenen Zusammensetzung in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung (entweder mit oder ohne vorherige Immuntolerierung, abhängig von der verwendeten Antigenzusammensetzung und Protokoll) und durch Sammeln von Antiseren aus diesem immunisierten Tier hergestellt. Eine große Vielzahl an Tierspezies kann für die Produktion von Antiseren verwendet werden. Typischerweise ist das für die Produktion von Anti-Seren verwendete Tier ein Kaninchen, eine Maus, eine Ratte, ein Hamster, ein Meerschweinchen, ein Hühnchen, oder eine Ziege. Wegen der relativ großen evolutionären Divergenz zwischen Vogelspezies und Säuge tierspezies ist ein Hühnchen eine bevorzugte Wahl zur Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen Säugetierpepsine. Jedoch ist für die Produktion von Anti-human-Pepsin-Antikörpern eine Ziege ein bevorzugtes Tier.
Wie auf dem Gebiet gut bekannt ist, kann eine gegebene Zusammensetzung in ihrer Immunogenizität variieren. Es ist deshalb oft notwendig, das Immunsystem des Wirts anzuregen („to boost"), was durch Koppeln eines Peptid- oder Polypeptid-Immunogens an einen Träger erreicht werden kann. Beispielhafte und bevorzugte Träger sind Keyhole-limpet-Hämocyanin (KLH) und Bovines Serum Albumin (BSA). Andere Albumine, wie etwa Ovalbumin, Maus-Serum-Albumin oder Kaninchen-Serum-Albumin können ebenso als Träger verwendet werden. Mittel zum Konjugieren eines Polypeptids an ein Trägerprotein sind auf dem Gebiet wohl bekannt und schließen Glutaraldehyd, m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester, Carbodiimid und bis-diazotisiertes Benzidin ein.
Wie ebenso auf dem Gebiet wohl bekannt ist, kann die Immunogenizität einer individuellen Immunogenzusammensetzung durch die Verwendung von nicht-spezifischen Stimulatoren der Immunantwort verstärkt werden, bekannt als Adjuvantien. Beispielhafte und bevorzugte Adjuvantien schließen vollständiges Freundsches Adjuvans (einen nicht-spezifischen Stimulator der Immunantwort, enthaltend abgetötetes Mycobacterium tuberculosis), unvollständige Freundsche Adjuvantien und Aluminiumhydroxid-Adjuvans ein.
Die bei der Herstellung von polyklonalen Antikörpern verwendete Menge an Immnunogenzusammensetzung variiert mit der Natur des Immunogens ebenso wie das Tier, das zur Immunisierung verwendet wird. Eine Vielzahl von Routen können verwendet werden, um das Immunogen zu verabreichen (subkutan, intramuskulär, intradermal, intravenös und intraperitoneal). Die Herstellung von polyklonalen Antikörpern kann durch Entnehmen von Blut des immunisierten Tiers zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Immunisierung überwacht werden. Eine zweite Booster-Injektion kann ebenso verabreicht werden. Der Prozeß des Boosting und des Titrierens wird wiederholt, bis ein geeigneter Titer erzielt ist. Wenn ein erwünschtes Niveau an Immunogenizität erhalten wird, kann das immunisierte Tier ausgeblutet und das Serum isoliert und gelagert werden, und/oder das Tier kann verwendet werden, um monoklonale Antikörper (MAbs) zu erzeugen.
Monoklonale Antikörper
Da davon ausgegangen wird, daß die Verfahren der vorliegenden Erfindung effektiver sind, wenn jegliches Pepsin oder Pepsinogen, das in dem Magen auftritt, von den Immunassays erkannt wird, ist eine bestimmte Menge an Kreuzreaktivität erwünscht. Deshalb sind polyklonale Antikörper bevorzugt, die soviel Pepsin- oder Pepsinogen-Antigene wie möglich erkennen. Alternativ kann man eine Mischung aus monoklonalen Antikörpern verwenden, von denen jeder auf ein bestimmtes Pepsin oder Pepsinogen gerichtet ist.
Die Verfahren zum Erzeugen von MAbs beginnen im allgemeinen in der selben Weise, wie die zum Herstellen von polyklonalen Antikörpern. MAbs können in leichter Weise durch die Verwendung von wohlbekannten Techniken hergestellt werden, wie etwa diejenigen, die in US Patent 4,196,265 beispielhaft veranschaulicht sind, hierin aufgenommen durch Bezugnahme. Typischerweise beinhaltet diese Technik das Immunisieren eines geeigneten Tiers mit einer ausgewählten Immunogenzusammensetzung, z.B. einem aufgereinigten oder partiell aufgereinigten Pepsinprotein, Polypeptid oder Peptid (oder jeglichem Proteinkomplex, wie einem Fusionsprotein, das einen immunologisch aktiven Teil eines Pepsinproteins enthält, wenn nach einer Tolerierung gegenüber üblichen Antigenen verwendet). Die Immunisierungszusammensetzung wird auf eine Weise verabreicht, die effektiv ist, um Antikörper erzeugende Zellen zu stimulieren. Hühnchen sind bevorzugte Tiere, jedoch ist die Verwendung von Zellen aus Ratten, Mäuseartigen, Kaninchen, Schafen oder Ziegen ebenso möglich.
Nach einer Immunisierung werden somatische Zellen mit dem Potential zum Erzeugen von Antikörpern, insbesondere B-Lymphocyten (B-Zellen) zur Verwendung in dem Protokoll zur Erzeugung von MAb ausgewählt. Diese Zellen können aus biopsierten Milzen, Mandeln oder Lymphknoten oder aus einer Peripherblutprobe erhalten werden. Milzzellen und Peripherblutzellen werden bevorzugt, die ersteren, weil sie eine reiche Quelle an Antikörper-produzierenden Zellen sind, die sich in dem sich teilenden Plasmablastenstadium befinden, und die letzteren, da Peripherblut leicht zugänglich ist. Oft wird eine Gruppe von Tieren immunisiert worden sein, und die Milz des Tiers mit dem höchsten Anitkörpertiter wird entfernt werden, und die Milzlymphocyten werden durch Homogenisieren der Milz mit einer Spritze erhalten werde. Typischerweise enthält eine Milz aus einer immunisierten Maus näherungsweise 5 × 10⁷ bis 2 × 10⁸ Lymphocyten.
Die Antikörper-erzeugenden B-Lymphocyten aus dem immunisierten Tier werden dann mit Zellen einer unsterblichen Myelomzelle, im allgemeinen eine aus der selben Spezies wie das Tier, das immunisiert wurde, fusioniert. Myelom-Zelllinien, die zur Verwendung bei Hybridom-produzierenden Fusionsprozeduren geeignet sind, sind bevorzugt nicht-Antikörper-erzeugend, haben eine hohe Fusionseffizienz und Enzymdefizienzen, die sie unfähig machen, in bestimmten selektiven Medien zu wachsen, die das Wachstum von nur den erwünschten fusionierten Zellen unterstützen (Hybridome).
Eine aus einer Vielzahl von Myelomzellen kann verwendet werden, wie Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist (Goding, S. 65–66; 1986; Campbell, S. 75–83, 1984). Zum Beispiel kann man, wenn das immunisierte Tier ein Maus ist, P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1,7 und S194/5XX0 Bul verwenden. Für Ratten kann man R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F und 4B210 verwenden; und U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 und UC729-6 sind alle im Zusammenhang mit humanen Zellfusionen nützlich.
Eine bevorzugte murine Myelomzelle ist die NS-1-Myelom-Zelllinie (ebenso als P3-NS-1-Ag4-1 bezeichnet), die von der NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository leicht erhältlich ist, indem man die Zelllinienhinterlegungsnummer GM3573 anfordert. Eine andere Maus-Myelomzellinie, die verwendet werden kann, ist die 8-Azaguanin-resistente Maus-murines Myelom-SP2/0-non-producer-Zellinie.
Verfahren zum Erzeugen von Hybriden aus Antikörper-erzeugenden Milz- oder Lymphknotenzellen und Myelomzellen umfassen gewöhnlich das Mischen von somatischen Zellen mit Myelomzellen in einem 2:1-Verhältnis, obwohl das Verhältnis von ungefähr 20:1 bis 1:1 variieren kann, in der Anwesenheit eines Mittels oder Mitteln (chemische oder elektrische), die die Fusion von Zellmembranen fördern. Fusionsverfahren unter Verwendung von Sendai-Virus sind von Kohler und Milstein (1975, 1976) beschrieben worden, und diejenigen, die Polyethylenglycol (PEG), wie etwa 37% (v/v) PEG verwenden, von Gefter et al. (1977). Die Verwendung von elektrisch induzierten Fusionsmethoden ist ebenso geeignet (Goding S. 71–74, 1986).
Fusionsprozeduren erzeugen gewöhnlich lebensfähige Hybride in niedrigen Frequenzen, ungefähr 1 × 10^–6 bis 1 × 10^–8. Jedoch stellt dies kein Problem dar, da die lebensfähigen, fusio nierten Hybride von den parentalen, nicht-fusionierten Zellen (insbesondere den nicht-fusionierten Myelomzellen, die sich normalerweise unendlich weiter teilen würden) durch Kultivieren in einem selektiven Medium differenziert werden. Das selektive Medium ist im allgemeinen eines, das ein Mittel enthält, das die de-Novo-Synthese von Nukleotiden in den Gewebekulturmedien blockiert. Beispielhafte und bevorzugte Mittel sind Aminopterin, Methotrexat und Azaserin. Aminopterin und Methotrexat blockieren die de-Novo-Synthese von sowohl Purinen als auch Pyrimidinen, während Azaserin nur die Purinsynthese blockiert. Wenn Aminopterin oder Methotrexat verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin und Thymidin als einer Quelle für Nukleotide supplementiert (HAT-Medium). Wenn Azaserin verwendet wird, wird das Medium mit Hypoxanthin supplementiert.
Das bevorzugte Selektionsmedium ist HAT. Nur Zellen, die in der Lage sind, Nukleotidrettungsstoffwechselwege („nucleotide salvage pathways") zu betreiben, sind in der Lage, in HAT-Medium zu überleben. Die Myelomzellen sind im Hinblick auf Schlüsselenzyme des Salvage-Stoffwechselwegs defizient, z.B. Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase (HPRT), und sie können nicht überleben. Die B-Zellen können diesen Weg betreiben, aber sie haben eine begrenzte Lebensspanne in der Kultur und sterben im allgemeinen innerhalb von zwei Wochen. Deshalb sind die einzigen Zellen, die in den selektiven Medien überleben können, diejenigen Hybride, die aus Myelom- und B-Zellen gebildet werden.
Dieses Kultivieren liefert eine Population von Hybridomen, aus denen spezifische Hybridome ausgewählt werden. Typischerweise wird eine Selektion von Hybridomen durch Kultivieren der Zellen durch Einzel-Klon-Verdünnung in Mikrotiterplatten, gefolgt von einem Testen der einzelnen klonalen Überstände auf die erwünschte Reaktivität (nach ungefähr zwei bis drei Wochen), durchgeführt. Der Assay sollte empfindlich, einfach und rasch sein, wie etwa Radioimmunassays, Enzym-Immunassays, Cytotoxizitätsassays, Plaque-Assays, Dot-Immunobindungsassays und ähnliches.
Die ausgewählten Hybridome werden dann seriell verdünnt und in einzelne Antikörper-erzeugende Zelllinien kloniert, wobei die Klone dann unendlich weiter propagiert werden können, um MAbs bereitzustellen. Die Zelllinien können auf ihre MAb-Produktion in zwei grundlegenden Wegen ausgenutzt werden. Eine Probe des Hybridoms kann (oft in die Peritonealhöhlung) in ein histokompatibles Tier desjenigen Typs injiziert werden, der verwendet wurde, um die somatischen und Myelomzellen für die ursprüngliche Fusion bereitzustellen. Das injizierte Tier entwickelt Tumore, die den spezifischen monklonalen Antikörper sezernieren, der durch den fusionierten Zellhybrid erzeugt wird. Die Körperflüssigkeiten des Tieres, wie etwa Serum- oder Ascites-Flüssigkeit, können dann abgelassen werden, um MAbs in hoher Konzentration bereitzustellen. Die individuellen Zelllinien können ebenso in-vitro kultiviert werden, wenn die MAbs in natürlicher Weise in das Kulturmedium sezerniert werden können, aus dem sie in leichter Weise in hohen Konzentrationen erhalten werden können. MAbs, die mit beiden Mitteln hergestellt worden sind, können weiter aufgereinigt werden, sofern erwünscht, unter Verwendung von Filtration, Zentrifugation und verschiedenen chromatographischen Verfahren, wie etwa HPLC oder Affinitätschromatographie.
Enzymatische Assays
Die enzymatischen Assays der vorliegenden Erfindung werden diejenigen einschließen, bei denen die Aktivität von Pepsin durch seinen Verdau eines Substrats, typischerweise Hämoglobin nachgewiesen wird. Nach Inkubation einer Probe wird die ultraviolette Extinktion bei 280 nm des Überstands gemessen. Typischerweise wird eine Reihe von Reaktionen mit einem identischen Substrat bei verschiedenen bekannten Enzymkonzentrationen durchgeführt, um eine „Standardkurve" zu erstellen. Die Extinktion des umgesetzten Probensubstrats wird dann mit der Standardkurve verglichen, um die Konzentration an Pepsin in der Probe zu bestimmen.
EXPERIMENTELLE PROZEDUREN
Immunisieren von Ziegen und Hühnchen
Fünf mg reines Schweinepepsin (Sigma Chemicals. St. Louis. MO) in einem getrockneten Röhrchen wurde aufgelöst und in vollständigem Freundschem Adjuvans emulgiert und subkutan in eine 1 Ziege oder 3 Hühnchen injiziert. Booster-Injektionen der selben Menge in unvollständigem Freundschem Adjuvans wurden in monatlichen Intervallen danach injiziert. Blutproben wurden in monatlichen Intervallen allen Tieren entnommen, und die Eier wurden täglich eingesammelt, beginnend mit dem Zeitpunkt der Immunisierung.
Herstellung der Hühnchen-IgY-Fraktion
Hühnchenantikörper wurden hergestellt, wie von Doellgast et al (1994) beschrieben. Eidotter wurden von den Eiern getrennt und in 0,025 M-Kaliumphosphat-gepufferter Salzlösung, pH 7,6 suspendiert (2 ml pro ml Dotter). Polyethylenglycol (Mol. gew. 8000) wurde auf eine Konzentration von 3% zugegeben, und die resultierende Suspension wurde bei 5.000 g für 30 Minuten zentrifugiert. Polyethylenglycol wurde auf eine Endkonzentration von 12% zugegeben, und die Suspension wurde wieder zentrifugiert, um das IgY-enthaltende Pellet zu erhalten. Dieses IgY-enthaltende Pellet wurde in 0,02 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,6, aufgelöst, bei 12.000 g für 10 Minuten zentrifugiert, um partikuläre Teilchen zu entfernen, und an eine QAE-Agarose-Säule gebunden (Q-Sepharose, Pharmacia Fine Chemical, Picataway, NJ). Ein Gradient von 0,0 bis 0,3 M NaCl wurde verwendet, um eine IgY-Fraktion abzutrennen, die mit einem Maximum bei näherungsweise 0,15 M NaCl eluierte. Die Fraktion wurde mit 40% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgefällt, gegen Phosphat-gepufferte Salzlösung dialysiert und entweder auf 50% Glycerinkonzentration gebracht oder in dieser Form zur Immunabsorption verwendet.
Herstellung von Ziegen-Ig-Fraktionen
Ziegenserum wurde auf eine Ammoniumsulfatkonzentration von 40% Sättigung durch Zugabe von 240 g Ammoniumsulfat pro Liter Serum gebracht und mittels Zentrifugation pelletiert. Dieses Pellet wurde gegen 0,05 M Kaliumphosphat, 0,15 M Natriumchlorid, pH 7,6 dialysiert und entweder auf 50% Glycerinkonzentrationen gebracht oder in dieser Form verwendet.
Herstellung von Pepsin-Immunabsorbentien
3 M-Corporation Emphase^TM-Absorbens (Pierce Chemicals, Rockford, IL) wurde mit Pepsin vermischt, aufgelöst in 1 M Kaliumphosphat, pH 7,6, in einem Verhältnis von 40 mg Pepsin pro Gramm Emphase^TM, suspendiert in 2x dem Rehydratationsvolumen von Emphase^TM (näherungsweise 6 ml pro Gramm). Die Mischung ließ man über Nacht bei Zimmertemperatur unter Mischen inkubieren, und sie wurde dann in eine 1 cm × 10 cm Glassäule gegossen. Die Säule wurde mit 1 M-Tris-Cl, pH 8,5, blockiert, in großem Umfang mit PBS gewaschen, dann mit 4 M NaCl in 0,05 M-Imidazol-HCl-Puffer, pH 8,0, und dann mit 4 M MgCl₂ in 0,05 M Imidazol-HCl, pH 8,0 behandelt. Die Säule wurde dann mit 0,05 M Imidazol-HCl 0,15 M NaCl, pH 7,8, gewaschen und zur Immnunabsorption verwendet.
Immunabsorptionsaufreinigung von spezifischen Antikörpern
Antikörperfraktionen aus entweder Hühnchen oder Ziegen wurden durch die Pepsinsäule laufen gelassen und mit 1 M NaCl in 0,05 M Imidazol-HCl, pH 8,0 gewaschen. Nach ungefähr 5 Säulen-Volumina Waschung wurde der gebundene Antikörper mit 4 M MgCl₂ in 0,05 M Imidazol-HCl, pH 8,0, eluiert, wie zuvor zur Aufreinigung von RVV-XA aus Schlangengift beschrieben (Durkee et al. 1993). Fraktionen, enthaltend den eluierten Antikörper, wurden in einer Amicon-Vorrichtung (Beverly, MA) aufkonzentriert, die mit einer YM-10-Membran ausgestattet war, und wurden wiederholt aufkonzentriert, nachdem sie in 0,05 M Imidazol-HCl-Puffer, pH 8,0 aufgelöst wurden. Der Antikörper wurde unter Verwendung von 40% gesättigtem Ammoniumsulfat ausgefällt und auf eine 1 × 50 cm-Säule von Sephacryl S 200^TM (Pharmacia Fine Chemicals) aufgetragen, um die IgG-(Ziege) oder IgY-Fraktion (Hühnchen) aus dem aggregierten Material zu trennen, wobei die Immunkomplexe und IgM (Ziege) in dem Hohlraumvolumen erschienen. Die Fraktionen wurden aus dem zurückbehaltenen Immunglobulin-Peak vereinigt, mittels Ausfällung aufkonzentriert, unter Verwendung von 40% gesättigtem Ammoniumsulfat, dialysiert und auf 50% Glycerin mittels Dialyse gegen ein gleiches Volumen an 100% Glycerin unter Mischen über Nacht bei Zimmertemperatur gebracht.
Herstellung von Konjugaten
Immunglobuline in 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,6, wurden mit 5 mM Dithiothreitol für 30 Minuten bei 30°C behandelt. Die reduzierten Immunglobuline wurden auf einer Spin-Säule mit SEPHADEX G25, äquilibriert mit 0,1 M Kaliumphosphat, pH 7,6, getrennt. Das Hohlraumvolumen, enthaltend 1 mg reduziertes Immunglobulin, wurde mit 1 mg einer 20 mg/ml-Lösung von RVV-XA-SMCC (wie zuvor beschrieben von Doellgast (1987)) oder mit einer 50 mM-Lösung von Fluoresceinmaleimid auf eine Endkonzentration von 1 mM vermischt. Das RVV-XA-Konjugat ließ man bei Zimmertemperatur für 4–16 Stunden reagieren und das Fluoresceinmaleimid-Konjugat für 1 Stunde. Das Fluoresceinmaleimid wurde rasch von dem Fluorescein-markierten Immunglobulin auf einer Spin-Säule mit G-25 SEPHADEX getrennt. Das RVV-XA-Ig-Konjugat wurde ohne weitere Aufreinigung verwendet.
Durchführung von ELISA-ELCA-Assays; Kreuzreaktivität von Schweine- und humanem Pepsin
ELISA-ELCA Assays werden durchgeführt, wie von Doellgast et al. (1994) und Doellgast et al. (1993) beschrieben. Platten, die mit entweder 10 μg/ml Affinitäts-aufgereinigtem Ziegen- oder Hühnchen-Antikörper in 0.2 M Natriumhydrogencarbonat, pH 9,5 beschichtet waren, wurden mit entweder Schweine-Pepsin-Standard oder Flüssigkeit ("humanem Magensaft") vermischt, die aus dem Magen eines Freiwilligen unter Verwendung einer transnasalen Magensonde abgesaugt und unter Verwendung von 1 M Dikaliumphosphatpuffer auf einen pH von 7,6 neutralisiert worden war. Die Proben werden in 50 mg/ml Casein, 0,05 M Imidazol-HCl, pH 8,0, enthaltend 0,5% Triton-X-100, verdünnt. Die Inkubation dauert 1 Stunde bei 37°C oder über Nacht bei 4°C. Die Platte wird dann gewaschen, und RVV-XA-Antikörper (Russell's Schlangengift-Koagulations-aktivierendes Enzym) wird zugegeben, und die Platte wird für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platte wird gewaschen, und die Elcatech-kits (Elcatech Inc., Winston-Salem, N. C.) zur Messung von gebundenen RVV-XA werden verwendet, um das gebundene Konjugat zu vermessen, wie vom Hersteller beschrieben.
Trennung von Pepsin von Magensaft
Unter Verwendung der Antikörperzubereitung, die Pepsin bindet, wird Pepsin, das mit diesem Antikörper reaktiv ist, auf Antikörpersäulen aufgereinigt. Magensaft, der durch eine transnasale Magensonde erhalten worden ist, die in Freiwillige eingeführt worden war, wird neutralisiert, gefiltert und durch eine Antikörpersäule laufen gelassen. Immunreaktives Material wird weiter unter Verwendung des Pepsin-spezifischen Assay überwacht, und dieses Material bindet an die Säule und wird unter Verwendung von 4 M MgCl₂ eluiert. Das eluierte Protein wird weiter unter Verwendung von Elektrophorese, Ionenaustausch und isoelektrischer Fokussierungstrennung charakterisiert. Immunassay und Pepsin-Aktivitätsassays werden verwendet, um diese getrennten Fraktionen routinemäßig zu bewerten. Da es mehrere Isotypen an humanem Pepsin gibt, d.h. mehrere Proteinisotypen, können Variationen hinsichtlich der spezifischen Reaktivität für getrennte Bestandteile auftreten. Eine Fraktionierung des Magensaftes ohne Immunabsorption und ein Assay auf sowohl Pepsinaktivität als auch Immunreaktivität werden verwendet, um zu bestimmen, ob und welche Isotypen mit den Anti-Schwein-Antikörpern nicht reaktiv sind.
Alternativ wurde humanes Pepsin aus humanen Magensaftproben folgendermaßen aufgereinigt: Magensaft wurde von Patienten erhalten, die Magenfunktionsanalysen durchliefen. Eine sequentielle QAE-SEPHAROSE-Chromatogaphie wurde durchgeführt, um Bestandteile mit niedrigem Molekulargewicht und niedrigem pKa zu isolieren. Die Bestimmung des Molekulargewichts und die Reinheit der Probe wurde mittels SDS-PAGE-Gel-Elektrophorese bestätigt. Die funktionelle (enzymatische) Aktivität wurde im wesentlichen mit dem Verfahren von Anson bestimmt (J. Gen. Physiol. 22: 79–83, 1938).
Die erhaltenen Endprodukte schlossen drei Zubereitungen für insgesamt 105,6 mg Pepsin 3 ein, der überwiegenden Pepsin-Isoform, die näherungsweise 75% der enzymatischen Aktivität im Magensaft ausmacht. Zubereitung HP1 (ein Pool von drei Patienten) enthielt 39,8 mg mit einer spezifischen Aktivität von 1458 Pepsineinheiten/mg Protein; PT4A aus einem einzelnen Patienten enthielt 61,8 mg mit einer spezifischen Aktivität von 2335 Einheiten/mg; und PT4B enthielt 4 mg mit einer spezifischen Aktivität von 1920 Einheiten/mg.
Diese Proteinzubereitungen wurden verwendet, um eine Ziege und sechs Hühnchen zu immunisieren. Die erste Ausblutung aus der Ziege wurde näherungsweise drei Wochen nach der Immunisierung erhalten. Eine Immunglobulinfratkion wurde mittels Ammoniumsulfatfraktionierung erhalten und auf Schweine- und Humanpepsin-Säulen aufgetragen. Es wurde gefunden, daß die Peaks der Säureelutions- und MgCl₂-Elutionsantikörper mit biotinyliertem humanem Pepsin (HP1) reagierten. Die Magnesiumchlorideluate aus sowohl den Schweine-Pepsin- und Human-Pepsin-Säulen wurden mit Fluorescein und Russell's Schlangengift (RVV) markiert. Zusätzlich wurde das Eluat aus der Schweine-Säule mit FITC und Biotin markiert. Die Immunglobulinzubereitung wurde erneut auf die Humanpepsin-Säule für die weitere Aufreinigung aufgetragen. Funktionelle Enzym-Assays sind an LPR-Patienten durchgeführt worden, die eine Doppelsonden-pH-Überwachung durchlaufen haben. Funktionelles Pepsin wurde im Sputum von mehreren Patienten nachgewiesen. Die höchste Konzentration wurde in einem GERD-Patienten unmittelbar nach einem Rückflußereignis nachgewiesen.
Herstellung von Antikörpern gegen humanes Pepsin
Das humane Pepsin, das immunabsorbierend aufgereinigt und chromatogaphisch getrennt wird, wie beschrieben, wird verwendet, um Antikörper in Hühnchen und Ziegen zu ziehen, die mit humanem Pepsin spezifischer reaktiv sind im Vergleich mit denjenigen Antikörpern, die gegen Schweine-Pepsin gezogen worden sind. Diese Antikörper werden auf Säulen von humanem Pepsin aufgereinigt oder auf denselben Säulen von Schweine-Pepsin, die zuvor verwendet wurden, um Hühnchen-Antikörper aufzureinigen. Diese neu aufgereinigten Antikörper haben sogar eine größere Affinität für das homologe humane Pepsin als diejenigen Antikörper, die gegen das heterologe Schweine-Pepsin gezogen worden sind. Eine Auswahl zu Gunsten hochaffiner Anti-human-Pepsin-Antikörpern wird bevorzugt.
Die folgenden Beispiele werden eingebaut, um bevorzugt Ausführungsformen der Erfindung zu demonstrieren. Es sollte von den Fachleuten erkannt werden, daß die in den folgenden Beispielen offenbarten Techniken Techniken darstellen, von denen der Erfinder gefunden hat, daß sie gut bei der Ausübung der Erfindung funktionieren, und die daher als bevorzugte Ausführungsformen angesehen werden können. Jedoch sollten Fachleute auf dem Gebiet im Lichte der vorliegenden Offenbarung erkennen, daß viele Veränderungen in den spezifischen Ausführungsformen, die offenbart sind, gemacht werden können, und das man immer noch ein gleiches oder ähnliches Resultat erhält, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.
BEISPIEL 1
Nachweis von Säugetierpepsinen in vitro
Antikörper, die gegen Schweine-Pepsin sowohl in Hühnchen als auch Ziegen gezogen worden waren, wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, mit Human- und Schweine-Pepsinen kreuzzureagieren und diese nachzuweisen. ELISA-ELCA-Assays wurden durchgeführt, und alle Materialien wurden hergestellt, wie hierin beschrieben.
Hühnchen-Antikörper zeigen eine starke Kreuzreaktivität auf sowohl Human- als auch Schweine-Pepsin (1A), während Ziegenantikörper nur eine bescheidene Kreuzreaktion auf Schweine-Pepsin und keine Kreuzreaktion auf humanes Pepsin (1B) zeigen. Schweinepepsin wurde zuverlässig bis zu einer Konzentration von 1 ng/ml durch die Hühnchenantikörper nachgewiesen. Da die Konzentration von Pepsin in „humanem Magensaft" nicht bestimmt wurde, konnte das Nachweisniveau für humanes Pepsin nicht bestimmt werden. Der Assay war ebenso in der Lage, sowohl aktive (Schweine) als auch inaktive (humane) Formen von Pepsin nachzuweisen, was zum Nachweis von LPR in Patienten mit persistierendem Rückfluß mit neutralem pH ideal ist.
BEISPIEL 2
Quantitativer Nachweis von Schweine-Pepsin mit der Zeit in vivo in einem Rattenmodell
Antikörper, die gegen Schweine-Pepsin in Ziegen gezogen wurden, wurden verwendet, um Schweine-Pepsin in der Kehle von Ratten/Sputum-Proben zu messen, nachdem die Ratten Schweine-Pepsin aufgenommen hatten. Kehle/Sputum-Proben wurden unmittelbar nach Einflößung und periodisch danach für 5 Stunden entnommen. Die Proben wurden durch Larynx-Waschung erhalten. ELISA-ELCA-Assays wurden durchgeführt, und alle Materialien wurden hergestellt, wie hierin beschrieben.
Die Studien wurden in doppelter Form durchgeführt, und die Menge an Schweinepepsin, die in den Larynx-Waschungen nach der Einflößung von 200 μg Schweinepepsin (zum Zeitpunkt Null) bis zu fünf Stunden nach der Einflößung für jedes Replikat nachgewiesen wurde, wird in 2 gezeigt. Nach einer einzelnen Anwendung auf die Rattenkehle wurde Pepsin im Bereich von 100–500 ng/ml für bis zu fünf Stunden nach einer künstlich induzierten Rückflußepisode effektiv nachgewiesen. Diese Ergebnisse demonstrieren, daß Pepsin als ein diagnostischer Marker für Rückflußereignisse verwendet werden kann und in Gewebesezernierungen für mehrere Stunden nach einem einzelnen Rückflußereignis meßbar ist.
BEISPIEL 3
Quantitativer Nachweis von Schweine-Pepsin über die Zeit in vivo in einem Menschen
In einer ähnlichen Studie wurden Antikörper, die gegen Schweine-Pepsin in Ziegen gezogen worden waren, dazu verwendet, um Schweine-Pepsin in Proben aus humaner Kehle/Sputum zu messen. Schweine-Pepsin wurde in die Kehle eines normalen freiwilligen Patienten, d.h. einem Patienten ohne eine Rückflußhistorie, durch eine transnasale Magensonde eingeflößt; 200 μg Pepsin wurden in 1 ml Salzlösung eingeflößt, auf pH 3,0 eingestellt. Die Proben wurden unmittelbar nach einer Einflößung entnommen und periodisch danach für zwei Stunden. Die Aliquots aus Kehle/Sputum wurden erhalten, indem der Patient sich räusperte und in einen Probenhalter spuckte. ELISA-ELCA-Assays wurden durchgeführt und alle Materialien wurden hergestellt, wie hierin beschrieben. Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß Pepsin in Sekretionen aus der menschlichen Kehle für wenigstens zwei Stunden meßbar ist, nachdem es in das Gewebe eingeführt worden ist, und zeigen, daß Pepsin als ein diagnostischer Marker für Rückflußereignisse in Menschen verwendet werden kann. Man beachte, daß Kontrollwerte, die vor der Einflößung erhalten wurden, negativ waren, aber auf „Null" in Tabelle 2 gesetzt wurden, um die Präsentation zu erleichtern.
TABELLE 2: Nachweis von Schweine-Pepsin (ng/ml) in humaner Kehle/Sputum mit der Zeit.
BEISPIEL 4
Nachweis von humanem Pepsin in vivo; Korrelation mit dem Auftreten von LPR
Antikörper, die gegen Schweine-Pepsin in Hühnchen gezogen wurden, wurden auf Ihre Fähigkeit untersucht, mit humanen Pepsinen in humanem Sputum kreuzzureagieren und diese nachzuweisen. ELISA-ELCA-Assays wurden durchgeführt, und alle Materialien wurden hergestellt, wie hierin beschrieben. Die Ergebnisse von klinischen Studien mit elf Patienten, die gebeten wurden, „sich zu räuspern und in eine Reagenzröhrchen zu spucken" werden in Tabelle 3 gezeigt.
TABELLE 3: Ergebnisse von klinischen Studien mit dem Pepsin-Imunoassay
Von den elf untersuchten Menschen hatten 73% (8 aus 11) Pepsin, das in ihren Auswürfen gefunden wurde. Die Patienten mit LPR hatten höhere Konzentrationen von Pepsin als die anderen Pepsin-positiven Patienten. Basierend auf den berichteten Symptomen der letzteren Patienten, können einige von ihnen LPR haben. Diese Ergebnisse waren nicht genauer quantifiziert, da der „normale" Bereich für Pepsin in humanem Sputum/Kehlen-Expektorat noch nicht etabliert worden ist. Jedoch weisen die Ergebnisse darauf hin, daß ein „normaler" Bereich ein „Grenzbereich" und ein „definitiv abnormaler" Bereich für humanes Pepsin mit diesem Assay bestimmt werden kann. Es ist möglich, daß diese Bestimmung die Entnahme von vielfachen Proben aus Individuen mit der Zeit beinhalten wird, um diese Bereiche zu etablieren. Die normalen, Grenz- und definitiv abnormalen Bereiche sollen verwendet werden, um einen standardisierten Assay zu entwickeln, um humanes Pepsin in routinemäßiger Weise nachzuweisen, das im Speichel aufgrund von Rückflußepisoden auftritt. Bestimmte Ausführungsformen können einen Kit für die Routinemessung von Pepsin in klinischen Situationen unter Verwendung eines festen Trägers, wie etwa eines „Eintauchstabes" („dipstick") einschließen.
BEISPIEL 5
Klinische Versuche in einer asymptomatischen Population
Um normale klinische Parameter für den Pepsinassay in Menschen zu etablieren, werden klinische Versuche unter Verwendung einer auf der allgemeinen Öffentlichkeit basierenden, humanen Population mit großer Anzahl (N = 300) durchgeführt, die gemäß der berichteten Symptomatologie gruppiert ist. Diese Daten ergeben ebenso Information über das Vorherrschen von LPR-Symptomen.
Die spezifischen Ziele von exemplarischen klinischen Studien, die in diesem und den folgenden Beispielen dargestellt sind, sind wie folgt:

1) Entwicklung von „normalen" Bereichen für Pepsin-Konzentrationen in Kehl-Sputum aus einer Kohorte von Individuen, die als asymptomatisch für LPR ausgewählt wurden;
2) Innerhalb dieser Kohorte, Untersuchung der Pepsin- und pH-Konzentrationen von Teilnehmern, die eine klinische Disposition zu LPR haben, und die sie nicht haben, basierend auf einem Profil von Lebensstil und Geschichte, Messen derjenigen, die entwickelt wurden;
3) Beschreibung von Assoziationen, die der einzelne Lebensstil, die Geschichte und die demographischen Bestandteile (einschließlich Geschlecht, Alter und Ethnizität) mit Pepsin- und pH-Konzentrationen in einer asypmptomatischen Kohorte haben;
4) Charakterisierung der Übereinstimmung zwischen den Meßergebnissen von der pH- und Pepsin-Überwachung in einer asymptomatischen Kohorte;
5) Charakterisierung der Assoziationen zwischen Lebensstil, Historie und demographischen Faktoren; Pepsin-Konzentrationen; pH-Konzentrationen; Symptomen; und Krankheitsstatus über alle Studienkohorten (siehe Beispiele 6 und 7). Von jeder Kohorte wird erwartet, daß sie spezifische Untergruppe einschließen (d.h. durch Geschlecht, Alter, Ethnizität, Lebensstil, Geschichte und Schwere der Erkrankung definiert). Alle sind im Alter zwischen 20 – 69 Jahren und haben ihre informierte Zustimmung gegeben. Drei repräsentative Kohorten an Teilnehmern werden beurteilt; Asymptomatische normale Patienten; Patienten mit einer Larynx-Erkrankung; und Patienten mit pulmonalen und respiratorischen Erkrankungen.

Da es keine gut etablierten Standards gibt, die die Diagnose von LPR vollständig ausschließen oder einschließen, wird die Erfindung verwendet, um die allgemeine Population zu erproben und einen „normalen Bereich" für Pepsin zu etablieren. Dies ist aus vier Gründen wichtig: (1) um das Vorherrschen einer LPR-Symptomatologie in einer Kohorte von Freiwilligen zu etablieren; (2) um den Bereich an Pepsin-Werten und pH-Niveaus zu etablieren; (3) um den LPR mit einem Lebensstil und anderen relevanten Variablen zu korrelieren; und (4) um unterschiedliche Untergruppen innerhalb der Kontrollgruppenkohorte zu definieren, basierend auf berichteten Symptomen und Pepsin- und pH-Konzentrationen.
LPR-Symptome werden von den meisten Patienten mit LPR berichtet, und vermutlich werden Leute, die kein LPR haben, selten über seine Symptome berichten. Frühere Erforschungen mit 20 normalen (d.h. asymptomatisch bezüglich LPR) humanen Freiwilligen mit einer Doppelsonden-pH-Überwachung fanden bei keinem Patienten, daß er irgendeinen pH-dokumentierten LPR hat; Deshalb ist es wahrscheinlich, daß die Erforschung einer Gruppe von Kontrollpatienten, die vollständig ohne Symptome waren, sehr selten LPR und Pepsin-Werte von Null aufzeigen würde. In Folge davon kann die Bewertung der zwei Patientengruppen innerhalb der auf der Allgemeinheit basierenden Kohorten mit Antworten auf den „LPR-Symptom-Fragebogen" (LSQ) durchgeführt werden, der die Gruppe der Patienten bestimmt. Der LSQ beinhaltet die folgenden Gruppen an Variabeln:
Demographische Information (z.B. Alter, Geschlecht, Rasse)
Vergangene medizinische Geschichte (z.B. Zustände und Medikationen, die mit Rückfluß in Beziehung stehen)
Lebensstil-Historie (z.B. Tabak- und Alkoholgebrauch)
LPR-Symptome (z.B. Heiserkeit, Globus, Dysphagie, Sodbrennen)
Morphologische Informationen (d.h. Größe und Gewicht der Patienten)
Innerhalb des LSQ sind 7 Fragen (#13–#19) über LPR-Symptome, die hier gezeigt werden:

(13) Wie oft, wenn überhaupt, haben Sie Sodbrennen oder aufsteigende Magensäure in einer Woche? 1. Niemals 2. Selten 3. Ein paar Mal pro Woche 4. Täglich 5. Die meiste Zeit
(14) Wie oft, wenn überhaupt, haben Sie die Empfindung eines Klumpen in der Kehle in einer Woche? 1. Niemals 2. Selten 3. Ein paar Mal pro Woche 4. Täglich 5. Die meiste Zeit
(15) Wie oft, wenn überhaupt, haben Sie häufiges Räuspern oder zuviel Schleim in der Kehle? 1. Niemals 2. Selten 3. Ein paar Mal pro Woche 4. Täglich 5. Die meiste Zeit
(16) Wie oft, wenn überhaupt, haben Sie Schwierigkeiten, zu schlucken, oder bleibt Ihnen das Essen stecken? („food sticking") 1. Niemals 2. Selten 3. Ein paar mal pro Woche 4. Täglich 5. Die meiste Zeit
(17) Wie oft, wenn überhaupt, haben Sie Verschluckungsepisoden (Durchschnitt pro Woche)? 1. Niemals 2. Selten 3. Ein paar mal pro Woche 4. Täglich 5. Die meiste Zeit
(18) Wie oft, wenn überhaupt, haben Sie einen stechenden Husten („nagging cough")? 1. Niemals 2. Selten 3. Ein paar mal pro 4. Oft 5. Die meiste Zeit
(19) Wie oft, wenn überhaupt, haben Sie Heiserkeit oder ein Problem mit Ihrer Stimme? 1. Niemals 2. Selten 3. Ein paar mal pro Jahr 4. Oft 5. Die meiste Zeit

Die Analysen der Pilotdaten von 64 Freiwilligen deuten darauf hin, daß ein Aufsummieren der angeordneten Antworten auf diese Fragen eine interne Validität hat. Die Hauptkomponentenanalysen deuten darauf hin, daß die Hauptquelle der Variation unter diesen Freiwilligen durch eine grobe Summe diese Ränge definiert war (eine lineare Kombination mit nahezu einheitlichen Belastungen): Dieser Bestandteil erklärte 23% der gesamten Variation.
Unter Verwendung der numerierten Codes auf der linken von jeder Antwort kann man sehen, daß der niedrigst mögliche Wert für eine Person, die vollkommen ohne Symptome war, 7 sein würde, und daß der höchst mögliche Wert für eine Person mit Symptomen 35 wäre. Zusätzlich werden Patienten insbesondere gefragt (Frage #7), ob sie „Rückfluß/Hiatushernie/Ösophagitis" haben. Die Antworten auf Fragen #7 und #13 bis #19 bilden die Grundlage für eine Zuordnung von Freiwilligen in die beiden Kontrollgruppen: Gruppe 1.1 – asymptomatische „normal" Gruppe – und Gruppe 1.2. – „subklinische" (bestimmte Rückflußsymptome) Gruppe.
Die Ergebnisse eines vorläufigen Test des LSQ mit 41 klinischen Otolaryngologie-Patienten mit „Ohrerkrankungen" (N = 20) und mit „LPR" (N = 21) werden in Tabelle 4 gezeigt.
TABELLE 4: LSQ-Wert für Patienten mit entweder „Ohrerkrankung" oder LPR
Daher würden von den 20 Ohrenpatienten 35% (7/20) den Kriterien genügen, um in Gruppe 1.1 eingeschlossen zu sein, und 65% (13/20) würden sich qualifizieren, um in der „subklinischen LPR"-Gruppe, d.h. Gruppe 1.2 zu sein, und offensichtlich würde keiner der Beantwortenden in der LPR-Gruppe sich als Kontrolle qualifizieren.
Probennehmen und Einschluß-/Ausschlußkriterien
„Normale" Kontrollen, die auf der allgemeinen Öffentlichkeit basieren, werden durch Aufforderungen in Zeitungen angesprochen. Dieses Verfahren, auf Teilnehmer zuzugehen, kann möglicherweise keine Probe bereitstellen, die für die Allgemeinheit vollständig repräsentativ ist, aufgrund von Selektionsverzerrungen, die bei Freiwilligen für medizinische Studien und medien-basierenden Aufforderungen typisch sind. Jedoch würde eine vollständige Zufallsprobe beträchtliche Ausgaben mit sich bringen. Um eine Beurteilung der Eignung der Studienprobe bereitzustellen, werden demographische Eigenschaften der Probe mit denjenigen der allgemeinen Population verglichen.
Antwortende Personen werden gefragt, einen LSQ auszufüllen und ihn an das Voice Center mit der Post zurückzusenden. Nur Individuen, die vollständig ausgefüllte Fragebogen zurücksenden, werden zur Teilnahme bei der Studie eingeladen. Gleiche Anzahlen von Frauen und Männern und gleiche Anzahl von Teilnehmern in jedem der fünf Lebensjahrzehnte innerhalb des bezeichneten Alterbereichs werden rekrutiert, um eine effiziente Charakterisierung quer durch diese Faktoren zu ermöglichen. Die Zielpopulation ist 30% afrikanisch-amerikanisch und 65% kaukasisch, was ungefähr die demographische Zusammensetzung von Forsyth County, NC, reflektiert. Näherungsweise 35% der Erwachsenen in dem geographischen Gebiet rauchen Zigaretten.
Die auf der allgemeinen Öffentlichkeit basierende Probe wird sich in zwei Untergruppen gemäß der berichteten Symptomatologie aufteilen:
Gruppe 1.1 – „normale" Kontrollgruppe ohne Symptome
Einschlußkriterien:
Patienten aus Gruppe 1.1 müssen LSQ-Symptomwerte von 10 oder weniger haben, und sie müssen in der Lage sein, die gesamte pH-Studie zu tolerieren, und haben das Tagebuch, das die pH-Studie begleitet, genau ausgefüllt. Zusätzlich müssen sie in der Lage sein, die erforderlichen Kehlen-/Sputum-Proben für einen Pepsin-Assay zu produzieren und zu sammeln.
Ausschlußkriterien:
Patienten aus Gruppe 1.1 dürfen keinen „Rückfluß, Hiatushernie oder Ösophagitits" haben, über die sie selbst berichtet haben (d.h. sie dürfen nicht den „Rückflußkasten" in LSQ-Frage #7 angekreuzt haben). Zusätzlich werden beantwortende Personen, die andeuten, daß sie keinen Schleim aus der Kehle produzieren können (LSQ #24), ausgeschlossen.
Gruppe 1.2 – „subklinische" Gruppe
Einschlußkriterien:
Patienten aus Gruppe 1.2 können LSQ-Symptomwerte von mehr als 10 haben, und sie müssen in der Lage sein, die gesamte pH-Studie zu tolerieren, und haben das Tagebuch, das die pH-Studie begleitet, vollständig ausgefüllt. Zusätzlich müssen sie in der Lage sein, die erforderlichen Kehlen-/Sputum-Proben für einen Pepsin-Assay zu produzieren und zu sammeln.
Ausschlußkriterien:
Patienten aus Gruppe 1.2 dürfen keinen „Rückfluß, Hiatushernie oder Ösophagitis" haben, über die sie selbst berichtet haben (d.h. sie dürfen den „Rückflußkasten" in LSQ-Frage #7 nicht angekreuzt haben). Zusätzlich werden beantwortende Personen, die andeuten, daß sie keinen Schleim aus der Kehle produzieren können (LSQ #24), ausgeschlossen.
Experimentelles Protokoll
Patienten, die die Einschlußkriterien in Gruppen 1.1 und 1.2 dieser Studie erfüllen, werden aufgelistet, nachdem sie das vom Institutional-Review-Board anerkannte „Informed Consent" und die Studienvereinbarung gelesen und unterzeichnet haben. Der Koordinator der Studie kontrolliert ihre Antworten auf den LSQ bei einzelnen Individuen, um sicherzustellen, daß alle Fragen verstanden werden, und um die Genauigkeit zu erhöhen. Nach einem Fasten über Nacht wird jeder Patient in dem pH-Labor empfangen. Alle Aspekte der Studie werden jedem Patienten durch den Projektadministrator oder den pH-Techniker vollständig erklärt. Vor dem Verlassen des pH-Labors wird jedem Patienten ein „pH-Studien-Tagebuchblatt" und markierte Kehlen/Sputum-Sammelröhrchen gegeben.
Probenentnahmen von Kehl-Sputum für einen Pepsin-Assay:
Jeder Patient erhält einen Satz von zehn (10) numerierten Gefäßen, die mit dem eigenen Namen des Patienten und dem Datum der Studie markiert sind. Jeder Patient wird gebeten, Sputum-Proben für einen Pepsin-Assay zu den folgenden Zeiten bereitzustellen:

(1) Vor einer Ösophagus-Manometrie und einem Einbringen der pH-Sonden Diese Probe wird entnommen, um einen Grundlinien-Pepsinwert während des Fastens bereitzustellen, und damit der Patient darin angeleitet werden kann, wie die Sputum-Proben gesammelt werden sollen.
(2) Kurz nach dem Einbringen der pH-Sonden Diese Probe wird entnommen, um die Effekte der Einbringung der pH-Überwachungsvorrichtung zu beurteilen und um die Empfindlichkeit des Pepsin-Assay zu beurteilen. Da bei Manometrie- und pH-Sonden-Einbringung Schläuche in den Magen eingebracht und dann in die Pharynx zurückgezogen werden, ist es wahrscheinlich, daß Magensäfte auf die Pharynx-Schleimhaut in geringen Quantitäten als ein Ergebnis dieser Prozeduren aufgebracht werden. Dies ist ebenso eine zweite angeleitete Probe.
(3) Vor der ersten Mahlzeit (Frühstück oder Mittagessen) nach dem Einbringen der pH-Sonde Diese Probe wird entnommen, um einen zweiten Datenpunkt, einen Grundlinienwert, während des Fastens bereitzustellen.
(4) Eine Stunde nach der ersten Mahlzeit (Frühstück oder Mittagessen) Diese Probe wird erhalten, um den LPR in der Periode nach der Mahlzeit zu beurteilen.
(5) Vor der Abendmahlzeit Diese Probe wird entnommen, um einen dritten Datenpunkt in einem halb-fastenden Zustand bereitzustellen.
(6) Eine Stunde nach der Abendmahlzeit Diese Probe wird entnommen, um LPR in der Periode nach der Mahlzeit zu beurteilen. Frühere LPR-Daten weisen darauf hin, daß die Periode nach der Mahlzeit die häufigste Zeit für das Auftreten von LPR in Patienten mit LPR ist.
(7) Vor dem Zu-Bett-gehen Diese Probe wird entnommen, um einen Vergleichspunkt mit Probe #8 bereitzustellen.
(8) Als erstes am Morgen nach dem Aufstehen Diese Probe wird entnommen, um Informationen über die nächtliche Periode in Rückenlage bereitzustellen, und sie ist ein weiterer Datenpunkt für das Fasten.
(9) Eine Stunde nach dem Frühstück Diese Probe wird entnommen, um LPR in der AM-Periode nach der Mahlzeit zu bewerten.
(10) Unmittelbar vor dem Entfernen der pH-Sonde Dies ist eine weitere angeleitete Probe, die als eine „endende" Pepsin-Konzentration entnommen wird.

Patienten werden gebeten, die Zeit, zu der jede Probe erhalten worden ist, auf zwei Arten aufzuzeichnen: durch Schreiben der Zeit der Probenentnahme auf dem pH-Tagebuch und durch Drücken eines Knopfes auf dem pH-Monitor, der das Ereignis auf der pH-Studienverfolgung aufzeichnet (dieser Knopf wird „ein Ereignismarker" genannt).
Ösophagus-Manometrie und pH-Überwachung
Alle Patienten lassen ebenso eine Ösophagus-Manometrie und eine Doppelsonden-pH-Testung gemäß dem Standardprotokoll für dieses Verfahren durchführen. Da über die Techniken berichtet worden ist (Koufman, 1991: Richter, 1991; Koufman et al., 1988; Koufman, 1993; Koufman 1996; Weiner et al., 1987; Weiner et al., 1989) und da die Technik Standard ist (Koufman, 1991; Richter, 1991; Richter et al., 1992), werden die spezifischen Eigenschaften hierin nicht wiederholt.
BEISPIEL 6
Klinische Versuche in Patienten mit Larynx-Erkrankungen
Die spezifische Ziele der klinischen Studien, die in diesem und im folgenden Beispiel dargestellt sind, sind wie folgt:

(1) Durch Herantreten an getrennte Kohorten mit Symptomen, Untersuchungen von Bereichen von Pepsin- und pH-Niveaus unter Teilnehmern mit einer Larynx-Erkrankung (Larynx-Ödem, gutartige Larynx-Läsionen und maligne/prä-maligne Larynx-Läsionen);
(2) Untersuchen des Einflusses des Erkrankungstyps und der Heftigkeit auf die Pepsin- und pH-Konzentrationen.

Zum gegenwärtigen Zeitpunkt diagnostizieren und behandeln klinische Ärzte am Voice-Center jährlich Hunderte von Patienten mit „Rückfluß-Laryngitis" und gutartigen und bösartigen Stimmbandläsionen, die mit LPR in Beziehung stehen. Aus dieser Gruppe wird eine Kohorte von Studienpatienten zufallsmäßig ausgewählt mit der folgenden Einteilung: Gruppe 2.1 – LPR-Gruppe ohne Läsionen (d.h. „Rückfluß-Laryngitis" ohne jegliche Schleimhautläsionen), und Gruppe 2.2 – Gruppe mit Larynx-Läsionen (z.B. Stimmbandknötchen, Cysten, Polypen, Carcinom).
Probenentnahme und Ausschluß-/Einschlußkriterien
Es werden Listen von Patienten erzeugt, die von besuchenden Allgemeinärzten an der Voice Clinic gesehen werden, und Patienten im Alter von 20–70 Jahren, die die Einschluß-/Ausschlußkriterien unten erfüllen, werden zufallsmäßig verteilt gezogen und zum Eintritt in die Studie aufgefordert. Der Studienkoordinator ruft diese zukünftigen Teilnehmer an, beschreibt kurz die Studie und schickt einen LSQ an diejenigen, die ein Interesse äußern. Zukünftige Teilnehmer, die vollständig ausgefüllte Fragebogen zurücksenden, werden eingeladen, die Voice Clinic zu besuchen, um sich in der Studie einzutragen. Diese Besuche schließen eine vollständige Beschreibung der Studie und den Erhalt einer informierten Zustimmung von jedem Teilnehmer ein.
Gruppe 2.1 – LPR-Gruppe mit „keiner Läsion" (N = 50)
Einschlußkriterien:
Um eingeschlossen zu werden, muß der Patient einen pH-dokumentierten LPR, aber keine Larynx-„Läsionen" haben. Der Patient muß in der Lage sein, die gesamte pH-Studie zu tolerieren, und hat das Tagebuch, das die LPR-Studie begleitet, vollständig ausgefüllt. Zusätzlich müssen sie in der Lage sein, die erforderlichen Kehlen-/Sputum-Proben für einen Pepsin-Assay zu erzeugen und zu sammeln.
Ausschlußkriterien:
Patienten der Gruppe 2.1 dürfen keine entzündlichen oder neoplastischen Läsionen der Larynx haben. Zusätzlich werden antwortende Personen, die darauf hinweisen, daß sie keinen Schleim in der Kehle produzieren können (LSQ #24), ausgeschlossen.
Gruppe 2.2 – LPR-Gruppe mit „Larynx-Läsionen" (N = 50)
Einschlußkriterien:
Um eingeschlossen zu werden, muß der Patient einen pH-dokumentierten LPR haben und eine oder mehrere Larynx-Läsionen. (Diese schließen Papillomen, Granulomen, Cysten, Carcinome, Leukoplakie, Reinke's Ödem, Polypen, Stimmbandknötchen und subglottische Stenose ein). Der Patient muß in der Lage sein, die gesamte pH-Studie zu ertragen, und hat das Tagebuch, das die pH-Studie begleitet, vollständig ausgefüllt. Zusätzlich müssen sie in der Lage sein, die erforderlichen Kehlen-/Sputum-Proben für einen Pepsin-Assay zu erzeugen und zu sammeln.
Ausschlußkriterien:
Patienten der Gruppe 2.2 müssen eine der entzündlichen oder neoplastischen Läsionen der Larynx haben, die oben aufgelistet sind; Patienten mit irgendwelchen anderen Läsionen werden ausgeschlossen werden. Insbesondere ausgeschlossen werden jeglicher Patient/Individuum mit einer Verlegung der Atemwege, sofern nicht ein Tracheotomie-Tubus eingesetzt ist. Zusätzlich werden beantwortende Personen, die darauf hinweisen, daß sie keinen Schleim aus der Kehle produzieren können (LSQ #24), ausgeschlossen.
Das Protokoll für diese Gruppen 2.1 und 2.2 wird ähnlich demjenigen der anderen Gruppen sein.
BEISPIEL 7
Klinische Versuche bei Patienten mit respiratorischen Erkrankungen
Diese spezifischen Ziele der beispielhaften chemischen Studien, die in diesem und dem folgenden Beispiel dargestellt sind, sind wie folgt:

(1) Durch Herantreten an separate Kohorten mit Symptomen, Untersuchung der Bereiche von Pepsin- und pH-Niveaus bei Teilnehmern mit Lungen- und respiratorischen Erkrankungen (Asthma und Carcinoma der Lunge);
(2) Untersuchung des Einflusses des Erkrankungstyps und -heftigkeit auf Pepsin- und pH-Niveaus.

Diese Patienten werden zum Einschluß in diese Studie aus dem Department of Pulmonary Medicine, Bowman Gray School of Medicine, rekrutiert. Patientenkarten werden erzeugt, und zukünftige Patienten, die die Ausfüllbarkeitskriterien erfüllen, werden zufallsmäßig gezogen und ähnlich denjenigen, die in Beispiel 6 beschrieben sind, verarbeitet. Zwei diskrete Kohorten werden untersucht werden: Gruppe 3.1 – Asthma-Gruppe und Gruppe 3.2 – Carcinom der Lungen-Gruppe.
Gruppe 3.1 – Asthma-Gruppe (N = 30)
Einschlußkriterien:
Um eingeschlossen zu werden, muß der Patient gut-dokumentiertes Asthma haben und sie müssen in der Lage sein, die gesamte pH-Studie zu ertragen, und haben das Tagebuch, das die pH-Studie begleitet, vollständig ausgefüllt. Zusätzlich müssen sie in der Lage sein, die erforderlichen Kehlen-/Sputum-Proben für einen Pepsin-Assay zu erzeugen und zu sammeln.
Ausschlußkriterien:
Patienten der Gruppe 3.1 dürfen keine andere primäre Lungenerkrankung haben, und sie dürfen keine mit Asthma in Beziehung stehende Blockade der Atemwege haben, die eine Hospitalisierung innerhalb der 6 Monate vor dem Einschluß in diese Studie erforderlich machte. Zusätzlich werden beantwortende Personen, die darauf hinweisen, daß sie keinen Schleim aus der Kehle produzieren können (LSQ #24), ausgeschlossen.
Gruppe 3.2 – Gruppe mit Lungencarcinom (N = 30)
Einschlußkriterien:
Um eingeschlossen zu werden, muß der Patient ein mittels Biopsie bestätigtes Plattenepithel-Carcinom der Larynx haben, und sie müssen in der Lage sein, die gesamte pH-Studie zu tolerieren, und haben das Tagebuch, das die pH-Studie begleitet, genau ausgefüllt. Zusätzlich müssen sie in der Lage sein, die erforderlichen Kehlen/Sputum-Proben für einen Pepsin-Assay zu erzeugen und zu sammeln.
Ausschlußkriterien:
Patienten der Gruppe 3.2 dürfen keine Atemwegsobstruktion, Hämoptysis oder metastasierende Erkrankung am Kopf und Hals haben. Zusätzlich darf ein Einschluß in dieser Studie eine Behandlung des Lungenkrebses nicht beeinträchtigen oder verzögern. Zusätzlich werden antwortende Personen, die darauf hinweisen, daß sie keinen Schleim aus der Kehle produzieren können (LSQ # 24), ausgeschlossen werden.
Das Protokoll für diese Gruppen 3.1 und 3.2 werden demjenigen der anderen Gruppen, Beispiele 5 und 6, ähnlich sein, und diese Patienten werden für ihre Teilnahme in der Studie entschädigt werden.
Erklärung für die Probengrößen
Es ist wichtig zu demonstrieren, daß die geplanten Probengrößen ausreichen, um Schätzungen bereitzustellen, die ziemlich genau sind, und um ausreichend „Kraft" für die geplanten Schlußfolgerungen zu ergeben. Wie oben beschrieben, Beispiel 5, können bis zu 300 normale Individuen ohne Symptome in einer klinischen Studie verwendet werden. Um die Angemessenheit dieser Probengröße zur Charakterisierung der Verteilung von Pepsin-Konzentrationen in der Population insgesamt einzuschätzen, wurde eine kleine Simulationsstudie durchgeführt. 100 Proben der Größe 300 wurden aus einer Normalverteilung gezogen. Tabelle 5 listet die Verteilung der echten Perzentilen der beobachteten empirischen Perzentilen aus diesen Proben auf:
TABELLE: Ergebnisse einer Simulation, zum Bestimmen einer erwarteten Verteilung, bei der N = 300
Die Simulationsstudie deutet darauf hin, daß 300 Patienten ausreichend sein sollten, um sicherzustellen, daß die beobachteten Perzentilen aus den klinischen Versuchen ±5 Perzentilen von ihrer Zielschätzung sind. Eine Probe dieser Größe ist ausreichend, um mittlere Unterschiede von 0,32 Standardabweichungseinheiten (SD) zwischen Geschlechtern nachzuweisen (50% Aufteilung), 0,34 SD zwischen Rauchern (35/65%-Aufteilung), und zwischen 0,36 SD Afrikanisch-Amerikanern und Kaukasiern (30% bzw. 65% der Kohorte), und um Korrelationen von ±0,16 mit 80% statistischer Aussagekraft nachzuweisen.
Eine Rekrutierung von 100 Teilnehmern mit einer Larynx-Erkrankung und 60 mit einer Lungen/respiratorischen Erkrankung ermöglicht die Fähigkeit, mittlere Unterschiede aus den asymptomatischen Kontrollen von einer Drittel- und einer halben Standardabweichungseinheit mit größer als 80% statistischer Aussagekraft nachzuweisen.
Statistische Analysen
Die Gruppe an Pepsin-Konzentrationen für jeden Teilnehmer wird mittels Plots und Mittelwerten beschrieben. Um die Hauptziele der Studie zu erfüllen, wird eine zusammenfassende Statistik erzeugt, um die Pepsin-Konzentrationen insgesamt zu beschreiben. Es wird erwartet, daß diese Statistik der Durchschnitt über alle Messungen ist, jedoch könnte man erwarten, daß das Maximum und der Bereich ebenso eine gewisse klinische Relevanz haben könnten. Hauptbestandteilsanalysen und Plots werden verwendet, um Muster in diesen Daten herauszufinden, und können mehrere zusammenfassende Messungen definieren, um allgemeine Ausdrücke von Pepsin-Konzentrationen bereitzustellen. In den folgenden Beschreibungen der Analysen werden diese Ergebnismessungen kurz als „Pepsin-Konzentrationen" bezeichnet.
Normale Bereiche für Pepsin-Konzentrationen
Mittelwerte, Standardabweichungen, Perzentilen und Histogramme werden verwendet, um die Verteilung von Pepsin-Konzentrationen von den Teilnehmern ohne Symptome und in Untergruppen zu beschreiben, die durch Geschlecht und Ethnizität definiert sind. Das Verfahren der asymmetrische kleinsten Quadrate (Efron, 1991) („asymmetric least squares") wird verwendet werden, um Perzentilen-Plots über den Altersbereich zu entwickeln.
Einfluß von LPR-Disposition und anderen Faktoren auf Pepsin und pH-Messungen
Varianzanalysen und Regressionsverfahren werden verwendet, um den Einfluß von LPR-Fragebogenwerten und individuellen demographischen Messungen, historischen Messungen und Messungen über den Lebensstil auf Pepsin und pH-Niveaus zu erkunden. Multivariable Regressionsmodelle werden entwickelt unter Verwendung von (schrittabwärts und schrittaufwärts) Selektionsprozessen. Abhängig von ihren empirischen Verteilungen können Messungen transformiert werden, um symmetrische Restverteilungen zu ergeben, jedoch werden resultierende Schätzungen und Standardfehler zurück auf ihren ursprünglichen Maßstab unter Verwendung des Delta-Verfahrens transformiert (Aickin, 1983).
Übereinstimmung zwischen Pepsin und pH-Messungen bei Teilnehmern ohne Symptome
Eine Übereinstimmung wird beschrieben unter Verwendung von Streu-Plots und Korrelations-Koeffizienten. Der Einfluß von verschiedenen Vorhersageindikatoren (Predictors) auf die Beziehungen zwischen Pepsin und pH werden unter Verwendung von Regressionsmodellen, die Wechselwirkungen auf zwei Wegen beinhalten, und in graphischer Weise beurteilt. Kanonische Korrelationen werden ebenso verwendet, um die multivariable Beziehung zu erkunden, die diese Maßnahmen auf Vorhersageindikatoren haben.
Einfluß von Larynx- und Lungen/respiratorischer Erkrankung auf Pepsin- und pH-Messungen und die Fähigkeit der Messungen, eine Krankheit zu charakterisieren
Varianz- und Regressionsanalysen werden verwendet, um den Einfluß zu erkunden, den eine Krankheit, der Krankheitstyp und die Schwere der Erkrankung auf Pepsin- und pH-Konzentrationen haben. Diskriminanten-Analysen werden verwendet, um empirische Diagno sekriterien zu entwickeln, basierend auf jeder Messung, getrennt und in einer multivariablen Weise, die die Information über Messungen und Fragebogenantworten kombinieren. Analysen werden separat für Hauptuntergruppen von Teilnehmern wiederholt (z.B. basierend auf Geschlecht und Rasse). Um die Zuverlässigkeit dieser diagnostischen Regeln zu erkunden, wird die Analyse unter Verwendung von Klassifikations- und Regressionsbaum-Analysen (CART) (Breiman et al., 1984) wiederholt, was weniger parametrische Annahmen erfordert.
Zusätzliche Analysen können verwendet werden, um die interne und externe Validität des LSQ-Fragebogens zu beurteilen, Beziehungen zwischen einzelnen Symptomen und vorhersagenden Indikatoren und die Wiederholbarkeit und Zuverlässigkeit der Pepsin- und pH-Messungen zu untersuchen. Da ein „Gold-Standard" zum Definieren von LPR, basierend auf klinischen Messungen und Teilnehmerantworten, existiert, können latente Variablen-Analysen (z.B. Faktoranalyse) verwendet werden, um zu versuchen, dieses zugrundeliegende Phänomen aus vorhersagenden Messungen und Symptomen zu charakterisieren.
Datenmanagement
Fragebogendaten, die von dem Interviewer durchgesehen wurden, werden auf eine systematische Weise von dem Studienkoordinator gemäß einem schriftlichen Studienprotokoll gesammelt, das die Vollständigkeit und Konsistenz verbessert. Jedem Teilnehmer wird ein einzigartiger Studienidentifizierungscode (ID) zugeordnet: Teilnehmeridentifikatoren (Name, Adresse und Kontaktinformation) werden auf einem separaten Formular gesammelt und nicht in die computerisierte Datenbank eingegeben, um die Vertraulichkeit zu verbessern. Proben werden mit dem ID markiert und von Personal analysiert, das gegenüber anderen Studiendaten maskiert ist.
Ein computerisiertes Datenmanagement findet bei der Section on Biostatistics statt, die weitreichende Erfahrung beim Verwalten von Daten aus biomedizinischen Studien hat. Fragebogendaten werden unter Verwendung von Software-Programmen (FoxPro^TM) doppelt eingegeben, die automatische Bereichsüberprüfungen und logische Überprüfungen einschließen; jegliche Diskrepanzen zwischen eingegebenen Kopien werden von Hand aufgelöst. Labordaten werden direkt computerisiert. Daten werden in einer einzelnen Studiendatenbank verschmolzen, die durch den Programmierer der Studie unterhalten wird. Reguläre Ausgaben und Berichte werden erzeugt, um Konsistenz und den Fortschritt der Studie einzuschätzen. Die For mulare werden sicher in verschlossenen Schränken gelagert; alle computerisierten Datenbanken sind von einem Password geschützt und auf eine sichere Weise gelagert, die mit Prozeduren übereinstimmt, die in der Section on Biostatistics für andere Studien entwickelt worden sind.
BEISPIEL 8
Longitudinale (tägliche) Erkundungen von Pepsin-Konzentrationen in Sekretionen der Atemwege
Um zu bestimmen, ob zyklische oder lebensstilabhängige Veränderungen auftreten, werden eine Teilmenge von Freiwilligen (mit und ohne LPR) gefragt, Kehl/Sputum-Proben auf einer täglichen Basis für einen Monat bereitzustellen. Zwei Proben werden jeden Tag entnommen, eine beim Aufstehen am Morgen, und die andere vor dem Zubettgehen.
Kriterien für den Einschluß/Ausschluß, Prozeduren und statistische Analysen sind wie in den vorherigen Beispielen.
BEISPIEL 9
Messung von Serum- und Urin-Pepsin-Konzentrationen in Patienten mit ulcerativer Ösophagitis
Patienten mit einer signifikante entzündlichen Erkrankung können abnorm hohe Konzentrationen an Pepsin/Pepsinogen in ihrem Blutstrom haben. Ein Messen der Konzentrationen an Pepsinen und Pepsinogenen sowohl im Urin als auch im Blutserum werden bestimmen, ob dies wahr ist. Wenn dies der Fall ist, dann könnten Serum- oder Urin-Pepsin-Konzentrationen als Meßwerte für die Effektivität einer Behandlung in allen Erkrankungen, die mit Rückfluß in Beziehung stehen, einschließlich Ösophagitis, verwendet werden.
Vorläufige Daten hinsichtlich der Serum- und Urin-Pepsin-Konzentrationen von Patienten mit (mittel Biopsie nachgewiesener) ulcerativer Ösophagitis, vor, während und nach einer Behandlung, können unter der Verwendung der vorliegenden Erfindung und herkömmlicher Methodologie gesammelt werden. Zwanzig Patienten werden überwacht, ebenso wie 20 Normalkontrollen. Der Zweck dieser Studie ist es, zu bestimmen, ob (1) eine Ösophagus-Entzündung zu einer systemischen Absorption von meßbaren, abnorm hohen Mengen an Pep sin führt, und (2) ob diese Konzentrationen auf ein „Normal" Niveau nach der Behandlung zurückkehren oder nicht.
BEISPIEL 10
Longitudinale Erforschung von LPR in pädiatrischen Patienten
Basierend auf vorläufigen Arbeiten ist unter Verwendung von einem Doppel-Sonden-pH-Test bestimmt worden, daß der Rückfluß eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und dem Verlauf von Atemwegs- und respiratorischen Erkrankungen in Kindern spielen kann. Leider ist es aufgrund der Invasivität und den Ausgaben einer pH-Testung nicht möglich, normale Werte in einer großen Population von gesunden Kleinkindern und Kindern zu erhalten.
In diesem Beispiel werden Atemwegssekretionen von 1500 neugeborenen Kleinkindern (bei der Geburt und vor Krankenhausentlassung) mit der vorliegenden Erfindung gescreent, und diese Patienten werden longitudinal in zweimonatigen Intervallen (zu den Zeiten von regulär angesetzten Besuchen beim Kinderarzt) unter Verwendung von sequentiellen, „zufallsmäßigen" Pepsin-Assays für wenigstens 6 Monate überwacht.
Bei dem Sechsmonatsbesuch wird ein Standard-„Symptom/Krankheit"-Fragebogen von den Eltern des Kleinkindes mit Hilfe des Kinderarztes ausgefüllt (um Daten über jede mögliche Atemwegs- und respiratorische Erkrankung, die mit „Rückfluß in Beziehung steht", zu sammeln). Die Pepsin-Assay-Daten und die klinischen Daten werden dann analysiert, um zu bestimmen, ob die Pepsin-Konzentrationen die Entwicklung einer Atemwegserkrankung vorhersagt.
Eine Überwachung wird über den Verlauf eines Jahres durchgeführt, und, sofern die Ergebnisse nahelegen, daß es eine Beziehung zwischen der Pepsin-Konzentration und der Entwicklung einer Atemwegserkrankung gibt, wird die anfängliche Gruppe von Patienten über sechs Monate hinaus verfolgt, und die Überwachung wird ausgeweitet werden, um eine größere Anzahl an neugeborenen Kleinkindern einzuschließen; und das Screening von Kindern im Schulalter wird beginnen.
BEISPIEL 11
Immunnachweis-Kits
Unter bestimmten breiten Aspekten betrifft die vorliegende Erfindung Immunnachweis-Kits zur Verwendung in den hierin beschriebenen Verfahren. Da die Anti-Pepsin-Antikörper verwendet werden, um Pepsine und/oder Pepsinogene nachzuweisen, können entweder ein solcher Bestandteil oder beide solchen Bestandteile in dem Kit bereitgestellt werden. Die Immunnachweis-Kits umfassen daher, in geeigneten Behältermitteln, einen Anti-Pepsin- oder Pepsinogen-Antikörper und ein Immunnachweis-Reagenz.
Weiter geeignete Immunnachweisreagenzien zur Verwendung in den vorliegenden Kits können ein Zwei-Komponenten-Reagenz einschließen, das einen sekundären Antikörper, der eine Bindungsaffinität für den ersten Antikörper hat, und möglicherweise einen dritten Antikörper umfaßt, der eine Bindungsaffinität für den zweiten Antikörper hat. Der letzte verwendete Antikörper, entweder der erste, zweite oder dritte, abhängig vom Fall, ist an eine nachweisbare Markierung geknüpft.
Eine Anzahl von beispielhaften Markierung sind auf dem Gebiet bekannt, und alle derlei Markierungen können im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Um ein Nachweismittel bereitzustellen, hat einer der Antikörper eine assoziierte Markierung, um einen Nachweis zu ermöglichen. Bevorzugt ist dies ein Enzym, das eine Farbentwicklung beim Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat erzeugt, wie etwa eine Urease, Glucoseoxidase, alkalische Phosphatase oder Wasserstoffperoxidase.
Nach Inkubation mit dem markierten Antikörper und nach einer Waschung, um ungebundenes Material zu entfernen, wird die Menge an Markierung quantifiziert, z.B. durch Inkubation mittels eines chromogenen Substrats, wie etwa Harnstoff und Bromcresol-Violett oder 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure [ABTS] und H₂O₂, im Falle von Peroxidase als Enzymmarkierung. Die Quantifizierung wird dann durch Messen des Ausmaßes an Farberzeugung erreicht, z.B. unter Verwendung eines Spektrophotometers für Spektren im sichtbaren Bereich.
Die Kits können weiterhin eine geeignet aliquotisierte Zusammensetzung des Pepsin- oder Pepsinogen-Proteins umfassen, markiert oder unmarkiert, das verwendet werden kann, um eine Standardkurve für einen Nachweisassay zu erzeugen.
Die Kits können Antikörper-Markierungs-Konjugate entweder in vollständig konjugierter Form, in der Form von Intermediaten oder als getrennte Gruppen enthalten, um durch den Benutzer des Kit konjugiert zu werden. Die Bestandteile der Kits können entweder in wäßrigen Medien oder in lyophilisierter Form verpackt werden.
Die Behältermittel der Kits werden im allgemeinen wenigstens ein Gefäß, Reagenzröhrchen, Kolben, Flasche, Spritze oder andere Behältermittel enthalten, in die der Antikörper oder das Antigen gebracht und bevorzugt in geeigneter Weise aliquotisiert werden kann. Wenn ein zweiter oder dritter Bindungsligand oder zusätzlicher Bestandteil bereitgestellt wird, wird der Kit ebenso im allgemeinen einen zweiten, dritten oder anderen zusätzlichen Behälter enthalten, in den dieser Ligand oder Bestandteil gebracht werden kann. Die Kits der vorliegenden Erfindung werden ebenso typischerweise ein Mittel zum Beinhalten des Antikörpers, Antigens und jegliche anderen Reagenzbehälter in enger Verpackung für einen kommerziellen Verkauf einschließen. Solche Behälter können spritzgegossene oder blasgeformte Plastikbehälter einschließen, in denen die gewünschten Gefäße gehalten werden.
Die Kits können weiterhin ein Mittel zum Erhalt einer Probe aus einem Patienten umfassen. Solche Mittel können einen Tupfer oder einen Teststreifen, wie hierein beschrieben, einschließen.
Alle hierein offenbarten und beanspruchten Zusammensetzungen und Verfahren können ohne übermäßiges Experimentieren im Licht der vorliegenden Offenbarung ausgeführt werden. Während die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung hinsichtlich bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden sind, wird es Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein, daß Variationen an den Zusammensetzungen und Verfahren und in den Schritten oder in der Abfolge von Schritten des hierin beschriebenen Verfahrens angebracht werden können. Genauer wird es offensichtlich sein, daß bestimmte Mittel, die sowohl chemisch als auch physiologisch verwandt sind, für die hierein beschriebenen Mittel substituiert werden können, während dieselben oder ähnlichen Ergebnisse gleichzeitig erzielt werden.
LITERATURANGABEN
Die folgenden Literaturangaben liefern beispielhafte Verfahrenseinzelheiten oder andere Einzelheiten, die die hierin aufgeführten Details ergänzen.

Aickin M. Linear Statistical Analysis of Discrete Data. New York: Wiley, 1983.
Axelsson, C. K., M. D. Nielsen, and A. M. Kappelgaard. Solid-phase double-antibody radioimmunoassay of pepsinogen I in serum. Clin Chim Acta 121: 309–319, 1982.
Baccino, E., Le Goff, D., Lancien, G., et al.: Exploration of Acid Gastroesophageal Reflux by 24-h pH Metry in Infants at Risk of Sudden Infant Death Syndrome: A Study of 50 Cases. Forensic Sci Int 36: 255–260, 1988.
Breiman L. Friedman JH. Olshen RA. Stone CJ. Classification and Regression Trees. Monterey, Calif: Wadsworth. 1984.
Campbell, in Monoclonal. Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. 13, Burden and Von Knippenberg, Eds. pp. 75–83, Amsterdam, Elseview, 1984.
Castell D. O., Richter J. E. Editorial: Esophageal Symptoms and the "Irritable Esophagus." Dysphagia 2: 109–111, 1987.
Cherry J., Margulies S. I. Contact ulcer of the larynx. Laryngoscope 78: 1937–1940, 1968.
Delahunty J. E. and Cherry J. Experimentally produced vocal cord granulomas. Laryngoscope 78: 1941–1947. 1968.
Doellgast, G. J. Enzyme-linked coagulation assay. IV. Sensitive sandwich enzyme-linked immunosorbent assays using russell's viper venom factor X acitvator-antibody conjugates. Analyt Biochem 167: 97–105, 1987.
Doellgast, G. J. Triscott M. X., Beard G. A., Bottoms J. D., Roh B. H., Roman M. G., Hall P. A., Brown J. E. Sensitive ELISA for detection of C. botulinum neurotoxins A, B and E using signal amplification via enzyme-linked coagulation assay. 1 Clinical Microbiol 31: 2402–2409, 1993.
Doellgast, G. J., Beard G. A., bottoms J. D., Cheng T., Roh B. H., Roman M. G. Hall P. A., Triscott M. X. Enzyme-linked immunoabsorbent assay and enzyme-linked coagulation assay for detection of C. botulinum neurotoxins A. B and E and solution-phase complexes with "dual-label" antibodies. J Clinical Microbiology 32: 105–111, 994.
Durkee ICH, Roh BH, Doellgast GJ. Immunoaffinity chromatographic purification of a russell's viper venom factor X activator using elution in high concentrations of magnesium chloride. Protein Expression and Purification 4: 405–411, 1993.
Efron B. Regression percentiles using asymmetric squared error loss. Statistica Sin 1: 93–126, 1991.
Flores TC, Cross FS, Jones RD. Abnormal Esophageal Manometry in Globus Hystericus. Ann Otol Rhinol Laryngol 90: 383–386, 1981.
Gefter al., Somatic Cell Genet. 3: 231–236, 1977.
Gerhardt DC, Shuck TJ, Bordeaux EA, et al. Human upper esophageal sphincter. Response to volume, osmotic, and and stimuli. Gastroenterol 7: 268–274, 1978.
Goding, 1986, in Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 2d ed., Orlando. Fla., Academic Press, 1986, pp. 60–61, 65–66, 71–74.
Herbst, J. J., Minton, S. D. and Book, L. S.: Gastroesophageal Reflux Causing Respiratory Distress and Apnea in Newborn Infants. J Pediatr, 95: 763–768, 1979.
Hirschowitz BI. A critical analysis, with appropriate controls, of gastric acid and pepsin secretion in clinical esophagitis. Gastroenterol 101: 1149–1158, 1991.
Huang, S. C., K. Miki, K Hirano et al. Enzyme-linked immunosorbent assay of serum pepsinogen I. Clin Chim Acta 162: 65–96, 1987.
Huang, S. C., K: Miki, C. Furihata, M, Ichinose, A. Shimizu and H. Oka. Enzyme-linked immunosorbent assays, for serum pepsinogens i and II using monoclonal antibodies – with data on peptic ulcer and gastric cancer. Clin Chim Acta 175: 37–50, 1988.
Johnson L. F., Harmon J. W. Experimental Esophagitis in a Rabbit Model. Clinical Relevance. J Clin Gastroenterol 8 (Suppf 1): 26–44, 1986.
Kahrilas PJ, Dodds WJ. Dent J. et al. Effect of sleep, spontaneous gastroesophageal reflux and a meal on upper esophageal sphincter pressure in normal human volunteers. Gastroenterol 92: 466–471, 1987.
Kohler and Milstein, Nature 256: 49–497 (1975).
Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511–519 (1976).
Koufman JA, Wiener GJ, Wu WC. Castell DO. Reflux laryngitis and its sequelae: the diagnostic role of ambulatory 24-hour pH monitoring. J Voice 2: 78–89. 1988.
Koufman JA. The otolaryngologic manifestations of gastroesophageal reflux disease. Laryngoscope 101: (Supplement 53) 1–78, 1991.
Koufman JA. Editorial: Aerodigestive Manifestations of Gastroesophageal Reflux: What We Don't Yet Know. Chest 104: 1321–1322, 1993.
Koufman JA. The otolaryngologic manifestations of gastroesophageal (laryngopharyngeal) reflux disease. The Instructional Courses of The American Academv of Otolaryngology – Head and Neck Surgery, Volume 8, Edited by Lucente et al., Mosby, Philadelphia, pages 57–67, 1996.
Lillemoe K. D., Johnson L. F., Harmon J. W. Role of the Components of the Gastroduodenal Contents in Experimental Acid Esophagitis. Surgery 92: 276–284, 1982.
Little FB, Koufman JA, Kohut RI, Marshall RB. Effect of gastric acid on the pathogenesis of subglottic stenosis. Ann Otol Rhinol Laryngol 94: 526–519, 1985.
Miki K, Ichinose M, Shimizu A, et al. Serum pepsinogens as a screening test of extensive chronic gastritis. Gastroenterologia Japonica 22: 133–141, 1987.
Morrison MD. Is chronic gastroesophageal reflux a causative factor in glottic carcinoma? Otolaryngol Head Neck Surg 99: 370–373, 1988.
Nakamura et al., Enzyme Immunoassays: Heterogeneous and Homogeneous Systems, Chapter 27, 1987.
Neoh SH, Jahoda DM, Rowe DS, Voller A. Immunoglobulin classes in mammalian species identified by cross-reactivity with antisera to human immunoglobulin. Immunochemistry 10: 805–813, 1973.
Ohman L, Olofsson J. Tibbling L, et al. Esophageal Dysfunction in Patients with Contact Ulcer of the Larynx. Ann Otol Rhinol Laryngol 92: 228–230, 1983.
Olson NR. The Problem of Gastroesophageal Reflux. Otolaryngol Clin North Am 19: 119–133, 1986.
Ossakow SJ, Etla G. Colturi T. et al.: Esophageal reflux and dysmotility as the basis for persistent cervical symptoms. Ann Otol Rhinol Laryngol 96: 387–392, 1987.
Paton, J. Y., MacFadyen, U. M. and Simpson, H.: Sleep Phase and Gastro-oesophageal Reflux in Infants at Possible Risk of SIDS. Arch Dis Child, 64: 264–269, 1989.
Piper DW, Fenton BH. pH stability and activity curves of pepsin with special reference to their clinical importance. Gut 6: 506–508, 1965.
Richter JE. ed. Ambulatory Esophageal pH Monitoring: Practical Approach and Clinical Applications. Igaku-Shoin, Tokyo, 1991.
Richter JE. Bradley LA. DeMeester TR, Wu WC. et al.: Normal 24-Hour pH values: Influence of study center. pH electrode. age, and gender. Dig Dis Sci 37: 849–856, 1992.
Samloff IM, Taggart RT. Pepsinogens, Pepsins, and Peptic Ulcer. Clin Invest Med 10: 215–221, 1987.
Stemmermann GN, Samloff IM, Heilbrun LK, Nomura A. Serum pepsinogens I and II and stomach cancer. Clin Chim Acta 163: 191–198, 1987.
Waldum HL, Straume BK, Burhol PG. Radioimmunoassay of group I gepsinogens (PG I) and the effect of food on serum PG I. Scand J Gastroenterol 14: 241–247, 1979.
Ward PH, Hanson DG. Reflux as etiological factor of carcinoma of the laryngopharynx. Laryngoscope 98: 1195–1199, 1988.
Wiener GJ, Cooper JB, Wu WC, et al. Is hoarseness an atypical manifestation of gastroesophageal reflux (GER)? An ambulatory 24 hour pH study. (Abstract) Gastroenterol 90A: 1691, 1986.
Wiener GJ, Koufman JA, Wu WC. Copper JB. Richter JE. Castell DO. The pharyngo-esophageal dual ambulatory pH probe for evaluation of atypical manifestations of gastroesophageal reflux (GER). Gastroenterol 92: A1694, 1987.
Wiener GJ, Koufman JA, Wu WC, et al. Chronic hoarseness secondary to gastroesophageal reflux disease: documentation with 24-hour ambulatory pH monitoring. Am J Gastroenterol 84: 1503–1508, 1989.

Claims

Verfahren zum Nachweis eines Magen-Rückfluß-Ereignisses in einem Immunassay oder einem enzymatischen Assay, wobei Pepsin oder Pepsinogen in einer Probe aus einem außerhalb der Speiseröhre befindlichen Gebiet eines Patienten nachgewiesen wird, wobei die Anwesenheit von Pepsin oder Pepsinogen auf ein Magen-Rückfluß-Ereignis hinweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagter Magen-Rückfluß auf eine Magen-Speiseröhren-Erkrankung hinweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagter Magen-Rückfluß auf eine laryngopharyngeale-Rückfluß-Erkrankung hinweist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagtes außerhalb der Speiseröhre befindliches Gebiet der Laryngopharynx, Tracheobronchialbaum, Lunge, Blutgefäß, Mund, Nasennebenhöhle, Atemwege oder Harntrakt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagter Immunassay das In-Kontakt-Bringen einer Probe mit einem auf einem festen Träger immobilisierten Antikörper umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagter Immunassay ein Radioimmunassay ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei besagter fester Träger in die Kehle oder Speiseröhre eines Patienten einführbar ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei besagter fester Träger an ein Endoskop, Aspirator, pH-Katheter, transnasale Magensonde oder einen Endotrachealtubus angehängt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei besagtes Verfahren den Nachweis von Pepsin in Schleim, Speichel, Auswurf, Blut oder Urin umfaßt.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Magen-Rückfluß-Erkrankung, umfassend: Nachweisen der Konzentration von Pepsin oder Pepsinogen in einer Probe, erhalten von einem Patienten, von dem angenommen wird, daß er eine Magen-Rückfluß-Erkrankung hat; und Vergleichen besagter Konzentration mit einer normalen Pepsin- oder Pepsinogen-Konzentration; wobei die Anwesenheit einer Pepsin- oder Pepsinogen-Konzentration über dem Normalwert auf eine Magen-Rückfluß-Erkrankung hinweist, wobei besagtes Verfahren das In-Kontakt-Bringen besagter Probe mit einem Antikörper umfaßt, der mit einem menschlichen Pepsin und/oder Pepsinogen immunreaktiv ist; Nachweisen besagter Immunreaktion; und Vergleichen besagter Immunreaktion mit einem Standard-Immunreaktionsniveau; wobei eine Zunahme hinsichtlich der Immunreaktion in besagter Probe im Vergleich mit besagtem Standard auf eine Magen-Rückfluß-Erkrankung hinweist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei besagte Probe eine Auswurf- oder eine Speichel-Probe ist oder von der Schleimhaut der Atemwege von besagtem Patienten stammt oder aus dem Gebiet zwischen dem unteren Speiseröhren-Sphincter und dem oberen Speiseröhren-Sphincter des besagten Patienten entnommen worden ist oder aus dem Gebiet oberhalb des oberen Speiseröhren-Sphincter des besagten Patienten entnommen worden ist oder eine Serum- oder Urinprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei eine Probe aus dem Gebiet zwischen dem unteren Speiseröhren-Sphincter und dem oberen Speiseröhren-Sphincter des besagten Patienten entnommen worden ist und eine Probe aus dem Gebiet oberhalb des oberen Speiseröhren-Sphincter des besagten Patienten entnommen worden ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei besagtes Nachweisen mittels einer kolorimetrischen Markierung, die an besagten Antikörper angehängt ist, oder mittels einer fluoreszierenden Markierung erfolgt, die an besagten Antikörper angehängt ist.