DE69720065T2

DE69720065T2 - Therapeutische anwendungen von antigenen oder epitopen assoziert mit unvollständiger zellulärer peptidprozesierung , z.b.: exprimiert in rma-s zellen transfiziert mit b7-1 gen

Info

Publication number: DE69720065T2
Application number: DE69720065T
Authority: DE
Inventors: Klas Kaerre; Max Pettersson; Johan Sandberg; Elisabeth Wolpert
Original assignee: ACCURO IMMUNOLOGY STOCKHOLM AB
Current assignee: ACCURO IMMUNOLOGY STOCKHOLM AB
Priority date: 1996-12-12
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2003-12-04
Anticipated expiration: 2017-12-13
Also published as: EP0964697B1; DK0964697T3; CA2274837A1; EP0964697A1; ES2193408T3; WO1998025645A1; ATE234628T1; DE69720065D1; JP2001517208A; SE9604581D0; PT964697E; AU5423898A; US20030087846A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Substanzen, die die Expression insbesondere MHC Klasse I abhängiger Antigene oder Epitope, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind zur Herstellung von Pharmazeutika, pharmazeutischen Zusammensetzungen oder Impfstoffen, die spezifische T-Zell-vermittelte Immunantworten gegen Krebs und virusinfizierte Zellen stimulieren. Sie betrifft für den gleichen Zweck ebenfalls die Verwendung insbesondere MHC Klasse I abhängiger Antigene oder Epitope oder Teilen davon, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung, assoziiert sind. Sie betrifft ebenfalls Säugetierzellen, die manipuliert worden sind, um insbesondere MHC Klasse I abhängige Antigene oder Epitope zu exprimieren, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind sowie lymphoide Zellen, die für den gleichen Zweck gegen solche MHC Klasse I abhängigen Strukturen aktiviert sind. Außerdem werden solche Manipulationsverfahren von Säugetierzellen und zum Behandeln von Menschen sowie auch Kits zur Verwendung bei solchen Manipulationen zur Verfügung gestellt. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Molekülen, einschließlich T-Zell-Rezeptoren oder Teilen davon, die insbesondere gegen MHC Klasse-I abhängige Antigene oder Epitope gerichtet sind, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind zur Herstellung von Pharmazeutika, pharmazeutischen Zusammensetzungen · oder Vakzinen. Der letztendliche Zweck dieser obengenannten Produkte oder Verfahren ist die Behandlung, Prävention und Diagnose von Krebserkrankungen und Virusinfektionen.

Hintergrund der Erfindung

Das Immunsystem erkennt Material, das dem Körper fremd ist (sogenannte Antigene) und eliminiert dieses Material. Ein wichtiger Teil des Immunsystems besteht aus CD8&spplus; cytotoxischen T-Zellen oder T-Lymphozyten (CTL), die zum Beispiel bei Virusinfektionen oder bei einer Transplantation fremde oder kranke Zellen erkennen und diese umbringen. T-Zellen erkennen Antigene über einen T-Zell-Rezeptor auf ihren Oberflächen. Der T-Zell-Rezeptor erkennt ein Zelloberflächenmolekül MHC (Haupthistokompatibilitätskomplex) (HLA (menschliches Leukozyten-assoziiertes Antigen) bei Menschen), an das ein Peptid gebunden ist. MHC Klasse I-Moleküle werden auf allen kernhaltigen Zellen exprimiert, sie präsentieren bevorzugt endogene zelluläre Peptide. MHC Klasse II-Moleküle werden bevorzugt auf professionellen Antigenpräsentierenden Zellen exprimiert und präsentieren bevorzugt Peptide extrazellulärer Antigene. Die Erkennungsstruktur für T-Zellen auf einer Zielzelle, d. h. ein Peptid, das an ein MHC-Molekül gebunden ist, wird als Epitop bezeichnet. Ein Epitop kann oft der Teil eines größeren Antigens, d. h. eines Proteins sein.
Die Produktion und Darstellung von MHC Klasse I-Komplexen kommt durch eine Peptidprozessierungsmaschinerie innerhalb der Zellen zustande, ob diese normal, virusinfiziert oder zu Krebszellen transformiert sind. Zellen verwenden Proteasomen, um cytoplasmatische Proteine in kurze Peptide zu degradieren (1). Einige dieser Peptide werden mit Hilfe des Transporters, der mit dem Antigenprozessierungs-(TAP)-Molekül assoziiert ist, aus dem Nukleus oder Cytoplasma in das Endoplasmatische Reticulum (ER) oder in den Golgi- Apparat transportiert. Sobald sie im ER- oder im Goli-Apparat sind, binden die Peptide an MHC Klasse I-Proteine, um einen trimolekularen Komplex zu bilden. Dieser Komplex wird dann auf die Zelloberfläche transportiert, wo er von Rezeptoren von T-Lymphozyten erkannt werden kann. Rezeptoren auf der Oberfläche eines bestimmten Typs von T-Lymphozyten, die als CD8&spplus;-positive T-Lymphozyten bekannt sind, erkennen spezifisch die MHC Klasse I-Komplexe, die durch die Kombination mit MHC Klasse I-Proteinen und Peptiden, die von einem bestimmten Protein stammen, gebildet werden, und sie induzieren die CD8&spplus;-Lymphozyten dazu, die Zellen umzubringen, die diese Komplexe tragen. Wenn das fragliche Protein viralen Ursprungs ist, sind die T-Lymphozyten daher spezifisch für Zellen, die mit dem relevanten Virus infiziert sind. Bei einer Virusinfektion sind viele der MHC-Moleküle der Zelle mit Viruspeptiden anstelle von Peptiden normaler zellulärer Proteine gefüllt.
Die intrazelluläre Kette der Ereignisse, die zur Bildung von MHC Klasse I-restringierten Epitopen für die T-Zell-Erkennung führt, d. h. die Degradierung eines nativen Proteins, der Peptidtransport in das ER und das Laden des Peptids auf die MHC Klasse L-Moleküle wird als "zelluläre Peptidprozessierung" bezeichnet.
Die Peptide werden durch einen intrazellulären molekularen Komplex, der als TAP (2) bezeichnet wird, in das ER transportiert. In Abwesenheit eines funktionellen TAP-Komplexes werden die meisten der MHC Klasse I-Moleküle im ER zurückgehalten, und nur eine geringe Fraktion wird auf die Zelloberfläche transportiert (3-6). Das ist in Zelllinien mit Defekten in den TAP-Genen studiert worden. Die MHC Klasse I-Moleküle solcher Zellen werden oft als "leer" oder "peptidrezeptiv" bezeichnet; sie sind bei physiologischer Temperatur unstabil, können aber in Kultur bei niedrigen Temperaturen oder durch die Zugabe exogener MHC Klasse I-bindender Peptide stabilisiert werden (7-9).
TAP wird als bedeutsam für MHC Klasse I-restringierte CTL-Antworten betrachtet, da TAP-defiziente Zellen von konventionellen MHC Klasse Irestringierten CTL ineffizient erkannt werden, die spezifisch für virale, Minor histocompatibility- oder Tumorantigene sind (7, 10, 11). Im Gegensatz dazu können TAP-defiziente Zellen durch einige Allo-MHC Klasse I-spezifische CTL erkannt werden (10, 12, 13). Es ist nicht klar, ob solche allospezifischen CTL per se MHC Klasse L-Moleküle oder MHC Klasse I-Moleküle, die mit TAP-unabhängigen Peptiden beladen sind, erkennen. Die zuletzt genannten können Peptidarten einschließen, die von Signalsequenzen stammen (14, 15), oder Peptide, die durch andere TAP-unabhängige Mechanismen aus dem ER importiert wurden.
Tumoren setzen sich aus Zellen zusammen, deren Wachstumskontrolle verloren gegangen ist, d. h. sie wachsen ohne Begrenzung und können normales Gewebe invadieren. Tumore können in allen Sorten von Organen entstehen. Viele Forschergruppen machen heute Versuche, T-Zellen zu induzieren, um Tumorzellen zu erkennen und umzubringen. Die Strategie liegt darin, Proteine und Peptide aus diesen Proteinen zu finden, die für den Tumor einzigartig sind, welche auf verschiedenen MHC-Molekülen haften können. Solche Peptide werden dann als Bestandteile von Impfstoffen verwendet, die die Immunantwort gegen den Tumor stimulieren sollten. Ein Problem liegt darin, dass verschiedene Tumoren unterschiedliche Proteine enthalten, und dass MHC- Moleküle und dadurch die Peptide, die sich an die MHC-Moleküle anlagern, zwischen Individuen sowie auch zwischen Tumoren variieren können. Ein weiteres Problem liegt darin, dass viele Tumoren Teile ihrer Antigen- Prozessierungsmechanismen, d. h. TAP, verloren haben, und deswegen werden sie durch konventionelle T-Zellen nicht entdeckt. Ihnen fehlt die Antigenizität und sie können der Immunantwort entkommen (16-19).
Die TAP-Funktion wird daher als essentiell für die Antigenizität betrachtet, und es wurde kürzlich vorgeschlagen, dass die Hemmung der TAP- Funktion in Zellen die T-Zell-Antworten gegen Antigene, die von diesen Zellen exprimiert werden, reduziert oder verhindert. WO 95/15384 beschreibt zum Beispiel einen TAP-Inhibitor - ein Protein ICP47 - das vom Herpes Simplex-Virus (HSV) isoliert wurde, und dessen Verwendung, um die Präsentation viraler und zellulärer Antigene, die mit MHC Klasse I-Proteinen assoziiert sind, gegenüber CD8&spplus;T-Lymphozyten zu inhibieren. Verschiedene Forscher unterstreichen die Herunterregulierung des TAP und des Proteasoms als Weg für Zellen, einem T-Zell-vermittelten Erkennen zu entkommen. Die vorliegende Erfindung basiert auf einem neuen Konzept, d. h., dass die Prävention der zellulären Peptidprozessierung durch die die Verhinderung der TAP-Funktion anstatt zu einer verminderten zu einer neuen und einzigartigen Antigenizität der Zellen durch Wirts-T-Zellen führt, mittels Erkennung neuer, endogener MHC Klasse I-abhängiger Antigene, die in Gegenwart eines voll funktionellen TAP-Moleküls nicht erkannt werden. Die Forscher haben gezeigt, dass die Immunisierung mit TAP-defizienten Zellen T-Zellen hervorbringt, die gegen Epitope, die bevorzugt von TAP-defizienten Zellen exprimiert werden, gerichtet sind, und dass die Induzierung solcher T-Zellen das Krebswachstum von einigen Tumorzielen verhindern kann.
Eine Anwendung dieser Erfindung ist die Immuntherapie gegen Krebs, die darauf zielt, Krebszellen mit nicht ausreichender Fähigkeit TAP-abhängige Peptide zu prozessieren und zu präsentieren, zu eliminieren. Krebs ist eine häufige Erkrankung bzw. eher eine Gruppe von Erkrankungen. Prozessierungs- /TAP-Defizite sind kürzlich in einer Vielzahl humaner Tumoren beobachtet worden (z. B. cervical Karzinome, Melanome, Brustkrebs). Die Entwicklung und Anwendung von Immuntherapieprotokollen ist heute außerdem mit dem Problem von Ausreißervarianten (z. B. mit TAP-Defekten) konfrontiert, die sogar durch die Behandlung selektioniert werden können, die verabreicht wird. Ob die Epitope sich als zelllinienspezifisch erweisen oder nicht, so kann sich das Prinzip doch auf eine Vielzahl von Krebsarten anwenden lassen, da verschiedene T-Zellen gegen verschiedene TAP-defiziente Tumoren erzeugt werden können. Das angewendete Prinzip kann deswegen in der Immuntherapiebehandlung relevant sein, die allein in Schweden jährlich einigen Hundert oder sogar Tausenden von Patienten gegen wird.
Eine weitere Anwendung ist die Entwicklung einer HSV-Vakzine. HSV ist ein sehr häufiges Virus. Eine hohen Prozentzahl der schwedischen Bevölkerung ist infiziert. Einige Leute haben eine nicht-symptomatische, aber ansteckende Infektion. Die meisten Personen mit Symptomen haben orale Geschwüre, die sehr lästig sein können, obwohl sie nicht die Lebenserwartung beeinflussen. Eine ungewöhnliche schwere Komplikation ist eine Meningitis, die lebensbedrohlich sein kann. HSV kann auch Vaginalgeschwüre verursachen, die eine lebensbedrohliche Infektion bei neugeborenen Kindern infizierter Mütter verursachen können. Es ist gezeigt worden, dass HSV TAP herunterreguliert und dadurch "normalen" MHC Klasse I-restringierten CTL-Antworten entkommen kann. Die beschriebenen Epitope und Verfahren können ein Weg sein, eine HSV-Virus-Vakzine zu entwickeln, die es nicht gibt.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung eines Substrats, das die zelluläre Peptidprozessierung für die MHC-Präsentation stört, wobei die Substanz dadurch charakterisiert ist, dass Tumorzellen, die mit der Substanz behandelt werden, einer spezifischen Lyse durch CTL unterworfen werden, die durch eine TAP-defiziente Variante der Tumorzelle hervorgerufen werden, die mit dem stimulatorischen Molekül B7-1 transfiziert worden ist, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Impfstoffs zur Behandlung von Krebs oder einer Virusinfektion wie in den Ansprüchen definiert.
Die vorliegende Erfindung bietet ebenfalls ein in vitro-Verfahren zum Herstellen von Zeilen, die in der Lage sind, CDB-T-Lymphozyten zu aktivieren, die selektiv Zellen erkennen, die eine gestörte zelluläre Peptidpro¬ zessierung bei die MHC-Präsentation aufweisen, umfassend den Schritt des Behandelns von Zellen mit einer wirksamen Dosis einer Substanz, die die zelluläre Peptidprozessierung für MHC-Präsentation stört, wobei die Substanz dadurch charakterisiert ist, dass Tumorzellen mit der Substanz behandelt werden, die einer spezifischen Lyse durch CTL unterworfen werden, die durch die TAP-defiziente Variante der Tumorzelle hervorgerufen wird, welche mit dem stimulatorischen Molekül B7-1 transfiziert wurde, wie in den Ansprüchen definiert.
Die vorliegende Erfindung bietet außerdem ein in vitro-Verfahren zum Herstellen immunologischer Effektorzellen, die selektiv Zellen erkennen, die eine gestörte zelluläre Peptidprozessierung für die MHC-Präsentation aufweisen, umfassend den Schritt des Stimulierens isolierter immunologischer Effektorzellen in vitro mit Zellen, die gemäß der oben erwähnten Methode hergestellt wurden.
Die folgende Beobachtung zeigt, dass insbesondere MHC Klasse I-abhängige Antigene oder Epitope, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, insbesondere Antigene, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, für die Immunisierung gegen Krebs oder als Virusimpfstoff verwendet werden können.
Eine der Schlüsselbeobachtungen, die dieser Anmeldung zugrunde liegt, liegt darin, dass T-Zellen gegen Antigene, die mit einer gestörten TAP- Funktion assoziiert sind, aktiviert werden können. Kürzlich ist eine TAP- defiziente Tumorzelle der Maus (RMA-S) hergestellt worden. Diese Zelllinie ist nicht in der Lage, Antworten von cytotoxischen T-Lymphozyten zu aktivieren (Beispiel 1, Fig. 1A und B). Nach einer Transfektion mit dem stimulatorischen Molekül B7-1 konnte die TAP-defiziente Tumorzelllinie (RMA- S.B7-1) T-Zellen hochgradig aktivieren. Die T-Zellen erkennen eine Struktur, die TAP-unabhängig ist, und deswegen konnten TAP-defiziente Tumorzellen in großem Maß (80% in vitro) umgebracht werden. Der Erfinder hat herausgefunden, dass TAP-defiziente nicht transformierte normale sowie Tumorzellen in der Lage waren, eine kräftige CTL-Antwort zu induzieren, die gegen MHC Klasse I-abhängige Epitope gerichtet ist, die bevorzugt von TAP-defizienten Zellen exprimiert werden. B6-Mäuse, die mit bestrahlten B7-1 transfizierten TAP-defizienten Tumorzellen immunisiert wurden, wurden vor dem Proliferieren durch eine folgende Transplantation TAP-defizienter Tumorzellen geschützt, was beweist, dass diese neuen Epitope, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, in vivo als Tumorabstoßungsantigene dienen können.
Auch eine humane TAP-defiziente Tumorzelllinie wird durch T-Zellen, die durch TAP-defiziente Zellen hervorgerufen werden, umgebracht.
Überraschenderweise werden einige TAP exprimierende murine Tumorzelllinien ebenfalls durch CD8&spplus;-Zellen umgebracht, die von TAP-defizienten Zellen hervorgerufen wurden (5/5 getestet, 4 Lymphome und 1 Mastocytom), während nicht transformierte TAP exprimierende Zellen (proliferierende T-Zellen, sogenannte Con A-Blasten), die von der gleichen Maus getestet wurden, nicht umgebracht wurden. Es wurde gezeigt, dass die CTL-Epitope, die unabhängig von der TAP-Funktion sind auf Tumoren erkannten, die eine TAP- Expression aufweisen, d. h. die Tumoren haben eine relative aber nicht vollständige Störung der TAP-Funktion.
Der Erfinder zeigt, dass Antigene, die mit einer gestörten TAP-Funktion einhergehen, ein geteiltes Tumorantigen sein können, das auf einigen Tumorzelltypen gefunden wird und daher für eine Tumorimmuntherapie verwendet werden kann.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Substanzen, die das zelluläre Prozessieren von Peptiden für die MHC-Präsentation stö¬ ren, wie beispielsweise Inhibitoren des TAP oder des Proteasesoms, zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels oder einer Vakzine, die das Krebswachstum oder eine Virusinfektion durch Stimulieren immunologischer Effektoren, insbesondere von CD8&spplus;-Zellen, bevorzugt cytotoxischer Zellen stoppen oder verhindern kann, die insbesondere gegen MHC Klasse I-abhängige Antigene oder Epitope gerichtet sind, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung, insbesondere endogener Antigene assoziiert sind.
Es kann getestet werden, dass immunologische Effektorzellen expandieren und gegen Krebs oder Viren aktiviert werden, indem bestrahlte Zellen, die Antigene von Krebsen oder Viren exprimieren allein in Gegenwart isolierter Blutfraktionen, beispielsweise einer Lymphozytenfraktion, kultiviert werden kann und durch Testen der Effektoren hinsichtlich der Erkennung der Zielzellen, die das Antigen exprimieren, zum Beispiel wie in (11) gemacht. Dass eine Substanz die Expression insbesondere von MHC Klasse I- abhängigen Antigenen oder Epitopen induziert, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, kann durch die Verwendung von Antikörpern gegen MHC Klasse I-Moleküle bestimmt werden sowie durch das Messen der MHC Klasse I-Herunterregulierung, oder durch den Nachweis von Effektorzellen, die gegen die Antigene gerichtet sind. Die MHC Klasse I- Komplexe sind bevorzugt die menschlichen Komplexe HLA A, B oder C. Um die MHC Klasse I-Expression zu messen, können zum Beispiel Antikörper von Phar- Mingen (San Diego, Kalifornien) bezogen werden. Die Herunterregulierung der TAP-Funktion kann ebenfalls durch Peptidtransporterassays, z. B. wie in (33) gemessen werden, und die Expression des TAP-Proteins kann mit Antikörpern gemessen werden, die gegen TAP-Moleküle gerichtet sind. Die Messung der Antikörperbindung erfolgt mittels Standardtechniken, z. B. durch Durchflusscytometrie mit einem FACScan-Analysegerät (Becton Dickinson).
Die erfindungsgemäß verwendeten Substanzen können alle Substanzen sein, die die Funktion oder Expression von Komponenten inhibieren, die an der Peptidprozessierung der Zelle teilnehmen oder die ein aktives Subfragment solch einer Substanz inhibieren. Noch genauer betrifft die Erfindung die Verwendung solcher Substanzen beim Auslösen von Immunantworten.
Beispiele für Komponenten, die an der Peptidprozessierung einer Zelle teilnehmen, sind beispielsweise Komponenten, die an der Translokalisierung von Peptiden durch die ER-Membran teilhaben, wie beispielsweise TAP. Auch Substanzen, die am cytosolischen Prozessieren endogener Proteine teilnehmen, wie beispielsweise das Proteasom, sind eingeschlossen.
Die Substanz kann eine Substanz sein, die die Funktion des TAP inhibiert, wie beispielsweise einige virale Proteine, z. B. TAP-Inhibitoren, z. B. ICP47 vom HSV-Typ 1, IE 12 vom HSV-Typ 2. TAP-Inhibitoren können gemäß WO 95/15384 hergestellt werden.
Die Substanz kann auch eine sein, die die Funktion des Proteasoms inhibiert, wie beispielsweise Proteasominhibitoren wie das Peptidaldehyd Z- Leu-Leu-Leu-H (Peptide Internationals Inc., Lousville, KY) oder Lactacystin (Calbiochem, La Jolla, Kalifornien).
Außerdem kann diese Substanz ein Gen sein, das einen Inhibitor einer Substanz codiert, der an der Peptidprozessierung der Zelle teilhat, z. B. ein Inhibitor des TAP oder Proteasoms.
Die Substanz kann auch eine sein, die die Expression einer Substanz blockiert, die an der Peptidprozessierung der Zelle teilnimmt, z. B. TAP oder das Proteasom, beispielsweise eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu mindestens einem Teil der RNA oder DNA-Sequenzen ist, die die Substanz codieren, die an der Peptidprozessierung der Zelle teilnehmen, z. B. Antisense-Oligonukleotide oder Ribozyme, die RNA zerstören.
Antisense-Polynukleotidsequenzen oder Analoga davon können verwendet werden, um die Expression von Proteinen in vivo oder in vitro zu verhindern. Wenn man eine zu einer Zelle eine große Anzahl an Strängen einer Nukleotidsequenz gibt, die komplementär zur transkribierten Messenger RNA, um ein bestimmtes Protein zu produzieren, hybridisieren diese "Antisense"- Stränge mit der RNA und beschränken oder verhindern deren Translation. Dieses Verfahren könnte verwendet werden, um die Expression beispielsweise des TAP und/oder des Proteasoms zu begrenzen oder zu verhindern. Auch Antisense-Oligonukleotide, die mit der DNA hybridisieren, können verwendet werden (20, 21). Dadurch ist es möglich, Zellen mit Antisense-TAP (22) zu behandeln. Antisense-RNA, die mit mRNA hybridisiert, kann entweder durch die Zugabe von RNA zu Zellen oder das Einschleusen einer Gensequenz, die Antisense-RNA transkribiert, zur Verfügung gestellt werden (23). Ribozyme, die enzymatische Prozesse mit der Spezifität von Antisense-Basenpaarungen verbinden, können ebenfalls verwendet werden (24). Diese Techniken werden in (25) diskutiert.
Ein Zweck, der durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird, liegt darin Zellen in einem Patienten zu stimulieren, der an Krebs oder an bestimmten Viren leidet, um insbesondere MHC Klasse I-abhängige Antigene oder Epitope zu exprimieren, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert, sind. Das Virus kann ein die Peptidprozessierung, z. B. die TAP-Funktion, störendes sein, wie beispielsweise Herpes Simplex. Das kann in vitro wie in vivo gemacht werden.
Wenn es in vivo durchgeführt wird, werden dem Patienten Substanzen gegeben, die das zelluläre Peptidprozessieren stören. Das heißt, Zusammensetzungen, die solch eine Substanz enthalten, z. B. Inhibitoren von TAP oder dem Proteasom können verabreicht werden. Der Patient kann beispielsweise mit einem Ribozym, Antisense-RNA, Antisense-DNA und/oder Antisense-Oligonukleotiden gegen die Expression einer Substanz geimpft werden, die am zellulären Peptidprozessieren teilnimmt, oder einem Gen, das einen Inhibitor einer solchen Substanz codiert, das heißt einem Gen, welches eine Substanz codiert, das die zelluläre Peptidprozessierung stört.
DNA kann direkt in die Zellen eines lebenden Wirts durch sogenannte DNA-Immunisierung eingebracht werden. Dieses schließt verschiedene Techniken ein, z. B. intramuskuläre Injektion, intradermale Injektion (Partikelbomardierung, wo Zellen in die Epidermis mit DNA-beschichteten Goldkügelchen transfiziert werden) oder durch zahlreiche Vektoren, beispielsweise rekombinante Shigellen übertragen werden. Zahlreiche andere Techniken wurden in verschiedenen Laboratorien entwickelt. Auch RNA und Oligonukleotide können auf diese Weise verabreicht werden (26, 27).
Ein weiteres Ziel der Erfindung sind Zellen, die so behandelt worden sind, dass sie insbesondere MHC Klasse I-abhängige Antigene oder Epitope exprimieren, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, um zur Herstellung eines Pharmazeutikums oder einer Vakzine gegen Krebs oder Virusinfektionen verwendet zu werden.
Diese Zellen können Nicht-Säugerzellen mit einer gestörten Peptidprozessierung sein, z. B. Zellen, denen TAP und/oder Proteasomfunktion fehlt, und in die humane MHC Klasse I-Moleküle transfiziert worden sind, z. B. Insektenzellen (28).
Die Erfindung betrifft bevorzugt Säugerzellen, insbesondere autologe Säugerzellen, die so behandelt worden sind, dass sie insbesondere MHC Klasse I-abhängige Antigene oder Epitope exprimieren, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind.
Diese Zellen können aus hämatopoetischen Zellen, insbesondere dendritischen Zellen ausgewählt werden. Autologe Zellen sind besonders bevorzugt.
Wenn Krebs zu behandeln ist, können die Zellen auch autologe Zellen, insbesondere gesunde Zellen aus dem betroffenen Gewebe/Organ sein.
Diese. Zellen, die MHC Klasse I-abhängige Antigene assoziiert mit einer gestörten Peptidprozessierung exprimieren, werden dann in einen Patienten injiziert, um T-Zellen dazu anzuregen, mit diesen Antigenen zu reagieren.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein in vitro Verfahren zur Induktion insbesondere von MHC Klasse I-abhängiger Antigene oder Epitope, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, in Säugerzellen, dadurch gekennzeichnet, dass:
a) die Zellen mit Mitteln behandelt werden, die Substanzen inhibieren, die am zellulären Peptidprozessieren in Säugerzellen teilnehmen, z. B. TAP- inhibierende oder Proteasom-inhibierende Mittel oder
b) eine Sequenz, die für solche inhibierenden Mittel codiert, wird in die DNA der Zelle eingeführt oder
c) eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu mindestens einem Teil der mRNA- oder DNA-Sequenzen ist, die eine Substanz codieren, die an der zellulären Peptidprozessierung in Säugerzellen teilhat, z. B. TAP oder das Proteasom, wird in die DNA der Zelle eingeschleust, oder
d) die Zellen werden mit einem geeigneten Ribozym behandelt und
e) wenn andere als Säugerzellen verwendet werden, erfolgt eine Transfektion mit humanen MHC Klasse I-Molekülen und
f) die Zellen können mit einer geeigneten Dosis bestrahlt werden, beispielsweise mit γ-Strahlung beispielsweise durch Cs¹³&sup7;.
Die Schritte e) und f) stellen Teile von Standardvakzinierungstechniken dar, insbesondere mit lebenden Zellen; sie sind nicht Teil der Erfindung, können aber in das Vakzinierungsverfahren eingeschlossen werden.
Um Zielzellen dazu zu bringen, fremdes Genprodukt zu exprimieren, muss die DNA in die Zielzellen eingeschleust werden. Plasmid-DNA kann durch Transfektion, z. B. durch Elektroporation, Lipofektion, Calciumpräzipitierung oder Partikelresolution in die Zielzellen eingeschleust werden. Es können Trägerstoffe, wie beispielsweise Liposomen, benötigt werden, z. B. DOTAP (Boehringer Mannheim).
Eine weitere Möglichkeit, die fremde DNA in vitro in die Zielzellen einzuschleusen, ist die Verwendung von Retroviren, in denen die DNA in ein Protein eingehüllt ist. Im Fall von Retroviren wird die DNA stabil ins Genom proliferierender Zellen eingeschleust (29)
Säugerzellen können in einem Medium kultiviert werden, das für eukaryotische Zellen geeignet ist, z. B. in RPMI 1640, das Rinderserumalbumin enthält.
Dendritische Zellen können z. B. durch immunomagnetisches Aussortieren mit Molekülen wie beispielsweise CD34 oder CD14 aus dem peripheren Blut aussortiert werden,. Magnetkügelchen können von Dynal bezogen werden. Sie werden in einem geeigneten Medium mit den geeigneten Zusatzstoffen und verschiedenen Adjuvantien, um die Entwicklung und Immunogenizität zu verbessern, gezüchtet, z. B. in IMDM (Life Technologies, Inc., Grand Island, NY) (30). Beispiele für Adjuvantien sind Cytokine wie beispielsweise Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF), IL-4, Tumornekrosefaktor-alpha (TNF-Alpha), Stammzellfaktor (SCF) oder Transforming Growth Factor-Beta (TGF-Beta), Antikörper gegen MHC Klasse II oder CD40 (welche die B7 Expression erhöhen) oder Gene für costimulatorische Moleküle.
Zellen, die so behandelt worden sind, dass sie insbesondere MHC Klasse I abhängige Antigene oder Epitope exprimieren, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, z. B. mit TAP- oder Proteasominhibitoren, können für die Aktivierung von T-Zellen gegen MHC Klasse I- abhängige Antigene, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, in vivo oder in vitro verwendet werden.
Die Stimulierung von T-Zellen mit dendritischen Zellen in vitro wird nach gewöhnlichen Standardverfahren durchgeführt, z. B. werden T-Zellen aus dem peripheren Blut aussortiert und in Gegenwart von dendritischen Zellen in einem geeigneten Medium und geeigneten Additiva, z. B. MEM-Medien und IL- 2 (30, 31) kultiviert.
Nach einem Aspekt der Erfindung werden lymphoide Zellen, wie beispielsweise T-Zellen, z. B. CTL, bevorzugt CD8&spplus;-T-Lymphozyten, die insbesondere gegen MHC Klasse I-abhängig Antigene oder Epitope aktiviert wurden, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, zum Herstellen eines Pharmazeutikums oder einer Vakzine gegen Krebs oder eine Virusinfektion verwendet.
Optimale Bedingungen für humane T-Zellen und dendritische Zellen sind z. B. wie in (30, 31). T-Zell-Aktivierung kann durch die Behandlung der Zellen mit Cytokinen, z. B. GM-CSF oder Antikörpern gegen beispielsweise CD40 oder MHC Klasse II erhöht werden, welche die B7-Expression erhöhen. Cytokine und Antikörper können von ImmunoKontakt, Schweiz, bezogen werden.
Diese Zellen können beispielsweise mit T-Zell-Klonen getestet werden, die gegen TAP-inhibierte Zellen gerichtet sind. Die Inhibierung der TAP- Funktion kann durch Peptidtransporterassays gemessen werden, wie z. B. in (32-34).
Die Erfindung betrifft ebenfalls einen Kit zur Verwendung in einem Verfahren zur Induzierung insbesondere von MHC Klasse I-abhängigen Antigenen oder Epitopen, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind in Zellen, dadurch gekennzeichnet, dass es eine wirksame Dosis einer Substanz umfasst, die die Bildung insbesondere von MHC Klasse I-abhängigen Antigenen oder Epitopen stimuliert, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, beispielsweise einem Inhibitor des TAP oder des Proteasoms oder eine Nukleotidsequenz, die mindestens teilweise komplementär zu mRNA- oder DNA-Sequenzen ist, die Proteasom oder TAP codieren als erstem Bestandteil, und Cytokine, Gene für Cytokine, stark stimulierende Moleküle, Goldkügelchen und/oder Liposomen als zweiten Bestandteil.
Die Erfindung betrifft ebenfalls eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine Vakzine, die eine pharmazeutisch wirksame Dosis einer Substanz umfasst, die insbesondere MHC Klasse I-abhängige Antigene oder Epitope induziert, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, beispielsweise einen Inhibitor von TAP oder vom Proteasom, oder ein Gen, das einen Proteasom- oder TAP-Inhibitor codiert, oder eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu mindestens einem Teil der mRNA - oder DNA- Sequenzen ist, die das Proteasom oder TÄP codieren, z. B. Antisense-Nukleotide oder ein Ribozym, zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Adjuvans, ausgewählt aus Cytokinen, Genen für Cytokine, stark stimulatorischen Molekülen, Goldkügelchen und/oder Liposomen und gegebenenfalls pharmazeutisch akzeptablen Additiva.
Ohne Gegenstand der Ansprüche zu sein, bietet die vorliegende Erfindung die folgenden Verfahren zur Behandlung, Prävention und Diagnose von Krebs und Virusinfektionen:
a) Zellen, die aus dem Körper eines Menschen entnommen wurden, werden mit Inhibitoren für die zelluläre Peptidprozessierung behandelt, z. B. mit TAP-Inhibitoren, und werden möglicherweise zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Adjuvans in den Körper zurückgegeben, oder
b) Zellen, die insbesondere MHC Klasse I-abhängige Antigene oder Epitope exprimieren, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, werden - möglicherweise mit einem pharmazeutisch akzeptablen Adjuvans - dem Körper verabreicht, oder
c) autologe T-Zellen werden in vitro insbesondere gegen MHC Klasse I- abhängige Antigene oder Epitope stimuliert, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, und werden dem Körper verabreicht, oder
d) Inhibitoren der zellulären Peptidprozessierung für die MHC Klasse I-Präsentation, wie beispielsweise TAP-Inhibitoren zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Adjuvans werden dem Körper verabreicht.
Die Zellen sind bevorzugt autologe Säugerzellen, wie solche, die hier z. B. auf der Seite 10, Zeile 5 bis Seite 10, Zeile 17 [d. engl. Texts, Anmkg. d. Übers.] erwähnt wurden.
Die T-Zellen können mit Zellen stimuliert werden, die behandelt wurden, um insbesondere MHC Klasse I-abhängige Antigene oder Epitope zu exprimieren, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, wie beispielsweise die Zellen, die hier z. B. auf Seite 9, Zeile 25 bis Seite 10, Zeile 17 [d. engl. Texts, Anmkg. d. Übers.] erwähnt sind. Sie können autolog sein.
Die Menge der Zielzellen, stimulierten T-Zellen oder Inhibitoren ist eine pharmazeutisch wirksame Menge, die vom Hausarzt oder Facharzt bestimmt werden kann.
Adjuvantien sind Substanzen, welche die Wirkung von pharmazeutischen Substanzen erhöhen, wie beispielsweise solche, die auf Seite 11, Zeile 27 bis 31 erwähnt wurden [d. engl. Texts, Anmkg. d. Übers.].
Pharmazeutische Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten einen physiologisch akzeptablen Trägerstoff zusammen mit mindestens einer Substanz, die das zelluläre Prozessieren von Peptid wie hier beschrieben stört, darin gelöst oder dispergiert als aktiven Inhaltsstoff.
So wie er hier verwendet wird, bedeutet der Begriff "pharmazeutisch akzeptabel", dass die Materialien zur Verabreichung an oder für einen Menschen ohne die Erzeugung unerwünschter physiologischer Effekte, wie beispielsweise Übelkeit, Schwindel, Magenbeschwerden und ähnliche in der Lage sind. Die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die aktive Inhaltsstoffe darin gelöst oder dispergiert enthält, ist im Fachgebiet gut bekannt. Typischerweise werden solche Zusammensetzungen als sterile Injektionen entweder als flüssige wässrige oder nicht wässrige Lösung oder Suspension hergestellt, jedoch können feste Formen, die für das Lösen geeignet sind, oder Suspensionen in einer Flüssigkeit vor der Verwendung ebenfalls hergestellt werden. Das Präparat kann auch emulgiert sein.
Der aktive Inhaltsstoff kann mit Arzneimittelträgern, die pharmazeutisch akzeptabel und kompatibel mit dem aktiven Inhaltsstoff sind in geeigneten Mengen für die Verwendung in dem therapeutischen hier beschriebenen Verfahren, gemischt werden. Geeignete Exzipienten sind beispielsweise Wasser, Salzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol oder ähnliche sowie Kombinationen davon. Außerdem kann die Zusammensetzung, falls gewünscht, geringe Mengen zusätzlicher Substanzen wie Benetzungs- oder Emulgierungsmittel, pH- Puffermittel und ähnliche enthalten, welche die Wirksamkeit des aktiven Inhaltsstoffs erhöhen.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann pharmazeutisch akzeptable Salze der darin enthaltenen Bestandteile einschließen. Pharmazeutisch akzeptable Salze schließen die Säureadditionssalze, die aus anorganischen Säuren wie beispielsweise Salzsäure oder Phosphorsäure, oder solchen organischen Säuren wie Essigsäure, Tartarsäure, Mandelinsäure gebildet werden; anorganische Basen wie beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium, Calcium oder Eisenhydroxide und solche organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain und ähnliche ein.
Physiologisch tolerierbare Trägerstoffe sind im Fachgebiet gut bekannt. Beispiele für flüssige Trägerstoffe sind sterile wässrige Lösungen, die keine Materialien zusätzlich zu aktiven Inhaltsstoffen und Wasser enthalten oder ein Puffer, wie beispielsweise Natriumphosphat, mit physiologischem pH-Wert, physiologische Salzlösung oder beides, wie beispielsweise Phosphat-gepufferte Salzlösung. Des weiteren können wässrige Trägerstoffe mehr als ein Puffersalz enthalten, wie auch beispielsweise Salze wie Natrium und Kaliumchloride, Dextrose, Propylenglykol, Polyethylenglykol und andere gelösten Stoffe.
Flüssigzusammensetzungen können auch Flüssigphasen zusätzlich zu oder zum Ausschließen von Wasser enthalten. Beispiele solcher zusätzlichen Flüssigphasen sind Glycerin, pflanzliche Öle wie beispielsweise Baumwollsamen- Öl, organische Ester wie Ethyloleat und Wasser-Öl-Emulsionen.
Die folgenden Beobachtungen zeigen Substanzen, die das zelluläre Prozessieren von Peptiden stören, insbesondere MHC Klasse I-abhängige, die als Mittel zur Immunisierung gegen Krebs verwendet werden können.

Zusammenfassung der Beobachtungen:

- CD8&spplus;-T-Zellen können gegen Epitope aktiviert werden, die bevorzugt auf TAP-defizienten Zellen erkannt werden. Dies wird durch die Immunisierung von B6-Mäusen mit syngenen TAP-defizienten Tumorzellen, die mit einem T-Zellen-aktivierenden Molekül transfiziert sind (TAP-defiziente RMA-S- Tumorzellen transfiziert mit dem costimulatorischen Molekül B7-1. Die Zellen werden als RMA-S.B7-1 bezeichnet) und nicht transformierte Milzzellen und dendritische Zellen von TAP1-/-Mäusen (beide Allele des TAP-Gens sind ausgeknocked) und im Testen der hervorgerufenen CTL auf verschiedenen TAP- defizienten und TAP exprimierenden Zielzellen (Beispiele 1-3).
- Die Erkennung von Epitopen ist abhängig von der MHC Klasse I-Expression. Dies wird durch das Testen der generierten CTLs an Zellen gezeigt, die verschiedene Kombinationen von MHC Klasse I-Defekten exprimieren (Beispiel 2).
- Die Epitope werden auf TAP-defizienten murinen Tumorzellen und murinen TAP-defizienten nicht transformierten Zellen wie auch auf einer TAP-defizienten humanen Tumorzelllinie erkannt (Beispiele 2-3).
- Überraschenderweise induzieren syngene TAP-defiziente Zellen sowohl RMA-S.B7-1-Tumorzellen wie auch Milzzellen und dendritische Zellen von TAP1-/-Mäusen, T-Zellen, die verschiedene unterschiedliche syngene TAP- exprimierende murine Tumorzellen erkennen, während syngene TAP-exprimierende nicht transformierte Zellen nicht umgebracht werden (Beispiele 6-8).
- Die Epitope, die auf TAP-exrimierenden Tumorzellen erkannt werden, sind Epitope, die von der TAP-Funktion unabhängig sind (Beispiel 6).
- Die Immunisierung mit syngenen TAP-defizienten Zellen kann gegen das Tumorwachstum in vivo, sowohl bei TAP-defizienten und TAP exprimierenden Tumorzellen schützen (Beispiele 5, 9)
Als Schlussfolgerung zeigt der Erfinder, dass die Antigene, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, ein geteiltes Tumorantigen sein kann, das auf verschiedenen Tumorzelltypen lokalisiert ist und daher für die Tumorimmuntherapie verwendet werden kann.
In den Experimenten werden B6-Mäuse mit syngenen TAP-defizienten Zellen immunisiert, z. B. Zellen von TAP1-/- Mäusen, in denen das TAP1-Gen durch genetische Manipulation deletiert worden ist. In einem lebenden Menschen ist das noch nicht möglich. Zellen, die mit Antisense-Oligonukleotiden gegen TAP behandelt worden sind, haben jedoch den gleichen zellulären Phenotyp wie Zellen, deren TAP-Funktion durch strukturelle genetische Veränderung ausgelöscht wurde wie in der Mutantenzelllinie RMA-S oder in Zellen von Mäusen, in denen TAP durch genetische Manipulation deletiert worden ist (TAP-Knockout-Mäuse) (22). Dieser Phänotyp wird z. B. durch eine erniedrigte Zelloberflächenexpression von MHC Klasse I-Molekülen gekennzeichnet, die durch die Inkubation bei 26ºC heraufreguliert werden können, und auch durch gesteigerte stimulatorische Fähigkeit gegenüber extern zugegebenen Antigenen. Der Hauptunterschied zwischen der Erfindung und diesen Studien ist, dass die Erfinder herausgefunden haben, dass die TAP-Inhibierung neue endogene MHC Klasse I-abhängige Antigene für CD8&spplus;-T-Zell-Erkennung hinzufügt. Es wird weiter gezeigt, dass diese auf einer Vielzahl verschiedener Tumorzellen erkannt werden. Da die humane Zelllinie T2Kb durch die hervorgerufenen CTL erkannt wird, können die Epitope, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, auch auf menschlichen Zellen erkannt werden. Im Menschen können autologe oder MHC-passende Zellen mit TAP-Inhibitoren verschiedener Art behandelt werden; diese Zellen können dazu verwendet werden, CTL insbesondere gegen MHC Klasse I-abhängige Antigene oder Epitope, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, hervorzurufen. Nach den präsentierten Daten können diese CTL sowohl in der Immuntherapie TAP-defizienter und TAP-exprimierender Tumoren verwendet werden. Aus der Literatur ist auch bekannt, dass einige Viren die Antigenpräsentation inhibieren können und dadurch der konventionellen CTL-Erkennung entkommen. Beispielsweise inhibiert Herpes Simplex die TAP-Funktion (33, 34). Deswegen können CTL, die durch TAP-inhibierte Zellen hervorgerufen werden, auch als therapeutisches Mittel bei viralen Infektionen verwendet werden, in denen TAP-Funktion wie oben beschrieben, inhibiert ist. Die Präsentation von MHC Klasse I-Molekülen und TAP-abhängigen Peptiden auf der Zelloberfläche ist ein komplexer Prozess, der von vielen Faktoren abhängt, von denen die Translokation von Peptiden durch die ER-Membran mittels TAP- Molekülen einer ist. Ein weiterer notwendiger Schritt ist die cytosolische Prozessierung endogener Proteine durch das Proteasom. Zellen, denen Bestandteile des Proteasoms fehlen, haben einen ähnlichen Phänotyp wie TAP- defiziente Zellen, d. h. eine defiziente Erzeugung antigener Peptide. Proteasominhibitoren blockieren die MHC Klasse L-restringierte Antigenpräsentation und den Zusammenbau von MHC Klasse I-Molekülen, wobei der Zusammenbau durch exogen hinzugefügte Peptide rekonstituiert werden kann (1, 35- 37). Es ist möglich, dass Epitope, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, nach der Inhibierung des Proteasoms exponiert werden, und mit einem allgemeineren Begriff als MHC Klasse I-abhängige Epitope, die mit einer gestörten zellulären Peptidprozessierung assoziiert sind, bezeichnet werden können. Deswegen betrifft die Erfindung auch die Erzeugung von T- Zellen mittels Proteasominhibitoren. Es ist auch leicht, sich vorzustellen, dass andere bis jetzt nicht definierte Faktoren zur Bildung des MHC/TAP-abhängigen Peptidkomplexes notwendig sind, und dass die Inhibierung solcher Faktoren zu einem ähnlichen Phänotyp führen, bei dem Epitope, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, exponiert werden.
Diese zugrundeliegende Entdeckung offenbart das Vorhandensein von MHC Klasse I-abhängigen CTL-Epitopen, die bevorzugt in Abwesenheit eines funktionellen TAP-Komplexes erkannt werden. B6-Mäuse, die mit B7-1-transfizierten TAP-defizienten RMA-S-Tumorzellen oder Milzzellen von TAP1-/- Mäusen immunisiert wurden, erzeugten sowohl gegen RMA-S-Tumorzellen und TAP1-/-Con A-Blastenzielzellen eine kräftige CTL-Antwort. Im Gegensatz dazu waren TAP- exprimierende RMA-S.TAP2-Tumorzellen und B6-Con A-Blasten überwiegend resistent gegenüber der Lyse durch diese CTL. RMA-S.B7-1-immunisierte Mäuse wurden vor dem Auswachsen von RMA-S-Tumortransplantaten geschützt, was darauf hinweist, dass diese Epitope, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, in vivo als Tumorabstoßungsantigene dienen können. Überraschenderweise waren einige TAP exprimierende Tumoren ebenfalls empfindlich gegenüber dem erzeugten CTL, während nicht transformierte Zellen resistent waren. Es wurde gezeigt, dass die CTL Epitope erkannten, die unabhängig von der TAP-Funktion auf Tumoren sind, die noch eine TAP-Expression haben, d. h., sie können eine relative, aber nicht vollständige Störung der TAP- Funktion haben. Der Empfindlichkeitsunterschied zwischen RMA und RMA- S.TAP2, die beide TAP exprimieren, ist wahrscheinlich darauf zurück zu führen, dass RMA-S.TAP2 eine Transfektante mit TAP ist und - verglichen mit den Niveaus im ursprünglichen Tumor-RMA - dadurch TAP überexprimieren kann,
In den Experimenten, die beschrieben werden, sind Mäuse mit syngenen TAP-defizienten Zellen immunisiert worden. Ein menschliches Korrelat ist das Erzeugen von CTLs mit TAP-defizienten Zellen, z. B. autologen Zellen, in die TAP-Inhibitoren eingeführt worden sind. Nach den dargestellten Daten können diese CTL sowohl bei der Immuntherapie TAP-defizienter und TAP- exprimierender Tumoren verwendet werden. Diese CTL können ebenfalls als therapeutisches Mittel bei viralen Infektionen verwendet werden, in denen die TAP-Funktion inhibiert ist (33, 34). Diese Studie wird mit verschiedenen unterschiedlichen Tumorzellen lymphoiden Ursprungs durchgeführt. Auch eine nicht-lymphoide Zelllinie, die H-2Kb-transfizierte Mastocytoma P815 wird durch die erzeugten CTL umgebracht.
Die erfindungsgemäßen Mittel können gegen Tumoren, bevorzugt solche, die die TAP-Expression verloren haben, aber auch gegen TAP exprimierende Tumoren verwendet werden. Die Mittel können ebenfalls gegen bestimmte Virusinfektionen verwendet werden, in denen die TAP-Funktion durch virale Proteine inhibiert ist, z. B. in Herpes Simplex-Virus infizierten Zellen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen:

Figurenlegenden

Fig. 1. Immunisierung von B6-Mäusen mit RMA-S.B7-1-Zellen erzeugt CD8&spplus;-CTL, die nicht transfizierte RMA-S-Zellen erkennen. (A und B) B6-Mäuse wurden in vivo immunisiert und Splenozyten wurden in vitro mit RMA-S-Tumorzellen (O) oder mit B7-1 transfizierten RMA-S-Zellen ( ) restimuliert und auf ihre Cytotoxizität gegenüber RMA-S-Zielzellen untersucht. Zwei Experimente werden gezeigt, Panel A ist repräsentativ für 4/6-Experimente, Panel B ist repräsentativ für die übrigen Experimente. (C) CTLs, die wie oben erzeugt wurden, wurden mit Anti-CD8-Antikörpern und Komplement ( ) oder mit Anti-CD4-Antikörpern und Komplement (Δ)depletiert und hinsichtlich der Cytotoxizität gegenüber RMA-S-Zielzellen getestet. Ein repräsentatives Experiment von dreien wird gezeigt.
Fig. 2. Die Erkennung von Epitopen durch RMA-S.B7-1-erzeugte CTL benötigt die Abwesenheit der TAP-Funktion und das Vorhandensein von MHC Klasse I-Molekülen bei der Zielzelle. B6-Mäuse wurden in vivo immunisiert und Splenozyten wurden in vitro mit RMA-S.B7-1-Zellen restimuliert und hinsichtlich der Cytotoxizität gegen (A) RMA-S (O) und RMA-S.TAP-2 ( ), (B) Con A-Blasten von B6 ( ), TAP1-/-( ), β&sub2;m-/- (Δ) und TAP1/β&sub2;m-/-Mäusen ( ) und (C) T2 ( ) und T2Kb ( ) -Zellen getestet. Ein repräsentatives Experiment von dreien wird gezeigt.
Fig. 3. Immunisierung mit TAP1-/-Splenozyten ruft CTLs hervor, die TAP1-/-Con A-Blasten und RMAs-Tumorzellen erkennen. B6-Mäuse wurden in vivo immunisiert und die Splenozyten wurden in vitro mit Splenozyten von TAP1-/- Mäusen restimuliert und hinsichtlich der Cytotoxizität gegen RMA-S(O), B6 Con A-Blasten ( ) und TAP1-/-Con A-Blasten ( ) getestet. Ein repräsentatives Experiment von vieren wird gezeigt.
Fig. 4. Immunisierung von B6-Mäusen mit RMA-S.B7-1-Zellen schützt vom Auswachsen RMA-S-Tumorzellen. B6-Mäusen wurden nach einer Immunisierung mit PBS (), RMA-S (O) oder RMA-S.B7-1 ( )10&sup6; RMA-S-Tumorzellen verabreicht. Die Figur stellt die zusammengefassten Daten von vier Einzelexperimenten dar (drei für RMA-S.B7-1) mit 4-6 Mäusen/Immunisierungsgruppe in jedem Experiment.
Fig. 5. Der TAP exprimierende Tumor RMA exprimiert Epitope, die unabhängig von der TAP-Funktion sind. B6-Mäuse wurden in vivo immunisiert und Splenozyten wurden in vitro mit RMA-S.B7-1-Tumorzellen restimuliert und hinsichtlich der Cytotoxizität gegen (A)RMA-S ( ), RMA(), RMA-S.TAP2 (O) oder B6 Con-A-Blasten (Δ), (B) RMA getestet, zu denen kalte B6 Con-A- Blasten ( ) oder TAP1-/-Con-A-Blasten () in den angezeigten Verhältnissen hinzugegeben wurden.
Fig. 6. Einige TAP exprimierende Tumorzelllinien werden durch CTL umgebracht, die durch RMA-S-B7-1 erzeugt werden, während nicht transformierte TAP exprimierende Zellen resistent sind. B6-Mäuse wurden in vivo immunisiert und Splenozyten wurden in vitro mit RMA-S.B7-1-Tumorzellen restimuliert und hinsichtlich der Cytotoxizität gegen RMA-S( ), EL-4(), ALC (O), C4425-(Δ), P815 ( ), B6 Con-A-Blasten ( ) und TAP1-/-Con-A-Blasten ( ) Ein repräsentatives Experiment aus dreien wird gezeigt.
Fig. 7. Immunisierung mit TAP1-/-dendritischen Zellen ruft CTLs hervor, die verschiedene TAP exprimierende Tumorzellen erkennen. B6-Mäuse wurden in vivo mit dendritischen Zellen von TAP1-/-Mäusen immunisiert und die Splenozyten wurden in vitro mit Splenozyten von TAP1-/-Mäusen restimuliert und hinsichtlich der Cytotoxizität gegen RMA-S ( ), EL-4 (), ALC (O), RMA (Δ), P815Kb ( ), 26E1Nmyc ( ) und B6 Con-A-Blasten ( ) getestet. Ein Experiment von zweien wird gezeigt.
Fig. 8. Die Immunisierung von B6-Mäusen mit RMA-S.B7-1-Zellen schützt vor Auswachsen von verschiedenen TAP exprimierenden Tumorzellen. B6-Mäuse wurden immunisiert mit PBS () oder RMA-S.B7-1 ( ), oder CD5-/-Mäuse wurden mit PBS (Δ) oder RMA-S.B7-1-Zellen (O) immunisiert und ihnen wurden (A) 10&sup5;-RMA-Tumorzellen verabreicht, (B) 10²-EL-4-Tumorzellen, (C) 10³ ALC- Tumorzellen. Die Figur stellt ein Experiment mit 4-6 Mäusen/Immunisierungsgruppe dar.
Die Erfindung wird nun im Hinblick auf einige nicht limitierende Beispiele beschrieben.
Alle technischen und wissenschaftlichen Termini, die hier verwendet werden, sind so beabsichtigt, dass sie die gleiche Bedeutung haben, wie sie für gewöhnlich durch jemanden mit allgemeinem Fachwissen in diesem Gebiet verstanden werden. Die hier verwendeten Techniken sind solche, die jemandem mit allgemeinen Fachkenntnissen in dem Gebiet bekannt sind, sofern nicht anders angegeben.

Material und Methoden

Mäuse. Alle Mäuse wurden im Microbiology and Tumour Biology Center, Karolinska Institute, gezüchtet und aufbewahrt. Die Erzeugung und Charakterisierung von TAP1-/-, β&sub2;-Microglobulin (β&sub2;m)-/- und TAP1/β&sub2;m-/-Mäusen ist beschrieben worden (38-40). Die in der vorliegenden Studie verwendeten TAP1-/- und β&sub2;m-/-Mäuse sind auf B6 (C57BL/6) mindestens sechsmal rückgekreuzt worden. Die Tierpflege war den Richtlinien des Instituts entsprechend.
Zelllinien. T2K4 ist eine H-2Kb (Maus-MHC-Allel (Typ)) transfizierte Sublinie der TAP1/2-defizienten Mutanten humanen Zelllinie T2 (41). Alle Zelllinien wurden in RPMI 1640-Medium (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gezüchtet, das mit Penizillin-, Streptomycin und 5% FCS (fötales Kälberserum) bei 37ºC und 5% CO&sub2; supplementiert war.
Antikörper. B7-1(RMA-S.B7-1) Expression wurde entweder mit dem CTLA- 4Ig-Fusionsprotein (42), einem Geschenk von Dr. P. Lane, Basel Institute for Immunology, Basel, Schweiz, und einem FITC (Fluoreszinisothiocyanat)- konjugiertem Antihuman-IgG-Antikörper (Dako, Glostrup, Dänemark) oder mit einem biotinylierten Anti-B7-1-monoklonalen Antikörper 16-10A1 (PharMingen, San Diego, CA) und NEUTRALITE avidin-FITC (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL) untersucht.
Kalter Ziel-Kompetitionstest. Für den kalten Ziel-Kompetitionstest wurden kalte (nicht markierte) Con A-Blasten zu verschiedenen Konzentrationen mit einer konstanten Anzahl an Effektorzellen und 5 · 10³ &sup5;¹Cr-markierten Zielzellen inkubiert.
Immunisierung mit aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen. Aus dem Knochenmark stammende dendritische Zellen wurden unter Verwendung des Protokolls von Inabe und Kollegen (43) mit den folgenden Veränderungen aus TAP1-/-Mäusen gewonnen. Knochenmarkszellen wurden in Dulbecco's modified Eagles Medium enthaltend 10% Überstand von der GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor) sezernierenden Zelllinie X63 (ein Ge¬ schenk von Dr. C. Watts, Univ. Dundee, Dundee, UK) und 20% FCS kultiviert. Das Kulturmedium wurde an jedem dritten Tag ersetzt, und die Zellen wurden an jedem siebten Tag neu ausplatiert. Am achten Tag wurden die nicht adhärenten Zellen für die in vivo Immunisierung verwendet. 10&sup5;-Zellen wurden intraperitoneal verabreicht, Splenozyten werden 10 Tage nach der in vivo Immunisierung restimuliert.

Beispiele

A. CD8&spplus;-T-Zellen können gegen MHC-Klasse I-abhängige Epitope, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, erzeugt werden. Die Immunisierung mit TAP-defizienten Zellen kann gegen Tumorwachstum in vivo schützen.

Beispiel 1

RMA-S-Zellen, die mit B7-1 (CD80) transfiziert sind, erzeugen CTL, die nicht transfizierte RMA-S-Zellen erkennen.
B6-Mäuse wurden mit drei wöchentlichen s.c.-Injektionen mit 10&sup7; bestrahlten (100 Gray (Gy)) Tumorzellen immunisiert. Die verwendeten Tumoren wurden seriell als Asciteszellinien in mit 4 Gy-bestrahlten Mäusen passagiert. Die Tumorzellen waren als RMA-S-Zellen bezeichnete TAP-2-defiziente Zellen (vom Rauscher Leukämie-Virusinduzierten Maus-T-Zell-Lymphom RBL-5 von B6-Ursprung stammend (44)); die mit B7-1 transfiziert waren, d. h. 2 · 10&sup6; RMA-S-Zellen wurden mit 10 ul LIPOFECTAMINE (Life Technologies, Gaithersburg, MD) und 1 ug des murinen B7-1-Gens inkubiert, das in pSRIneo- Plasmid kloniert war (45), einem Geschenk von Bristol Meyers Inc., Seattle, an Prof. Klas Kärre. Transfizierte Zeilen wurden auf GENETICIN (Life Technologies, Gaithersburg, MD) in einer Konzenttation von 1 mg/ml selektiert. Die 1% der stärksten positiven Fraktion der B7-1-exprimierenden RMA-S-Zel¬ len wurden mit einem FACS VANTAGE cell sorter (Becton Dickinson, Mountain View, CA) sortiert und als RMA-S.B7-1 bezeichnet.
Diese Transfektion führte zu einer starken und reproduzierbaren Lyse nicht transfizierter RMA-S-Zielen (Fig. 1A und B). Die Lyse konnte durch eine Vorbehandlung der Effektoren mit Anti-CD8-Antikörpern verhindert werden (CD8 ist ein Marker der Zelloberfläche von CTL) und mit Komplement (Fig. 1C). Die Komplement-vermittelte Depletion von Effektorpopulationen wurde wie folgt durchgeführt: 20 · 10&sup6;-Effektorzellen wurden in 200 ug Anti-CD8-Antikörper (ein Gemisch aus 169,4 und 156,7.7 in 1 ml PBS, oder 200 ug von Anti-CD4-Antikörper (YTS191) in 1 ml PBS für 60 Minuten bei 4ºC inkubiert. Alle Antikörper wurden großzügigerweise von Dr. H. Waldman, University of Cambridge, Cambridge, UK, zur Verfügung gestellt. Die Zellen wurden einmal gewaschen und mit Kaninchenkomplement (Pel-Freeze Biologicals, Brown Deer, WI), das 1 : 8 verdünnt war, für 75 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Das zeigt, dass es möglich ist, CTL gegen syngene TAP-defiziente Zellen zu erzeugen. Kontrollzelllinien, YAC-1 (ein Moloney-Virus-induziertes T-Zelllymphom auf A/Sn-Hintergrund) und P815 (ein Methylcholantren-induzierte Mastocytom mit DBA/2-Hintergrund) sowie Concanavalin A(Con A)- Blasten von BALB/c-Mäusen waren resistent gegen die Lyse durch diese CTL (Daten werden nicht gezeigt). Die Erzeugung von Con A-aktivierten T-Zell- Blasten war wie folgt: Milzzellen wurden für 48 Stunden bei 2 · 10&sup6;-Zellen/ml in α-MEM-Medium (Life Technologies, Gaithersburg, MD) inkubiert, das mit Penizillin-Streptomycin, 10% FCS, 10 mM HEPES (Life Technologies, Gaithersburg, MD), 3 · 10&supmin;&sup5; M 2-ME (2-Mercaptoethanol) (Sigma, St. Louis, MO) und 3 ug/ml an Con A (Sigma, St. Louis, MO) supplementiert war. Vor der Verwendung als Ziele in einem 4 Stunden Standard-51Cr-Cytotoxizitätstest wurden tote Zellen durch Zentrifugation auf einem LYMPHOPREP-Gradienten (Nycomed, Oslo, Norwegen) entfernt.
TAP2-defiziente RMA-S-Tumorzellen waren ineffizient beim Hervorrufen von cytotoxischen Antworten in B6-Mäusen (Fig. 1A und B).

Beispiel 2

CTL-Erkennung benötigt das Vorhandensein von MHC-Klasse I-Molekülen und die Abwesenheit von TAP in der Zielzelle.
Eine TAP-2-Transfektante von RMA-S (RMA-S.TAP2-Zellen, die auch als RMA-S II 5.9-Zellen bezeichnet wurden, wurden durch Transfektion von RMA-S mit dem murinen TAP-2-Gen erhalten (46)), war so gut wie resistent gegen die Lyse durch RMA-S.B7-1-erzeugte CTL (Fig. 2 A) wie im Beispiel 1. Das weist darauf hin, dass die Epitope bevorzugt in Zellen erkannt wurden, die frei von einer TAP-Expression waren. Hiermit übereinstimmend waren Con A- Blasten von TAP1-/-Mäusen hochsensitiv gegenüber der Lyse, während Con A- Blasten von B6-Mäusen resistent gegenüber der Lyse waren. Con A-Blasten von TAP1/β&sub2;m-/-(doppelmutante)-Mäuse waren resistent gegen Lyse, was vermuten lässt, dass eine MHC-Klasse I-Abhängigkeit bei der CTL-Erkennung von Epitopen vorliegt (Fig. 2 B).
In der Tat war die humane TAP-defiziente Zelllinie T2, die mit dem H-2Kb transfektiert war, gegenüber der Lyse durch RMA-S.B7-1 erzeugte CTL empfindlich, während nicht transfizierte T2-Zellen resistent waren (Fig. 2 C). Zusammengefasst weisen diese Ergebnisse darauf hin, dass mindestens ein Teil der Antwort, die durch RMA-S.B7-1 generiert wird, MHC-Klasse I-spezifisch oder restringiert ist und gegen Epitope gerichtet ist, die bevorzugt, falls nicht exklusiv, von TAP-defizienten Zellen exprimiert werden. Mindestens einige der Epitope konnten sowohl auf nicht transformierten und transformierten Lymphoiden Zellen erkannt werden sowie auf Zellen humanen wie murinen Ursprungs. Diese Epitope werden als Epitope, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, bezeichnet.

Beispiel 3

TAP1-/- Splenozyten erzeugen CTL, die TAP1-/- Con A-Blasten und RMA-S- Tumorzellen erkennen.
Wie oben gezeigt, bringen CTL, die durch RMA-S.B7-1 hervorgerufen wur¬ den, TAP1-/-Con A-Blasten um. Demnach erzeugte die Immunisierung von B6- Mäusen mit Splenozyten von TAP1-/-Mäusen cytotoxische Zellen, die TAP1-/- Con A-Blasten und RMA-S-Tumorzellen wirksam lysierten, während B6-Con A- Blasten und RMA-S. TAP2 zu auffällig reduzierten Niveaus umgebracht wurden (Fig. 3, Daten nicht gezeigt). Das Umbringen der TAP-defizienten Zellen wurde ebenfalls mit Effektoren von NK (natural killer)-Zellen depletierten Mäusen beobachtet (Daten nicht gezeigt). B6-Mäuse wurden zweimal wöchentlich s.c.-Injektionen von 50 · 10&sup6;-bestrahlten (20 Gy) Milzzellen immunisiert.

Beispiel 4

Erzeugung von primärem CTL durch Epitope, die mit einer gestörten TAP- Funktion assoziiert sind.
Die Stimulierung von B6-Milzzellen mit RMA-S.B7-1 und TAP1-/-Milzzellen in vitro ohne vorherige in vivo-Immunisierung wurde wie folgt durchgeführt: Einzelzellsuspension von Milzen immunisierter und nicht immunisierter Mäuse wurden hergestellt. 20 · 10&sup6;-Effektorzellen wurden mit 2 · 10&sup6; bestrahlten Tumorzellen oder 20 · 10&sup6; bestrahlten Milzzellen inkubiert. Die Kulturen wurden in 10 ml RPMI 1640 Medium, das mit Penizillin-Streptomycin, 10% FKS, 3 · 10&supmin;&sup5; M2-ME, 1 mM Natriumpyruvat, 0,1 mM nicht essentiellen Aminosäuren und 2 mM L-Glutamin supplementiert war bei 37ºC und 5% CO&sub2; für fünf Tage aufbewahrt.
Diese Stimulation führte reproduzierbar zu cytotoxischen Antworten gegen RMA-S- und TAP1-/-Con A-Blasten-Ziele, während RMA-S.TAP2 und B6-Con A- Blasten auffällig weniger empfindlich waren. Der in vitro-Cytotoxizitätstest wurde wie folgt durchgeführt: Zielzellen wurden mit &sup5;¹Cr markiert und in Zellkulturmedium resuspendiert. 5 · 10³ Zellen wurden in jede Kavität gegeben, gefolgt von der Zugabe von Effektorzellen. Die Zellen wurden für 4 Stunden bei 37ºC inkubiert und die Überstände wurden geerntet. Die Radioaktivität wurde in einem Pharmacia-LKB-γ-Counter gemessen, und die spezifische Lyse wurde errechnet [(CPM (counts per minute) freigesetzt mit Effektorzellen - CPM freigesetzt ohne Effektorzellen)/(CPM freigesetzt durch Detergens - CPM freigesetzt ohne Effektorzellen)] · 100. Ergebnisse mit mehr als 20% spontaner Lyse wurden verworfen.
Die Stimulierung mit nicht transfiziertem RMA-S-Zellen in vitro führte in einigen Experimenten zu niedrigeren Niveaus der Lyse (Tabelle I; Daten nicht gezeigt). Das Umbringen von RMA-S und TAP1-/- Con A-Blasten-Zielen wurde durch eine Vorbehandlung von Effektoren mit Anti-CD8-Antikörpern und Komplement verhindert (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 5

Immunisierung von B6-Mäusen mit RMA-S.B7-1 schützt gegen RMA-S-Tumorwachstum.
Um herauszufinden, ob es möglich war, eine protektive Immunantwort gegen eine TAP-defiziente Tumorzelllinie hervorzurufen, immunisierten wir B6- Mäuse mit RMA-S-Zellen, RMA-S.B7-1-Zellen oder PBS (phosphatgepufferte Salzlösung). Nach drei wöchentlichen Immunisierungen wurden die Mäuse mit 106 lebenden RMA-S-Tumorzellen s.c. gefordert, einer Dosis, die - wie kürzlich herausgefunden - die NK-vermittelte Abstoßung von RMA-S überwindet (41). Das Tumorwachstum in vivo war wie folgt: B6-Mäuse wurden immunisiert wie beschrieben. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden den Mäusen 106 lebende Tumorzellen s.c. verabreicht und das Wachstum wurde wöchentlich durch Abtasten verfolgt. Bei jeder Maus wurde das Experiment beendet, wenn der Tumor einen Durchmesser von 20 mm erreichte.
89 Prozent der Mäuse (17/19 Mäuse), die mit PBS immunisiert waren, entwickelten innerhalb von drei Wochen nach der Forderung progressiv wachsende Tumoren. Im Gegensatz dazu entwickelten nur acht Prozent (1/13) der Mäuse Tumoren, die mit RMA-S.B7-1 immunisiert wurden. Mäuse, die mit RMA-S immunisiert wurden, wurden teilweise geschützt: 55% der Mäuse (10/18 Mäuse) entwickelte progressiv wachsende Tumoren (Fig. 4).
Die RMA-S-B7-1-vermittelte Protektion gegen Tumorwachstum wurde auch in NK 1.1-depletierten Mäusen beobachtet (Daten nicht gezeigt).
B. Epitope, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind, sind ein geteiltes Tumorantigen, das auf mehreren TAP exprimierenden Tumoren, aber nicht auf nicht transformierten Zellen gefunden wird. Die Immunisierung mit einer TAP-defizienten Zelle schützt in vivo gegen Tumorwachstum von TAP exprimierenden Tumorzellen.

Beispiel 6

Die TAP exprimierende Tumorzelle RMA wird durch CTL erkannt, die gegen Epitope gerichtet sind, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind.
Überraschenderweise brachten CTL, die durch RMA-S.B7-1 generiert wurden, reproduzierbar die TAP exprimierenden parentalen Tumorzellen von RMA- S, RMA, um. Die Lyse-Niveaus waren markant höher als bei der TAP-transfizierten Tumorzelllinie RMA-S.TAP2, aber noch unter den Niveaus der Lyse der TAP-defizienten Zelle RMA-S (Fig. 5A). Wie oben beschrieben wurde, wurde kein Umbringen von TAP exprimierenden B6-Con A-Blasten beobachtet. In kalten Ziel-Inhibitionsexperimenten mit Con A-Blasten von B6 und TAP-/-Mäusen waren die letztgenannten effizienter beim Inhibieren der Lyse von RMA durch CTL, die durch RMA-S.B7-1 hervorgerufen worden waren (Fig. 5B), was zeigt, dass mindestens ein Teil des Umbringens der RMA durch diese CTL von der Erkennung von Epitopen abhängt, die unabhängig von TAP-Funktion waren. Kontrollexperimente, in denen heiße und kalte Ziele ohne Effektoren inkubiert wurden, führten durch kein kaltes Ziel zu keiner Lyse (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 7

Einige TAP exprimierende Tumorzelllinien werden durch CTL umgebracht, die durch RMA-S.B7-1 hervorgerufen wurden, während nicht transformierte TAP exprimierende Zellen resistent sind.
Eine mögliche Erklärung des beobachteten Umbringens von RMA liegt darin, dass einige Tumorzellen ein relatives Defizit der TAP-Funktion haben können, d. h. sie exprimieren suboptimale Niveaus der TAP-Proteine. Um zu untersuchen, ob Epitope, die mit gestörter TAP-Funktion assoziiert sind, ein geteiltes Antigen seien, haben wir andere H-2b-exprimierende Tumorzelllinien mit verschiedenen Mitteln transformiert für das Umbringen durch RMA- S.B7-1 hervorgerufene CTL. In der Tat wurden alle getesteten Tumorzellen, die karzinogen induzierte (9,10-Dimethyl-1,2-benzanthracen)-EL-4 (American Type Culture Condition, Rockville, MD), die Radiation Leukaemia virusinduzierte ALC (großzügigerweise zur Verfügung gestellt von Dr. Wen Tao, Karolinska Institute, Schweden) und 26E-1Nmyc-Tumorzellen (ein Geschenk von Dr. Santiago Silva, Karolinska Institut, Schweden) durch RMA-S.B7-1 hervorgerufene CTL umgebracht. 26E1Nmyc ist ein spontanes Lymphom von Mäusen, die für transgen EBNA-1 und N-myc sind (aus dem Kreuzen von EBNA-1 und N-myctransgenen Mäusen stammend (47, 48)). Eine β&sub2;m-negative Variante von EL-4, wie auch P815-Tumorzellen (ein Mastocytom vom H-2d-Ursprung, das von der American Type Culture Condition, Rockville, MD) erhalten wurde) wurden durch RMA-S.B7-1 erzeugte CTL nicht umgebracht (Fig. 6). Von diesen oben beschriebenen Zellen wurden nur H-2d-positive P815 und 26E-1Nmyc-Zellen durch B6-CTL, die durch Balb/c-Splenozyten hervorgerufen wurden, umgebracht (Daten nicht gezeigt), was zeigt, dass die Tumorzellen nicht generell für alle CTL, die getestet wurden, empfindlich waren.

Beispiel 8

TAP-defiziente nicht transformierte Zellen rufen CTLs hervor, die verschiedene TAP exprimierende Tumorzelllinien erkennen, aber nicht TAP-exprimierende nicht transformierte Zellen.
CTL von B6-Mäusen, die mit Splenozyten oder mit kultivierten dendritischen Zellen von TAP1-/-Mäusen immunisiert wurden brachten RMA, ALC, 26E-1Nmyc, EL-4 (im geringen Maße), P815-Zellen, die mit H-2Kb transfiziert waren und TAP1-/- Con A-Blasten ebenfalls um. B6-Con A-Blasten wurden nicht durch diese CTL umgebracht (Fig. 7). Das verstärkt die Annahme, dass TAP- exprimierende Tumorzellen, jedoch nicht untransformierte Zellen Epitope exprimieren, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind. Die Lyse-Niveaus waren niedriger als die, die mit RMA-S.B7-1 beobachtet wurden, was wahrscheinlich auf die hohen Niveaus der B7-Expression auf RMA-S.B7-1 zurückzuführen ist.

Beispiel 9

Immunisierung mit RMA-S.B7-1 schützt vom Tumorauswachsen einiger TAP- exprimierender Tumoren.
B6-Mäuse wurden mit RMA-S.B7-1 immunisiert oder wurden nicht immunisiert. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden den Mäusen 10&sup5;-RMA- Tumorzellen oder 102-EL-4-Tumorzellen oder 10³-ALC-Tumorzellen verabreicht. In der immunisierten Gruppe entwickelten nur 20% der Mäuse Tumoren, während alle Mäuse in der nicht immunisierten Gruppe progressiv wachsende Tumoren entwickelten. Bei RMA und EL-4 wurde der beobachtete Schutz in den immunisierten Mäusen nicht in Mäusen beobachtet, die CD8-defizient waren, was zeigt, dass dieser Schutz durch CD8&spplus;-CTL vermittelt war (Fig. 8 A-C).

Referenzen

1. Groettrup M., A. Soza, U. Kuckelhorn und P.-M. Kloetzel, 1996. Peptide antigen production by the proteasome: complexity provides efficiency. Immunol. Today. 9: 429-435.
2. Heemels, M. T. und H. Ploegh. 1995. Generation, translocation, and presentation of MHC class I-restricted peptides. Annu. Rev. Biochem. 64: 463-491.
3. Powis, S. J., A. R. Townsend, E. V. Deverson, J. Bastin, G. W. Butcher und J. C. Howard. 1991. Restoration of antigen presentation of the mutant cell line RMA-S by an MHC-linked transporter. Nature. 354: 528-531.
4. Spies, T. und R. De Mars. 1991. Restored expression of major histocompatibility class I molecules by gene transfer of a putative peptide transporter. Nature. 351: 323-324.
5. Degen, E., M. F. Cohen-Doyle und D. B. Williams. 1992. Efficient dissociation of the p88 chaperone from major histocompatibility complex dass I molecules requires both β&sub2;-microglobulin and peptide. J. Exp. Med. 175: 1653-1661.
6. Suh, W. K., E. K. Mitchell, Y. Yang, P. A. Peterson, G. L. Waneck und D. B. Williams. MHC class I molecules from ternary complexes with calnexin and tap and undergo peptide-regulated interaction with TAP via their extracellular domains, J. Exp. Med. 184: 337-348.
7. Townsend, A. , C. Öhlén, J. Bastin, H. G. Ljunggren, L. Foster und K. Kärre. 1989. Association of class I major histocompatibility heavy and light chains induced by viral peptides. Nature. 340: 443-448.
8. Ljunggren, H. G., N. J. Stam, C. Öhlén, J. J. Neefjes, P. Höglund, M. T. Heemels, J. Bastin, T. N. Schumacher, A. Townsend und K. Kärre. 1990. Empty MHC class I molecules come out in the cold. Nature. 346: 476-480.
9. Day, P. M., F. Esquivel, J. Lukszo, J. R. Bennink und J. W. Yewdell. 1995. Effect of TAP on the generation and intracellular trafficking of peptide-receptive major histocompatibility complex class I molecules. Immunity. 2: 137-147.
10. Öhlén, C., J. Bastin, H. G. Ljunggren, L. Foster, E. Wolpert, G. Klein, A. R. Townsend und K. Kärre. 1990. Resistance to H-2-restricted but not to allo-H2-specific graft and cytotoxid T lymphocyte responses in lymphome mutant. J. Immunol. 145: 52-58.
11. Franksson, L., M. Petersson, R. Kiessling und K. Kärre. 1993. Immunization against tumour and minor histocompatibility antigens by eluted cellular peptides loaded an antigen processing defective cells. Eur. J. Immunol. 23: 2606-2613.
12. Aosai, F., C. Öhlén, H. G. Ljunggren, P. Höglund, L. Franksson, H. Ploegh, A. Townsend, K. Kärre und H. J. Strauss. 1991. Different types of allospecific CTL clones identified by their ability to recognize peptide loading-defective target cells. Eur. J. Immunol. 21: 2767-2774.
13. Rötzschke, O., K. Falk, S. Faath und H. G. Rammensee. 1991. On the nature of peptides involved in T cell alloreactivity. J. Exp. Med. 174: 1059-1071.
14. Wei, M. L. und P. Cresswell. 1992. HLA-A2 molecules in an antigenprocessing mutant cell contain signal sequence-derived peptides. Nature. 356: 443-446.
15. Henderson, R. A., A. L. Cox, K. Sakaguchi, E. Appella, J. Shabanowitz, D. F. Hunt und V. H. Engelhard. 1993. Direct identification of an endogenous peptide recognized by multiple HLA-A2.1-specific cytotoxid T cells. Proc. Acad. Sci. U.S.A. 90: 10275-10279.
16. Restifo, N. P., F. Esquivel, Y. Kawakami, J. W. Yewdell, J. J. Mule, S. A. Rosenberg und J. R. Bennink. 1993. Identification of human cancers deficient in antigen processing. J. Exp. Med. 177: 265-272.
17. Cromme, F. V., J. Airey, M. T. Heemels, H. L. Ploegh, P. J. Keating, P. L. Stern, C. J. Meijer und J. M. Walboomers. 1994. Loss of transporter protein, encoded by the TAP-1 gene, is highly correlated with loss of HLA expression in cervical carcinomas. J. Exp. Med. 179: 335-340.
18. Seliger, B., A. Hohne, A. Knuth, H. Bernhard, T. Meyer, R. Tampe, F. Momburg und C. Huber. 1996. Analysis of the major histocompatibility complex class I antigen presentation machinery in normal and malignant renal cells: evidence for deficiencies associated with transformation and progression. Cancer Res. 56: 1756-1760.
19. Garrido, F., T. Cabrera, A. Concha, S. Glew, F. Ruiz-Cabello und P. L. Stern. 1993. Natural history of HLA expression durino tumour develapment. Immunol. Today. 14: 491-499.
20. Crooke, S. T., Bennett, C. F. 1996. Progress in antisense oligonucleotide therapeutics. Annual Review of Pharmacology & Toxicology 36: 107-129.
21. Zon, G. 1995. Antisense phosphorothioate oligodeoxinucleotides: introductory concepts and possible mechanisms of toxicity. Toxicology Letters, Dez., 82-83: 419-424.
22. Nair, S. K., D. Snyder und E. Gilboa. 1996. Cells treated with TAP-2 antisense oligonucleotides are potent antigen-presenting cells in vitro and in vivo. J. Immunol. 156: 1772-1780.
23. Sharma H. W., Narayanan, R. 1996. The NF-kappaB transcriptionfactor in oncogenesis. Anticancer Research, März-April, 16(2): 589-596.
24. Ohkawa, J., Koguma, T., Kohda, T., Taira, K. 1995. Ribozymes: from mechanistic studies to applications in vivo. Journal of Biochemistry, Aug., 118(2): 251-258.
25. Putnam, D. A. 1996. Antisense strategies and therapeutic applications. American Journal of Health-System Pharmacy, 15. Jan.; 53(2): 151-160.
26. Ulmer J. B., J. C. Sadoff und M. A. Liu. 1996. DNA Vakzines. Current Opinion in Immunology. 8: 531-536.
27. Tascon, RE., Colston MJ., Ragno, S., Stavropoulus, E., Gregory, D., Lowrie, DB. 1996. Vaccination against tuberculosis by DNA injection. Nature Medicine, 2. Aug. (8): 888-892.
28. Uebel S., T. H. Meyer, W. Kraas, S. Kienle, G. Jung, K. H. Wismuller und R. Tampe. 1995. Requirements for peptide binding to the human transporter associated with antigen processing revealed by peptide scans and complex libraries. J. Biological Chemistry 270 (31): 18512-18516. 29. WO 96/33272.
30. Strobl H., E. Riedl, C. Scheinecker, C. Bello-Fernandez, W. F. Pickl, K. Rappersberger, O. Majdic und W. Knapp. 1996. TGF-betal promotes in vitro development of dendritic cells from CD34&spplus; hemopoetic progenitors. J. Immunology. 157(4): 1499-507.
31. Kiertscher S. M. und Roth M. D. 1996. Human CD14&spplus; leukocytes acquire the phenotype and function of antigen-presenting dendfitic cells when cultured in GM-CSF und IL-4. Journal of Leukocyte Biology 59(2): 208-218.
32. Obst, R., Armandola, E. A., Nijenhuis, M., Momburg, F., Hammerling, GJ. 1995. TAP polymorphism does not influence transport of peptide variants in mice and humans. European Journal of Immunology. 25. Aug. (8): 2170- 2176.
33. Hill, A., P. Jugovic, I. York, G. Russ, J. Bennink, J. Yewdell, H. Ploegh und D. Johnson. 1995. Herpes simplex virus turns off the TAP to evade host immunity. Nature. 175: 411-415.
34. Fruh, K., K. Ahn, H. Djaballah, P. Sempe, P. M. von Endert, R. Tampe, P. A. Peterson und Y. Yang. 1995. A viral inhibitor of peptide transporters for antigen presentation. Nature. 375: 415-418.
35. Rock, K. L., C. Graham, L. Rothstein, K. Clark, R. Stein, L. Dick, D. Hwang und A. L. Goldberg. 1994. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class 1 molecules. Cell. 78: 761-771.
36. Harding C. V., J. France, R. Song, J. M. Farah, S. Chatterjee, M. Iqbal und R. Siman. 1995. Novel dipeptide aldehyds are proteasome inhibitors and block the MHC class I antigen processing pathway. J. Immunol. 155: 1767-1775.
37. Fehling H. J., W. Swat, C. Laplace, R. Kuhn, K. Rajewsky, U. Muller und H. von Boehmer. 1992. MHC Klasse I expression in mice lacking the proteasome subunit LMP-7. Science 265: 1234.
38. Koller, B. H., P. Marrack, J. W. Kappler und O. Smithies. 1990. Normal development of mice deficient in β&sub2;-microglobulin, MHC class I proteins, and CD8&spplus; T cells. Science. 248: 1227-1230.
39. Van Kaer, L., P. G. Ashton-Rickardt, H. L. Ploegh und S. Tonegawa. 1992. TAP1 mutant mice are deficient in antigen presentation, surface class I molecules, and CD4&supmin;8&spplus; T cells. Cell. 71: 1205-1214.
40. Ljunggren, H. G., L. Van Kaer, M. S. Sabatine, H. Auchincloss Jr., S. Tonegawa und H. L. Ploegh. 1995. MHC dass I expression and CD8&spplus; T cell development in TAP1/β&sub2;-microglobulin double mutant mice. Int. Immunol. 7: 975-984.
41. Cerundolo, V., J. Alexander, K. Anderson, C. Lamb, P. Cresswell, A. McMichael, F. Gotch und A. Townsend. 1990. Presentation of viral antigen controlled by a gene in the major histocompatibility complex. Nature. 345: 449-452.
42. Lane, P., W. Gerhard, S. Hubele, A. Lanzavecchia und F. McConnell. 1993. Expression and functional properties of mouse B7/BB1 using a fusion protein between mouse CTLA4 and human γ1. Immunology. 80: 56-61.
43. Inaba K., Inaba M., Romani N., Aya H., Deguchi M., Ikehara S., Murumatsu S. und Steinman R. M. 1992. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 175(6): 1693-1703.
44. Karre, K., H. G. Ljunggren, G. Piontek und R. Kiessling. 1986. Selective rejection of H-2-deficient lymphoma variants suggests alternative immune defence strategy. Nature. 319: 675-678.
45. Takebe, Y., Seiki, M., Fujisawa, J-I., Hoy, P., Yokota, K., Arai, K-I., Yoshida, M. und Arai, N. 1988. Srα Promotor: an efficient and versatile Mammalian cDNA expression system composed of the simina virus 40 early promoter and the R-US segment of human T-cell leukemia virus type 1 Tong terminal repeat. Molecular and Cellular Biology, 466-472.
46. Zhou, X., R. Glas, F. Momburg. G. J. Hammerling, M. Jondal und H. G. Ljunggren. 1993. TAP2-defective RMA-S cells present Sendai virus antigen to cytotoxic T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 23: 1796-1801.
47. Wilson, J. B., Bell, J. L., Levine, A. J. 1996. Expression of Epstein-Barr virus nuclear antigen 1 induces B-cell neoplasia in transgenic mice. EMBO Journal, 17. Juni, 15(12): 3117-3126.
48. Dildrop R. MA. A., Zimmerman, K., Hsu, E., Tesfaye, A., DePinho, R., Alt, F. W. T989. IgH enhancer-mediated deregulation of N-myc gene expression in transgenic mice: generation of lymphoid neoplasias that lack c-myc expression. EMBO Journal. 8. April (4): 1121-1128. Tabelle 1. Erzeugung primärer CTL durch Epitope, die mit einer gestörten TAP-Funktion assoziiert sind*
* Die Tabelle zeigt ein repräsentatives Experiment von dreien.
¹ Con-A-Blasten von TAP1-/-, β&sub2;m-/- und B6-Mäusen
& Prozent spezifischer Lyse
Nicht durchgeführt

Claims

1. Verwendung einer Substanz, die die zelluläre Peptidbearbeitung für die MHC-Präsentation beeinträchtigt, wobei die Substanz dadurch gekennzeichnet ist, dass Tumorzellen, die mit der Substanz behandelt werden, einer spezifischen Lysis durch CTL unterliegen, die durch endogene MHC-Klasse I-abhängige Antigene der TAP-defizienten Variante dieser Tumorzelle, die mit dem stimulatorischen Molekül B7-1 transfiziert worden ist, ausgelöst wird, in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Vaccins für die Behandlung von Krebs oder einer Virusinfektion.

2. Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei die Substanz ausgewählt wird aus Substanzen, die die Funktion und/oder Expression von TAP inhibieren.

3. Verwendung gemäss Anspruch 2, wobei die Substanz ausgewählt wird aus ICP47 vom HSV-Typ 1, IE 12 vom HSV-Typ 2, einem Gen, das einen TAP-Inhibitor codiert, einem Gen, das eine Nukleotidsequenz codiert, die zumindest teilweise zu den mRNA- oder DNA-Sequenzen, die TAP codieren, komplementär ist, Antisense-Oligonukleotiden und RNA-zerstörendem Ribozym.

4. Verwendung gemäss Anspruch 1, wobei die Substanz die Funktion und/oder Expression des Proteasoms inhibiert.

5. Verwendung gemäss Anspruch 4, wobei die Substanz ausgewählt wird aus einem Peptidaldehyd Z-Leu-Leu-H, Lactacystin, einem Gen, das einen Proteasom-Inhibitor codiert, einer Nukleotidsequenz, die zumindest teilweise zu den mRNA- oder DNA-Sequenzen, die das Proteasom codieren, komplementär ist, Antisense-Oligonukleotiden und RNA-zerstörendem Ribozym.

6. In vitro-Verfahren zur Bereitstellung von Zellen, die CD8&spplus; T- Lymphozyten aktivieren können, die selektiv Zellen erkennen, die eine beeinträchtigte zelluläre Peptidbearbeitung für die MHC-Präsentation zeigen, umfassend den Schritt des Behandelns der Zellen mit einer wirksamen Dosis einer Substanz, die die zelluläre Peptidbearbeitung für die MHC-Präsentation beeinträchtigt, wobei die Substanz dadurch gekennzeichnet ist, dass Tumorzellen, die mit der Substanz behandelt werden, einer spezifischen Lysis durch CTL unterliegen, die durch endogene MHC-Klasse I-abhängige Antigene der TAP-defizienten Variante der Tumorzelle, die mit dem stimulatorischen Molekül B7-1 transfiziert worden ist, ausgelöst wird.

7. Verfahren gemäss Anspruch 6, wobei die Substanz ausgewählt wird aus Substanzen, die die Funktion und/oder Expression von TAP inhibieren.

8. Verfahren gemäss Anspruch 7, wobei die Substanz ausgewählt wird aus ICP47 vom HSV-Typ 1, IE 12 vom HSV-Typ 2, einem Gen, das einen TAP-Inhibitor codiert, einem Gen, das eine Nukleotidsequenz codiert, die zumindest teilweise zu den mRNA- oder DNA-Sequenzen, die TAP codieren, komplementär ist, Antisense-Oligonukleotiden und RNA-zerstörendem Ribozym.

9. Verfahren gemäss Anspruch 6, wobei die Substanz die Funktion und/oder Expression des Proteasoms inhibiert.

10. Verfahren gemäss Anspruch 9, wobei die Substanz ausgewählt wird aus einem Peptidaldehyd Z-Leu-Leu-H, Lactacystin, einem Gen, das einen Proteasom-Inhibitor codiert, einer Nukleotidsequenz, die zumindest teilweise zu den mRNA- oder DNA-Sequenzen, die das Proteasom codieren, komplementär ist, Antisense-Oligonukleotiden und RNA-zerstörendem Ribozym.

11. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6 bis 10, wobei die Zellen autologe und/oder hämatopoetische Zellen sind.

12. Verfahren gemäss Anspruch 11, wobei die autologen und/oder hämatopoetischen Zellen dendritische Zellen oder Zellen aus Krebsgewebe sind.

13. In vitro-Verfahren zur Bereitstellung von immunologischen Effektorzellen, die selektiv Zellen erkennen, die eine beeinträchtigte zelluläre Peptidbearbeitung für die MHC-Präsentation zeigen, umfassend den Schritt des Stimulierens von isolierten immunologischen Effektorzellen in vitro mit Zellen, die gemäss dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6 bis 12 bereitgestellt werden.

14. Verfahren gemäss Anspruch 13, wobei die immunologischen Effektorzellen CD8&spplus; T-Lymphozyten sind.

15. Verwendung von Zellen, bereitgestellt gemäss dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6 bis 12, oder Antigene oder Epitope, die von solchen Zellen exprimiert werden, in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Vaccins für die Behandlung von Krebs oder einer Virusinfektion.

16. Verwendung von immunologischen Effektorzellen, bereitgestellt gemäss dem Verfahren gemäss Anspruch 13 oder 14, in der Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung oder eines Vaccins für die Behandlung von Krebs oder einer Virusinfektion.

17. Pharmazeutische Zusammensetzung oder Vaccin, umfassend eine Substanz, die die zelluläre Peptidbearbeitung für die MHC-Präsentation beeinträchtigt, wobei die Substanz dadurch gekennzeichnet ist, dass Tumorzellen, die mit der Substanz behandelt werden, einer spezifischen Lysis durch CTL unterliegen, die durch endogene MHC-Klasse I-abhängige Antigene der TAP-defizienten Variante dieser Tumorzelle, die mit dem stimulatorischen Molekül B7-1 transfiziert worden ist, ausgelöst wird, zusätzlich enthaltend ein pharniazeutisch annehmbares Adjuvans, ausgewählt aus Cytokinen, Genen für Cytokine, costimulatorischen Molekülen, Goldbeads und/oder Liposomen und wahlweise pharmazeutisch annehmbare Additive.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung oder Vaccin, umfassend Zellen, bereitgestellt gemäss dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 6 bis 12, oder Antigene oder Epitope, die von solchen Zellen exprimiert werden, und ein pharmazeutisch annehmbares Additiv.

19. Pharmazeutische Zusammensetzung oder Vaccin, umfassend immunologische Effektorzellen, bereitgestellt gemäss dem Verfahren von Anspruch 13 oder 14.

20. Kit, umfassend als eine erste Komponente eine Substanz, die die zelluläre Peptidbearbeitung für die MHC-Präsentation beeinträchtigt, wobei die Substanz dadurch gekennzeichnet ist, dass Tumorzellen, die mit der Substanz behandelt werden, einer spezifischen Lysis durch CTL unterliegen, die durch endogene MHC-Klasse I-abhängige Antigene der TAP- defizienten Variante dieser Tumorzelle, die mit dem stimulatorischen Molekül B7-1 transfiziert worden ist, ausgelöst wird, und Cytokine, Gene für Cytokine, costimulatorische Moleküle, Goldbeads und/oder Liposome als eine zweite Komponente.