DE69714745T2

DE69714745T2 - Antikoagulierend wirkende peptidyl-arginin aldehyd derivate

Info

Publication number: DE69714745T2
Application number: DE69714745T
Authority: DE
Inventors: Sandor Bajusz; Eva Barabas; Andras Feher; Attila Juhasz; Eva Kaszas; JÿZSEF LANGO; Emilia Lavich; Klara Makk; Zsuzsanna Mohai; Imre Moravcsik; Gabriella Szabo; Anna Maria Szalkay; Agnes Szeker; Erzsebet Szell; Zsuzsanna Taschler; Gabor Toth; Iren Veghelyi
Original assignee: Institute for Drugs Research Ltd
Current assignee: Teva Hungary Pharmaceutical Marketing PLC
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1997-06-05
Publication date: 2003-04-24
Anticipated expiration: 2017-06-06
Also published as: PT922054E; DK0922054T3; EP0922054A1; CA2256391C; WO1997046576A1; ES2182086T3; JP3970935B2; HUP9601526A3; EP0922054B1; HU224315B1; ATE222261T1; JP2000512278A; CA2256391A1; HUP9601526A2; DE69714745D1; US6235707B1; HU9601526D0; AU726516B2; AU3043697A

Description

Die Erfindung betrifft neue Peptidyl-arginin-aldehyd- Derivate der allgemeinen Formel (I)
Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I)
worin
Q für eine Acylgruppe der Formel Q'-O-CO- steht, in der Q' Alkyl mit 1-3 Kohlenstoffatomen bedeutet,
D-Xaa fur 3-Cyclobutyl-D-alanyl oder 3-Cyclopentyl-D- alanyl steht,
Pro einen L-Prolylrest und
Arg einen L-Arginylrest bedeutet,
sowie auf ihre mit organischen oder anorganischen Säuren gebildeten Säureadditionssalze und auf diese Verbindungen enthaltende Arzneimittelpräparate.
Die neuen Verbindungen der Formel (I) haben wertvolle therapeutische Eigenschaften, insbesondere wirken sie gerinnungshemmend und hemmen auch die Funktion der Blutplattchen sowie die Entstehung von Thrombosen
Von den Verbindungen der allgemeinen Formel (I) sind die folgenden besonders bevorzugt:
Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd, Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd, Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd, Methoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd und ihre mit organischen oder anorganischen Säuren gebildeten Säureadditionssalze, insbesondere die Hydrogensulfate.

Definitionen

Die Abkürzungen der Amino sauren, ihrer Substituenten und der daraus aufgebauten Peptide sind die gemäß dem Stand der Technik [z. B. Biochem. J. 126, 773 (1972); Biochemistry 14, 449 (1975)] üblichen.

Aminosäuren:

Arg = L-Arginin [(2R)-2-Amino-6-guanidinopentansäure],
Asp = L-Asparaginsäure [(2S)-2-Amino-3-carboxypropionsäure],
boroArg = L-Boroarginin [(1R)-1-Amino-4-guanidino-butylborsäure],
D-Cba = 3-Cyclobutyl-D-alanin [(2R)-2-Amino-3-cyclobutylpropionsäure],
DL-Cbg = DL-Cyclobutyl-glycin [(2RS)-2-Amino-2-cyclobutylessigsäure],
D-Chg = D-2-Cyclohexyl-glycin [(2R)-2-Amino-cyclohexylessigsäure],
D-Cpa = 3-Cyclopentyl-D-alanin [(2R)-2-Amino-3-cyclopentylpropionsäure],
Gla = γ-Carboxy-L-glutaminsäure [(2S)-2-Amino-4,4-dicarboxy-buttersäure],
Glu = L-Glutaminsäure [(2S)-2-Amino-4-carboxy-buttersäure],
Glp = L-Pyroglutaminsäure [(5S)-2-Pyrrolidon-5-carbonsäure],
Gly = Glycin (2-Aminoessigsäure),
D-MePhe = N-Methyl-3-phenyl-D-alanin [(2R)-2-Methylamino-3- phenyl-propionsäure],
D-MePhg = D-N-Methyl-phenylglycin [(2R)-2-Amino-2-phenylessigsäure],
Nal(1) = 3-(Naphthyl-1)-L-alanin [(2S)-2-Amino-3-(naphthyl-1)- propionsäure],
D-Phe = 3-Phenyl-D-alanin [(2R)-2-Amino-3-phenyl-propionsäure],
Pro = L-Prolin [(2S)-Pyrrolidin-2-carbonsäure].

Substituenten

Ac = Acetyl, Boc = t-Butoxycarbonyl, Bz = Benzoyl, Eoc = Ethoxycarbonyl, Et = Ethyl, iPoc = Isopropoxycarbonyl, Me = Methyl, 4MeP = 4-Methylpentanoyl, Moc = Methoxycarbonyl, pNA = p-Nitrophenylamino, Poc = Propoxycarbonyl, Tos = p- Toluolsulfonyl, Z = Benzyloxycarbonyl.

Peptide und ihre Derivate

Die Abkürzungen der Aminosäuren für sich allein bedeuten die L-Form der jeweiligen Aminosäure. Die D-Aminosäure ist besonders gekennzeichnet, zum Beispiel 3-Phenyl-D-alanin = D- Phe. Der Bindestrich vor beziehungsweise hinter der Aminosäureabkürzung zeigt an, daß ein H-Atom von der Aminogruppe beziehungssweise die OH-Gruppe der Carboxylgruppe fehlt. Dementsprechend bedeutet Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H Ethoxycarbonyl-3- cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-L-arginin-aldehyd, während Bz-Ile- Glu-Gly-Arg-pNA die Bedeutung Benzoyl-L-icoleucyl-L- glutarnyl-glycyl-L-arginin-p-nitroanilid hat.

Stand der Technik

Die Blutgerinnung ist ein Teil der Schutzmechanismen des Organismus. Der Prozeß wird von einer Aderwandverletzung ausgelöst, das Blut gerinnt, um ein Verbluten zu verhindern. Außerdem kann die Blutgerinnung auch durch Blutgefäßkrankheiten, Blutstockungen oder pathologische Aktivierung der Gerinnungsfaktoren ausgelöst werden. In diesem Fall bildet sich das geronnene Blut (Thrombus) innerhalb des Gefäßes und verschließt dieses ganz oder teilweise, es entsteht eine Thrombose. Ein anderer Teil des Schutzmechanismus ist die Fibrinolyse. Die daran beteiligten Enzyme entfernen den Überschuß an geronnenem Blut und nehmen auch an der Thrombolyse, der Auflösung des Thrombus, teil.
Der Prozeß der Blutgerinnung ist eine Kaskadenreaktion, eine Serie von katalysierten Enzymreaktionen, in dem Plasmaproteine, die sog. Gerinnungsfaktoren, nacheinander aktiviert werden. Die Faktoren werden mit römischen Zahlen bezeichnet, die aktive Form kennzeichnet der Buchstabe "a". Es werden auch Trivialnamen verwendet, zum Beispiel Fibrinogen = Faktor I (fI), Fibrin = Faktor Ia (fIa), Prothrombin = Faktor II (fII) und Thrombin = Faktor IIa (fIIa). Bei der Gerinnung entstehen Serinproteasen (fXIIa, fVIIa, fIXa, fXa und Thrombin), einige beschleunigende Cofaktoren (fVa und fVIIIa) und der Gerinnstoff selbst (Fibrin). Von den entstehenden Proteasen sind fXa und Thrombin die beiden letzten. Durch die Wirkung von fXa entsteht das Thrombin, welches durch Spaltung des Fibrinogens geronnenes Fibrin erzeugt.
Im Sinne früherer Annahmen über den Blutgerinnungsprozeß [R. G. MacFarlane, Nature 202, 498 (1964); E. W. Davie und O. D. Ratnoff, Science 145, 1310 (1964)] geschieht die Aktivierung von fX auf zwei Wegen, dem inneren und dem äußeren Weg. Im ersteren Fall wird der Prozeß durch fXII (fXIIa), der an irgendeiner Oberfläche aktiviert wurde, durch die Umwandlung fXI → fXIa ausgelöst, auf welche die Umwandlung fIX → fIXa folgt; fX wird durch fIXa aktiviert. Auf dem äußeren Wege beginnt der Prozeß mit dem Auftreten eines Rezeptors an der Zelloberfläche, des Gewebefaktors TF (tissue factor), und der Herausbildung des Komplexes [fVII + TF] bzw. [fVIIa + TF]. fX wird durch den Komplex [fVIIa + TF] aktiviert.
Neueren Erkenntnissen zufolge ist die im lebenden Organismus ablaufende Blutgerinnung ein Ergebnis der Kombination beider Wege [E. W. Davie et al., Biochemistry 43, 10363 (1991)] mit den folgenden Hauptschritten:
1. Ist die Gefäßwand verletzt oder krank, so gelangt TF an die Oberfläche und bindet einen Teil des im Blut zirkulierenden Faktors VII. Der entstandene Komplex [fVII + TF] wird durch eine geeignete und wenigstens in Spuren vorliegende Protease (fXIIa, fXa und Thrombin) zu dem aktiven Enzymkomplex [fVIIa + TF] aktiviert, der seinerseits einen geringen Anteil der im Plasma vorhandenen Faktoren IX und X aktiviert (wenig fIXa und fXa entsteht) und dann durch TFPI [Tissue Factor Pathway Inhibitor, früherer Name LACI (Lipoprotein-Associated Coagulation Inhibitor)], der im Plasma für fXa und [fVII + TF] der gemeinsame Inhibitor ist [T. J. Girard et al., Nature 338, 518-520 (1989)], inaktiviert wird.
2. Der entstandene fIXa erzeugt zusammen mit dem Faktor X und dem Cofaktor VIII in Gegenwart von Ca&spplus;&spplus;-Ionen an Phospholipidoberflächen (PL) den "Tenase"-Komplex, [fIXa + fVIIIa + fX + PL + Ca&spplus;&spplus;], in welchem fX zu fXa aktiviert wird.
3. Der bis dahin entstandene fXa erzeugt zusammen mit Prothrombin (fII) und dem Cofaktor Va den "Prothrombinase"- Komplex, [fXa + fVa + fII + PL + Ca&spplus;&spplus;], dessen Struktur der des "Tenase"-Komplexes ähnlich ist. In diesem Komplex wird Prothrombin zu Thrombin umgewandelt. Zu den Umwandlungen fV → fVa und fVIII → fVIIIa sind sowohl fXa wie auch Thrombin befähigt.
4. Das wenige entstandene Thrombin wandelt einen Teil von fXI zu dem Enzym fXIa um und aktiviert einige Faktoren VIII und V, die weitere Mengen an fVIIIa bzw. fVa produzieren. Jetzt wird der Faktor IX bereits durch fXIa zu dem Enzym fIXa umgewandelt. Damit kann die vom Xase-Komplex bis zur Bildung des Thrombins verlaufende Kettenreaktion erneut beginnen. Mit der Wiederholung des Prozesses entsteht immer mehr Thrombin.
5. Ist die Thrombinkonzentration genügend hoch, so beginnt eine partielle Proteolyse des im Plasma gelösten Fibrinogens, es entsteht ein Fibrinmonomer, das sich zuerst zu einem löslichen Fibrinpolymer assoziiert und dann in unlösliches Fibrinpolymer verwandelt. Auch hierbei spielt das Thrombin eine Rolle, denn durch seine Wirkung entsteht fXIIIa, der die Polymerisation bewirkende Faktor [L. Lorand und K. Konishi, Arch. Biochem. Biophys. 105, 58 (1964)].
Das unlösliche Fibrinpolymer ist eine Hauptkomponente des geronnenen Blutes und der Thromben, die andere ist ein Aggregat aus Blutplättchen, welches sich in erster Linie ebenfalls durch die Wirkung des Thrombins bildet. Der entstehende Thrombus bzw. das geronnene Blut schließt einen bedeutenden Teil des in dem Prozeß entstandenen Thrombins in sich ein, wodurch ein neuer Gerinnungsprozeß gestartet wird, wenn dieses Thrombin beim Auflösen des Thrombus wieder in Lösung geht [A. K. Gash et al., Am. J. Cardiol. 57, 175 (1986); R. Kumar et al., Thromb. Haemost. 72, 713 (1994)].
Aus dem Dargelegten ist die Schlüsselrolle des Thrombins in der Entstehung von Thromben ersichtlich. Infolgedessen kommt allen Verbindungen, die die Funktion und/oder Entstehung des Thrombins hemmen, in der Therapie der Thrombose eine ausserordentliche Bedeutung zu.
Die in der Behandlung und Vorbeugung der Thrombose gegenwärtig am verbreitetsten und erfolgreichsten angewendeten Verbindungen sind die Heparine und die vitamin-K-antagonistischen Cumarine (zum Beispiel Syncumar und Wafarin), die indirekte Thrombininhibitoren sind.
Heparin katalysiert die Reaktion zwischen Thrombin und seinem natürlichen Inhibitor, dem Antithrombin-III (AT-III). Diese Wirkung des Heparins tritt jedoch nicht ein, wenn die Plasmakonzentration des AT-III weniger als 75% des Normalwertes beträgt [R. Egbring et al., Thromb. Haemost. 42, 225 (1979)]. Wichtig ist ferner, daß das Thrombin, das auf die erwähnte Weise im Thrombus gebunden ist, mittels dieses indirekten Mechanismus nicht inhibiert werden kann, da es für den Heparin-AT-III-Komplex nicht zugänglich ist [J. I. Weitz et al., 7. Clin. Invest. 86, 385 (1990)]. Schließlich sind Nebenwirkungen, wie durch die Behandlung hervorgerufene Hämophilie, durch immunpathologische Prozesse entstehende Thromboembolie, nicht zu vernachlässigen [J. M. Walenga et al., Clin. Appl. Thrombosis/Haemostasis, 2(Suppl. 1), S21-S27 (1996)].
Die Vitamin-K-Antagonisten können auch oral verabreicht werden, ihre Wirkung zeigt sich nach 16-24 Stunden. Sie hemmen die Entstehung der reaktiven Form einiger Gla-haltiger Gerinnungsfaktoren (zum Beispiel des Prothrombins). Für eine therapeutische Wirkung ist eine partielle (60-70%ige) Hemmung erforderlich [M. P. Esnouf und C. V. Prowse, Biochim. Biophys. Acta 490, 471 (1977)], die durch eine entsprechende Dosierung des Mittels erzielt werden kann. Die Vitamin-K-Antagonisten sind jedoch in der Anwendung kompliziert wegen ihres schmalen therapeutischen Bereiches, ihrer starken Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Nahrung (Vitamin K) und der unterschiedlichen individuellen Empfindlichkeit.
Die erste hochwirksame, das Thrombin direkt hemmende synthetische Verbindung war das Tripeptid-aldehyd D-Phe-Pro- Arg-H, ein reversibler Inhibitor, der sowohl in vitro als auch in vivo eine bedeutende gerinnungshemmende Wirkung zeigte [S. Bajusz et al., in: Peptides, Chemistry, Structure and Biology (R. Walter and J. Meienhofer, Eds.), Ann Arbor Publ., Ann Arbor, Michigan, USA, 603-608 (1975); Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217 (1978)]. Zahlreiche dem D-Phe-Pro-Arg-H verwandte Verbindungen wurden synthetisiert. Eine der ersten war Boc-D- Phe-Pro-Arg-H [S. Bajusz et al., Int. J. Peptide Protein Res. 12, 217 (1978)] und sein Chlormethylketon-Analog (D-Phe-Pro-Arg- CH&sub2;Cl), das sich als irreversibler Inhibitor erwies [C. Kettner und E. Shaw, Throm. Res. 14, 969 (1979)]. Weitere erwähnenswerte Peptide und Acylpeptide sind die Boroarginin-Analogen (D-Phe- und Boc-D-Phe- sowie Ac-D-Phe-Pro-boroArg), welche potente reversible Thrombinihibitoren sind [C. Kettner et al.: J. Biol. Chem. 265, 18289 (1990)], und die sonstigen Analogen von Boc- D-Phe-Pro-Arg-H, darunter das Analog Boc-D-Chg-Pro-Arg-H [(P. D. Gesellchen und T. Shuman, EP 0479489 A2 (1992)].
D-Phe-Pro-Arg-H ist in wäßriger Lösung zu spontanen Umwandlungen geneigt, das durch Methylieren der terminalen Aminogruppe erhaltene D-MePhe-Pro-Arg-H (GYKI-14766) ist jedoch entsprechend stabil und ebenso wirksam wie die nicht methylierte Verbindung [S. Bajusz et al., USP 4 703 036 (1987); J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)]. Die Verbindung hemmt in Versuchstieren die Blutgerinnung und Thrombusbildung bedeutend [D. Bagdy et al., Thromb. Haemost. 67, 357 und 68, 125 (1992); J. V. Jackson et al., J. Pharm. Exp. Ther. 261, 546 (1992)]; ihre auf die Enzyme der Fibrinolyse ausgeübte inhibierende Wirkung war vernachlässigbar, zusammen mit Thrombolytika verabreicht fördert sie signifikant das Auflösen des Thrombus [C. V. Jackson et al., J. Cardiovascular Pharmacol. 21, 587 (1993)], was der Heparin-AT-III-Komplex nicht vermag. Unterschiedliche dem D-MePhe-Pro-Arg-H verwandte Verbindungen wurden hergestellt, zum Beispiel D-MePhg-Pro-Arg-H [R. T. Shuman et al., J. Med. Chem. 36, 314 (1993)].
Die blutgerinnungshemmende Wirkung (d. h. die Hemmung der proteolytischen Reaktionen in dem Prozeß) wird in Gerinnungshemmungstests gemessen, zum Beispiel dem Thrombinzeit- (TT), dem aktiviert-partiellen Thromboplastinzeit- (APTT) und dem Prothrombinzeittest (PT) [E. J. W. Bovie et al., Mayo Clinic Laboratory Manual of Maemostasis; W. B. Saunders Co., Philadelphia (1971)]. Dabei wird am spontanen Gerinnen gehindertes Plasma, zum Beispiel Citratplasma, zum Koagulieren gebracht, und die zum Gerinnen erforderliche Zeit wird gemessen. Durch die Wirkung von Gerinnungshemmern wird die Gerinnungszeit proportional mit der Hemmung der Reaktion(en) in dem Prozeß verlängert. Die gerinnungshemmende Wirkung kann durch die Substanzkonzentration, die bezogen auf die Kontrolle zur Verdoppelung der Gerinnungszeit erforderlich ist, charakterisiert werden (IC&sub5;&sub0;). Die Wirkung von Gerinnungshemmern auf die einzelnen Gerinnungsproteasen wird mittels der amidolytischen Methode [R. Lotterberg et al., Methods in Enzymol. 80, 341 (1981); G. Cleason, Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 411 (1994)] gemessen. Der isolierte aktive Faktor (zum Beispiel Thrombin, fXa) und sein chromogenes oder fluorogenes Peptidamid-Substrat werden in Gegenwart bzw. Abwesenheit des Inhibitors miteinander umgesetzt. Die enzymhemmende Wirkung wird durch die zum Beispiel mittels Amidolyse gemessene Hemmkonstante (IC&sub5;&sub0;) ausgedruckt.
Im TT-Test wird die Gerinnung durch das dem Citratplasma zugesetzte Thrombin ausgelöst. In dem System ist Thrombin in einer Menge von 22 pMol/ml vorhanden, und seine Hemmung kann durch Messung des vorhandenen Fibrinogens (eines der natürlichen Substrate des Thrombins) in Gegenwart der Plasmakomponenten bestimmt werden. Im APTT- und PT-Test läuft der gesamte Gerinnungsprozeß ab. Abhängend vom Aktivator wird fX auf dem äußeren oder dem inneren Weg aktiviert. Der entstehende fXa aktiviert Prothrombin zu Thrombin, welches schließlich die Blutgerinnung hervorruft Wenn die Enzyme oder eines von ihnen durch den Inhibitor gehemmt sind, verlängert sich die Gerinnungszeit. Im APTT- und im PT-Test können höchstens 40 pMol/ml Xa entstehen (das ist die Gesamtmenge des Faktors X in beiden Systemen), während 150 pMol/ml (APTT) beziehungsweise 350 pMol/ml (PT) Thrombin gebildet werden [B. Kaiser et al., Thromb. Res. 65, 157 (1992)].
Im Fall von D-MePhe-Pro-Arg-H (C1) war die eine Verdoppelung der Gerinnungszeit bewirkende Konzentration in den TT-, APTT- und PT-Tests 87, 622 bzw. 2915 nM. Diese Werte und die in den Tests aktive Thrombinmenge (22, 150 bzw. 350) zeigen einen ähnlichen Anstieg, was nahelegt, daß C1 sich sowohl im APTT- wie auch im PT-Test als Thrombinihibitor verhält und auf die Funktion von fXa keinen oder nur einen geringen Einfluß hat. In guter Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wird die amidolytische Wirkung des Thrombins an Tos-Gly-Pro-Arg-pNA- Substrat durch C1 gehemmt (IC&sub5;&sub0; = 2nM), während die amidolytische Wirkung von fXa an dem entsprechenden Bz-Ile- Glu-Gly-Arg-pNA-Substrat mit einem IC&sub5;&sub0;-Wert von 9,1 mM nur geringfügig gehemmt war (Bajusz et al., unpublizierte Ergebnisse).
Es ergibt sich aus dem Mechanismus der Blutgerinnung, daß der Prozeß nicht nur von den direkten Thrombininhibitoren, sondern auch von den die Bildung des Thrombins hindernden Stoffen, zum Beispiel fXa-Inhibitoren, gehemmt wird. Zum Beispiel sind das aus Zecken isolierte, aus 60 Gliedern bestehende Polypeptid TAP (Tick Anticoagulant Peptide) [L. Waksman et al., Science 248, 593 (1990); A. B. Kelly et al., Circulation 86, 1411 (1992)] und DX-9065a (C2), ein sytheiisches Nicht-peptid, (+)-(2S)-2-[4-[[(3S)-1-Acetimidoyl-3-pyrrolidinyl]- oxy]-phenyl]-3-[7-[amidino-2-naphthyl]-propionsäure-hydrochlorid-pentahydrat [T. Hara et al., Thromb. Haemost. 71, 3 14 (1994); T. Yokoyama et al., Circulation 92, 485 (1995)] starke Inhibitoren der Blutgerinnung und Thrombusbildung. Im PT- und APTT-Test hemmen diese Verbindungen sowohl die amidolytische Wirkung von fXa wie auch die Plasmagerinnung stark, d. h. inhibieren sowohl den freien wie auch den komplex gebundenen Faktor Xa, während sie als spezifische fXa-Inhibitoren das Thrombin nicht hemmen, d. h. im TT-Test keine Aktivität zeigen. 4-MeP-Asp-Pro-Arg-H C3) (internationale Patentanmeldung Nr. 93/15756) und Boc-D-Phe-Nal(1)-Arg-H (C4) (internationale Patentanmeldung Nr. 95/13693) sind synthetische Peptidinhibitoren von fXa.
Laut der Literatur hemmen C3 und C4 die amidolytische Wirkung von fXa auf dem Substrat Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA mit IC&sub5;&sub0; = 57 beziehungsweise 30 nM. Betreffend ihre gerinnungshemmende Wirkung liegen keine Angaben vor. In eigenen Versuchen wurde gefunden, daß C3 und C4 auch an dem Substrat Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA eine signifikante Hemmwirkung zeigten, während ihre gerinnungshemmende Wirkung in den Plasmagerinnungstests außerordentlich gering ist. Die publizierten (C2) und die gemessenen (C3-C4) Wirkungen der synthetischen fXa- Inhibitoren im Vergleich zu der Antithrombinverbindung C1 sind in der Tabelle 1 zusammengefaßt.
In der Tabelle bedeuten:
a Die Peptidkonzentration, die die Gerinnungszeit im Prothrombinzeit- (PT), im aktiviert-partiellen Thromboplastinzeit- (APTT) und im Thrombinzeittest (TT) bezogen auf die Kontrolle auf das Doppelte verlängert.
b Mit isoliertem menschlichem fXa an dem chromogenen Substrat Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA gemessener Wert.
c NA = inaktiv Tabelle 1: fXa-hemmende (A) und gerinnungshemmende (B) Wirkung bekannter synthetischer Inhibitoren
Die Daten der Tabelle 1 zeigen, daß im Fall von C1 die gerinnungshemmende Wirkung auf die Hemmung des Thrombins zurückzuführen ist, im Fall von C2 jedoch auf die Hemmung von fXa. Die signifikante fXa-hemmende Wirkung von C3 und C4 ist mit keinerlei bedeutenderer gerinnungshemmender Wirkung verbunden. Wahrscheinlich ist das aktive Zentrum von fXa in dem Prothrombinase-Komplex für C3 und C4 nicht zugänglich, diese Peptide können nur das freie fXa in Lösung hemmen.
Nach einer neueren Mitteilung [N. A. Prager et al., Circulation 92, 962 (1995)] trägt nicht nur das Thrombin, sondern auch der ebenfalls in den Thrombus/das Blutgerinnsel eingeschlossene und durch Auflösen wieder freigesetzte Faktor Xa zur Auslösung und Aufrechterhaltung eines neuen Gerinnungsprozesses bei, durch die Aktivierung des [fVII + TF]- Komplexes oder der Faktoren V und VIII. Infolgedessen ist es vorteilhaft, wenn die Gerinnungshemmer neben Thrombin auch den Faktor Xa zu hemmen vermögen, insbesondere, wenn sich diese Hemmung auch auf in Blutgerinnseln gebundenes Thrombin und fXa erstreckt.

Kurze Beschreibung der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Herstellung neuer Peptidderivate, die verglichen mit den bekannten Verbindungen eine verbesserte gerinnungshemmende Wirkung aufweisen und diese Wirkung auch bei oraler Verabreichung ausüben.
Es wurde beobachtet, daß im TT- und im APTT-Test die gerinnungshemmende Wirkung von BOC-D-Phe-Pro-Arg-H (C5) geringer ist als die des Tripeptid-aldehyds C1, im PT-Test jedoch C5 etwas wirksamer ist und den Faktor Xa mit einem um das Zehnfache geringeren IC&sub5;&sub0;-Wert hemmt als C1. Überraschenderweise wurde gefunden, daß der Ersatz der BOC- Gruppe durch die Eoc-Gruppe in C5 die gerinnungshemmende Wirkung des Peptides positiv beeinflußt; das so erhaltene Eoc-D- Phe-Pro-Arg-H zeigt in allen drei Tests eine stärkere Wirkung als C5 und übertrifft zusätzlich die Aktivität von C1 nicht nur im PT-, sondern auch im APTT-Test, während seine fXa-hemmende Wirkung der des BOC-Peptides C5 vergleichbar ist. Die gerinnungshemmende Wirkung von Moc-D-Phe-Pro-Arg-H (C7) ist ähnlich wie die der Eoc-Verbindung C6, ihre fXa-hemmende Wirkung ist etwas höher. Die Werte sind in der Tabelle 2 zusammengestellt.
In der Tabelle bedeuten:
a Die Peptidkonzentration, die die Grinnungszeit verglichen mit der Kontrolle auf das Doppelte verlängert
b Mit isoliertem menschlichem fXa an dem chromogenen Substrat Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA gemessener Wert Tabelle 2 Gerinnungshemmende (A) und fXa-hemmende (B) Wirkung von Peptidaldehyden der Struktur R-D-Phe-Pro-Arg-H
Es wurde weiterhin gefunden, daß Verbindungen mit noch besserer gerinnungshemmender Wirkung entstehen, wenn die Nterminale Aminosäure nicht Phenylalanin, sondern 3-Cyclobutylalanin ist. Ein Austausch des Phenylalanins gegen das homologe Cyclobutylglycin hingegen vermindert die Aktivität. Neben 3- Cyclobutylalanin ergibt auch eine Substitution durch 3- Cyclopentylalanin wirksame Peptidylarginin-aldehyde. Es wurde auch beobachtet, daß der Austausch der N-terminalen Ethoxycarbonylgruppe gegen Methoxycarbonyl oder Propoxycarbonyl das Aktivitätsspektrum, d. h. das Verhältnis der in den einzelnen Tests gemessenen Aktivitäten untereinander, verändert.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung betrifft neue Peptidyl-arginin-aldehyd- Derivate der allgemeinen Formel (I)
Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I)
worin
Q für eine Acylgruppe der Formel Q'-O-CO- steht, in der Q' Alkyl mit 1-3 Kohlenstoffatomen bedeutet,
Xaa für 3-Cyclobutyl-D-alanyl oder 3-Cyclopentyl-D- alanyl steht,
Pro einen L-Prolylrest und
Arg einen L-Arginylrest bedeutet,
sowie auf ihre mit organischen oder anorganischen Säuren gebildeten Säureadditionssalze und auf diese Verbindungen enthaltende Arzneimittelpräparate.
Die Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin die Bedeutung von Q, Q', Xaa, Pro und Arg die gleiche wie oben ist, können zum Beispiel hergestellt werden, indem man ein Acyldipeptid Q-D-Xaa-Pro mit einem L-Arginin-lactam, das an der Guanidinogruppe durch Benzyloxycarbonyl geschützt ist, kondensiert, das erhaltene geschützte Tripeptidlactam zu dem geschützten Tripeptid-aldehyd der Formel Q-D-Xaa-Pro-Arg(Z)-H reduziert, schließlich die Gruppe Z von der Guanidinogruppe des Arginins entfernt und das Peptidderivat der allgemeinen Formel (I) in Form eines mit einer organischen oder anorganischen Säure gebildeten Salzes isoliert.
Das als Ausgangsverbindung eingesetzte Acylpeptid Q-D- Xaa-Pro kann zum Beispiel durch Acylieren der Aminosäure D- Xaa mit einem Ameisensäure-Q'-alkylester in basischem Medium und anschließendem Koppeln der erhaltenen Acylaminosäure Q- D-Xaa mit L-Prolin erhalten werden.
Die zur Kopplung mit L-Prolin erforderliche Acylaminosäure Q-D-Xaa kann vorteilhaft hergestellt werden, indem man die DL-Acylaminosäure zu ihrem Methlester umsetzt und den racemen Ester Q-DL-Xaa-OMe einer enzymatischen Racematspaltung unterzieht. Der dabei entstehende Ester Q-D- Xaa-OMe wird dann zu der erforderlichen Acylaminosäure Q-D- Xaa verseift.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I), worin die Bedeutung von Q, Xaa, Pro und Arg die gleiche wie oben ist, zeigen sowohl in vitro wie auch in vivo eine starke gerinnungshemmende Wirkung und besitzen eine ausgezeichnete Bioverfügbarkeit.
Die gerinnungshemmenden Wirkungen der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) in vitro wurden im Prothrombinzeit- (PT), im aktiviert-partiellen Thromboplastin- (APTT) und im Thrombinzeittest (TT) [D. Bagdy et al., Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)] gemessen. Ebenfalls bestimmt wurde die fXahemmende Wirkung der Verbindungen an dem chromogenen Substrat Bz-Ile-Glu-Arg-pNA (s. Methode M6).
Die erhaltenen Ergebnisse sind in der Tabelle 3 zusammengestellt. Die entsprechenden Daten des Thrombininhibitors C1, der Eoc-D-Phe-Verbindung C6 und dem Eoc-DL- Cba-Analog C8 dienen als Kontrolle. In der Tabelle sind die Verbindungen nach sinkender PT-Aktivität geordnet. Die Daten zeigen deutlich die vorteilhafte Wirkung von Cba und Cpa als terminaler Aminosäure im Vergleich zu Phe oder zu dem homologen Cyclobutylglycin (s. DL-Verbindungen C8, C9 und C10).
In der Tabelle bedeuten:
a Peptidkonzentration, die die Thrombinzeit auf das Doppelte verlängert
b Identisch mit der Nummer des Herstellungsbeispiels
c Mit isoliertem menschlichem Faktor Xa an dem Substrat
Bz-Ile-Glu-Gly-Arg-pNA gemessener Wert (s. Methoden M1-M5) Tabelle 3: Gerinnungshemmende (A) und fXa-hemmende (B) Wirkung der neuen Peptidylaldehyde (1-4, allgemeine Formel Q-D-Xaa-Pro- Arg-H) und von Kontrollverbindungen, nach sinkender PT- Aktivität geordnet
Die inhibierende Wirkung der erfindungsgemäßen neuen Verbindungen auf Plasmin sowie auf durch den Gewebeplasminogenaktivator (tPA) und Urokinase (UK) ausgelöste Plasminbildung wurde mittels der Fibrinplattenmethode untersucht [D. Bagdy et al.: Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)]. Die Verbindungen C1 und C5 dienten als Kontrolle. Es ist bekannt, daß die fibrinolysehemmende Wirkung von C1 sich in vivo als unbedeutend erwiesen hat und die Verbindung als Adjuvant beim Auflösen des experimentellen Thrombus gut geeignet war, während die fibrinolysehemmende Wirkung von C5 auch in vivo nachweisbar war [C. V. Jackson et al.: J. Cardiovasc. Pharmacol 21, 587 (1993)]. Als ein Beispiel sind in der Tabelle 4 die mit den neuen Verbindungen 1 und 2 sowie die mit den Kontrollverbindungen C1 und C5 erhaltenen Ergebnisse dargestellt. Tabelle 4: Hemmwirkung (IC&sub5;&sub0;) der erfindungsgemäßen neuen Peptidylarginin-aldehyde und der Kontrollverbindungen ähnlicher Struktur auf Plasmin (PL) sowie auf die durch Gewebeplasminogenaktivator (tPA) und durch Urokinase (UK) hervorgerufene Plasminbildung, bestimmt nach der Fibrinplattenmethodea
a IC&sub5;&sub0; = die Peptidkonztentration (uM), die auf der Fibrinplatte das hydrolysierte Gebiet auf 50% der Kontrolle verringert.
b Auf die Wirksamkeit von C1 (1/IC&sub5;&sub0; = 1)bezogener Wert.
c Nr. des Herstellungsbeispiels bzw. Kontrollverbindung.
Neben den IC&sub5;&sub0;-Werten (Spalten A) ist auch die auf C1 bezogene relative Wirksamkeit der Verbindungen angegeben (Spalten B). Letztere zeigt, daß die antifibrinolytische Wirkung der neuen Verbindungen 1 und 2 ähnlich wie die von C1 gemäßigt ist; ihre Wirkung gegen die drei Enzyme ist um das 3,2-, 4,5- bzw. 39fache schwächer als die der Verbindung C5.
Die Hemmwirkung der neuen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) auf in geronnenes Plasma eingeschlossenes fXa und Thrombin sowie auf an Fibringel gebundenes Thrombin ist in Tabelle 5 am Beispiel der Verbindungen 1-3 dargestellt; die entsprechenden Werte von C1 dienen als Kontrolle. Geronnenes Plasma wurde durch Versetzen von plättchenreichem menschlichem Citratplasma mit Calciumionen hergestellt. Fibringel wurde durch Gerinnenlassen von Humanfibrinogen mit Humanthrombin erhalten. Für die Aktivitätsmessungen von fXa und Thrombin wurden die Substrate Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA bzw. Tos-Gly-Pro-Arg-pNA auf die bei den Methoden M1-M3 beschriebene Weise verwendet. Tabelle 5 Hemmwirkung (IC&sub5;&sub0;, uM) der neuen Peptidyl-arginin-aldehyde 1- 3 und der Verbindung C1 als Kontrollverbindung auf in geronnenes Plasma eingeschlossenes fXa und Thrombin sowie auf an Fibringel gebundenes Thrombina
a Bei der Bestimmung der IC&sub5;&sub0;-Werte wurde die Aktivität von fXa und Thrombin an den Substraten Moc-D-Chg-Gly-ArgpNA bzw. Tos-Gly-Pro-Arg-pNA gemäß den Methoden M2 und M3 gemessen.
b Herstellungsbeispiel der Verbindung bzw. Kontrollverbindung (C1).
Aus den Daten ist ersichtlich, daß die Eoc-Verbindungen 1 und 3 nicht nur Thrombin, sondern auch an geronnenes Plasma gebundenes fXa mit einem ICS von unter 1 Mikromol hemmen.
Die blutgerinnungshemmende und die Plättchenaggregation inhibierende Wirkung der Verbindungen der allgemeinen Formel (I) wurde an weißen Neuseeländer Kaninchen ex vivo nach der Methode von D. Bagdy et al. [Thromb. Haemost. 67, 357 (1992)] untersucht. Die Verbindungen wurden in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung gelöst und i.v. (0,04-0,05 mg/kg) oder als Infusion (0,25-5,0 mg/kg·h) oder subcutan (0,5-6,0 mg/kg) oder p. o. (2,5-20 mg/lg) verabreicht. Im Fall der Verabreichung p. o. war die Wirkung der Verbindungen schon nach 30 Minuten nachweisbar, der größte Wert wurde zwischen 60 und 180 Minuten erreicht, und die therapeutische Wirkung blieb dosisabhängig über 3 - > 6 Stunden bestehen.
Die Wirkung von Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L- prolyl-L-arginin (1) in vivo wird in den Tabellen 6 und 7 ausführlich gezeigt. Die entsprechenden Werte von C1 sind als Kontrolle angegeben. Die Verbindung wurde in einer Dosis von 5 mg/kg per os verabreicht. Aus der Ohrvene der Tiere wurden alle 30-60 Minuten Blutproben entnommen und analysiert. Bestimmt wurden die Gerinnungszeit des Vollblutes (WBCT) und das Ausmaß (PAI) der Inhibition der durch Thrombin auslösbaren Blutplättchenaggregation Ferner wurden die aktiviert-partielle Thromboplastinzeit (APTT) und die Thrombinzeit (TT) des aus den Blutproben gewonnenen Citratplasmas bestimmt. Die APTT- und TT-Werte sind in der Tabelle 6, die WBCT- und PAI-Werte in der Tabelle 7 enthalten. Tabelle 6 Die blutgerinnungshemmende Wirkung von Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H (1) und D-MePhe-Pro-Arg-H (C1) als Kontrolle an Kaninchen in einer oralen Dosis von 5 mg/kg, charakterisiert durch die im APTT- und TT-Test gefundenen relativen Gerinnungszeitena
a Verhältnis der Gerinnungszeiten der behandelten und der unbehandelten Tiere. Therapeutische Werte hervorgehoben. Tabelle 7 Die blutgerinnungshemmende und die Blutplättchenaggregation inhibierende Wirkung (PAI) von Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H (1) und D-MePhe-Pro-Arg-H (C1) als Kontrolle an Kaninchen in einer oralen Dosis von 5 mg/kg, charakterisiert durch die im WBCT- Test gefundenen relativen Gerinnungszeitena
a Verhältnis der Gerinnungszeiten der behandelten und der unbehandelten Tiere.Therapeutische Werte hervorgehoben.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen der allgemeinen Formel (I) werden zum Vorbeugen und Heilen der folgenden, mit Thrombose und/oder verstärkter Gerinnungsneigung verbundenen Zustände eingesetzt: tiefe Venenthrombose, Lungenembolie, Arterienthrombose, instabile Angina, Herzmuskelinfarkt, Vorhofflimmern und auf Thrombose beruhender Stroke. Bei Atherosklerose können die Verbindungen zum Vorbeugen gegen thrombotische Krankheiten der Herzkranzarterie und der Gehirnarterien, ferner zur chirurgischen Prophylaxe bei Kranken mit hohem Risiko oder sonstiger chirurgischer Prophylaxe verwendet werden. Darüberhinaus sind sie in Zusammenhang mit Thrombolyse oder perkutaner transluminaler Angioplastik zur Verhütung eines Neuverschlusses, ferner als ergänzende Therapie bei Haemodialyse und Nephrose und auch bei Krankheitsbildern mit gesteigerter Gerinnungsneigung, wie maligne Geschwulst- und Entzündungskrankheiten (z. B. Gelenkentzündung) und Zuckerkrankheit, geeignet. Die Verbindungen können ferner in Fällen angewendet werden, in denen die Verabreichung sonstiger gerinnungshemmender Mittel nicht genügend wirkungsvoll oder kontraindiziert ist: zum Beispiel im Fall von Heparin Mangel an Antithrombin-III oder HIT (heparin-induzierte Thrombocytopenie), im Fall der Cumarine zum Beispiel Schwangerschaft.
Für therapeutische Zwecke können die erfindungsgemäßen Verbindungen und deren pharmazeutisch akzeptablen Salze an sich oder vorzugsweise in Form pharmazeutischer Formulierungen verwendet werden. Die Erfindung bezieht sich auch auf diese Formulierungen.
Die pharmazeutischen Formulierungen enthalten in wirksamer Menge eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) oder deren physiologisch verträgliches Salz zusammen mit bekannten, physiologisch verträglichen Träger- und Füllstoffen, Lösungsmitteln und/oder sonstigen Arzneimittelhilfsstoffen.
Die erwähnten Träger-, Streck- und Füllstoffe können Wasser, Alkohole, Gelatine, Lactose, Saccharose, Stärke, Pektin, Magnesiumstearat, Stearinsäure, Talkum, unterschiedliche Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, ferner Glycole, zum Beispiel Propylenglycol oder Polyethylenglycol, sein. Die Arzneimittelhilfsstoffe sind zum Beispiel Konservierungsmittel, unterschiedliche natürliche oder synthetische Emulgatoren, Dispergier- und Netzmittel, Farbstoffe, Aromastoffe, Sprengmittel und andere, die Bioverwertbarkeit des Wirkstoffes fördernde Substanzen.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittelpräparate können in den üblichen Formulierungen vorliegen, zum Beispiel als orale Kompositionen (durch den Mund zu verabreichen wie Tabletten, Kapseln, Pulver, Pillen, Dragees oder Granulate), oder parenterale Kompositionen (Arzneimittel, die das gastrointestinale System umgehen, zum Beispiel Injektionen, Infusionen, Suppositorien, Pflaster oder Salben).
Die therapeutische Dosis der erfindungsgemäßen Verbindungen hängt vom individuellen Gesundheitszustand und dem Alter des Patienten ab und variiert dementsprechend; letztendlich wird sie vom behandelnden Arzt bestimmt. Zum Vorbeugen und/oder Heilen von Krankheiten, bei denen eine Inhibierung der Funktion und/oder der Bildung des Thrombins wünschenswert ist, werden täglich oral oder parenteral (zum Beispiel intravenös) 0,01-1000 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,25-20 mg/kg Körpergewicht, verabreicht.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, werden sie zusammen mit Thrombolytika (zum Beispiel mit tPA oder Urokinase) verabreicht, fördern die Auflösung der in den Arterien oder Venen entstandenen Thromben effizient bzw. verhindern wirkungsvoll deren Neubildung. In diesen Fällen ist es zweckmäßig, die erfindungsgemäßen Verbindungen gleichzeitig mit dem Thrombolytikum oder nach der thrombolytischen Behandlung zu verabreichen.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, schränken den Schutzumfang jedoch nicht ein.
Die in den Beispielen angegebenen Rf-Werte wurden schicht-chromatographisch (DC-Alufolien Kieselgel 60 F&sub2;&sub5;&sub4;, Merck, Darmstadt) mit folgenden Lösungsmitteln bestimmt:
1. Ethylacetat
2. Ethylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (480 : 20 : 6 : 11)
5. Ethylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (45 : 20 : 6 : 11)
6. Ethylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (240 : 20 : 6 : 11)
7. Ethylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (480 : 10 : 3 : 5,5)
9. Ethylacetat-Pyridin-Essigsäure-Wasser (120 : 20 : 6 : 11)
13. Ethylacetat-Butanol-Essigsäure-Wasser (1 : 1 : 1 : 1)
Die in den Beispielen angegebenen Kapazitätsfaktoren (k') wurden mit dem Gerät "Pharmacia LKB Analytical HPLC System Two" wie folgt bestimmt:
Säule: "VYDAC C-18 reversed phase: 10 mm, 300 Å, 4 · 250 mm"
Puffer A: 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser
Puffer B: 0,1% Trifluoressigsäure in Acetonitril.
Die angewendeten Gradienten bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min waren folgende:
I: 0-5 min 0-25% B, dann isokratisch 25% B;
II: 0-30 min 0-60% B.
Der Peptidgehalt des Eluates wurde bei 214 nm mit UV- Licht detektiert. Die Konzentration der Probe betrug 1 mg/ml Puffer A, das Injektionsvolumen 25 ul.
Der in den HPLC-Analysen angewendete Gradient (I oder II) wird in den einzelnen Schritten der Beispiele in Klammern nach der Abkürzung angegeben.
Die Acylarginin-aldehyde liegen in Gleichgewichtsformen vor: Aldehyd, Aldehydhydrat sowie zwei Aminocyclolformen. Von diesen erscheinen bei der HPLC-Analyse das Aldehydhydrat und ein oder alle beide Aminocyclole als getrennte peaks. Infolgedessen sind in den Beispielen die Acylarginin-aldehyde durch zwei oder drei k'-Werte gekennzeichnet.
Massenspektrometrie. Die FAB-Messungen der positiven Ionisation wurden mit dem Gerät Finnigan MAT 8430 vorgenommen. Die Proben wurden in einer m-Nitrobenzylalkoholmatrix gelöst und direkt in die Ionenquelle eingeführt. Im Spektrum der Peptidylarginin-aldehyde war ein zusätzliches Molekülion nachweisbar, das einer mit m-Nitrobenzylalkohol (NBA) gebildeten Additionsverbindung: [M + G]&spplus; und [M + H + NBA&spplus;]. In den Beispielen sind die FAB-Spektraldaten entsprechend angegeben.
Die ESI-Messungen der positiven Ionisation wurden mit einem Gerät VG Quattro (Fisons) vorgenommen. Die Proben wurden in einem 1 : 1-Gemisch aus Acetonitril und Wasser, das 1 Vol.-% Ameisensäure enthielt, gelöst und dann unter Verwendung einer 10 ml-Probenschleife, während die Strömungsgeschwindigkeit der Schleppflüssigkeit 15-25 ml/min betrug, in die Ionenquelle eingeführt.
Die spezifischen Drehvermögen ([α]D) wurden bei 20ºC gemessen.

Beispiel 1

Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd (Eoc-D-Cba-Pro-Arg-H) Hemisulfat

Schritt 1: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam

3,28 g (8,4 mMol) t-Butoxycarbonyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam [S. Bajusz et al.: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] werden in 8 ml Chloroform suspendiert, und die Suspension wird unter ständigem Rühren und Eiskühlung mit 8 ml salzsaurem Ethylacetat (Sättigungsgrad 0,11-0,15 g HCl/ml) versetzt. Die Reaktion wird dünnschichtchromatographisch verfolgt [Rf(9) = 0,91 (Boc-Verbindung); 0,07 (freie Verbindung)]. Am Ende der Reaktion wird das Reaktionsgemisch mit 18 ml Diethylether verdünnt, die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit 5 ml Aceton und 5 ml Diethylether gewaschen und in einem Vakuumexsikkator über Kaliumhydroxyd getrocknet. Das erhaltene NG-Benzyloxycarbonyl-L-argininlactam-hydrochlorid wird in 8 ml Dimethylformamid gelöst, auf -20ºC gekühlt und zu dem wie folgt hergestellten gemischten Anhydrid gegeben.
2,5 g (8 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L- prolin (Beispiel 1, Schritt E) werden in 8 ml Dimethylformamid gelöst und auf -20ºC gekühlt. Unter ständigem Rühren werden 0,9 ml (8 mMol) N-Methylmorpholin und 1,05 ml (8 mMol) Chlorkohlensäureisobutylester zugesetzt, dann werden nach 10minütigem Rühren die oben beschriebene NG-Benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactamlösung und 2,35 ml (16,8 mMol) Triethylamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 30 Minuten lang bei -10ºC und dann eine Stunde lang bei 0ºC gerührt. Die Salze werden abfiltriert und verworfen, und das Filtrat wird mit 40 ml Benzol verdünnt. Die Lösung wird dreimal mit je 10 ml Wasser, dann mit 10 ml 1M KHSO&sub4;-Lösung und dann wieder dreimal mit je 10 ml Wasser gewaschen, mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Das erhaltene Produkt wird auf eine Säule aus 70 g Kieselgel 60 aufgebracht und mit Ethylacetat eluiert. Die die reine Substanz [Rf(I) = 0,50] enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, und das Lösungsmittel wird bei einem Druck von 2,0- 2,5 kPa verdampft. Der ölige Rückstand wird mit Petrolether verrieben, filtriert und getrocknet.
Ausbeute: 3,0 g (64%),
Rf(1) = 0,50,
[α]D = -47,4º (c = 1, THF).
Das FAB-Massenspektrum bestätigt die angenommene Struktur (585[M + H]&spplus;).

Schritt 2: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd

2,27 g (4,6 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl- L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam (Beispiel 1, Schritt 1) werden in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter ständigem Rühren bei wenigstens -50ºC mit einer Lösung von 3,6 mMol Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran versetzt. Das Voranschreiten der Reaktion wird dünnschichtchromatographisch mit dem Losungsmittelsystem (6) verfolgt und erforderlichenfalls weiteres Lithiumaluminiumhydrid zugegeben. Unter ständigem Rühren und Kühlen wird das Reaktionsgemisch mit vorgekühlter 0,5 M Schwefelsäure versetzt, bis der pH-Wert 3 beträgt. Die entstandene Lösung wird zweimal mit je 15 ml n-Hexan und dann dreimal mit je 20 ml Dichlormethan extrahiert. Die Dichlormethanphasen werden vereinigt, dreimal mit je 15 ml Wasser, einmal mit 15 ml kalter 5%iger NaHCO&sub3;-Lösung und dann wieder mit 15 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Benzol gelöst und mit Cyclohexan ausgefällt. Nach dem Filtrieren und Trocknen erhält man 1,8 g (65%) Produkt.
Rf(6) = 0,30,
[α]D = -30,8º (c = 1, THF).
Das FAB-Massenspektrum bestätigt die angenommene Struktur (587[M + H]&spplus;).

Schritt 3: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd-hemisulfat

1,58 g (2,7 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl- L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd (Beispiel 1, Schritt 2) werden in 14 ml Ethanol gelöst. Die Lösung wird mit 2,7 ml 0,5 M Schwefelsäure, 3,2 ml Wasser und einer Suspension von 0,17 g Pd/C-Katalysator in 6 ml Ethanol versetzt und dann bei 10ºC hydriert. Die Reaktion, deren Voranschreiten dünnschichtchromatographisch verfolgt wird, ist nach 15 Minuten beendet. Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa auf ein Volumen von 7-9 ml eingeengt. Der Rückstand wird mit 20 ml Wasser verdünnt, mit 6 ml Dichlormethan extrahiert und die wäßrige Lösung bei Raumtemperatur 24 Stunden lang stehengelassen. Dann wird der pH-Wert mit Dowex AG 1-XB-Harz in OH-Form auf 3,5 eingestellt, und die Lösung wird gefriergetrocknet.
Ausbeute: 1,0 g (78%),
Rf(5) = 0,44,
[α]D = -75,5º (c = 1, Wasser).
HPLC(I): k' = 5,53; 6,20 und 7,17.
Das FAB-Massenspektrum bestätigt die angenommene Struktur (453[M + H]&spplus;).
Der Ausgangsstoff kann wie folgt hergestellt werden:

Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolin (Eoc-D-Cba-Pro)

Schritt A: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanin

10 g (70 mMol) 3-Cyclobutyl-DL-alanin [A. Burger et al., J. Med. Chem. 6, 221 (1963)] werden in 70 ml 2M Natronlauge gelöst, auf +5ºC gekühlt und unter ständigem Rühren tropfenweise mit 11,1 ml (116,2 mMol) Chlorkohlensäureethylester versetzt. Das Rühren wird bei dieser Temperatur noch zwei Stunden lang, dann zwei weitere Stunden lang bei Raumtemperatur fortgesetzt. Dann wird das Reaktionsgemisch mit 20 ml Diethylether gewaschen, dann die Lösung auf pH 1 angesäuert und dreimal mit je 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Das verbleibende Öl wird als das reine Produkt betrachtet [Ausbeute: 13,1 g (87%), Rf(7) = 0,8] und ohne weitere Reinigung im folgenden Schritt eingesetzt.

Schritt B: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanin-methylester

11 g (51 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanin (Beispiel 1, Schritt A) werden in 100 ml Methanol gelöst, auf -15ºC gekühlt und unter ständigem Rühren mit 10 ml (137 mMol) Thionylchlorid versetzt. Das Rühren wird ohne weitere Kühlung fortgesetzt. Wenn das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gekommen ist, wird noch zwei Stunden lang gerührt Dann wird die Lösung bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Das verbleibende Öl wird in 40 ml Ethylacetat gelöst, mit 10 ml 1N HCl, dann zweimal mit je 10 ml 5%iger NaHCO&sub3;-Lösung und zweimal mit je 10 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird als das reine Produkt betrachtet [Ausbeute: 10,8 g (92%), Rf(1) = 0,85; Rf(6) = 0,65] und ohne weitere Reinigung im folgenden Schritt eingesetzt.

Schritt C: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanin-methylester

Die enzymatische Hydrolyse der Acylaminosäuremethylester kann bei pH = 7,5 in einem automatischen Titrator vorgenommen werden, der zwei Reaktionsgefäße hat (eines mit 100 ml und eines mit 250 ml Volumen). Das Reagens ist 1M Natronlauge.
10,8 g (47 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alaninmethylester (hergestellt in Schritt B) werden in dem 250-ml- Gefäß des Titrators in 20 ml Benzol gelöst Nach Zugabe von 100 ml Wasser wird der pH der Lösung unter Rühren mit 1M Natronlauge auf 7,5 gestellt. Dann werden 40 mg Enzym [Subtilisin Carlsberg, Protease, Type VIII (Sigma)] zugegeben, der pH wird erneut auf 7,5 gestellt und während der Titration auf diesem Wert gehalten. Die enzymatische Hydrolyse ist nach 3 Stunden beendet. Die Phasen werden voneinander getrennt. Aus der wäßrigen Phase kann reines Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-L- alanin isoliert werden. Die Benzolphase wird zweimal mit je 10 ml 5%iger NaHCO&sub3;-Lösung und zweimal mit je 10 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Das erhaltene gelbliche Öl wird als das reine Produkt betrachtet und ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt eingesetzt.

Schritt D: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanin

Das ölige Produkt von Schritt C wird in 20 ml Ethanol gelöst und mit 10 ml 2,5 M Natronlauge versetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt und dann bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml Wasser gelöst, die Lösung mit 10 ml Diethylether gewaschen, mit 3M Salzsäure auf pH = 1 angesäuert und dreimal mit je 10 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Ausbeute: 4,3 g (90%) eines öligen Produktes [Rf(2) = 0,8]. Der größere Teil davon wird im nächsten Schritt verwendet, der Rest wird wie folgt zu einem kristallinen Salz umgesetzt.
0,43 g (2 mMol) des öligen Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl- D-alanins (Beispiel 1, Schritt D) werden in 10 ml Diethylether gelöst und mit 0,23 ml (2,1 mMol) Cyclohexylamin versetzt. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute: 0,57 g (90%),
Fp.: 129-131ºC,
[α]D = 3,93º (c = 1, Methanol).
Elementaranalyse für C&sub1;&sub6;H&sub3;&sub0;N&sub2;O&sub4; (314,42):
Berechnet: C = 61,12%; H = 9,62%; N = 8,91%
Gefunden: C = 61,30%; H = 9,80%; N = 8,60%.

Schritt E: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolin

3,7 g (12,7 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanin (Beispiel 1, Schritt D) werden in 60 ml Tetrahydrofuran gelöst, auf 0ºC gekühlt und mit 4,85 g (24,5 mMol) 2,4,5- Trichlorphenol sowie 5,06 g (24,5 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt, der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und mit Tetrahydrofuran gewaschen Das mit der Waschflüssigkeit vereinte Filtrat wird bei einem Druck von 2,0- 2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird in 25 ml eines Gemisches aus Diethylether und Petrolether (1 : 1) gelöst, der unlösliche Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat erneut eingedampft [Menge des abfiltrierten Dicyclohexylharnstoffs: 4,9 g (89%) bzw. 0,6 g (11%)]. Der ölige Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanin-2,4,5-trichlorphenylester wird in 40 ml Pyridin gelöst und mit 2,12 g (18,4 mMol) feinpulverisiertem L-Prolin sowie mit 3,43 g (24,6 mMol) Triethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 3 Stunden lang gerührt und dann bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird zwischen 50 ml Ethylacetat und 50 ml 1M HCl verteilt. Die organische Phase wird zunächst mit 10 ml 1M HCl, dann zweimal mit je 10 ml Wasser gewaschen und dreimal mit je 100 ml 5%iger NaHCO&sub3;-Lösung extrahiert. Die vereinigten Hydrogencarbonatextrakte werden mit 6M HCl auf pH 3 angesäuert und dreimal mit je 20 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten etherischen Extrakte werden mit Wasser säurefrei gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann zur Trockne eingedampft.
Ausbeute: 3,2 g (60%) Öl,
Rf(6) = 0,49.
Das FAB-Massenspektrum (313[M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Beispiel 2

Methoxyvcarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd (MOC-D-Cba-Pro-Arg- H) Hemisulfat

Schritt 1: Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-laktam

Man geht von 1,64 g (4,2 mMol) t-Butoxycarbonyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam [5. Bajusz et al.: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] und 1,25 g (4,0 mMol) Methoxycarbonyl- 3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolin (Beispiel 2, Schritt C) aus und nimmt die Kopplung der Komponenten sowie die chromatographische Reinigung des Endproduktes auf die im Schritt 1 des Beispiels 1 beschriebene Weise vor, wobei jeweils proportionale Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln verwendet werden. Die reines Endprodukt enthaltenden Fraktionen [Rf(1) = 0] werden vereinigt und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird mit Petrolether verrieben, filtriert und im Exsikkator über Paraffin und Phosphorpentoxyd getrocknet.
Ausbeute: 1,15 g (50%),
Rf(2) = 0,45-0,47.
[α]D = -43,5º (c = 1, THF).
Das FAB-Massenspektrum (571[M + H]&spplus;, 724 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 2: Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd

1,06 g (1,8 mMol) Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl- L-prolyl-L-arginin-lactam (Beispiel 2, Schritt 1) werden auf die im Schritt 2 des Beispiels 1 beschriebene Weise unter Verwendung proportionaler Mengen von Reagentien und Lösungsmitteln reduziert.
Ausbeute: 0,76 g (73%),
Rf(9) = 0,47,
[α]D = -37,5º (c = 1, THF).
Das FAB-Massenspektrum (573[M + H]&spplus;, 726 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 3: Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd-hemisulfat

0,69 g (1,2 mMol) Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl- L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd (Beispiel 2, Schritt 2) werden auf die im Schritt 3 des Beispiels 1 beschriebene Weise unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln einer Hydrogenolyse unterzogen.
Ausbeute: 0,53 g (91%),
HPLC(II): k' = 4,74; 5,47 und 5,82,
[α]D = -60,9º (c = 1, Wasser).
Das FAB-Massenspektrum (439[M + H]&spplus;, 592 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.
Die Ausgangsverbindung kann wie folgt hergestellt werden:

Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolin (MOC-D- Cba-Pro)

Schritt A: Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanin

4,3 g (30 mMol) 3-Cyclobutyl-DL-alanin [A. Burger et al., J. Med. Chem. 6, 221 (1963)] werden in 15 ml 2M Natronlauge gelöst, auf 0ºC gekühlt und unter energischem Rühren gleichzeitig mit 16,5 ml 2M NaOH und 2,55 ml (33 mMol) Methoxycarbonylchlorid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei 0ºC noch 30 Minuten lang und dann bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt, mit 40 ml Wasser verdünnt und mit 10 ml Ethylether extrahiert. Nach Einstellen des pH-Wertes auf 3 mit 3M HCl wird das Produkt mit 4 · 20 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden mit 20 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der ölige Rückstand [5,3 g (88%), Rf(7) = 0,61] wird ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt eingesetzt.

Schritt B: Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanin

5,03 g (25 mMol) Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanin (Beispiel 2, Schritt A) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die in den Schritten B-D des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt. Ausbeute: 2,22 g (11 mMol) eines öligen Produktes.
Rf(7) = 0,61.

Schritt C: Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolin

1,21 g (6 mMol) Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanin (Beispiel 2, Schritt B) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt E des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt. Ausbeute: 1,6 g (5,4 mMol, 90%) eines öligen Produktes [Rf(9) = 0,48], dessen größerer Teil unmittelbar in Schritt 1 eingesetzt wird, während aus dem Rest auf folgende Weise ein kristallines Salz hergestellt wird.
0,30 g (1 mMol) des öligen Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl- D-alanyl-L-prolins werden in 5 ml Diethylether gelöst und mit 0,21 ml (1,05 mMol) Dicyclohexylamin versetzt. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute: 0,43 g (90%),
Fp.: 149,5-164ºC.
Elementaranalyse für C&sub2;&sub4;H&sub4;&sub5;N&sub3;O&sub5; (478,64):
Berechnet: C = 65,10%; H = 9,46%; N = 8,76%
Gefunden: C = 60,4%; H = 9,98%; N = 10,47%.

Beispiel 3

Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyt-D-alanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd (iPoc-D-Cba-Pro-Arg-H) Hemisulfat

Schritt 1: Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl- NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-Iactam

Man geht von 0,43 g (1,1 mMol) t-Butoxycarbonyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam [5. Bajusz et al.: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] und 0,33 g (1 mMol) Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolin (Beispiel 3, Schritt C) aus und nimmt die Kopplung der Komponenten sowie die chromatographische Reinigung des Endproduktes auf die im Schritt 1 des Beispiels 1 beschriebene Weise vor, wobei jeweils proportionale Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln verwendet werden. Die reines Endprodukt enthaltenden Fraktionen [Rf(1) = 0,55] werden vereinigt und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird mit Petrolether verrieben, filtriert und im Exsikkator getrocknet.
Ausbeute: 0,3 g (50%),
Rf(1) = 0,55.
Das FAB-Massenspektrum (599[M + H]&spplus;, 752 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 2: Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl- NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd

0,26 g (0,43 mMol) Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D- alanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam (Beispiel 2, Schritt 1) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 2 des Beispiels 2 beschriebene Weise hydriert.
Ausbeute: 0,15 g, Rf(6) = 0,30.
Das FAB-Massenspektrum (601 [M + H]&spplus;, 754 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 3: Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd-hemisulfat

0,13 g (0,2 mMol) Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D- alanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd (Beispiel 2, Schritt 2) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 3 des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt.
Ausbeute: 0,07 g (75%),
HPCL(I): k' = 3,69; 4,15 und 5,04.
Das FAB-Massenspektrum (467[M + H]&spplus;, 620 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.
Die Ausgangssubstanz kann wie folgt hergestellt werden:

Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolin (iPoc-D-Cba-Pro)

Schritt A: 3-Cyclobutyl-D-alanin

Zu 1,0 g (5 mMol) Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanin (Beispiel 2, Schritt 2) werden 10 ml 6M HCl gegeben, und das Gemisch wird am Rückfluß 3 Stunden lang gekocht. Die Lösung wird bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft, der Rückstand in 5 ml Wasser gelöst, die Lösung zur Trockne eingedampft und der Vorgang wiederholt. Die Wasserspuren können durch azeotrope Destillation mit einem Ethanol-Benzol- Gemisch entfernt werden. Das zurückbleibende Öl wird in 10 ml Ethanol gelöst und mit 5 mMol 1,2-Epoxypropan versetzt. Das Gemisch wird gekühlt, der Niederschlag abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und dann getrocknet.
Ausbeute: 0,65 g (90%) 3-Cyclobutyl-D-alanin,
Rf(13) = 0,65,
[α]D = -34,7º (c = 1,1 M HCl).
Elementaranalyse für C&sub7;H&sub1;&sub3;NO&sub2;:
Berechnet: C = 58,71%; H = 9,15%; N = 9,78%
Gefunden: C = 58,70%; H = 9,30%; N = 9,50%.

Schritt B: Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanin

0,57 g (4 mMol) 3-Cyclobutyl-D-alanin werden in 8 ml eines im Verhältnis 1 : 1 bereiteten Gemisches aus 1M NaOH und Dioxan gelöst. Das Gemisch wird auf 0ºC gekühlt und unter energischem Rühren gleichzeitig mit 4 ml 1M Natronlauge und 4 ml Isopropoxycarbonylchloridlösung (1M in Toluol) versetzt. Das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei 0ºC und dann 5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dioxan und Toluol werden bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa abdestilliert. Die verbleibende wäßrige Lösung wird mit 5 ml Diethylether gewaschen und dann mit 1M KHSO&sub4;-Lösung auf pH 3 angesäuert. Die Emulsion wird dreimal mit je 5 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Eindampfen bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa erhält man 0,83 g (90%) Produkt.
Rf(6) = 0,60.
[α]D = +9,5º (c = 0,5, Methanol).

Schritt C: Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolin

0,46 g (2 mMol) Isopropoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanin (Beispiel 3, Schritt B) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt E des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt.
Ausbeute: 1,3 g (4,35 mMol, 87%) Öl.
Rf(2) = 0,40.
Das FAB-Massenspektrum (327[M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Beispiel 4

Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd (Eoc-D-Cpa-Pro-Arg-H) Hemisulfat

Schritt 1: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam

2,93 g (7,5 mMol) t-Butoxycarbonyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam [S. Bajusz et al.: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] und 2,3 g (7,1 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D- alanyl-L-prolin (Beispiel 4, Schritt C) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 1 des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt. Die das reine Endprodukt enthaltenden Fraktionen [Rf(1) = 0,55] werden vereinigt und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Das verbleibende Öl wird mit n-Hexan verrieben, abfiltriert, mit n-Hexan gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute: 2,5 g (59%),
Rr(1) = 0,55,
[α]D = -48,6º (c = 1, THF).
Das FAB-Massenspektrum (599[M + H]&spplus;, 752 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 2: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd

2,34 g (3,9 mMol Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl- L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam (Beispiel 4, Schritt 1) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 2 des Beispiels 1 beschriebene Weise reduziert.
Ausbeute: 1,75 g (74,7%),
Rf(6) = 0,42,
[α]D = -34,4º (c = 1, THF).
Das FAB-Massenspektrum (601 [M + H]&spplus;, 754 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 3: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd-hemisulfat

1,59 g (2,65 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D- alanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd (Beispiel 4, Schritt 2) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 3 des Beispiels 1 beschriebene Weise hydriert.
Ausbeute: 1,13 g (83%),
Rf(3) = 0,37,
[α]D = -34,4º (c = 1, Wasser),
HPLC(I): k' = 4,76; 5,40 und 7,32.
Das FAB-Massenspektrum (467[M + H]&spplus;, 620 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.
Die Ausgangssubstanz kann wie folgt hergestellt werden:

Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolin (Eoc-D-Cpa-Pro)

Schritt A: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanin

7,87 g (50 mMol) 3-Cyclopentyl-DL-alanin [P. R. Pal et al., J. Am. Chem. Soc. 78, 5116 (1956)] werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt A des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt mit dem Unterschied, daß das Produkt aus dem Reaktionsgemisch mit 2 · 50 ml Diethylether extrahiert, die etherische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft wird. Ausbeute: 10,55 g (98%) eines weißen, amorphen Pulvers [Rf(2) = 0,84], das ohne weitere Reinigung im nächsten Schritt eingesetzt wird.

Schritt B: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanin

7,8 g (34 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanin (Beispiel 4, Schritt A) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die in den Schritten B, C und D des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt. Ausbeute: 3,45 g (88,6%) eines Öles [Rf(6) = 0,062], dessen größerer Teil unmittelbar im Schritt C eingesetzt wird. Aus dem Rest wird wie folgt ein kristallines Salz hergestellt:
0,46 g (2 mMol) des öligen Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl- D-alanins werden in 10 ml Diethylether gelöst und mit 0,42 ml (2,1 mMol) Dicyclohexylamin versetzt. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute 0,74 g (90%) eines kristallinen Salzes.
Fp.: 138-140ºC,
[α]D = -1,5º (c = 1, Methanol).
Elementaranalyse für C&sub2;&sub3;H&sub4;&sub2;N&sub2;O&sub4; (410,58):
Berechnet: C = 67,28%; H = 10,31%; N = 6,81%
Gefunden: C = 67,40%; H = 10,40%; N = 6,80%.

Schritt C: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolin

2,43 g (10,5 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanin (Beispiel 4, Schritt B) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt E des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt. Der erhaltene 2,4,5-Trichlorphenylester wird mit 1,15 g (10 mMol) L-prolin gekoppelt. Man erhält 2,3 g (71%) eines öligen Produktes. Rf(6) = 0,53.
Das FAB-Massenspektrum (327[M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Synthese der Kontrollverbindungen

Synthese 1

Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd (Eoc-D-Phe-Pro-Arg-H) Hemisulfat

Schritt 1: Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam

Man geht von 2,3 g (5,8 mMol) t-Butoxycarbonyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam [S. Bajusz et al.: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] und 1,67 g (5 mMol) Ethoxycarbonyl-3- phenyl-D-alanyl-L-prolin (Synthese 1, Schritt C) aus und nimmt die Kopplung der Komponenten sowie die Reinigung des Produktes auf die im Schritt 1 des Beispiels 1 beschriebene Weise vor, wobei jeweils proportionale Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln verwendet werden. Die reines Endprodukt enthaltenden Fraktionen [Rf(1) = 0,37] werden vereinigt und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird im Vakuumexsikkator getrocknet. Ausbeute: 1,18 g (60%) eines Öles.
Das FAB-Massenspektrum (607[M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 2: Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd

0,9 g (1,5 mMol) Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L- prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam (Synthese 1, Schritt 1) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 2 des Beispiels 1 beschriebene Weise reduziert.
Ausbeute: 0,33 g (36%),
Rf(1) = 0, 16.

Schritt 3: Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd-hemisulfat

0,33 g (0,54 mMol) Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L- prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd (Synthese 1, Schritt 2) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 3 des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt.
Ausbeute: 0,26 g (92%),
HPLC(I): k' = 4,00; 4,45 und 5,45.
Das FAB-Massenspektrum (475[M + H]&spplus;, 628 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolin (Eoc-D-Phe-Pro)

Schritt A: Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanin

16,5 g (0,1 Mol) 3-Phenyl-D-alanin werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt A des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt mit dem Unterschied, daß das Endprodukt, ein Öl, nachdem das Ethylacetat aus seiner Lösung entfernt wurde, im Vakuumexsikkator getrocknet wird.
Ausbeute: 14,6 g (55%),
Rf(9) = 0,70.

Schritt B: Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanin-N-hydroxysuccinimidester

14,5 g (55,4 mMol) Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanin (Synthese 1, Schritt A) und 6,4 g (56 mMol) N-hydroxysuccinimid werden in 60 ml Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird auf 0ºC gekühlt und unter Rühren mit 11,5 g (56 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird bei 0ºC noch 10 Stunden lang gerührt, dann filtriert und das Filtrat bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird aus Benzol kristallisiert. Die Kristalle werden abfiltriert, mit Benzol und Diethylether gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet. Ausbeute: 11,3 g (60%),
Rf(10) = 0,53,
[α]D = +58,1º (c = 1, Dimethylformamid).
Das FAB-Massenspektrum (335[M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.
Elementaranalyse für C&sub1;&sub6;H&sub1;&sub8;N&sub2;O&sub6; (334,33):
Berechnet: C = 57,48%; H = 5,42%; N = 8,30%
Gefunden: C = 57,40%; H = 5,40%; N = 8,30%.

Schritt C: Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolin

3,34 g (10 mMol) Ethoxycarbonyl-3-phenyl-D-alaninhydroxy-succinimidester (Synthese 1, Schritt B) werden in 15 ml Pyridin gelöst und mit 1,15 g (10 mMol) L-Prolin und 1,4 ml (10 mMol) Triethylamin versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur 10 Stunden lang gerührt und dann bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird zwischen 30 ml 5%iger NaHCO&sub3;-Lösung und 10 ml Diethylether verteilt. Die wäßrige Phase wird dreimal mit je 5 ml Diethylether gewaschen, und die vereinigten organischen Waschflüssigkeiten werden mit 5%iger NaHCO&sub3;-Lösung extrahiert. Die Hydrogencarbonatphasen werden vereinigt, mit 1M KHSO&sub4;- Lösung auf pH 3 angesäuert und dreimal mit je 10 ml Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Diethylether kristalliert. Die Kristalle werden abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute: 2,6 g (77%),
Fp.: 141-143ºC,
Rf(6) = 0,40.
Das FAB-Massenspektrum (335[M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.
Elementaranalyse für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub2;N&sub2;O&sub5; (334,33):
Berechnet: C = 61,06%; H = 6,63%; N = 8,38%
Gefunden: C = 61,10%; H = 6,70%; N = 8,1%.

Synthese 2

Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd (Moc-D-Phe-Pro-Arg-H) Hemisulfat

Schritt 1: Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam

Man geht von 4,1 g (10,5 mMol) t-Butoxycarbonyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam [5. Bajusz et al.: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] und 2,88 g (9 mMol) Methoxycarbonyl- 3-phenyl-D-alanyl-L-prolin (Synthese 2, Schritt C) aus und nimmt die Kopplung auf die im Schritt 1 des Beispiels 1 beschriebene Weise vor, wobei jeweils proportionale Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln verwendet werden. Das rohe Produkt wird durch Kristallisieren aus Cyclohexan gereinigt.
Ausbeute: 4,65 g (86%),
Fp.: 72-82,7ºC,
Rf(2) = 0,56.
[α]D = +72,9º (c = 1, THF).
Das FAB-Massenspektrum (593[M + H]&spplus;, 746 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 2: Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd

4,13 g (7 mMol) Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L- prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam (Synthese 2, Schritt 1) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 2 des Beispiels 1 beschriebene Weise reduziert mit dem Unterschied, daß nach dem Eindampfen des Dichlormethans das ölige Endprodukt aus Diethylether kristallisiert wird. Die Kristalle werden abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute: 3,06 g (74%),
Fp.: 103-107ºC,
Rf(6) = 0,44,
[α]D = -69º (c = 1, THF).
Das FAB-Massenspektrum (595[M + H]&spplus;, 748 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 3: Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd-hemisulfat

2,68 g (4,5 mMol) Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L- prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd (Synthese 2, Schritt 2) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 3 des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt.
Ausbeute: 2,15 g (94%),
[α]D = -87,6º (c = 1, Wasser).
HPLC(I): k' = 3,3; 3,57 und 4,09.
Das FAB-Massenspektrum (461[M + H]&spplus;, 614 [M + H + NBA&spplus;]) bestätigt die angenommene Struktur.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolin (Moc-D-Phe-Pro)

Schritt A: Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanin-dicyclohexyl-aminsalz

5 g (30 mMol) D-Phenylalanin werden in 15 ml 2M Natronlauge gelöst, auf 0ºC gekühlt und gleichzeitig mit 16,5 ml 2M Natronlauge und 2,55 ml (33 mMol) Methoxycarbonylchlorid versetzt. Das Gemisch wird bei 0ºC 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gerührt. Das mit 40 ml Wasser verdünnte Gemisch wird mit 10 ml Diethylether gewaschen, mit 3M HCl auf pH 3 angesäuert und dann viermal mit je 20 ml Ethylacetat gewaschen. Die vereinigten organischen Phasen werden mit 20 ml Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird in 60 ml Diisopropylether gelöst und mit 6 ml (30 mMol) Dicyclohexylamin versetzt. Die ausgefallenen Kristalle werden abfiltriert, mit Diisopropylether gewaschen und an der Luft getrocknet.
Ausbeute: 11,5 g (28,5%),
Rf(2) = 0,56,
Fp.: 167-170ºC,
[α]D = -37,9º (c = 0,5, Ethanol).
Elementaranalyse für C&sub2;&sub3;H&sub3;&sub6;N&sub2;O&sub4; (404,53):
Berechnet: C = 68,28%; H = 8,97%; N = 6,92%
Gefunden: C = 68,30%; H = 9,15%; N = 6,75%.

Schritt B: Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanin-2,4,5- trichlorphenylester

11,3 g (28 mMol) Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanindicyclohexalammoniumsalz (Synthese 2, Schritt A) werden zwischen 75 ml Ethylacetat und 30,5 ml 1M KHSO&sub4;-Lösung verteilt. Die Phasen werden voneinander getrennt, die organische Phase wird mit Wasser neutral gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa auf ein Volumen von 15 ml eingeengt. Zu dem etwa auf 0ºC gekühlten Rückstand werden 5,5 g (28 mMol) 2,4,5- Trichlorphenol und 5,75 g (28 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid gegeben, und das Reaktionsgemisch wird über Nacht stehengelassen. Der ausgefallene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert, und das Filtrat wird eingedampft. Der ölige Rückstand wird aus Ethanol kristallisiert. Die Kristalle werden abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute: 6,86 g (61%),
Fp.: 109-110ºC,
Rf(4) = 0,84.
Elementaranalyse für C&sub1;&sub7;H&sub1;&sub4;NO&sub4;Cl&sub3; (402,66):
Berechnet: C = 50,70%; H = 3,50%; N = 3,48% Cl = 26,42%
Gefunden: C = 50,80%; H = 3,20%; N = 3,40% Cl = 26,60%.

Schritt C: Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl-L-prolin

4,83 g (12 mMol) Methoxycarbonyl-3-phenyl-D-alanyl- 2,4,5-trichlorphenylester (Synthese 2, Schritt B) werden in 12 ml Pyridin gelöst. Zu der Lösung werden unter Rühren 1,38 g (12 mMol) fein pulverisiertes L-Prolin und 1,68 ml (12 mMol) Triethylamin gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 16 Stunden lang gerührt und dann bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird in 40 ml 5%iger NaHCO&sub3;-Lösung gelöst und die Lösung dreimal mit je 7 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigten etherischen Phasen werden mit 7 ml 5%iger NaHCO&sub3;-Lösung gewaschen. Die vereinigten Hydrogencarbonatphasen werden mit 3M HCl auf pH 3 angesäuert und dreimal mit je 10 ml Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird aus Diethylether kristallisiert. Die Kristalle werden abfiltriert, mit Diethylether gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute: 3,05 g (79%),
Fp.: 154-157ºC,
Rf(2) = 0,47.
Das FAB-Massenspektrum (321[M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Synthese 3

Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-atanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd (Eoc-DL-Cba-Pro-Arg-H) Hemisulfat

Schritt 1: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam

Man geht von 1,35 g (3,46 mMol) t-Butoxycarbonyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam [S. Bajusz et al.: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] und 1,03 g (3,3 mMol) Ethoxycarbonyl- 3-cyclobutyl-DL-alanyl-L-prolin (Synthese 3, Schritt A) aus und nimmt die Kopplung der Komponenten sowie die chromatographische Reinigung des Produktes auf die im Schritt 1 des Beispiels 1 beschriebene Weise vor, wobei jeweils proportionale Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln verwendet werden Die reines Endprodukt enthaltenden Fraktionen [Rf(1) = 0,50] werden vereinigt und bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft. Der Rückstand wird mit n-Hexan verrieben, abfiltriert, mit n-Hexan gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute: 1,0 g (51%),
Rf(1) = 0,50.
Das ESI-Massenspektrum (585(M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 2: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanyl-L-prolyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd

0,94 g (1,6 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-3-D-L- alanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam (Synthese 3, Schritt 1) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 2 des Beispiels 1 beschriebene Weise reduziert.
Ausbeute: 0,64 g (68%),
Rf(6) = 0,30.
Das ESI-Massenspektrum (587 [M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 3: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanyl-L-prolyl-L- argininin-aldehyd-hemisulfat

0,59 g (1,0 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanyl- L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd (Synthese 3, Schritt 2) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 3 des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt.
Ausbeute: 0,39 g (78%),
HPLC(I): k' = 5,55; 6,27 und 7,09.
Das FAB-Massenspektrum (453 [M + H]&spplus;, 606 [M + H + NBA]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanyl-L-prolin (Eoc-DL-Cba-Pro)

Schritt A: Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanyl-L-prolin

1,13 g (5,25 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-DL-alanin (Beispiel 1, Schritt A) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt E des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt. Der erhaltene ölige 2,4,5-Trichlorphenylester wird dann mit 0,58 g (5,0 mMol) fein pulverisiertem L-Prolin gekoppelt.
Ausbeute: 1,1 g (71%) eines Öles.
Rf(6) = 0,53.
Das ESI-Massenspektrum (313 [M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Synthese 4

Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd (Eoc-DL-Cpa-Pro-Arg-H) Hemisulfat

Schritt 1: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanyl-L-prolyl- NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam

Man geht von 3,7 g (9,5 mMol) t-Butoxycarbonyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam [S. Bajusz et al., J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] und 2,94 g (9,0 mMol) Ethoxycarbonyl-3- cyclopentyl-DL-alanyl-L-prolin (Synthese 4, Schritt A) aus und setzt die Verbindungen unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 1 des Beispiels 1 beschriebene Weise um. Die das reine Endprodukt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, bei einem Druck von 2,0-2,5 kPa eingedampft, und der Rückstand wird mit n-Hexan verrieben. Das feste Produkt wird abfiltriert, mit n-Hexan gewaschen und im Vakuumexsikkator getrocknet.
Ausbeute: 2,87 g (54%),
Rf(1) = 0,55.
Das ESI-Massenspektrum (599 [M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 2: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanyl-L-prolyl- NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd

2,75 g (4,6 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-L- alanyl-L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam (Synthese 4, Schritt 1) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 2 des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt.
Ausbeute: 1,74 g (64%),
Rf(6) = 0,42.

Das ESI-Massenspektrum (601 [M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Schritt 3: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd-hemisulfat
1,2 g (2,0 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanyl- L-prolyl-NG-benzyloxycarbonyl-L-arginin-aldehyd (Synthese 4, Schritt 2) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt 3 des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt.
Ausbeute: 0,8 g (78%),
HPLC(I): k' = 3,96; 4,4 und 4,92.
Das FAB-Massenspektrum (467 [M + H]&spplus;, 620 [M + H + NBA]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanyl-L-prolin (Eoc-DL-Cpa-Pro)

Schritt A: Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanyl-L-prolin

3,1 g (13,5 mMol) Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-DL-alanin (Beispiel 4, Schritt A) werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die im Schritt E des Beispiels 1 beschriebene Weise umgesetzt. Der erhaltene ölige 2,4,5-Trichlorphenylest er wird dann mit L-Prolin gekoppelt.
Ausbeute: 3,1 g (74%),
Rf(6) = 0,50.
Das ESI-Massenspektrum (327 [M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

Synthese 5

Ethoxycarbonyl-DL-cyclobutyl-glycyl-L-prolyl-L- arginin-aldehyd (Eoc-DL-Cbg-Pro-Arg-H) Hemisulfat

Man geht von 1,2 g (3,0 mMol) t-Butoxycarbonyl-NG- benzyloxycarbonyl-L-arginin-lactam [S. Bajusz et al., J. Med. Chem, 33, 1729 (1990)] und 0,69 g (2,3 mMol) Ethoxycarbonyl- DL-cyclobutyl-glycyl-L-prolin (Synthese 5, Schritt A) aus. Die Kopplung zu dem entsprechenden geschützten Tripeptidlactam [Rf(1) = 0,32], die Reduktion zu dem geschützten Tripeptidaldehyd [Rf(9) = 0,53] und die Entfernung der Schutzgruppe werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln auf die in den Schritten 1, 2 und 3 des Beispiels 1 beschriebene Weise vorgenommen.
Ausbeute: 0,22 g,
HPLC(I): k' = 2,74; 2,96 und 3,41.
Das FAB-Massenspektrum (439 [M + H]&spplus;, 592 [M + H + NBA]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.
Das Ausgangsmaterial kann wie folgt hergestellt werden:

Ethoxycarbonyl-DL-cyclobutyl-glycyl-L-prolin (Eoc-DL-Cbg-Pro)

Schritt A: Ethoxycarbonyl-DL-cyclobutyl-glycyl-L-prolin

0,78 g (6,0 mMol) DL-Cyclobutyl-glycin [T. H. Porter et al., Arch. Biochem. Biophys., 179, 266 (1977)] werden unter Verwendung proportionaler Mengen an Reagentien und Lösungsmitteln wie in den Schritten A und E des Beispiels 1 beschrieben acyliert [Rf(7) = 0,60], zum 2,4,5-Trichlorphenylester umgesetzt [Rf(4) = 0,84] und dann mit L-Prolin gekoppelt.
Ausbeute: 0,68 g (50%) eines Öles,
Rf(2) = 0,17 und 0,22.
Das FAB-Massenspektrum (299 [M + H]&spplus;) bestätigt die angenommene Struktur.

METHODEN

Methode M1

Herstellung von geronnenem menschlichem Plasma

a) An Plättchen reiches Plasma wird hergestellt, indem man ein im Verhältnis 9 : 1 bereitetes Gemisch aus menschlichem Blut und 3,8%iger Natriumcitratlösung 5 Minuten lang bei 240 · g zentrifugiert.
b) 200 ul plättchenreiches Plasma und 80 ul 40 mM CaCl&sub2;- Lösung werden bei Raumtemperatur eine Stunde lang stehengelassen Das geronnene Plasma wird sechsmal mit je 2 ml 0,9%iger NaCl-Lösung gewaschen, wobei schonend gerührt wird, um die anhaftenden Enzyme (Thrombin und Faktor Xa) zu entfernen. Der Thrombingehalt der Waschflüssigkeit wird wie folgt bestimmt.
c) Zu 400 ul Waschflüssigkeit werden 100 ul 1 mM Tos-Gly- Pro-Arg-pNA-Substratlösung gegeben, das Gemisch wird bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert und dann die Reaktion durch Zusatz von 100 ul 50%iger Essigsäure abgebrochen. Von dem Gemisch werden je 150 ul Überstand in die Vertiefungen einer 96-Well- Platte gefüllt und bei 405 nm die Extinktionskoeffizienten gemessen (ELISA. READER SLT Laborinstrument GmbH, Österreich). War das Waschen erfolgreich, so beträgt der Extinktionskoeffizient weniger als 5% von dem der Kontrolle.

Methode M2

Bestimmung der Hemmung des im geronnenen Plasma gebundenen Faktors Xa

a) Von dem Peptidinhibitor werden mit 0,02% Humanalbumin enthaltendem 0,1 M Trispuffer (pH = 8,5) Lösungen der Konzentrationen von 0,1, 1,0, 10 und 100 ug/ml hergestellt.
b) Nach dem Abziehen der Waschflussigkeit (Methode M1) werden zu dem geronnenen Plasma 400 ul Peptidlösung (für jede Konzentration 3 Parallelproben) bzw. als Kontrolle 400 ul Puffer gegeben und die Proben bei 37ºC 5 Minuten lang inkubiert. Dann werden zu jedem Ansatz 100 ul 2 mM Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA- Substratlösung gegeben. Die Proben werden bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert, dann wird die Reaktion mit 100 ul 50%iger Essigsäure abgebrochen.
c) Von jedem Ansatz werden 150 ul in die Vertiefungen einer 96-Well-Mikrotiterplatte gegeben, und die Extinktionskoeffizienten werden bei 405 nm gemessen (ELISA READER SLT Laborinstrument GmbH, Österreich). Der IC&sub5;&sub0;-Wert (die für eine 50%ige Hemmung erforderliche Konzentration) wird graphisch aus den auf die Kontrolle bezogenen durchschnittlichen Extinktionswerten bestimmt.

Methode M3

Bestimmung der Hemmung des im geronnenen Plasma eingeschlossenen Thrombins

a) Wie unter Methode 2/a beschrieben, werden Lösungen von den Peptidinhibitoren angefertigt.
b) Nach dem Abziehen der Waschflüssigkeit werden zu dem geronnenen Plasma (Methode M1) 400 ul Peptidlösung (für jede Konzentration 3 Parallelproben) bzw. als Kontrolle 400 ul Puffer gegeben und die Proben bei 37ºC 5 Minuten Lang inkubiert. Dann werden zu jedem Ansatz 100 ul 1 mM Tos-Gly-Pro-Arg-pNA- Substratlösung gegeben. Die Proben werden bei 37ºC 30 Minuten lang inkubiert, dann wird die Reaktion mit 100 ul 50%iger Essigsäure abgebrochen. Im weiteren wird gemäß M2/c vorgegangen.

Methode M4

Bereitung von Fibringel

a) In jedes Reaktionsgefäß werden 200 ul Humanfibrinogen (SIGMA), 25 ul NIH/E/ml Humanthrombin (SIGMA) und 40 ul 100 mM CaCl&sub2;-Lösung gegeben. Die Ansätze werden bei 20-22ºC eine Stunde lang stehengelassen. Das gelierte Fibrin wird dreimal mit je 2 ml physiologischer Kochsalzlösung gewaschen, wobei schonend gerührt und 5 Minuten lang absetzen gelassen wird, um anhaftende Thrombinspuren zu entfernen. Die Effizienz des Waschens kann wie unter M1/c kontrolliert werden.

Methode M5

Bestimmung der Hemmung des an Fibringel gebundenen Thrombins

a) Mit Hepes/NaCl-Puffer (0,001 M Hepes und 0,1 M NaCl, pH = 7,4) werden von den Peptidinhibitoren Lösungen der Konzentrationen 0,1, 1,0, 10 und 100 ug/ml hergestellt.
b) Die Messungen erfolgen wie unter M3/b beschrieben.

Methode M6

Messung der Hemmung des Faktors Xa in Lösung auf einer 96-Well-Mikrotiterplatte

a) Mit Phosphatpuffer (0,1 M Natriumphosphat und 0,05 M Natriumchlorid, pH 7,4) werden von menschlichem Faktor Xa (SIGMA) eine Lösung der Konzentration 1,3 E/ml und von den Peptidinhibitoren Lösungen der Konzentrationen 0,1, 1,0, 10 und 100 ug/ml bereitet. Das Substrat Bz-Ile-GIu-Gly-Arg-pNA wird in Form einer mit destilliertem Wasser bereiteten 0,33 nM Lösung verwendet.
b) Von der Kontrolle und den Peptidinhibitorlösungen (für jede Konzentration drei parallele Proben) werden je 30 ul Überstand in die Vertiefungen der Platte gegeben. Zu der Peptidlösung werden 30 ul Faktor Xa, 90 ul Puffer und 150 ml Substratlösung gegeben. Die Extinktion wird nach 10 Minuten bei 405 nm gemessen. Im folgenden wird wie in M2/c beschrieben gearbeitet

Claims

1. Peptidylargininaldehyd-Derivate der allgemeinen Formel (I),

Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I)

worin

Q eine Acylgruppe der Formel Q'O-CO bedeutet, worin Q' für eine Alkylgruppe mit 1-3 Kohlenstoffatomen steht,

D-Xaa eine 3-Cyclobutyl-D-alanyl- oder 3-Cyclopentyl-D- alanylgruppe bedeutet,

Pro eine L-Prolylgruppe bedeutet und

Arg für eine L-Arginylgruppe steht,

und ihre mit einer ogranischen oder anorganischen Säure gebildeten Säureadditionssalze.

2. Ethoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd und seine Säureadditionssalze.

3. Methoxycarbonyl-3-cyclobutyl-D-alanyl-L-prolyl-L- argininaldehyd und seine Säureadditionssalze.

4. Ethoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd und seine Säureadditionssalze.

5. Methoxycarbonyl-3-cyclopentyl-D-alanyl-L-prolyl-L-argininaldehyd und seine Säureadditionssalze.

6. Eine pharmazeutische Komposition, die als aktive Komponente mindestens eine Verbindung der allgemeinen Formel (I), worin Q, D-Xaa, Pro und Arg die im Anspruch 1 definierte Bedeutung besitzen, oder ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz davon im Gemisch mit in der pharmazeutischen Industrie allgemein verwendeten Trägerstoffen und/oder Zusatzstoffen enthält.

7. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) - worin Q, D- Xaa, Pro und Arg die im Anspruch 1 definierte Bedeutung besitzen - für Verwendung als Arzneimittel.

8. Verbindungen der allgemeinen Formel (I) - worin Q, D- Xaa, Pro und Arg die im Anspruch 1 definierte Bedeutung besitzen - für Verwendung als Arzneimittel in Heilung und Vorbeugung von Thrombosis und/oder beschleunigter Blutkoagulation.