CN105092851B - 无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条及其制备和使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条及其制备和使用方法，所述试纸条包括：底板，其上、下两面分别有多个平行的第一隔板，形成相互独立的平行凹槽，凹槽侧壁分布有突刺；检测模块，其由样品垫、结合垫、检测垫及吸水纸沿底板的长度方向顺次排列连接构成，结合垫上喷涂有标记了胃蛋白酶单克隆抗体I的纳米金颗粒；检测垫上间隔设置有由胃蛋白酶单克隆抗体II构成的检测带和由羊抗鼠lgG抗体构成的质控带。多个检测模块分别固定在不同的凹槽内。取咽喉分泌物或唾液作为待检测样品液滴加到加样孔上，观察质控带是否显色，并且在24小时内每个2小时连续检测，出现显色反应则诊断为未患有咽喉反流性疾病。

Description

无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条及其制备和使用方法

技术领域

本发明涉及临床诊断技术领域，更具体地说，本发明涉及一种无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条及其制备和使用方法。

背景技术

咽喉反流性疾病是指胃内容物反流至食管上括约肌以上部位，引起一系列症状和体征的总称，临床表现为声音嘶哑或发音障碍、咽喉肿痛、咽喉部异物感、持续清嗓、慢性长期咳嗽、呼吸困难、喉痉挛等症状，以及声带后连合区域粘膜增生、肥厚，声带弥漫性充血水肿，严重时出现肉芽肿、喉室消失、声门下狭窄等喉部体征。

咽喉反流性疾病是耳鼻咽喉头颈外科一些疾病的源头病因，与慢性喉炎、声带息肉、喉接触性肉芽肿等喉部疾患关系密切。目前，咽喉反流性疾病的诊断一般依据症状和喉镜检查的反流症状指数量表以及反流体征评分量表、24小时喉咽部pH监测和胃蛋白酶试剂盒进行诊断。量表诊断缺乏特异性，准确度差；24小时喉咽部pH监测属于有创检查，不易被患者接受；目前应用的胃蛋白酶试剂盒检测唾液中胃蛋白酶诊断咽喉反流，虽然是无创检查，但其是传统的酶联免疫技术，灵敏度较差，且每天患者咽喉反流次数有限，唾液中的胃蛋白酶含量相对较低，只有在咽喉反流后一段时间内的唾液中才能监测到，漏诊率高。

此外，传统的酶检测试剂条一般为单个检测单元，而对于咽喉反流性疾病的检测因胃反流的不定性，需要长时间进行间隔检测，利用一般的试剂条检测时消耗量较大。另外，一般的试剂条的检测模块利用胶体固定在底板上，且检测模块分割时易造成厚度不均，均会不同程度地对检测结果造成影响，从而降低检测的灵敏度和准确度。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明的另一个目的是，提供一种用于无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条，能够对咽喉反流性疾病进行无创诊断，并提高检测的方便性及准确性。

本发明的又一个目的是，提供一种不使用胶体对检测模块进行固定的方法，并使检测模块厚度均匀，提高检测的准确性和灵敏度。

本发明的另一个目的是，提供一种用于无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条的制备方法。

本发明还有一个目的是，提供一种用于无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条的使用方法，能够对咽喉反流性疾病进行准确的诊断。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，本发明提供了以下技术方案：

无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条，包括：

底板，其上、下两面分别设置有多个平行的第一隔板，使底板的上、下两面分别形成多个相互独立的平行凹槽；所述凹槽的侧壁分布有多个呈10-30°倾斜向上设置的突刺，所述突刺的端部向下弯折，使突刺的端部形成与凹槽侧壁平行的倒钩；

检测模块，其由样品垫、结合垫、检测垫及吸水纸沿底板的长度方向顺次排列连接构成；

其中，所述结合垫上喷涂有标记了胃蛋白酶单克隆抗体I的纳米金颗粒；

所述检测垫上间隔设置有由胃蛋白酶单克隆抗体II构成的检测带和由羊抗鼠lgG抗体构成的质控带；

此外，所述检测模块的数量与所述凹槽的数量相对应，且各个检测模块分别固定在不同的凹槽内，形成多个相互独立的检测单元。

优选的是，所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条中，所述凹槽内与样品垫和结合垫的连接处相对应的部位设置有凸起，以使结合垫与样品垫结合处呈坡面；

所述凹槽的深度以凹槽上缘高出检测模块的最高处1-3mm为准。

优选的是，所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条中，所述凹槽内与吸水纸相邻的端部设置有第二隔板，所述第二隔板与凹槽两侧壁相抵顶，将凹槽端部隔离出一空腔；且所述第二隔板上设置有多个通孔，使该空腔与凹槽内的检测模块相互连通；

所述空腔内放置有由无纺布包裹干燥剂形成的干燥包；

此外，所述第二隔板与所述空腔对应的一侧的通孔上设置有向下倾斜15-30°的倒刺，用以将干燥包固定在空腔内。

优选的是，所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条中，所述底板的上、下两面所设置凹槽的数量为8-12个，所述检测模块的数量与凹槽的数量一致。

优选的是，所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条中，还包括塑料外壳，所述塑料外壳套设在所述底板外部，将底板及检测模块封闭；

且所述第一隔板与所述塑料外壳内部相抵顶，使各个凹槽相互隔离；

所述塑料外壳上与各个检测模块的样品垫相对应的位置分别设置有加样孔，与各个检测模块的检测垫相对应的位置分别设置有观察窗；所述加样孔上覆盖有防水隔膜。

无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、提纯胃蛋白酶单克隆抗体I和胃蛋白酶单克隆抗体II；

步骤二、制备结合垫，用共价偶联的方式将步骤一中处理得到的胃蛋白酶单克隆抗体I标记在纳米金颗粒上，然后喷涂在玻璃纤维膜上，避光条件下35～38℃烘干，即制得结合垫；

步骤三、制备检测垫，使用含有4-8％蔗糖的磷酸缓冲溶液分别将胃蛋白酶单克隆抗体II、羊抗鼠IgG抗体稀释至终浓度为0.8-1.2mg/ml，然后分别间隔喷涂在硝酸纤维素膜上，烘干，即得所述检测垫；

步骤四、制备样品垫，用磷酸缓冲溶液浸泡玻璃纤维素膜20-40min，35-38℃烘干，即得所述样品垫；

步骤五、组装，在湿度小于35％，温度为20～25℃条件下进行检测模块的组装；另外，所述检测垫的设置方式为，检测带接近结合垫一端，质控带接近吸水纸一端；将组装后的检测模块裁切为与凹槽相对应的尺寸，将裁切后的检测模块放入各个凹槽中并固定，即得所述试纸条。

优选的是，所述的无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的制备方法中，步骤一中胃蛋白酶单克隆抗体I和胃蛋白酶单克隆抗体II的提纯方法为：

采用离子交换层析和凝胶过滤技术分离纯化人胃液中的胃蛋白酶；将纯化的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备针对人胃蛋白酶的单克隆抗体；通过蛋白酶亲和层析技术和凝胶过滤技术纯化单克隆抗体，利用酶联免疫技术筛选具有高度特异性的诊断用单克隆抗体。

优选的是，所述的无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的制备方法中，步骤二中，直径为10-20nm的纳米金颗粒标记有生物素；直径为40-60nm的纳米金颗粒标记有链霉亲和素，作为二级捕获纳米金。

无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的使用方法，方法为：

打开一个加样孔上的防水隔膜，取咽喉分泌物或唾液作为待检测样品液，将样品液滴加到该加样孔上，观察质控带是否显色：

质控带显色则诊断为患有咽喉反流性疾病；

质控带不显色则间隔2小时后重复上一步操作，直至在24小时内出现显色反应则诊断为患有咽喉反流性疾病，未出现显色反应则诊断为未患有咽喉反流性疾病。

优选的是，所述的用于无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的使用方法中，也可按照下列步骤进行：

步骤一、打开一个加样孔上的防水隔膜，取咽喉分泌物或唾液作为待检测样品液，将样品液滴加到该加样孔上，观察质控带是否显色，并在与该加样孔对应的位置做出相应的标记；

步骤二、间隔2小时后，打开与上一次加样相邻的加样孔，再次采集样品液并滴加到该加样孔上，并依此方法在24小时内连续采样滴加，观察每次质控的显色情况并标记；

步骤三、对所述试纸条上的所有检测垫进行结果统计并分析，并按照以下方法进行判断：

质控带均不显色，诊断为未患有咽喉反流性疾病；

只有一个检测模块的质控带显色，诊断为患有轻度咽喉反流性疾病；

有2-3个检测模块的质控带显色，诊断为患有中度咽喉反流性疾病；

有3个以上检测模块的质控带显色诊断为患有重度咽喉反流性疾病。

本发明至少包括以下有益效果：首先，本发明通过设置喷涂有标记了胃蛋白酶单克隆抗体I的纳米金颗粒的结合垫、以及在检测垫上喷涂由胃蛋白酶单克隆抗体II构成的检测带和由羊抗鼠lgG抗体构成的质控带，使所述试纸条通过对咽喉分泌物的检测，能够方便地对咽喉反流性疾病进行无创诊断。病人可不需要专业仪器设备和专业操作人员，自行利用所述试纸条对咽喉分泌物随时随地进行分析检测，从而方便地对咽喉反流性疾病做出准确旳诊断。同时，本发明通过在底板上设置多个凹槽，可在同一底板上固定多个检测模块，从而针对胃反流的不定时性，病人可方便地进行间隔性连续检测，不必在医院进行24小时监测，并且由于多个检测模块在同一底板上顺序排列，可记录不同时间的咽喉分泌物的变化情况，提高了检测的准确性及便利性，同时减小耗材，降低检测成本。

其次，本发明通过采用双纳米金颗粒增强信号的方式，即将较小直径的纳米金颗粒标记生物素，较大直径的纳米金颗粒标记链霉亲和素，可以用于放大检测信号，并作为二级捕获纳米金，可以使试纸条灵敏度提高10-100倍。

最后，本发明通过在底板上的凹槽的侧壁设置向下倾斜的突刺，能够使检测模块放入凹槽后，不利用任何胶体就能够将检测模块在凹槽内进行固定，不仅避免了胶体对检测结果的影响，而且由于突刺的划动，使检测模块裁切时形成的裁切线自动回复蓬松，从而使检测模块的厚度一致，提高检测的准确性。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明所述的胃蛋白酶检测试纸条的底板的结构示意图；

图2为本发明所述的胃蛋白酶检测试纸条的俯视图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做详细说明，以令本领域普通技术人员参阅本说明书后能够据以实施。

如图1、2所示，无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条，包括：

底板1，其可为PVC、PE或其他硬性材质，且具有一定的防水性。底板1的上、下两面分别设置有多个平行的第一隔板8，使底板1的上、下两面分别形成多个相互独立的平行凹槽9。第一隔板8由不透水材料制成，使各个凹槽9内的检测模块相互独立，互补干扰。通过在底板1上设置多个凹槽9，并在同一底板1上固定多个检测模块，可针对胃反流的不定时性，病人可方便地进行间隔性连续检测，不必在医院进行24小时监测，并且由于多个检测模块在同一底板1上顺序排列，可记录不同时间的咽喉分泌物的变化情况，提高了检测的准确性及便利性，同时减小耗材，降低检测成本。

所述凹槽9的侧壁分布有多个呈10-30°倾斜向上设置的突刺10，所述突刺10的端部向下弯折，使突刺10的端部形成与凹槽9侧壁平行的倒钩。检测模块进行裁切时，两侧由于裁切时的压力作用往往形成一定的裁切线，使检测模块两侧厚度略小于中部厚度，对检测的准确性造成一定的影响。通过在凹槽9内壁设置向上倾斜的突刺10，那么在将检测模块向下放置入凹槽9的过程中，突刺10对检测模块的两侧会形成一定的阻隔，并对其两侧产生一定程度的划动，从而能够使检测模块的两侧恢复蓬松，使放置到凹槽9中的检测模块平整，厚度一致，提高检测的准确性。此外，所述突刺10的端部向下弯折，使突刺10的端部形成与凹槽9侧壁平行的倒钩，使检测模块放入凹槽9后，倒钩会将检测模块固定，不利用任何胶体就能够将检测模块在凹槽9内进行固定，避免了胶体对检测结果的影响。倒钩与凹槽9内壁平行是为了减小检测模块进入凹槽9中的阻力。

检测模块，其由样品垫2、结合垫3、检测垫4及吸水纸6沿底板1的长度方向顺次排列连接构成；其中，所述结合垫3上喷涂有标记了胃蛋白酶单克隆抗体I的纳米金颗粒；所述检测垫4上间隔设置有由胃蛋白酶单克隆抗体II构成的检测带6和由羊抗鼠lgG抗体构成的质控带7；此外，所述检测模块的数量与所述凹槽9的数量相对应，且各个检测模块分别固定在不同的凹槽9内，形成多个相互独立的检测单元，并构成各自独立液体泳动通路。通过设置喷涂有标记了胃蛋白酶单克隆抗体I的纳米金颗粒的结合垫3、以及在检测垫4上喷涂由胃蛋白酶单克隆抗体II构成的检测带6和由羊抗鼠lgG抗体构成的质控带7，使所述试纸条通过对咽喉分泌物进行检测，能够方便地对咽喉反流性疾病进行无创诊断。

所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条中，所述凹槽9内与样品垫2和结合垫3的连接处相对应的部位设置有凸起11，以使结合垫3与样品垫2结合处呈坡面，使待检测样本流过结合垫3的时间和路程延长，样本中被分析物能够更加充分地与带有金标的抗体结合，从而使被分析物上携带的金标更加均匀，从而在下一步进入到检测垫4上进行结果测试时，检测结果线显示较均匀，进一步改善测试结果线的断线和颜色不均匀的问题。所述凹槽9的深度以凹槽上缘高出检测模块的最高处1-3mm为准，使塑料外壳不会对检测模块产生压迫。所述的用于无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条中，所述结合垫3为玻璃纤维膜。

所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条中，所述凹槽9内与吸水纸5相邻的端部设置有第二隔板12，所述第二隔板12与凹槽9两侧壁相抵顶，将凹槽9端部隔离出一空腔15；且所述第二隔板12上设置有多个通孔，使该空腔15与凹槽9内的检测模块相互连通。所述空腔15内放置有由无纺布包裹干燥剂形成的干燥包，干燥剂可选择硅胶、生石灰粉、氯化镁、活性炭等，因其具有良好的吸水性，一方面能够起到虹吸作用，另一方面能够保持检测模块的干燥，增加检测模块的稳定性。第二隔板12上的通孔作用在于使空腔15和凹槽9内空间连通，以便干燥包对检测模块的吸水纸5能够接触，进而产生虹吸作用。此外，所述第二隔板与所述空腔对应的一侧的通孔上设置有向下倾斜15-30°的倒刺，用以将干燥包固定在空腔内，并能够使干燥包贴附在第二隔板12上，进而与吸水纸5保持接触，产生虹吸效果。

所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条中，所述底板1的上、下两面所设置凹槽9的数量为8-12个，所述检测模块的数量与凹槽9的数量一致。针对咽喉反流性疾病的发生反流的不确定性，24小时内可不定时地发生有限的几次反流，而只有发生反流后所采集的咽喉分泌物样本才具有诊断价值，因此，需要病人在24小时内每间隔一段时间，一般为2小时左右，即做一次检测，那么采用一般的单个试纸条的用量比一般的检测用量大很多，而且一般的单个试纸条不带有任何标记，检测过后的试纸条很容易发生混淆，不利于结果分析。而本发明通过将多个试纸条在同一底板1的上下两面顺序均匀地排列，不仅减小试纸条的制作成本，而且使每次的检测结果均能在同一试纸条组上顺序呈现，便于对检测结果进行分析比对，不仅能得出精确的检测结果，而且能够清晰反映出胃蛋白酶在24小时内的变化情况，进而做出准确的线性分析，大大提高了诊断的准确性。

所述的用于无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条中，还包括塑料外壳，所述塑料外壳套设在所述底板1外部，将底板1及检测模块封闭；且所述第一隔板8与所述塑料外壳内部相抵顶，使各个凹槽9相互隔离。所述塑料外壳上与各个检测模块的样品垫2相对应的位置分别设置有加样孔13，与各个检测模块的检测垫4相对应的位置分别设置有观察窗14；所述加样孔13上覆盖有防水隔膜。每个加样孔13上覆盖独立的防水隔膜，那么在使用时仅仅打开所使用的单个加样孔13即可，避免其他检测模块暴露于空气中。

无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、提纯胃蛋白酶单克隆抗体I和胃蛋白酶单克隆抗体II；

步骤二、制备结合垫3，用共价偶联的方式将步骤一中处理得到的胃蛋白酶单克隆抗体I标记在纳米金颗粒上，然后喷涂在玻璃纤维膜上，避光条件下35～38℃烘干，即制得结合垫3；

步骤三、制备检测垫，使用含有4-8％蔗糖的磷酸缓冲溶液分别将胃蛋白酶单克隆抗体II、羊抗鼠IgG抗体稀释至终浓度为0.8-1.2mg/ml，然后分别间隔喷涂在硝酸纤维素膜上，烘干，即得所述检测垫；

步骤四、制备样品垫，用磷酸缓冲溶液浸泡玻璃纤维素膜20-40min，35-38℃烘干，即得所述样品垫；

步骤五、组装，在湿度小于35％，温度为20～25℃条件下进行检测模块的组装；另外，所述检测垫4的设置方式为，检测带6接近结合垫3一端，质控带7接近吸水纸5一端；将组装后的检测模块裁切为与凹槽9相对应的尺寸，将裁切后的检测模块放入各个凹槽9中并固定，即得所述试纸条。

所述的无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的制备方法中，步骤一中胃蛋白酶单克隆抗体I和胃蛋白酶单克隆抗体II的提纯方法为：采用离子交换层析和凝胶过滤技术分离纯化人胃液中的胃蛋白酶；将纯化的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备针对人胃蛋白酶的单克隆抗体；通过蛋白酶亲和层析技术和凝胶过滤技术纯化单克隆抗体，利用酶联免疫技术筛选具有高度特异性的诊断用单克隆抗体。

所述的无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的制备方法中，步骤二中，直径为10-20nm的纳米金颗粒标记有生物素；直径为40-60nm的纳米金颗粒标记有链霉亲和素，作为二级捕获纳米金。

无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的使用方法，方法为：打开一个加样孔上的防水隔膜，取咽喉分泌物或唾液作为待检测样品液，将样品液滴加到该加样孔13上，观察质控带7是否显色：质控带7显色则诊断为患有咽喉反流性疾病；质控带7不显色则间隔2小时后重复上一步操作，直至在24小时内出现显色反应则诊断为患有咽喉反流性疾病，未出现显色反应则诊断为未患有咽喉反流性疾病。

所述的用于无创诊断咽喉反流性疾病的胃蛋白酶检测试纸条的使用方法中，也可按照下列步骤进行：

步骤一、打开一个加样孔13上的防水隔膜，取咽喉分泌物或唾液作为待检测样品液，将样品液滴加到该加样孔13上，观察质控带7是否显色，并在与该加样孔13对应的位置做出相应的标记；

步骤二、间隔2小时后，打开与上一次加样相邻的加样孔13，再次采集样品液并滴加到该加样孔13上，并依此方法在24小时内连续采样滴加，观察每次质控带7的显色情况并标记；

步骤三、对所述试纸条上的所有检测垫4进行结果统计并分析，并按照以下方法进行判断：

质控带7均不显色，诊断为未患有咽喉反流性疾病；

只有一个检测模块的质控带7显色，诊断为患有轻度咽喉反流性疾病；

有2-3个检测模块的质控带7显色，诊断为患有中度咽喉反流性疾病；

有3个以上检测模块的质控带7显色诊断为患有重度咽喉反流性疾病。

实施例1

步骤一、提纯胃蛋白酶单克隆抗体I和胃蛋白酶单克隆抗体II。采用离子交换层析和凝胶过滤技术分离纯化人胃液中的胃蛋白酶；将纯化的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备针对人胃蛋白酶的单克隆抗体；通过蛋白A亲和层析技术和凝胶过滤技术纯化单克隆抗体，利用酶联免疫技术筛选具有高度特异性的诊断用单克隆抗体。

步骤二、制备结合垫3。所述纳米金颗粒选用制备的不同直径的纳米金颗粒，通过紫外-可见光分析、透射电子显微镜分析，对制备的纳米金颗粒进行表征；首先，用共价偶联的方式将步骤一中处理得到的胃蛋白酶单克隆抗体I标记在所述纳米金颗粒上。再使用喷膜仪将标记有胃蛋白酶单克隆抗体I喷涂于玻璃纤维膜上，避光条件下35℃烘干，制得结合垫3，加入干燥剂封存备用。选择直径分别为15nm和50nm两种纳米金颗粒进行标记，其中直径为15nm的纳米金颗粒标记生物素，直径为50nm的纳米金颗粒标记链霉亲和素，作为二级捕获纳米金。

步骤三、制备硝酸纤维素膜。使用含有5％蔗糖的磷酸缓冲溶液分别将胃蛋白酶单克隆抗体II、羊抗鼠IgG抗体稀释至终浓度为1mg/ml，再使用喷膜仪将二者间隔喷涂在硝酸纤维素膜上，35℃烘干，烘干时间30min，制成包括检测带6和质控带7的硝酸纤维素膜，加入干燥剂封存备用。

步骤四、制备样品垫2。用磷酸缓冲溶液浸泡玻璃纤维素膜，浸泡时间30min，35℃烘干20min，制得样品垫2。

步骤五、组装试纸条。在湿度为30％，温度为22℃条件下进行检测模块的组装，组装的顺序为样品垫2、结合垫3、检测垫4、吸水纸5，所述检测垫4设置时，在远离所述样品垫2的方向上依次为检测带6和质控带7。所述底板1选用PVC板。将组装后的检测模块进行裁切，使其与底板1上凹槽9的大小相对应，将裁切后的检测模块放入各个凹槽9中并固定。

使用时，每间隔2小时取待检测病人咽喉分泌物作为待检测样品液，将样品液滴加到样品垫2上，24小时内检测试纸条的多个检测模块中，有一个质控带显色，判断为该病人未患有轻度咽喉反流性疾病。

实施例2

步骤一、提纯胃蛋白酶单克隆抗体I和胃蛋白酶单克隆抗体II。采用离子交换层析和凝胶过滤技术分离纯化人胃液中的胃蛋白酶；将纯化的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备针对人胃蛋白酶的单克隆抗体；通过蛋白A亲和层析技术和凝胶过滤技术纯化单克隆抗体，利用酶联免疫技术筛选具有高度特异性的诊断用单克隆抗体。

步骤二、制备结合垫3。所述纳米金颗粒选用制备的不同直径的纳米金颗粒，通过紫外-可见光分析、透射电子显微镜分析，对制备的纳米金颗粒进行表征；首先，用共价偶联的方式将步骤一中处理得到的胃蛋白酶单克隆抗体I标记在所述纳米金颗粒上。再使用喷膜仪将标记有胃蛋白酶单克隆抗体I喷涂于玻璃纤维膜上，避光条件下37℃烘干，制得结合垫3，加入干燥剂封存备用。选择直径分别为20nm和60nm两种纳米金颗粒进行标记，其中直径为20nm的纳米金颗粒标记生物素，直径为60nm的纳米金颗粒标记链霉亲和素，作为二级捕获纳米金。

步骤三、制备硝酸纤维素膜。使用含有6％蔗糖的磷酸缓冲溶液分别将胃蛋白酶单克隆抗体II、羊抗鼠IgG抗体稀释至终浓度为0.8mg/ml，再使用喷膜仪将二者间隔喷涂在硝酸纤维素膜上，37℃烘干，烘干时间20min，制成包括检测带6和质控带7的硝酸纤维素膜，加入干燥剂封存备用。

步骤四、制备样品垫2。用磷酸缓冲溶液浸泡玻璃纤维素膜，浸泡时间40min，37℃烘干30min，制得样品垫2。

步骤五、组装试纸条。在湿度为25％，温度为25℃条件下进行检测模块的组装，组装的顺序为样品垫2、结合垫3、检测垫4、吸水纸5，所述检测垫4设置时，在远离所述样品垫2的方向上依次为检测带6和质控带7。所述底板1选用PVC板。将组装后的检测模块进行裁切，使其与底板1上凹槽9的大小相对应，将裁切后的检测模块放入各个凹槽9中并固定。

使用时，每间隔2小时取待检测病人咽喉分泌物作为待检测样品液，将样品液滴加到样品垫2上，24小时内检测试纸条的多个检测模块中，有4个质控带显色，判断为该病人未患有重度咽喉反流性疾病。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条，其特征在于，包括：

底板，其上、下两面分别设置有多个平行的第一隔板，使底板的上、下两面分别形成多个相互独立的平行凹槽；所述凹槽的侧壁分布有多个呈10-30°倾斜向上设置的突刺，所述突刺的端部向下弯折，使突刺的端部形成与凹槽侧壁平行的倒钩；

检测模块，其由样品垫、结合垫、检测垫及吸水纸沿底板的长度方向顺次排列连接构成；

其中，所述结合垫上喷涂有标记了胃蛋白酶单克隆抗体I的纳米金颗粒；

所述检测垫上间隔设置有由胃蛋白酶单克隆抗体II构成的检测带和由羊抗鼠lgG抗体构成的质控带；

此外，所述检测模块的数量与所述凹槽的数量相对应，且各个检测模块分别固定在不同的凹槽内，形成多个相互独立的检测单元。

2.如权利要求1所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条，其特征在于，所述凹槽内与样品垫和结合垫的连接处相对应的部位设置有凸起，以使结合垫与样品垫结合处呈坡面；

所述凹槽的深度以凹槽上缘高出检测模块的最高处1-3mm为准。

3.如权利要求1所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条，其特征在于，所述凹槽内与吸水纸相邻的端部设置有第二隔板，所述第二隔板与凹槽两侧壁相抵顶，将凹槽端部隔离出一空腔；且所述第二隔板上设置有多个通孔，使该空腔与凹槽内的检测模块相互连通；

所述空腔内放置有由无纺布包裹干燥剂形成的干燥包；

此外，所述第二隔板与所述空腔对应的一侧的通孔上设置有向下倾斜15-30°的倒剌，用以将干燥包固定在空腔内。

4.如权利要求1所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条，其特征在于，所述底板的上、下两面所设置凹槽的数量为8-12个，所述检测模块的数量与凹槽的数量一致。

5.如权利要求1所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条，其特征在于，还包括塑料外壳，所述塑料外壳套设在所述底板外部，将底板及检测模块封闭；

且所述第一隔板与所述塑料外壳内部相抵顶，使各个凹槽相互隔离；

所述塑料外壳上与各个检测模块的样品垫相对应的位置分别设置有加样孔，与各个检测模块的检测垫相对应的位置分别设置有观察窗；所述加样孔上覆盖有防水隔膜。

6.如权利要求1所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、提纯胃蛋白酶单克隆抗体I和胃蛋白酶单克隆抗体II；

步骤二、制备结合垫，用共价偶联的方式将步骤一中处理得到的胃蛋白酶单克隆抗体I标记在纳米金颗粒上，然后喷涂在玻璃纤维膜上，避光条件下35～38℃烘干，即制得结合垫；

步骤三、制备检测垫，使用含有4-8％蔗糖的磷酸缓冲溶液分别将胃蛋白酶单克隆抗体II、羊抗鼠IgG抗体稀释至终浓度为1mg/ml，然后分别间隔喷涂在硝酸纤维素膜上，烘干，即得所述检测垫；

步骤四、制各样品垫，用磷酸缓冲溶液浸泡玻璃纤维素膜20-40min，35-38℃烘干，即得所述样品垫；

步骤五、组装，在湿度小于35％，温度为20～25℃条件下进行检测模块的组装；另外，所述检测垫的设置方式为，检测带接近结合垫一端，质控带接近吸水纸一端；将组装后的检测模块裁切为与凹槽相对应的尺寸，将裁切后的检测模块放入各个凹槽中并固定，即得所述试纸条。

7.如权利要求6所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤一中胃蛋白酶单克隆抗体I和胃蛋白酶单克隆抗体II的提纯方法为：

采用离子交换层析和凝胶过滤技术分离纯化人胃液中的胃蛋白酶；将纯化的胃蛋白酶免疫BALB/c小鼠，通过杂交瘤融合技术制备针对人胃蛋白酶的单克隆抗体；通过蛋白酶亲和层析技术和凝胶过滤技术纯化单克隆抗体，利用酶联免疫技术筛选具有高度特异性的诊断用单克隆抗体。

8.如权利要求6所述的无创诊断咽喉反流性疾病的试纸条的制备方法，其特征在于，步骤二中，直径为10-20nm的纳米金颗粒标记有生物素；直径为40-60nm的纳米金颗粒标记有链霉亲和素，作为二级捕获纳米金；标记生物素的纳米金颗粒和标记链霉亲和素的纳米金颗粒均标记有所述胃蛋白酶单克隆抗体I。