HU224427B1

HU224427B1 - Véralvadásgátló hatású peptidszármazékok, a vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények és alkalmazásuk

Info

Publication number: HU224427B1
Application number: HU9601528A
Authority: HU
Inventors: Dániel Bagdy; Sándor Bajusz; Éva Barabás; András Fehér; Gabriella Szabó; Györgyné Széll; Béláné dr. Véghelyi; Attila Juhász; Lászlóné Mohai; Ocskay Klára Makkné; Györgyné Szalkay; Gáborné Szeker; József Langó; Jánosné Lavich; Imre Moravcsik; István Pallagi; Istvánné Taschler
Original assignee: Gyógyszerkutató Intézet Kft.
Priority date: 1996-06-05
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2005-09-28
Also published as: HUP9601528A3; HUP9601528A2; HU9601528D0

Abstract

A találmány tárgyát (I) általános képletű új peptidszármazékok –Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol Q jelentése Q'–O–CO– képletűacilcsoport, mely képletben Q' jelentése 1–3 szénatomszámúalkilcsoport, D-Xaa jelentése NH–CH(R)–CO képletű D-aminosav-gyök,ahol R jelentése 3–6 szénatomszámú egyenes vagy elágazó láncúalkilcsoport, 7–8 szénatomszámú cikloalkilcsoport vagy ciklohexil-metil-csoport, Pro jelentése L-prolin-gyök és Arg jelentése L-arginin-gyök – és ezek szerves vagy szervetlen savval képzett savaddíciós sói,valamint a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítményekképezik. A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek értékesgyógyászati, közelebbről véralvadást és vérlemezke- funkciót, valaminttrombózisképződést gátló hatással rendelkeznek.

Description

A találmány tárgyát (I) általános képletű új peptidszármazékok Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol

Q jelentése Q’-O-CO- képletű acilcsoport, mely képletben

Q’ jelentése 1-3 szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése NH-CH(R)-CO képletű D-aminosav-gyök, ahol R jelentése 3-6 szénatomszámú egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, 7-8 szénatomszámú cikloalkilcsoport vagy ciklohexil-metil-csoport,

Pro jelentése L-prolin-gyök és

Arg jelentése L-arginin-gyök és ezek szerves vagy szervetlen savval képzett savaddiciós sói, valamint a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények képezik.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek értékes gyógyászati, közelebbről véralvadást és vérlemezke-funkciót, valamint trombózisképződést gátló hatással rendelkeznek.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek különösen értékes képviselői az alábbiak: etoxi-karbonil-D-hexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid, etoxi-karbonil-D-pentil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid, etoxi-karbonil-D-norleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid, etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolil-L-arginin-aldehid, etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid, etoxi-karbonil-D-norvalil-L-prolil-L-arginin-aldehid, etoxi-karbonil-D-ciklohexil-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid, valamint a fenti vegyületek savaddíciós (elsősorban hidrogén-szulfát-) sói.

Definíciók

A leírásban szereplő aminosavak és szubsztituensek, valamint az ezekből felépített peptidek rövidítése megfelel a peptidkémiai irodalomban szokásos jelöléseknek.

Aminosavak: D-Ale=D-alloizoleucin [(2R,3S)-2amino-3-metil-pentánsav], Arg=L-arginin [(2R)-2amino-5-guanidino-pentánsav], Asp=L-aszparaginsav [(2S)-2-amino-3-karboxi-propionsavj, boroArg=L-boro-arginin [(1 R)-1-amino-4-guanidino-butil-bórsav], D-Cha=D-ciklohexil-alanin ](2R)-2-amino-3-ciklohexil-propionsav], D-Chg=D-ciklohexil-glicin, D-cHpg=Dcikloheptil-glicin [(2R)-2-amino-2-cikloheptil-ecetsavj, D-cOcg=D-ciklooktil-glicin [(2R)-2-amino-2-ciklooktil-ecetsav], Gla=gamma-karboxi-L-glutaminsav [(2S)2-amino-4,4-dikarboxi-vajsav], Glu=L-glutaminsav [(2S)-2-amino-4-karboxi-vajsavj, Glp=L-piroglutaminsav [(2S)-pirrolidon-5-karbonsavj, Gly=glicin (2-amino-ecetsav), D-Hxg=D-hexil-glicin [(2R)-2-amino-oktánsav], D-lle=D-izoleucin [(2R,3R)-2-amino-3-metil-pentánsav], D-Leu=D-leucin [(2R)-2-amino-4-metil-pentánsav], D-MePhe=N-metil-3-fenil-D-alanin [(2R)-2-metil-amino-3-fenil-propionsavj, D-MePhg=DN-metil-fenil-glicin [(2R)-2-amino-2-fenil-ecetsavj, Nal( 1 )=3-(naftil-1 )-L-alanin [(2S)-2-amino-3-(naftil-1 )-propionsav], D-Nle=D-norleucin j(2R)-2-aminohexánsav], D-Nva=D-norvalin [(2R)-2-amino-pentánsav], D-Pgl=D-pentil-glicin [(2R)-2-amino-heptánsavj, D-Phe=3-fenil-D-alanin [(2R)-2-amino-3-fenil-propionsav], D-Phg=D-fenil-glicin [(2R)-2-amino-2-fenilecetsav], Pro=L-prolin [(2S)-pirrolidin-2-karbonsav], D-Val=D-valin [(2R)-2-amino-3-metil-vajsavj. Szubsztituensek: Ac=acetil, Boc=íerc-butoxi-karbonil, Bz=benzoil, Eoc=etoxi-karbonil, Et=etil, iPoc=izopropoxi-karbonil, Me=metil, 4MeP=4-metil-pentanoil, Moc=metoxi-karbonil, pNA=p-nitro-fenil-amino, Poc=propoxi-karbonil, Tos=p-toluolszulfonil, Z=benzil-oxi-karbonil.

Peptidek és származékaik: Az aminosavrövidítések önmagukban az L-aminosavat jelölik. A D-aminosavat külön jelöljük, például a D-fenil-alanin=D-Phe. Az aminosavrövidítések előtt és után álló kötőjel azt jelzi, hogy az aminocsoportról egy H-atom, illetve a karboxilcsoportról egy OH-csoport hiányzik. Ennek megfelelően az Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H jelentése etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid, a Bz-lle-Glu-GlyArg-pNA jelentése pedig benzoil-L-izoleucil-L-glutamilglicil-L-arginin-p-nitro-anilid.

A véralvadás a szervezet védekezőmechanizmusának része. Érfalsérülés hatására indul el a folyamat, véralvadék keletkezik, hogy meggátolja az elvérzést. Emellett az ér betegsége, a vér pangása és az alvadási faktorok kóros aktiválódása is kiválthatja a véralvadást. Ilyenkor az éren belül keletkezik vérrög (trombus), ami azt részben vagy egészen eltörni, trombózis lép fel. A védekezőmechanizmus másik része a fibrinolízis. Az ebben működő enzimek végzik a véralvadék feleslegének eltávolítását, és ezek vesznek részt a trombolízisben, a trombus oldásában is.

A véralvadás folyamata egy katalizált enzimreakció-sorozat, kaszkádreakció, amelyben plazmafehérjék, az úgynevezett alvadási faktorok aktiválódnak egymás után. A faktorokat római számokkal jelölik, az aktív formára a betű utal. Néhányuk esetében a triviális név (is) használatos: például fibrinogén=l faktor (fi), fibrin=la faktor (fia), protrombin=ll faktor (fii) és trombin=lla faktor (flla). Az alvadás során keletkeznek szerin-proteázok (fXlla, fVlla, fXIa, fIXa, fXa és trombin), néhány gyorsító kofaktor (fVa és fVllla), és maga az alvadó anyag (fibrin). A keletkező proteázok sorában a fXa és a trombin a két utolsó. A fXa hatására képződik a trombin, ami a fibrinogén hasításával kialakítja a fibrinalvadékot.

A véralvadás korábbi mechanizmusa [R. G. MacFarlane: Natúré 202, 498 (1964); E. W. Davie és O. D. Ratnoff: Science 145, 1310 (1964)] szerint a fX aktiválása két úton, az úgynevezett belső vagy külső úton történik. Az előbbi esetben a valamilyen felületen aktiválódott fXII (fXlla) indítja el a folyamatot a fXI—>fXla átalakítással, amit a fIX >flXa átalakulás követ; a fX aktiválását a fIXa végzi. A külső úton egy sejtfelszíni receptor, a szöveti faktor (TF, tissue factor) megjelenésével és a [fVIITF], illetve [fVlla-TF] komplex kialakulásával indul a folyamat. A fX aktiválását a [fVlla- TF] komplex végzi.

Az újabb eredmények szerint az élő szervezetben lejátszódó véralvadás a fentiek kombinációja [E. W.

HU 224 427 Β1

Davie és munkatársai: Biochemistry 43, 10 363 (1991)], és a fontosabb lépései az alábbiak.

1. Az érfal sérülése vagy betegsége esetén a TF a felszínre kerül, és megköt valamennyit a vérben lévő VII faktorból. A képződött [fVII-TF] komplex egy alkalmas, és legalább nyomnyi mennyiségben jelen lévő proteáz (például fXlla, fXa, fIXa és trombin) hatására átalakul az aktív [fVlla-TF] enzimkomplexszé, ami aktiválja a plazmában lévő IX és X faktor kis részét (keletkezik kevés fIXa és fXa), majd inaktiválódik a TFPI [Tissue Factor Pathway Inhibitor, korábbi nevén LACI (Lipoprotein-Associated Coagulation Inhibitor)] hatására, ami a plazmában a fXa és a [fVlla-TF] komplex közös inhibitora [T. J. Girard és munkatársai: Natúré, 338, 518-520 (1989)].

2. A keletkezett fIXa a X faktorral és a fVllla gyorsítómolekulával foszfolipid- (PL) felületen, Ca⁺⁺-ion jelenlétében létrehozza az úgynevezett „tenase” komplexet: [flXa fVllla fX PL Ca⁺⁺], amiben a fX aktiválódik, keletkezik a fXa.

3. Az eddig keletkezett fXa a protrombinnal (fii) és a fVa gyorsítómolekulával kialakítja a „tenase”-hoz hasonló felépítésű úgynevezett protrombinázkomplexet: [fXa tVa fll PL Ca⁺⁺]. Ebben megy végbe a protrombin->trombin átalakulás. A fV->fVa és fVIII—>fVllla átalakulást a fXa vagy a trombin tudja elvégezni.

4. A keletkezett kevés trombin átalakítja a fXI egy részét fXIa enzimmé, és aktivál valamennyit a Vili és V faktorból, hogy újabb fVllla, illetve fVa keletkezzen. Most már a fXIa végzi el a IX faktor átalakítását fIXa enzimmé. Ezzel újból elindulhat a Xáz-komplextől a trombin képződéséig vezető láncreakció. A folyamat ismétlődésével egyre több trombin keletkezik.

5. Kellően nagy trombinkoncentrációnál következik be a plazmában oldott fibrinogén részleges proteolízise, a fibrinmonomer képződése, ami előbb az úgynevezett oldható fibrinpolimerré asszociálódik, majd átalakul az oldhatatlan fibrinpolimerré. Ez utóbbi átalakulásban is szerepet játszik a trombin, mivel ennek hatására keletkezik a polimerizációt végző fXllla [L. Lorand és K. Konishi: Arch. Biochem. Biophys. 105, 58 (1964)].

Az oldhatatlan fibrinpolimer a véralvadék és a trombus egyik főkomponense, a másik összetevő a vérlemezke-aggregátum, mely ugyancsak a trombin hatására keletkezik elsősorban. A kialakuló trombus, illetve véralvadék magába zárja a folyamatban keletkezett trombin jelentős részét, ami újabb alvadási folyamatot indít el, amikor a trombus oldódása/oldása során oldatba kerül [A. K. Gash és munkatársai: Am. J. Cardiol. 57, 175 (1986)]; R. Kumar és munkatársai: Thromb. Haemost. 72, 713 (1994)].

A fentiekből kitűnik a trombin kulcsszerepe a trombus képződésében. Emiatt a trombózisos betegségek gyógyításában rendkívüli jelentőséggel bírnak az olyan anyagok, melyek a trombin működését és/vagy keletkezését gátolják.

A trombózis kezelésében és megelőzésében a jelenleg legelterjedtebben és legsikeresebben alkalmazott készítmények a heparinok és a K-vitamin-antagonista kumarinok (például Syncumar és Warfarin), melyek közvetve gátolják a trombint.

A heparin katalizálja a trombin és természetes inhibitora, az antitrombin-lll (ΑΤ-III) közötti reakciót. A heparin ezen hatása azonban elmarad, ha az ΑΤ-III plazmakoncentrációja a normális 75%-ánál kisebb [R. Egbring és munkatársai: Thromb. Haemost. 42, 225 (1979)]. Nem kevésbé fontos, hogy e közvetett mechanizmussal nem gátolható az említett trombus által kötött trombin, mert a heparin-AT-lll komplex számára nem hozzáférhető [J. I. Weitz és munkatársai: J. Clin. Invest. 86, 385 (1990)]. Mindemellett a kezelés hatására kialakuló vérzéses szövődmények, és immunkórfolyamat következtében kialakuló trombembóliás esetek előfordulása sem elhanyagolható [lásd például J. M. Walenga és munkatársai: Clin. Appl. Thrombosis/Hemostasis, 2(Suppl. 1), S21-S27 (1996)].

A K-vitamin-antagonisták orálisan is adhatók. Hatásuk 16-24 óra után jelentkezik, és abban nyilvánul meg, hogy meggátolják némely alvadási faktor (például a protrombin) reaktív, Gla-tartalmú formáinak kialakulását. A terápiás hatáshoz részleges (60-70%-os) gátlás szükséges [Μ. P. Esnouf és C. V. Prowse: Biochim. Biophys. Acta 490, 471 (1977)], ami a gyógyszer megfelelő adagolásával érhető el. A K-vitamin-antagonisták alkalmazását megnehezíti a keskeny terápiás sáv, valamint a táplálék összetételétől (K-vitamin) való nagyfokú függőség és a változó egyedi érzékenység.

A trombint közvetlenül gátló első nagy hatású szintetikus anyag a D-Phe-ProArg-H tripeptid-aldehid volt, amely egy reverzibilis inhibitor, és mind in vitro, mind in vivő jelentős alvadásgátló hatást mutatott [S. Bajusz és munkatársai: In: Peptides: Chemistry, Structure and Biology (R. Walter and J. Meienhofer, Eds.), Ann Arbor Publ., Ann Arbor, Michigan, USA, 1975, pp. 603-608; Int. J. Peptide Protein Rés. 12, 217 (1978)]. A D-Phe-Pro-Arg-H számos rokon vegyületét állították elő. Az elsők között volt a Boc-D-Phe-Pro-Arg-H [S. Bajusz és munkatársai: Int. J. Peptide Protein Rés. 12, 217 (1978)], valamint a klór-metil-keton-analóg (D-Phe-Pro-Arg-CH₂CI), ami irreverzíbilis inhibitornak bizonyult (C. Kettner és E. Shaw: Thromb. Rés. 14, 969 (1979)]. A továbbiak közül kiemeljük a peptid és acilvegyületei boro-arginín-analógjait (D-Phe- és Boc-D-Phe-, valamint Ac-D-Phe-Pro-boroArg), melyek a trombin hatékony reverzibilis inhibitorai [C. Kettner és munkatársai: J. Bioi. Chem. 265, 18 289 (1990)] és a Boc-D-Phe-Pro-Arg-H egyéb analógjait, köztük a Boc-D-Chg-Pro-Arg-H analógot [P. D. Gesellchen és R. T. Shuman: EP 0 479 489 A2 (1992)].

Kitűnt, hogy a D-Phe-Pro-Arg-H vizes oldatban hajlamos spontán átalakulásra, de a terminális aminocsoport metilezésével kapott D-MePhe-Pro-Arg-H (GYKI-14 766) már megfelelően stabil és hasonlóan hatásos vegyület [S. Bajusz és munkatársai: 4,703,036 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1987); J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)]. Kísérleti állatokban jelentősen gátolja a véralvadást és trombusképződést [D. Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 357 és 68, 125 (1992); J. V. Jackson és

HU 224 427 Β1 munkatársai: J. Pharm. Ex. Ther. 261, 546 (1992)]; a fibrinolízis enzimjeire gyakorolt gátlóhatása jelentéktelen, trombolitikumokkal együtt adva hatékonyan segíti a trombus oldódását [C. V. Jackson és munkatársai: J. Cardiovasc. Pharmacol. 21, 587 (1993)], amire a heparin-AT-lll komplex nem képes. A D-MePhe-Pro-Arg-H rokon vegyületeinek a szintézisére is sor került, például a D-MePhgPro-Arg-H előállítására [R. T. Shuman és munkatársai; J. Med. Chem. 36, 314 (1993)].

A véralvadásgátló hatást (a folyamat proteolitikus reakcióinak gátlását) az alvadási tesztekben mérik, például a trombin idő (TT-), aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT-) és protrombin idő (PT-) tesztben (E. J. W. Bovie és munkatársai: Mayo Clinic Laboratory Manual of Hemostasis; W. B. Sanuders Co., Philadelphia, 1971). A spontán alvadásban gátolt plazmát, például citrátplazmát alvadásra késztetnek, és mérik az alvadási időt. Alvadásgátlók hatására az alvadási idő megnyúlik a rendszerben működő reakció(k) gátlásával arányosan. Az alvadásgátló hatás jellemezhető például azzal az anyagkoncentrációval, aminél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik (IC50). Az alvadásgátlóknak az egyes alvadási proteázokra gyakorolt hatását pedig az úgynevezett amidolitikus módszerrel mérik [R. Lottenberg és munkatársai: Methods Enzymol. 80, 341 (1981); G. Cleason: Blood Coagulation and Fibrinolysis 5, 411 (1994)]. Az izolált aktív faktort (például trombin, fXa) és ennek kromogén vagy fluorogén peptid-amid-szubsztrátját reagáltatják az inhibitor távollétében, illetve jelenlétében. Az enzimgátló hatást például az amidolízisben mért gátlási állandóval (IC₅₀) jellemzik.

A TT-tesztben a citrátplazmához adott trombin váltja ki az alvadást. A rendszerben működő trombin 22 pmol/ml, ennek gátlása mérhető jelen lévő fibrinogénen (a trombin egyik természetes szubsztrátján) - plazmakomponensek jelenlétében. Az APTT- és PT-tesztben az alvadási folyamat egésze zajlik. Az aktivátortól függően az úgynevezett belső, illetve külső úton aktiválódik a fX. A keletkező fXa a protrombint aktiválja trombinná, ami végül kiváltja a plazma alvadását. Az alvadási idő megnyúlik, ha az inhibitor gátolja a tesztekben működő enzimeket vagy ezek valamelyikét. Amíg a Xa faktorból legfeljebb 40 pmol/ml keletkezhet az APTTés PT-tesztben (ennyi X faktor van jelen a két rendszerben), a trombinból kb. 150 pmol/ml (APTT), illetve 350 pmol/ml (PT) képződik [vö. B. Kaiser és munkatársai: Thromb. Rés. 65, 157 (1992)].

A D-MePhe-Pro-Arg-H (C1) esetében a TT-, APTTés PT-tesztben a kétszeres alvadási időt eredményező koncentráció 87, 622, illetve 2915 nM. Ezek az értékek és a tesztekben működő trombin mennyisége (22, 150, illetve 350 pmol/ml) hasonlóan emelkedik, ami arra utal, hogy C1 az APTT- és PT-tesztben is trombingátlóként viselkedik, és például a fXa működését nem vagy alig befolyásolja. Ezzel összhangban van, hogy C1 IC₅₀=2 nM értékkel gátolja a trombin amidolitikus hatását a Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztráton, míg a fXa amidolitikus hatását a megfelelő Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA szubsztráton csak kevéssé, IC₅₀=9,1 μΜ értékkel gátolja (Bajusz S. és munkatársai: nem közölt eredmények).

A véralvadás mechanizmusából következik, hogy a folyamatot nemcsak a trombin közvetlen inhibitorai, de a trombin képződését akadályozó anyagok is gátolják, például a fXa inhibitorok. Jelentős véralvadást és trombusképződést gátló hatással rendelkező fXa inhibitor például a kullancsból izolált 60 tagú polipeptid, a TÁP (Tick Anticoagulant Peptide) [L. Waxman és munkatársai: Science 248, 593 (1990); A. B. Kelly és munkatársai: Circulation 86, 1411 (1992)] és a DX-9065a (C2), egy szintetikus nempeptid: (+)-(2S)-2-[4[[(3S)-1-acetimidoil-3-pirrolidinil]-oxi]-fenil]-3-[7-amidino-2-naftil]-propionsav-hidrogén-klorid-pentahidrát [T. Hara és munkatársai: Thromb. Haemost. 71, 314 (1994); T. Yokoyama és munkatársai: Circulation 92, 485 (1995)]. Ezek az anyagok erősen gátolják a fXa amidolitikus hatását és a plazma alvadását a PT- és APTT-tesztben. Vagyis egyaránt jól gátolják a szabad és a komplexben lévő Xa faktort. Ugyanakkor - mint specifikus fXa inhibitorok - a trombint nem gátolják, a TT-tesztben nem hatnak. A fXa szintetikus peptid inhibitora például a 4MeP-Asp-Pro-Arg-H (C3) (WO 93/15756 szám alatt publikált nemzetközi bejelentés) és a Boc-D-PheNal(1)-Arg-H (C4) (WO 95/13693 szám alatt publikált nemzetközi bejelentés). A közlés szerint C3 és C4 IC₅₀=57, illetve 30 nM értékkel gátolja a fXa amidolitikus hatását a Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA szubsztráton; alvadásgátló hatásukra nincs adat. Saját méréseinkben Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA szubsztráton is jelentős gátlóhatást mutatott C3 és C4, míg alvadásgátló hatásuk a plazma alvadási tesztekben rendkívül kicsi. Az 1. táblázat mutatja a fenti szintetikus fXa inhibitorokra közölt (C2),, illetve kapott (C3-C4) aktivitási értékeket összehasonlításban a C1 trombingátló adataival.

1. táblázat

Ismert szintetikus inhibitorok Xa faktort gátló (A) és alvadásgátló (B) hatása

Inhibitor	A: IC₅₀, nM^b	8: IC₅₀, pM^a
PT	APTT	TT
C1	9133	2,91	0,62	0,09
C2	70	0,52	0,97	NA^C
C3	64	19,32	4,59	0,87
C4	86	53,62	9,96	17,24

^a Peptidkoncentráció, melynél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik a protrombin idő (PT-), aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT-) és trombin idő (TT-) tesztben. ^b Izolált humán Xa faktorral Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton mért érték.

^c NA=nem aktív.

A fenti adatokból látszik, hogy a PT- és APTT-tesztben észlelt alvadásgátló hatás C1 esetében trombingátlásra, C2-nél pedig fXa gátlására vezethető vissza. C3 és C4 jelentős fXa-gátló hatása azonban nem jár együtt számottevő alvadásgátlással. Valószínű, hogy C3 és C4 számára nem hozzáférhető a protrombinázkomplex4

HU 224 427 Β1 ben lévő fXa aktív centruma, ezek a peptidek csak a szabad, oldatban lévő Xa faktort képesek gátolni.

Újabb közlés szerint [N. A. Prager és munkatársai: Circulation 92, 962 (1995)] a trombusba/véralvadékba zárt, és az oldódás során onnan kiszabaduló alvadási 5 enzimek közül nemcsak a trombin, de a Xa faktor is hozzájárul az újabb alvadási folyamat elindításához és fenntartásához, például a [fVII TF] komplex, illetve az V és Vili faktor aktiválása révén. Előnyös tehát, ha az alvadásgátlók a trombin mellett a Xa faktor gátlására is 10 képesek, és különösen előnyös, ha e gátlóhatás az alvadókba zárt trombinra és Xa faktorra is kiterjed.

A találmány célja olyan új peptidszármazékok előállítása, melyek a véralvadás folyamatát az ismerteknél előnyösebben gátolják, és gátlóhatásuk orális adás 15 esetén is megnyilvánul.

Korábbi megfigyelésünk volt, hogy a Boc-DPhe-Pro-Arg-H (C5) alvadásgátló hatása a TT- és APTT-tesztben ugyan kisebb, mint a C1 tripeptid-aldehidé, de a PT-tesztben már valamivel aktívabb, és a Xa faktort pedig 10-szer kisebb IC₅₀-értékkel gátolja, mint Cf. Most meglepő módon azt találtuk, hogy C5 Boc-csoportjának Eoc-csoporttal történő helyettesítése előnyösen módosítja a peptid alvadásgátló hatását, mert az ily módon előállt Eoc-D-Phe-Pro-Arg-H (C6) mindhárom tesztben nagyobb hatású, mint a C5, továbbá a C1 aktivitását már nemcsak a PT, de az APTT tesztben is meghaladja, miközben Xa faktort gátló hatása a C5 Boc-peptidéhez hasonló. A Moc-D-Phe-Pro-Arg-H (C7) alvadásgátló hatása a C6 Eoc-vegyületéhez hasonló, de Xa faktort gátló hatása valamivel nagyobb. Az elmondottakat a

2. táblázat szemlélteti.

2. táblázat

R¹-D-Phe-Pro-Arg-H szerkezetű peptid-aldehidek alvadásgátló (A) és Xa faktort (B) gátló hatása

Peptid-aldehid	A: ICgo, pM^a	B: IC₅₀, pM^b
No.	R¹	TT	APTT	PT
Cf	Me	0,09	0,62	2,93	9,13
C5	Boc	0,20	0,76	2,27	0,91
C6	Eoc	0,13	0,38	1,91	0,92
C7	Moc	0,20	0,29	1,96	0,13

^a Peptidkoncentráció, melynél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik.

^b Izolált humán Xa faktorral Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton mért érték (lásd M6. módszer).

Azt találtuk továbbá, hogy még előnyösebb véralvadásgátló vegyületekhez jutunk, ha az N-terminálison lévő D-aminosav oldallánca 3-6 szénatomszámú alkilcsoport vagy 7-8 szénatomszámú cikloalkilcsoport. Különösen előnyösnek találtuk azon (I) általános képletű vegyületeket, amelyekben Q’ jelentése 1-3 szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése NH-CH(R)-CO képletű D-aminosav-gyök, ahol R jelentése 3-6 szénatomszámú egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport.

A fentiek alapján a találmány tárgyát (I) általános képletű új peptidszármazékok Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol

Q jelentése Q’-O-CO- képletű acilcsoport, mely képletben

Pro jelentése L-prolin-gyök és

Arg jelentése L-arginin-gyök és ezek szerves vagy szervetlen savval képzett savaddíciós sói, valamint a fenti vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítmények képezik.

A találmány tárgyát képező (I) általános képletű 35 mely képletben Q, Q’, valamint D-Xaa, Pro és Arg jelentése a fenti - vegyületek előállításánál például úgy járunk el, hogy egy Q-D-Xaa-Pro acil-dipeptidet kondenzálunk guanidinocsoportján benzil-oxi-karbonil-csoporttal védett L-arginin-laktámhoz, majd a kapott védett tripeptid-laktámot Q-D-Xaa-Pro-Arg(Z)-H képletű védett tripeptid-aldehiddé redukáljuk, végül az arginin guanidinocsoportjáról a Z-csoportot hidrogenolízissel eltávolítjuk, és az (I) általános képletű peptidszármazékot valamilyen szerves vagy szervetlen savaddíciós só formájában elkülönítjük.

A kiindulási vegyületként alkalmazott új Q-DXaa-Pro acil-dipeptidet például úgy állítjuk elő, hogy a megfelelő D-Xaa aminosavat bázikus közegben klór-szénsav valamely Q' alkil-észterével acilezünk, majd a kapott Q-D-Xaa acil-aminosavat L-prolinhoz kapcsoljuk.

Az L-prolinnal való kapcsoláshoz szükséges Q-D-Xaa acil-aminosavat előnyösen úgy állítjuk elő, hogy a DL-Xaa racém vegyületet acilezzük és me55 til-észterré alakítjuk, majd a kapott Q-DL-Xaa-OMe racém acil-aminosav-metil-észter enzimes hidrolízise után nyerhető Q-D-Xaa-OMe-t szappanosítjuk a kívánt Q-D-Xaa acil-aminosavvá.

A találmány tárgyát képező (I) általános képletű

- mely képletben Q, Xaa, Pro és Arg jelentése a fenti 5

HU 224 427 Β1 vegyületek erős véralvadásgátló hatást fejtenek ki in vitro és in vivő egyaránt, előnyös biológiai hasznosulás mellett.

Az (I) általános képletű vegyületek in vitro kifejtett véralvadásgátló hatását a protrombin idő (PT-), az akti- 5 vált parciális tromboplasztin idő (APTT-) és a trombin idő (TT-) tesztben [D. Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)] határoztuk meg. Ugyancsak meghatároztuk a vegyületek Xa faktort gátló hatását a Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton (lásd 10 M6. módszer), valamint a fibrinolízist gátló hatást az úgynevezett fibrinlemezmódszerrel [D. Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 325 (1992)]. A kapott eredményeket a 3. táblázatban mutatjuk be; a C1 trombingátló és a C2 fXa-gátló, valamint a C6 Eoc-D-Phe 15 analóg megfelelő adatai kontrollként szerepelnek.

A táblázat az új vegyületeket a PT-aktivitás csökkenő sorrendjében tartalmazza, miáltal könnyen belátható az Eoc mint Q-csoport előnyös befolyása. Például a Q-D-Ale-Pro-Arg-H szerkezetű 5-8 esetében az aktivitási sorrend: Eoc (5)>Poc (7)> Moc (6)>iPoc (8). Az Eoc-vegyületek (1-5, 10 és 11) PT-tesztben mért aktivitása nagyobb, mint a C1 trombingátlóé, és például a 2 jelű vegyület PT-aktivitása megközelíti a C2-re közölt értéket. A 2-4, 9 és 10 jelű vegyület az APTT-tesztben és fXa-gátlásban nemcsak a C1, de a C2 hatékonyságát is meghaladja. Emellett az új vegyületek trombingátló hatása is számottevő a TT-tesztben, melyben a fXa-gátlásra készült C2 hatástalan. Az új Eoc-peptidek plazmint gátló hatása a C1 kontrollvegyületéhez hasonlóan csekély, vagy annál is kisebb, például az 1, 2 és 4 jelű vegyületek esetében.

3. táblázat

A Q-D-Xaa-Pro-Arg-H általános képletű új peptidszármazékok alvadásgátló (A), Xa faktort gátló (B) és plazmint gátló (C) hatása a PT-aktivitás csökkenő sorrendjében

Q-D-Xaa-Pro-Arg-H		A: IC₅₀, pM^a		B: ICs,,	IC₅₀
Szám^b	Q	Xaa	PT	APTT	TT	nM^c	pM^d
2	Eoc	Hxg	0,68	0,26	0,17	28	164
4	Eoc	Pgi	1,34	0,40	0,30	24	83
1	Eoc	Nle	1,53	0,25	0,13	168	65
10	Eoc	Leu	1,53	0,41	0,16	53	204
5	Eoc	Ale	1,67	0,77	0,41	61	31
3	Eoc	Nva	1,83	0,26	0,27	67	463
11	Eoc	Cha	1,89	0,24	0,13	98	17
7	Poc	Ale	1,99	0,64	0,52	-	-
6	Moc	Ale	2,31	0,68	0,30	-	-
8	ÍPoc	Ale	2,48	0,25	0,41	-	-
9	Eoc	Ile	2,55	0,51	0,25	-	-
Kontrollvegyületek
C2	fXa-gátló^e		0,52	0,97	NA	70	-
C6	Eoc Phe		1,91	0,38	0,13	993	130
C1	trombingátló		2,91	0,62	0,09	9133	56

^a Peptidkoncentráció, melynél az alvadási idő a kontroll kétszeresére nyúlik a protrombin idő (PT-), aktivált parciális tromboplasztin idő (APTT-) és trombin idő (TT-) tesztben. ^b Azonos a vegyületet leíró kiviteli példa számával.

^c Izolált humán Xa faktorral Bz-lle-Glu-Gly-Arg-pNA kromogén szubsztráton mért érték.

^d Peptidkoncentráció, melynél a lízisterület a kontroll 50%-a.

^θ Közölt adatok, NA=nem aktív.

Az (I) általános képletű vegyületeknek a plazmaalvadékba zárt Xa faktort és trombint gátló hatását, valamint a fibringélhez kötött trombint gátló hatását a 4. táblázatban mutatjuk be az 1, 2 és 11 vegyület példáján; a C1 esetében talált megfelelő értékeket kontrollként tüntetjük fel. A plazmaalvadékot lemezkedús hu55 mán citrátplazma rekalcinálásával, a fibringélt pedig humán fibrinogén humán trombinnal történő akasztásával nyertük, a Xa faktor és trombin aktivitásának mérésére a Moc-D-ChgGly-Arg-pNA, illetve Tos-Gly-ProArg-pNA szubsztrátot használtuk az M1-M5. módszerben leírtak szerint.

HU 224 427 Β1

4. táblázat

A találmány szerinti 1, 2 és 11 új peptidil-arginin-aldehid, valamint C1 mint kontrollvegyület gátlóhatása (IC₅₀, μΜ) plazmaalvadékba zárt Xa faktorra és trombinra, valamint fibringélhez kötött trombinra³

Peptidil-arginin-aldehid	(szám^b)	Plazmaalvadék	Fibringél
Xa faktor	trombin	trombin
Eoc-D-Nle-Pro-Arg-H	(1)	0,57	0,30	0,36
Eoc-D-Hxg-Pro-Arg-H	(2)	0,40	0,48	0,47
Eoc-D-Cha-Pro-Arg-H	(11)	0,30	0,27	0,31
D-MePhe-Pro-Arg-H	(C1)	1,12	0,38	0,30

^a Az IC₅₀-értékek meghatározásánál a Xa faktor és trombin aktivitását Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA, illetve Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztráttal mértük (lásd M1-M5. módszer).

^b Azonos az új vegyületet leíró kiviteli példa számával, illetve kontrollvegyület (C1).

Az adatokból látszik, hogy az 1, 2 és 11 jelű vegyület nemcsak a trombint, de a plazmaalvadékba zárt Xa faktort is mikromól alatti IC₅₀-értékkel gátolja.

Az (I) általános képletű vegyületek véralvadást és lemezkeaggregációt gátló hatását új-zélandi fehér nyulakban vizsgáltuk ex vivő a korábban leírt módon [D. Bagdy és munkatársai: Thromb. Haemost. 67, 357 (1992)]. A vegyületeket pufferolt fiziológiás konyhasóban oldva adtuk intravénás injekcióban (0,04-5,0 mg/kg) vagy infúzióban (0,25-5,0 mg/kg/h), illetve 0,5-6,0 mg/kg dózisban bőr alá vagy 2,5-20 mg/kg dózisban szájon át. A vegyületek hatása a szájon át történő beadás után <30 perccel már kimutatható, a legnagyobb értéket a 60-180. percben éri el, és a terápiás hatás dózisfüggő módon fennmarad 3->6 órán át.

Részletesen az etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid (5) 10 mg/kg és 5 mg/kg orális dózisnál észlelt in vivő hatását mutatjuk be az 5-6., illetve 7-8. táblázatban; ahol a C1 esetében talált megfelelő értékeket kontrollként tüntetjük fel. A vegyület beadása után az állatok fülvénájából 30-60 percenként vett vérmintákat analizáltuk. Meghatároztuk a teljes vér alvadási idejét (WBCT), valamint a trombinnal kiváltható vérlemezke-aggregáció gátoltságának mértékét (PAI). Meghatároztuk továbbá a vérmintából nyert citrátplazma aktivált parciális tromboplasztin idejét (APTT) és trombin idejét (TT). Az APTT- és TT-értékeket az 5. és 7. táblázat, míg a WBCT- és PAI-értékeket a 6. és 8. táblázat tartalmazza.

5. táblázat

Az Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H és a D-MePhe-Pro-Arg-H véralvadásgátló hatása nyulakban 10 mg/kg orális dózisnál az APTT- és TT-tesztben relatív alvadási időkkel jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H (5)	D-MePhe-Pro-Arg-H (C1)
APTT	TT	APTT	TT
0	1,0	1,0	1,0	1,0
30	2,33±1,00	9,18±4,06	2,07+0,38	7,89±4,13
60	2,13±0,20	20,11 ±3,08	2,30±0,31	19,27±3,60
120	2,04±0,33	18,41±3,06	1,93±0,14	17,21+4,73
180	1,85±0,26	14,21±5,92	1,75±0,17	7,23±2,00
240	1,68±0,25	10,51±3,46	1,61±0,15	3,77±1,25
300	1,50±0,50	8,89±4,49	1,25±0,22	2,36±1,21
360	1,20±0,20	4,94±3,78	-	-

^a A kezelt és nem kezelt állatokban mért alvadási idők hányadosa. A terápiás értékeket kiemeltük.

HU 224 427 Β1

6. táblázat

Az Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H és a D-MePhe-Pro-Arg-H véralvadást és vérlemezke-aggregációt (PAI) gátló hatása nyulakban 10 mg/kg orális dózisnál a WBCT-tesztben talált relatív alvadási idővel, illetve a %-os gátlással jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H (5)	D-MePhe-Pro-Arg-H (C1)
WBCT	PAI (%)	WBCT	PAI (%)
0	1,0	0	1,0	0
30	1,29±0,27	81,6±17,9	1,38±0,16	89,0±7,5
60	1,85±0,71	100,0+0	1,49±0,13	96,5±2,2
120	1,75±0,24	85,6±12,2	1,45±0,09	100,0+0,0
180	1,40+0,22	87,0±13,2	1,25±0,08	94,0±3,7
240	1,34±0,16	77,7 ±22,2	1,00±0,18	81,8±14,0
300	-	81,0±12,8	1,09+0,06	55,0±29,3
360	-	91,3±8,8	1,22±0,17	72,0±25,0

7. táblázat

Az Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H és a D-MePhe-Pro-Arg-H véralvadásgátló hatása nyulakban 5 mg/kg orális dózisnál az APTT- és TT-tesztben relatív alvadási időkkel jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H (5)	D-MePhe-Pro-Arg-H (C1)
APTT	TT	APTT	TT
0	1,0	1,0	1,0	1,0
30	1,28±0,07	3,30±0,85	1,27±0,38	1,52±0,17
45	1,41 ±0,08	5,20±1,18	1,30±0,02	2,50±0,44
60	1,46±0,11	6,35±1,05	1,37±0,03	4,75±1,38
90	1,48±0,10	5,62±0,96	1,45±0,09	10,50±5,49
120	1,34±0,06	3,77±0,94	1,43±0,11	5,51 ±3,59
180	1,14±0,12	2,28+0,56	1,39±0,09	2,05±0,38
240	0,95±0,09	1,42±0,13	1,31±0,11	1,81 ±0,39 \|

8. táblázat

Az Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H és a D-MePhe-Pro-Arg-H véralvadást és vérlemezke-aggregációt (PAI) gátló hatása nyulakban 5 mg/kg orális dózisnál a WBCT-tesztben talált relatív alvadási idővel, illetve a %-os gátlással jellemezve³

Idő (p)	Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H (5)	D-MePhe-Pro-Arg-H (C1)
WBCT	PAI (%)	WBCT	PAI (%)
0	1,0	0	1,0	0
30	1,30±0,06	40,2±18,2	1,07±0,13	52,8±14,7
45	1,49±0,11	66,7±13,7	1,26±0,07	58,4±15,6
60	1,56±0,10	60,7±17,4	1,55±0,17	54,2±11,6
90	1,62±0,09	71,8±18,0	1,61 ±0,34	83,2±8,9
120	1,53±0,04	75,0± 12,0	1,45±0,21	75,2±12,3
180	1,40±0,06	52,0±18,4	1,44 ±0,08	47,5±20,9
240	1,15±0,04	49,6±16,1	1,22±0,08	32,2±16,0

HU 224 427 Β1

A táblázatok adataiból kitűnik, hogy a hatás nagysága és tartama szempontjából egyaránt előnyösebb alvadásgátló 5, mint C1.

A találmány szerinti (I) vegyületeket az alábbi, trombózissal és/vagy fokozott véralvadékonysággal járó állapotok kezelésére és megelőzésére alkalmazzuk: mélyvénás trombózis, tüdőembólia, artériás trombózis, instabil angina, szívizomelhalás, pitvarfibrilláció, valamint trombózis alapon létrejött stroke. Használhatók még érelmeszesedés esetén a koronáriaartéria és agyi artéria trombotikus megbetegedéseinek megelőzése céljából, magas rizikójú betegek sebészi profilaxisára, illetve egyéb sebészi profilaxisra. Ezenkívül alkalmazhatók trombolízis vagy perkután transzluminális angioplasztika kapcsán az újraelzáródás megelőzésére, továbbá hemodialízis esetén és nefrózisszindróma kiegészítő terápiájára, valamint a vér fokozott alvadékonyságával együtt járó kórképekben: a rosszindulatú daganatos és gyulladásos megbetegedésekben (például ízületi gyulladás), valamint cukorbetegségben. Alkalmazhatók továbbá olyan esetekben, amikor az egyéb antikoagulánsok adása nem elég hatékony vagy kontraindikált: például heparin esetében antitrombin-llt hiánya vagy HIT (heprin indukálta trombocitopénia), kumarinok esetében például graviditás.

Gyógyászati célokra a jelen találmány szerinti vegyületeket és ezek gyógyászatilag elfogadható sóit alkalmazhatjuk önmagukban vagy célszerűen gyógyszerkészítmény formájában. Az ilyen készítmények szintén beletartoznak a jelen találmány oltalmi körébe.

E gyógyszerkészítmények hatóanyagként valamely (I) általános képletű vegyületnek vagy gyógyászatilag elfogadható sójának a hatás kifejtéséhez szükséges mennyiségét tartalmazzák a gyógyszerkészítésben szokásosan alkalmazott, önmagában ismert vivő-, töltőanyagok, hígítószerek és/vagy egyéb gyógyszerészeti segédanyagok kíséretében.

A fentieknek megfelelő vivő-, hígító-, illetve töltőanyagok például a víz, alkoholok, zselatin, laktóz, szacharóz, keményítő, pektin, magnézium-sztearát, sztearinsav, talkum, különböző állati vagy növényi olajok, valamint glikolok, például propilénglikol vagy polietilénglikol. A gyógyászati segédanyagok közé tartoznak a tartósítószerek, különböző természetes vagy szintetikus emulgeáló-, diszpergáló- vagy nedvesítőszerek, színezőanyagok, ízjavító szerek, pufferálóanyagok, szétesést elősegítő szerek és más, a hatóanyag biológiai hasznosulását elősegítő anyagok.

A találmány szerinti gyógyszerkészítmények a szokásos formákban lehetnek. Ilyen szokásos gyógyszerformák például az orális (szájon át adagolt) készítmények (tabletta, kapszula, por, pirula, drazsé vagy granulátum), valamint a parenterális (a gyomor- és bélrendszer megkerülésével adagolt) készítmények (injekciós vagy infúziós készítmények, a végbélkúp, tapasz vagy kenőcs).

Habár a jelen találmány szerinti vegyületeknek a gyógyászati hatás kifejtéséhez szükséges dózisa a kezelendő betegek egyéni állapotától és életkorától függ, ettől függően változhat, és végső soron a kezelőorvos határozza meg; az olyan betegségek megelőzésére és/vagy kezelésére, amelyben kívánatos a trombin működésének és/vagy keletkezésének gátlása, általában e vegyületeknek a testtömeg 1 kg-jára számítva körülbelül 0,01 mg és körülbelül 1000 mg közötti, és előnyösen 0,25 mg és 20 mg közötti napi orális vagy parenterális, például intravénás dózisait használhatjuk.

A találmány szerinti (I) általános képletű vegyületek trombolitikumokkal (például tPA-val vagy urokinázzal) együtt adagolva hatékonyan segíthetik elő az artériákban vagy vénákban kialakult trombusok oldódását, illetve hatékonyan gátolhatják a trombusok újraképződését. Ilyen esetekben a találmány szerinti vegyületeket a trombolitikumokkal egyidejűleg vagy a trombolitikus kezelést követően célszerű adagolni.

A találmány szerinti eljárást az alábbi kiviteli példákon mutatjuk be anélkül, hogy a találmányt e példákra korlátoznánk.

A példákban megadott R_rértékeket rétegkromatográfiával határoztuk meg szilikagélen (DC-Alufolien Kieselgel 60 F₂₅4, Merck, Darmstadt) az alábbi oldószerekben:

1. Etil-acetát

2. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (480:20:6:11)

3. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (60:20:6:11)

4. Kloroform-metanol (9:1)

5. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (45:20:6:11)

6. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (240:20:6:11)

7. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (480:10:3:55)

8. Etil-acetát-hexán (1:2)

9. Etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (120:20:6:11)

10. Etil-acetát-hexán (1:1)

11. Kloroform-aceton (98:2)

A példákban megadott kapacitásfaktor-értékeket (k’) „Pharmacia LKB analytical HPLC System Two” berendezéssel határoztuk meg az alábbiak szerint. Oszlop: „VYDAC C-18 reversed phase: 10 gm, 300 A, 4*250 mm.”

A puffer: 0,1% trifluor-ecetsav vízben.

B puffer: 0,1% trifluor-ecetsav acetonitrilben.

Az alkalmazott gradiens 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett

I: 0-5 min. 0-25% B, majd izokratikus 25% B;

II: 0-30 min. 0-60% B.

Az eluátum peptidtartalmának detektálása UV fénnyel történt 214 nm-en. A minta töménysége 1 mg/ml A puffer, az injekciós térfogat 25 gl.

A HPLC analízisnél az alkalmazott gradienst (I vagy II) a példa egyes lépéseinél a rövidítés után zárójelben adjuk meg.

Az acil-arginin-aldehidek egyensúlyi formákban léteznek: aldehid és aldehid-hidrát, valamint két amino-ciklol formában.

Ezek közül az aldehid-hidrát és egy vagy mindkét amino-ciklol külön csúcsban jelenik meg a HPLC során. Ennek megfelelően az acil-arginin-aldehideket a talált két vagy három k’-értékkel jellemezzük a példákban.

Tömegspektroszkópia. A FAB pozitív ionizációs mérések Finnigan MÁT 8430 típusú készüléken történtek. A mintákat m-nitro-benzil-alkohol-mátrixban oldot9

HU 224 427 Β1 tűk fel, közvetlen mintabevezetéssel vittük be az ionforrásba. A peptidil-arginin-aldehidek spektrumában a molekulaion mellett az m-nitro-benzil-alkohol (NBA) oldószerrel képzett addíciós vegyület molekulaionja is megjelenik: [M+H]⁺, illetve [M+H+NBA]⁺. Ennek megfelelően adjuk meg a FAB tömegspektrum adatait a példákban. Az ESI pozitív ionizációs mérések VG Quattro (Fisons) típusú készüléken történtek. A mintákat 1 térfogat*?^ hangyasavat tartalmazó 1:1 arányú acetonitril-víz elegyben oldottuk fel, majd 10 μΙ-es mintahurok alkalmazásával, a vivőfolyadék 15-25 μΙ/perc áramlási sebessége mellett áramoltattuk az ionforrásba.

A fajlagos forgatási értékek ([a]_D) 20 °C-ra vonatkoznak.

1. példa

Etoxi-karbonil-D-norieucil-L-prolil-L-arginin-aldehid(Eoc-D-Nle-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-norleucil-Lprolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginín-laktám

6,83 g (17,5 mmol) ferc-butil-oxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] szuszpendálunk 25 ml kloroformban, majd keverés és jeges hűtés mellett hozzáadunk 25 ml sósavas etil-acetátot (töménysége 0,11-0,15 g/ml). Két óra után a reakcióelegyet 30-40 ml dietil-éterrel hígítjuk, a kivált kristályos anyagot kiszűrjük, mossuk 15 ml acetonnal és 15 ml dietil-éterrel, majd éjszakán át szárítjuk vákuumexszikkátorban kálium-hidroxid mellett. A kapott N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám-klór-hidrátot feloldjuk 25 ml dimetil-formamidban, lehűtjük -20 ’C-ra, és az alábbi vegyes anhidridhez adjuk.

4,5 g (15 mmol) etoxi-karbonil-D-norleucil-L-prolint [1. példa, F) lépés] feloldunk 15 ml dimetil-formamidban, lehűtjük -20 ’C-ra, és keverés közben hozzáadunk 1,65 ml (15 mmol) N-metil-morfolint, 1,95 ml (15 mmol) klór-szénsav-izobutil-észtert, majd 10 perc keverés után az N^G-benzil-oxi-karbonil-L-argininlaktámot tartalmazó fenti dimetil-formamidos oldatot, és végül 4,63 ml (33,25 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet 30 percen át keverjük -10 °C-on, majd 1 órán át 0 °C-on. Ezt követően a sókat kiszűrjük, és a szűrletet hígítjuk 100 ml etil-acetáttal. A kapott oldatot mossuk 3^X25 ml vízzel, 25 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal és 3*25 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott terméket szilikagél oszlopon kromatografáljuk etil-acetátot alkalmazva eluensként. A terméket [R_f(1 )=0,50] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott olajos párlási maradékot petroléterrel eldörzsöljük.

3,5 g (40%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(1 )=0,5. [a]_D=-46,5° (c=1; tetrahidrofuránban).

Elemzési eredmény a C₂8H4₀N₆O₇.1/2H₂O (581,66) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=57,81; H%=7,10; N%=14,44;

talált: C%=57,7; H%=7,1; N%=14,4.

A FAB tömegspektrum (573 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-norleucil-Lprolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

3,02 g (5,2 mmol) etoxi-karbonil-D-norleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (1. példa,

1. lépés) feloldunk 15 ml tetrahidrofuránban, és keverés közben, -50 °C alatt hozzáadunk 4,03 mmol lítium-alumínium-hidridet tetrahidrofuránban oldva. A redukció előrehaladását rétegkromatográfiával követjük etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (480:20:6:11) rendszerben, és szükség szerint adagolunk további lítium-alumínium-hidridet. A reakcióelegyhez hűtés és keverés mellett annyi hűtött 0,5 M kénsavat csepegtetünk, hogy a pH 3 legyen, majd 35 ml vízzel hígítjuk. A kapott oldatot 2x15 ml n-hexánnal kirázzuk, majd 3*20 ml metilén-kloriddal kivonatoljuk. A metilén-kloridos oldatokat egyesítjük, mossuk 3*15 ml vízzel, 15 ml hideg 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal és 15 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot 10 ml benzolban feloldjuk, majd ciklohexánnal kicsapjuk. A csapadékot szűrjük és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 2,6 g (87%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(2)=0,30. [a]_D=-30,1° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (575 [M+H]⁺, 728 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-norleucil-Lprolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

2,3 g (4 mmol) etoxi-karbonil-D-norleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (1. példa,

2. lépés) feloldunk 30 ml etanol, 4,4 ml víz és 4 ml 0,5 M kénsav elegyében, hozzáadunk 15 ml etanolban szuszpendált 0,3 g csontszenes palládiumkatalizátort, és kb. 10 ’C-on hidrogénezzük. A reakció - aminek előrehaladását rétegkromatográfiával követjük - mintegy 30 perc alatt lejátszódik. A katalizátort kiszűrjük, és az oldatot 2,0-2,5 kPa nyomáson 7-9 ml térfogatra töményítjük. A maradékot 30 ml vízzel hígítjuk, 2*10 ml metilén-kloriddal kirázzuk, majd a pH-t 3,5-re állítjuk hidroxilciklusú Dowex AG 1-X8 ioncserélő gyantával. Ezután az oldatot 24 órán át állni hagyjuk 20-22 ’C-on, majd lefagyasztjuk és liofilizáljuk. 1,55 g (79%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=3,65; 4,0 és 4,7. [a]_D=-54,9° (c=1; vízben). A FAB tömegspektrum (441 [M+H]⁺, 594 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Etoxi-karbonil-D-norleucil-L-prolin (Eoc-D-Nle-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-DL-norleucin

19,65 g (0,15 mól) DL-norleucint feloldunk 75 ml

M nátrium-hidroxidban, az oldatot 0 ’C-ra hűtjük, és keverés mellett hozzáadunk párhuzamosan 100 ml 2 M nátrium-hidroxidot és 19,1 ml (0,2 mól) etoxi-karbonil-kloridot. A reakcióelegyet egy óra keverés után 200 ml vízzel hígítjuk, 50 ml dietil-éterrel kirázzuk, 3 M sósavval 3-as pH-ra savanyítjuk, majd 4*50 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat mossuk 50 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyo10

HU 224 427 Β1 máson bepároljuk. A párlási maradékot n-hexánnal eldörzsöljük. 22,7 g (74%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 58-60 °C. Rf(7)=0,48.

Elemzési eredmény a C₉H₁₇NO₄ (203,23) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=53,18; H%=8,43; N%=6,89;

talált: C%=52,7; H%=8,4; N%=6,6.

B) lépés: Etoxi-karbonil-DL-norleucin-metil-észter

20,3 g (0,1 mól) etoxi-karbonil-DL-norleucint [1. példa, A) lépés] feloldunk 200 ml vízmentes metanolban, hozzáadunk 0,75 ml tömény kénsavat, majd az oldatot forraljuk kb. 4 órán át, amíg teljessé nem válik az észterképződés, aminek előrehaladását rétegkromatográfiával követjük [R_f(7)=0,48 (sav) és 0,54 (észter)]. Az oldatot betöményítjük kb. 20 ml térfogatra 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékot hígítjuk 150 ml metilén-kloriddal, mossuk 2*15 ml vízzel és 2*15 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal, majd ismét vízzel, amíg semleges nem lesz. Az oldatot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A párlási maradékként kapott 15,7 g olajat [Rf(6)=0,88] 72 mmol cím szerinti terméknek tekintjük, és közvetlenül felhasználjuk a következő C) lépésben.

C) lépés: Etoxi-karbonil-D-norleucin-metil-észter

Az acil-L-aminosav-metil-észterek enzimes hidrolízisét 7,5-es pH-η végezzük automata titrátorban, melynek 100 ml-es és 250 ml-es reakcióedénye van, az adagolt reagens: 1 M nátrium-hidroxid.

A fenti B) lépésben kapott etoxi-karbonil-DL-norleucin-metil-észtert belehelyezzük az automata titrátor 250 ml-es reakcióedényébe, hozzáadunk 150 ml vizet és 5 ml benzolt. Erős keverés mellett az emulzió pH-ját 7,5-re állítjuk 1 M nátrium-hidroxiddal, hozzáadunk 135 mg enzimet [Subtilisin Carlsberg, Protease, Type Vili (Sigma)], a pH-t ismét 7,5-re állítjuk, és ezen az értéken tartjuk a titrátor segítségével. Mintegy 3 óra alatt megy végbe az etoxi-karbonil-L-norleucin-metil-észter hidrolízise. A reakcióelegyből a nem hidrolizált etoxi-karbonil-D-norleucin-metil-észtert 3*30 ml benzollal kivonjuk, a benzolos oldatokat egyesítjük, 2*10 ml vízzel mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradék olaj 7,8 g, amit 36 mmol cím szerinti terméknek tekintünk, és közvetlenül felhasználjuk a következő D) lépésben.

D) lépés: Etoxi-karbonil-D-norleucin-diciklohexil-ammónium-só

A fenti C) lépésben kapott etoxi-karbonil-D-norleucin-metil-észtert feloldjuk 60 ml metanolban, hozzáadunk timolftaleinindikátort, majd keverés mellett 36 ml 1 M nátrium-hidroxidot csepegtetünk hozzá. A reakcióelegyet 40 ml vízzel meghígítjuk, 3*15 ml dietil-éterrel kirázzuk, 6 M sósavval pH=3-ra savanyítjuk, majd 2*40 ml metilén-kloriddal kivonatoljuk. A metilén-kloridos oldatokat egyesítjük, vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 70 ml dietil-éterben, és hozzáadunk 6,7 ml diciklohexil-amint. Az elkülönült kristályos sót kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk.

12,45 g (90%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 167-168 °C. Rf(7)=0,48. [a]_D=-11° (c=0,5; etanolban).

Elemzési eredmény a C₂₁H₄₀N₂O₄ (384,55) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=65,59; H%=10,49; N%=7,28. talált: C%=65,0; H%=10,4; N%=7,15.

E) lépés: Etoxi-karbonil-D-norleucin-pentaklór-fenil-észter

11,55 g (30 mmol) etoxi-karbonil-D-norleucin-diciklohexil-ammónium-sót [1. példa, D) lépés] feloldunk 60 ml dietil-éterben és 33 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, a dietil-éteres fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után bepároljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékot feloldjuk 50 ml etil-acetátban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 7,99 g (30 mmol) pentaklór-fenolt, valamint 6,2 g (30 mmol) diciklohexil-karbodiimidet, majd a reakcióelegyet kb. 16 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot 30 ml dietil-éterrel kristályosítjuk. A kivált anyagot kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 10,3 g (76%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 121-122 °C. Rf(2)=0,9.

Elemzési eredmény a C₁₅H₁₆NO₄CI₅ (451,57) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=39,89; H%=3,57; N%=3,10;

Cl%=39,26;

talált: C%=40,1; H%=3,35; N%=3,0;

Cl%=39,15.

F) lépés: Etoxi-karbonil-D-norleucil-L-prolin

9,5 g (21 mmol) etoxi-karbonil-D-norleucin-pentaklór-fenil-észtert [1. példa, E) lépés] feloldunk 25 ml piridinben, hozzáadunk 2,42 g (21 mmol) L-prolint és 5,88 ml (42 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át keverjük. A reakcióelegyet bepároljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékot feloldjuk 50 ml vízben és 50 ml dietil-éterben. A vizes fázist mossuk 20 ml dietil-éterrel, 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, majd 2*30 ml etil-acetáttal kirázzuk. Az etil-acetátos oldatokat egyesítjük, vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. 5,67 g (90%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában [R_f(6)=0,50], melynek nagyobb részét közvetlenül felhasználjuk a példa 1. lépésében, kisebb részét pedig kristályos sóvá alakítjuk az alábbi módon.

0,6 g (2 mmol) etoxi-karbonil-D-norleucil-L-prolint feloldunk 10 ml dietil-éterben, és hozzáadunk 0,23 ml (2,1 mmol) ciklohexil-amint, a kivált kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 0,75 g (90%) etoxi-karbonil-D-norleucil-L-prolin-ciklohexil-ammónium-sót kapunk. Olvadáspont: 135-139 °C. Rj(6)=0,55.

Elemzési eredmény a C₂oH3₇N₃0₅.H₂0 (417,54) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=57,53; H%=9,41; N%=10,06;

talált: C%=57,6; H%=9,2; N%=9,85.

HU 224 427 Β1

2. példa

Etoxi-karbonil-D-hexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid(Eoc-D-Hxg-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-hexil-glicilL-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

3,43 g (8,8 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karboníl-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33,1729 (1990)] és 2,52 g (7,65 mmol) etoxi-karbonil-D-hexil-glicil-L-prolinból [2. példa F) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását. A végterméket [Rf(1 )=0,51] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot n-hexánnal eldörzsöljük és exszikkátorban szárítjuk. 2,1 g (45%) cím szerinti terméket kapunk. Rf{1 )=0,51. [a]_D=-41,2° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (601 [M+H]⁺,

754 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-hexil-glicilL-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

1,9 g (3,16 mmol) etoxi-karbonil-D-hexil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (2. példa,

1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon redukálunk arányos mennyiségű reagens és oldószer felhasználásával. 1,4 g (73%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,54. [a]_D=-20,8° (c=0,5; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (603 [M+H]⁺, 756 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-hexil-glicilL-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

1,3 g (2,15 mmol) etoxi-karbonil-D-hexil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (2. példa,

2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 0,82 g (74%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(II): k’=5,83 és 6,43. [<x]_D=-61,4° (c=1, vízben). A FAB tömegspektrum (469 [M+H]⁺, 622 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Etoxi-karbonil-D-hexil-glicil-L-prolin (Eoc-D-Hxg-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-DL-hexil-glicin

5,03 g (31,4 mmol) DL-hexil-glicint az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk. Ily módon 6,67 g (91%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(7)=0,52.

B) lépés: Etoxi-karbonil-DL-hexil-glicin-metil-észter

6,5 g (28,1 mmol) etoxi-karbonil-DL-hexil-glicint az 1.

példa B) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át. A párlási maradékként kapott 5,23 g olajat [Rf{7)=0,59] 21,35 mmol cím szerinti terméknek tekintjük, és közvetlenül felhasználjuk a következő C) lépésben.

C) lépés: Etoxi-karbonil-D-hexil-glicin-metil-észter

A fenti B) lépésben kapott etoxi-karbonil-DL-hexilglicin-metil-észter enzimes hidrolízisét arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával az 1. példa C) lépésében leírt módon végezzük az automata titrátor 100 ml-es reakcióedényében. A művelet végén, a párlási maradékként kapott olajat

10,5 mmol cím szerinti terméknek tekintjük, és közvetlenül felhasználjuk a következő D) lépésben.

D) lépés: Etoxi-karbonil-D-hexil-glicin-diciklohexil-ammónium-só

A fenti C) lépésben kapott etoxi-karbonil-D-hexilglicin-metil-észtert az 1. példa D) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - elszappanosítva 3,94 g (91%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 128-129 °C. R_f(7)=0,52. [a]_D=-12° (c=2; etanolban).

Elemzési eredmény a C23H44N2O4 (412,60) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=66,95; H%=10,75; N%=6,79. talált: C%=66,5; H%=10,8; N%=6,45.

E) lépés: Etoxi-karbonil-D-hexil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észter

3,87 g (9,4 mmol) etoxi-karbonil-D-hexil-glicin-diciklohexil-ammónium-sót [2. példa, D) lépés] feloldunk 20 ml dietil-éterben és 10 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, a dietil-éteres fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után bepároljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékot feloldjuk 16 ml etil-acetátban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 1,86 g (9,4 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt, valamint 1,94 g (9,4 mmol) diciklohexil-karbodiimidet, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. Az olajos maradékot vákuumexszikkátorban szárítjuk. A kapott 3,57 g olajat 8,7 mmol cím szerinti terméknek tekintjük, és közvetlenül felhasználjuk a következő F) lépésben.

F) lépés: Etoxi-karbonil-D-hexil-glicil-L-prolin

A fenti E) lépésben kapott etoxi-karbonil-D-hexil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észtert és 1,0 g (8,7 mmol) L-prolint az 1. példa F) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - kondenzálunk. A művelet végén 2,52 g (88%) olajat kapunk [Rf(6)=0,6], melyet 7,65 mmol cím szerinti terméknek tekintünk, és közvetlenül felhasználjuk a példa 1. lépésében.

3. példa

Etoxi-karbonil-D-norvalil-L-prolil-L-arginin-aldehid(Eoc-D-Nva-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-norvalil-Lprolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

1,37 g (3,5 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 0,87 g (3 mmol) etoxi-karbonil-D-norvalil-L-prolinból [3. példa,

C) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását. A végterméket [Rf{1 )=0,49] tisztán tartalmazó frakció12

HU 224 427 Β1 kát egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot exszikkátorban szárítjuk. Az így nyert 0,7 g (42%) olajat 1,25 mmol cím szerinti terméknek tekintjük.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-norvalil-Lprolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

0,7 g (1,25 mmol) etoxi-karbonil-D-norvalil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (3. példa,

1. lépés) feloldunk 5 ml tetrahidrofuránban, és keverés közben, -50 °C alatt hozzáadunk 0,97 mmol lítium-alumínium-hidridet tetrahidrofuránban oldva. A redukció előrehaladását rétegkromatográfiával követjük etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (480:20:6:11) rendszerben, és szükség szerint adagolunk további lítium-alumínium-hidridet. A reakcióelegyhez hűtés és keverés mellett annyi hűtött 1 M kénsavat csepegtetünk, hogy a pH 3 legyen, majd 30 ml vízzel hígítjuk. A kapott oldatot előbb kirázzuk 2*5 ml etil-acetáttal, azután telítjük konyhasóval és kivonatoljuk 2*20 ml metilén-kloriddal. Az egyesített metilén-kloridos oldatokat mossuk 2*10 ml 15%-os konyhasóoldattal, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot exszikkátorban szárítjuk. 0,15 g (21%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. R_f(2)=0,38. A FAB tömegspektrum (561 [M+H]⁺, 714 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-norvalil-Lprolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

0,15 g (0,26 mmol) etoxi-karbonil-D-norvalil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (3. példa,

2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 0,12 g (96%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k‘=3,0; 3,19 és 3,52. A FAB tömegspektrum (427 [M+H]⁺, 580 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Etoxi-karbonil-D-norvalil-L-prolin (Eoc-D-Nva-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-D-norvalin g (42,7 mmol) D-norvalint az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozása során a végterméket tartalmazó etil-acetátos oldat bepárlásával nyert olajat vákuumexszikkátorban szárítjuk. 7,6 g (89%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,65.

B) lépés: Etoxi-karbonil-D-norvalin-2,4,5triklór-fenil-észter

7,2 g (38 mmol) etoxi-karbonil-D-norvalint [3. példa,

A) lépés] és 7,5 g (38 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt feloldunk 40 ml etil-acetátban, az oldatot 0 °C körüli hőmérsékletre hűtjük, majd keverés közben hozzáadunk 8,6 g (42 mmol) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet hűtés mellett 10 órán át tovább keverjük, majd szűrjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. Az olajos párlási maradékot 20 ml etanolban oldjuk, az oldatot 3-4 órán át 0 °C körüli hőmérsékleten tartjuk. A kivált kristályokat szűrjük, 1-2 ml hűtött etanollal mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 4 g (28%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(8)=0,70. [a]_D=+40,9° (c=1; dimetil-formamidban).

Elemzési eredmény a Ci₄Hi₆NO₄CI₃ (368,64) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=45,61; H%=4,37; N%=3,79;

Cl=28,85;

talált: C%=45,2; H%=4,3; N%=3,4;

0=29,5.

C) lépés: Etoxi-karbonil-D-norvalil-L-prolin

3,68 g (10 mmol) etoxi-karbonil-D-norvalin-2,4,5triklór-fenil-észtert [3. példa, B) lépés] feloldunk 15 ml piridinben, hozzáadunk 1,15 g (10 mmol) L-prolint és

1,4 ml (10 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 10 órán át, majd 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban és 10 ml dietil-éterben. A vizes fázist kirázzuk 3*5 ml dietil-éterrel. A dietil-éteres fázisokat egyesítjük, és kirázzuk 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. Az olajos maradékot vákuumexszikkátorban szárítjuk. 1,98 g (69%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(6)=0,45. A FAB tömegspektrum (287 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

4. példa

Etoxi-karbonil-D-pentil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid(Eoc-D-Pgl-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-pentil-glicilL-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

2,28 g (5,8 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 1,57 g (5 mmol) etoxi-karbonil-D-pentil-glicil-L-prolinból [4. példa F) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását. A végterméket [R_f(1 )=0,48] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradék olaj, melyet vákuumexszikkátorban szárítunk. 1,1 g (37%) cím szerinti terméket kapunk. A FAB tömegspektrum (587 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-pentil-glicilL-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

1,1 g (1,87 mmol) etoxi-karbonil-D-pentil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (4. példa, 1. lépés) a 3. példa 2. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk, azzal az eltéréssel, hogy a reakció előrehaladását követő rétegkromatográfiát etil-acetátban végezzük [R_f(1 )=0,48 (laktám), 0,2 (aldehid)]. 0,76 g (69%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. R_f(1 )=0,20. A FAB tömegspektrum

HU 224 427 Β1 (589 [M+H]⁺, 742 [M+H+NBA]®) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-pentil-glicilL-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

0,7 g (1,2 mmol) etoxi-karbonil-D-pentil-glicilL-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (4. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 0,5 g (83%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k'=4,65; 5,22 és 6,57. A FAB tömegspektrum (455 [M+Hf, 608 [M+H+NBAf) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Etoxi-karbonil-D-pentil-glicil-L-prolin (Eoc-D-Pgl-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-DL-pentil-glicin

14,1 g (96,5 mmol) DL-pentil-glicint az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozása során a végterméket tartalmazó etil-acetátos oldat bepárlásával nyert olajat vákuumexszikkátorban szárítjuk. 21 g (98%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(7)=0,74.

B) lépés: Etoxi-karbonil-DL-pentil-glicin-metil-észter g (27,5 mmol) etoxi-karbonil-DL-pentil-glicint [4.

példa, A) lépés] feloldunk 50 ml vízmentes metanolban, hozzáadunk 0,5 ml tömény kénsavat, majd az oldatot forraljuk mintegy 8 órán át, amíg teljessé nem válik az észterképződés, aminek előrehaladását rétegkromatográfiával követjük [R_f(7)=0,74 (sav) és 0,87 (észter)]. Az oldatot bepároljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékot feloldjuk 100 ml benzolban és 100 ml vízben. A benzolos fázist mossuk 2*20 ml vízzel és 2*20 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal, majd ismét vízzel, amíg semleges nem lesz. Az oldatot vízmentes nátrium-szulfáton szárítjuk, és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A párlási maradékként kapott 5,47 g olajat [Rf(7)=0,87] 23,6 mmol cím szerinti terméknek tekintjük, és közvetlenül felhasználjuk a következő C) lépésben.

C) lépés: Etoxi-karbonil-D-pentil-glicin-metil-észter

A fenti B) lépésben kapott etoxi-karbonil-DL-pentil-glicin-metil-észter enzimes hidrolízisét az 1. példa C) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - végezzük az automata titrátor 100 ml-es reakcióedényében. A művelet végén, a párlási maradékként kapott olajat 11,0 mmol cím szerinti terméknek tekintjük, és közvetlenül felhasználjuk a következő D) lépésben.

D) lépés: Etoxi-karbonil-D-pentil-glicin-diciklohexil-ammónium-só

A fenti C) lépésben kapott etoxi-karbonil-D-pentil-glicin-metil-észtert az 1. példa D) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - elszappanosítva 4,3 g (85%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 119-121 °C. R_f(7)=0,74. [a]_D=-10,4° (c=1; metanolban).

Elemzési eredmény a C22H42N2O4.I/2H2O (407,58) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=64,82; H%=10,63; N%=6,87. talált: C%=64,9; H%=10,6; N%=6,6.

E) lépés: Etoxi-karbonil-D-pentil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észter

9,44 g (23,7 mmol) etoxi-karbonil-D-pentil-glicin-diciklohexil-ammónium-sót [4. példa, D) lépés] feloldunk 50 ml etil-acetátban és 25 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, az etil-acetátos fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után bepároljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékot feloldjuk 50 ml metilén-kloridban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, majd keverés közben hozzáadunk 4,74 g (24 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt és 5,6 g (27 mmol) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet állni hagyjuk szobahőmérsékleten 10 órán át, majd szűrjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. Az olajos maradékot vákuumexszikkátorban szárítjuk. 9,12 g (97%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(10)=0,76.

F) lépés: Etoxi-karbonil-D-pentil-glicil-L-prolin

3,96 g (10 mmol) etoxi-karbonil-D-pentil-glicin-2,4,5triklór-fenil-észtert [4. példa, E) lépés] és 1,15 g (10 mmol) L-prolint a 3. példa C) lépésében leírt módon kapcsolva 2,51 g (80%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. Rj(6)=0,50. [a]_D=-23,5° (c=1; metanolban). Elemzési eredmény a C₁₅H₂₆N₂O₅ (314,37) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=57,30; H%=8,34; N%=8,91.

talált: C%=57,4; H%=8,5; N%=8,5.

A FAB tömegspektrum (315 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

5. példa

Etoxi-karbonH-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid(Eoc-D-Ale-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-alloizoleucilL-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

6,83 g (17,5 mmol) ferc-butil-oxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] szuszpendálunk 25 ml kloroformban, majd keverés és jeges hűtés mellett hozzáadunk 25 ml sósavas etil-acetátot (töménysége 0,11-0,15 g/ml). Két óra után a reakcióelegyet 30-40 ml dietil-éterrel hígítjuk, a kivált kristályos anyagot kiszűrjük, mossuk 15 ml acetonnal és 15 ml dietil-éterrel, majd éjszakán át szárítjuk vákuumexszikkátorban kálium-hidroxid mellett. A kapott N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám-klór-hidrátot feloldjuk 25 ml dimetil-formamidban, lehűtjük -20 °C-ra, és az alábbi vegyes anhidridhez adjuk.

7,22 g (15 mmol) etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-sót [5. példa, C) lépés] feloldunk 40 ml dietil-éterben és 16,5 ml 0,5 M kénsavban. A dietil-éteres fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékként kapott olaj az etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin, melyet feloldunk 15 ml dimetil-formamidban, lehűtjük -20 °C-ra, és keverés közben hozzáadunk 1,65 ml (15 mmol) N-metil-morfolint, 1,95 ml

HU 224 427 Β1 (15 mmol) klór-szénsav-izobutil-észtert, majd 10 perc keverés után az N^G-benzil-oxi-karbonil-L-argininlaktámot tartalmazó fenti dimetil-formamidos oldatot, és végül 4,63 ml (33,25 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet 30 percen át keverjük hűtés mellett, majd

1,5 órán át hűtés nélkül. Ezt követően a sókat kiszűrjük, és a szűrletet hígítjuk 100 ml benzollal. A kapott oldatot mossuk 3*25 ml vízzel, 25 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal és 3x25 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott terméket szilikagél oszlopon kromatografáljuk etil-acetátot alkalmazva eluensként. A terméket [Rf(1 )=0,53] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük, 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott olajos párlási maradékot petroléterrel eldörzsöljük. 3,15 g (36,7%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(1 )=0,53. [a]_D=-41,5° (c=1; tetrahidrofuránban). Elemzési eredmény a C₂8H₄₀N₆O₇ (572,65) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=58,72; H%=7,04; N%=14,68;

talált: C%=58,3; H%=7,1; N%=14,2.

A FAB tömegspektrum (573 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-alloizoleucilL-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

2,98 g (3,8 mmol) etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (5. példa, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 2,45 g (90%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(2)=0,35. [a]_D=-33,1° (c=0,5; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (575 [M+H]⁺, 728 [M+H+NBAf) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-alloizoleucilL-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

2,01 g (3,5 mmol) etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (5. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával átalakítva 1,19 g (71%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k-3,35; 3,65 és 4,17. [a]_D=-64° (c=1; vízben). A FAB tömegspektrum (441 [M+H]⁺, 594 [M+H+NBA]⁴) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő: Etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-só (Eoc-D-Ale-Pro.DCHA) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-D-alloizoleucin

3,93 g (30 mmol) D-alloizoleucint az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozása során a végterméket tartalmazó etil-acetátos oldat bepárlásával nyert olajat vákuumexszikkátorban szárítjuk. 4,6 g (75%) cím szerinti terméket kapunk [Rf(7)=0,50], melynek nagyobb részét közvetlenül felhasználjuk a példa

B) lépésében, kisebb részét pedig kristályos sóvá alakítjuk az alábbi módon.

0,2 g (1 mmol) fenti olajos terméket feloldunk 10 ml dietil-éterben, és hozzáadunk 0,14 ml (1,2 mmol) ciklohexil-amint. A kivált kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 0,27 g (90%) etoxi-karbonil-D-alloizoleucin-ciklohexil-ammónium-sót kapunk. Olvadáspont: 143-143,5 °C.

[a]_D=-11,9° (c=1; etanolban).

Elemzési eredmény a C₁₅H₃₀N₂O4 (302,41) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=59,57; H%=10,00; N%=9,26; talált: C%=59,55; H%=10,0; N%=9,05.

B) lépés: Etoxi-karbonil-D-alloizoleucin-2,4,5-triklór-fenil-észter

4,37 g (21,5 mmol) etoxi-karbonil-D-alloizoleucint [5. példa, A) lépés] és 4,24 g (21,5 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt feloldunk 25 ml tetrahidrofuránban, az oldatot 0 °C körüli hőmérsékletre hűtjük, majd keverés közben hozzáadunk 4,43 g (42 mmol) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet hűtés mellett 10 órán át tovább keverjük, majd szűrjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott olajat 21,5 mmol cím szerinti terméknek tekintve közvetlenül felhasználjuk a következő lépésben.

C) lépés: Etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-só

A fenti B) lépésben kapott, és 21,5 mmol etoxi-karbonil-D-alloizoleucin-2,4,5-triklór-fenil-észternek tekintett olajos terméket feloldjuk 25 ml piridinben, hozzáadunk 2,53 g (22 mmol) L-prolint és 3,08 ml (22 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 50 ml vízben és 50 ml dietil-éterben. A vizes fázist 20 ml dietil-éterrel mossuk, 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, és 2x30 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 100 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 4,4 ml (22 mmol) diciklohexil-amint. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 8,5 g (82%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,53. Olvadáspont: 143-144 °C. [a]_D=-21,8° (c=0,5; etanolban).

Elemzési eredmény a C₂₆H₄₇N₃O₅ (481,66) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=64,83; H%=9,83; N%=8,72;

talált: C%=64,8; H%=9,85; N%=8,25.

A FAB tömegspektrum (301 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

6. példa

Metoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-argininaldehid- (Moc-D-Ale-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Metoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

1,32 g (3,4 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 0,95 g (3,31 mmol) metoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolinból [6. példa C) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolá15

HU 224 427 Β1 sát az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - végezzük. A reakcióelegyet szűrés és benzollal történő hígítás után mossuk 3 ml 15%-os konyhasóoldattal, 3 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal és 2*3 ml 15%-os konyhasóoldattal, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradék olajat (1,82 g) szilikagél oszlopon kromatografáljuk etil-acetátot alkalmazva eluensként. A terméket [Rf(1 )=0,48] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott olajos párlási maradékot n-hexánnal eldörzsöljük. 0,88 g (47%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(1 )=0,48. Olvadáspont: 124-125 °C. [_a]_D=-44,5° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (559 [M+H]⁺, 712 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Metoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

0,78 g (1,396 mmol) metoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (6. példa, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. 0,4 g (51%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(6)=0,30. Olvadáspont: 99,5-100,6 °C. [a]_D=-24,3° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (561 [M+H]⁺, 714 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Metoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

0,31 g (0,55 mmol) metoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (6. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át. 0,23 g (90%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=3,14; 3,32 és 3,68. [a]_D=-48,1° (c=1; vízben). A FAB tömegspektrum (427 [M+H]⁺, 580 [M+H+NBAJ+) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Metoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin (Moc-D-AlePro) előállítása

A) lépés: Metoxi-karbonil-D-alloizoleucin-ciklohexil-ammónium-só

5,24 g (40 mmol) D-alloizoleucint feloldunk 20 ml 2 M nátrium-hidroxidban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés mellett hozzáadunk párhuzamosan 22 ml 2 M nátrium-hidroxidot és 3,4 ml (44 mmol) metoxi-karbonil-kloridot. A reakcióelegyet egy óra keverés után 10 ml vízzel hígítjuk, 30 ml dietil-éterrel kirázzuk, 3 M sósavval 3-as pH-ra savanyítjuk, majd 4*20 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat mossuk 20 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A párlási maradékot feloldjuk 200 ml dietil-éterben, és hozzáadunk 4,52 ml (40 mmol) ciklohexil-amint. A kivált kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 9,7 g (84%) cím szerinti terméket kapunk.

R_f(6)=0,58. Olvadáspont: 170,5-172 °C. [a]_D=-12,7° (c=1; etanolban).

Elemzési eredmény a C₁₄H₂₈N₂O₄ (302,41) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=58,30; H%=9,79; N%=9,71;

talált: C%=58,4; H%=9,8; N%=9,8.

B) lépés: Metoxi-karbonil-D-alloizoleucin-pentaklór-fenil-észter

5,76 g (20 mmol) metoxi-karbonil-D-alloizoleucin-ciklohexil-ammónium-sót [6. példa, A) lépés] az 1. példa E) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át, azzal az eltéréssel, hogy a végterméket etil-acetátból kristályosítjuk. 6,6 g (75%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(11)=0,7. Olvadáspont: 163-163,5 °C. Elemzési eredmény a C14H14NO4CI5 (437,54) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=38,43; H%=3,22; N%=3,20;

CI%=40,52;

talált: C%=38,3; H%=3,0; N%=3,1;

CI%=40,45.

C) lépés: Metoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin

6,52 g (14,9 mmol) metoxi-karbonil-D-alloizoleucin-pentaklór-fenil-észtert [6. példa, B) lépés] feloldunk 15 ml piridinben, hozzáadunk 1,71 g (14,9 mmol) L-prolint és 4,17 ml (29,8 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 15 ml vízben és 30 ml dietil-éterben. A vizes fázist 10 ml dietil-éterrel mossuk, majd 3 M sósavval pH=3-ra savanyítjuk, és 2*20 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat 10 ml telített konyhasóoldattal mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékként kapott nyersterméket [2,6 g, R_f(6)=0,40, valamint 0,12 és 0,88] szilikagél oszlopon kromatografáljuk etil-acetát-piridin-ecetsav-víz (240:20:6:11) elegyet alkalmazva eluensként. A terméket [R_f(6)=0,40] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott olajos párlási maradékot vákuumexszikkátorban szárítjuk. 0,95 g (22%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,40. A FAB tömegspektrum (287 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

7. példa

Propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (Poc-D-Ale-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

1,5 g (3,85 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 1,37 g (3,3 mmol) propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin-ciklohexil-ammónium-sóból [7. példa, C) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 5. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - végezzük el. A végterméket

HU 224 427 Β1 [R_f( 1)=0,49] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradék olaj, melyet vákuumexszikkátorban szárítunk. 0,83 g (43%) cím szerinti terméket kapunk. [a]_D=-40° (c=0,5; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (587 [M+H]⁺, 740 [M+H+NBA]®) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucii-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

0,77 g (1,31 mmol) propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (7. példa, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket használva - redukálunk, azzal az eltéréssel, hogy a művelet végén az olajos végterméket n-hexánnal dörzsöljük el. Szűrés és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 0,41 g (54%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(7)=0,25.

3. lépés: Propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

0,4 g (0,68 mmol) propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (7. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 0,25 g (70%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=4,27; 4,91 és 5,97. [a]_D=-78,3° (c=1; vízben). A FAB tömegspektrum (455 [M+H]⁺, 547 [M+H+glicerin]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin (Poc-DAle-Pro) előállítása

A) lépés: Propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucin

1,31 g (10 mmol) D-alloizoleucint acilezünk 1,24 ml (11 mmol) propil-oxi-karbonil-kloriddal az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozása során a végterméket tartalmazó etil-acetátos oldat bepárlásával nyert olajat vákuumexszikkátorban szárítjuk. 1,75 g (80%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(2)=0,60.

B) lépés: Propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucin-2,4,5-triklór-fenil-észter

1,75 g (8 mmol) propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucint [7. példa, A) lépés] és 1,73 g (8,8 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt feloldunk 10 ml tetrahidrofuránban, az oldatot 0 °C körüli hőmérsékletre hűtjük, majd keverés közben hozzáadunk 1,73 g (8,4 mmol) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet hűtés mellett 10 órán át tovább keverjük, majd szűrjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A kapott olajat 8 mmol cím szerinti terméknek tekintve közvetlenül felhasználjuk a következő lépésben.

C) lépés: Propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin-ciklohexil-ammónium-só

A fenti B) lépésben kapott, 8 mmol propil-oxi-karbonil-D-alloizoleucin-2,4,5-triklór-fenil-észternek tekintett olajos terméket feloldjuk 8 ml piridinben, hozzáadunk 0,92 g (8 mmol) L-prolint és 1,12 ml (8 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 15 ml vízben és 15 ml dietil-éterben. A vizes fázist 5 ml dietil-éterrel mossuk, majd 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, és 2« 10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 10 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 0,91 ml (8 mmol) ciklohexil-amint. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 2,3 g (70%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(9)=0,70. Olvadáspont: 142 °C (135 °C-on zsugorodik). [a]_D=-28,6° (c=1; metanolban).

Elemzési eredmény a C₂iH₃9N3O₅ (413,55) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=60,99; H%=9,51; N%=10,16;

talált: C%=60,3; H%=9,95; N%=10,0.

A FAB tömegspektrum (315 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

8. példa

Izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (iPoc-D-Ale-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Izopropil-oxi-karbonil-D- alloizoleucil-Lprolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

2,9 g (7,4 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 3,1 g (6,32 mmol) izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-sóból [8. példa, B) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 5. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - végezzük el. A végterméket [R_f(1 )=0,55] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradék olaj, melyet vákuumexszikkátorban szárítunk. 2,22 g (60%) cím szerinti terméket kapunk. [a]_D=-37° (c=1; tertrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (587 [M+H]⁺, 740 [M+H+NBA]®) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid g (3,4 mmol) izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (8. példa, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket használva - redukálunk, azzal az eltéréssel, hogy a művelet végén az olajos végterméket n-hexánnal dörzsöljük el. Szűrés és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 1,15 g (58%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(7)=0,25.

3. lépés: Izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát g (0,68 mmol) izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (8. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 0,59 g (70%) cím szerinti

HU 224 427 Β1 terméket kapunk. HPLC(I): k-4,09; 4,57 és 5,48. [a]_D=-41,85° (c=0,5; vízben). A FAB tömegspektrum (455 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

Izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-só (iPoc-D-Ale-Pro.DCHA) előállítása

A) lépés: Izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucin-diciklohexil-ammónium-só

1,31 g (10 mmol) D-alloizoleucint feloldunk 10 ml 1 M nátrium-hidroxid és 10 ml dioxán elegyében. Keverés és hűtés (0 °C) mellett párhuzamosan hozzácsepegtetünk 10 ml 1 M nátrium-hidroxidot és 10 ml izopropil-oxi-karbonil-kloridot 1 M-os toluolos oldatban, majd a keverést tovább folytatjuk 1 órán át 0 °C-on és 5 órán át szobahőmérsékleten. A reakcióelegyből a dioxánt és toluolt kidesztilláljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradék vizes oldatot 10 ml dietil-éterrel kirázzuk, majd 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk. A keletkezett emulziót 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 10 ml dietil-éterben, hozzáadunk 2 ml (10 mmol) diciklohexil-amint, csökkentett nyomáson kb. 5 ml-re betöményítjük, majd kb. 20 ml petroléterrel (fp.: 30-40 °C) kristályosítjuk. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük, petroléterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 3,54 g (88%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,70. Olvadáspont: 70-71 °C. [<x]_D=—6,7° (c=2; metanolban).

Elemzési eredmény a C22H42N2O4 (398,57) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=66,29; H%=10,62; N%=7,03;

talált: C%=66,5; H%=10,8; N%=6,9.

B) lépés: Izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-só g (7,5 mmol) izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucin-diciklohexil-ammónium-sót [8. példa, A) lépés] feloldunk 15 ml dietil-éterben és 8 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, a dietil-éteres fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után bepároljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékot feloldjuk 8 ml tetrahidrofuránban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 1,6 g (8,25 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt és 1,6 g (7,88 mmol) diciklohexil-karbodiimidet, majd a reakcióelegyet 1 órán át 0 °C-on és 4 órán át szohabőmérsékleten keverjük. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradék olajat 7,5 mmol izopropil-oxi-karbonil-D-alloizoleucin-2,4,5-triklór-fenil-észternek tekintjük, és feloldjuk 8 ml piridinben, hozzáadunk 0,86 g (7,5 mmol) L-prolint, valamint 1,05 ml (7,5 mmol) trietil-amint, majd kb. 16 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 15 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban és 15 ml dietil-éterben. A vizes fázist 5 ml dietil-éterrel mossuk, majd 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 10 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 1,48 ml (8 mmol) diciklohexil-amint. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 2,23 g (60%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,50. Olvadáspont: 137-138,5 °C. [a]_D=-28,3° (c=1; metanolban).

Elemzési eredmény a C27H49N3O5 (495,69) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=65,42; H%=9,96; N%=8,48;

talált: C%=64,6; H%=10,6; N%=8,63.

A FAB tömegspektrum (315 (M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

9. példa

Etoxi-karbonil-D-izoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid(Eoc-D-lle-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-izoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

1,85 g (4,3 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 2,52 g (7,65 mmol) etoxi-karbonil-D-izoleucil-L-prolinból [9. példa, C) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - végezzük el. A végterméket [Rf(1 )=0,60] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot n-hexánnal eldörzsöljük és exszikkátorban szárítjuk. 1,23 g (49%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(1)=0,60. [a]_D—31,1° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (573 [M + H]⁺, 726 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-izoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

1,14 g (2 mmol) etoxi-karbonil-D-izoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (9. példa,

1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket használva - redukálunk. 0,85 g (74%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,32. [a]_D=-23° (c=0,5; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (575 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-izoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

2,01 g (3,5 mmol) etoxi-karbonil-D-izoleucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (9. példa,

2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 0,49 g (78%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC: k'=3,39; 3,65 és 4,35. [a]_D=-57,9° (c=1; vízben). A FAB tömegspektrum (441 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő:

HU 224 427 Β1

Etoxi-karbonil-D-izoleucil-L-prolin (Eoc-D-lle-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-D-izoleucin

0,91 g (7 mmol) D-izoleucint az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk, azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozása során a végterméket tartalmazó etil-acetátos oldat bepárlásával nyert olajat vákuumexszikkátorban szárítjuk. 1,13 g (80%) cím szerinti terméket kapunk. [Rf(7)=0,45]. A FAB tömegspektrum (204 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

B) lépés: Etoxi-karbonil-D-izoleucin-2,4,5triklór-fenil-észter

1,09 g (5,4 mmol) etoxi-karbonil-D-izoleucint [9. példa, A) lépés] és 1,06 g (21,5 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt az 5. példa B) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva

- kondenzálunk. A kapott olajat [Rf(10)=0,70] 5 mmol cím szerinti terméknek tekintjük, és közvetlenül felhasználjuk a következő lépésben.

C) lépés: Etoxi-karbonil-D-izoleucil-L-prolin

A fenti B) lépésben kapott, és 5 mmol etoxi-karbonil-D-izoleucin-2,4,5-triklór-fenil-észternek tekintett olajos terméket a 3. példa C) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - 0,58 g (5 mmol) L-prolinnal kapcsolva 1,35 g (90%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. Rf(6)=0,50. A FAB tömegspektrum (301 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

10. példa

Etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolil-L-arginin-aldehid(Eoc-D-Leu-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

2,28 g (5,8 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 2,41 g (5 mmol) etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-sóból [10. példa, C) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 5. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával

- végezzük. A végterméket [Rf(1 )=0,62] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot diizopropil-éterből kristályosítjuk. A kristályokat kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk és exszikkátorban szárítjuk. 1,93 g (67,6%) cím szerinti terméket kapunk. A FAB tömegspektrum (573 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

1,93 g (3,38 mmol) etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (10. példa,

1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk, azzal az eltéréssel, hogy a végtermék izolálásakor a metilén-kloridos oldat párlási maradékát n-hexánnal dörzsöljük el. 1,65 g (86%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(5)=0,50. A FAB tömegspektrum (575 [M+H]⁺, 728 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

1,6 g (2,8 mmol) etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (10. példa,

2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - átalakítva 0,96 g (72%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=3,52; 3,83 és 4,30. [a]_D=-55,05° (c=1, vízben). A FAB tömegspektrum (441 [M+H]⁺, 594 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő: Etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-só (Eoc-D-Leu-Pro.DCHA) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-D-leucin

6,55 g (50 mmol) D-leucint az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk, azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozása során a végterméket tartalmazó etil-acetátos oldat bepárlásával nyert olajat vákuumexszikkátorban szárítjuk. 9,2 g (90%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(7)=0,50.

B) lépés: Etoxi-karbonil-D-leucin-2,4,5triklór-fenil-észter

9,15 g (45 mmol) etoxi-karbonil-D-leucint [10. példa, A) lépés] és 9,85 g (45 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt az 5. példa B) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - kondenzálunk. A kapott 17,2 g olajat [R_f(10)=0,65] 45 mmol cím szerinti terméknek tekintjük, és közvetlenül felhasználjuk a következő lépésben.

C) lépés: Etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolin-diciklohexil-ammónium-só

A fenti B) lépésben kapott etoxi-karbonil-D-leucin-2,4,5-triklór-fenil-észtert (45 mmol) és 5,18 g (45 mmol) L-prolint az 5. példa C) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - kondenzálva, majd diciklohexil-ammónium-sóvá alakítva 11,7 g (54%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(9)=0,63. Olvadáspont: 169-173 °C. [a]_D=-26,2° (c= 1; etanolban).

Elemzési eredmény a C26H47N3O5 (481,66) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=64,83; H%=9,83; N%=8,72;

talált: C%=64,6; H%=10,0; N%=8,3.

A FAB tömegspektrum (295 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

11. példa

Etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (Eoc-D-Cha-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanil-Lprolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

3,5 g (9 mmol) ferc-butil-oxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 2,72 g (8 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanil-L-prolinból [11. példa, C) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 1.

HU 224 427 Β1 példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - végezzük, azzal az eltéréssel, hogy a végterméket [R_f(2)=0,73] tisztán tartalmazó frakciók egyesítése és bepárlása után kapott olajos maradékot diizopropil-éterrel dörzsöljük el. 3 g (61%) cím szerinti terméket kapunk. [a]_D=-47,2° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (613 [M+H]⁺, 766 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanil-Lprolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

2.5 g (4 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (11. példa, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 2,2 g (90%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(2)=0,30. [a]_D=-30,6° (c=1; tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (615 [M+H]⁺, 768 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

2,3 g (4 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil L-arginin-aldehidet (11. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - alakítunk át. Ily módon 1,4 g (75%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=6,26 és 10,0. [a]_D=-75,2° (c=1; vízben). A FAB tömegspektrum (481 [M+H]⁺, 634 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő: Etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanil-L-prolin (Eoc-DCha-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanin-diciklohexil-ammónium-só

2,74 g (16 mmol) 3-ciklohexil-D-alanint feloldunk 8 ml 2 M nátrium-hidroxidban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés mellett egyidejűleg hozzáadunk 9 ml 2 M nátrium-hidroxidot és 1,73 ml (18 mmol) etoxi-karbonil-kloridot. A reakcióelegyet egy óra keverés után 20 ml vízzel hígítjuk, 5 ml dietil-éterrel kirázzuk, 3 M sósavval 3-as pH-ra savanyítjuk, majd 4*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat mossuk 10 ml vízzel, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 3,2 ml (16 mmol) diciklohexil-amint. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk és levegőn szárítjuk. 5,8 g (85%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(6)=0,83. Olvadáspont: 147-148 °C. [a]_D=-6° (c=0,5; kloroformban).

Elemzési eredmény a C24H44N2O4 (424,61) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=67,88; H%=10,44; N%=6,60. talált: C%=68,0; H%=10,75; N%=6,3.

B) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklohexil-Dalanin-2,4,5-triklór-fenil-észter

5.5 g (13 mmol) etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanin-diciklohexil-ammónium-sót [11. példa, A) lépés] feloldunk 35 ml etil-acetátban és 14 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, az etil-acetátos fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson mintegy 15 ml térfogatra töményítjük. A maradék oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 2,55 g (13 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt, valamint 2,67 g (13 mmol) diciklohexil-karbodiimidet, majd a reakcióelegyet kb. 16 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékként kapott 5,5 g olajat [Rf(4)=0,84] 13 mmol cím szerinti terméknek tekintjük.

C) lépés: Etoxi-karbonil-3-ciklohexil-Dalanil-L-prolin

A fenti B) lépésben kapott, és 13 mmol etoxi-karbonil-3-ciklohexil-D-alanin-2,4,5-triklórfenil-észternek tekintett olajos terméket feloldjuk 15 ml piridinben, hozzáadunk 1,5 g (13 mmol) L-prolint és 1,82 ml (13 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet kb. 16 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban, és az oldatot kirázzuk 3*5 ml dietil-éterrel. A dietil-éteres fázisokat egyesítjük, és kirázzuk 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 3 M sósavval pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 2,6 ml (13 mmol) diciklohexil-amint. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük és diizopropil-éterrel mossuk, majd feloldjuk 30 ml etil-acetátban és 15 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, az etil-acetátos fázist vízzel semlegesre mossuk, majd nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot diizopropil-éterrel kristályosítjuk, a kristályokat kiszűrjük és levegőn szárítjuk. 3 g (68%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(6)=0,49. A FAB tömegspektrum (341 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

12. példa

Etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (Eoc-D-cOcg-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

0,43 g (1,1 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 0,36 g (1,0 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicil-L-prolinból [12. példa, E) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - végezzük. A végterméket [R_f(1 )=0,65] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot n-hexánnal eldörzsöljük és exszikkátorban szárítjuk. 0,30 g (50%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(1 )=0,65. [a]_D=-32,7° (c=1; tetrahidrofurán20

HU 224 427 Β1 bán). A FAB tömegspektrum (626 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

0,15 g (0,25 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (12. példa, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 0,14 g (88%) cím szerinti terméket kapunk, Rf(7)=0,30.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

0,14 g (0,22 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (12. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - alakítunk át. Ily módon 0,05 g (50%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=6,17; 7,17 és 7,96. A FAB tömegspektrum (495 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő: Etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicil-L-prolin (Eoc-D-cOcgPro) előállítása

A) lépés: DL-ciklooktil-glicin

28,05 g (0,2 mól) ciklooktán-karbaldehidből 5-ciklooktil-hidantoint készítünk, majd ezt hidrolizáljuk DL-ciklooktil-glicinné a ciklobutil-glicin előállítására közölt [T. H. Porter és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys. 179, 266 (1977)] eljárással analóg módon. 12,2 g (33%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 222-223 °C.

Elemzési eredmény a Ci₀H₁₉NO₂ (185,26) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=64,83; H%=10,34; N%=7,56. talált: C%=64,8; H%=10,3; N%=7,45.

B) lépés: Klór-acetil-DL-ciklooktil-glicin

3,7 g (20 mmol) DL-ciklooktil-glicint [12. példa, A) lépés] feloldunk 40 ml 1 M nátrium-hidroxidban. Keverés közben, 0 °C-on 3,16 ml (40 mmol) klór-acetil-kloridot és mintegy 20 ml 1 M nátrium-hidroxidot csepegtetünk az oldathoz egyidejűleg olyan módon, hogy a pH 8 legyen. A reakcióelegyet 30 percig 0 °C-on, majd 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd 30 ml vízzel hígítjuk, és 2*10 ml dietil-éterrel kirázzuk. A vizes fázist pH=2-re savanyítjuk 5 M sósavval. A kivált kristályos anyagot szűrjük, vízzel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 4,12 g (79%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 147-149 °C. Rf(6)=0,60.

C) lépés: D-ciklooktil-glicin

3,9 g (15 mmol) klór-acetil-DL-ciklooktil-glicint [12. példa, B) lépés] feloldunk 160 ml 0,1 M töménységű kálium-foszfát-pufferben (pH=7), majd 30 mg CoCI₂.6H₂O hozzáadása után az oldat pH-ját 7-re állítjuk 0,1 M kálium-hidroxiddal. Ezután néhány kristály nátrium-azidot és 200 mg Aciláz-I enzimet (Acylase-I, Grade I from Porcine kidney, SIGMA) adunk az oldathoz, és 3 napon át keverjük szobahőmérsékleten. Ezt követően a reakcióelegyet tömény ecetsavval pH=4,5-re savanyítjuk, 300 ml etanollal hígítjuk, és éjszakán át állni hagyjuk, majd szűrjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot 30 ml etil-acetátban és 30 ml kálium-hidrogén-szulfátban oldjuk. Az etil-acetátos oldatot vízzel savmentesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után bepároljuk 2,0-2,5 kPa nyomáson. A maradékhoz 10 ml 6 M sósavat adunk, és visszafolyós hűtő alatt forraljuk 3 órán át. Ezután az oldat pH-ját 5-re állítjuk 4 M nátrium-hidroxiddal. A kivált kristályos anyagot kiszűrjük, hideg vízzel és éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 1,1 g (6 mmol, 80%) cím szerinti anyagot kapunk. Olvadáspont: 184-185 °C. [a]_D=-29° (c=0,1; 1 M sósavban).

D) lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicin-ciklohexil-ammónium-só

0,92 g (5 mmol) D-ciklooktil-glicint [12. példa, C) lépés] feloldunk 8 ml dioxán és 5 ml 1 M nátrium-hidroxid elegyében, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés mellett hozzáadunk párhuzamosan 5 ml 1 M nátrium-hidroxidot és 0,48 ml (5 mmol) etoxi-karbonil-kloridot. A keverést folytatjuk egy órán át hűtés mellett és 2 órán át hűtés nélkül. A reakcióelegyből a dioxánt kidesztilláljuk csökkentett nyomáson, hozzáadunk 10 ml vizet, kirázzuk 15 ml dietil-éterrel, majd 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az etil-acetátos oldatokat egyesítjük, vízzel savmentesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után bepároljuk 2,0-2,5 kPA nyomáson. A párlási maradékot feloldjuk 15 ml dietil-éterben, és hozzáadunk 0,57 ml (5 mmol) ciklohexil-amint. A kivált kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 1,3 g (60%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 178 °C (169 °C-on zsugorodik). [a]_D=-21,5° (c=0,51; metanolban). Elemzési eredmény a C₂₅H₃₆N₂O₄ (428,55) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=70,06; H%=8,47; N%=6,54;

talált: C%=70,0; H%=8,5; N%=6,45.

E) lépés: Etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicil-L-prolin

0,76 g (2 mmol) etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicin-ciklohexil-ammónium-sót [12. példa, D) lépés] feloldunk 6 ml etil-acetátban és 6 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, az etil-acetátos fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPA nyomáson bepároljuk. A maradékot 8 ml tetrahidrofuránban feloldjuk, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 0,42 g (2,2 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt, valamint 0,42 g (2,05 mmol) diciklohexil-karbodiimidet, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet 2,0-2,5 kPA nyomáson bepároljuk. A maradékként kapott olajat 2 mmol etoxi-karbonil-D-ciklooktil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észternek tekintjük, feloldjuk 4 ml piridinben, hozzáadunk 0,22 g (2 mmol) L-prolint és 0,28 ml (2 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet 16 órán át keverjük szobahőmérsékleten, majd 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A párlási maradékot feloldjuk 10 ml dietil-éterben és 10 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban. A vizes fázist 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, és 3*5 ml etil-ace21

HU 224 427 Β1 táttal kivonatoljuk. Az etil-acetátos oldatokat egyesítjük, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A párlási maradék olaj, melyet vákuumexszikkátorban szárítunk. 0,56 g (79%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(2)=0,35. [a]_D=-19,2° (c=1; metanolban). A FAB tömegspektrum (355 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

13. példa

Etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (Eoc-D-cHpg-Pro-Arg-H) hemiszulfát előállítása

1. lépés: Etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

0,43 g (1,1 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33,1729 (1990)] és 0,34 g (1,0 mmol) etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicil-L-prolinból [13. példa, A) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek felhasználásával - végezzük. A végterméket [Rf(2)=0,69] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot n-hexánnal eldörzsöljük és exszikkátorban szárítjuk. 0,43 g (68%) cím szerinti terméket kapunk. R_f(2)=0,69. A FAB tömegspektrum (612 [M+H]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

0,20 g (0,32 mmol) etoxi-karbonil-D-cikloheptilglicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (13. példa, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 0,16 g (81%) cím szerinti terméket kapunk. Rj(6)=0,14.

3. lépés: Etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

0,14 g (0,22 mmol) etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-al dehidet (13. példa, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagensek és oldószerek alkalmazásával - alakítunk át. Ily módon 0,06 g (42%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(3)=0,27. HPLC(I): k’=4,36; 5,36 és 5,96. A FAB tömegspektrum (481 [M+H]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő: Etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicil-L-prolin (Eoc-DcHpg-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicil-L-prolin

Cikloheptán-karbaldehidből kiindulva a 12. példa A)-E) lépésében leírtakkal analóg módon állítjuk elő a megfelelő köztitermékeken - azaz DL-cikloheptil-glicin, klór-acetil-DL-cikloheptil-glicin, D-cikloheptil-glicin, etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicin-ciklohexil-ammónium-só és etoxi-karbonil-D-cikloheptil-glicin-2,4,5-triklór-fenil-észter - keresztül a cím szerinti terméket olaj formájában. R_f(9)=0,52. A FAB tömegspektrum (341 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

Kontrollvegyületek szintézise

1. szintézis

Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-arginin-aldehid(Eoc-D-Phe-Pro-Arg-H) hemiszulfát

1. lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolilN^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

2,3 g (5,8 mmol) ferc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33, 1729 (1990)] és 1,67 g (5 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolinból [1. szintézis, C) lépés] kiindulva a komponensek kapcsolását és a végtermék kromatográfiás tisztítását az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű oldószereket és reagenseket alkalmazva - végezzük. A végterméket [R_f(1 )=0,37] tisztán tartalmazó frakciókat egyesítjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot exszikkátorban szárítjuk. 1,18 g (60%) cím szerinti terméket kapunk olaj formájában. A FAB tömegspektrum (607 [M+H]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolilN^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

0,9 g (1,5 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (1. szintézis, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk. Ily módon 0,33 g (36%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(1 )=0,16.

3. lépés: Etoxi-karbonil-3fenil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

0,33 g (0,54 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (1. szintézis, 2. lépés) átalakítunk az 1. példa 3. lépésében leírt módon, arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva. 0,26 g (92%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k-4,0; 4,45 és 5,45. A FAB tömegspektrum (475 [M+H]⁺, 628 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin (Eoc-D-Phe-Pro) előállítása

A) lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin

16.5 g (0,1 mól) 3-fenil-D-alanint az 1. példa A) lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - acilezünk, azzal az eltéréssel, hogy a reakcióelegy feldolgozásánál a végterméket tartalmazó etil-acetát bepárlásával nyert olajat vákuumexszikkátorban szárítjuk. 14,6 g (55%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(9)=0,70.

B) lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-N-hidroxi-szukcinimid-észter

14.5 g (55,4 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanint [1. szintézis, A) lépés] és 6,4 g (56 mmol) N-hidroxi-szukcinimidet feloldunk 60 ml tetrahidrofuránban. Az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 11,5 g (56 mmol) diciklohexil-karbodiimidet. A reakcióelegyet hűtés mellett 10 órán át tovább keverjük, majd szűrjük és 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot benzollal kristályosítjuk. A kristályokat kiszűrjük, benzollal és

HU 224 427 Β1 dietil-éterrel mossuk, majd vákuumexszikkátorban szárítjuk. 11,3 g (60%) cím szerinti terméket kapunk. Rf(10)=0,53. [ct]_D=+58,1° (c=1, dimetil-formamid). Elemzési eredmény a C₁₆H₁₈N₂O₆ (334,33) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=57,48; H%=5,42; N%=8,30;

talált: C%=57,4; H%=5,4; N%=8,3.

A FAB tömegspektrum (335 (M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

C) lépés: Etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin

3,34 g (10 mmol) etoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-N-hidroxi-szukcinimid-észtert [1. szintézis, B) lépés] feloldunk 15 ml piridinben, hozzáadunk 1,15 g (10 mmol) L-prolint és 1,4 ml (10 mmol) trietil-amint. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten keverjük 10 órán át, majd 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 30 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban és 10 ml dietil-éterben. A vizes fázist kirázzuk 3*5 ml dietil-éterrel. A dietil-éteres fázisokat egyesítjük, és kirázzuk 5 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 1 M kálium-hidrogén-szulfáttal pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. Az olajos maradékot dietil-éterrel kristályosítjuk. A kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 2,6 g (77%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 141-143 ’C. Rf(6)=0,40.

Elemzési eredmény a C₁₇H₂₂N₂O₅ (334,33) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=61,06; H%=6,63; N%=8,38;

talált: C%=61,1; H%=6,7; N%=8,1.

A FAB tömegspektrum (335 (M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. szintézis

Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid- (Moc-D-Phe-Pro-Arg-H) hemiszulfát

1. lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolilN^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktám

4,1 g (10,5 mmol) terc-butoxi-karbonil-N^Gbenzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámból [S. Bajusz és munkatársai: J. Med. Chem. 33,1729 (1990)] és 2,88 g (9 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolinból [2. szintézis, C) lépés] kiindulva az 1. példa 1. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - elvégezzük a komponensek kapcsolását és a nyers végtermék elkülönítését. A nyers végterméket ciklohexánból történő kristályosítással tisztítjuk. 4,65 g (86%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 72-82,7 ’C. R_f(2)=0,56. [a]_D=+72,9° (c=1, tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (593 [M+H]⁺, 746 [M+H+NBA]^{2 * 4-}) a várt szerkezetet erősíti meg.

2. lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolilN⁶-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehid

4,13 g (7 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-laktámot (2.

szintézis, 1. lépés) az 1. példa 2. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - redukálunk, azzal az eltéréssel, hogy a művelet végén, a metilén-kloridos oldat bepárlása után kapott olajos terméket dietil-éterrel kristályosítjuk. Szűrés, dietil-éteres mosás és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 3,06 g (74%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 103-107 ’C. R_f(6)=0,44. [a]_D=-69° (c=1, tetrahidrofuránban). A FAB tömegspektrum (595 [M+H]⁺, 748 [M+H+NBA]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

3. lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-hemiszulfát

2,68 g (4,5 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolil-N^G-benzil-oxi-karbonil-L-arginin-aldehidet (2. szintézis, 2. lépés) az 1. példa 3. lépésében leírt módon - arányos mennyiségű reagenseket és oldószereket alkalmazva - átalakítunk. Ily módon 2,15 g (94%) cím szerinti terméket kapunk. HPLC(I): k’=3,3; 3,57 és 4,09. [a]_D=-87,6° (c=1, vízben). A FAB tömegspektrum (461 [M+H]⁺, 614 [M+H+NBA]*) a várt szerkezetet erősíti meg.

A kiindulási anyagot például az alábbi módon állítjuk elő: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin (Moc-D-PhePro) előállítása

A) lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-diciklohexil-ammónium-só g (30 mmol) D-fenil-alanint feloldunk 15 ml 2 M nátrium-hidroxidban, az oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés mellett hozzáadunk párhuzamosan 16,5 ml 2 M nátrium-hidroxidot és 2,55 ml (33 mmol) metoxi-karbonil-kloridot. A reakcióelegyet fél órán át hűtés mellett és 2 órán át szobahőmérsékleten keverjük. Ezután a reakcióelegyet hígítjuk 40 ml vízzel, kirázzuk 10 ml dietil-éterrel, majd 3-as pH-ra savanyítjuk 3 M sósavval, és 4*20 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat 20 ml vízzel mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 60 ml diizopropil-éterben, és hozzáadunk 6 ml (30 mmol) diciklohexil-amint. A kivált kristályokat kiszűrjük, diizopropil-éterrel mossuk és levegőn szárítjuk. 11,5 g (28,5%) cím szerinti terméket kapunk. R,(2)=0,56. Olvadáspont: 167-170 ’C. [a]_D--37,9° (c=0,5, etanolban).

Elemzési eredmény a C₂₃H₃₆N₂O₄ (404,53) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=68,28; H%=8,97; N%=6,92.

talált: C%=68,3; H%=9,15; N%=6,75.

B) lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-2,4,5-triklór-fenil-észter

11,3 g (28 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanint [2. szintézis, A) lépés] feloldunk 75 ml etil-acetátban és

30,5 ml 1 M kálium-hidrogén-szulfátban. A fázisokat elválasztjuk, az etil-acetátos fázist vízzel semlegesre mossuk, majd vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson mintegy 15 ml térfogatra töményítjük. A maradék oldatot 0 °C-ra hűtjük, és keverés közben hozzáadunk 5,5 g (28 mmol) 2,4,5-triklór-fenolt, valamint 5,75 g (28 mmol) diciklohexil-karbodiimidet, majd a reakcióelegyet mintegy

HU 224 427 Β1 órán át állni hagyjuk. A kivált diciklohexil-karbamidot kiszűrjük, és a szűrletet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékként kapott olajos végterméket etanolból kristályosítjuk. Szűrés, dietil-éteres mosás és vákuumexszikkátorban történő szárítás után 6,86 g (61%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 109-110 °C. Rf(4)=0,84.

Elemzési eredmény a C₁7H₁₄NO₄CI₃ (402,66) képletre vonatkoztatva:

számított: C%=50,70; H%=3,50; N%=3,48;

Cl=26,42;

talált: C%=50,8; H%=3,2; N%=3,4;

Cl=26,6.

C) lépés: Metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanil-L-prolin 4,83 g (12 mmol) metoxi-karbonil-3-fenil-D-alanin-2,4,5-triklór-fenil-észtert [2. szintézis, B) lépés] feloldunk 12 ml piridinben, hozzáadunk 1,38 g (12 mmol) L-prolint és 1,68 ml (12 mmol) trietil-amint, majd a reakcióelegyet mintegy 16 órán át keverjük. Ezt követően a reakcióelegyet 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk. A maradékot feloldjuk 40 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonátban, és az oldatot kirázzuk 3*7 ml dietil-éterrel. A dietil-éteres fázisokat egyesítjük, és kirázzuk 7 ml 5%-os nátrium-hidrogén-karbonáttal. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat egyesítjük, 3 M sósavval pH=3-ra savanyítjuk, és 3*10 ml etil-acetáttal kivonatoljuk. Az egyesített etil-acetátos oldatokat vízmentes nátrium-szulfáton történő szárítás után 2,0-2,5 kPa nyomáson bepároljuk, majd a maradékot dietil-éterrel kristályosítjuk, a kristályokat kiszűrjük, dietil-éterrel mossuk és vákuumexszikkátorban szárítjuk. 3,05 g (79%) cím szerinti terméket kapunk. Olvadáspont: 154-157 °C. R_f(2)=0,47.

A FAB tömegspektrum (321 [M+H]⁺) a várt szerkezetet erősíti meg.

Módszerek

M1. módszer Plazmaalvadék készítése

a) Lemezkedús plazmát (PRP) készítünk olyan módon, hogy humán vér és 3,8%-os nátrium-citrát—víz(1 /2) 9:1 arányú elegyét 240*g-n centrifugáljuk 5 percig.

b) Egy-egy reakcióedénybe 200 μΙ PRP-t teszünk, hozzáadunk 80 μΙ 40 mM-os kalcium-kloridot, és állni hagyjuk szobahőmérsékleten 1 órán át. A kialakult plazmaalvadékot 6*2 ml 0,9%-os nátrium-kloriddal mossuk enyhe keveréssel és 5 perc ülepítéssel, hogy az oldatban maradt enzimeket (Xa faktor és trombin) eltávolítsuk. A mosófolyadék trombintartalmát a következő módon határozzuk meg.

c) 400 μΙ mosófolyadékhoz 100 μΙ 1 mM-os Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztrátoldatot adunk, 30 percet inkubáljuk 37 °C-on, majd 100 μΙ 50%-os ecetsavval leállítjuk a reakciót. Az elegyből 150-150 μΙ-t teszünk egy 96 lyukú lemez (96-well microtitre plate) mélyedéseibe, és 405 nm-en meghatározzuk az extinkciós értékeket (ELISA READER SLT Laborinstrument GmbH, Austria). Eredményes mosás esetén az extinkció értéke kisebb, mint a kontroll 5%-a.

M2. módszer

Plazmaalvadékba zárt Xa faktor gátlásának meghatározása

a) A peptidinhibitorból 0,1-1,0-10 és 100 ng/ml-es oldatot készítünk 0,1 M Tris-pufferrel, mely 0,02% humán albumint tartalmaz, pH=8,5.

b) A mosófolyadék leszívása után az alvadókra (M1. módszer) teszünk 400 μΙ peptidoldatot (minden koncentrációban 3-3 párhuzamos minta), illetve kontrollként 400 μΙ puffért, és 5 percig inkubáljuk 37 °C-on. Ezt követően hozzáadunk 100 μΙ 2 mM-os Moc-D-Chg-Gly-Arg-pNA szubsztrátoldatot, további 30 percet inkubáljuk 37 °C-on, majd 100 μΙ 50%-os ecetsavval leállítjuk a reakciót.

c) Minden reakcióelegyből 150-150 μΙ-t teszünk egy 96 lyukú lemez (96-well microtitre plate) mélyedéseibe, és 405 nm-en meghatározzuk az extinkciós értékeket (ELISA READER SLT Laborinstrument GmbH, Austria). A kontrolihoz viszonyított, átlagolt extinkcióértékekből grafikusan meghatározzuk az 50%-os gátláshoz szükséges peptidkoncentrációt (IC₅₀).

M3. módszer

Plazmaalvadékba zárt trombin gátlásának meghatározása

a) A peptidinhibitorból oldatokat készítünk az M2. módszer a) pontjában leírtak szerint.

b) A mosófolyadék leszívása után az alvadókra (M1. módszer) teszünk 400 μΙ peptidoldatot (minden koncentrációban 3-3 párhuzamos minta), illetve kontrollként 400 μΙ puffért, és 5 percig inkubáljuk 37 °C-on. Ezt követően hozzáadunk 100 μΙ 1 mM-os Tos-Gly-Pro-Arg-pNA szubsztrátoldatot, további 30 percet inkubáljuk 37 °C-on, majd 100 μΙ 50%-os ecetsavval leállítjuk a reakciót. A továbbiakban az M2. módszer c) pontja szerint járunk el.

M4. módszer Fibringél készítése

a) Egy-egy reakcióedénybe 200 μΙ 6 mg/ml-es humán fibrinogént (SIGMA), 25 μΙ 25 NIH E/ml-es humán trombint (SIGMA) és 40 μΙ 100 mM-os kalcium-kloridot teszünk, és állni hagyjuk 1 órán át 20-22 °C-on. A kialakult fibringélt 3*2 ml fiziológiás konyhasóoldattal mossuk enyhe keveréssel és 5 perc ülepítéssel, hogy az oldatban maradt trombint eltávolítsuk. A mosás eredményességét az M1. módszer c) pontja szerint ellenőrizzük.

M5. módszer

Fibringélhez kötött trombin gátlásának meghatározása

a) A peptidinhibitorokból 0,1-1,0-10 és 100 pg/ml-es oldatot készítünk Hepes/NaCI pufferrel (0,01 M Hepes és 0,1 M nátrium-klorid, pH=7,4).

b) A továbbiakban az M3. módszer b) pontja szerint járunk el.

HU 224 427 Β1

M6. módszer

Xa faktor gátlásának mérése oldatban 96 lyukú lemezen (96-well microtitre plate)

a) A Xa faktorból (humán, SIGMA) 1,3 E/ml-es, a peptidinhibitorokból 0,1-1,0-10 és 100 pg/ml-es oldatokat készítünk foszfátpufferrel (0,1 M nátrium-foszfát és 0,05 M nátrium-klorid, pH=7,4). A Bz-lle-GluGly-Arg-pNA szubsztrátból 0,33 nM-os desztillált vizes oldatot használunk.

b) A kontroliból és minden egyes peptidoldatból 3-3 reakcióelegyet készítünk. A lemez mélyedésébe teszünk 30 μΙ peptidet, illetve kontrollként puffért, 30 μΙ Xa faktort, 90 μΙ puffért és 150 μΙ szubsztrátot, majd 10 perc múlva 405 nm-en leolvassuk az extinkcióértékeket. A továbbiakban az M2. módszer

c) pontja szerint járunk el.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. (I) általános képletű új peptidszármazékok Q-D-Xaa-Pro-Arg-H (I) ahol

Q jelentése Q’-O-CO- képletű acilcsoport, mely képletben

Q’ jelentése 1-3 szénatomszámú alkilcsoport, D-Xaa jelentése NH-CH(R)-CO képletű D-aminosav-gyök, ahol R jelentése 3-6 szénatomszámú egyenes vagy elágazó láncú alkilcsoport, 7-8 szénatomszámú cikloalkilcsoport vagy ciklohexil-metil-csoport,

Pro jelentése L-prolin-gyök és

Arg jelentése L-arginin-gyök és ezek szerves vagy szervetlen savval képzett savaddíciós sói.
2. Etoxi-karbonil-D-hexil-glicil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
3. Etoxi-karbonil-D-norleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
4. Etoxi-karbonil-D-leucil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
5. Etoxi-karbonil-D-alloizoleucil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
6. Etoxi-karbonil-D-norvalil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
7. Etoxi-karbonil-D-ciklohexil-alanil-L-prolil-L-arginin-aldehid és savaddíciós sói.
8. Gyógyszerkészítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként valamely (I) általános képletű vegyületet - ahol Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy ennek valamely gyógyászatilag elfogadható sóját tartalmazza, a gyógyászatban szokásosan alkalmazott oldó-, hígító-, hordozó- és töltőanyagok kíséretében.
9. (I) általános képletű vegyületek - ahol Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése az 1. igénypontban megadott gyógyszerként való alkalmazásra.
10. (I) általános képletű vegyületek - ahol Q, D-Xaa, Pro és Arg jelentése az 1. igénypontban megadott - alkalmazása trombózissal és/vagy fokozott véralvadékonysággal járó állapotok kezelésére és megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására.